KULTIVASI MIKROORGANISME
Organisme
Waktu Penggandaan sel
Bakteri dan khamir Kapang dan Alga Rumput Ayam Babi Sapi muda Manusia (muda)
20-120 menit 2-6 jam 1-2 minggu 2-4 mingu 4-6 mingu 1-2 bulan 3-6 bulan
Skema Umum Proses Kultivasi Pengembangan Inokulum
Kultur Stok
Labu Kocok
Biomassa
Cairan Fermentasi
Bioreaktor Inokulum
Supernatan Bebas Sel
Sterilisasi Media
Ekstraksi Produk
Formulasi Media
Bahan Baku Media
Pemisahan Sel
Bioreaktor
Pemurnian Produk
Pengemasan produk
Penanganan Limbah Cair
CONTOH KULTIVASI PADA SUATU BIOINDUSTRI
METODE KULTIVASI
Metode kultivasi berdasarkan cara operasi bioreaktor : - nir sinambung/curah (batch) - sinambung (continuous) - semi sinambung (fed- batch)
Continuous
CONTOH BIOREAKTOR
KULTUR CURAH/NIR SINAMBUNG Pelaksanaan kultivasi :
Bioreaktor steril diisi dengan media segar steril lalu diinokulasi dengan inokulum Î KULTIVASI (merupakan sistem tertutup)
Pada akhir kultivasi, isi bioreaktor dikeluarkan untuk dilakukan pemanenan produk (proses hilir)
Bioreaktor selanjutnya dibersihkan dan disterilisasi untuk digunakan pada kultivasi berikutnya
Penyiapan/pembersihan bioreaktor repot
Kultur Curah : 1. Kultur curah merupakan cara yang paling sederhana, sehingga menjadi titik awal untuk studi kinetika kultivasi 2. Resiko kontaminasi rendah 3. Konsentrasi produk akhir lebih tinggi 4. Tidak perlu mikroba dengan kestabilan tinggi krn waktu kultivasinya pendek 5. Dapat untuk fase fermentasi yang berbeda pada bioreaktor yang sama (Contoh : pertumbuhan sel pd fase eksponensial & pembentukan produk pd fase stasioner = metabolit sekunder 6. Pada industri farmasi, semua bahan-bahan yang digunakan harus diketahui dengan tepat, sehingga lebih praktis dengan proses curah 7. Dari aspek rekayasa bioproses, kultur curah lebih fleksibel dalam perencanaan produksi, terutama untuk memproduksi beragam produk dengan pasar kecil 8. Kelemahan : Terakumulasi produk yang dapat menghambat pertumbuhan
Kurva Pertumbuhan Bila sel ditumbuhkan pada kultur curah, maka sel akan tumbuh dengan melalui : fase lag, fase eksponensial (fase log), fase stasioner dan akhirnya fase kematian
Log Jml Sel/ml Ln X (g/l)
Lag
Eksponensial Stasioner
Kematian Lisis sel, diikuti pertumbuhan kriptik
‘Viable cell count’ dg lisis sel
Waktu
Fase Eksponensial :
Keterangan : X = konsentrasi biomassa di dalam bioreaktor (g/l bobot kering) µ = laju pertumbuhan spesifik (jam-1) t = waktu (jam)
Model pertumbuhan mikrobial ini dikenal sebagai Î Model Pertumbuhan Eksponensial
Plot antara ln[Sel] vs waktu Î akan menghasilkan hubungan garis lurus pada fase eksponensial (ingat pembelahan biner) (slope Î untuk menentukan μ)
Mengapa populasi sel meningkat dengan cara eksponensial ? Perhatikan sel tunggal di dalam bioreaktorÎ Sel ini membelah diri tiap jam (pembelahan biner). Populasi sel pada tiap waktu generasi dapat digambarkan sbb.
Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel Î 2 Î 4 Î 8 …. dst 1 Î 21 Î 22 Î 23 Î 24 ………….. Î 2n = N (jumlah sel) Pangkat (eksponen) n = jumlah generasi
Laju pertumbuhan spesifik(µ) : - Menggambarkan kecepatan reproduksi sel. - Semakin tinggi nilainya, maka semakin cepat sel tumbuh. - Pada saat sel tidak tumbuh, maka laju spesifik pertumbuhan =0 Model Pertumb Eksponensial
¾
Pada saat fase eksponensial, laju spesifik pertumbuhan relatif tetap
¾
Hasil integrasi :
Persamaan di atas menggambarkan hubungan eksponensial antara konsentrasi biomassa vs waktu
Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik :
Plot antara ln X vs t akan menghasilkan garus lurus Î Slope = μ
Hubungan antara Waktu Penggandaan (doubling time = tD) dengan laju spesifik pertumbuhan (μ) td menggambarkan waktu yang diperlukan untuk menggandakan
populasi sel Î menggambarkan laju pertumbuhan sel
Selama
fase eksponensial tD relatif konstan
Hubungan
antara tD dengan laju pertumbuhan spesifik Î bila konsentrasi biomassa menjadi dua kali dari X0 menjadi X1 selama waktu penggandaan tD (= t 1- t0) :
td = 0,693 μ
Aplikasi Kultur Curah : •
Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer dan metabolit sekunder
•
Untuk produksi biomassa Î digunakan kondisi kultivasi yang mendukung pertumbuhan biomassa, sehingga mencapai maksimal
•
Untuk prodiksi metabolit primer Î kondisi kultivasi harus dapat memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi dengan sintesis produk
•
Untuk produksi metabolit sekunder Î kondisi kultivasi harus dapat memperpendek fase eksponensial dan memperpanjang fase stasioner
KULTUR SINAMBUNG
Media segar secara kontinyu ditambahkan ke dalam bioreaktor, dan pada saat yang bersamaan cairan kultivasi dikeluarkan (Sistem Terbuka)
Sel mikroba secara kontinyu berpropagasi menggunakan media segar yang masuk, dan pada saat yang bersamaan produk, produk samping metabolisme dan sel dikeluarkan dari bioreaktor Î volume tetap
Bioreaktor kultur sinambung membutuhkan lebih sedikit pembersihan dibandingkan sistem curah.
Dapat menggunakan Sel mikroba imobil untuk memaksimumkan waktu tinggalnya (retensi), sehingga meningkatkan produktivitasnya. Imobilisasi sel : penempatan mikroba pada ruang/daerah tertentu, sehingga dapat mempertahankan kestabilannya & dapat digunakan berulang-ulang (contoh : menumbuhkan/melekatkan mikroba pada carrier)
Kultur Sinambung Kelebihan : 1. Produktivitas lebih tinggi, penyebab : - lebih sedikit waktu persiapan bioreaktor per satuan produk yang dihasilkan - laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol Î dengan mengatur laju dilusi - pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diatur Dengan demikian hanya butuh pabrik lebih kecil (pengurangan biaya modal untuk fasilitas baru) 2. Dapat dijalankan pada waktu yang lama 3. Cocok untuk proses yang resiko kontaminasinya rendah (contohnya penanganan limbah cair) & produk yang berasosiasi dengan pertumbuhan 4. Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana 5. Tidak ada akumulasi produk yang menghambat
Kultur Sinambung Dengan mengontrol laju dilusi Î dimungkinkan untuk mempertahankan laju pertumbuhan spesifik yang optimal untuk pembentukan produk Kelemahan : Aliran umpan yang lama Î resiko kontaminasi besar (operasi harus hati-hati & desain peralatan lebih baik) Peralatan untuk operasi dan pengendalian proses harus bisa tetap bekerja baik untuk waktu yang lama Memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi, karena akan digunakan pada waktu yang lama Î Terjadinya degenerasi galur mikroba yang digunakan akibat mutasi spontan menyebabkan penurunan produk yang dihasilkan Sebaiknya ada konsumen/permintaan yang tetap terhadap produk spy efisien
NERACA MASSA PADA KULTUR SINAMBUNG Biomassa : Akumulasi = Sel masuk – Sel keluar + Pertumbuhan – Sel mati
F dX F = X 0 − X + μX − αX dt V V Bila suplai medium steril (X0 = 0) dan μ >> α, maka
dX F = μX − X dt V = μX − DX = (μ − D )X Dalam keadaan setimbang (staedy state), Dcrit ≈ μmax D mendekati Dcrit ⇒ tidak stabil D > μmax ⇒ wash out
dX = 0 dan μ = D dt
Substrat : Akumulasi = nutrisi masuk – nutrisi keluar – konsumsi untuk tumbuh – konsumsi untuk pemeliharaan – konsumsi untuk sintesis produk qpX dS F F μX = Sf − S − − mX − dt V V YX YP S
Bila mX <<
S
μX , dan tidak ada pembentukan produk, maka YX S
dS μX = D(Sf − S) − dt YX
S
(
dS Saat setimbang, = 0, sehingga x = YX S f − S S dt
)
Kultur Sinambung : Start-Up Kultivasi sinambung diawali dengan kultivasi curah Setelah kultur mencapai fase eksponensial, lalu umpan dimasukkan Bila komposisi media saat start-up sama dengan umpan, perubahan dari curah ke sinambung menyebabkan konsentrasi sel atau produk berosilasi (A) Î penyebab : kultur mikroba mengalami hambatan oleh substrat) Î dicegah dengan komposisi media saat start-up 1/2 umpan (B) Penambahan umpan dilakukan kira-kira setelah kons sel ½ kons sel saat “steady-state” (biomassa, substrat & produk tidak berubah dan laju metabolisme sel kontan)
B
A
Kons Sel
Kons Sel
Waktu
Dimulai kultivasi sinambung
Waktu
Kultur Sinambung :
Model hubungan laju pertumbuhan sel dgn konsentrasi substrat pada kultivasi sinambung Î Model MONOD µ µmaks
=
S KS + S
Keterangan : µ = laju pertumbuhan spesifik (jam-1) µmaks = laju pertumbuhan spesifik maksimum (jam-1) S = konsentrasi substrat pembatas (g/l)
KS
= kons substrat (g/l) pada saat ½ laju pertumbuhan spesifik maksimum Î menggambarkan efisiensi mikroba dalam mengkonsumsi substrat
Model yang menghubungkan X, S dan D
μ max .S μ= Ks + S
Persamaan Saat Tidak Setimbang (Non-Steady State) Biomassa
dX = (μ − D )X dt ⎛ μ max .S ⎞ = ⎜⎜ − D ⎟⎟ X ⎝ Ks + S ⎠ Substrat
dS μX = D(Sf − S) − YX dt
S
X = D(Sf − S) − YX
S
⎛ μ max .S ⎞ ⎜⎜ ⎟⎟ ⎝ KS + S ⎠
D=μ Persamaan dalam Keadaan Setimbang (Steady State) Substrat
DK S dS = 0, maka S = Bila dt μ max − D Biomassa
(
X = YX S f − S S
)
⎛ DK S ⎞ ⎜ ⎟⎟ = YX ⎜ S f − S μ max − D ⎠ ⎝ S fungsi dari D X fungsi dari D dan S f
D=
μ max .S KS + S
D kritis D kritis ⇒ D terendah saat mana wash out terjadi
D C = μ max dan S = Sf D C = μ max
Sf K S + Sf
DC fungsi dari Sf . Bila Sf >> KS, maka DC = μmax
Aplikasi Kultur Sinambung :
Digunakan untuk penelitian fisiologi dan biokimia mikroba, dikarenakan kondisinya mantap, laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir dan laju pertumbuhan dibatasi oleh konsentrasi substrat pembatas Î dapat digunakan untuk penelitian pengaruh substrat pembatas thd kinerja mikroba, untuk perbaikan sistem curah/semi sinambung
Untuk isolasi dan seleksi mikroba penghasil enzim menggunakan media diperkaya
Untuk produksi biomassa, contoh ICI (Imperial Chemical Industries, kapasitas bioreaktor 3000 m3, substrat metanol)
Untuk produksi bir menggunakan bioreaktor menara (tower bioreactor)
KULTUR SEMI SINAMBUNG (FED-BATCH)
Media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor tanpa pengeluaran isi bioreaktor.
Pada kultur fed batch, media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor tanpa pengeluaran isi bioreaktor secara kontinyu.
Harus disediakan ruang dalam bioreaktor untuk penambahan media
Pada saat isi bioreaktor penuh, bioreaktor dikosongkan, baik sebagian atau seluruhnya dan proses dimulai kembali.
Dapat mengurangi efek represif sumber karbon akibat penggunaan kons substrat yang tinggi dan mempertahankan kapasitas aerasi dalam bioreaktor
Dapat mencegah efek toksik komponen media
Aplikasi Kultur Semi Sinambung (Fed-Batch)
Untuk produksi antibiotika penisilin (metabolit sekunder) Î - kultivasi 2 tahap : fase pertumbuhan sel cepat dan fase produksi yang diatur dengan mengatur umpan substrat glukosa - Na-fenilasetat (prekursor) toksik thd Penicillium chrysogenum Î pengumpanan harus diatur
Untuk memproduksi enzim yang rentan thd represi katabolit Contohnya : selulase oleh Trichoderma reesei
Perbandingan Berbagai Metode Kultivasi Kultur Curah Semi Sinambung
Kultur Sinambung
Aliran masuk (Fin) Aliran keluar (Fout)
Fin = Fout = 0
Fin> 0, Fout = 0
Fin = Fout > 0
Volume kultur
Konstan
Meningkat
Konstan
Pengendalian kons substrat
Tdk mungkin (menurun)
Mungkin (konstan)
Mungkin (konstan)
Konsentrasi Sel
Rendah (<5 g/l)
Kons. tertentu (> 100 g/l)
Kons. tertentu
Konsentrasi produk
Meningkat s.d tk rendah
Meningkat s.d tk tinggi
Konstan
Kemudahan bagi pengguna
Mudah
Agak mudah
Sulit
Bahaya kontaminasi
Tidak serius
Tidak serius
Serius
CONTOH PERHITUNGAN KINETIKA
Kinetika Curah (Batch) Produksi Etanol oleh bakteri Zymomonas mobilis Waktu (jam)
Biomassa (g/l)
Glukosa (g/l)
Etanol (g/l)
ln biomassa
5
0,05
247
1,5
-2,99573
9
0,15
240
5
-1,89712
14
0,45
225
12
-0,79851
18
1,2
195
22
0,182322
22
2,8
130
47
1,029619
24
3,4
100
63
1,223775
26
3,8
75
74
1,335001
30
4,15
40
90
1,423108
35
4,2
25
100
1,435085
ln X (g/L)
kurva pertumbuhan 2 1 0 -1 -2 -3 -4
5
9
14
18
22
24
26
Waktu (jam )
Fase eksponensial = 5 – 22 jam
30
35
Penent Laju Pertumb. Spesifik
Ln Biomassa (g/l)
2 y = 0,2355x - 4,0992 R2 = 0,9984
1 0 -1 0
5
10
15
20
25
-2 -3 -4 Waktu (jam )
Laju Pertumb. Spesifik maks (μmaks) = 0,24 Jam-1
Waktu (jam)
(X-Xo)
(So-S)
(P-Po)
5
0
0
0
9
0,1
7
3,5
14
0,4
22
10,5
18
1,15
52
20,5
22
2,75
117
45,5
24
3,25
147
61,5
26
3,75
172
72,5
30
4,1
207
88,5
35
4,15
222
98,5
(P-Po ) g /l
Yp/s 50 40 30 20 10 0
y = 0,3827x + 0,8447 R2 = 0,9983 0
50
100 (So-S) g/l
Yp/s = 0,38 g etanol/g substrat
150
Yx/s
(X-Xo) g/l
4 3 2
y = 0,0273x + 0,4472 R2 = 0,8583
1 0 0
50
100 (So-S) g/l
Yx/s = 0,03 g etanol/g substrat
150
Yp/x
(P-Po) g/l
60 40
y = 12,047x - 2,4313 R2 = 0,8615
20 0 -20
0
1
2
3
(X-Xo) g/l
Yp/x = 12,047 g etanol/g biomassa
4
