Mgr. Jan Itvánek, Ph.D. Laboratoø molekulární diagnostiky, IFCOR-99, s.r.o.
Kvantitativní vyetøení hepatitidy B a C první zkuenosti s virologickým panelem na pøístroji cobas® 4800, srovnání s cobas® TaqMan® 48 Úvod Virové hepatitidy jsou celosvìtovì nejèastìjí jaterní onemocnìní, které vede a ke 2 milionùm úmrtí roènì.1 V souèasnosti rozeznáváme 6 virù zpùsobujících virové hepatitidy (oznaèované jako hepatitidy A, B, C, D, E a G). V Èeské republice se bìnì vyskytují pouze virové hepatitidy A, B a C. Mnohem závanìjí prùbìh ne hepatitida A mají hepatitidy B a C, co souvisí pøedevím s jejich schopností pøecházet do chronicity. Onemocnìní trvající déle ne pùl roku ústí v chronickou hepatitidu, jaterní cirhózu èi rakovinu jater. Následkem chronických forem onemocnìní roènì umírá dalích nìkolik milionù osob. Nezanedbatelné jsou také ekonomické ztráty spojené s pracovní neschopností, léèbou apod. Virové hepatitidy tedy i ve 21. stole-
14
Labor Aktuell 03/16
tí pøedstavují velmi významný zdravotnický problém. Virová hepatitida B je jedním z nejzávanìjích zdravotnických problémù souèasnosti, pøedevím v rozvojovém svìtì. Bìhem svého ivota se virem hepatitidy B nakazí více ne 2 miliardy osob, pøièem v souèasnosti je chronicky infikováno 350400 milionù lidí.15 Na následky chronické infekce HBV poté umírá pøiblinì 1525 % chronicky infikovaných osob. V celosvìtovém mìøítku to pøedstavuje roènì pùl a jeden milion osob, co øadí hepatitidu B mezi deset nejèastìjích pøíèin úmrtí. Na základì posledních sérolo-
gických pøehledù, které v Èeské republice probìhly, byla chronická infekce virem hepatitidy B prokázána u 0,56 % spoluobèanù.6 Chronická hepatitida B se pøitom léèí nejèastìji pomocí 4 úèinných preparátù (pegylovaným interferonem (IFN) alfa-2a, konvenèním interferonem alfa, lamivudinem a adefovir dipivoxilem7). Doba léèby je závislá na pouitém preparátu, typu viru HBV, léèebné odpovìdi pacienta a trvá standardnì od 4 do 12 mìsícù. Virovou hepatitidou C jsou podle kvalifikovaných odhadù nakaeny pøiblinì 3 % svìtové populace, pøièem vìtina pøejde do chronicity, jeliko virová hepati-
tida C je v akutním stadiu rozpoznána jen velmi zøídka. Celosvìtovì je nemocných více ne 180 milionù. Virová hepatitida C je pøitom problémem nejen rozvojových zemí, ale i rozvinutých, a to v dùsledku nedostupnosti oèkování vùèi viru hepatitidy C. Poèet hláených pøípadù novì zjitìných hepatitid C v Èeské republice rok od roku narùstá (158 pøípadù novì diagnostikovaných infekcí HCV v roce 1993, 868 pøípadù v roce 2004).6 Protoe naprostá vìtina onemocnìní probíhá bezpøíznakovì a uniká proto pozornosti, budou skuteèná èísla výraznì vyí. Èeská republika pøesto patøí mezi státy s relativnì nízkým výskytem infekce HCV okolo 0,2 % populace.6 Bìhem uplynulých desetiletí podstatnì rostla úèinnost léèby z pùvodních 5 % na souèasných 5060 % u nemocných infikovaných virem hepatitidy C typu 1 a 7080 % u pacientù nakaených typy 2 a 3. Tento pokrok v léèbì je dosahován kombinací pegylovaného interferonu a ribavirinu.8, 9 Léèba poté trvá nejèastìji mezi 24 a 48 týdny.
Kvantifikace virové náloe se v souèasnosti stala dùleitou souèástí antivirové terapie chronických hepatitid.
Graf 1: Srovnání výsledkù kvantifikaèních kitù pro urèení virové náloe HBV v logaritmickém mìøítku
Detekce DNA viru HBV a RNA viru HCV pomocí PCR10, 11 na rozdíl od vyetøení protilátek prokazuje aktivní replikaci viru, a je tedy dùkazem probíhající infekce. Nicménì v pøípadì pouití real-time PCR je moné kvantifikovat poèáteèní mnoství templátu, tzn. urèit aktuální virovou nálo. Kvantifikace virové náloe se v souèasnosti stala dùleitou souèástí antivirové terapie chronických hepatitid. Lze ji pouít k prùkazu i monitorování trvalé i doèasné virologické odpovìdi na terapii. Vzhledem k tomu, e význam kvantifikace virové náloe v léèbì pacientù infikovaných HBV nebo HCV stále roste, zamìøili jsme se v následující studii na porovnání novì dostupného testu pro kvantifikaci virové náloe u hepatitidy B a C na automatickém pøístroji cobas® 4800 s døívìjí, v souèasnosti vak v ÈR stále nejpouívanìjí metodou, zahrnující ma-
nuální izolaci a amplifikaci na pøístroji TaqMan® 48.
Metody Celkem 15 vzorkù (4 negativní a 11 pozitivních s rùznými virovými náloemi) bylo testováno obìma kvantifikaèními testy. V pøípadì testování na pøístroji cobas® TaqMan® 48 byla nukleová kyselina izolována manuální metodou pomocí kitu High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (Roche) z 500 µl klinického materiálu. K amplifikaci byly pouity reagencie kitù cobas® TaqMan® HBV Test (Roche) a cobas® TaqMan® HCV Test, v2.0 (Roche). Mastermix byl namíchán ruènì, stejnì jako byl do PCR pøidán ruènì i templát. Izolace nukleových kyselin (ze 400 µl klinického materiálu), pøíprava mastermixu i pøíprava PCR reakce do mikrotitraèní
Tab. 1: Srovnání výsledkù kvantitativních metod urèujících virovou nálo ve vzorku u HBV i HCV
Labor Aktuell 03/16
15
destièky vèetnì pøidání templátu jsou na pøístroji cobas® 4800 automatizovány a probíhají v pøístroji cobas® x480. Samotná amplifikace probíhá v real-time cykleru cobas® z480. Vechny pouité soupravy byly pouity dle návodu výrobce. U kvantitativních testù realizovaných na cobas® 4800 urèujících virovou nálo HBV a HCV, jako nových laboratorních vyetøení, byla provedena verifikace (mezilehlá preciznost, opakovatelnost) z dùvodu ovìøení základních charakteristik testù. K ovìøení pracovního rozsahu testù byly simulovány vzorky s rùznými virovými náloemi. Ovìøoval se limit detekce i meze lineárního rozsahu testù. Bylo také ovìøeno mnoství vstupního klinického materiálu a limitu, které je schopen cobas® x480 (izolátor) zpracovat. Dle doporuèení výrobce je vstupní mnoství klinického materiálu stanoveno na 800 µl, pøièem 400 µl je pouito k izolaci nukleových kyselin. 400 µl je tudí mrtvý objem. Vzhledem k moné limitaci ze strany mnoství materiálu byly vyzkoueny alternativní sekundární zkumavky (Sarstedt, kat. è. 60.546.002) s jinými rozmìry (6 ml, 92 x 11,5 mm), které jsou vhodné pro 32místný nosiè, a byl ovìøen minimální pouitelný objem.
Graf 2: Srovnání výsledkù kvantifikaèních kitù pro urèení virové náloe HCV v logaritmickém mìøítku
Výsledky Srovnáním výsledkù obou metod je patrné, e jak vzorky HBV, tak vzorky HCV byly shodnì hodnoceny jako pozitivní nebo negativní (u pozitivních výsledkù je pøímo uvedena hodnota virové náloe; tabulka 1). Srovnáním vypoèítaných virových náloí u pozitivních vzorkù v logaritmickém mìøítku se poté ukazuje, e v pøípadì HBV cobas® 4800 pøi nízkých virémiích oproti cobas® TaqMan® výsledky mírnì nadhodnocuje a pøi vysokých mírnì podhodnocuje (graf 1). U HCV jsou poté oba testy pøi nízkých virémiích srovnatelné, avak pøi vyích virémiích cobas®
4800 ve srovnání s cobas® TaqMan® výsledky mírnì nadhodnocuje (graf 2). V rámci verifikace nových kvantifikaèních testù bylo provedeno mìøení opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti a z namìøených hodnot byly vypoèítány základní charakteristiky testu. Namìøené hodnoty i charakteristiky testù jsou shrnuty v tabulce 2. Oba testy vykazují velmi malou odchylku mìøení, jak lze vidìt z výsledkù opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti. Malé odchylky mìøení jsou pøitom dùleité z hlediska spolehlivosti výsledkù a správného monitoringu virové náloe u pacientù s chronickými hepatitidami. V rámci ovìøení pracovního rozsahu
Tab. 2: Verifikace nových kvantifikaèních testù HBV a HCV provádìných na cobas® 4800. Stanovení opakovatelnosti, mezilehlé preciznosti a ovìøení základních parametrù testù (smìrodatná odchylka, variaèní koeficient, bias a rozíøená kombinovaná nejistota mìøení)
16
Labor Aktuell 03/16
Tab. 3: Ovìøení pracovního rozsahu nových kvantifikaèních testù
kvantitativního testu HBV byl testován limit detekce (4,4 IU/ml) a lineární rozsah (10 IU/ml a 109 IU/ml). U kvantitativního testu HCV pak byl ovìøen limit detekce (9,2 IU/ml) a lineární rozsah testu (15 IU/ml a 108 IU/ml) (tabulka 3). V rámci testování detekèního limitu oba testy detekovaly i polovinu limitu detekce stanoveného výrobcem. Pøestoe limit detekce u obou testù leel pod dolní mezí lineárního rozsahu testu, v pøípadì HCV byla stanovena virová nálo a celkovì výsledky virové náloe pøi dolní hranici lineárního rozsahu HCV testu byly mírnì nadhodnoceny. U vysoce pozitivního HCV vzorku pak byla namìøená virová nálo mení. To vak mùe být zpùsobeno delím skladováním a opakovaným rozmraením vzorku. V pøípadì testu HBV výsledky ovìøující lineární rozsah velmi dobøe korelují. Pøi testování potøebného vstupního mnoství klinického materiálu v alternativních sekundárních zkumavkách bylo pouito 8 vzorkù o rùzných objemech (450 µl a 800 µl). Minimální vstupní objem vzorku byl tímto experimentem definován na 600 µl, co znamená, e mrtvý objem, který nemùe pøístroj pouít, se zmenil na polovinu. Pøístroj cobas® x480 byl sice schopen nalézt hladinu a pouít i vzorek s objemem 550 µl, nicménì kvùli moné pipetovací chybì nemùeme toto mnoství spolehlivì doporuèit (obrázek 1).
Diskuse Ze srovnání výsledkù testù pro kvantifikaci virové náloe HBV a HCV je patrné, e oba srovnávané systémy poskytují výsledky o velmi dobré shodì. Mírné nadhodnocení nebo podhodnocení výsledkù, a ji v rámci srovnání systémù nebo pøi
Obr. 1: Testování vstupního objemu, který je nutný pro zpracování vzorku v alternativních sekundárních zkumavkách
verifikaci pracovního rozsahu, jsou z klinického hlediska pro lékaøe nepodstatné. Jeliko i pøi hodnocení léèebné odpovìdi jsou nejdùleitìjím ukazatelem mocninné exponenty virové náloe, bylo i srovnání testù provedeno v logaritmickém mìøítku.
Verifikací kvantifikaèních testù HBV a HCV na automatickém pøístroji cobas® 4800 bylo dokázáno, e pøístroj splòuje vechny potøebné parametry pro rutinní pouití v laboratoøi, pøièem eliminuje podstatnou èást lidské práce, a tudí
Verifikací kvantifikaèních testù HBV a HCV na automatickém pøístroji cobas® 4800 bylo dokázáno, e pøístroj splòuje vechny potøebné parametry pro rutinní pouití v laboratoøi, pøièem eliminuje podstatnou èást lidské práce, a tudí monost chyby zpùsobené lidským faktorem. Labor Aktuell 03/16
17
monost chyby zpùsobené lidským faktorem. Pøi ovìøení pracovního rozsahu bylo navíc prokázáno, e oba testy dokáou detekovat i polovinu detekèního limitu uvádìného výrobcem, co umoòuje dostateènou senzitivitu testu i v pøípadì malých virových náloí v zaèátcích onemocnìní èi relapsu. Samotný pøístroj vak potøebuje drobné softwarové i hardwarové úpravy. Izolátor cobas® x480 vyaduje relativnì velký objem klinického materiálu v sekundární zkumavce doporuèované výrobcem, aby byl schopen nabrat vzorek k izolaci. To vede k potøebì mnohem vìtího objemu vzorku (doporuèeno je 800 µl), pøestoe samotná izolace probíhá pouze ze 400 µl
klinického materiálu. Urèitým východiskem mùe být volba alternativní sekundární zkumavky, co v naem pøípadì zmenilo nevyuitý objem na polovinu. Ovem vhodnìjím øeením by byla úprava nastavení izolátoru. Samotný pøístroj umoòuje také alternativní postup, izolaci z 200 µl klinického materiálu, který lze pouít i s mením vstupním objemem (doporuèeno 600 µl). Tato monost je nicménì spojena s mírnì nií senzitivitou testù a potøebou speciálního diluentu. Protoe diluent nebyl v dobì naeho testování k dispozici, tuto monost jsme nezkoueli. V softwaru je poté potøeba zapracovat limity pro dolní i horní meze lineárního rozsahu testù tak, aby byly virové náloe, které jsou pod nebo nad touto hranicí, uvádìny na výsledku jako <10 IU/ml nebo >1x109 IU/ml u testu HBV a <15 IU/ml nebo >1x108 IU/ml u testu HCV. V souèasnosti je toti uvádìno pouze <min Titer nebo >max Titer, co mùe komplikovat spárování s laboratorním informaèním systémem nebo mùe dojít k lidské chybì pøi pøepisu výsledkù, jeliko se u obou testù lineární rozsah lií. Celkovì vak kvantifikaèní testy HBV
a HCV zpracované pøístrojem cobas® 4800 podstatnì urychlí èas potøebný k vydání výsledku pøi souèasné redukci manuální pracnosti obou metod.
Závìr V této práci je diskutováno pouití pøístroje cobas® 4800, který pøináí vyí stupeò automatizace, s dosud pouívaným systémem cobas® TaqMan® 48, který je zaloen na manuálním zpracování. Z výsledkù testování vyplývá, e obì metody poskytují srovnatelné výsledky. Kvantifikace virové náloe HBV i HCV na pøístroji cobas® 4800 splòuje vekeré poadavky kladené na rutinní pouití kvantitativních metod v laboratorní praxi. Pouitím jiných sekundárních zkumavek lze navíc analýzu spustit bez nutnosti øedìní z meního mnoství klinického materiálu, pøedevím díky zmenení mrtvého (nevyuitého) objemu.
Kvantifikace virové náloe HBV i HCV na pøístroji cobas® 4800 splòuje vekeré poadavky kladené na rutinní pouití kvantitativních metod v laboratorní praxi.
Literatura: 1) Husa P., Husová L. Virové hepatitidy. 1. vyd. Praha: Galén 2005, 247 s. 2) Conjeevaram H.S., Lok A.S.F. Management of chronic hepatitis B. J Hepatol 2003; 38 (Suppl. 1): S90S103. 3) Lee W.M. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 1997; 337: 17331745. 4) Lok A.S.F, Heathcote E.J., Hoofnagle J.H. Management of hepatitis B: 2000 Summary of a workshop. Gastroenterology 2000; 120: 18281853. 5) Lok A.S.F, McMahon B.J. Chronic hepatitis B: update of recommendations. AASLD Practice Guideline. Hepatology 2004; 39: 857861. 6) Nìmeèek V. Sérologický pøehled ÈR v roce
18
Labor Aktuell 03/16
2001 virová hepatitida A, B, C. Zprávy CEM 2003; 12: 5561. 7) Ozaras R., Corti G., Ruta S., Lacombe K., Mondelli M.U., Irwing W.L., Puoti M., Khalighi A., Santos M.L., Harxhi A., Lazarevic I., Soriano V., Gervain J., Leblebicioglu H., Salmon D., Arends J.E. Differences in the availability of diagnostics and treatment modalities for chronic hepatitis B across Europe. Clin Microbiol Infec 2015; 21 (11): 10271032. 8) Galský J., Husa P., Kümpel P., Nìmeèek V., Plíek S., perl J., Urbánek P., Volfová M. (abecednì). Diagnostika a léèba chronické virové hepatitidy C (HCV). Doporuèený postup Èeské hepatologické spoleènosti a Spo-
leènosti infekèního lékaøství z roku 2002. Klin mikrobiol inf lék 2003; 9: 5456. 9) Strader D.F.B., Wright T., Thomas D.L., Seeff L. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology 2004; 39: 11471171. 10) Chevaliez S., Pawlotsky J.M. Virology of hepatitis C virus infection. Best Pract Res Cl Ga 2012; 26 (4): 381389. 11) Kania D., Ottomani L., Meda N., Peries M., Dujols P., Bolloré K., Rénier W., Viljoen J., Ducos J., Van de Perre P., Tuaillon E. Performance of two real-time PCR assays for hepatitis B virus DNA detection and quantitation. J Virol Methods 2014; 201: 2430.