Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav analýzy potravin a výživy
LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ
Stanovení vitaminů, kofeinu, antioxidantů a konzervačních látek (metoda: kapalinová chromatografie s UV detekcí)
Garant úlohy: doc. Dr. Ing. Věra Schulzová
OBSAH Základní požadované znalosti pro vstupní test .......................................................................... 3 Další doporučené otázky ............................................................................................................ 3 Náplň úlohy ................................................................................................................................ 4 Časový snímek cvičení ............................................................................................................... 5 A. Pracovní postup pro stanovení vitaminu C v nápojích, ovoci a zelenině .............................. 6 1. Použitelnost metody ............................................................................................................... 6 2. Princip metody ....................................................................................................................... 6 3. Používané přístroje a zařízení ................................................................................................ 6 4. Chemikálie, roztoky a standardy ............................................................................................ 6 5. Pracovní postup ...................................................................................................................... 7 B. Pracovní postup pro stanovení kofeinu, chlorogenové kyseliny a konzervačních látek v nápojích ...................................................................................................................................... 9 1. Použitelnost metody ............................................................................................................... 9 2. Princip metody ....................................................................................................................... 9 3. Používané přístroje a zařízení ................................................................................................ 9 4. Chemikálie, roztoky a standardy ............................................................................................ 9 5. Pracovní postup ...................................................................................................................... 9 C. Pracovní postup pro stanovení antioxidantů a jejich stability v ovoci, zelenině a v nápojích .................................................................................................................................................. 11 1. Použitelnost metody ............................................................................................................. 11 2. Princip metody ..................................................................................................................... 11 3. Používané přístroje a zařízení .............................................................................................. 11 4. Chemikálie, roztoky a standardy .......................................................................................... 11 5. Pracovní postup .................................................................................................................... 11 Vybavení pracovního stolu....................................................................................................... 12 Požadavky na protokol ............................................................................................................. 13 Klasifikace ................................................................................................................................ 14 Přílohy ...................................................................................................................................... 15
Základní požadované znalosti pro vstupní test 1. Principy kapalinové chromatografie (stacionární fáze – typy kolon, mobilní fáze, detektory, princip spektrofotometrie, Lambert-Beerův zákon) 2. Přepočet hmotnosti na látkové množství, hmotnostního zlomku na hmotnostní koncentraci, hmotnostní koncentrace na molární (látkovou) a naopak, příprava roztoků 3. Vyhodnocení metodou kalibrační křivky, metodou přímého srovnání se standardem 4. Základní struktura a vlastnosti vitaminu C, jeho stabilita, doporučená denní dávka a běžný výskyt v potravinách 5. Flavonoidy, jejich vlastnosti, stabilita a výskyt v potravinách 6. Kofein, jeho vlastnosti a výskyt v potravinách 7. Konzervační látky, jejich použití v potravinách 8. Pravidla bezpečnosti práce a protipožární ochrany (Požadované znalosti jsou v rozsahu přednášek z Chemie potravin a Analytické chemie a navazují na cvičení a přednášky z Analýzy potravin)
Další doporučené otázky o o o o o o
o
o
o
Jaká je stabilita vitaminu C při působení tepla, světla, vzdušného kyslíku…? Jaký je běžný obsah vitaminu C v potravinách? Co to jsou flavonoidy a které látky se nejčastěji vyskytují v potravinách? Jaký je běžný obsah některých flavonoidů v potravinách? Jaké jsou běžné hladiny kofeinu v kávě a energetických nápojích? Jaké je NPM (nejvyšší přípustná množství) kofeinu v potravinách? Jaké konzervační látky znáte a pro jaké potraviny je povoleno jejich použití? Jaká jsou NPM konzervačních látek v potravinách? Kolik g standardu kyseliny askorbové je potřeba pro přípravu 100 ml zásobního roztoku o koncentraci 1 mg/ ml? Jaký objem (ml) odeberete z tohoto zásobního roztoku pro přípravu 10ml standardních roztoků o koncentraci 30, 60, 90 a 120 mg/l? Deklarovaný obsah vitaminu C ve vzorku jablečného džusu je 10 mg/100 ml. Požadovaná koncentrace (s ohledem na rozsah kalibrační křivky) vitaminu C v naředěném vzorku je 50 mg/l. Jak připravíte 10 ml tohoto roztoku? Deklarovaný obsah vitaminu C ve vzorku tablety je cca 100 mg v jedné tabletě. Jaký bude obsah (mg/l) vitaminu C v roztoku získaném rozpuštěním této tablety ve 100 ml extrakčního činidla? Jaký objem (ml) tohoto roztoku potřebuje pro naředění 10 ml roztoku o koncentraci 50 mg/l? 30 g homogenizovaných brambor bylo extrahováno 80 ml 3% roztoku kyseliny metafosforečné. Získaný extrakt byl přefiltrován přes filtrační papír, filtrát byl kvantitativně převeden do 100 ml odměrné baňky a doplněn po značku extrakčním činidlem. 1 ml extraktu byl přefiltrován přes membránový filtr a 20 µl extraktu bylo nastříknuto do kapalinového chromatografu. Plocha odpovídající píku vitaminu C byla A=92. Jaká je výsledná koncentrace vitaminu C v bramborách v mg/kg, je-li rovnice kalibrační křivky y=1,7333x-4,5?
Náplň úlohy 1. Stanovení vitaminu C v nápojích, ovoci a zelenině metodou HPLC/UV, akreditovaná zkušební metoda SZPI Praha (A/11), ČSN EN 14130 (adaptováno pro potřeby výuky) o Sledování stability vitaminu C v průběhu přípravy vzorku, skladování a tepelného zpracování 2. Stanovení kofeinu (případně chlorogenové kyseliny), vitaminu C a konzervačních látek v nápojích ČSN EN 12856 (adaptováno pro potřeby výuky) 3. Stanovení dalších antioxidantů (např. flavonoidů) a sledování jejich stability
upřesnění ke stanovení obsahu vitaminu C v nápojích a vzorcích ovoce, zeleniny sledování vlivu tepelných úprav na obsah vitaminu C a dalších látek o Část studentů bude provádět analýzy v čerstvém vzorku společně s přípravou standardů, část studentů bude sledovat vliv zpracování - tepelné úpravy (vaření, mražení), skladování, různý způsob homogenizace vzorků na hladiny vitaminu C o Porovnání s nutričními tabulkami, vyhodnocení vlivu tepelných úprav, degradace v závislosti na čase nebo teplotě Použité matrice o Ovocné džusy, čaje a bonbóny obohacených vitamínem C, šípky, citronová šťáva (čerstvý vzorek, vzorek po zalití horkou vodou …), čerstvá a tepelně upravená zelenina (brambory, brokolice, kapusta, pór, petržel, paprika, rajčata…) a ovoce. upřesnění ke stanovení kofeinu, vitaminu C a konzervačních látek v nápojích o každý student (případně dvojice) studentů pracuje samostatně (nezávisle na ostatních studentech dané pracovní skupiny) a analyzuje jeden (přidělený) vzorek Použité matrice o Káva, čaj, energetické nápoje upřesnění ke stanovení dalších antioxidantů (např. flavonoidů, kyseliny chlorogenové) a sledování jejich stability o V rámci této úlohy bude provedeno sledování dalších biologicky aktivních látek – např. některých flavonoidů (katechin, rutin, kvercetin), případně sledování obsahu organických kyselin, chlorogenové kyseliny atd. o Pro stanovení uvedených látek budou využity vzorky analyzované v předchozích úlohách (ovoce, zelenina, káva), jednotlivé analyty / skupiny analytů budou ze vzorku extrahovány metodou doporučenou asistentem. V některých případech bude sledován vliv podmínek (viz předchozí úlohy) na stabilitu látek. Tyto analýzy budou realizovány jako doplňkové k předchozím úlohám.
Časový snímek cvičení Operace Úvodní výklad a zkoušení, test Navážení standardů a příprava vzorku Extrakce a filtrace vzorku Výklad k HPLC Měření vzorků Úklid Celkem
Přibližná časová náročnost (min) HPLC/UV 20 min 30 min 30 min 20 min 120 min 20 min 240 min (4 h)
Studenti provádějí alternativně stanovení podle pracovního postupu A či B, úloha může být doplněna o stanovení dalších biologicky aktivních látek v přiděleném vzorku – viz postup C. Každý student zpracovává vlastní vzorek, v případě sledování stability zpracovávají dva studenti stejný vzorek: 1. student - v čerstvém stavu, 2. student - po tepelných a jiných úpravách. Vlastní nálezy kyseliny askorbové a dalších sledovaných látek student porovná s deklarovaným obsahem na obalu vzorku (pokud je uveden), případně s běžnými obsahy uvedenými v dostupné literatuře.
A. Pracovní postup pro stanovení vitaminu C v nápojích, ovoci a zelenině (podle akreditované zkušební metody SZPI Praha (A/11) a ČSN EN 14130; adaptováno pro potřeby výuky)
1. Použitelnost metody Metoda slouží ke stanovení kyseliny askorbové v nápojích, v ovoci a zelenině, v rostlinných výrobcích a ve vitaminových přípravcích.
2. Princip metody Kyselina askorbová se z homogenizovaného materiálu extrahuje roztokem kyseliny metafosforečné. Po filtraci extraktu se její obsah stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí. Identifikace a kvantifikace se provádí metodou vnějšího standardu.
3. Používané přístroje a zařízení o Kapalinový chromatograf – Hewlett Packard Series HP1050 či Hewlett Packard Series HP1100 ( UV detektor, λ= 254 nm) o Analytická kolona s RP C18 nebo RP C8 (250 × 4,6 mm, 5 μm; 125 × 4 mm, 5 μm) o HP Chemstation, Hewlett Packard, USA o o o o o
Analytické váhy Ultrazvuková lázeň Laboratorní mixer nebo homogenizátor, skleněné nebo plastové struhadlo Vařič, nerezový hrnec, rychlovarná konvice Podtlakové filtrační zařízení
4. Chemikálie, roztoky a standardy -
methanol (pro HPLC) demineralizovaná a destilovaná voda kyselina metafosforečná pokud není uvedeno jinak používají se chemikálie čistoty p.a. membránový filtr o porozitě 5 µm běžné laboratorní sklo
kyselina L-askorbová p.a. (PENTA) Příprava standardních roztoků: Připravte zásobní roztok kyseliny L-askorbové o koncentraci cca 1 mg/ml v extrakčním činidle (příprava extrakčního činidla viz bod 5.1).
Pro zhotovení kalibrační křivky připravte standardní roztoky o koncentraci 30, 60, 90 a 120 mg/l v extrakčním činidle (příprava extrakčního činidla viz bod 5.1). Poznámka: Maximální doba použitelnosti standardů je 1 den.
5. Pracovní postup - modifikace normy SZPI Praha (viz příloha návodů) 5.1. Příprava laboratorního vzorku Příprava extrakčního činidla: 3 % roztok kyseliny metafosforečné (tj. roztok 9 ml kapalné kyseliny metafosforečné v 491 ml vody, popř. rozpustit 15 g pevné kyseliny metafosforečné v 500 ml vody). 5.1.1. Pevné vzorky 20 - 25 g pevného vzorku se homogenizuje s 60 - 80 ml extrakčního činidla po dobu 1 minuty. Získaný extrakt se přefiltruje přes filtrační papír, který se několikrát propláchne; případně je možné využít fitrace za pomoci vakua. Filtrát se kvantitativně převede do 100 ml odměrné baňky a doplní po značku extrakčním činidlem. Všechny roztoky vzorků se před nástřikem do kapalinového chromatografu filtrují přes skládaný filtr, popř. membránový filtr. 5.1.2. Kapalné vzorky Tekuté materiály se po dokonalém promíchání (množství se volí podle předpokládaného obsahu, tak aby koncentrace v analyzovaném roztoku odpovídala rozsahu kalibrace 30 – 120 mg/l) převedou do 100 ml odměrné baňky a doplní vodou po značku. Před nástřikem do kapalinového chromatografu je nutné extrakt přefiltrovat přes membránový filtr. 5.1.2. Tableta Tabletu je nutno zvážit a rozdrtit, na základě výpočtu student naváží příslušné množství tablety dle deklarovaného obsahu vitaminu C do požadovaného objemu (25, 50 nebo 100 ml – bude specifikováno asistentem), tak aby výsledná koncentrace vitaminu C byla v rozsahu kalibrační křivky. Poznámka: V případě nutnosti (odezva je mimo rozsah kalibrace) je možné vzorek dále ředit extrakčním činidlem (kyselinou metafosforečnou). Sledování stability vitaminu C v průběhu přípravy vzorku, skladování a tepelného zpracování Pevné vzorky Vzorky ovoce a zeleniny jsou zahřívány v páře v nerezovém hrnci – podmínky dle určení asistenta Kapalné vzorky, čaje s obsahem vitaminu zorek je zalit horkou vodou, případně skladován za definovaných podmínek - podmínky dle určení asistenta
5.2. Stanovení kapalinovou chromatografií
Analytická kolona: Mobilní fáze: Průtok mobilní fáze: Detekce: Objem nástřiku: Teplota kolony:
analytická kolona s RP C18 nebo RP C8 (250 × 4,6 mm, 5 m; 125 ×4,6 m, 5 m;) s předkolonkou methanol : voda (5:95, v/v) pH3 (H3PO4) (připravená mobilní fáze se odplyní v ultrazvukové lázni po dobu 10 minut) 1 ml/min UV 254 nm 20 µl laboratorní teplota
6.3. Identifikace a kvantitativní vyhodnocení Identifikace se provádí porovnáním retenčního času analytu ve vzorku s retenčním časem kalibračního standardu. Další možností identifikace látky je přídavek standardu ke vzorku. Kvantitativní vyhodnocení se provádí metodou vnějšího standardu buď odečtením koncentrace analytu z kalibrační křivky (tj. závislosti plochy, příp. výšky píku na koncentraci standardu v g/l v rozsahu jednoho řádu; koncentrace analytu ve vzorku musí ležet v intervalu mezi nejnižším a nejvyšším bodem kalibrační přímky) a přepočtem na původní vzorek nebo porovnáním plochy, případně výšky píku sledovaného analytu a standardu podobné koncentrace a přepočtem na původní vzorek.
B. Pracovní postup pro stanovení kofeinu, chlorogenové kyseliny a konzervačních látek v nápojích (podle ČSN EN 12856; adaptováno pro potřeby výuky)
1. Použitelnost metody Metoda má univerzální použití pro nápoje (čaj, káva, energetické nápoje, aj.).
2. Princip metody Kofein a další sledované látky se z homogenizovaného materiálu extrahuje vodou (pro rozpustné nápoje, čaj, kávu). V extraktu se stanoví po filtraci metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí. Identifikace a kvantifikace se provádí metodou vnějšího standardu.
3. Používané přístroje a zařízení - analytické váhy - ultrazvuková lázeň - HPLC systém (Hewlett Packard 1050 či HP 1100 s UV detektorem) - analytická kolona s RP C18 (125 × 4,6 mm, 5 μm) - běžné chemické sklo a laboratorní materiál
4. Chemikálie, roztoky a standardy - destilovaná voda - methanol - standardy (kyseliny sorbové, kyseliny benzoové, kyseliny chlorogenové a kofeinu) budou poskytnuty asistentem jako pevné látky či roztoky - mobilní fáze: MeOH/acetátový pufr (3/7, v/v);
5. Pracovní postup 5.1 Příprava vzorků – káva, čaj 1 g vzorku se naváží do 150 ml kádinky s přesností na 0,01 g. Přelije se 30 – 60 ml vroucí destilované vody a ponechá se 5 minut louhovat. Po důkladném promíchání se směs přefiltruje přes skládaný filtr do 100 ml odměrné baňky a doplní destilovanou vodou. Čirý filtrát se zředí 5 – 10 mobilní fází a nastřikuje se do dávkovací smyčky kapalinového chromatografu. 5.2 Příprava tekutých vzorků Vzorek se dokonale promíchá a krátce odplyní v ultrazvukové lázni. Poté se přefiltruje přes mikrofiltr do vialky Čirý filtrát se nastřikuje do dávkovací smyčky kapalinového chromatografu.
5.3. Stanovení kapalinovou chromatografií Analytická kolona: Mobilní fáze: Průtok mobilní fáze: Detekce: Objem nástřiku: Teplota kolony:
analytická kolona s RP C18e (125 × 3 mm, 5 m;) spředkolonkou mobilní fáze: MeOH/acetátový pufr (3/7, v/v); 1 ml/min UV 273 nm pro kofein, 254 nm pro kyselinu sorbovou, 228 nm pro kyselinu benzoovou 10 nebo 20 µl laboratorní teplota
5.4 Identifikace a kvantitativní vyhodnocení Identifikace se provádí porovnáním retenčních časů píku ve vzorku s retenčním časem standardní látky. Pro kvantifikaci se připraví roztoky směsných standardů o čtyřech koncentracích: 50, 100, 200 a 400 µg/ml, naředěním zásobních roztoků standardů (c = 1000 µg/ml). Kvantitativní vyhodnocení se provádí metodou vnějšího standardu buď odečtením koncentrace analytu z kalibrační křivky (tj. závislosti plochy, příp. výšky píku na koncentraci standardu v µg/ml v rozsahu jednoho řádu, koncentrace analytu ve vzorku musí ležet uvnitř mezi nejnižším a nejvyšším bodem kalibrační přímky) a přepočtem na původní vzorek nebo porovnáním plochy, případně výšky píku sledovaného analytu a standardu podobné koncentrace a přepočtem na původní vzorek Obsah kofeinu (případně konzervačních látek nebo kyseliny chlorogenové) v nealkoholických nápojích uvádějte v mg/l nápoje, koncentrace v kávě a čaji v mg/kg. Rozsah kalibrační křivky pro další sledované analyty bude specifikován asistentem.
C. Pracovní postup pro stanovení antioxidantů a jejich stability v ovoci, zelenině a v nápojích
1. Použitelnost metody Metoda je použitelná pro sledování vybraných analytů v nápojích a rostlinných materiálech
2. Princip metody Biologicky aktivní látky se z homogenizovaného materiálu extrahují vodou či metanolem (případně jejich směsí). V extraktu se stanoví po filtraci metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí. Identifikace a kvantifikace se provádí metodou vnějšího standardu.
3. Používané přístroje a zařízení - analytické váhy - ultrazvuková lázeň - HPLC systém (Hewlett Packard 1050 či HP 1100 s UV detektorem) - analytická kolona s RP C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm; 125 × 4 mm, 5 μm) - běžné chemické sklo a laboratorní materiál
4. Chemikálie, roztoky a standardy - destilovaná voda - kyselina fosforečná konc. (p.a.) - methanol - zásobní standardní roztoky sledovaných látek – budou dodány asistentem - mobilní fáze: methanol/voda/kyselina fosforečná (25/74/1, v/v/v) - standardy budou poskytnuty asistentem jako pevné látky či roztoky
5. Pracovní postup Příprava vzorků Vzorek je homogenizován a extrahován vodou či metanolem (případně jejich směsí). Navážka a množství extrakčního činidla bude upřesněno asistentem. V extraktu se stanoví po dalším případném naředění a filtraci obsah sledovaných látek metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí. Identifikace a kvantifikace se provádí metodou vnějšího standardu (viz. Postup A a B).
Vybavení pracovního stolu
kompletní dokumentace k úloze – 4 kopie
Laboratorní sklo: filtrační nálevka (4×) váženka (2×) odměrná baňka 10 ml (5×), 25 ml (1×), 50 ml (3×), 100 ml (3×), 250 ml (2×), 500 ml (2×), skleněné zátky pipeta 1 ml (2×), 10 ml (2×), 5 ml (2×), 2 ml (1×) Pasteurovy pipety, dudlík (1×) odměrný válec 50 ml (1×), 250 ml (1×) kádinka 150 ml (2×), 100 ml (2×), 50 ml (2×) odsávací baňka (1×) Erlenmeyerova baňka 250 ml (1×), 1000 ml (2×) Bűchnerův nástavec (2×) tmavá zásobní láhev vývěva Laboratorní potřeby: stříkačka 500 l (Hamilton) (1×) lžička (2×) pipetovací balónek filtrační papíry membránové filtry 5 m střička (2×) struhadlo mixér prkénko na krájení nůž Chemikálie: kyselina L-askorbová kyselina metafosforečná methanol kyselina fosforečná (v laboratoři ve skříni s anorganickými kyselinami)
Požadavky na protokol Jméno: Petr Novák
Jméno asistenta: Ing. Antonín Dvořák
Skupina, den měření: (pondělí odpoledne) Datum konání práce: 18. 9. 2011 ___________________________________________________________________________
Název práce: Stanovení vitaminů, kofeinu, antioxidantů a konzervačních látek metodou kapalinové chromatografie s UV detekcí Konkrétní činnost studenta (např. Stanovení vitaminu C ve vzorcích brambor, vliv tepelného zpracování na obsah vitaminu C) Označení a popis analyzovaného vzorku: (např. brambory, odrůda Katka, raná; tableta s obsahem vitaminu C, Celaskon, č. šarže, deklarovaný obsah výrobcem) Princip metody: stručně Postup práce: stručně, uvést odkaz na normy, uvést odchylky od postupu, veškeré navážky, podmínky experimentu, výpočty (detailně a v chronologickém pořadí: příprava zásobních roztoků, ředění kalibrace, kalibrační křivka, výpočet obsahu sledované látky ve vzorku) Výsledek: zaokrouhlit, podtrhnout, jednotky Diskuse: diskutovat vlastní výsledky, porovnat s fakty dostupnými v literatuře a informacemi z předchozího studia, posoudit případný vliv podmínek na stabilitu, nalezené hladiny porovnat s hladinami uváděnými v literatuře případně s hladinami deklarovanými výrobcem (tableta, energy drink) Závěr: slovně celou větou Podpis Poznámka: Pokud jsou k protokolu přikládány grafické materiály (chromatogramy, kalibrační křivky, grafy ..), musí být na nich uvedeno jméno a skupina a musí být k protokolu pevně připojeny!
Klasifikace Do klasifikace bude zahrnuto: o Příprava na úlohu, kontrola požadovaných znalostí o Výsledky kontrolního testu / zkoušení o Správnost základních výpočtů v protokolu a dodržení formálních požadavků na protokol o Celková práce v laboratoři a přístup studenta o Úklid v laboratoři a dodržování organizačních pravidel
Přílohy
UV spektra sledovaných analytů
Akreditovaná zkušební metoda SZPI Praha (A/11) – stanovení kyseliny askorbové v potravinách metodou HPLC
ČSN EN 14130 – Potraviny – Stanovení vitaminu C metodou HPLC – titulní list
Obsah vitaminu C, chlorogenové kyseliny a kofeinu v některých potravinách
Velíšek J., Hajšlová J.: Chemie potravin, 3. vydání, OSSIS, Tábor, 2009. Sbírka zákonů č. 52/2002 Podmínky použití kofeinu a chininu při výrobě potravin
Sbírka zákonů č. 304/2004, část 6 – Konzervanty a antioxidanty, oddíl A - kyselina sorbová, benzoová a p-hydroxybenzoová
ČSN EN 12856 – Potraviny – Stanovení acesulfamu-K, aspartamu a sacharinu – stanovení pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (možno též použít pro stanovení kofeinu, sorbové a benzoové kyseliny v potravinových materiálech) - výběr
UV spektra sledovaných analytů Kyselina askorbová 12 mg/l *D A D 1 , 1 .8 3 4 (2 8 .6 m A U , - ) R e f= 1 .5 9 4 & 2 .0 4 1 o f 1 0 1 0 0 5 0 0 0 0 0 0 .D m AU
25
20
15
10
5
0 200
220
240
260
280
300
nm
Kyselina chlorogenová 250 mg/l *D A D 1 , 9 .2 6 1 (7 3 8 m A U , - ) R e f= 8 .6 9 5 & 9 .9 0 1 o f 1 1 0 9 0 7 0 0 0 0 0 0 .D m AU 700
600
500
400
300
200
100
0 200
225
250
275
300
325
350
375
nm
Kofein 250 mg/l *D A D 1 , 1 1 .0 3 6 (1 8 4 1 m A U , - ) R e f= 2 .8 0 9 & 1 4 .9 9 6 o f 1 1 0 9 0 7 0 0 0 0 0 4 .D m AU 1750
1500
1250
1000
750
500
250
0 200
225
250
275
300
325
350
375
nm
Kyselina sorbová 50 mg/ml DAD1, 11.507 (389 mAU, - ) of 033-0301.D mAU
350
300
250
200
150
100
50
0
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
nm
