KVANTITATIVNÍ ANALYTICKÉ METODY

Základy analýzy potravin

Přednáška 4

KVANTITATIVNÍ ANALYTICKÉ METODY 1. absolutní (bezkalibrační) • • • •

odměrná analýza (většina metod) vážková analýza (většina metod) coulometrie technika isotopového zřeďování • detekce aktivity radionuklidu • ID-MS

2. srovnávací (kalibrační) – ostatní metody Srovnávací (kalibrační) metody Analytický signál Kalibrace Kalibrační funkce, citlivost Mez detekce, mez stanovitelnosti Analytická funkce

1


Přednáška 4

METODY ZALOŽENÉ NA INTERAKCI HMOTY A ELEKTOMAGNETICKÉHO ZÁŘENÍ Základní klasifikace 1. metody založené na interakci, při níž nedochází k výměně energie • polarimetrie • refraktometrie 2. metody založené na interakci s výměnou energie (spektrometrické metody) Elektromagnetické záření Vlnová délka λ

[m], [µm], [nm]

Vlnočet ν ν = 1/λ λ

[m-1]

[nm],

ν = 107/λ [cm-1]

Kmitočet (frekvence) ν ν = c/λ

[Hz] = [s-1]

[kHz], [MHz]

c rychlost světla ve vakuu, c = (2,99792458 ±0,00000001).108 m s-1 Energie záření energie fotonu: E = h . ν = h . c/λ

[J]

h je Planckova konstanta, h = (6,626176±0,00000036).10-34 J s jednotka energie elektronvolt (eV): 1eV = 1,6021.10-19 J 2


Přednáška 4

Spektrální oblasti elektromagnetického záření Oblast spektra γ-záření rentgenová oblast

λ ν [cm-1] 10-4-10-2 nm <20 nm

E ν [Hz] 3.1020-3.1018 >60eV > 1,5.1017

• tvrdé záření • měkké rtg. záření ultrafialová (UV)

<0,1 nm >0,1 nm 20-380 nm

> 0,8 .1015

5.105-26300

Metoda gama-spektrometrie rentgenová absorpční a fluorescenční spektrometrie, ESCA, elektronová >12 keV mikroanalýza, PIXE

5

• vzdálená (vakuová) 20-190 nm 5.10 -52600 >1,5 .1015 190-380 nm 52600-26300 • blízká viditelná (VIS) 400-800 nm 25000-12500 >0,38.1015 26300-12820 (380-780) > 3.1011

infračervená (IR)

0,8-1000 µm 12500-10

• blízká • střední • vzdálená mikrovlnná oblast

0,8-2,5 µm 12500-4000 4000-400 2,5-25 µm 25-1000 µm 400-10 1-100 mm 3.1011-3.109

radiofrekvenční oblast desetiny až jednotky m

108

3

ultrafialová (UV) spektrometrie, fluorimetrie, atomová absorpční (AAS), emisní (AES) a fluorescenční (AFS) spektrometrie molekulová absorpční spektrometrie ve viditelné oblasti, kolorimetrie, AAS, AES Ramanova spektrometrie infračervená a Ramanova spektrometrie elektronová paramagnetická (spinová) resonanční (EPR, ESR) spektrometrie nukleární magnetická resonanční (NMR) spektrometrie


Přednáška 4

POLARIMETRIE je analytická metoda založená na měření optické otáčivosti opticky aktivních látek a jejich roztoků. Optická otáčivost je schopnost opticky aktivních látek otáčet rovinu lineárně polarizovaného světla o určitý úhel α vpravo (+) nebo vlevo (-). Optickou aktivitu vykazují látky s asymetrickou molekulou. Některé látky existují jako pravotočivé i levotočivé isomery.

Základní vztah α = [α]λt . l . cw

[°<]

[α]λt je měrná otáčivost (specifická rotace) při teplotě t a vlnové délce λ l je délka měrné kyvety přístroje [dm] cw je hmotnostní koncentrace opticky aktivní látky [g/ml] Měrná otáčivost závisí • na vlnové délce světla • na teplotě (většinou mírně klesá s rostoucí teplotou) pro sacharosu platí v intervalu 5-30°C: [α]Dt = +66,525 - 0,0144 . (t-20) • na koncentraci (mírně) pro roztoky sacharosy platí v intervalu 0,005-0,65 g/ml [α]D20 = +66,435 + 0,87 . cw - 2,35.10-2 . cw2 4


Přednáška 4

Obvyklé podmínky měření • dublet spektrálních čar sodíkové výbojky (589,0 a 589,6 nm, označení D) • teplota 20°C Za těchto podmínek se měrná otáčivost označení [α]D20 a platí vztah α = [α]D20 . l . cw [°<]. Pravidlo o aditivitě otáčivosti Roztok dvou opticky aktivních látek A a B o hmotnostních koncentracích cwA a cwB vykazuje otáčivost, která je dána součtem příspěvků obou opticky aktivních složek:

α = l . ([α]D20(A) . cwA + [α]D20(B) . cwB) Měřící přístroje • polarimetry • sacharimetry

schema polarimetru

5


Přednáška 4

Analytické využití polarimetrie Měrné otáčivosti běžných sacharidů Látka dextrin D-fruktosa D-galaktosa D-glukosa invertní cukr laktosa

[α]D20 +194,8 -93,78 +80,47 +52,74 -20,59 +55,3

Látka maltosa rafinosa sacharosa škrob xylosa

[α]D20 +137,5 +123,01 +66,53 +196,4 +18,8

Některá stanovení • měření koncentrace jedné opticky aktivní látky v roztoku • stanovení sacharosy • ve směsi s invertním cukrem • ve směsi s monosacharidem • ve směsi s jiným oligosacharidem

6


Přednáška 4

REFRAKTOMETRIE je metoda založená na měření indexu lomu. Absolutní index lomu je poměr rychlosti světla ve vakuu k rychlosti v měřeném prostředí (vzorku) N = c/vλ Relativní index lomu je poměr rychlostí světla (vlnové délky λ) v prostředí 1 (vzduch) a 2 (vzorek) n = vλ1/ vλ2 = sin α/sin β α je úhel dopadu paprsku na fázové rozhraní β je úhel lomu paprsku N = 1,0000028 . n Index lomu závisí • • • •

na teplotě (u tuhých látek se n mění s teplotou jen málo) na tlaku (prakticky jen u plynů) na vlnové délce světla (n je přímo úměrný kmitočtu) na hustotě prostředí (koncentraci)

Refraktometry: Pulfrichův Abbeův ponorný 7


Přednáška 4

Obvyklé podmínky měření • teplota 20°C • světlo wolframové žárovky nebo sodíkový dublet Analytické využití refraktometrie • ověření čistoty látek (rozpouštědla, krystalické látky) • měření koncentrace roztoků (směs EtOH + voda, vodný roztok sacharosy) – refraktometrické stanovení sušiny

Index lomu vodných roztoků sacharosy 1,52 1,5 1,48 1,46 1,44

n 1,42 1,4 1,38 1,36 1,34 1,32 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% sacharosy

• univerzální detekce látek v kapalinové chromatografii (při použití isokratické eluce)

8


Přednáška 4

MOLEKULOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE VE VIDITELNÉ A ULTRAFIALOVÉ OBLASTI (UV/VIS SPEKTROFOTOMETRIE) Synonymum: spektrometrie v oblasti elektronových spekter Podstata metody • absorpce zářivé energie molekulami analytu při průchodu paprsku vzorkem ⇒ valenční elektrony přechází na vyšší energetickou hladinu (přechod elektronu z vazebného orbitalu π nebo σ nebo z nevazebného orbitalu n do antivazebných orbitalů π* nebo σ*) • absorpce je dána přítomností chromoforu v molekule Využívané spektrální oblasti • blízká ultrafialová 190-380 nm • viditelná 380-780 nm (některé přístroje 190-1100 nm) Absorpce v UV oblasti • chromofory např. −CH=CH− −CH=CH−CH=CH− >C=O >C=N− −N=N− (nad 250 nm), aromatická jádra • nasycené sloučeniny absorbují jen ve vakuové oblasti Absorpce ve viditelné oblasti • sloučeniny chromofory: −N=N− , C=S, −N=O v konjugaci s −C=C− a (heterocyklickými) aromatickými jádry • vícejaderné aromatické a heterocyklické sloučeniny

9


Přednáška 4

Barevnost, komplementarita barev Vlnová délka světla 400-435 nm 435-480 nm 480-490 nm 490-500 nm 500-560 nm 560-580 nm 580-595 nm 595-610 nm 620-760 nm

Barva světla fialová modrá zelenomodrá modrozelená zelená zelenožlutá žlutooranžová červenooranžová červená

Barva roztoku žlutozelená žlutá-žlutooranžová oranžová červenooranžová červená-purpurová fialová modrá zelenomodrá modrozelená

Uspořádání experimentu Veličiny v absorpční spektrometrii Transmitance τ = Φ/Φ0 Absorbance A= -log τ = log (Φ0/Φ) Základní vztah Φ = Φ0 . 10-εbc log Φ = log Φ0 - ελ . b . c log Φ0 - log Φ = ελ . b . c

Lambertův-Beerův zákon

Aλ = log (Φ0/Φ) = ελ . b . c Aλ = log (Φ0/Φ) = aλ . b . cw ελ [l.mol-1.cm-1] molární absorpční koeficient aλ [l.g-1.cm-1] (hmotnostní) absorpční koeficient 10


Přednáška 4

Absorpční spektrum A vs. λ ε vs. λ (nebo A resp. ε vs. ν) τ vs. λ (nebo τ vs. ν) Výběr podmínek pro spektrofotometrické měření • • • • •

přístroj (jedno a dvoupaprskový, λ= konst. nebo scan λ) vlnová délka (délky) ⇒ druh kyvety šířka štěrbiny koncentrace absorbující látky a tloušťka kyvety druh rozpouštědla

Kvantifikace výsledků měření 1) přímý výpočet koncentrace z absorbance a známé hodnoty absorpčního koeficientu: c = A/(b. ελ)

[mol/l]

2) kalibrace a odečet z kalibrační křivky (výpočet z analytické funkce) 3) výpočet koncentrací z hodnot absorbancí a absorpčních koeficientů na základě aditivity absorbancí (multikomponentní analýza)

11


Přednáška 4

Základní součásti absorpčního spektrofotometru • zdroj záření (180-360 nm deuteriová výbojka, nad 360 nm wolframová lampa) • dispersní systém (monochromátor) • kyveta se vzorkem (srovnávací kyveta) • detektor (fotonásobič nebo DAD)

12


Přednáška 4

Analytické aplikace UV/VIS spektrofotometrie • spektrální charakterizace neznámých látek • fotometrická indikace při titracích s barevným indikátorem • stanovení barevných látek • přírodní barviva (anthokyany, chlorofyly…) • syntetická barviva • stanovení látek absorbujících v UV oblasti • • • • • •

bílkoviny (aromatické aminokyseliny) nukleotidy a nukleové kyseliny některé vitaminy, kofaktory enzymů fenolové látky aromatické uhlovodíky heterocyklické sloučeniny (alkaloidy)

• stanovení neabsorbujících látek po jejich konverzi na látky absorbující • substituční reakce: příprava 2,4-dinitrofenylderivátů aminokyselin (lysin) • kondenzační reakce • aminokyseliny + ninhydrin → barevné produkty • produkty dehydratace cukrů v kyselém prostředí + aromatická činidla (1-naftol, orcinol, anthron) → barevné látky • cholesterol + acetanhydrid + H2SO4 → modrozelené zbarvení • nenasycené aldehydy + aromatický amin (p-anisidin) → žluté zbarvení • formaldehyd + acetylaceton + NH3 → žlutý diacetyldihydrolutidin 13


Přednáška 4

• redoxní reakce • vznik NADH+H+ nebo NADPH+H+ při dehydrogenaci substrátů pyridinovými dehydrogenasami • redukce molybdatofosforečné kyseliny na molybdenovou modř (stanovení fosforu) • komplexotvorné reakce • stanovení kovů po reakci s chelatačními činidly (Fe3+ +SCN- → červené zbarvení Fe2+ + 2,2′-bipyridyl → červené zbarvení Cu2+ + NaDDC → žluté zbarvení…) • stanovení bílkovin biuretovou metodou • selektivní detekce v kapalinové chromatografii Poznámky automatizace spektrofotometrického měření využití spektrofotometrie pro studium chemických reakcí (rovnováhy, kinetika, stechiometrie)

14


Přednáška 4

MOLEKULOVÁ FLUORESCENČNÍ SPEKTROMETRIE patří mezi metody luminiscenční analýzy Luminiscenční jevy

metody

fluorescence

fluorimetrie a spektrofluorimetrie

fosforescence

fosforimetrie

Podstata fluorescence a fosforescence molekula absorbuje zářivou energii ze zdroje (vlnová délka λ1) a dostává se do excitovaného stavu. Z excitovaného stavu do základního přechází vyzářením (emisí) fluorescenčního záření (vlnová délka λ2) (Rozdíly: fluorescence: dosvit 10-9-10-6 s fosforescence: dosvit 10-3-10-2 s) Látky vykazující fluorescenci • kondenzované vícejaderné aromatické a heterocyklické sloučeniny • komplexy kovů s některými organickými ligandy Experimentální uspořádání

schema spektrofluorimetru 15


Přednáška 4

Spektrum • excitační • emisní Kvantitativní vztahy ΦF = k . Φabs = k . (Φ0-Φ) = k . Φ0 . (1-10-εbc) ΦF ≈ k′ . Φ0 . c (koeficient k′ v sobě zahrnuje také molární absorpční koeficient ε látky při vlnové délce excitačního záření a délku absorpční dráhy b) Analytické vlastnosti fluorimetrie • • • •

vysoká selektivita vysoká citlivost omezený koncentrační rozsah horší robustnost

Analytické aplikace fluorimetrie • stanovení stopových množství PAH, vitaminů (riboflavin, thiamin…), porfyrinů, mykotoxinů, hormonů… • velmi selektivní a citlivá detekce těchto látek v kapalinové chromatografii

16


Přednáška 4

ATOMOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE (AAS) je metoda prvkové analýzy založená na absorpci záření resonanční spektrální čáry prvku volnými atomy daného prvku. Měřená absorbance je funkcí koncentrace volných atomů v atomizovaném vzorku. Využívaná spektrální oblast: blízká ultrafialová až viditelná (čára As 193,7 nm, čára K 766,5 nm) Experimentální uspořádání a součásti spektrometru

• • • • • • •

zdroj záření (výbojka s dutou katodou) optické prvky (zrcadla) absorpční prostředí (plamen, elektrotermický atomizátor) monochromátor zařízení pro korekci nespecifické absorpce detektor záření (fotonásobič) vyhodnocovací a řídící zařízení

Schema dvoupaprskového AA spektrometru

17


Přednáška 4

Analytické aplikace AAS stanovení malých a stopových koncentrací kovů a některých polokovových a nekovových prvků (As, Se, Ge, Si, B) v roztocích. Vzorek se zpravidla převede do roztoku zředěné minerální kyseliny (HNO3 nebo HCl) Pracovní techniky AAS • • • •

plamenová AA spektrometrie (F AAS) AAS s elektrotermickou atomizací (ET AAS, GF AAS) technika generování hydridů (HG AAS) technika studených par (CV AAS)

Plamenová AAS • slouží k rychlému stanovení malých koncentrací prvků (setiny až desítky mg/l) citlivost charakteristická koncentrace • roztok vzorku se kontinuálně nasává do zmlžovače a vytvořený aerosol se přivádí do plamene Plameny: • C2H2-vzduch: stanovení alk. kovů, Mg, (Ca), (Cr), Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sb, Te, Ir, Pt, Au, (Hg), Tl, Pb, Bi • C2H2-N2O: stanovení Be, Sr, Ba, Sc, Ti, Zr, V, Cr, Mo, W, Y, La, lanthanoidů, B, Al, Si, Ge, Sn, As, Se, Os, Re, U AAS s elektrotermickou atomizací • slouží ke stanovení stopových a ultrastopových koncentrací prvků (setiny až stovky µg/l) • jednorázová dávka vzorku (5-50 µl) • odpaření rozpouštědla, termický rozklad a atomizace v grafitové kyvetě

18


Přednáška 4

INFRAČERVENÁ SPEKTROMETRIE • založena na měření infračerveného (IR) záření • absorbovaného vzorkem při průchodu paprsku vrstvou vzorku (transmisní měření, měřená veličiny transmitance, absorbance), nebo • odraženého povrchem vzorku (reflexní měření, měřená veličina reflektance) • měřené vzorky: tuhé (bez úpravy, KBr tablety), kapalné (filmy čistých látek, roztoky v CCl4, CS2, CHCl3) • absorpce IR záření → změna vibračních a rotačních stavů molekul • vibrace molekul • valenční • deformační

Rozdělení oblastí IR záření a metod IR oblast λ = 0,8-1000 µm • blízká infračervená oblast (NIR): λ = 0,8-2,5 µm • střední infračervená oblast (MIR): λ = 2,5-25 µm (vlnočet 4000-400 cm-1) • (vzdálená – FIR: λ = 25-1000 µm)

Aplikace IR spektrometrie poskytuje informace o molekulách obsažených ve vzorku (funkční skupiny, mezimolekulové interakce). NIR spektrometrie: kvantitativní nedestruktivní analýza hlavních složek vzorku (v potravinářské analýze: stanovení vody, bílkovin, tuků, sacharidů, vlákniny…) MIR spektrometrie: především identifikace organických látek; MIR spektrum látku charakterizuje, je možné z něj určit jaké funkční skupiny molekula obsahuje (oblast charakteristických vibrací – 40001250 cm-1), příp. určit totožnost látky srovnáním s atlasem (knihovnou) spekter (porovnání také v tzv. oblasti otisku palce – 1250-400 cm-1).

V menší míře se MIR používá také ke kvantitativní analýze. 19


Přednáška 4

NUKLEÁRNÍ MAGNETICKÁ RESONANČNÍ SPEKTROMETRIE • založena na absorpci vysokofrekvenčního elektromagnetického záření jádry určitých atomů vzorku umístěného v magnetickém poli • nejčastěji využívaná jádra: nuklidy 1H, 13C, (19F, 31P, 35Cl…) • druhy NMR spekter • podle nuklidu (fyzikálně rozlišeno nastavením frekvenční oblasti) • 1H-NMR: protonová (vodíková) spektra • 13C-NMR: uhlíková spektra • 31P-NMR… • podle rozlišení (vysoké, nízké rozlišení signálů ve spektru). NMR spektrum látky (intensita vs. chemický posun) charakterizuje příslušnou molekulu; obsahuje signály, jejichž počet, poloha (příp. štěpení signálu) a velikost (integrální hodnota) poskytují informace • o počtu typů funkčních skupin, které obsahují atom daného druhu (nejčastěji atom 1H) • o konkrétním typu dané funkční skupiny • o bezprostředním okolí dané funkční skupiny v molekule • o počtu atomů daného druhu (např. 1H) vázaných v molekule určitým způsobem resp. o množství látky.

Aplikace NMR • identifikace organických látek (doplňkový nástroj k infračervené a hmotnostní spektrometrii) • kvantitativní analýza (např. stanovení vody, stanovení tuku, složení mastných kyselin, isotopové složení vzorků…).

20

KVANTITATIVNÍ ANALYTICKÉ METODY

Recommend Documents