LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ
Stanovení pesticidů v citrusových plodech metodou LC-MS/MS
Garant úlohy: Ing. Vojtěch Hrbek 1
1. Základní požadované znalosti pro vstupní test
Základní informace o pesticidech
Princip QuEChERS extrakce
Validace metody – význam a účel
Princip a využití kapalinové chromatografie
Princip a užití hmotnostní spektrometrie
Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři a protipožární ochrany
2. Náplň úlohy
Extrakce pesticidů ze vzorků metodou QuEChERS
Příprava kalibračních standardů, fortifikovaných a neznámých vzorků
Seznámení s LC-MS/MS instrumentu, měření kalibrace a vzorků
Vyhodnocení naměřených dat (validace)
3. Časový snímek cvičení 30 minut
Kontrola požadovaných znalostí, diskuse: způsob přípravy vzorků, měření a vyhodnocování naměřených dat
90 minut
Příprava jednotlivých vzorků a standardů
30 minut
Seznámení s LC-MS instrumentací
20 minut
Měření vzorků
60 minut
Vyhodnocení naměřených dat a diskuse výsledků
10 minut
Ukončení úlohy + úklid
2
4. Teoretický úvod 4.1. Pesticidy Pesticidy jsou definovány jako sloučeniny a jejich směsi určené k prevenci, ničení, potlačení, odpuzení či kontrole škodlivých činitelů (nežádoucích mikroorganismů, rostlin a živočichů) během produkce, skladování, transportu, distribuce a zpracování potravin a krmiv. Tato definice dále zahrnuje látky, které působí jako defolianty (druh herbicidu užívaného zejména před mechanizovanou sklizní plodin, který u rostliny způsobuje opadávání listů), desikanty (látky vyvolávající desikaci čili stav vysušení), regulátory růstu rostlin, inhibitory klíčení, ale i látky podávané zvířatům proti ektoparazitům. V současné době představuje aplikace pesticidů nejběžnější metodu ochrany rostlinné výroby proti působení škodlivých organismů. Dopadem používání pesticidů k ochraně rostlin je možnost výskytu reziduí účinných látek, ale i jejich metabolitů nebo rozkladných produktů v životním prostředí, v ošetřených produktech (ovoci, zelenině, cereáliích, …), v tělech zvířat (v důsledku jejich přítomnosti v krmivech) a následně i v potravinách. Pesticidy představují široké spektrum chemických sloučenin, které se nejčastěji klasifikují podle cílového škodlivého činitele, viz Tabulka 1. Tabulka 1: Klasifikace pesticidů dle cílového škodlivého činitele (vybrané skupiny pesticidů) Skupina
Cílový škodlivý činitel
Skupina
Cílový škodlivý činitel
herbicidy
plevelné rostliny
ovicidy
vajíčka hmyzu
fungicidy
plísně, cizopasné houby
larvicidy
larvy hmyzu
insekticidy
hmyz
adulticidy
dospělý hmyz (imago)
rodenticidy
hlodavci
molluskocidy
měkkýši
algicidy
řasy
virucidy
viry
avicidy
ptáci
baktericidy
bakterie
Přestože pesticidy pomáhají během zemědělské produkce zvyšovat výnosy a chránit plodiny, jejich rezidua v těchto komoditách mohou představovat zdravotní riziko pro člověka, zejména pak pro malé děti. Z tohoto důvodu je nutno rezidua ve zmíněných komoditách sledovat/stanovovat.
4.2. Legislativa Množství reziduí v potravinách a krmivech jsou regulována nařízením Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 396/2005 ve znění pozdějších předpisů. Součástí tohoto nařízení (Příloha II a III) jsou hodnoty maximálních limitů reziduí (MLR) v potravinách rostlinného a živočišného původu pro jednotlivé kombinace pesticid-komodita. Pro produkty, u nichž není stanovena zvláštní hodnota MLR, je stanovena tzv. standardní hodnota 0,01 mg kg-1 (default MRL). V češtině MLR neboli maximální limit reziduí má celosvětově používaný anglický
3
ekvivalent MRL, maximum residue level. MLR pro dětskou výživu je pro všechny pesticidy stanoveno na hladinu 0,01 mg kg-1.
4.3. Stanovení Obecný princip metod pro stanovení reziduí pesticidů se skládá z několika kroků: izolace reziduí, odstranění koextraktů, identifikace a kvantifikace analytů. Nejběžnější metodou pro izolaci reziduí pesticidů z pevných matric je jejich extrakce rozpouštědlem (extrakce typu kapalina-pevná látka (LSE)). Mezi hlavní separační techniky užívané při analýze reziduí pesticidů, patří plynová chromatografie (Gas Chromatography, GC) a kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography, LC). Pro identifikaci a kvantifikaci analytů jsou v současné době obě techniky nejčastěji používány ve spojení s hmotnostní spektrometrií (Mass Spectrometry, MS), tedy s instrumentální technikou umožňující separaci iontů v plynné fázi ve vakuu dle poměru jejich hmotnosti a náboje (m/z). Mezi pesticidy se řadí více než 1000 látek s různými chemickými vlastnostmi, zejména polaritou. V dnešní době se pro stanovení pesticidů používají tzv. multi reziduální metody (MRM), které umožňují stanovení několika desítek až stovek reziduí pesticidů v jednom měření. Nicméně některé pesticidy nelze takto stanovit, některé, díky svým natolik odlišným chemickým vlastem, musí být stanovovány zvlášť za odlišných podmínek, vyžadují tak individuální přístup, který je označen jako single reziduální metoda (SRM). SRM se využívá např. pro stanovení silně polárních pesticidů (např. glyphosate). Pro MRM stanovení pesticidů se v dnešní době nejvíce využívá extrakční (izolační) metoda QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe – rychlá, jednoduchá, levná, efektivní, robustní a bezpečná). Princip metody QuEChERS spočívá v navážení homogenizovaného vzorku (matrice), 10g pro matrice s vysokým obsahem vody, 5 g v případě matric s nižším obsahem vody (okolo 50%) je navážka vzorku a přidává se i 5g vody. V případě suchých matric (cereálie) je navážka vzorku 2,5g a přídavek vody 7,5g. K naváženému vzorku (ať už s přídavkem vody nebo bez něj), je přidáno extrakční rozpouštědlo – acetonitril. Směs se intenzivně protřepe a v následujícím kroku dojde k přídavku anorganických solí – chloridu sodného a síranu hořečnatého. Tento přídavek solí má vliv na usnadnění extrakce analytů, takto lépe přejdou ze vzorku do acetonitrilové frakce. Vzorek se znovu protřepe a následně se přidá vnitřní standard TPP (trifenylfosfát) a vzorek se odstředí. Pro analýzu se odebírá acetonitrilová frakce. Pokud je třeba následuje ještě přečišťující krok pro odstranění koextraktů matrice, které by mohly rušit stanovení (typicky v případě čajů).
4
Návod laboratorní práce Předmětem této úlohy je analýza citrusových plodů (citróny, limetky apod.) na obsah pesticidů imazalilu a thiabendazolu, jimiž se plody běžně ošetřují. Tyto dva pesticidy jsou legislativně regulovány a pro citrusové plody je stanovena hodnota MLR na 5 mg.kg-1.
Princip metody Thiabendazol a imizalil jsou ze vzorku extrahovány metodou QuECheRS. Vlastní stanovení pesticidů ve vzorku se provádí s využitím techniky kapalinové chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí za ionizace elektrosprejem (LC-ESI-MS). Hmotnostním analyzátorem je trojitý kvadrupól (QqQ). Specifické detekce je dosaženo v MRM módu (tj. monitorováním produktů fragmentace prekurzorového iontu, kterým je zpravidla pseudomolekulární iont daného analytu). Konfirmačním kritériem je shoda retenčních časů analytu ve vzorku a ve standardu a přítomnost minimálně dvou charakteristických produktových iontů (fragmentů) o určitém poměru intenzit. Kvantifikace se provádí metodou kalibrační křivky, srovnáním ploch píků vybraných produktových iontů v MS/MS chromatogramu vzorku a standardu. Úkoly: 1. Příprava blanku (vzorek prostý stanovovaných analytů, extrakt matrice), matričních kalibračních standardů, fortifikovaných vzorků (spiků) a neznámých vzorků (reálných vzorků) 2. Měření vzorků metodou LC-MS/MS 3. Vyhodnocení naměřených dat
Chemikálie a standardy -
Pracovní roztoky pesticidů v acetonitrilu Methanol – LiChrosolv, gradient grade, Merck (D) Acetonitril – Chromasolv, gradient grade, Sigma-Aldrich (USA) Síran hořečnatý, > 98 %, Fluka (USA) Chlorid sodný, Penta (ČR) Mravenčan amonný, 99,999 %, Sigma-Aldrich (D) Kys. mravenčí, 85 % p.a., Lachema (ČR)
Použité přístroje -
Kapalinový chromatograf Waters Aliance, Separate Module 2695, Waters (USA) Hmotnostní spektrometr Quattro Premier XE, Waters (USA)
5
Tabulka 2: HPLC podmínky stanovení pesticidů Discovery C18, 100 x 3,0 mm x 5 m A: 5 mM mravenčan amonný s 0,1 % kyselinou mravenčí v methanolu B: 5 mM mravenčan amonný s 0,1 % kyselinou mravenčí ve vodě 5 l 30 C 10 C
kolona mobilní fáze objem nastřikovaného vzorku teplota kolony teplota autosampleru
Tabulka 3: Gradient Čas [min] 0 0,5 4 4,5 6 8
A [%] 20 50 100 100 100 10
B [%] 80 50 0 0 0 90
Průtok [ml.min-1] 0,3 0,3 0,4 1,0 1,0 1,0
Pracovní postup 1. Izolace analytů ze vzorku Do 50ml plastové centrifugační kyvety se naváží 5 g homogenizovaných citrusů. Ke vzorku se následně přidá 5 ml vody s 1% kyselinou mravenčí (v/v). Poté se ke vzorku přidá 10 ml acetonitrilu, kyveta se uzavře a po dobu 2 minut intenzivně protřepává v ruce. Následně se ke vzorku přidají 4 g síranu hořečnatého a 1 g chloridu sodného, které jsou předem naváženy do kyvety k tomu určené, a kyveta se opět po dobu 1 minuty intenzivně protřepe v ruce. Po přídavku 200 µl vnitřního standardu (TPP, koncentrace 5 000 ng.ml-1) ke vzorku je kyveta naposledy krátce protřepána a poté odstředěna při 10 000 rpm po dobu 5 minut. (Před odstředěním je nutné kyvety proti sobě vyvážit do dvojic tak, aby rozdíl v jejich hmotnosti nepřesáhl 0,1 g.) Z horní acetonitrilové vrstvy se následně odebere pomocí skleněné Pasteurovy pipety přibližně 1-1,5 ml extraktu do krimplovací vialky. Extrakt se poté analyzuje pomocí techniky LC-MS/MS.
2. Příprava extraktu matrice („blank“) a fortifikovaného vzorku („spike“) Blank Extrakt matrice se připraví dle postupu popsaného v kapitole 1 pracovního postupu, ovšem bez přídavku vnitřního standardu TPP.
Spike Do 50ml plastové centrifugační kyvety se přesně naváží 5 g homogenizovaných citrusů (neobsahující stanovované pesticidy). Ke vzorku se přidá 200 µl roztoku standardů pesticidů o koncentraci 2500 ng ml-1, kyveta se uzavře, důkladně protřepe a poté se ponechá stát při laboratorní teplotě stát po dobu 30 minut. Vzorek se následně extrahuje výše uvedeným postupem v kapitole 1. 6
Výpočet koncentrace spiku: 𝑛1 = 𝑛2 𝑐1 𝑉1 = 𝑐2 𝑉2 𝑛1 𝑐1 𝑉1 𝑛2 𝑐2 𝑉2
látkové množství std. pesticidů ve výchozím roztoku koncentrace std. pesticidů ve výchozím roztoku [ng ml-1] objem std. pesticidů ve výchozím roztoku [ml] látkové množství std. pesticidů v připravovaném roztoku (spiku) koncentrace std. pesticidů v připravovaném roztoku (spiku) [ng ml-1] objem std. pesticidů v připravovaném roztoku (spiku) [ml]
3. Příprava matričních kalibračních standardů Pro stanovení obsahu sledovaných látek ve vzorcích se připraví řada matričních kalibračních bodů o koncentraci: 2; 5; 10; 20; 50; 100; 200; 300 a 400 ng ml-1. K přípravě kalibračních bodů se použijí zásobní směsné kalibrační roztoky standardů pesticidů v acetonitrilu, vnitřní standard (TPP) o koncentraci 2 000 ng ml-1 a extrakt matrice „blank“, viz Tabulka 4. Tabulka 4: Příprava kalibračních standardů Kalibrační bod [ng.ml-1]
Objem [ml]
Zásobní std. [ng.ml-1]
400 300 200 100 50 20 10 5 2
1 1 1 1 1 1 1 1 1
8000 6000 4000 2000 1000 400 200 100 40
Pipetovat [ml] Zásobní std. TPP
0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050
0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050
Blank
0,900 0,900 0,900 0,900 0,900 0,900 0,900 0,900 0,900
Koncentrace kalibračních roztoků se vypočte stejným způsobem jako příprava spiků o určité koncentraci. Příklad výpočtu kalibračního bodu 400 ng.ml-1: 𝑐1 𝑉1 = 𝑐2 𝑉2 400.1 = 8000. 𝑉2 𝑉2 = 0,05 𝑚𝑙 𝑐1 𝑉1 𝑐2 𝑉2
koncentrace kalibračního bodu ve vialce [ng.ml-1] objem kalibračního bodu ve vialce [ml] koncentrace pesticidů v zásobním standardu [ng.ml-1] objem pipetovaného množství zásobního standardu pesticidů [ml]
7
Obrázek 1: Schéma sekvence – pořadí vzorků
4. Identifikace a kvantifikace Identifikace analytů se provádí porovnáním retenčního času píku daného analytu (charakteristických MRM přechodů) v chromatogramu analyzovaného vzorku a kalibračního standardu. Kvantitativní vyhodnocení se provádí metodou vnitřního standardu, a to odečtením koncentrace analytu z kalibrační křivky a přepočtem na původní vzorek.
Obrázek 2: Ukázka získaných dat, kalibrační křivky a výpočtu výsledku
8
Tabulka 5: Identifikační a kvantifikační přechody Imazalilu a Thiabendazolu Analyt Imazalil Thiabendazol
Kvantifikační přechod 297,1 ˃ 158,9 202,1 ˃ 175,0
Konfirmační přechod 299,1 ˃ 160,9 202,1 ˃ 131,0
Retenční čas (min) 4,74 4,26
Kalibrace, korekce na vnitřní standard a další vyhodnocení naměřených dat je prováděno pomocí softwarového vybavení LC-MS/MS přístroje v našem případě MassLynx 4.1. Další zpracování dat (výpočty) jsou prováděny v programu MS Excel, po překopírování, přičemž je kontrolována linearita kalibrační křivky a rozptyl pomocí regresního koeficientu (R2). Součástí zpracování dat je vyhodnocení výsledků analýz a zjištění pracovních charakteristik, které jsou součástí validace metody. Výpočet koncentrace analytu ve vzorku metodou interní kalibrace s korekcí na vnitřní standard: A AN a AIS Výpočet koncentrace analytu ve vzorku metodou interní kalibrace: Cvz Ccal f f
AN Aa AIS Cvz Ccal Vextrakt m f
Vextrakt m
korigovaná plocha plocha analytu plocha vnitřního standardu koncentrace analytu ve vzorku (µg/kg) koncentrace analytu vypočítaná z kalibrační závislosti (μg/ml) objem extraktu (ml) navážka vzorku (g) přepočítávací faktor (obsah matrice v extraktu)
5. Validace = testování (zjišťování, prověřování) vlastností metody Validační parametry: -
správnost (pravdivost) – kontrolována měřením (komerčně) dodaných referenčních materiálů, účastí v mezilaboratorních testech, popř. srovnáním s jinou laboratoří… - selektivita a specifičnost – stanovení analytů není ovlivněno složkami matrice (vzorku) - výtěžnost [%] – výpočet ze spiků - pohybuje se v rozmezí: 70 – 120 %
9
Obrázek 3: Validační parametry: přesnost - správnost -
shodnost (přesnost) - opakovatelnost – jak se shodují výsledky mezi více stanoveními – vyjadřuje se jako směrodatná odchylka, počítaná většinou z 6 paralelně stanovených vzorků nebo jako relativní směrodatná odchylka (RSD) 𝑛
1 𝑠=√ ∑(𝑥𝑖 − 𝑥)2 𝑛−1 𝑖=1
𝑅𝑆𝐷 = (𝑠/𝑥) 100
s n 𝑥 xi
-
směrodatná odchylka počet hodnot průměrná hodnota i-tá hodnota
- reprodukovatelnost – jak se shodují výsledky mezi laboratořemi citlivost – směrnice kalibrační přímky, nejnižší 2 koncentrace, které mohu od sebe rozlišit
Obrázek 4: Směrnice kalibračních přímek – 2 koncentrace odpovídají různým odezvám
10
-
mez detekce (LOD) a mez stanovitelnosti (LOQ) 𝑆
pro LOD platí: 𝑁 ≥ 3 𝐿𝑂𝐷 = 3 . š𝑢𝑚 pro LOQ platí:
𝑆 𝑁
≥ 10
𝐿𝑂𝑄 = 3 . 𝐿𝑂𝐷 nebo se u chromatografických metod používá hodnota LOD a LOQ jako nejnižší bod kalibrační křivky
Obrázek 5: Znázornění signálu a šumu na části chromatogramu -
pracovní rozsah – lineární 8000
area
6000 4000
2000 0 0
100
200
300
400
500
600
koncentrace (ng/ml)
Obrázek 6: kalibrační body → lineární pracovní rozsah -
robustnost – necitlivost metody na „malé“ odchylky v postupu nebo složení vzorku nejistota – ve spojení s výsledkem měření tvoří interval hodnot, o němž se tvrdí, že uvnitř něho leží skutečná hodnota – odhad nejistoty výsledku se odvíjí od nálezu ve vzorku, pro obsah pesticidu < 0,02 mg kg-1, je zavedeno, že nejistota výsledku je 40 % z hodnoty výsledku, pro obsah: 0,02-0,5 mg kg-1 je nejistota 30 % a pro > 0,5 mg kg-1 je nejistota rovna 20 %
11
6. Výstup
Vyhodnocení naměřených dat Výpočet výsledků – nálezy pesticidů včetně nejistoty, pracovní charakteristiky metody vyplývajících z validace (výtěžnost, opakovatelnost, lineární pracovní rozsah, LOD a LOQ) Sepsání protokolu
Zkušební otázky: 1. Co jsou to pesticidy, resp. k čemu se používají? Uveďte příklad účinku, proti čemu se pesticidy používají? 2. Jakou extrakční metodu byste zvolili pro izolaci reziduí pesticidů, uveďte základní princip, popis metody. 3. Jakou instrumentální metodu byste zvolili pro stanovení imazalilu v citronech? 4. Co je to validace? Vyjmenujte základní pracovní charakteristiky metody. 5. Popište princip chromatografické separace. 6. Vysvětlete princip analýzy látek pomocí hmotnostní spektrometrie. 7. Jaká je výtěžnost metody pro thiabendazol v případě, že připravenému spiku na hladině 20 ng ml-1odpovídá naměřená koncentrace 18,5 ng ml-1?
12
