HALFJAARLIJKS INFOBLAD - NR. 4
JUNI 2010
Labinfo Verantwoordelijke uitgever : Gil Houins
Informatieblad voor de erkende laboratoria voedselveiligheid
p. 4
Standaardovereenkomst FAVV-NRL
p. 6
Fytopathologie
p. 10
Materialen bestemd om met levensmiddelen in aanraking te komen
p. 13
Mycotoxinen
p. 16
Mariene toxines
p. 18
Melamine in levensmiddelen: van de crisis tot de accreditatie
p. 22
Melk en melkproducten
p. 27
Workshops & Symposia
FAVV AC-Kruidtuin - Food Safety Center Kruidtuinlaan 55, 1000 Brussel
Fytopathologie
NRL
N AT I O N A L E REFERENTIE LABORATORIA
NRL
N AT I O N A L E REFERENTIE LABORATORIA
Labinfo Informatieblad voor de erkende laboratoria voedselveiligheid
Redactiegroep Dirk Courtheyn, Mieke De Mits, Conny De Schepper, Alain Dubois, Marc Evrard, Alain Laure, Bert Vandenborre, Mieke Van de Wiele, Eva Wevers en Marie-Christine Wilem. Auteurs van dit nummer Geert De Poorter, Fanny Di Silvestro, Sandrine Léonard, Johan Van Vaerenbergh, Fabian Etienne-Thewissen, Bart Huybrechts, Emmanuel Tagni, Mirjana Andjelkovic, Séverine Goscinny, Vincent Hanot, Wim Reybroeck, Koen De Reu en Jessy Claeys. Vertaling Vertaaldienst van het Agentschap Redactiegroep Foto’s en illustraties Aangebracht door de laboratoria Vormgeving Gert Van Kerckhove Redactieadres LabInfo p.a. D. Courtheyn FAVV AC-Kruidtuin - Food Safety Center 4de verdieping, bureel K04/120218 Kruidtuinlaan 55, 1000 Brussel Tel.: 02.211.87.33
[email protected]
2
Editoriaal Beste lezer, Langzaam maar zeker kruipt de economie terug uit het dal. Globaal genomen hebben de analytische laboratoria deze crisis vrij goed doorstaan. Analyses in het kader van de autocontrole en de controle zijn min of meer gelijk in aantal gebleven. De overheid heeft ook zijn processen herzien om de betalingen stipter uit te voeren. Via Foodlims en de TSE betalingen had het FAVV hierop reeds geanticipeerd. Het spreekt vanzelf dat we de stiptheid van betalingen verder zullen zetten in de toekomst op voorwaarde dat de dienstverlening correct is uitgevoerd. Op het vlak van automatisering en administratieve vereenvoudiging staat het FAVV niet stil. Binnen het project Foodlims is de module “PT Schemes” gelanceerd die labmanagers moet toelaten om de resultaten van alle interlaboratorium vergelijkingen, waaraan zijn/ haar laboratorium heeft deelgenomen, beter op te volgen. Deze module is al beschikbaar voor de eigen FAVV labs en zal in het tweede semester van 2010 gelanceerd worden voor de externe laboratoria. Ondertussen is ook de openbare aanbesteding voor de TSE laboratoria lopende waarbij waarschijnlijk vanaf augustus 2010 het huidige systeem met 17 laboratoria zal herzien worden naar een nieuw systeem met nog 4 laboratoria. In dit nummer van LABINFO vindt u opnieuw heel wat interessante artikelen over actuele onderwerpen in de agro-voedingssector (op analytisch-microbiologisch vlak wel te verstaan). De auteurs zijn werkzaam in de eigen FAVV labs en de Nationale Referentie Laboratoria (NRL). Wat deze laatste betreft zal er een malus systeem worden ingevoerd in het kader van de werkingsovereenkomsten die zijn afgesloten tussen het FAVV en de NRL. Dit houdt concreet in dat als de NRL de doelstellingen niet halen zij gesanctioneerd worden en een deel van hun dotatie niet krijgen. In het kader van totale transparantie zijn deze doelstellingen en Kern Perfomantie Indicatoren (KPI’s) terug te vinden op de beveiligde website. And last but not least: binnenkort zal de beveiligde website in een nieuw jasje gestoken worden. Veel leesplezier. Geert De Poorter Directeur-generaal Laboratoria
3
Standaardovereenkomst FAVV-NRL Concrete invulling van de samenwerking tussen het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen en de nationale referentielaboratoria: te volgen procedure en vastlegging van een standaardovereenkomst* Het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen kan zich laten bijstaan door derden om zijn opdracht als bewaker van de veiligheid van de voedselketen en de kwaliteit van het voedsel ter bescherming van de gezondheid van consumenten, naar behoren te vervullen (art.4 §5 van de wet van 04/02/2000 (1) ). Het Agentschap koos in dat verband voor een samenwerking met een tiental nationale referentielaboratoria (NRL) en haalde zo een aanzienlijke hoeveelheid technische en wetenschappelijke expertise binnen. Om de relatie tussen het Agentschap en elk van die NRL te optimaliseren worden, met het oog op de organisatie van het netwerk van referentielaboratoria, overeenkomsten afgesloten met die partners die het mogelijk maken om de prestaties van de laboratoria te volgen aan de hand van prestatie-indicatoren. Dit stagewerk beoogde een standaardovereenkomst op te stellen, die zou kunnen worden gebruikt bij elke samenwerking met een referentielaboratorium, en een beschrijving te geven van de verschillende stappen die het ontwerp moet doorlopen voordat ze door de overeenkomst sluitende partijen wordt ondertekend. Er werd daarbij een procedure uitgeschreven als redactionele ondersteuning voor het opmaken van dergelijke overeenkomsten. Onder overeenkomst wordt verstaan : « handeling waarbij een of meer personen zich jegens een of meer andere personen tot of omtrent iets verbinden (syn. contract) » (definitie in van Dale, Groot woordenboek der Nederlandse taal). Een overeenkomst bestaat uit meerdere hoofdstukken en artikelen waarin de overeenkomst sluitende partijen worden aangeduid, het partnerschap kan worden gerechtvaardigd, de rechten en plichten van elkeen kunnen worden omschreven en de financiering van de taken kan worden geregeld alsook de voortgangsbewaking van die taken in stuurgroepen. De verbintenis van een NRL om diensten te presteren in opdracht en/of voor rekening van het Agentschap is een opdracht voor aanneming van diensten die wordt aangerekend op de rijksbegroting, zoals bedoeld in de wet van 24/12/1993 (2) . Zij moet dan ook, al naargelang van het betreffende bedrag, in een vastgelegde volgorde aan verscheidene instanties worden voorgelegd: • voor advies aan de Inspecteur van Financiën; • voor akkoordbevinding aan de Minister die bevoegd is voor de begroting; • voor akkoordbevinding aan de Ministerraad. Als al die adviezen/akkoordbevindingen zijn verkregen, kan de overeenkomst ter ondertekening aan de overeenkomst sluitende partijen worden voorgelegd. Het duurt gemiddeld 5 tot 6 maand om een dergelijke overeenkomst rond te krijgen. Er kunnen daarbij verschillende fasen worden onderscheiden: opstellen van de tekst en de stappen die moeten worden gezet om adviezen/akkoordbevinding van de diensten voor begrotingscontrole te verkrijgen.
Fanny Di Silvestro
[email protected] *(stagewerk ingediend in samenhang met de van 01/07/2008 tot 30/06/2009 gedane stage met het oog op statutarisering in niveau A)
(1) Wet van 04 februari 2000 houdende oprichting van het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen (2) Wet van 24 december 1993 betreffende overheidsopdrachten en sommige opdrachten voor aanneming van werken, leveringen en diensten
4
X+28
(1,5 tot 2 maand
X+20
(10 dagen
Opmaken van dossier voor IF en toezending aan GB ter ondertekening
Dossier toegezonden aan IF (1 maand)
Onderzoek dossier door IF
X+14
Verstrekking advies IF (2 weken)
X+10
(1 maand)
Dossier naar Kabinet verzonden om akkoordbevinding van Min van Begroting te vragen
Opmaken dossier voor Minister van Begroting en toezending ter ondertekening aan GB en dan aan Kabinet
Onderzoek dossier door Min van Begroting
X+6
Verstrekking akkoordbevinding Min van Begroting (2 weken)
X+4
Dossier naar Kabinet verzonden om akkoordbevinding Ministerraad te vragen
Opmaken dossier voor Ministerraad en toezending ter ondertekening aan GB en dan aan Kabinet
(1 tot 2 weken)
Inschrijving als agendapunt van volgende Ministerraad
X+2
Verstrekking akkoordbevinding Ministerraad (1,5 tot 2 weken)
Week X
Overeenkomst ondertekend
IF : Inspecteur van financiën GB : Gedelegeerd bestuurder
Overeenkomst aangevuld met data van diverse adviezen/akkoordbevindingen en toezending ter ondertekening
Tijdlijn
in weken
Scannen document en publicatie op intranet
5
Tijdlijn voor het uitwerken van een overeenkomst tussen het FAVV en een externe partner
X+18
LAB P 515-D009-v01-fr
Draft overeenkomst
Bespreking tussen overeenkomst sluitende partijen
Fytopathologie Stand van zaken betreffende analysemethoden in de fytopathologie Planten zijn een onmisbare schakel in de voedselketen. Door fytopathogenen veroorzaakte ziekten verstoren daarom het evenwicht en dat heeft soms zware gevolgen voor de economie en de volksgezondheid. Om problemen, of erger nog, verspreiding ervan, te vermijden is bewaking noodzakelijk. Twee aspecten moeten daarbij alle aandacht krijgen: internationale communicatie waarbij de ruimtefactor in aanmerking wordt genomen en de ontwikkeling van analysemethoden die een nauwkeurige diagnose mogelijk maken. Er bestaan op diverse niveaus, nationaal en internationaal, reeds veel organisaties die zich bezighouden met plantengezondheid. Een opmerkelijk voorbeeld daarvan is de EPPO, de Plantenbeschermingsorganisatie voor Europa en het gebied van de Middellandse Zee, waarbij een vijftigtal landen betrokken zijn. Die organisatie is op meerdere niveaus actief: werkgroepen, groepen van deskundigen die uiteenlopende onderwerpen onderzoeken, verspreiding van diagnoseprotocols, publicatie van wetenschappelijke artikelen, lijsten en indelingen van schadelijke organismen, verzameling van illustraties van ziekten, organisatie van conferenties, bijhouden van een jaarboek van laboratoria, enz. Met betrekking tot de diagnosemethoden is het zo dat thans meerdere, zowel klassieke als moderne, analytische benaderingen worden toegepast. Er duiken geregeld nieuwe methoden op die in het bijzonder een verbetering nastreven van de 6 sleutelcriteria : snelheid, gebruiksgemak, niveau van de aangeleverde informatie (specificiteit), gevoeligheid, betrouwbaarheid en kostprijs. De eerste benadering van een zieke plant is vooral visueel. In een aantal gevallen kan een voordiagnose worden gesteld op grond van de symptomen die de planten vertonen (misvormingen, letsels, verkleuringen, …) of van de aanwezigheid van organismen of van sporen daarvan (insecten, eieren, afscheiding, gangen, …). Doorgaans is echter een bevestiging via laboratoriumonderzoek vereist. Dat geldt des te meer aangezien sommige ziekten latent of asymptomatisch voorkomen.
Foto links: witte roest op chrysant. Foto in het midden: bacterievuur op peer, met zichtbare afscheiding. Foto rechts: nest van processierupsen in een spar. De analysemethoden van laboratoria steunen op een aantal identificatieprincipes waarvan de meeste behoren tot een van de volgende categorieën: observeren van de ziekteverwekker (met het blote oog of met een optisch instrument), in vitro kweek, biotest (test op planten), nucleïnezuuranalyse (DNA/RNA), eiwitanalyse, vetzuuranalyse, serologische test (met antistoffen), voedings- en enzymonderzoek. Meerdere principes kunnen in één test worden gecombineerd. Dat gebeurt bijvoorbeeld bij immunofluorescentie waarbij onder de microscoop organismen worden bekeken die gemerkt zijn met specifieke antistoffen die gekoppeld zijn aan een fluorochroom. Naast de tests uit de grote categorieën worden in bepaalde bijzondere gevallen nog andere tests gebruikt (bijvoorbeeld water-streaming of test met in water lopende witte vloeistof voor ringrot, kleuring met DAPI (4,6-diamidino-2phenylindole) voor fytoplasmen, meten van stikstofgehalte en pigmentgehalte, …).
6
Foto links: in vitro kweek van de bacterievuurbacterie. Foto in het midden: immunofluorescentie op de bruinrotbacterie. Foto rechts: enzymonderzoek op ringrotbacterie. Van de methoden die thans de voorkeur genieten, is de moleculaire biologie een van de belangrijkste. Ze kan worden toegepast op alle levende organismen, vergt slechts kleine hoeveelheden materiaal en levert zeer nauwkeurige informatie aan. De klassieke PCR-techniek wordt daarbij algemeen gebruikt, eventueel in combinatie met analyses van restrictieprofielen (enzymen die DNA afbreken), toegepast op een welbepaald doel of een heel genoom (RFLP-, AFLP-technieken). Als moderne methode lijkt real time PCR algemeen te zullen worden toegepast. Het gebruik van bestaande technologieën om diagnoses te stellen is ook een nieuwe benadering in de fytopathologie, bijvoorbeeld DNA-microarray en sequentieanalyse. In verband met sequentieanalyse dient aangestipt dat thans ook wordt gewerkt aan de ontwikkeling van nieuwe, zogenaamde tweedegeneratiemethoden die krachtiger en minder duur zijn. Tot slot wordt gewerkt aan een internationaal « Barcoding » project dat als doel heeft aan elk levend organisme en aan alle fytopathogenen een unieke « streepjescode » toe te kennen die bestaat uit één of meer korte DNA-sequenties om eenvoudiger en met een grotere betrouwbaarheid diagnoses te kunnen stellen.
Foto links: real time PCR. Foto in het midden: DNA barcoding-project. Foto rechts: tweedegeneratiesequentieanalyse Daarnaast worden nog andere in mindere of meerdere mate gedurfde moderne methoden voor fytopathologen ontwikkeld of reeds toegepast, zo bijvoorbeeld de elektronische neus (herkenning van vluchtige moleculen, analyse van het iso-elektrische punt, Lateral Flow Devices (principe van de zwangerschapstest), PCR-varianten (LAMP-PCR bij constante temperatuur, Proximity ligation met koppeling van DNA en antistoffen, enz.), akoestische analyses voor houtboorders, satellietbeelden om bossen te bewaken, enz.
Foto links: Lateral Flow Device tests op staafjes. Foto in het midden: akoestische analyses. Foto rechts: satellietbeelden
Sandrine Léonard (LFSAGx, Gembloux)
[email protected]
7
Feedback over Symposia De European Association of Phytobacteriologists (EAP) (Europese Vereniging van Fytobacteriologen) De EAP werd begin 2007 opgericht door experten-fytobacteriologen uit acht EU-lidstaten met als doel de samenwerking te bevorderen op het gebied van de diagnose, de opsporing, de identificatie en de classificatie van bacteriële fytopathogenen . De vereniging richt zich in het bijzonder tot fytobacteriologen van laboratoria, agentschappen of instellingen (specifiek van de overheid) die actief werkend zijn in diagnosestelling en analyse van plantschadelijke bacteriën, in het bijzonder deze die wetgevend zijn gereguleerd. Er werd een oprichtingsakte (Charter of Foundation) opgesteld die op 5 februari 2007 werd goedgekeurd door het uitvoerend comité. Op 28 oktober 2008 keurde dat comité een nieuwe versie van de akte goed. De doelstellingen van de EAP zijn: • ontwikkelen, verbeteren en implementeren van diagnose, opsporing, identificatie en classificatie van bacteriële ziekteverwekkers bij planten; • aanleren en inoefenen van de principes en methoden van de fytobacteriologie; • advies en expertise verschaffen aan diensten die bevoegd zijn voor de plantengezondheid; • technische en wetenschappelijke samenwerking bevorderen; • informatie uitwisselen via communicatienetwerken. De belangrijkste door de EAP met het oog daarop opgezette activiteiten zijn: • ontwikkelen, standaardiseren, aanpassen, bijwerken en valideren van bestaande en nieuwe diagnosemethoden, voor al dan niet gereguleerde bacteriële plantenziekteverwekkers; • organiseren van ringonderzoeken, bekwaamheidsproeven voor de validatie van analysemethoden; • inrichten van workshops over welbepaalde thema’s; • exploreren van samenwerking in onderzoek; • vergemakkelijken van toegang tot databanken (bijv. kweekcollecties, nucleïnezuursequenties, antistoffen, gevalideerde testprotocollen, ...); • een website uitbouwen en onderhouden; • een nieuwsbrief uitgeven; • een discussieforum oprichten en animeren; • de aangesloten leden een jaarvergadering laten organiseren. Lidmaatschap van de EAP is individueel. Er moet geen lidmaatschapsbijdrage worden betaald. Het uitvoerend
8
comité maakt een onderscheid tussen de volgende leden: • gewone leden die zich op de website registreren en toegang hebben tot de belangrijkste informatiemiddelen van de EAP; • expertleden (“fellow members”) met ten minste 10 jaar ervaring op het gebied van diagnose, opsporing, identificatie en classificatie van bacteriële ziekteverwekkers bij planten zoals blijkt uit de aanvraag om expert-lid te worden en zoals goedgekeurd door het uitvoerend comité van de EAP; • ereleden, die worden benoemd door het uitvoerend comité als erkenning van hun carrière in de diagnostische fytobacteriologiek. J.D. Janse, fytobacterioloog bij de NAK (Nederland) is voorzitter van de vereniging. J. Van Vaerenbergh, fytobacterioloog bij het ILVO (België) borgt het secretariaat van de EAP. De eerste gewone vergadering van de EAP vond tegelijk plaats met het EPPO Panel on Bacterial Diseases in Izmir, Turkije, op 4 en 5 februari 2009. De volgende onderwerpen kwamen aan bod: • aankondiging van de website www.eapnet.eu en sollicitatieformulier voor aanmelding als expertlid. De website is tijdelijk ondergebracht op de server van het ILVO en is bereikbaar op www.ilvo.vlaanderen.be\eap. • EUPHRESCO-projecten (interlaboratoriumonderzoek over Clavibacter & Ralstonia, test op Pantoea stewartii); • Samenwerking bij aanlevering van resultaten van interlaboratoriumonderzoek (derdelijnscontrole) met het oog op ISO17025 accreditatie (bijv. uitwisseling van IF-glaasjes, DNA extracten, enz...); • Validatie van real-time PCR methoden; • pectinolytische Erwinia (Pectobacterium en Dickeya) op pootaardappelen; • gensequenties voor identificatie en fylogenie van fytopathogene Pseudomonas en Xanthomonas; • bespreking van criteria voor gereglementeerde plantenziekteverwekkende bacteriën. De tweede gewone vergadering van de EAP heeft tegelijk met de vergadering van het EPPO Panel on Bacterial Diseases plaats gevonden op 24/25 maart 2010 in Ljubljana, Slovenië.
Johan Van Vaerenbergh (ILVO Plant, Merelbeke)
[email protected]
9
Materialen bestemd om met levensmiddelen in aanraking te komen De levensmiddelenindustrie is de grootste verbruiker van verpakkingen en is goed voor 66 % van de omzet van de sector verpakkingen. Ze wordt ook het vaakst en in alle productiestadia geconfronteerd met reglementaire eisen. Naast de verpakkingen zijn er nog een groot aantal verschillende voorwerpen of containers die met levensmiddelen in aanraking kunnen komen. Het risico voor wederzijdse overdracht tussen die voorwerpen of materialen en de levensmiddelen mag niet als onaanzienlijk worden afgedaan. Als een voorwerp geschikt is om met levensmiddelen in contact te komen, wil dat zeggen dat het materiaal waaruit het bestaat voldoet aan de reglementaire eisen die garanderen dat er bij consumptie van de eetwaren of dranken die met het voorwerp in aanraking komen geen risico’s zijn die een gevaar kunnen inhouden voor de menselijke gezondheid. Die geschiktheid komt aan bod in verordening (EG) nr. 1935/2004 met betrekking tot materialen en voorwerpen zoals : • onmiddellijke verpakkingen en eindverpakkingen; • recipiënten en keukengerei, machines en materialen die worden gebruikt bij de productie, de opslag of het vervoer van levensmiddelen; • fles- en fopspenen. De verordening is van toepassing op voor mensen bestemde voedingsmiddelen en dranken, ongeacht of het gaat om eindproducten of om intermediaire producten. Naast de raamverordening bestaan er nog een aantal specifieke verordeningen of richtlijnen die inertiecriteria vastleggen voor bepaalde materialen (plastiek, keramiek, folie van geregenereerde cellulose) en voorzien in voorschriften voor de normcontrole. De specifieke regelgeving legt inertiecriteria vast die zijn aangepast aan de aard van de materialen.
10
Het inertieprincipe wordt uitgedrukt als totale migratielimiet en specifieke migratielimiet (SML). De totale migratie is gelijk aan de som van de migraties van de bestanddelen waaruit het materiaal of het voorwerp bestaat. De specifieke migratielimiet is de limiet voor een welbepaald bestanddeel. De Europese regelgeving werkt met positieve lijsten. Dat zijn lijsten van stoffen die mogen worden gebruikt in de fabricage van materialen. Zij gaan uit van DG-Sanco. De Amerikaanse wetgeving werkt met negatieve lijsten. Alle stoffen die niet op die lijsten vermeld zijn, zijn toegestaan. Sommige richtlijnen zijn omgezet in het Belgisch recht. Zij hebben betrekking op een bepaald materiaal of een materiaaltype. Vanuit een streven naar een hoge bescherming van de menselijke gezondheid en het menselijk leven steunt de levensmiddelenwetgeving op risicoanalyse. De Europese Unie vraagt aan elke lidstaat om een nationaal controleplan op te maken dat algemene informatie bevat over de structuur en de organisatie van de officiële controlesystemen. Om aan die eisen te voldoen wordt de globale of de specifieke migratie onderzocht in ofwel de laboratoria van het FAVV, ofwel externe laboratoria. Het LFSAL voert sinds januari 2010 analyses uit in verband met de specifieke migratie van bisfenol A, formaldehyde en diaminodifenylmethaan.
ONDERZOEKSOMSTANDIGHEDEN : Het algemene principe van de analyses met betrekking tot migratie bestaat erin dat het materiaal in omstandigheden wordt gebracht die representatief zijn voor de omstandigheden waarin het wordt gebruikt. Gedistilleerd water
Simulatiestof A
Azijnzuur (3% p/v)
Simulatiestof B
Ethanol 10% (v/v)
Simulatiestof C
Geraffineerde olijfolie
Simulatiestof D
Tabel 1 : vloeibare simulatiestoffen Omdat het moeilijk is om het materiaal samen te brengen met alle levensmiddelen waarmee het in aanraking kan komen, gebeurt de migratieanalyse met behulp van vloeibare simulatiestoffen. Bij het migratieonderzoek worden de temperatuur, de duur en de simulatiestof bepaald al naargelang van de reële gebruiksomstandigheden of van het worst case scenario. Figuur 1 geeft het stroomschema weer van een analyse van de totale migratie. De totale migratie wordt berekend door het verschil te berekenen tussen het aanvankelijke gewicht van het monster en het gewicht ervan na beëindiging van de proef. De totale migratielimiet wordt uitgedrukt in mg/dm2 materiaal.
11
Fig. 1 : stroomschema van een analyse van de totale migratie Om de specifieke migratie te analyseren wordt een deel van de simulatiestof geanalyseerd met HPLC of GC als het gaat om plastiek en met ICP als het gaat om keramiek. De specifieke migratielimiet wordt uitgedrukt in mg/kg simulatiestof of in mg/dm2 materiaal. De migratieonderzoeken worden uitgevoerd door vulling, onderdompeling of in een migratiecel. Onderzoeken in migratiecellen worden vooral uitgevoerd voor plastiekfolie met een dikte van minder dan 0,5 mm waarvan één zijde aan het levensmiddel wordt blootgesteld. Onderzoeken door onderdompeling worden toegepast op gereedschap en voorwerpen waarvan beide zijden met levensmiddelen in contact kunnen komen.
Fig. 3 : migratieproef door onderdompeling
Fig. 2: proef in migratiecel
Voor voorwerpen die maar eenmaal worden gebruikt, gebeurt de analyse op de eerste migratie en voor herbruikbare voorwerpen gebeurt de analyse op de derde migratie. Fabian Etienne-Thewissen (LFSAL, Liège)
[email protected]
12
Mycotoxinen Evaluatie van commerciële sneltesten voor deoxynivalenol (DON) in graanproducten Mycotoxinen zijn secundaire metabolieten van schimmels die een reeks van toxische en carcinogene effecten kunnen hebben indien gecontamineerd voedsel geconsumeerd wordt. Mycotoxinen zijn de laatste jaren actueler geworden door de toegenomen aandacht voor voedselveiligheid. Ze zijn stabiel onder de meeste omstandigheden waaraan voedsel wordt blootgesteld tijdens verwerking. Bijgevolg is het nagenoeg onmogelijk ze te verwijderen eens voedsel gecontamineerd is. Identificatie van aangetaste batches moet dan ook zo snel en betrouwbaar mogelijk gebeuren. Analysemethoden voor mycotoxinen zoals vloeistofchromatografie met ultraviolet of massaspectrometrische detectie zijn weliswaar zeer selectief en accuraat maar zijn vaak tijdsintensief en vereisen complexe en dure apparatuur (en dus vaak hoog gespecialiseerde operatoren). Bovendien zijn deze methoden ongeschikt voor in-situ detectie. Methoden gebaseerd op de vorming van een specifieke binding tussen een antigen en een antilichaam worden aangeboden als een alternatief door verscheidene producenten als zijnde selectief, betrouwbaar, eenvoudig, snel en gemakkelijk te gebruiken. De meest courant aangeboden sneltesten zijn ELISA kits (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Voor de detectie in levensmiddelen van vrijwel alle wettelijk gereglementeerde mycotoxinen in de EU zoals aflatoxines, deoxynivalenol (DON), zearalenone (ZEA), fumonisines en ochratoxine A (OTA) zijn er commercieel kits verkrijgbaar. Het CODA als Nationaal Referentie Laboratorium (NRL) voor mycotoxinen startte in 2008 met een uitgebreide evaluatie van ELISA kits voor deoxynivalenol. Sneltesten voor DON werden als eerste uitgekozen aangezien deze tot de meest gebruikte behoren op de Belgische markt. DON komt vaak voor in ons klimaat en er is er dan ook zowel in de EU als in Noord-Amerika een strikte wetgeving voor de toegelaten contaminatieniveaus. Deoxynivalenol is een mycotoxine behorende tot de trichothecenen en wordt geproduceerd door Fusarium schimmels. DON wordt voornamelijk gevormd tijdens de teelt op het veld en in het bijzonder tijdens de bloei wanneer de luchtvochtigheid en temperatuur hoog (rond 30ºC) zijn. Het komt voor het merendeel voor in tarwe, haver, gerst, rogge en maïs maar minder in rijst en sorghum. Chronische blootstelling, via consumptie van brood en andere graanhoudende producten kan het immuunsysteem nadelig beïnvloeden en kan leiden tot verminderde groei. Braken is een acuut effect na consumptie van zeer grote hoeveelheden DON. Deoxynivalenol is relatief stabiel tijdens processing. Eenmaal de graangewassen op het veld gecontamineerd zijn, kan het nagenoeg niet meer verwijderd worden. Daarom is het belangrijk te beschikken over snelle en goedkope testen, zowel voor instanties bevoegd voor voedselveiligheid als voor de voedingsindustrie, om besmette batches zo snel en betrouwbaar mogelijk te identificeren. Voor deze evaluatie werd een strategische groep van experts (figuur 1) opgezet bestaande uit mensen van het CODA, het FAVV en verscheidene eindgebruikers van kits teneinde de belangrijkste problemen in verband met ELISA kits voor DON te identificeren. De evaluatie gebeurde in twee stadia: • Een administratieve beoordeling waarbij het validatiedossier van de fabrikant wordt getoetst aan minimale criteria (bv. expertcomité, EU, GIPSA en AOAC). • Een technische beoordeling door het betrokken referentielaboratorium van het CODA-CERVA waarbij de opgevraagde diagnostische reagentia van de fabrikant experimenteel worden getest.
13
Fig. 1 : Partnerschap Ons experimenteel werk bevestigde dat, vergeleken met referentiemethoden zoals vloeistofchromatografie, deze kits vaak te hoge waarden geven voornamelijk door kruisreacties (zogenaamde cross-reactivity, dwz. bepaalde componenten die met de antilichamen reageren alsof het DON is). Kruisreacties zijn een gekend probleem met andere mycotoxinen die ook door deze schimmels geproduceerd worden. Een belangrijk, tot nu toe ondergewaardeerd minpunt bleken echter de kruisreacties met zogenaamde gemaskeerde mycotoxinen te zijn. Dit zijn mycotoxinen die -net als alle andere xenobiotica- gemetaboliseerd werden door planten. Ook tijdens het verwerken van voeding kunnen deze onder invloed van warmte, vochtigheid of specifieke pH-condities gevormd worden. Mensen die besmet plantaardig materiaal consumeren worden dus niet alleen aan het precursormycotoxine blootgesteld maar ook aan deze afgeleiden. Voor al de door ons geteste kits bleek het differentiëren tussen DON en DON afgeleiden problematisch te zijn, vaak reageerde de kit zelfs sterker op de gemaskeerde vorm dan op DON zelf. Hoewel er nogal wat variatie was in de resultaten van de verschillende sneltesten kan geconcludeerd worden dat interferentie toch een groter probleem vormt dan tot nu toe bekend voor ELISA testen. Dit is belangrijk aangezien het niet meer toelaat om betrouwbaar te verifiëren of de testbatches voldoen aan de wettelijke normen. Het analytisch resultaat van een kit dient dan ook eerder als een benadering van de som van meerdere mycotoxinen en afgeleiden gezien te worden. Een standaardisatie en regelmatige update van de cross-reactivity evaluatie lijkt ons absoluut wenselijk en zou een grote hulp zijn in het correct interpreteren van een positief resultaat. De betrouwbaarheid van deze sneltesten hangt ook af van de geteste matrix (gerst, haver, dierenvoeding, koffie, thee,…). Incubatieomstandigheden (temperatuur, tijd,…) bleken eveneens de resultaten te beïnvloeden. Het door de fabrikant voorgeschreven protocol dient dan ook nauwgezet gerespecteerd te worden. Aangezien deze kits net gepromoot worden als uitermate geschikt om in-situ metingen te verrichten, waar net deze omstandigheden vaak variabel en bovendien moeilijk te controleren zijn, dienen eindgebruikers er zich dan ook bewust van te zijn dat dit een bijkomende oorzaak van meetonzekerheid kan zijn. Figuur 2 geeft een grafisch overzicht van de algemene score van 5 kits zowel voor de evaluatie van het validatiedossier als voor de experimentele evaluatie.
14
Adminstratieve evaluatie Experimentele evaluatie
Fig. 2 : Algemene score van 5 sneltesten voor DON Deze sneltesten zijn dan wel geschikt voor een snelle en goedkope screening van stalen in situ, teneinde een indicatie van het niveau van contaminatie te krijgen, voor een eenduidige bevestiging en kwantificatie is het gebruik van meer accurate referentiemethoden echter aangewezen. Gezien de opvallende resultaten en de interesse voor een gestandaardiseerde evaluatie van deze frequent gebruikte testen werd besloten deze oefening te herhalen voor ochratoxine A in 2009-2010 en voor aflatoxines in 2010-2011. Tevens zal een regelmatige update gedaan worden van nieuwe of gewijzigde kits voor DON. De resultaten van deze evaluatie kunnen ingekeken worden op het beschermd internet van het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen of op de website van het CODA (http://www.var.fgov.be). Op deze website of de site van het FAVV (http://www.favv-afsca.be/consumenten) kan men tevens meer algemene informatie aangaande de mycotoxine problematiek vinden.
Bart Huybrechts (CODA, Tervuren)
[email protected] Emmanuel Tagni (CODA, Tervuren)
[email protected]
15
Mariene toxines Toepassing van vloeistofchromatografie (HPLC) en vloeistofchromatografie met massaspectrometrische detectie (LC-MS) in het laboratorium Mariene Biotoxines Mariene toxines hebben belangrijke gevolgen voor economie en volksgezondheid. Uitgebreide monitoring programma’s zijn dan ook vereist. Verschillende groepen van mariene toxines zijn beschreven, met de meest gekende • amnesic shellfish poisoning toxines (ASP), met domoine zuur als voornaamste vertegenwoordiger; • diarrhetic shellfish poisoning toxines (DSP) met verschillende subgroepen, zoals okadazuur groep (OA en dinophysisotoxins: DTX1, DTX2 en DTX3), pectenotoxines (PTXs: PTX1 en PTX2), azaspiracides (AZAs: AZA1, AZA2, en AZA3) en yessotoxines (YTXs: YTX, 45-OH-YTX, homo-YTX en 45OH homo-YTX). De laatste twee worden beschouwd als afzonderlijke groepen omwille van hun toxiciteit en het niet veroorzaken van gastrointestinale stoornissen door de YTX toxines.. • paralytic shellfish poisoning toxines (PSP): Saxitoxine groep (STX). Hoewel er een sterke en internationale nood heerst aan betere methoden voor de bepaling van deze toxines zijn nieuwe officiële gevalideerde methoden nog niet beschikbaar. Er zijn een aantal referentiemethoden voor de bepaling van de mariene biotoxines in schelpdieren beschreven in EU-verordeningen (Verordening (EG) nr. 2074/2005, Verordening (EG) nr. 1664/2006, Verordening (EG) nr. 1244/2007). Deze omvatten een bioassay in muizen (MBA) voor STX en lipofiele toxines, een bioassay in ratten (RBA) voor lipofiele toxines, een hoge druk vloeistofchromatografische methode (HPLC) voor STX toxines en domoine zuur en antilichaam-gebaseerde methoden (ELISA) voor de screening van domoine zuur. Volgens rapporten hebben enkel de bioassays voor de analyse van lipofiele toxines nog nooit een validatieprocedure door een interlaboratoriumonderzoek doorlopen. De andere methoden werden wel gevalideerd en gestandaardiseerd door het AOAC-international (Association of Official Analytical Chemists). Deze AOAC methoden bieden vele voordelen. Ze worden o.a. aangewend om overheidsvoorschriften na te leven, kwaliteit te controleren en ter ondersteuning van wetenschappelijk onderzoek. Er zijn ook nog andere mogelijkheden om een methode te standaardiseren, zoals de procedure van CEN in Europa.
16
De impact van een AOAC-methode heeft een internationaal karakter. Als voorbeeld kan een alternatieve methode voor de officiële PSP toxinen (OMA 2005.06) worden aangehaald. Zodra deze methode werd onderzocht en goedgekeurd door de Marine and Freshwater Toxines Task Force en de officiële methoden Board (OMB) van AOAC, volgden meerdere opleidingen, EU-richtlijnen, en de Codex Alimentarius reviews. Een verfijning en uitbreiding van de methode was onmiddellijk prioriteit in de verschillende expertise centra en forensische labo’s in de VS. Sinds vorig jaar heeft het NRL van het Verenigd Koninkrijk een verfijnde en geautomatiseerde versie ontwikkeld met de introductie van een pre-column oxidatie voor de groep van PSP toxines. Zo zijn snellere en meer gevoelige methoden beter beschikbaar en neemt het gebruik van proefdieren af. Tegenwoordig is de uitbreiding van de HPLC-FLD (hoge druk vloeistofchromatografie met fluorescentie detectie) methode voor PSP toxines (‘Lawrence-methode) naast vervanging van MBA voor de bepaling van lipofiele toxines een van het belangrijkste onderwerpen voor het Community Reference Laboratory (EURL). De Lawrence-methode, zoals beschreven in de AOAC Official Method 2005.06 voor de bepaling van PSP toxinen met HPLC, wordt momenteel geëvalueerd met meer up-to-date standaarden. Daarvoor werd deze methode nog niet gevalideerd. Deze methode is toepasbaar voor de bepaling van saxitoxine (STX), neosaxitoxin (NEO), gonyautoxins 2 en 3 (GTX 2, 3; samen), gonyautoxins 1 en 4 (GTX 1, 4; samen), decarbamoyl Saxitoxine (dcSTX), B-1, C-1 en C-2 samen, en C-3 en C-4 (samen) in schelpdieren (mosselen, kokkels, oesters en sint-jakobsvruchten). Onlangs is een van de methoden geëvalueerd voor de andere toxinen zoals dcNEO, dcGTX 2,3 en GTX6. Het WIV heeft de methode gevalideerd en het is voortdurend betrokken bij de werkzaamheden georganiseerd door het EURL voor mariene biotoxines. Zowel nationale referentielaboratoria als officiële controlelaboratoria zijn verplicht de referentiemethoden te gebruiken voor hun controle programma’s. De meest gebruikte methode voor de detectie van lipofiele mariene biotoxines in schelpdieren is de MBA. Momenteel wordt voorgesteld om deze te vervangen door een chemische methode. De MBA omvat de injectie van een schelpdier extract in de buikholte van muizen. De dood van de muis wijst op de aanwezigheid van mariene toxines. De Europese Autoriteit voor Voedselveiligheid (EFSA) merkte evenwel op dat de MBA niet voldoende geschikt bleek te zijn om de consumenten beter en vroeger te beschermen. Daarom besliste de Europese Commissie in 2009 dat een meer specifieke methode noodzakelijk was. Momenteel wordt er in Europa aandacht besteedt aan interlaboratoriumonderzoek en validatie van de opsporing van lipofiele mariene toxines in schelpdieren door middel van vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS). Deze test moet uiteindelijk meer dan tien lipofiele toxines (okadazuur, DTX’s, AZA’s, PTXs and YTXs) simultaan detecteren met detectiegrenzen lager dan 40 mg/kg Dit is vier keer lager dan de huidige limieten. In België heeft het Nationaal Referentielaboratorium (NRL) voor de controle van mariene biotoxines eveneens nauw samengewerkt met het EURL voor de ontwikkeling van een chemische methode voor de analyse van lipofiele toxines als een alternatief voor de bioassay in de muis. Door de inspanningen van het NRL werd de methode in 2009 gevalideerd. Deze methode maakt gebruikt van UPLC technologie wat tot een kortere analysetijd en tot een betere identificatie van de toxines leidt. Inmiddels reageerde het AFSSA (Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments) positief door deze methode te gebruiken in monitoring en controleprogramma’s. Daarmee wil het AFSSA snel en krachtig anticiperen op mogelijke gevolgen van atypische toxiciteit sinds 2005. De atypische toxiciteit is een fenomeen dat veel valse positieve resultaten bij MBA kan opleveren. Deze positieve resultaten met de bioassay in de muis zijn niet steeds bevestigd met de chemische methode. In de verdere ontwikkeling van de detectie van bekende en opkomende toxines werkt de Europese Commissie aan de praktische aspecten van de vervanging van MBA door chemische methoden. De MBA methode zal enkel nog tijdens de “overgangsfase” mogen gebruikt worden. Deze fase hangt af van de noden van de verschillende NRL in de voorziening van apparatuur en personeel. Mirjana Andjelkovic (WIV, 1050 Brussel)
[email protected]
17
Melamine in levensmiddelen: van de crisis tot de accreditatie Vervalste melk Zes kinderen dood en bijna driehonderdduizend ziek als gevolg van inname van met melamine verontreinigde zuigelingenvoeding in China. Dat was het begin van een schandaal dat uitdeinde naar andere uit China afkomstige levensmiddelen, zoals eipoeder, ammoniumcarbonaat (een rijsmiddel), oploskoffie en zelfs diervoeders. In zuigelingenvoeding werden soms gehalten tot 2563 mg/kg aangetroffen.
Melamine is geen proteïne Melamine is een synthetisch product dat niet spontaan voorkomt in het milieu en in biologische weefsels. Het was oorspronkelijk bedoeld als meststof en als bron van niet-eiwithoudende stikstof voor dieren. Vanwege de te langzame hydrolyse werd naderhand afgezien van beide toepassingen. Melamine werd echter met veel succes toegepast in de industrie, bijvoorbeeld in de productie van harsen voor plastic en schuim, maar ook als schoonmaakmiddel of als brandwerend middel. Frauduleus gebruik ervan in de landbouw en de voeding heeft te maken met het hoge stikstofgehalte (66 % in de massa) ervan. Door melamine toe te voegen kan men zo ofwel het ‘eiwitgehalte’ en daardoor de verkoopprijs van het product kunstmatig verhogen ofwel verdunning van het basisproduct wegwerken. De standaardkwaliteitsproeven, Kjeldahl et Dumas, maken immers geen onderscheid tussen melamine en eiwitten omdat daarbij alleen de totale stikstof wordt gemeten. Levensmiddelenfraude bestaat al zo lang als levensmiddelen worden verhandeld en komt geregeld voor. Door de globalisering van de economie krijgt dat probleem echter een nieuwe dimensie: verontreinigde levensmiddelen kunnen zeer snel overal ter wereld opduiken. De Europese landen voeren dan wel geen melk in vanuit China maar wel een groot aantal verwerkte producten die melk bevatten, bijvoorbeeld koekjes en snoepgoed, en zeker niet te vergeten: ook grondstoffen voor de diervoeding. De Europese Unie moest snel reageren om de veiligheid van de in Europa verkochte producten te garanderen. Er werd daartoe een beschikking aangenomen (2008/921/EG) en er werd een interlaboratoriumproef georganiseerd om de prestaties van de laboratoria te kunnen meten.
Analytiek Binnen die nieuwe wetgeving ontwikkelde het Wetenschappelijk Instituut voor de Volksgezondheid een methode voor het bepalen van melamine in melk, melkpoeder, melkproducten, snoepgoed en meel van plantaardige oorsprong. Het voordeel van de ontwikkelde methode is dat ze eenvoudig uitvoerbaar is en dat een groot aantal monsters snel kunnen worden verwerkt.
Extractie In deze stap wordt de melamine uit de matrix geëxtraheerd bij middel van een gepast oplosmiddel. Er wordt een mengsel van water en acetonitril gebruikt dat een dubbele functie heeft: water kan de melamine oplossen en acetonitril kan de eiwitten, die de analyse hinderen, doen neerslaan. Via ultrasone extractie wordt de overdrachtkinetica versneld door verhoging van de diffusie van de melamine naar het oplosmiddel. Die stap is vooral belangrijk voor vaste matrices en om voor alle betreffende matrices een eenvormig testprotocol te kunnen toepassen.
18
Voorzuivering In dit stadium van de analyse bevat het ruwe extract weliswaar de melamine maar ook gelijktijdig daarmee geëxtraheerde interferenties die problemen met de herhaalbaarheid kunnen veroorzaken. Er werden twee methoden toegepast om dat probleem op te lossen. Bij de eerste werd een vloeistof-vloeistof extractie toegepast op de vetresiduen met dichloormethaan waarmee boven de organische fase een waterige fase kan worden verkregen. De tweede methode bestaat uit het verdunnen van het gezuiverde extract met water (factor 5). Met die techniek kunnen de hydrofiele interferenties worden verdund die worden geëxtraheerd uit matrices zoals zouten en suikers.
Meting : scheiding en detectie Er werd meteen voor vloeistofchromatografie (LC) gekozen om de bij de gaschromatografie horende lastige fase van derivatisering te vermijden. Bovendien is hydrofiele interactiechromatografie (HILIC) vanwege de polariteit bijzonder interessant voor melamine. Omdat isotopische standaarden beschikbaar zijn moet de techniek van kwantificering door isotopenverdunning absoluut worden toegepast. Die biedt heel wat voordelen, zoals correcte terugvindingspercentages, een betere juistheid en vooral compensatie voor de talrijke fysische of chemische interferenties (matrixeffect). Die techniek vereist echter een massaspectrometer. De beschikbare apparatuur die aan de EU-eisen met betrekking tot gevoeligheid kan voldoen is een systeem van ACQUITY UltraPerformance LC gekoppeld aan een quadrupool massaspectrometer Quattro Premier. Het bijzondere nut van een UPLC-MS/MS combinatie bestaat erin dat in amper 2 minuten een kwantitatieve analyse wordt uitgevoerd (zie figuur 1)
Fig. 1 : Chromatogrammen van een wafel belast op 10 mg/kg (MRM-transities voor de kwantificering)
19
Afsluitend onderzoek: validatie De prestaties van de ontwikkelde methode werden met succes geëvalueerd tijdens de validatie en de resultaten hiervan zijn weergegeven in tabel 1. Bij de keuze van de matrix voor de validatie werd rekening gehouden met de samenstelling van de verschillende betreffende levensmiddelen. Er werd gekozen voor een wafel omdat die 3 ingrediënten bevat (eipoeder, rijsmiddel en melkpoeder) die voorkomen op de lijst van met melamine verontreinigde producten. Tabel 1 : Validatieresultaten Bepaalbaarheidsgrens
Kleinste concentratie met signaal/ruisniveau gelijk aan 6 Vastgesteld op 0,5 mg/kg
Lineariteit
0,5 mg/kg tot 40 mg/kg
Matrixeffect
Niet aanwezig en ijkoplossing in oplosmiddel (water)
Herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid en meetonzekerheid Aanrijkingsniveau’s
1 mg/kg
10 mg/kg
30 mg/kg
CVr %
3,2
2,3
0,9
Maximum Horwitz %
10,7
7,6
6,4
CVrw %
3,3
2,5
1,2
Maximum Horwitz %
16,1
11,3
9,6
Schijnbare terugvinding %
97
98
99
Meetonzekerheid %
9,6
10
3,8
Nauwkeurigheid
Resultaten deelneming aan twee interlaboratoriumproeven : DLA (Dienstleistung Lebensmittel Analytik) en IRMM (Institut des Mesures et Matériaux de Référence)
Matrix
Melkpoeder (DLA)
Melkpoeder (IRMM)
Kookmengsel (IRMM)
39,6 +- 4,2
10 +- 1,12
3,18 +- 0,43
Gerapporteerde waarde
43,5
10,2
3,1
Z-score
1,07
0,50
0,00
Toegekende waarde (+- DS)
Ecologische voetafdruk van de methode Een methode waarmee met zekerheid kan worden gekwantificeerd dank zij de combinatie MS/MS en isotopenverdunning verkleint de kans op fouten en dus de noodzaak om opnieuw te analyseren. Bovendien gebruikt de methode weinig organisch oplosmiddel (tabel 2). De benadering beantwoordt dus aan het streven om milieuvriendelijker methoden te ontwikkelen die toch de veiligheid van levensmiddelen kunnen garanderen. Tabel 2 : Verbruik van organische oplosmiddelen per geanalyseerd monster Acetonitril (mL)
Dichloormethaan (mL)
5
0
Opzuivering
0
10
LC
1,26
0
Standaard
0
0
Extractie
Séverine Goscinny et Vincent Hanot, WIV
[email protected] [email protected]
20
21
Melk en melkproducten Controle van antibioticaresiduen in melk Geïntegreerd systeem Om een hoge technologische kwaliteit en veiligheid voor de consument te verzekeren, werd voor melk een geintegreerd systeem ontwikkeld dat 2 aspecten omvat: de toepassing van verschillende methoden en de bepaling van een gedeelde verantwoordelijkheid voor de melkveehouder, de verwerkende industrie en de voedingsinspectie. Het systeem past elementen van het HACCP-concept (Hazard Analysis & Critical Control Points) toe om het aantal risico’s te minimaliseren en veiliger voedsel te garanderen. In het geïntegreerd systeem (Fig. 1) heeft elk niveau zijn verantwoordelijkheid. Zo heeft de bedrijfsdierenarts zijn verantwoordelijkheid bij de diagnosestelling, het toedienen of afleveren van diergeneesmiddelen en het geven van juist advies aan de melkveehouder. De melkveehouder moet de voorgeschreven wachttijden voor de gebruikte geneesmiddelen respecteren. De geleverde rauwe melk moet op geregelde tijdstippen getest worden op de aanwezigheid van residuen van bacteriegroeiremmende stoffen met een microbiologische inhibitortest (penalisatiesysteem). De zuivelbedrijven zijn verplicht zelfcontrole uit te voeren (Art. 14 EEG Richtlijn 92/46) om zo te verzekeren dat de MRL-waarden (Maximumwaarden voor residuen, EU Verordening 47/2010) niet overschreden worden en dat de melk vrij is van verboden substanties zoals chlooramfenicol, dapson, nitrofuranen en nitro-imidazolen. Daarom wordt voorgesteld de melk op tankerniveau (RMO) regelmatig te testen op ß-lactamantibiotica (en tetracyclines) met een sneltest of de silomelk vόόr productie te testen met een microbiologische inhibitortest en in aanvulling testen toe te passen voor de opsporing van verbindingen die niet op gevoelige wijze microbiologisch kunnen gedetecteerd worden (vb. quinolones, aminoglycosiden, …) of verboden zijn (chlooramfenicol, dapson, ...).
Fig. 1 : Geïntegreerd systeem voor de controle van melk (naar HEESCHEN & SUHREN, 1996).
Productie
Zuivelfabriek
Behandelde dieren
Eigen controle
Wachtperiode respecteren
Verzekeren dat MRL-waarden niet overschreden zijn (antibiotica en sul fonamiden)
Tankmelk
Het afwezig zijn van chlooramfenicol, dapson, nitrofuranen, …
Testen op remstoffen Positief resultaat > prijsdaling
22
Voedingsinspectie
Testen op MRL- niveau (kwantitatieve bepaling) Resultaat: indien overschrijding MRL > sanctie: penalisatie/ verkoopsverbod
De voedingsinspectie of de bevoegde instanties dienen bij vaststelling van residuen deze te identificeren en te bepalen of de MRL al of niet overschreden wordt. Daarvoor worden fysico-chemische testen aangewend zoals HPLC of LC-MS/MS. Een dergelijk systeem is procesgeoriënteerd en kan gedefinieerd worden als een barrièresysteem.
ANALYSES UITGEVOERD IN BELGIË Analyses in het kader van de officiële kwaliteitsbepaling De opsporing van antibioticaresiduen in melk is sedert 1966 één van de kwaliteitsparameters bij de officiële kwaliteitsbepaling van rauwe melk. Voor die officiële kwaliteitsbepaling wordt elke melklevering met een monsternamesysteem bemonsterd. Deze melkstalen worden bij de interprofessionele organismen voor de melkkwaliteit op inhoud geanalyseerd (berekening basisprijs) en op kwaliteit gecontroleerd. Sinds november 2000 wordt elke levering gecontroleerd op de aanwezigheid van bacteriegroeiremmende stoffen. Volgens het huidig opgelegd schema (Fig. 2) wordt de Copan Milk Test (DSM-Food Specialties, Delft, NL) als screeningstest gebruikt. De Copan Milk Test is een microbiologische breedspectrumtest met (sporen van) Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis als testorganisme. Bij afwezigheid van remstoffen in de melk tijdens de incubatie wordt zuur gevormd wat resulteert in een kleuromslag van de pH-indicator (broomcresolpurper) van paars naar geel. Bacteriegroeiremmende stoffen in de melk kunnen een dergelijke zuurvorming inhiberen zodat de kleur van het testmedium desgevallend paars blijft. Voor de reflectometrische kleuraflezing wordt gebruik gemaakt van een vlakbedscanner met specifieke software (C-scan).
Fig. 2 : Schema voor het aantonen van melkvreemde bacteriegroeiremmende stoffen in hoevemelk bij de interprofessionele organismen.
23
De te hoge gevoeligheid van de screeningstest voor de meeste ß-lactamverbindingen wordt gecompenseerd bij de bevestiging. Daartoe wordt als eerste bevestigingstest de receptortest ßeta-s.t.a.r. 25 met een speciale cut-off ingezet. Een ratio testlijn/referentielijn onder de vooropgestelde cut-off resulteert in een bestraffing van de betreffende melkleveraar. Wordt daarentegen een ratio boven de cut-off gemeten, dan wordt overgegaan naar een tweede fase van bevestiging waarbij men nagaat of de groeiremming al dan niet te wijten zou zijn aan natuurlijke inhibitoren in de melk, zoals een verhoogd lactoferrine- of lysozymegehalte. Is dit niet het geval, dan wordt gecontroleerd of de groeiremming blijft na incubatie van de melk in aanwezigheid van penicillinase. Is dit het geval, dan wijst dit op de aanwezigheid van een niet-ß-lactamverbinding en wordt de melkleveraar alsnog beboet.
Analyses op het zuivelbedrijf (autocontrole) Ter beveiling van de productie van gefermenteerde zuivelproducten (yoghurt, kaas, …) en ter respectering van EG-Verordening 853/2004 worden door de zuivelbedrijven ook tal van antibiotica-analyses uitgevoerd. Krachtens de voorschriften mogen exploitanten van levensmiddelenbedrijven in de zuivelsector geen rauwe melk in de handel brengen waarvan het gehalte aan antibioticaresiduen hoger is dan de MRL. Meer dan 90% van alle melkleveringen wordt bij ontvangst getest met een sneltest. Deze controle richt zich bijna uitsluitend tot de groep van penicillines en cefalosporines, de groep van de meest voorkomende residuen. Met een sneltest kan het feitelijke residugehalte echter niet kwantitatief worden bepaald. Dit kan enkel met een fysicochemische bevestigingstest. Indien zo’n bevestigingstest niet wordt uitgevoerd, wordt ervan uitgegaan dat melk met een positieve screeningstest onveilig is. Melk met een residugehalte boven de MRL is niet geschikt voor humane consumptie en mag niet verder worden verwerkt. Verdunning van de residuen tot onder de norm is niet toegelaten. Naast ingangscontrole wordt soms silomelk (industriemelk) vόόr productie gecontroleerd op antibioticaresiduen met een breedspectrum microbiologische test.
Analyses in het kader van MONIMILK of FAVV-monitoring Residuen van diergeneesmiddelen worden ook opgespoord in tal van zuivelproducten (individuele hoevemelk, RMO-melk, consumptiemelk, melkpoeders, schapen- en geitenmelk). Deze analyses worden uitgevoerd, deels in opdracht van BCZ-CBL in het kader van MONIMILK en deels in opdracht van het FAVV in het kader van het nationaal monitoringplan. Bij deze monitoring wordt getracht zoveel mogelijk substanties op MRL-niveau op te sporen en nadien te identificeren en te kwantificeren. Aldus wordt getracht een zo volledig mogelijk beeld te bekomen van de problematiek van residuen van diergeneesmiddelen in de Belgische zuivel. Naast infectiewerende stoffen (antibiotica en chemotherapeutica) worden ook antiparasitaire stoffen (benzimidazolen en macrocyclische lactonen) en niet-steroïdale anti-inflammatoire middelen opgespoord. Voor het onderzoek op antibioticaresiduen worden de zuivelproducten onderzocht met drie verschillende microbiologische inhibitortesten en een receptortest. Een deel van de monsters worden immunologisch gescreend op chlooramfenicol, (dihydro)streptomycine en 3-amino-2-oxazolidone (AOZ), metaboliet van furazolidone.
24
Analyses op de hoeve Steeds meer gaan de melkveehouders zelf ook antibioticatesten uitvoeren om na te gaan of de voorgeschreven wachttermijn volstaat. Daartoe wordt de melk van de behandelde dieren na het verstrijken van de wachttermijn getest met een microbiologische test (bijvoorbeeld Delvotest SP Mini of Single Copan Milk Test in ampullevorm) of een sneltest. Zeker na het aanwenden van droogzetpreparaten is het aangewezen om systematisch de melk van de behandelde dieren te (laten) testen. Bij een te vroeg afkalven is de voorgeschreven periode, waarbij men de melk dient apart te houden, vaak onvoldoende. Door preventief op deze wijze te verhinderen dat melk met antibioticaresiduen in de tank terechtkomt, zal de melkveehouder gespaard blijven van penalisaties op basis van remstoffen.
Besluit Melk en zuivelproducten behoren inzake antibioticaresiduen tot de best gecontroleerde levensmiddelen. Niet alleen wordt in België elke melklevering gecontroleerd op remstoffen met een breedspectrum microbiologische inhibitortest, tevens passen de meeste zuivelbedrijven een sneltest toe bij de ingangscontrole op antibioticaresiduen. Daarnaast zijn er steekproeven waarbij de melk gecontroleerd wordt op een zeer breed gamma diergeneesmiddelen (antibiotica, chemotherapeutica, antiparasitaire stoffen, …) met tal van performante testmethoden. Op elk niveau in de keten heeft elkeen zijn verantwoordelijkheid. In een geïntegreerd systeem voor de controle op residuen hebben microbiologische, immunologische en receptortesten hun waarde en functie naast fysicochemische testen.
Referenties • Anonymous. Richtlijn 92/46/EEG van de Raad van 16 juni 1992 tot vaststelling van gezondheidsvoorschriften voor de produktie en het in de handel brengen van rauwe melk, warmtebehandelde melk en produkten op basis van melk. Publicatieblad van de Europese Gemeenschap L268: 1-32 (1992). • Anonymous. Verordening (EG) nr. 853/2004 van het Europees Parlement en de Raad van 29 april 2004 houdende vaststelling van specifieke hygiënevoorschriften voor levensmiddelen van dierlijke oorsprong. Publicatieblad van de Europese Unie L139: 55-205 (2004). • Anonymous. Verordening (EU) nr. 37/2010 van de Commissie van 22 december 2009 betreffende farmacologisch werkzame stoffen en de indeling daarvan op basis van maximumwaarden voor residuen in levensmiddelen van dierlijke oorsprong. Publicatieblad van de Europese Unie L15: 1-72 (2010). • HEESCHEN, W.H. & SUHREN, G. Principles of and practical experiences with an integrated system for the detection of antimicrobials in milk. Milchwissenschaft, 51, 3, 154-160 (1996). Wim Reybroeck (T&V-ILVO, Melle)
[email protected]
25
Normatieve en wettelijke ontwikkelingen Nieuwe IDF- FIL (International Dairy Federation – Fédération International de Laiterie) normen in 2009 (van 12 mei 2009 tot 2 november 2009):
Normen: ISO 3890-1|IDF 075-1:2009 - Milk and milk products - Determination of residues of organochlorine compounds (pesticides) - Part 1: General considerations and extraction methods ISO 3890-2|IDF 075-2:2009 - Milk and milk products - Determination of residues of organochlorine compounds (pesticides) - Part 2: Test methods for crude extract purification and confirmation ISO 8196-1|IDF 128-1:2009 - Milk - Definition and evaluation of the overall accuracy of alternative methods of milk analysis - Part 1: Analytical attributes of alternative methods ISO 8196-2|IDF 128-2:2009 - Milk - Definition and evaluation of the overall accuracy of alternative methods of milk analysis - Part 2: Calibration and quality control in the dairy laboratory ISO 8196-3|IDF 128-3:2009 - Milk - Definition and evaluation of the overall accuracy of alternative methods of milk analysis - Part 3: Protocol for the evaluation and validation of alternative quantitative methods of milk analysis ISO 12080-1|IDF 142-1:2009 - Dried skimmed milk - Determination of vitamin A content - Part 1: Colorimetric method ISO 12080-2|IDF 142-2:2009 - Dried skimmed milk - Determination of vitamin A content - Part 2: Method using high-performance liquid chromatography ISO 11870|IDF 152:2009 - Milk and milk products - Determination of fat content - General guidance on the use of butyrometric methods ISO 14378|IDF 167:2009 - Milk and dried milk - Determination of iodide content - Method using high-performance liquid chromatography ISO 11865|IDF 174:2009 - Instant whole milk powder - Determination of white flecks number ISO 26323|IDF 213:2009 - Milk products - Determination of the acidification activity of dairy cultures by continuous pH measurement (CpH) ISO/TS 11059|IDF/RM 225:2009 - Milk and milk products - Method for the enumeration of Pseudomonas spp. ISO/TS 27265|IDF/RM 228:2009 - Dried milk - Enumeration of the specially thermoresistant spores of thermophilic bacteria
Andere nuttige IDF publicaties: Bulletin of the IDF No. 436/2009 - Environmental/Ecological Impact of the Dairy Sector: - E-Form Bulletin of the IDF No. 437/2009 - Effects of Foot-and-Mouth Disease on the Dairy Industry - E-Form Bulletin of the IDF No. 438/2009 - The World Dairy Situation 2009 - E-Form Bulletin of the IDF No. 439/2009 - Interlaboratory Collaborative Studies on Reference Method ISO 1211|IDF 1 for the Determination of the Fat Content in Cow Milk, Sheep Milk and Goat Milk
Koen De Reu (ILVO-T&V) Jessy Claeys (ILVO-T&V)
[email protected] [email protected]
26
Workshops & Symposia Datum
Onderwerp
Plaats
Meer informatie (website)
08-11/06/2010
2nd International Moniqa Conference
Krakow, Polen
http://krakow.moniqa. org/
08-11/06/2010
June 8-11: 2nd ASM Conference on Antimicrobial Resistance in Zoonootic Bacteria and Foodborne Pathogens
Toronto, Canada
http://www.asm.org/index.php?option=com_co ntent&view=article&catid =73&id=91109&title=2nd +ASM+Conference+on+A ntimicrobial+ Resistance+in+Zoonoot ic++Bacteria+and+Food borne+Pathogens&Itemi d=227
08-12/06/2010
ISTA workshop on GMO testing
Oberschleißheim, Germany
http://www.ista-cologne2010.de/workshopsand-tours/pre-congressworkshops/workshop-iii/
09-11/06/2010
IDF Dairy Science and Technology Week 2010 - IDF Symposium on Microstructure of Dairy Products
Tromsö, Norway
http://www.idfmic2010. no/
09-11/06/2010
European Symposium International Association for Food Protection
Dublin, Ireland
http://www.foodprotection.org/events/european-symposia/index.php.
10-11/06/2010
4th International Fresenius Conference Food Allergens
Frankfurt, Germany
http://www.akademie-fresenius.de/konferenz/output.php?kurs=218
20-24/06/2010
June 20-24: 8th European Pesticide Residue Workshop,
Strasbourg, France
http://www.eprw2010. com/
21-22/06/2010
Behaviour of Pesticides in Air, Soil and Water
Mainz, Germany
http://www.akademie-fresenius.com/english/konferenz/output. php?kurs=219
29-30/06/2010
International Symposium St-Malo, France Salmonella and Salmonelloses
www.zoopole.com/ispaia/ i3s2010
15-20/08/2010
XIIth International Congress of Parasitology (ICOPA)
Melbourne, Australia
www.icopaxii.org
22-28/08/2010
IUFoST - 15th Annual World Congress of Food Science and Technology
Cape Town, South Africa
http://www.iufost2010. org.za/index.asp
16-18/09/2010
European Conference on GMO free regions, Biodiversity and rural development
Brussels and Ghent
http://www.gmo-free-regions.org/
30/8-3/09/2010
Food-micro
Copenhagen, Denmark
www.foodmicro.dk
27
12-17/09/2010
Dioxin 2010: 30th International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (POPs)
San Antonio, Texas
http://www.dioxin2010. org/
13-15/09/2010
Risk Analysis 2010
Algarve, Portugal
http://www.wessex. ac.uk/10-conferences/riskanalysis-2010.html
19-23/09/2010
15th International Conference on Heavy Metals in the Environment
Gdansk, Poland
http://www.pg.gda. pl/chem/ichmet/
27/10/2010
NIVA: Nordic Tour 2010: Health effects and risks of nanoparticles.
Eigtveds Pakhus, Copenhagen, Denmark
http://www.niva.org/courses/6012.htm
4-11/11/2010
IDF World Dairy Summit
Auckland, New Zealand
http://www.wds2010.com
8-10/11/2010
The World Mycotoxin Fo- Noordwijkerhout, The rum - the sixth conference Netherlands
http://www.bastiaansecommunication.com/ html/wmf6_new.html
16-18/11/2010
Nano Safe
Grenoble, France
http://www.nanosafe.org/ scripts/home/publigen/ content/templates/show. asp?P=100&L=EN The objectives of the conference will be to make available the major progresses and future trends in the domain of the safe production and use of nanomaterials.
17/11/2010
Measuring Food Safety and comparing self checking systems
Brussels, Belgium
http://www.favv.be/selfcheckingsystems/
23-25/11/2010
The future of reference materials – Science and Innovation
IRMM, Geel, Belgium
http://irmm.jrc.ec.europa. eu/html/events/documents/future-rm/future_ rm_2nd_announcment. pdf
24/11/2010
NANOTECHNOLOGY IN THE FOOD CHAIN OPPORTUNITIES & RISKS
Brussels, Belgium
http://www.favv.be/nanotechnology/
24-27/02/2011
February 24–27: 6th International Conference on Emerging Zoonoses
Cancún, Mexico
http://www.zoonoses2011.com/
20-24/06/2011
2nd Global conference on Como, Italy GMO analysis
No website available yet (15/04/2010) – more information will appear on: http://mbg.jrc.ec.europa. eu/capacitybuilding/globalconference
24-29/07/2011
10th International Conference on Mercury as a Global Pollutant,
http://mercury2011. org/com/
Halifax, Nova Scotia, Canada
28
1-6/08/2011
13th International Conference on Trichinellosis
Changchun, P. R. China
21-25/08/2011
World Association for the Buenos Aires, Argentina Advancement of veterinary Parasitology (WAAVP)
21-26/08/2011
DIOXIN 2011, 31st Sympo- Brussels, Belgium sium on Halogenated Persistent Organic Pollutants
29
International Commission on trichinellosis (ICT); will be organized by Pr Liu Mingyuan in Jilin University, Changchun, P. R. China
[email protected]
NRL
N AT I O N A L E REFERENTIE LABORATORIA
