Krónikus légúti gyulladás nem invazív mérése gyermekkori asztmában és primer ciliáris diszkinéziában

Ph. D. Értekezés

Krónikus légúti gyulladás nem invazív mérése gyermekkori asztmában és primer ciliáris diszkinéziában Dr. Csoma Zsuzsanna

Témavezető:

Dr. Herjavecz Irén Dr. Horváth Ildikó

Szigorlati Bizottság: Prof. Dr. Vastagh Endre Prof. Dr. Losonczy György Dr. Fónay Károly Bíráló bizottság:

Prof. Dr. Cserháti Endre Dr. Kósa Lajos Dr. Gálffy Gabriella

Hivatalos bírálók:

Dr. Mezey Györgyi Dr. Halász Adrienn

Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola Tudományági Doktori Iskola: Klinikai Orvostudományok Budapest, 2004

Tartalomjegyzék 1

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE.................................................................................................. 3

2

BEVEZETÉS............................................................................................................................. 6 2.1

A GYERMEKKORI ASZTMA EPIDEMIOLÓGIÁJA, NÉPEGÉSZSÉGÜGYI JELENTŐSÉGE ......................... 6

2.2

LÉGÚTI GYULLADÁS ASZTMÁBAN ................................................................................................. 7

2.3

PRIMER CILIÁRIS DISZKINÉZIA EPIDEMIOLÓGIÁJA, A BETEGSÉG KLINIKAI VONATKOZÁSAI......... 11

2.4

A LÉGÚTI GYULLADÁS MÉRÉSÉNEK LEHETŐSÉGEI ...................................................................... 12

2.4.1 Invazív módszerek .............................................................................................................. 13 2.4.2 Nem invazív módszerek ...................................................................................................... 13 2.4.2.1 Kilégzett gyulladásos markerek ..................................................................................... 13 2.4.2.2 Indukált köpet ................................................................................................................ 19 3

CÉLKITŰZÉSEK................................................................................................................... 21

4

MÓDSZEREK ........................................................................................................................ 22 4.1

I. ALTÉMA - LEUKOTRIÉNEK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMBAN GYERMEKKORI ASZTMÁBAN............................................................................................................................... 22

4.2

II. ALTÉMA - NITROGÉN-OXID METABOLITOK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMBAN PRIMÉR CILIÁRIS DISZKINÉZIÁBAN ......................................................................................................... 27

5

EREDMÉNYEK ..................................................................................................................... 31 5.1

I. ALTÉMA - LEUKOTRIÉNEK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMBAN GYERMEKKORI ASZTMÁBAN............................................................................................................................... 31

5.2

II. ALTÉMA - NITROGÉN-OXID METABOLITOK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMBAN PRIMÉR CILIÁRIS DISZKINÉZIÁBAN ......................................................................................................... 35

6

MEGBESZÉLÉS..................................................................................................................... 40 6.1

I. ALTÉMA - LEUKOTRIÉNEK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMBAN GYERMEKKORI ASZTMÁBAN............................................................................................................................... 40

6.2

II. ALTÉMA - NITROGÉN-OXID METABOLITOK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMBAN PRIMÉR CILIÁRIS DISZKINÉZIÁBAN ......................................................................................................... 44

6.3 7

ÁLTALÁNOS MEGBESZÉLÉS......................................................................................................... 47 KÖVETKEZTETÉSEK ......................................................................................................... 54

7.1

I. ALTÉMA - LEUKOTRIÉNEK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMBAN GYERMEKKORI ASZTMÁBAN............................................................................................................................... 54

7.2

II. ALTÉMA - NITROGÉN-OXID METABOLITOK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMBAN PRIMÉR CILIÁRIS DISZKINÉZIÁBAN ......................................................................................................... 54

8

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................................ 56

9

IRODALOMJEGYZÉK......................................................................................................... 57

10

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE……………………….…………………………..…73

11

ÖSSZEFOGLALÁS

76

12

SUMMARY

78

2

1

Rövidítések jegyzéke

ARDS

Felnőttkori Respirációs Distressz Szindróma

ATS

Amerikai Tüdőgyógyász Társaság

ADO

adenozin

β2-agonista

β2 receptor agonista

BAL

bronchoalveolaris lavage

CF

cisztás fibrózis

cisz-LT

ciszteinil leukotriének (LTC4, LTD4, LTE4)

CK

kemokinek

CO

szén-monoxid

CO2

szén-dioxid

COPD

krónikus obstruktív tüdőbetegség

DAN

2,3-diaminonaftalen

DC

dentrikus sejt

DNS

dezoxiribonukleinsav

∆e° T

hőmérséklet változás

EDRF

endotél eredetű relaxáló faktor

ERS

Európai Tüdőgyógyász Társaság

FAD

flavin adenin dinukleotid

FEV1

forszírozott kilégzési térfogat a kilégzés 1 másodpercében

FMN

flavin mononukleotid

GM-CSF

granulocita-makrofág kolonia stimuláló faktor

HCl

hidrogén-klorid (sósav)

Hg2Cl

higany-klorid

H2O

víz

H2O2

hidrogén peroxid

HO

hem-oxigenáz

ICAM

intercelluláris adhéziós molekula

Ig

immunglobulin

IL

interleukin

INF

interferon

L-NAME

NG-nitro-L-arginin-metilészter

L-NMMA

NG-monometil-L-arginin 3

LT

leukotrién

MBP

fő (major) bázikus protein

MCP

makrofág kemotaktikus protein

mg/mL

miligramm/mililiter

µL

mikroliter

M

mól/liter

MM

milimól/liter

µM

mikromól/liter

nAB

antibiotikum kezelés nélkül

NADP

nikotinamid adenin dinukleotid foszfát

NaOH

nátrium-hidroxid

NO

nitrogén-monoxid

NO2∗

nitrogén-dioxid

NO2-

nitrit

NO3-

nitrát

NOS

nitrogén-monoxid szintáz

cNOS

konstitutív nitrogén-monoxid szintáz

eNOS

endoteliális nitrogén-monoxid szintáz

iNOS

indukálható nitrogén-monoxid szintáz

nNOS

neurális nitrogén-monoxid szintáz

nsz

szteroid kezelés nélkül

O2

oxigén

O2.-

szuperoxid anion -

ONOO

peroxinitrit

PAF

trombocita aktiváló faktor

PCD

primer ciliáris diszkinézia

PG

prosztaglandin

pg/mL

pikogramm/mililiter

ppb

partikulum (rész) per billió (milliárd)

RANTES

regulated on activation T-cell expressed and secreted

RNS

ribonukleinsav

SEM

standard error of the mean (az átlag szórása)

S-GSNO

s-nitrozoglutation

4

Th

T-helper limfocita

TNF

tumor nekrózis faktor

Tx

tromboxán

VCAM

vaszkuláris sejtadhéziós molekula

5

2

Bevezetés

2.1 A gyermekkori asztma epidemiológiája, népegészségügyi jelentősége Az allergiás kórképek, ezen belül az asztma a XX. század utolsó évtizedeiben a leggyakrabban előforduló gyermekkori krónikus betegséggé vált, így világszerte jelentős társadalmi és népegészségügyi problémát jelent. Számos nemzetközi vizsgálat igazolta, hogy különösen a technikai civilizáció magas szintjén álló országokban a gyerekkori asztma előfordulási gyakorisága nő. Egységes kérdőívvel végzett nemzetközi felmérés alapján az asztma a gyermekkorú lakosság körében országonként különböző, 1.5% és 30% közötti gyakorisággal fordul elő. Az asztmások száma egy adott területen belül, több év távlatában rendelkezésre álló adatokat összehasonlítva folyamatos és legtöbbször jelentős növekedést mutat1,

2

Magyarországon az elmúlt években, 142 ezer budapesti gyerek adatainak feldolgozása alapján végzett felmérés szerint az orvosok által diagnosztizált, valamint gondozott gyermekkori asztma előfordulási gyakorisága 2.26%, amely a négy évvel korábban hasonló módszerrel végzett vizsgálat eredményével összevetve 20%-os növekedést jelent3. Az asztma prevalencia növekedésének hátterében a legtöbb elmélet a „nyugati típusú életmóddal” járó változások szerepét hangsúlyozza. Ennek eredményeként az újszülötteket, csecsemőket kevesebb infekció éri (antibiotikum, védőoltások), így az ezek elleni védekezésért felelős Th1 limfocita rendszer háttérbe szorul és az atópiás vonal, a Th2 sejtek dominanciája érvényesül. Ezen kívül a környezeti hatások is felerősödnek, egyre több allergénnel érintkezik szervezetünk (lakásban tartott háziállatok), növekszik az élelmiszerekben előforduló kémiai adalékanyagok száma, valamint az ipari szennyezettség mértéke4, 5, 6. A növekvő gyerekkori asztma prevalencia mellett, feltehetően a korszerűbb asztma gyógyszerek megjelenésének köszönhetően az asztma miatti tartósabb iskolai hiányzás, a sürgősségi ellátás, a kórházi felvételek gyakorisága, a kórházban töltött napok száma, az intenzív osztályos kezelések aránya, valamint a mindennapos életvitel asztma miatti korlátozottsága csökkent7, 8. A 1-21 évesek között előforduló hirtelen halálesetek hátterében 5%-ban azonban még mindig az asztma áll 9. A rendelkezésre álló korszerű preventív gyógyszerelés mellett észlelt viszonylag magas asztma mortalitás oka nem 6

teljesen tisztázott. Valószínűleg szerepet játszik ebben az, hogy a kezelőorvosok sokszor nem értékelik megfelelően az asztma súlyosságát és a betegeket „alulkezelik”. Hasonlóképpen fontos, hogy a betegek, különösen a serdülőkorú gyerekek compliancesze gyakran nem megfelelő és állapotuk súlyosságát sok esetben alábecsülik.

2.2 Légúti gyulladás asztmában Az asztma az esetek nagy részében IgE-függő allergiás folyamatok által indukált légúti gyulladás következménye, kialakulása genetikai és környezeti hatások interakciójával magyarázható. Bronchoszkopiával vizsgálva az asztmás hörgők nyálkahártyája ödémás, lobos, a bronchoalveolaris lavage (BAL) folyadék a nem asztmás kontrollcsoporthoz hasonlítva nagyszámú limfocitát, eozinofilt, hízósejtet és aktivált makrofágot tartalmaz. A biopsziás szövetmintát is aktivált hízósejtek, makrofágok, eozinofilek és T-sejtek jelenléte jellemzi. A gyulladásos eltérések az enyhe asztmás csoportban, tünetmentesség idején is megtalálhatóak. A hízósejtek szerepe ismert az allergének és más stimulusok, mint a fizikai terhelés és a hiperventilláció (a légutak lehűlése és az ozmolaritás változása miatt) kiváltotta bronchospazmus kialakulásában. Ezeknek a stimulusoknak a hatására a hízósejtekből bronchokonstiktor hatású anyagok (hisztamin, prosztaglandinok /PG/, leukotriének /LT/) mellett olyan mediátorok (neurotrofinok, proinflammációs citokinek, kemokinek és növekedési faktorok) szabadulnak fel, amelyek az akut allergiás gyulladásos válaszban és valószínűleg a krónikus légúti gyulladás fenntartásában, valamint a remodelling kialakulásában játszanak szerepet10, 11. A monocitákból származó makrofágok mint antigénprezentáló sejtek ismertek. Az aktivált sejtek egy sor lipidmediátor (lipoxigenáz és ciklooxigenáz termékek) valamint trombocita aktiváló faktor (PAF) szekréciójára képesek, továbbá biológiailag aktív proteineket és peptideket, mint az interleukin (IL)-8, tumornekrózis faktor (TNF), granulocita-makrofág kolónia stimuláló faktor (GM-CSF), IL-1 termelnek, ami alapján feltételezhető, hogy ezek a sejtek részt vesznek az allergénre adott légúti válaszban. A dentrikus sejtek (DC) a légúti traktusban, az epitéliumban speciális hálózatot képeznek, és hatékony antigén-prezentáló sejtekként működnek. A dentrikus sejtek

7

felveszik az allergént, peptidekké dolgozzák fel, majd a nyirokcsomókhoz szállítva az el nem kötelezett T-sejteknek prezentálják és kostimulátor molekulák segítségével programozzák az allergén specifikus T-sejtek képződését, és ezáltal az adott allergénre specifikus immunválasz beindítását. A T-limfociták fontos koordináló szerepet játszanak a légúti gyulladás kialakulásában. Az asztma krónikusan aktivált Th (T helper)2 limfocitákkal jellemezhető betegség. A T sejtek eltérő citokin mintázat expresszálására kódoltak, a Th2 sejtek döntően IL-4, IL-5, IL-9 és IL-13 citokineket szekretálnak. T-sejt citokinek hatásának eredménye a légutak eozinofil infiltrációja, az eozinofil sejtek túlélése, a légúti hízósejtek jelenléte, valamint az IgE (immunglobulin E) termelés12. A B-limfociták allergiás betegségekben IgE-t, illetve az IgE képződést szabályozó faktorokat képeznek. A B sejtek IgE termelésének beindításában az IL-4 játszik központi szerepet. A légutak strukturális sejtjei, az epiteliális és endoteliális sejtek, a fibroblasztok és a légúti simaizomsejtek is gyulladásos mediátorokat (citokinek és lipid mediátorok) termelnek. Számukat tekintve a strukturális sejtek adják a gyulladásos sejtek döntő többségét, és a krónikus légúti gyulladást eredményező mediátorok fő forrását képezik. Az epiteliális sejtek állnak közvetlen kapcsolatban a környezettel, és valószínűleg kulcsszerepük van az inhalált ágensek hatására kialakuló gyulladásos reakció szabályozásában. A légutak eozinofil infiltrációja annyira jellemző vonása az asztmának, hogy patológusok a betegséget „krónikus eozinofil desquamatív bronchitis”-ként írják le. A légutakban jelen lévő eozinofilek száma összefügg az asztmás tünetek intenzitásával és a légúti hiperreaktivitással13. Szteroid kezelés mellett az eozinofil gyulladás csökken, de sok esetben a klinikailag jól kontrollált, normális tartományban eső légzésfunkciós értékekkel jellemzett állapotokban is perzisztál14. Az eozinofil sejtek a légúti epitéliumot károsító toxikus proteineket termelnek (fő bázikus protein, eozinofil kationos protein), továbbá LTC4 és PAF szekrécióra képesek. Az eozinofilek toborzásában különböző mechanizmusok vesznek részt (1. ábra).

8

1.ábra A gyulladás patomechanizmusa asztmában

Az eozinofil sejtek először a légúti keringés vaszkuláris endotél sejtjeihez kötődnek adhéziós molekulák közvetítésével, majd a szubmukozába kerülnek és aktiválódnak. Az eozinofilek adhéziójához specifikus glikoprotein molekulák (integrinek) jelennek meg az eozinofil sejtek felszínén és a vaszkuláris endotél sejtekben az intercelluláris adhéziós molekula (ICAM-1), valamint a vaszkuláris sejtadhéziós molekula (VCAM-1) expresszálódik15. Az eozinofilek migrációja során a sejtek a keringésből a légutak felszínére jutnak. Ebben a folyamatban számos mediátor involvált. A legerősebben ható, szelektív ágensek jelenlegi ismereteink szerint a kemokinek, mint a RANTES (regulated on activation T-cell expressed and secreted), az eotaxin1-3, valamint a makrofág kemotaktikus protein (MCP)-4, amelyet az epiteliális sejtek expresszálnak16. Az eozinofil válasz kialakulásához a hörgőkben a kemokinek és az IL-5 közötti együttműködés szükséges17. A légutakba már bejutott eozinofilek túlélését növekedési faktorok, mint a GM-CSF és az IL-5 szabályozzák. A neutrofilek szerepe humán asztmában tisztázatlan. Enyhe és középsúlyos asztmában nem ismert jelentőségük. Súlyos krónikus asztmában18, valamint asztma exacerbáció idején emelkedett neutrofil granulocita számot, valamint fokozott neutrofil aktivitást igazoltak19,

20

. Akut súlyos asztmában hirtelen elhaltak légútjaiban is kimutathatóak,

ami gyors neutrofil influx lehetőségére utal. Légúti tüneteket mutató csecsemők BAL folyadékában szintén magasabb arányban mutattak ki neutrofil granulocitákat21. Az sem zárható ki, hogy a súlyos asztmában észlelt különböző mértékű szteroid rezisztencia kialakulásában a neutrofileknek szerepük van. 9

Az asztmás kórélettani és kórtani jellemzők kialakulásáért nagyszámú, hatásaiban eltérő mediátor felelős. A hisztamin, prosztaglandinok, a leukotriének, citokinek, kemokinek és adenozin simaizom kontrakciót, vaszkuláris permeabilitás fokozódást, fokozott nyák szekréciót és légúti gyulladásos sejtes beáramlást okoznak. 1987-ben az endotél eredetű relaxáló faktorról (EDRF) kimutatták, hogy a nitrogén-monoxiddal (NO) azonos22. Azóta nyilvánvalóvá vált hogy az NO számos élettani és kórélettani folyamat fontos kiváltója/szabályozója, és valószínűleg szerepe van az asztma patomechanizmusában. Tekintve, hogy valamennyi mediátor hatása összetett, többszörös hatás, egy adott mediátor pontos szerepének a meghatározása asztmában nehéz. Az arachidonsav lebontása során az 5-lipoxigenáz enzim által katalizált folyamatban leukotriének (LT), a ciklooxigenáz úton pedig prosztaglandinok (PG) és tromboxánok (Tx) képződnek.

Arachidonsav

ciklooxigenáz

5-lipoxigenáz

15-lipoxigenáz

PGG 2

5-HPETE

15-HPETE

PGH 2

LTA 4

PGD 2

TxA 2

PGE 2

LTC 4

PGI 2

Lipoxinok LTB 4

LTD 4

PGF 2α LTE 4

TxB 2

2. ábra Az arachidonsav metabolizmusa

A ciszteinil leukotriéneket (cisz-LT: LTC4, LTD4 és LTE4) főként az eozinofil granulociták, valamint hízósejtek termelik. Potens bronchokonstriktorok, növelik a légúti hiperreaktivitást, fokozzák az erek permeabilitását és a légúti váladékképződést, befolyásolják a mukociliáris aktivitást. Ezen kívül eozinofil kemotaktikus aktivitásuk van, amely súlyosabb eozinofil gyulladást és további mediátor felszabadulást eredményez. Az LTE4 belégzése növeli az eozinofil, valamint neutrofil granulociták

10

számát a légúti mukozában, és ez kimutatható az indukált köpet mintákban. Újabb adatok szerint a ciszteinil leukotriének részt vesznek a légúti remodelling kialakulásában23, 24, 25, 26. Az LTD4 antagonisták protektív hatásúak a fizikai terheléssel indukált bronchospazmus kialakulására, ami igazolja a leukotriének szerepét a terhelés indukálta asztmában27. Az antileukotrién terápia tartós kezelés során javítja a tüdőfunkciót és mérsékli a klinikai tüneteket, ami közvetve megerősíti szerepüket a asztma krónikus gyulladásos folyamatainak patomechanizmusában. A neutrofilek különböző stimulusokra LTB4-et szekretálnak, és felszínükön nagy számban vannak LTB4 receptorok. Az LTB4 aktiválja a neutrofil granulocitákat és potens neutrofil kemoattraktáns. LTB4 belégzése nem befolyásolja a légzésfunkciós paramétereket asztmás betegekben, mivel a légúti simaizomra nincs jelentős hatása28, viszont növeli a neutrofilek számát a BAL folyadékban29, 30. Az LTB4 –nek hatása van a gyulladásos folyamatokra, például növeli mikrovaszkuláris permeabilitást, aktiválja a leukocitákat és fokozza azok diapedezisét, ezek a hatások, azonban csak lassan következnek be31, 32. Egyre több adat szól amellett, hogy az LTB4-nek szerepe lehet az asztma patomechanizmusában. Emelkedett LTB4 szintet mértek felnőttkori asztmások BAL folyadékában33, valamint gyerekeknél akut exacerbációban, és 1 hónappal annak lezajlását követően34.

2.3 Primer ciliáris diszkinézia epidemiológiája, a betegség klinikai vonatkozásai A primer ciliáris diszkinézia (PCD) egy összefoglaló elnevezés minden olyan kóros állapotra vonatkozóan, amely összefügg a csillószőrök kongenitális morfológiai és funkcionális defektusával. Az első PCD-vel kapcsolatos feljegyzés 1904-ből Siewert-től származik, majd a klasszikus triászt (situs inversus, bronchiektázia és sinusitis) 1935ben Kartagener írta le. A primer ciliáris diszkinézia ritka, a legtöbb esetben autoszómális recesszíven öröklődő betegség. Valószínű, hogy genetikailag heterogén csoportot képvisel, amelyben különböző gének defektusa felelős a csillószőrök eltérő strukturális, funkcionális rendellenességeiért. A betegség prevalenciája 1:20 000. Klinikai szempontból minden olyan szervet érinthet, amelynél a csillószőrök működésének szerepe van. Ennek megfelelően gyakori a méhen

11

kívüli terhesség, az infertilitás és az esetek kb. 50%-ban megfigyelhető a situs inversus, amely valószínűleg az embrionális fejlődés során a kezdetleges csillók nem megfelelő működésével és ennek következményeként a korai embrió bal-jobb orientációjának rendellenességével függ össze. A légutak tekintetében a csillók nem megfelelő működése a mukociliáris clearance elégtelenségéhez, krónikus felső, alsó légúti gyulladás kialakulásához vezet. Ritka, népegészségügyi szempontból mégis jelentős betegségről van szó. A PCD-s esetek nagy aránya egyáltalán nem kerül felfedezésre, a prevalencia alapján kalkulált, adott populáció esetén várható esetszám alig 5%-a ismert. A regisztrált PCD-s esetek egy részét is csak későn, az irreverzibilis károsodások (bronchiektázia, a krónikus felső légúti gyulladás következményeként kialakult halláskárosodás) kialakulását követően veszik gondozásba, pedig korai életkorban diagnosztizált, megfelelően kezelt betegség esetén a szövődmények kialakulása megelőzhető35, 36. Tekintve, hogy egy ritka kórképről van szó a betegség, valamint a társuló légúti gyulladás patomechanizmusa még kevéssé ismert. A légúti gyulladást a neutrofilek dominanciája jellemzi. In vitro megfigyelések alapján PCD-ben a neutrofilek bizonyos funkciói, így a motilitás, kemotaxis és a fagocitózis károsodott37. A betegség feltételezett patomechanizmusában egyre nagyobb figyelmet a nitrogénmonoxid, amely a csillóműködés ismert regulátora, a szervezet nem specifikus védelmi rendszerének (host defence) része és PCD-s betegekben mind a kilégzett levegőben, mind a felső légutakban az egészségesekénél alacsonyabb koncentrációban van jelen38.

2.4 A légúti gyulladás mérésének lehetőségei A szervezetben zajló gyulladásos folyamatok során felszabaduló mediátorok megjelennek a szérumban és bomlástermékeik kimutathatóak a vizeletmintákban. Ezek a vizsgálati anyagok könnyen hozzáférhetőek, de csak közvetett információt nyújtanak a szervspecifikus gyulladás folyamatairól. Ennek megfelelően a légúti gyulladásos folyamatok vizsgálatában előtérbe kerültek a direkt, légutakból származó vizsgálati mintát biztosító anyagvételi módszerek.

12

2.4.1

Invazív módszerek

Bronchofiberoszkopia során lehetőség van arra, hogy a hörgőnyálkahártya, vagy akár a tüdőparenchyma citológiai, hisztológiai vizsgálatára alkalmas biopsziás anyagokat nyerjünk. A bronchoalveolaris lavage-zsal vett folyadékból gyulladásos mediátorok mennyisége mérhető, és ugyancsak meghatározható a gyulladásos folyamatokban résztvevő sejtek aránya. A bronchológiai anyagvétel azonban a beteg számára megterhelő eljárás, amelyeknek szövődményi kockázata van, így különösen gyerekeknél és idős, rossz állapotú betegnél csak meghatározott indikáció alapján végezhető, széleskörű, kutatási céllal végzett vizsgálatokra nem alkalmas.

2.4.2

Nem invazív módszerek

2.4.2.1 Kilégzett gyulladásos markerek Kilégzett gázok A kilégzett levegő számos gáz halmazállapotú anyagot tartalmaz. 1991-ből származik az első adat arra vonatkozóan, hogy az endogén nitrogén-monoxid (NO) a kilégzett levegőben kimutatható39. Gázkromatográfiás vizsgálatokkal egy sor egyéb gáz, így szén-monoxid (CO), aceton, hidrokarbonok, halokarbonok, sulfid, alkilnitrát jelenlétét igazolták40. A kilégzett levegőben detektálható gázok biológiai jelentősége csak egyes esetekben ismert, viszont a relatív könnyű hozzáférhetőség, a mintavétel egyszerűsége széleskörű vizsgálatokat tesz lehetővé.

Kilégzett és nazalisan mért NO Talán a legszélesebb körben kutatott, fiziológiai, és patofiziológiai vonatkozásaiban leginkább ismert kilégzett gáz az NO. Az endogén NO-t az NO szintáz (NOS) állítja elő L-argininből. A NOS-nak két izoformja ismert. A konstitutív forma (cNOS) a neuronokban (nNOS), valamint az érendotélben (eNOS) található, de kimutatható a légúti epitél sejtekben is41,

42, 43

.A

cNOS az NO szignálszerű felszabadításával vesz részt a sejtműködés fenntartásában. A

13

NOS indukálható formáját (iNOS) citokinek, más gyulladásos mediátorok, endotoxinok aktiválják. Indukciója intenzív és hosszan tartó NO képzést biztosít. Az iNOS a gyulladásos sejtekben és a légúti epitél sejtekben, alveoláris makrofágokban fordul elő42 44

.

Egészségesekben a kilégzett levegőben mért NO-t főként az alveoláris és légúti epitél sejtekben található cNOS termeli45, míg patológiás állapotokban az iNOS aktiválódik. A cNOS működését a glükokortikoidok nem befolyásolják, ezzel szemben szteroid kezelés hatására asztmás betegekben az iNOS expressziója és ezzel összefüggésben a kilégzett NO csökken46. A kilégzett levegőben mért NO az alsó légutakból származik. A kilégzés során az alveoláris térből, valamint a légutakból származó NO keveredik47,

48

, különböző

kilégzési sebességeknél arányuk megbecsülhető49. Az orrmelléküregekben az NO pontos forrása nem ismert. Valószínű hogy az iNOS folyamatos aktivált állapotának következtében az alsó légutakénál lényegesen magasabb koncentrációban van jelen50. A kilégzett, valamint nazalis NO mérése kemilumineszcens módszerrel történik, amelynek lényege az, hogy a vizsgált mintában levő NO ózonnal reagál és nitrogéndioxid (NO2*) formájában aktivált állapotba kerül. Az aktivált NO2* foton emissziójával tér vissza a bázis energiaszintre, a kibocsátott fény intenzitása, pedig, arányos a vizsgált minta NO koncentrációjával. A nemzetközi laborokban a kilégzett NO meghatározása az Amerikai Tüdőgyógyász Társaság (ATS), valamint az Európai Tüdőgyógyász Társaság (ERS) mérési módszerek standardizálását szolgáló ajánlásai alapján történik51, 52. Az ún. „online” NO mérés során a beteg a kilégzést közvetlenül a mérőműszerbe végzi, amely kilégzett NO-t folyamatosan rögzíti, és az áramlás sebességével, a nyomással, valamint a kilégzett szén-dioxid (CO2) szintekkel együtt az idő függvényében ábrázolja. Az ún. „offline” módszernél a kilégzett levegőt egy ballonba gyűjtik és a mérést később, lehetőleg 6 órán belül végzik. A két módszerrel mért NO eredmények jó egyezést mutatnak. A kilégzett NO meghatározásánál kis ellenállással szemben végrehajtott lassú, egyenletes kilégzés során történik. Az ellenállás biztosítja azt a légúti nyomást, amely a

14

lágyszájpad záródását előidézve megakadályozza a kilégzett levegő érintkezését a felső légutakkal, ahol az NO kb. 100-szoros koncentrációban mérhető. A meghatározott sebességgel végzett egyenletes kilégzés a mérés reprodukálhatóságát biztosítja. A felső légutakban termelődő NO szintén egyszerűen mérhető. A nazalis NO meghatározása teljes belégzés állapotában, a levegő visszatartása alatt történik, amikor is az orrba helyezett csatlakozón át a mérőműszer által generált áramlással a vizsgálati minta a mérés helyére jut. Az NO számos mechanizmus révén vesz részt a szervezet fiziológiás folyamatainak fenntartásában, így ismert baktérium, vírus és parazita toxicitása, részt vesz a légutak sterilitásának biztosításában, a csillószőrök motilitásának valamint a ventilláció, perfúzió eloszlás szabályozásában53, 54. Az elmúlt években számos tanulmány látott napvilágot, amely a különböző légúti betegségek esetén mért kilégzett NO eredményeket ismerteti. Az eddigi vizsgálatok azt mutatják, hogy asztmában a kilégzett NO koncentrációja az egészségesekben talált értékek akár többszöröse is lehet, míg más krónikus gyulladással jellemzett légúti megbetegedésekben, így krónikus obstruktív tüdőbetegségben (COPD), bronchiektásiában, interstitialis pulmonalis betegségekben, légúti infekciók kapcsán ez az emelkedés sokkal kevésbé kifejezett, vagy nem is értékelhető55,

56, 57, 58, 59, 60, 61

.A

kilégzett NO koncentráció asztmás betegekben összefüggést mutat a légúti hiperreaktivitás mértékével, a vér és a köpet eozinofil sejtszámával, valamint az eozinofil kationos protein indukált köpetben mért szintjével62,

63,

64

. Asztma

exacerbációban, természetes allergén expozíció esetén, valamint az allergén-indukált légúti válasz késői szakaszában nő a kilégzett NO koncentráció, arra utalva, hogy szintje az asztmás légúti gyulladás intenzitását tükrözi65

66

. A légúti gyulladás intenzitását

csökkentő kezelések, így kortikoszteroid illetve leukotrién antagonista terápia hatására a kilégzett NO koncentráció csökken67, 68. Mivel az asztmások egy részénél a kilégzett NO emelkedés csak kisfokú, illetve a betegek kis hányadában, főként a nem-atópiás esetekben nincs kimutatható koncentráció emelkedés az egészségesekéhez képest, a mérés önmagában nem elégséges a diagnózis felállításához. Cisztás fibrózisban (CF), és PCD-s esetekben a krónikus, rekurráló légúti gyulladás mellett alacsony kilégzett NO koncentrációk mérhetőek. Markánsabb és egyéb

15

betegségek között egyedülálló mértékű ez az NO koncentráció csökkenés a PCD-s betegek felső légútjaiban38, 69 ,70. Ennek a jelenségnek a patofiziológiai háttere még nem ismert. CF-ben kimutatták, hogy az iNOS expessziója csökkent az állati eredetű, valamint humán légutakban71, PCD-ben azonban a NOS működésére vonatkozó egyértelmű adat nem áll rendelkezésre.

3. ábra Az NO képződése és metabolizmusa

Az NO egy szabad gyök, amely instabil és gyorsan metabolizálódik (2. ábra). Oxigénnel reakcióba lépve az NO-ból nitrit (NO2-) és nitrát (NO3-), míg szuperoxid anionnal (O2.-) reagálva az erős oxidáns peroxinitrit (ONOO-) képződik72. A peroxinitrit egy sor egyéb molekulával, így DNS-sel, lipidekkel, a proteinek szulfhidril csoportjával lép reakcióba. A proteinek tyrozin aminosav komponenseivel reagálva a peroxinitrit 3-nitrotyrozin képződését idézi elő. A szervezetben antioxidáns védelmi rendszer működik, amelynek fontos résztvevői a tiolok, mint a glutation, cisztein, homocisztein, albumin. Az NO metabolitjai tiolokkal reagálva s-nitrozotiolok és s-nitrozoglutation (S-GSNO) képződését eredményezi. Az s-nitrozotiolok képződése az amúgy rövid életű NO-ot „stabilizálja”, ugyanakkor bioaktivitásától nem fosztja meg, minthogy az s-nitrozotiolok maguk is aktív vazo és bronchodilátorok73,

74

. Légúti gyulladásos

folyamatokat kísérő alacsony pH-n az NO metabolitjaiból ismét NO képződhet75. A bronchoalveoláris folyadékban megjelenő nitrit, nitrát, s-nitrozotiolok mennyiségének meghatározása az NO szintézisről, az NO képzés rövid és hosszú távú változásairól ad képet, és az NO rövid életidejét figyelembe véve talán jobban tükrözi a NOS aktivitását, mint a kilégzett NO meghatározása.

16

Egyéb kilégzett gázok A légúti gyulladás, valamint az azt kísérő oxidatív stressz állapotában a gyulladásos sejtekből nagy mennyiségben szabadulnak fel reaktív oxigén gyökök, amelyek a nukleinsavak, proteinek, zsírsavak oxidációját okozzák és ezen keresztül károsítják a sejtek működését. A lipidperoxidáció során a többszörösen telítetlen zsírsavak oxidációja eredményeként hidrocarbonok, így etán és pentán képződnek, amelyek kromatográfiával a kilégzett levegőben mérhetőek. Mennyiségük nemcsak a gyulladás intenzitásáról, hanem a következményes sejtkárosodás mértékéről is információt ad76, 77, 78

.

A különböző patológiás állapotokhoz társuló oxidatív stressz károsító hatásaival szemben

a

szervezetben

védelmi

mechanizmusok

működnek.

A

defenzív

enzimrendszerek egyik képviselője a hem-oxigenáz (HO), amelynek három izoformja közül a HO-1 a leginkább indukálható. A HO-1-t egy sor gyulladásos mediátor, így a citokinek, NO, interleukinek, tumor nekrózis faktor-α, interferon-γ (INF-γ) indukálja. A HO-1 a hem lebontását katalizálja, így először biliverdin, majd a bilirubin reduktáz hatására bilirubin keletkezik, miközben szabad vas és CO képződik. Ezeknek a termékeknek számos biológiai, ezen belül antioxidáns hatása van. A CO mérhető a kilégzett levegőben és koncentrációja közvetve a légúti gyulladást reflektálja. Mérése az NO mérésével egyezően, általában az NO mérésére alkalmas eszközhöz csatlakoztatott műszerrel történik79, 80. Gyulladással járó légúti betegségekben a légúti nyálkahártya hipervaszkularizált. A gyulladásos mediátorok egy része a légutak ereiben vazodilatációt okoz. A hipervaszkularizált, hiperémiás nyálkahártyával borított légutakban a vérátáramlás, és ezáltal a hőleadás megnő, a kilégzett levegő felmelegszik. A kilégzett levegő hőmérséklete termométerrel meghatározható. A kilégzés során a hőmérséklet növekedés üteme (∆e°T) a nyálkahártya vaszkularizáltságát, hiperémiáját tükrözi81.

Kilégzett levegő kondenzátum A bronchoalveolaris folyadék összetétele a légutakban zajló élettani, valamint patofiziológiai folyamatok függvénye. Ennek vizsgálata korábban csak invazív úton, bronchoscopos lavage-zsal volt megvalósítható. A kilégzett levegő kondenzálása azon a

17

feltételezésen alapszik, hogy a kilégzett levegő részecskéi a bronchoalveolaris folyadék illetve az alsó légutak levegőjének az összetételét tükrözik A kilégzett levegőt lehűtve a benne található pára és folyadékcseppek lecsapódnak. Ezen a fizikai jelenségen alapul a kilégzett levegő kondenzálásának módszere. A mintavétel során a vizsgált személy egyenletesen és nyugodtan lélegzik egy szeleppel ellátott szájrészen keresztül, melynek segítségével a be- és kilégzett levegő elkülönül. A kilégzett levegő egy hűtött mintagyűjtőn halad át, amelyben páratartalma lecsapódik. A kilégzett levegő kondenzátumot eleinte kettős falú, jéggel hűtött üvegedényben gyűjtötték, a későbbiekben azonban speciális eszközöket fejlesztettek ki. A gyári „kondenzálók” működésének lényege a korábban használt „házilag” előállítottakéval megegyező azzal a különbséggel, hogy az eszköz hűtőrendszere annak belsejében –20 fokos hőmérsékletet tart fenn (4. ábra). A jelenleg kutatási célra használt eszközökkel 10 perc alatt kb. 1-2 ml kondenzátum gyűjthető, amelyet minták elemzéséig -70ºC-on kell tárolni.

4. ábra A kilégzett levegő kondenzátum mintavétel elve A kilégzett levegő kondenzátum mintavételi módszere egyszerű, a beteg számára nem megterhelő, biztonságosan alkalmazható eljárás, így gyermekeknél, sőt csecsemőknél és olyan súlyos állapotban levő betegeknél is alkalmazható, akiknél az invazív diagnosztikus módszerek alkalmazása nem jön szóba82,

83, 84.

. Ezért nem meglepő, hogy

az elmúlt években számos közlemény született, amelyek a kilégzett levegő kondenzátumában mért mediátor koncentrációkról számolnak be különböző légúti megbetegedésekben. E vizsgálatok legnagyobb része asztmával kapcsolatos, és csak kisebb hányaduk vizsgálja a COPD-t, CF-t, bronchiektáziát, interstitiális tüdőbetegségeket, valamint a dohányzás és a légúti infekciók hatásait (1. táblázat). 18

1. táblázat A kilégzett levegő kondenzátumban mérhető gyulladásos markerek Asztma

COPD

Dohányzás

Bronchiek

CF

tázia

Allergiás

ARDS Interstitiális Infekció

nátha

pH

85,86

87

88

87

85,89

H 2O 2

91,92

93

94

95

96

8-izoprosztán

98,99

100

100

101

TXB2

104

PGE2

99

cisz-LT

106

LTB4

107

tüdőbeteség

90

88 97 102

103

105 108

IL-6

109

110

109

110

IL-8

111

IL-4

112

INF-γ

112

TNF α

113

ADO

115

aldehid

117

glutation

117

114 116

nitrit/nitrát

118 119

120

121

119

s-nitrozotiol

122

121

123

121

nitrotyrozin

107

124

2.4.2.2 Indukált köpet A köpetindukció a nem-invazív légúti mintavétel sokat alkalmazott eszköze, amelynek lényege, hogy légzésfunkciós mérést követően a vizsgált személy meghatározott ideig (általában 15 percig) porlasztott hipertóniás (3% vagy 4,5 %-os) nátrium klorid oldatot lélegez be. Ezt követően a felköhögött „köpetet” (alsó légúti szekrétum) egy steril tartályban gyűjtik. Az így kapott vizsgálati mintából megfelelő előkészítést követően az alsó légutakból származó sejtes állomány, valamint különböző mediátorokat tartalmazó felülúszó nyerhető Megfelelően előkészítést követően a sejtes állomány nemcsak az alsó légutak sejtösszetételéről ad képet, hanem az így nyert sejtek citokémiai, immuncitokémiai

19

feldolgozásra, molekuláris biológiai módszerek alkalmazására, sejttenyésztésre is alkalmasak125, 126. A köpet felülúszó nem sejtes fázisában a gyulladásos mediátorok szintjének meghatározása viszont pontatlan eredményeket adhat, mivel a belélegzett sóoldat, valamint az indukált köpet nyáltartalma felhígítja a mintát. Ezen felül a minta feldolgozása során használt detergens is befolyásolhatja a mediátorok meghatározását. A hígulással kapcsolatos probléma ellenére számos vizsgálatban tanulmányozták a különböző

mediátorok

(eozinofil

kationos

protein,

citokinek,

leukotriének)

koncentrációját, annak változását krónikus légúti betegségekben. A mintavétel inkább szemiinvazívnak tekinthető, mivel a nátrium klorid oldat belégzése a provokációs vizsgálatokhoz hasonlóan bronchospazmust válthat ki. Ezen túl az indukció a légutakban neutrofil gyulladást idéz elő, ezért 24 órán belüli ismétlése nem ajánlott127.

20

3

Célkitűzések

A gyermekkori krónikus légúti gyulladásos betegségek (asztma, primér ciliáris diszkinézia) patofiziológiája kevésbé ismert, mint a felnőttkori kórformáké, ami azzal magyarázható, hogy a korábban légúti mintavételre használt invazív vizsgáló módszerek gyermekek esetén csak korlátozottan alkalmazhatóak. Mindamellett a gyermekkorban kezdődő krónikus betegségek jelentősége talán még hangsúlyosabb, mint a felnőttkori kórképeké. Mai ismereteink alapján ezek a betegségek a legtöbb esetben nem gyógyíthatóak, de szoros obszerváció mellett megfelelően kontrollálható folyamatok. A beteg optimális életminőségének biztosítása, valamint a késői szövődmények megelőzése gyerekek kezelésénél kiemelkedő fontosságú. A vizsgálatok célkitűzései voltak: 1. A légúti gyulladás mechanizmusának vizsgálata nem invazív módszerekkel gyermekkori asztmában 2. Primer ciliáris diszkinéziában a légúti gyulladás mintázatának vizsgálata a kilégzett levegő gyulladásos markerei alapján. I.

Altéma: Leukotriének szerepe a krónikus légúti gyulladásban gyermekkori asztma esetén.

II. Altéma: PCD-ben a nitrogén-oxid metabolitok meghatározásán keresztül az alacsony kilégzett NO koncentrációk biológiai hátterének vizsgálata.

21

4

Módszerek

4.1 I. Altéma - Leukotriének a kilégzett levegő kondenzátumban gyermekkori asztmában Bevont betegek és kontroll személyek A vizsgálatban 7-14 éves korú gyerekek vettek részt: 11 egészséges, nem atópiás gyerek, 11 enyhe intermittáló asztmás, 13 enyhe perzisztáló asztmás, valamint 13 középsúlyos-súlyos asztmás beteg. Az asztmás gyerekeket a Royal Brompton Hospital asztma járóbeteg rendelésén ellenőrizték rendszeresen. A betegeket a kezelőorvosukkal történő előzetes konzultációt követően a szokásos kontroll vizit alkalmával vontuk be a vizsgálatba. Egyéb krónikus légúti betegség, valamint a vizsgálatot megelőző 1 hónapban lezajlott exacerbáció esetén a beteget nem vontuk be a vizsgálatba. Az atópiát négy szokásos légúti allergénnel (házipor atka, Aspergillus Fumigatus, macskaszőr, fűpollen, ALK Abelló, Horsholm, Dánia) végzett bőrpróbával vizsgáltuk és abban az esetben tekintettük igazoltnak ha legalább egy > 3 mm pozitív reakciót tudtunk kimutatni. A vizsgált 37 beteg 4 gyerek kivételével atópiás asztmás volt. Az asztma diagnózisa az ATS ajánlása alapján történt. Az asztma súlyosságát a National Heart, Lung and Blood Institute (National Institutes of Health, Bethesda, MD)/ World Health Organization kritériumai szerint határoztuk meg. Az enyhe intermittáló asztmás gyerekeknek heti egy alkalomnál ritkábban voltak tünetei, nem igényeltek rendszeres preventív gyógyszerelést, asztmás roham oldására szükség szerint betamimetikumot (β2-agonista) használtak. Az enyhe perzisztáló asztmás gyerekeknek hetente többször, de nem napi gyakorisággal voltak tünetei, és rendszeresen inhalációs szteroidot (budesonid 0.2-0.4 mg, fluticasone proprionate 0.1-0.2 mg) használtak. A középsúlyossúlyos asztmás gyerekek mindennapos tüneteket mutattak, rendszeresen nagy adagú inhalációs szteroid kezelésben részesültek (budesonide napi 0.4 mg dózisnál nagyobb adagban, fluticasone proprionate napi 0.2 mg-nál nagyobb adagban és néhány betegnél az adag budesonidból meghaladta a napi 1 mg-ot, fluticasone proprionate-ból a napi 0.5 mg-ot). Egyik beteg sem szedett a vizsgálat idején LT receptor antagonistát. Az

egészséges

kontroll

csoport

a

járóbeteg

rendelést

látogató

gyerekek

hozzátartozóiból, valamint a kórház személyzetének gyerekeiből tevődött össze. Atópia,

22

vagy kórelőzményben bármilyen krónikus betegség, a közelmúltban lezajlott akut légúti infekció kizáró ok volt (2. Táblázat). Nem volt szignifikáns különbség az asztmás, valamint egészséges kontroll csoportok életkora között. A vizsgálati protokollt elfogadta a Royal Brompton és Harefield Trust etikai bizottsága, és a vizsgálatban résztvevő gyerekek, valamint szüleik írásbeli beleegyezésüket adták.

2. táblázat A vizsgálatban résztvevő egészséges kontroll személyek, valamint betegek adatai

Betegszám Életkor(évek) Nem(F/N) FEV1 (% prediktív) Atópia

Egészséges kontroll személyek

Enyhe intermittáló asztma

Enyhe perzisztáló asztma

Középsúlyossúlyos perzisztáló asztma

11

11

13

13

11.7 ± 0.4

11.2 ± 0.6

11.7 ± 0.6

11.5 ± 0.5

5/6

5/6

5/8

10/3

100 ± 5.1

96 ± 4.5

84 ± 5.7

73±4.4∗

0

11

9

13

0

0

13

0

0

0

0

13

0

0

0

7

Kezelés: Inhalációs szteroid <400µg/nap >400µg/nap ≥1000µg/nap

∗ p < 0.05 eltérés a kontroll csoporttól Vizsgálat menete A betegek adatainak felvétele, valamint a fizikális vizsgálat után kilégzett NO mérés, majd légzésfunkciós vizsgálat történt. Ezt követően kb. 10 perc elteltével került sor a kilégzett levegő kondenzátum minták gyűjtésére.

23

Kilégzett NO A kilégzett NO-t az ERS és az ATS ajánlásainak megfelelően, kemilumineszcens módszerrel (Aerocrine AB, NIOX, Stockholm, Svédország) mértük. A műszer mérési tartománya 0-25000 ppb között van, amelyből a kilégzett NO meghatározásához a 0-200 ppb közötti tartományt használtuk. A mérés pontossága 50 ppb alatt ± 2.5 ppb, 50 ppb felett ±5%. Detekciós szint 1.5 ppb, a válaszidő kisebb mint 1.5 sec. A mérőműszert 14 naponként kalibráltuk meghatározott összetételű N2-ben NO-t tartalmazó kalibrációs gázzal (200 ±20 ppb 3 bár, AGA Linde Healthcare). A mérés egy 2-3 másodperces teljes tüdőkapacitás szintjéig végrehajtott mély belégzéssel indult, amelyet eszköz szájrészén át (holttér < 10 ml) végeztek a gyerekek. A beépített szűrőrendszer biztosította, hogy a belégzés során NO mentes levegő jusson a légutakba. A mély belégzést követően ugyancsak a szájrészen át egy lassú, egyenletes kilégzés következett. A műszerbe elasztikus membrán szelepet, automatikus érzékelőt építettek be, amely biztosította az állandó (50mL/sec) kilégzési sebességet és a minimum 5 H2Ocm nyomás fenntartását. Az állandó áramlási sebesség a mérés reprodukálhatóságát biztosítja. Az eszköz által biztosított pozitív nyomás előidézi a lágyszájpad záródását, így megelőzi a felső légúti kontaminációt. A gyerekeket a műszer képernyőjén megjelenő vizuális kijelző (a kilégzéssel párhuzamos mozgó repülő ballon) segítette az egyenletes és megfelelő időtartamú (10 sec) kilégzés végrehajtásában (5. ábra). A kilégzési NO görbét a műszer automatikusan elemezte, a kilégzett NO értékét a maximális (stabil) NO szakaszon (70-100%-os kilégzésnek megfelelő tartomány) határozta meg. A kilégzett NO értékét három sikeresen végrehajtott mérés eredményének átlaga adta.

24

Légzésfunkció A

forszírozott

kilégzési

másodperc

térfogatot

(FEV1)

spirométerrel

mértük

(Vitalograph, Buckingham, Anglia). Három mérés közül a legjobb értéket választottuk ki és azt a betegre jellemző prediktív érték százalékában rögzítettük. Kilégzett levegő kondenzátum A kilégzett levegő kondenzátumot egy erre a célra tervezett kondenzáló eszközzel (ECoScreen, Jaeger, Würzburg, Németország) gyűjtöttük (6.ábra). A nyállal történő kontamináció elkerülése végett a gyerekek a mintavétel előtt a szájüreget vízzel kiöblítették. Emellett felhívtuk a figyelmüket, hogy a kondenzátumgyűjtés idején a termelődő nyálat nyeljék le. Ennek idejére az anyagvételt felfüggeszthették. A mintavétel idején a megfelelő kooperációt folyamatosan ellenőriztük. A mintavétel az eszköz szájrészén át, nyugodt légzés mellett, 8 perc alatt történt miközben a gyerekek orrcsipeszt viseltek. Az orrcsipesz megakadályozta a véletlenszerű orron keresztül történő légvételeket, ezáltal a belégzett levegő felső légúti kontaminációját. A szájrészbe épített egyenirányusító szelep belégzésnél utat engedett a környezet felé, míg kilégzésnél a levegő az eszköz belsejében elhelyezett teflon csövöt haladt keresztül. A kondenzáló hűtőrendszere az eszköz belsejében –20 °C-t tartott fenn. A kilégzett levegőben lévő pára a cső falán és az ennek végéhez csatlakoztatott műanyag tartályban csapódott le. A szájrész, valamint a szelep egyben nyálcsapdaként működött. A 8 perces mintavétel alatt 500-1000 µL kilégzett levegő kondenzátumot nyertünk. A mintagyűjtést követően a kondenzátumot kisebb frakciókra osztva műanyag tárolóedényekben azonnal –70°C-ot biztosító mélyhűtőbe tettük és az analitikai módszer elvégzéséig (max. 2-4 hét) tároltuk.

25

Leukotriének meghatározása A cisz-LT, valamint a LTB4 mérése kompetitív elven működő enzim immunoassay-vel történt (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). A mérés elve: A módszer a jelzetlen és az ismert, állandó mennyiségben a mintákhoz adott, acetilkolineszterázzal

jelzett

cisz-LT

kompentícióján

alapul,

amennyiben

mennyiségüknek megfelelő arányban kötődnek a specifikus antitesteken lévő, korlátozott számú cisz-LT receptorokhoz. A cisz-LT-antitest komplex a mérőlemezre felvitt monoklonális antitestekhez kötődik. Ezt követően a jelzőenzim szubsztrátját (Ellmans reagens) a rendszerhez adva az enzimatikus folyamat eredményeként acetilkolinból a sárga színű hullámhosszon

erősen

5-tio-nitrobenzolsav képződik,

abszorbeál.

Az

abszorbancia

amely 414 intenzitása,

nm amit

spektrofotométerrel mérünk, arányos a kötődött acetilkolineszterázzal jelölt cisz-LT mennyiségével és fordítottan arányos a vizsgált kondenzátum minta jelzetlen cisz-LT tartalmával. A standard görbét 7.8 pg/mL és 1000 pg/mL cisz-LT koncentráció tartományban vettük fel. Az assay specificitás LTC4-re 100%, LTD4-re 100%, LTE4 –re 67%, LTD5-re 61%, LTC5-re 54%, LTE5-re 41%, n-acetil-LTE4-re 10.5%. Egyéb leukotriénekre, prostaglandinokra, TXB2-re ez az érték < 0.01%. A LTB4 meghatározása: A fentiek szerint LTB4-re specifikus immunassay-vel történt. Az assay specificitása LTB4-re 100%, LTB5-re 50%, 20-hidroxi-LTB4-re 15%, 6-transz-LTB4-re 3% volt. Egyéb leukotriénekre ez az érték < 0.01%. A detekciós limit cisz-LT esetén 15.0, LTB4nél, pedig 4.4 pg/mL volt.

Statisztikai elemzés Az adatokat átlag±SEM formában adtuk meg. Kruskal-Wallis és Mann-Whitney tesztet használtunk a csoportok összehasonlításához. A korreláció vizsgálata a cisz-LT és LTB4, valamint a leukotriének és a kilégzett NO, éppúgy, mint a leukotriének és a légzésfunkciós paraméterek (FEV1) között Spearman korrelációs analízissel történt. A csoportok közötti eltéréseket p < 0.05 értéknél tekintettük szignifikánsnak. 26

4.2 II. Altéma - Nitrogén-oxid metabolitok a kilégzett levegő kondenzátumban primér ciliáris diszkinéziában Bevont betegek és kontroll személyek A vizsgálatban résztvevő betegeket a Royal Brompton Hospital gyermek PCD rendelésén ellenőrizték rendszeresen. A PCD diagnózisa a ciliák működésének (szacharin

teszt,

fénymikroszkóp:

ütési

frekvencia),

valamint

strukturális

rendellenességeinek (elektronmikroszkópos vizsgálat) meghatározására támaszkodott. A betegeket negyedéves rendszeres kontroll vizsgálatuk idején, a kezelőorvosukkal történő előzetes egyeztetést követően vontuk be a vizsgálatba. Tizenöt 7-14 éves PCD-s gyereket vizsgáltunk. Közülük 8 beteg rendszeres inhalációs szteroid kezelésben részesült, szintén nyolcan pedig rendszeresen antibiotikumot szedtek. A vizsgálat idején valamennyi PCD-s gyerek stabil állapotban volt. A korban illeszkedő kontroll csoportba 14 egészséges gyerek tartozott, akik kórelőzményében krónikus, valamint a közelmúltban lezajlott akut légúti betegség nem szerepelt (3. Táblázat). A kontroll személyek a Royal Brompton Hospital gyermek asztma járóbeteg rendelését látogató

asztmás

betegek

egészséges

hozzátartozóiból,

valamint

a

kórház

személyzetének gyerekeiből kerültek ki. A vizsgálati tervet a Royal Brompton és Harefield Trust etikai bizottsága elfogadta. A vizsgálatban résztvevő gyerekek, és szüleik írásbeli beleegyezésüket adták. 3. táblázat A vizsgálatban résztvevő egészséges kontroll személyek, valamint betegek adatai Egészséges kontroll személyek (n=14)

PCD (n=15)

11.5 ± 0.4

10.3 ± 0.7

7/7

7/8

103 ± 5.0

73 ± 2.1∗

Inhalációs szteroid

0

8

Per os szteroid

0

0

Antibiotikum

0

8

Életkor (évek) Nem (F/N) FEV1 (% prediktív) Kezelés:

∗

p < 0.0001 eltérés a kontroll csoporttól

27

Vizsgálati terv A betegek adatainak felvétele, valamint a fizikális vizsgálat után kilégzett, valamint nazalis NO-t mértünk, majd a légzésfunkciós vizsgálatot végeztünk. Ezt követően kb. 10 perc elteltével került sor a kilégzett levegő kondenzátum minták gyűjtésére.

Kilégzett NO Az NO mérést az ERS és ATS ajánlásainak megfelelően kemilumineszcens módszerrel végeztük. A mérőműszer (Logan LR 2000, Rochester, Anglia) NO érzékenysége 1 és 5000 ppb (partikulum per billió) tartományban van, felbontása 0.3 ppb. Az NO-n kívül a műszer méri a CO2-t is (0.1% felbontóképességgel, 200 ms-os válaszidővel) A műszert naponta N2-ben NO-ot tartalmazó gázzal kalibráltuk (90 ppb és 436 ppb, BOC Special Gases, Guilford, UK). A háttér NO szintén meghatározásra került és minden mérés automatikusan az abszolút zéró értékről indult. A mérés a funkcionális vitálkapacitásról szintjéről állandó áramlási sebességgel (5-6 L/min) megvalósított kilégzés során történt, amelyet a vizsgálatban résztvevő személyek kis, a lágyszájpad záródását biztosító, ezáltal a nazalis kontaminációt megelőző ellenállással (3 +/- 0.4 Hgmm) szemben végeztek 15-20 másodpercen át. A mérés során a kilégzés egyenletességét és a nyomás folyamatos fenntartását egy nyomás-térfogat érzékelő rendszer biztosította. A beteg számára vizuális kijelző berendezés segítette a megkívánt kilégzési sebesség fenntartását. A mérőműszer számítógépes softwer rendszere a kilégzett NO-ot, valamint az áramlást, nyomást és a kilégzett CO2-t az idő függvényében ábrázolva jelenítette meg a műszer képernyőjén. A kilégzés kezdetén jelentkező NO csúcs a holtteret, valamint az oro-pharynxból származó mintát reprezentálta. A végkilégzési CO2 platónak megfelelő szakaszon történt az NO meghatározása ami a kis légutakban, alveoláris térben zajló NO képzést mutatta. 3 sikeres mérés átlagát tekintettük a kilégzett NO értékének.

Nazalis NO A nazalis NO meghatározása a LOGAN LR 2000 készüléken, kemilumineszcens módszerrel történt. A mérés során a beteg orrbemenetébe helyezett adapteren (teflon csövön) keresztül az orrüregben levő gáz negatív nyomás hatására diffundál a gépbe, mialatt a vizsgált személy mély levegővételt követően a lélegzetét visszatartja. Ez a 28

módszer biztosítja a lágyszájpad záródását, és megakadályozza a környezeti levegő szabad áramlását egyik orrfélből a másikba és ezen keresztül a mérőműszerbe. A mérés során az NO szint folyamatosan követhető. A nazalis NO értéket a 20-40 másodpercig tartó légzésvisszatartás során képződő NO görbén, annak (stabil) elért maximuma jelenti. A mérés során a CO2-t is folyamatosan rögzíti a műszer, amelynek ellenőrzése mutatja, hogy a mérés során nem történik-e kilégzés. Minden gyereknél legalább két mérést végeztünk és ezek átlagát használtuk a kiértékelésnél.

Légzésfunkció A

forszírozott

kilégzési

másodperc

térfogatot

(FEV1)

spirométerrel

mértük

(Vitalograph, Buckingham, Anglia). Három mérés közül a legjobb értéket választottuk ki és azt a betegre jellemző prediktív érték százalékában rögzítettük.

Kilégzett levegő kondenzátum A kilégzett levegő kondenzátumot a 4.1 pont alatt részletezettek szerint gyűjtöttük (ECoScreen, Jaeger, Würzburg, Németország) és tároltuk.

Nitrit, nitrit+nitrát, valamint s-nitrozotiolok meghatározása A nitrit (NO2-) mérése fluorometriásan történt. A módszer a nitrit, valamint a 2,3diaminonaftalen (DAN) közti reakción alapult, ami a fluoreszcens 1-(H)+naftotriazol kialakulásához vezet. 1.

a minták nitrit tartalmának meghatározása: 100 µL kondenzátum mintához 10 µL 0.625 M sósav (HCl) oldatban elkészített 0.05 mg/mL koncentrációjú DAN reagenst tettünk. Az elegyet 10 percen át szobahőmérsékleten sötétben inkubáltuk, a reakciót 10 µL 1.4 M nátrium-hidroxid (NaOH) hozzáadásával állítottuk le. A képződő termék fluoreszcenciáját Biolite F1 fluorométerrel (Labtech International Ltd, Uckfield, Anglia) 360 nm-es excitációs és 460 nm-es emissziós hullámhosszon mértük. A fluorométer szenzitivitása 40-50 % között volt. A mintákban lévő nitrit koncentráció számítása ismert nitrit

29

koncentrációkkal meghatározott standard görbe alapján történt. A mérés szenzitivitása 0.1 µM volt. 2. a minták nitrit+nitrát tartalmának meghatározása: 100 µL kondenzátum mintát 10 µM NADPH hozzáadását követően 0.14 U nitrit reduktázzal 10 percen át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A nitrát reduktáz a nitrátot nitritté alakította. Ezt követően a nitrit mehatározása a fentiekben részletezettek szerint történt. Így a nitrit+nitrát együttes mennyiségét kaptuk meg. 3. a mintákban található s-nitrozotiolok mennyiségének meghatározása: a kondenzátum mintákban levő s-nitrozotiolokból a nitritet 2 mM Hg2Cl hozzáadásával felszabadítottuk. A mért nitrit koncentrációból az eredeti nitrit koncentrációt (1) kivonva kaptuk meg az s-nitrozotiolok koncentrációját. Minden vizsgálati mintából 2 párhuzamos mérés történt.

Statisztikai elemzés Az eredményeket átlag±SEM (átlag szórása) formában adtuk meg. A csoportokat Mann-Whitney módszerrel hasonlítottuk össze. A korrelációt a kilégzett NO valamint a nitrit, nitrit+nitrát, s-nitrozotiolok, illetve az egyes nitrogén oxid metabolitok, valamint a légzésfunkciós értékek (FEV1) között Spearman korrelációs analízissel végeztük. A csoportok közötti eltéréseket p<0.05 értéknél tekintettük szignifikánsnak.

30

5

Eredmények

5.1 I. Altéma - Leukotriének a kilégzett levegő kondenzátumban gyermekkori asztmában Leukotriének Nem volt különbség a cisz-LT koncentrációkban enyhe intermittáló asztmában a kontroll csoporttal történt összehasonlítás során (19.1±1.1 vs 18.5±0.5 pg/mL), ellenben szignifikánsan magasabb cisz-LT értéket találtunk enyhe perzisztáló asztmás gyerekek esetén a kontroll, valamint az egyhe intermittáló betegcsoporttal összehasonlítva. Az eltérés a kontroll csoporttól 27.9±2.8 vs 18.5±0.5 pg/mL, p<0.001, enyhe intermittáló asztmás csoporttól 27.9±2.8 vs 19.1±1.1 pg/mL, p=0.01 volt. Középsúlyos-súlyos asztmában szintén emelkedett cisz-LT koncentrációt mértünk a kontroll csoporttal összehasonlítva, az eltérés 31.5±4.5 vs 18.5±0.5 pg/mL, p<0.05 volt (7.ábra). Enyhe perzisztáló asztmában az LTB4 szignifikánsan magasabb volt mint enyhe intermittáló asztmában és a kontroll csoportban (126.0±8.8 vs 52.7±3.8 és 47.9±4.1 pg/mL, p<0.01, és p<0.001). Középsúlyos-súlyos perzisztáló asztmában az LTB4 szintén magasabb volt az enyhe intermittáló asztmás és a kontroll csoporttal összehasonlítva (131.9±7.1 vs 52.7±3.8 és 47.9±4.1 pg/mL, p<0.001 és p<0.0001) (8. ábra). Az LTB4 nem különbözött a kontroll és enyhe intermittáló asztmás csoportok között (47.9±4.1 vs 52.7±3.8 pg/mL). Enyhe perzisztáló és középsúlyos-súlyos asztmában a cisz-LT (27.9±2.8 vs 31.5±4.5 pg/mL), valamint LTB4 koncentrációk között (126.0±8.8 vs 131.9±7.1 pg/mL) nem volt különbség. Az enyhe perzisztáló asztmás betegeknél negatív korrelációt mutattunk ki a kilégzett levegő kondenzátum cisz-LT, valamint LTB4 értékei között (r=-0.76, p<0.01) (9. ábra). A többi betegcsoportban nem volt korreláció a leukotriének között (10, 11. ábra).

31

cisz-LT (pg/mL)

80

« «««

60 40 20

««

0

Normál

Asztma

enyhe enyhe középsúlyos-súlyos intermittáló perzisztáló perzisztáló

7. ábra Ciszteinil leukotriének a kilégzett levegő kondenzátumban egészségesekben, valamint enyhe intermittáló, enyhe perzisztáló, valamint középsúlyossúlyos perzisztáló asztmában.

∗

p<0.05,

∗∗

p=0.01,

∗∗∗

p<0.001

LTB4 (pg/mL)

300

««« ««

200

100

«

0

Normál

««

Asztma

enyhe enyhe középsúlyos-súlyos intermittálót perzisztáló perzisztáló

8. ábra Leukotrién B4 a kilégzett levegő kondenzátumban egészségesekben, perzisztáló,

valamint

valamint

enyhe

intermittáló,

középsúlyos-súlyos

asztmában. ∗ p<0.01, ∗∗p<0.001, ∗∗∗p<0.0001

32

enyhe

perzisztáló

LTB4 (pg/mL)

250 r=-0.76 p<0.01

200 150 100 50 0 0

25

50

75

100

cisz-LT (pg/mL)

9. ábra Korreláció a cisz-LT, valamint az LTB4 között enyhe perzisztáló asztmában 250

LTB4 (pg/mL)

LTB4 (pg/mL)

150

ns 100

50

ns 200 150 100 50

0

0 0

10

20

30

0

cisz-LT (pg/mL)

25

50

75

cisz-LT (pg/mL)

10. ábra Korreláció a cisz-LT, valamint az LTB4 között enyhe intermittáló asztmában.

11. ábra Korreláció a cisz-LT, valamint az LTB4 között középsúlyos-súlyos asztmában.

Kilégzett NO A kilégzett NO valamennyi asztmás csoportban emelkedett volt az egészséges gyerkeknél mért értékkel összehasonlítva. A különbség a kontroll csoporthoz képest enyhe intermittáló asztmában 16.6±2.4 vs 10.1±1.7 ppb, p<0.05, enyhe perzisztáló asztmában 30.8±11.1 vs 10.1±1.7 ppb, p<0.01, és középsúlyos-súlyos perzisztáló asztmában 36.4±7.8 vs 10.1±1.7 ppb, p<0.001 volt. Szignifikáns különbség volt az enyhe intermittáló, valamint középsúlyos-súlyos perzisztáló asztmás csoport kilégzett NO értéke között is (36.4±7.8 vs16.6±2.4 ppb, p<0.05). Az enyhe intermittáló és enyhe perzisztáló asztmás csoportok kilégzett NO értékeiben nem volt eltérés (16.6±2.4 vs 30.8±11.1 ppb). Ugyancsak nem volt különbség az enyhe perzisztáló és középsúlyos-

33

súlyos perzisztáló asztmás csoportok kilégzett NO értékei között (30.8±11.1 vs 36.4±7.8 ppb) (12. ábra).

kilégzett NO (ppb)

150

««

«««

100 «

50

0

«

Asztma

Normál

enyhe enyhe középsúlyos-súlyos intermittáló perzisztáló perzisztáló

12. ábra Kilégzett NO egészségesekben, valamint enyhe intermittáló, enyhe perzisztáló, valamint középsúlyossúlyos perzisztáló asztmában. ∗ p<0.05, ∗∗p<0.01, ∗∗∗p<0.001 Nem volt szignifikáns korreláció a kilégzett NO valamint a cisz-LT koncentrációi között (13.ábra). Hasonlóan nem volt összefüggés a kilégzett NO valamint az LTB4 és FEV1 értékek tekintetében. ns

150

kilégzett NO (ppb)

kilégzett NO (ppb)

75

ns 50

25

0

100

50

0

0

25

50

75

0

cisz-LT (pg/mL)

20

40

60

cisz-LT (pg/mL)

kilégzett NO (ppb)

150

ns 100

50

0 0

25

50

75

cisz-LT (pg/mL)

13. ábra Korreláció a cisz-LT, valamint a kilégzett NO között enyhe intermittáló, enyhe perzisztáló, valamint középsúlyos-súlyos asztmában. 34

5.2 II. Altéma - Nitrogén-oxid metabolitok a kilégzett levegő kondenzátumban primér ciliáris diszkinéziában Kilégzett, valamint nazalis NO A kilégzett NO szignifikánsan alacsonyabb volt PCD-s betegekben a kontroll csoporttal összehasonlítva (3.2±0.2 ppb vs 8.4±0.9 ppb, p<0.001). Nem volt szignifikáns különbség a szteroid naív és szteroid kezelt PCD-s csoport (3.4±0.3 vs 3.0±0.3 ppb), valamint a krónikus antibiotikus kezelésben részesülő, valamint antibiotikumot nem kapó betegek között (3.0±0.4 vs 3.5±0.3 ppb) (14, 15, 16. ábra). A felső légúti NO szintén jelentősen alacsonyabb volt a PCD-s betegekben, mint az egészséges kontroll személyekben (59.6±12.2 vs 505.5±66.8 ppb p<0.001) (17, 18.ábra). Nem volt korreláció a kilégzett NO és a FEV1 értékek között.

14. ábra Eredeti regisztrátum: kilégzett NO egészséges kontroll személynél (8.9 ppb) és PCD-ben (3.1ppb)

35

Kilégzett NO (ppb)

20

p< 0.001

10

0

Normál

PCD

15. ábra Kilégzett NO egészségesekben és PCD-s betegeknél 20

Kilégzett NO (ppb)

kilégzett NO (ppb)

20

ns 10

ns 10

0

0

Normál

PCD nsz

Normál sz

PCD nAB

AB

16. ábra Kilégzett NO szteroid és antiobiotikum kezelt és ilyen terápiában nem részesülő PCD-s betegeknél (nsz, nAB) Nazalis NO (ppb)

1200 p< 0.001 800

400

0

Normál

PCD

17. ábra Nazalis NO PCD-ben és egészségesekben

36

„A”

„B”

„C”

18. ábra Eredeti regisztrátum: nazalis NO két egészséges kontroll személynél (850 ppb, 330 ppb) (A,B) és egy PCD-s betegnél (60 ppb) (C). Nitrit, nitrit+nitrát, s-nitrozotiolok Nem volt szignifikáns különbség a kilégzett levegő kondenzátumban mért nitrit, nitrit+nitrát és s-nitrozotiolok koncentrációjában (2.9±0.4 vs 3.5±0.3 µM; 35.2±5.0 vs 34.3±4.5 µM; 1.0±0.2 vs 0.6±0.1 µM) a PCD-s betegek, valamint az egészséges kontroll személyek között (19, 20, 21. ábra). Ugyancsak nem volt különbség a nitrit, nitrit+nitrát, valamint s-nitrozotiolok koncentrációjában a szteroid naív és szteroiddal kezelt (2.8±0.7 vs 3.1±0.5 µM; 34.1±6.6 vs 36.5±8.1 µM; 1.0±0.3 vs 1.0±0.2 µM) és a krónikus antibiotikus kezelésben részesülő és antibiotikum terápia mentes (3.2±0.7 vs 2.6±0.5 µM; 34.2±7.9 vs 36.3±6.3 µM; 1.3±0.3 vs 0.6±0.2 µM) betegek között (22.ábra). 37

ns

µ M) nitrit (µ

9

6

3

0

Normál

PCD

19. ábra Nitrit a kilégzett levegő kondenzátumban egészségesekben és PCD-ben µ M) nitrit+nitrát (µ

150

ns

125 100 75 50 25 0

Normál

PCD

µ M) s-nitrozotiolok (µ

20. ábra Nitrit+nitrát a kilégzett levegő kondenzátumban egészségesekben, PCD-ben

6

ns

5 4 3 2 1 0

Normál

PCD

21. ábra S-nitrozotiolok a kilégzett levegő kondenzátumban egészségesekben és PCD-ben

38

15

15

nitrit (µ µ M)

nitrit (µ µ M)

ns 10

5

0

ns 10

5

0

Normál

PCD nsz

Normál sz

PCD nAB

AB

22. ábra Nitrit a kilégzett levegő kondenzátumban inhalációs szteroiddal, illetve antibiotikummal kezelt, valamint ilyen kezelésben nem részesülő PCD-s betegek esetén (nsz, nAB) Nem volt korreláció a kilégzett levegő kondenzátumban mért nitrit, nitrit+nitrát, snitrozotiolok koncentrációi között, valamint az NO metabolitok és a kilégzett NO (23. ábra), illetve FEV1 értékek vonatkozásában. 150

ns

nitrit+nitrát (µ µ M)

nitrit (µ µ M)

10

5

ns 100

50

0

0 0

5

0

10

10

kilégzett NO (ppb)

kilégzett NO (ppb)

µ M) s-nitrozotiolok (µ

5

5.0

ns 2.5

0.0 0

5

10

kilégzett NO (ppb)

23. ábra Korreláció a kilégzett NO valamint a kilégzett levegő kondenzátumban mért NO metabolitok koncentrációja között.

39

6

Megbeszélés

6.1 I. Altéma - Leukotriének a kilégzett levegő kondenzátumban gyermekkori asztmában

A tanulmány során a leukotriének krónikus légúti gyulladásban betöltött szerepét vizsgáltuk gyermekkori asztmában. Enyhe és középsúlyos-súlyos perzisztáló asztmában emelkedett cisz-LT, valamint az LTB4 szinteket mértünk a kilégzett levegő kondenzátumban. Az asztma patofiziológiája bonyolult, egy sor sejttípus és mediátor részvételével zajló folyamat. Köztudott, hogy az asztmás légutakban zajló gyulladást az eozinofil sejtek dominanciája jellemzi mind felnőtt, mind a gyermekkori kórformák esetén. A cisz-LT szerepe jól ismert a gyermekkori asztmában akut bronchokontrikció esetén128, viszont krónikus gyulladásban betöltött szerepükre csak a leukotrién antagonisták klinikai hatásossága alapján következtethetünk129. Eredményeink azt mutatják, hogy a cisz-LTnek szerepe lehet a gyermekkori asztma patomechanizmusában, ami akár nagy dózisú inhalációs szteroid kezelés mellett is érvényesülhet. Eredményeink hasonlóak a felnőttkori asztma esetén közöltekkel107, 130. A kortikoszteroidokról tudjuk, hogy in vivo elősegítik az eozinofil sejtek apoptózisát131 csökkentve az eozinofil sejtek számát a légutakban132. Ennek ellenére a légúti eozinofília olyan asztmás betegeknél is perzisztálhat, akik nagy adag inhalációs szteroiddal klinikailag jól kontrolláltak. Ilyen esetekben az eozinofília kevésbé súlyos, mint tüneteket mutató betegeknél133. A cisz-LT koncentrációját azonban nemcsak az eozinofilek száma határozza meg, mivel az aktivált hízósejtek szintén jelentős mértékben bocsátják ki ezeket a mediátorokat. Laviolette és munkatársai kimutatták, hogy a középsúlyos asztmás betegek véréből származó eozinofil sejtek in vitro stimulusra nagyobb mennyiségű LTC4-t szekretálnak, mint az enyhe és súlyos asztmás betegek eozinofil granulocitái. Valószínű, hogy a sejtek által kibocsátott leukotriének mennyisége a betegség súlyosságával változik, amit befolyásol a szteroid kezelés134. A légúti eozinofil sejtek kevésbé érzékenyek szteroidra, mint a vérben találhatóak, így a súlyosabb asztmások légúti sejtjei nagyobb kapacitású cisz-LT források lehetnek135. Ez megmagyarázhatja, hogy miért találtunk emelkedett

40

cisz-LT szinteket a középsúlyos-súlyos asztmás gyerekeknél a nagy adag inhalációs szteroid kezelés ellenére. Másik oldalról a magasabb cisz-LT szintek összefügghetnek azzal is, hogy az alkalmazott szteroid adag a klinikai tüneteket kontrollálta ugyan, a légúti gyulladást teljes mértékben azonban nem szorította vissza. A kilégzett NO szintén emelkedett volt a szteroiddal kezelt enyhe és középsúlyos-súlyos perzisztáló asztmás betegcsoportban. Ismert, hogy a kilégzett NO nagyon érzékenyen reagál a gyulladásos folyamatokban szteroid kezelés mellett bekövetkező változásokra, tehát az érintett betegcsoportokban mért magasabb NO értékek valószínűleg a nem megfelelő gyulladáskontrollt jelzik136,

137

. Az hogy légzésfunkciós eredmények nem

mutattak súlyos légúti obstrukciót még a középsúlyos-súlyos asztmás gyerekek esetén sem, azt bizonyítja, hogy a kilégzett NO az asztma kontroll érzékenyebb markere, mint a FEV1. Korábbi vizsgálatokban összefüggést mutattak ki az eozinofil gyulladás intenzitása és a kilégzett NO között gyermekkori asztmában138. A cisz-LT-kel kapcsolatban ismert, hogy fokozzák a humán polimorfonukleáris sejtek NO kibocsátását in vitro139, ezzel szemben az LTE4 belégzése nem növelte a kilégzett NO-t asztmás betegekben140. A leukotrién antagonista kezelés bizonyítottan csökkenti a kilégzett NO szintjét asztmásoknál67, 68. Az általunk vizsgált szteroid naív enyhe intermittáló asztmás betegcsoportban tendenciájában felismerhető az összefüggés a cisz-LT valamint a kilégzett NO között, de szignifikáns korreláció nem volt kimutatható. A szteroid kezelt enyhe perzisztáló, valamint középsúlyos-súlyos perzisztáló asztmásoknál negatív irányú összefüggésre utaló tendenciát észleltünk, de szignifikáns korreláció itt sem volt. Mivel a cisz-LT szekretálása nemcsak az eozinofil granulocitákból történik nem meglepő, hogy a korábban az eozinofil granulociták száma, valamint a kilégzett NO összefüggésével kapcsolatban tett megfigyeléseket az általunk vizsgált szteroid naív betegcsoportnál kapott eredmények nem támasztják alá ,mely szerint nem tudtunk kimutatni szignifikáns összefüggést a kilégzett NO, valamint a kondenzátumban mért cisz-LT között. Az NO és cisz-LT valószínűleg részben egymástól független mechanizmus révén vesz részt a légúti gyulladás szabályozásában, a szteroid kezelt asztmásoknál észlelt negatív irányba

41

mutató tendencia pedig összefügghet a két gyulladásos marker által jellemzett folyamatok eltérő szteroid érzékenységével. LTC4 és LTD4 direkt módon növeli az eozinofil sejtek élettartamát141, így súlyosabb asztmás esetekben az intenzívebb eozinofil gyulladás és nagyobb mennyiségű cisz-LT kibocsátás az eozinofil sejtek megnövekedett élettartamát eredményezi, ami további mediátor felszabaduláshoz és fokozódó eozinofil gyulladáshoz vezethet. A cisz-LT szintje a vizsgálat idején tünetmentes enyhe intermittáló asztmás betegek kilégzett levegő kondenzátumában nem volt emelkedett, ami alapján feltételezhető, hogy a cisz-LT-nek inkább a súlyosabb állapotokban van szerepük. A kilégzett levegő kondenzátumban mért LTB4 szintén magasabb volt a rendszeres szteroid kezelésben részesülő enyhe és középsúlyos-súlyos perzisztáló asztmás gyerekeknél, míg enyhe intermittáló asztmában nem volt eltérés. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az LTB4-nek a súlyosabb asztmás állapotokban van jelentősége, illetve, hogy az emelkedett LTB4, legalábbis részben a szteroid kezelés következménye lehet. Bár az LTB4 a cisz-LT-kel ellentétben nem hozható közvetlen összefüggésbe az asztma patomechanizmusával, egyre több adat áll rendelkezésre, amely azt mutatja, hogy a neutrofileknek szerepe van az asztmás gyulladásban mind az akut exacerbációk során, mind pedig súlyosabb krónikus állapotokban. LTB4 potens neutrofil kemoattraktáns, és így fokozza a légutakban a neutrofil granulociták arányát142. Az LTB4 in vitro gátolja a neutrofilek apoptózisát, ezáltal szabályozza a neutrofilek élettartamát. Ezen túlmenően az LTB4 részt vesz a kortikoszteroidok neutrofilek élettartamára gyakorolt hatásában143. Korábbi vizsgálatokban igazolták, hogy az asztmás betegek neutrofil granulocitái aktivált állapotban vannak, amit jelez a nagyobb komplement-receptor expresszió144, valamint az 5-lipoxigenáz reakcióút fokozott aktivitása145. Ez az asztmában megfigyelt aktivált állapot abból adódhat, hogy a negatív feed-back jelekre adott válasz nem megfelelő, így a sejt nem tud leállítani bizonyos folyamatokat146, ami további LTB4 termeléshez, megnyúlt neutrofil élettartamhoz és a légutakban további neutrofil ganulociták megjelenéséhez vezethet. A szteroidokkal kapcsolatban in vitro igazolták, hogy az apoptózis gátlásával megnövelik a neutrofilek élettartamát147, így a kortikoszteroid kezelés in vivo intenzívebb neutrofil gyulladáshoz vezethet. Stimulált alveoláris makrofág esetén in

42

vitro a kortikoszteroidok erősebben gátolták a ciklooxigenáz termékek szintézisét, mint a leukotriénekét148. Ennek megfelelően a krónikus szteroid kezelés megnövelheti a neutrofil granulociták élettartamát anélkül, hogy a leukotrién szintézist jelentősen befolyásolná. Ez további mediátor felszabadulást eredményez, aminek szerepe lehet újabb gyulladásos sejtek megjelenésében és ezáltal a krónikus gyulladás fenntartásában. A kortikoszteroidoknak a gyermekkori asztmában zajló gyulladásos folyamatok sejtösszetételére kifejtett lehetséges hatását támasztja alá az is, hogy a neutrofilek nagyobb arányát figyelték meg akut exacerbáció során olyan betegeknél akik megelőzően rendszeresen inhalációs szteroidot használtak és ez még kifejezettebb volt per os szteroid kezelés esetén149. A kilégzett levegő kondenzátum LTB4 koncentrációja nem volt emelkedett enyhe intermittáló asztmában, jelezve, hogy a neutrofil gyulladásnak inkább a súlyosabb, szteroid kezelt asztmás esetekben van szerepe. A fenti eredmény némileg eltér az eddig ismert adatoktól, mivel egy korábbi vizsgálatban enyhe, preventív szteroid kezelésben nem részesülő, a vizsgálat idején tünetes asztmás betegek BAL folyadékában emelkedett LTB4 szintet mutattak ki és a plazma LTB4 magasabb volt szteroid naív asztmás gyerekek akut exacerbációja idején, illetve még 1 hónappal azt követően is33, 34. Erre a különbségre magyarázatot adhat az, hogy az általunk vizsgált enyhe intermittáló asztmás betegek a kilégzett levegő kondenzátum minta gyűjtése idején tünetmentesek voltak, és a közelmúltban akut exacerbációjuk nem volt. Nem találtunk pozitív korrelációt az LTB4 és cisz-LT között egyik asztmás csoportban sem, annak ellenére, hogy az LTB4 bizonyítottan befolyásolja az eozinofilek kemotaxisát és valószínűleg közvetve élettartamukat150, valamint egy korábbi vizsgálatban szteroid naív asztmás betegek BAL folyadékában az eozinofil és neutrofil granulociták száma között pozitív korrelációt mutattak ki151. Ismert azonban, hogy a cisz-LT szekretálásában az eozinofileken kívűl egyéb sejttípusok is részt vesznek, ami érthetővé teszi, hogy az eozinofil és neutrofil sejtek vonatkozásában tett megfigyelés ellenére a cisz-LT és LTB4 kilégzett levegő kondenzátumban mért koncentrációi nem minden esetben mutatnak összefüggést. Az is megállapítható, hogy szignifikáns pozitív korrelációt ugyan nem észleltünk tendenciájában mégis észlelhető ez az összefüggés az általunk vizsgált szteroid naív, enyhe intermittáló asztmás csoport esetén, míg a szteroiddal kezelt betegekben, valószínűleg a kortikoszteroidok eozinofil és neutrofil granulociták élettartamára gyakorolt eltérő hatása révén ez módosul. Ennek megfelelően 43

enyhe perzisztáló asztmában az LTB4 és cisz-LT között negatív korrelációt találtunk, míg a középsúlyos-súlyos asztmás betegcsoportban szignifikáns összefüggés nem volt kimutatható, viszont tendenciájában a két mediátor közötti összefüggés szintén a negatív korreláció irányába mutatott. A középsúlyos-súlyos asztmásoknál feltehetően az intenzívebb, talán részleteiben is kicsit eltérő gyulladás, valamint a nagyobb dózisú gyulladáscsökkentő kezelés indokolhatja az enyhe perzisztáló asztmás betegekétől eltérő eredményt.

6.2 II. Altéma - Nitrogén-oxid metabolitok a kilégzett levegő kondenzátumban primér ciliáris diszkinéziában A vizsgálat eredményei megerősítették azt a korábbi megfigyelést, miszerint PCD-ben a kilégzett és nazalisan mért NO az egészségesekénél alacsonyabb. Különösen jelentős ez a különbség a felső légutakban mérhető NO esetén, amely PCD-ben egyedülálló mértékben csökkent. A PCD-re jellemző krónikus, rekurráló légúti gyulladást figyelembe véve az alacsonyabb kilégzett és nazalis NO értékek meglepőek. Ennek a jelenségnek a patofiziológiai háttere még nem ismert. A NO-nak szerepe van a légutak baktericid funkciójában, az orrnyálkahártya kálium és klorid transzportjában és a ciliák működésének szabályozásában, így az endogén NO képzés

csökkenése

kialakulásához

53, 54

hozzájárulhat

PCD-ben

a

visszatérő

légúti

infekciók

. Az alacsony kilégzett, valamint nazalis NO valószínűleg összefügg

a PCD-ben észlelt mukociliáris diszfunkcióval, minthogy az NO donor L-argininnel történő kezelés növeli a nazalis NO-t és javítja a mukociliáris transzportot ezekben a betegekben. A vizsgálat eredménye alapján azonban a NOS csökkent aktivitása is feltételezhető PCD-s esetekben, mivel a kilégzett, valamint nazalisan detektált NO arginin kezelést követően sem érte el a normál tartományt

152, 153

L-

.

A vizsgálat tervezésénél abból indultunk ki, hogy a kilégzett levegő kondenzátumban mérhető NO metabolitok meghatározása közelebbi információt szolgáltathat a NOS aktivitásáról ebben a betegcsoportban. Az alacsony kilégzett és nazalis NO értékek, valamint a NOS aktivitására vonatkozó közvetett eredmények alapján feltételeztük, hogy az NO metabolitok, így a nitrit,

44

nitrit+nitrát és s-nitrozotiolok szintje a kilégzett levegő kondenzátumban alacsonyabb lesz PCD-ben a kontroll csoporthoz képest. Váratlan eredmény volt, hogy nem találtunk különbséget az NO metabolitok koncentrációiban a PCD-s betegek, valamint egészséges gyerekek között, a nitrit kis mértékű, nem szignifikáns csökkenése és az s-nitrozotiolok enyhe, szintén nem szignifikáns emelkedése mellett. Az NO metabolitok normál szintje bizonytalanná teszi azt a feltevést, amely szerint a alacsonyabb kilégzett és nazalis NO kizárólag a csökkent NOS aktivitás következménye, hiszen ebben az esetben feltevésünknek megfelelően alacsonyabb kilégzett NO mellett alacsonyabb NO metabolit szinteket kellett volna kapnunk. Normál NOS aktivitás esetén az alacsonyabb kilégzett NO azt jelenti, hogy az NO metabolizációja fokozott, mely esetben azonban az NO metabolitok koncentrációjának növekedése várható. Az NO metabolitok szintjének normál értéke a kilégzett NO csökkenése mellett jelzi, hogy PCD-ben a cisztás fibrózishoz hasonlóan az NO képzés, valamint metabolizmus egyaránt érintett lehet. A CF-es betegekre ugyancsak jellemző a krónikus, rekurráló gyulladás mellett mért fiziológiásnál alacsonyabb kilégzett, valamint nazalis NO69, 70. Ez a csökkenés azonban CF-ben a nazalis NO esetén kevésbé kifejezett, mint PCD-ben, a kilégzett NO-val kapcsolatban pedig néhány közlemény a normál tartományba eső értékekről számol be154,155. CF-ben a feltételezett fokozott NO metabolizációnak megfelelően emelkedett nitrit,

nitrit+nitrát,

kondenzátumban119, exacerbáció során

156

és 124, 154

nitrotyrozin

szinteket

mértek

a

kilégzett

levegő

, valamint az indukált köpetben stabil állapotban és

. Stabil, súlyos állapotú felnőttkori CF-ben az s-nitrozotiolok

koncentrációja a kilégzett levegő kondenzátumban szintén magasabb volt122. Ezzel szemben normális légzésfunkciós értékekkel járó gyermekkori CF-es esetekben a BAL folyadék nitrit+nitrát koncentrációja a normális tartományban volt, az s-nitrozotiolok szintje viszont szignifikánsan alacsonyabb értéket mutatott157. Állati eredetű és humán CF-es légutakban egyaránt bizonyították a iNOS csökkent expresszióját71. A NOS aktivitás csökkenése valószínűleg kifejezettebb PCD-ben, mint CF-ben, ami megmagyarázza a két betegségnél a kilégzett NO szintek, valamint az NO metabolitok vonatkozásában észlelt különbségeket.

45

A PCD-ben zajló krónikus gyulladást a CF-hez hasonlóan a neutrofil granulociták dominanciája jellemzi. A myeloperoxidáz a neutrofil granulociták HEM tartalmú enzimjeként hidrogén peroxid (H2O2) felhasználásával a kloridot hipoklórsavvá oxidálja. A myeloperoxidáz a tyrozin nitrációját katalizálja, ami a peroxinitrit alternatívájaként 3-nitrotyrozin képződését eredményezi. A neutrofil gyulladás színhelyén a myeloperoxidáz elősegíti a proteinek nitrációját, mivel rendelkezésre áll a koszubsztrát tyrozin158,

159

. Stabil CF-es betegek kilégzett levegő kondenzátumában

szignifikánsan magasabb nitrotyrozin szintet találtak, mint egészségesekben. Ez alapján feltételezhető, hogy a myeloperoxidáz által előidézett protein nitráció egy járulékos nitrotyrozin forrás lehet az alacsony NO produkcióval jellemzett CF-es betegekben. A tény, hogy a myeloperoxidáz szint emelkedett CF-es betegek indukált köpetében és korrelál a nitrotyrozin koncentrációval160 azt a feltevést erősíti, hogy az NO abban az esetben is részt vehet a légúti gyulladásban, ha a kilégzett levegőben a szintje nem emelkedett. Ezeknek a folyamatoknak szerepe lehet a PCD-ben zajló krónikus gyulladás esetén is, ebben a betegségben a légutak nitrotyrozin koncentrációjával kapcsolatban azonban még nincsenek eredmények. A neutrofil granulociták által kibocsátott szabad gyökök fokozhatják az NO metabolizmusát, minthogy elősegítik az NO-ból a nitrit, nitrát, s-nitrozotiolok képződését. Intenzív neutrofil gyulladás esetén normál NO képzés mellett az alacsony kilégzett NO-t a kilégzett levegő kondenzátumban az NO metabolitok magasabb koncentrációja kísérné. Néhány baktérium esetében ismert, hogy nitritből NO-t képez161. Az NO-nak fontos szerepe van a szervezet bakteriális, vírus és gomba okozta infekciókkal szemben működő nem specifikus védekező mechanizmusaiban. Az egyik ilyen antimikróbás védelmi mechanizmus a cisztein proteázok működése révén érvényesül, amelyek az NO-ból s-nitrozotiolokat képeznek. A csökkent endogén NO képzés hozzájárulhat a PCD-ben és CF-ben megfigyelt visszatérő légúti infekciókhoz. A PCD-s betegeket gyakran, vagy folyamatosan antibiotikummal kezelik. Ez módosíthatja az orr, valamint alsó légutak baktérium flóráját, amely befolyásolhatja a NO képzését, illetve a légutakban az NO metabolitjainak koncentrációját. Kimutatták, hogy benzoquinoid ansamycinek csökkentették a nitrit akkumulációt, az iNOS mRNS szintjét, valamint a iNOS promoter régió citokin dependens

46

aktiválódását162. Eredményeink nem támasztják alá azt a feltevést, hogy ezeknek a mechanizmusoknak szerepe van a PCD-ben mért alacsony NO koncentrációkban, tekintve, hogy nem találtunk különbséget a kilégzett NO, valamint a kondenzátumban mért NO metabolitok mennyiségében a PCD-s betegek, valamint egészséges kontroll személyek között. Ezen túlmenően nem volt különbség a folyamatos antibiotikus kezelésben részesülő, valamint az antibiotikumot nem szedő betegek között. A légutak higiéniája nagy mértékben függ a mukociliáris clearance-től, tehát attól, hogy a légúti epitél sejteken elhelyezkedő csillószőrök hogyan mozgatják a viszkoelasztikus váladékot a légutakban163. A mukociliáris clearance elégtelen működése hátterében több tényező szerepe feltételezhető: a) nagyon alacsony NO képzés az iNOS elégtelen működése miatt b) mikróbák toxinjai, amelyek a csillószőrök működéséhez szükséges energetikai lépéseket befolyásolják (szekunder ciliáris diszkinézia) c) a mucus viszkozitásának rendellenességei, csökkent sótartalom és ozmolaritás kialakulása, amely a csillószőrök mozgásához nem megfelelő közeget eredményez. A PCD-ben zajló, megváltozott mukociliáris clearance hátterében álló mechanizmusok megismerése fontos segítséget jelentene a betegség kezelésében. Az NO biológiai jótékony és káros hatásait figyelembe véve, mind a NOS inhibítoroknak, mind a NOS szubsztrátjainak potenciális szerepe lehet a PCD kezelésében. Eddig az L-arginin szupplementációt hatását vizsgálták olyan esetekben, amikor az NO képzés fokozása volt a cél. PCD-ben az L-arginin kezelés javította a mukociliáris clearence-t, a kilégzett, valamint nazalis NO emelkedését eredményezte, de nem befolyásolta a betegek funkcionális értékeit151, 152. Szelektív és hatásos NOS inhibitorok és NO donorok, valamint az NO biokémiájának nem invazív módszerekkel történő további vizsgálatai tisztázhatják a NOS és az NO pontos szerepét ebben a betegségben.

6.3 Általános megbeszélés A gyermekkorban kezdődő krónikus gyulladással járó légúti betegségek korai diagnózisa, rendszeres ellenőrzése és optimális kezelése elengedhetetlen mivel a tudomány jelenlegi állása szerint ezek a legtöbb esetben gyógyíthatatlan, viszont

47

általában jól kontrollálható folyamatok. Gyakorisága, valamint folyamatosan növekvő prevalenciája miatt a gyerekkori atópiás betegségek, ezen belül az asztma jelentősége a legnagyobb. Az asztma patofiziológiájának lényegét jelentő krónikus légúti gyulladás pontos mechanizmusának megismerése évtizedek óta a pulmonológiai betegségek kutatásának középpontjában áll. Az eddigi eredmények jelentősen hozzájárultak az asztmás betegek légútjaiban zajló gyulladásos folyamatok megismeréséhez, de ezek összetettsége miatt pontos mechanizmusuk jelenleg még nincs tisztázva. A hazai és nemzetközi ajánlásokban összefoglalt kezelési útmutatók asztmában a krónikus gyulladásos folyamatok optimális kontrollját, ezen keresztül a betegek életminőségének javítását és a késői, sok esetben irreverzibilis következmények megelőzését célozzák. Ennek megfelelően a betegek egyre nagyobb hányada használja folyamatosan, krónikus betegségekről lévén szó akár évtizedeken át az inhalációs szteroidokat, valamint az utóbbi években előtérbe kerülő leukotrién antagonistákat. A kezelés beállításánál egyenlőre jórészt a hagyományos módszerekre, így a betegek tüneteinek, valamint légzésfunkciós paramétereinek értékelésére, és a fizikális vizsgálat során észlelt eltérésekre támaszkodhatunk, amelyek csak közvetve adnak információt a háttérben zajló légúti gyulladásos folyamatok intenzitásáról és sok esetben nem tükrözik annak súlyosságát. Köztudott, hogy az esetek egy részében klinikailag tünetmentes állapotban is kimutatható a légúti gyulladás, sőt ennek patológiai következménye (remodelling) asztmás betegekben. Az elmúlt évtizedekben a légúti gyulladás patológiai, patofiziológiai folyamatainak követése csak indirekt módon, a szérum, vagy vizeletminták vizsgálatával vagy invazív módszerekkel

végzett

direkt

mintavétellel,

így

bronchoszkopos

biopszia,

bronchoalveolaris lavage alkalmazásával volt megoldható. A szérum és vizeletminták vizsgálata csak közvetett információt ad a légutakban zajló gyulladásos folyamatokról ezért tudományos „értékük” elmarad a légúti minták vizsgálatától. A bronchológiai beavatkozások szövődményi kockázatot jelentenek, a beteg számára megterhelőek, így kutatási célra csak körültekintően megválasztott esetekben alkalmazhatóak. Különösen át kell gondolni az invazív módszerek indikációját gyerekek és súlyos állapotú felnőtt betegek esetén. Nagy költségigényük és invazivitásuk miatt a bronchológiai mintavételi módszerek a légúti gyulladás rutinszerű követésére és szűrővizsgálatokra alkalmatlanok.

48

Ezek alapján érthető a törekvés olyan nem invazív, a beteg számára megterhelést, kockázatot nem jelentő, egyszerűen alkalmazható módszerek kifejlesztésére, amelyek alkalmasak a légúti gyulladás követésére, valamint felhasználhatóak diagnosztikai problémák esetén és szűrővizsgálatoknál. A jelenleg rendelkezésre álló nem invazív mérési és mintavételi módszereket egyenlőre kutatási

céllal,

a

krónikus

légúti

betegségek

patomechanizmusának

jobb

megismerésében hasznosíthatjuk, rutinszerű klinikai alkalmazásuk még nem valósult meg. Az elmúlt években tapasztalt, a nem invazív módszerekkel kapcsolatos intenzív tudományos érdeklődés az első lépés ahhoz, hogy az eljárások tökéletesítésével, az így mérhető gyulladásos mediátorokra vonatkozó ismeretek bővítésével ezek végül a mindennapi orvosi gyakorlatban egyszerűen és megbízhatóan alkalmazható eljárásokká váljanak. A köpetindukció gyerekkori betegségek esetén is széles körben alkalmazott eljárás a krónikus légúti betegségek megismerését szolgáló vizsgálatokban. Tudományos szempontból előnye, hogy az alsó légutakból származó sejtek és gyulladásos markerek párhuzamos vizsgálatát teszi lehetővé, viszont rutinszerű klinikai alkalmazhatóságát megnehezíti az, hogy némiképp mégis invazív eljárásról van szó (hiszen bronchokonstrikciót okozhat) illetve hozzáértő, gyakorlott személyzetet és komoly laboratóriumi hátteret igényel. Gyerekek esetén mindenképpen figyelembe kell venni azt is, hogy a köpetindukció a beteg számára kellemetlen eljárás mivel a hipertóniás sóoldat belégzése a légúti váladékképződést fokozza, a beteget köhögteti. Ezen túl az eljárás megfelelő kooperációt igényel, amelyre általában csak a 5-6 évesnél idősebb gyerekek képesek. Gyerekeknél a sikeres köpetindukciók aránya a különböző kutató centrumokban 60-100% között mozog125, 164. A

kilégzett

levegőben

mérhető

gyulladásos

markerek

jövőbeli

gyakorlati

alkalmazhatósága a mérési, valamint a mintavételi módszerek viszonylag alacsony költségigénye és egyszerűsége miatt inkább elképzelhető. Ehhez azonban arra van szükség, hogy a kilégzett levegőben jelenleg csak tudományos céllal vizsgált mediátoroknak a különböző krónikus légúti betegségek, ezen belül az asztma patomechanizmusában betöltött szerepét pontosabban megismerjük, meghatározzuk ezeknek egymással, illetve a betegek állapotát tükröző egyéb paraméterekkel (klinikai tünetek súlyossága, légúti obstrukció és hiperreaktivitás) való összefüggését, valamint a gyulladáscsökkentő kezelés mellett mutatott változásaikat. 49

Napjainkban a kutatásban használt nem invazív módszerek közül a kilégzett NO-val kapcsolatban már rendelkezésre állnak olyan széleskörű vizsgálati eredmények, amelyek alapján körvonalazódnak azok a területek, ahol a jövőben a kilégzett NO meghatározása a mindennapos pulmonológiai gyakorlatba beilleszthető lesz. Valószínű azonban, hogy a kilégzett levegőben mért NO önmagában nem tükrözi az asztmás légutakban zajló gyulladásos folyamatok egészét, így a későbbiekben más gyulladásos mediátorok szimultán meghatározásával együtt értékelve adhat átfogó képet a légúti gyulladás háttérmechanizmusairól. A kilégzett NO egészen fiatal gyerekeknél is megbízhatóan mérhető. Általában az „online” NO mérés is megfelelően kivitelezhető, 4 éve kor alatt azonban megbízhatóbb az NO „offline” meghatározása, amely jelentős kooperációt nem igényel. Csecsemők részére a kilégzett NO mérésére speciális eszközök állnak rendelkezésre. Az eddigi vizsgálatok azt mutatják, hogy asztmában a kilégzett NO koncentrációja az egészségesekben talált értékek akár többszöröse is lehet. A kilégzett NO meghatározása azonban önmagában nem diagnosztikus értékű, tekintve, hogy az asztmások egy részében az NO csak kis mértékben emelkedett, vagy, elsősorban a nem atópiás esetekben az egészségesekétől eltérést nem mutat. Ezen túl más, gyulladással járó légúti megbetegedésekben, így bronchiektásiában, légúti infekciók kapcsán is megfigyelhető a kilégzett NO emelkedése, igaz, hogy ennek mértéke elmarad a szteroid naív atópiás asztmásokétól. A kilégzett NO koncentrációja emelkedett légúti hiperreaktivitást mutató atópiás személyekben, ami felveti, hogy a légútjaikban már szubklinikus gyulladás zajlik.165 Az allergiás rhinitiszes betegek közel egy harmadában lehet emelkedett kilégzett NO koncentrációt detektálni, ami feltehetően az alsó légutak érintettségét jelenti. Ezen kívül olyan tizenévesekben, akiknek gyermekkorukban asztmájuk volt, a kilégzett NO szint emelkedése mérhető, még olyan esetekben is, ha nem állnak fenn klinikai tünetek és normális légzésfunkció mérhető166. Ezek alapján a kilégzett NO meghatározása a későbbiekben esetleg hasznosítható lesz szűrővizsgálatoknál. A kilégzett NO koncentráció asztmás betegekben összefüggést mutat a gyulladás intenzitásával, a hiperreaktivitás, valamint a légúti obstrukció reverzibilitásának mértékével. A kilégzett NO tovább emelkedik allergénexpozíció, vagy akut asztma

50

exacerbáció idején. Ezek alapján a kilégzett NO rendszeresen meghatározása alkalmas lehet a betegek állapotának követésére. A légúti gyulladást csökkentő kezelések, így kortikoszteroid illetve leukotrién antagonista terápia mellett a kilégzett NO csökken. Ennek megfelelően a kilégzett NOval ellenőrizhető a frissen beállított, vagy korábban már használt, de adagjában módosított kezelés légúti hatása. Úgy tűnik azonban, hogy az NO szteroid kezelés mellett érzékenyebben változik, mint a légúti gyulladás intenzitása. A kilégzett NO csökkenése már olyan kicsi szteroid adagnál megfigyelhető, amely mellett az eozinofil gyulladás még bizonyítottan fennáll167. Ezek alapján a kilégzett NO csökkenése ugyan jelzi, hogy az alkalmazott kezelés a gyulladás intenzitását befolyásolja-e, de önmagában a gyulladáskontroll minőségének meghatározására nem alkalmas. A kilégzett levegő kondenzátumban mért gyulladásos markerek (H2O2, leukotriének, prosztaglandinok, citokinek, adenozin) által jellemzett gyulladásos folyamatok valószínűleg csak részben mutatnak átfedést azokkal, amelyek a kilégzett NO-t meghatározzák. Az sem kizárt, hogy az NO metabolitjainak mérése pontosabb képet ad majd a légutakban zajló NO képzésről, mint önmagában a kilégzett NO meghatározása. A kilégzett levegő kondenzátum anyagvételi módszere könnyen kivitelezhető, biztonságosan alkalmazható (szignifikáns légúti obstrukciót nem okoz) eljárás. Különleges kooperációt nem igényel, gyerekeknél is közel 100%-os eredményességgel alkalmazható, speciális eszközökkel csecsemőknél is kivitelezhető. Az eddigi vizsgálati eredmények azt mutatják, hogy vannak olyan tényezők, amelyek befolyásolhatják a minta minőségét és a mintavétel hatékonyságát, de ezek szerepe még teljes mértékben nem ismert. Ilyen kérdéses terület, hogy a kilégzési áramlási sebesség, a percventilláció, a páratartalom, a mintavételi idő, valamint a mintagyűjtő készülékek hatékonysága és anyaga befolyásolja-e a kondenzátum összetételét, illetve, hogy a jelenleg alkalmazott módszernél a felső légúti és nyállal történő kontaminációnak van-e érdemi szerepe. A módszer standardizálásával kapcsolatban több kutató centrumban folynak vizsgálatok. Ezek eredményeinek összegzését az ERS tudományos munkacsoportja jelenleg végzi. A metodikai problémák ellenére egyre több eredmény áll rendelkezésre a kilégzett levegő kondenzátumban mérhető gyulladásos markerekkel kapcsolatban, az még nem

51

rajzolódott ki azonban, hogy egy-egy mediátor meghatározása hogyan jellemzi a gyulladásos folyamatok intezitását és mennyire megbízhatóan tükrözi a beteg állapotát. Az eddigi vizsgálatok ígéretes eredményeket mutatnak. A kilégzett levegő kondenzátum pH-ja speciális pH mérő eszközzel egyszerűen meghatározható, komoly laboratóriumi hátteret nem igényel. A pH akut asztmában alacsonyabb, mint egészségeseké és szteroid kezelés mellett a pH érték normalizálódik. Ezen túl stabil állapotú asztmás gyerekeknél is alacsonyabb pH-t mértek a kilégzett levegő kondenzátumban, és a csökkenés mértéke összefüggést mutatott betegségük súlyosságával85, 86. A kilégzett levegő kondenzátumban vizsgált anyagok közül talán H2O2–vel van a legtöbb ismeretünk asztmában. A H2O2 az asztmás gyulladás során a szuperoxid anion metabolizmusa során képződik, és az oxidatív stressz mértékét mutatja. Asztmában a kilégzett levegő kondenzátumában a H2O2 koncentrációja emelkedett, összefüggést mutat a köpet eozinofil sejtszám arányával és a légúti hiperreaktivitással. Inhalációs szteroid kezelés mellett a H2O2 szint csökken a kilégzett levegő kondenzátumban91, 92. A 8-izoprosztán a membrán-foszfolipidek oxidatív stresszhez kötött peroxidációja során keletkezik és az oxidatív stressz klinikai megítélésére használható. Asztmás betegekben emelkedett a 8-izoprosztán szintje a kilégzett levegőben az egészségesekéhez képest és koncentrációja arányos a betegség súlyosságával98, 99. A kondenzátumban mérhető a Th2-típusú gyulladásra jellemző IL-4 és Th1-típusú gyulladásos mediátor INF-γ. Az IL-4 szintje emelkedett szteroid-mentes asztmás gyermekek kondezátumában, de nem különbözik az egészségesekétől szteroid kezelés esetén. Az INF-γ szintje csökkent mindkét asztmás csoportban112. Számos adat bizonyítja az adenozin szerepét az asztmás gyulladás kialakulásában. A kilégzett kondenzátumban mért koncentrációja a szteroiddal nem kezelt asztmásokban emelkedett a szteroiddal kezelt asztmásokéval és az egészségesekével összehasonlítva. Asztmás betegekben az adenozin koncentrációja összefüggést mutat a kilégzett NO koncentrációjával115. A glutation (mint az oxidatív állapot markere), és az aldehidek (az oxidatív károsodás mutatói)

kimutathatóak

a

kilégzett

levegő

kondenzátumban.

Asztmások

exacerbációjában az előbbi szintje csökken, az utóbbié nő, orális szteroid adását követően mindkettő az eredeti tartományba tér vissza, mutatva ezzel az exacerbáció 52

során végbemenő oxidatív folyamatokat és a szteroid kezelés mellett bekövetkező változásokat117. A kilégzett levegőben mérhető számos, az NO bomlásához kötött termékek közül a nitrotyrozin szintje emelkedett a szteroiddal nem kezelt kezelés enyhe asztmásokban, míg alacsony az inhalációs vagy per os kezelésben részesülő középsúlyos és súlyos asztmás betegcsoportban107. A kilégzett levegő kondenzátumban mérhető nitrit és nitrát kapcsán felmerült, hogy

meghatározásukat alkalmazni lehetne az asztmás légúti

gyulladás ellenőrzésére118, 119. Magasabb nitrozotiol koncentrációt találtak súlyos, orális szteroiddal kezelt asztmásokban szemben az egészségesekkel és enyhe, szteroid-mentes asztmásokkal122. A kilégzett gyulladásos markerek meghatározását a jövőben talán a rendszeres kontroll vizsgálatok során, a jelenlegi laboratóriumi vizsgálatokhoz hasonlóan alkalmazhatjuk a beteg állapotának követésében.

Jövőbeli feladatok: 1. a nem invazív vizsgálómódszerekkel kapcsolatos ismereteket bővítése, pontosítása, különös tekintettel a későbbi klinikai alkalmazhatóságuk lehetőségére 2. a módszerek, elsősorban a kilégzett levegő kondenzátum standardizációjával kapcsolatos kérdések tisztázása 3. a jelenleg kutatási céllal használt eszközök egyszerűsítése, portábilis eszközök kifejlesztése.

53

7

Következtetések

7.1 I. Altéma - Leukotriének a kilégzett levegő kondenzátumban gyermekkori asztmában A vizsgálatban bizonyítottuk, hogy a cisz-LT, valamint az LTB4 magasabb koncentrációban van jelen a kilégzett levegő kondenzátumban az inhalációs szteroiddal kezelt enyhe és középsúlyos-súlyos perzisztáló asztmás betegekben, míg enyhe intemittáló asztmában a mediátorok mennyiségében szignifikáns eltérés nem észlelhető az egészségesekkel összehasonlítva. Ezek az eredmények alátámasztják a leukotriének krónikus légúti gyulladásban betöltött szerepét elsősorban a súlyosabb, rendszeres preventív gyulladáscsökkentő kezelést igénylő esetekben. LTB4 vonatkozásában felmerül annak a lehetősége, hogy az asztma kezelésben jelenleg alapvető inhalációs szteroidok használata amellett, hogy csökkenti a gyulladásos folyamatok intenzitását, azok háttérfolyamatainak összetételét is befolyásolhatja. Az eredmények alapján szintén megállapítható, hogy az asztmás betegek követésénél hagyományosan alkalmazott módszerek, mint a tünetek értékelése, fizikális vizsgálat, légzésfunkció, nem minden esetben tükrözik a betegek valós állapotát, hiszen inhalációs szteroiddal klinikailag jól kontrollált asztmás betegeknél is kimutatható a kezelés mellett perzisztáló légúti gyulladás. Korábbi vizsgálatok eredményével egyezően úgy tűnik, hogy a kilégzett NO nem tükrözi az asztmás légutakban zajló gyulladásos folyamatok teljes spektrumát, és a leukotriének

kilégzett

levegő

kondenzátumban

mérhető

koncentrációjának

meghatározása hozzájárulhat a légúti gyulladás háttérmechanizmusának komplexebb megismeréséhez.

7.2 II. Altéma - Nitrogén-oxid metabolitok a kilégzett levegő kondenzátumban primér ciliáris diszkinéziában A vizsgálat eredménye megerősítette azt a korábbi megfigyelést, amely szerint a kilégzett, valamint nazalisan mérhető NO PCD-s betegekben az egészségesekénél szignifikánas alacsonyabb. Az NO metabolitjainak kilégzett levegő kondenzátumban mért egészségesekével megegyező koncentrációja alapján feltételezhető, hogy az alacsony kilégzett NO értékek hátterében a NOS működésének defektusa, valamint a fokozott NO metabolizáció egyaránt szerepet játszik. Az NO biológiai szerepét 54

figyelembe véve nem kizárt, hogy az alacsony kilégzett, valamint felső légúti NO-nak jelentősége van a betegség patomechanizmusában. Szelektív és hatásos NOS inhibitorok és NO donorok, valamint az NO biokémiájának nem invazív módszerekkel történő további vizsgálatai tisztázhatják a NOS és az NO pontos szerepét ebben e betegségben és egyben új terápiás lehetőségek felfedezését eredményezhetik. PCD-ben a kilégzett és felső légúti NO csökkenés mértéke, különösen a nazalis NO esetén olyan mértékű, amely más betegségben nem fordul elő. A kilégzett és nazalis NO meghatározása ennek megfelelően alkalmas a PCD-s eseteknek a visszatérő légúti infekciók, infertilitás miatt vizsgált betegcsoportból történő kiemelésére. Az így kiszűrt betegeknél, amennyiben a megfelelő vizsgálatok a PCD diagnózisát megerősítik rendszeres kezelés, valamint pulmonológiai és orr-fül-gégészeti gondozás mellett a késői szövődmények kialakulása megelőzhető.

A gyermekkorban kezdődő krónikus légúti betegségek gyakran egész életre szóló állapotot jelentenek. Ennek megfelelően a korai diagnózis, valamint az optimális gyulladáskontroll jelentősége vitathatatlan. Ismereteink bővülésével a jelenleg kutatási programokban használt nem invazív mérési és mintavételi módszerek a jövőben talán a mindennapi

klinikai

gyakorlatban

alkalmazható,

szűrővizsgálatoknál,

diagnosztizált betegségek követésénél felhasználható eljárások lesznek.

55

a

már

8

Köszönetnyilvánítás

Köszönettel tartozom az Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet vezetésének, azért hogy kutatási ambícióimat támogatta és lehetőséget biztosított arra, hogy éljek a külföldi ösztöndíj lehetőségével. Köszönetet szeretnék mondani dr. Herjavecz Irénnek, hogy kutatómunkám, valamint a dolgozat elkészítése idején midvégig messzemenőkig támogatott, szakmai tanácsaival segített. Köszönettel tartozom dr. Horváth Ildikónak, aki felkeltette érdeklődésemet a kutatómunka iránt, és kapcsolatai révén segítségemre volt abban, hogy egy nemzetközi viszonylatban is elismert kutatólabor munkájában vehessek részt. Köszönettet szeretnék mondani Prof dr. Peter J. Barnesnak (London, Anglia), aki lehetőséget adott számomra, hogy az általa irányított laboratóriumban dolgozhassak és a munkámat támogatta. Köszönettel tartozom a londoni laborban volt munkatársaimnak, akik tanácsaikkal a segítségemre voltak. Köszönetet szeretnék mondani dr. Huszár Évának szakmai tanácsaiért, valamint Kórélettani Osztályunk munkatársainak segítségükért. Köszönettel tartozom dr. Vizi

Évának, hogy a terhelés indukálta asztma

patomechanizmusával kapcsolatos kutatási témájához csatlakozhattam, és a klinikai kutatómunkával kapcsolatos első tapasztalatokat még külföldi tanulmányutam előtt megszerezhettem. Szeretnék köszönetet mondani közvetlen munkatársaimnak, dr. Reindl Ildikónak, dr. Máthé Olgának, dr. Bánkuti Beátának és dr. Argay Katalinnak baráti támogatásunkért valamint azért, hogy a kutatómunkával kapcsolatos távollétem idején a betegellátás zavartalanságát biztosították. Végül, de nem utolsó sorban köszönettel tartozom családomnak feltétlen segítségükért és bíztatásukért.

56

9

1

Irodalomjegyzék

International Study of Asthma and Allergies in Childhood Steering Committee. Woldwide variation in the prevalence of symptoms of asthma, allergic rhinoconjunctivitis and atopic eczema: ISAAC. Lancet; 351: 1225-1232.

2

European Allergy White Paper. Braine-l’ Allend-Belgium, UCB Pharmaceutical Sector 1997: 14-47.

3

Endre L. Gyermekkori asztma növekvő gyakorisága Budapesten 1995-től 1999-ig. Allergol Klin Immunol 1999; 2: 100-103.

4

Holt PG, Sly PG, Björkstén B. Atopic versus infectious diseases in childhood: a question of balance? Pediatric Allergy Immunol 1997; 8: 53-58.

5

von Mutius E, Illi S, Hirsch T, Leupold W, Keil U, Weiland SK. Frequency of infections and risk of asthma, atopy and airway hyperresponsiveness in children. Eur Respir J 1999; 14: 4-11.

6

Cserháti E, Halász A, Mezei Gy. Gyermekkori asthma változó prevalenciája és felnőttkori prognózisa. Orvosképzés 2001; 1: 49-56.

7

Rona RJ, Chinn S, Burney PG. Trends in the prevalence and severity of childhood asthma. Br Med J 1994; 308:1600-1604

8

Manfreda J, Becker AB, Wang PZ, Roos LL, Anthonisen NR. Trends in physician-diagnosed asthma prevalence in Manitoba between 1980-and 1990. Chest 1993; 103:151-157.

9

Neuspiel DR, Kuller LH. Sudden and unexpected natural death in childhood and adolescence. JAMA 1985; 254: 1321-1325.

10

Akers IA, Parsons M, Hill MR. Mast cell tryptase stimulates human lung fibroblast proliferation via protease-activated receptor-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2000;278: 193-201.

11

Barnes PJ. Are mast cells still important in asthma ? Rev Fr Allergol Immunol Clin 2002;42 :20-27.

57

12

Lambrecht BN, De Veerman M, Coyle AJ et al. Myeloid dentric cells induce Th2 responses to inhaled antigen, leading to eosinophilic airway inflammation. J Clin Invest 2000; 106: 551-559.

13

Gibson PG, Wlodarczyk JW, Hensley MJ, Gleeson M, Henry RL, Cripps AW, Clancy RL. Epidemiological association of airway inflammation with asthma symptoms and airway hyperresponsiveness in childhood. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158: 36-41.

14.

Cai Y, Carty K, Henry RL, Gibson PG. Persistence of sputum eosinophilia in children with controlled asthma when compared with healthy children. Eur Respir J 1998; 11: 848-853.

15

Wegner CD, Gundel L, Reilly P. Intracellularis adhesion molecule-1 (ICAM-1) in the pathogenesis of asthma. Science 1990; 247: 456-459.

16

Evans DJ, Lindsay MA, O’Connor BJ. Priming of circulating human eosinophils following exposure to allergen challenge. Eur Respir J 1996;9 : 703-708.

17

Collins PD, Marleau S, Griffiths-Johnson DA. Cooperation between IL-5 and the chemokine eotaxin to induce eosinophil accumulation in vivo. J Exp Med 1995; 182: 1169-1174.

18

Jatakanon A, Uasuf C, Maziak W, Lim S, Fan Chung K and Barnes PJ. Neutrophilic inflammation in severe persistent asthma. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: 1532-1539.

19

Fahy JV, Kim KW, Liu J, Boushey HA. Prominent neutrophilic inflammation in sputum from patients with asthma exacerbation J Allergy Clin Immunol 1995; 95: 843-852.

20

Twaddel SH, Gibson PG, Carty K, Woolley KL, Henry RL. Assessment of airway inflammation in children with acute asthma using induced sputum. Eur Respir J 1996; 9: 2104-2108.

21

Chedevergne F, Le Bourgeois M, De Blic J, Scheinmann P. The role of inflammation in childhood asthma. Arch Dis Child 2000; 82 Suppl 2: II 6-9.

22

Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 1987; 327(6122): 524-526.

58

23

Barnes NC, Piper PJ, Costello JF. Comparative actions of inhaled leukotriene C4, leukotriene D4 and histamine in normal human subjects. Thorax 1984; 39: 500504.

24

Drazen JM, Austen KF, Lewis RA, Clark DA, Goto G, Marfat A, Corey EJ. Comparative airway and vascular activity of leukotriene C and D in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 1980; 77: 4345-4358.

25

Marom Z, Shelhamer JH, Bach MK, Morton DR, Kaliner M. Slow-reacting substances, leukotriene C4 and D4, increase the release of mucus from human airways in vitro. Am Rev Respir Dis 1982; 126: 449-451.

26

Laitinen L, Laitinen A, Haahtel T, Vilkka V, Spur BW, Lee TH. Leukotriene E4 and granulocytic infiltration into asthmatic airways. Lancet 1993; 341: 989-990.

27

Leff JA, Busse WW, Pearlman D. Montelukast, a leukotriene-receptor antagonist, for the treatment of mild asthma and exercise-induced bronchoconstriction. N Engl J Med 1998; 338: 147-152.

28

Claesson HE, Odlander B, Jakobssen PJ. Leukotriene B4 in the immune system. Int J Immunopharmacol 1992; 14: 441-449.

29

Black PN, Fullen RW, Taylor GW, Barnes PJ, Dollery CT. Effect of inhaled leukotriene B4 alone and in combination with prostaglandin D2 on bronchial responsiveness to histamine in normal subjects. Thorax 1989, 44: 491-495.

30

Martin TR, Pistorese BP, Chi EY, Goodman RB, Matthay MA. Effects of leukotriene B4 in the human lung. Recruitment of neutrophils into the alveolar spaces without a change in protein permeability. J Clin Invest 1989; 84: 16091619.

31

Wedmore

CV,

Williams

TJ.

Control

of

vascular

permeability

by

polymorphonuclear leukocytes in inflammation. Nature 1981; 289: 646-650. 32

Bjork J, Hedqvist P, Arfons KE. Increase of vascular permeability induced by leukotriene B4 and the role of polymorphonuclear leukocytes. Inflammation 1982: 6: 189-200.

33

Wardlaw A, Hay H, Cromwell O, Collins JV, Kay AB. Leukotrienes LTC4 and LTB4 in bronchoalveolar lavage in bronchial asthma and other respiratory diseases. J Allergy Clin Immunol 1989; 84:19-26.

59

34

Sampson AP, Castling DP, Green CP, Price JF. Persistent increase in plasma and urinary leukotrienes after acute asthma. Arch Dis Child 1995; 73: 221-225.

35

Bush A, Cole P, Hariri M, Mackay I, Phillips G, O’Callaghan C, Wilson R, Warner JO. Primary ciliary dyskinesia: diagnosis and standard of care. Eur Respir J 1998; 12: 982-988.

36

Meeks M, Bush A. Primary ciliary dyskinesia. Pediatr Pulmonol 2000; 29: 307316.

37

Knudsen BB, Valerius NH, Pedersen M. Neutrophil function in primary ciliary dyskinesia. Eur J Respir Dis 1983; 64(suppl 128): 476-478.

38

Karadag B, James AJ, Gultekin E, Wilson NM, Bush A. Nasal and lower airway level of nitric oxide in children with primary ciliary dyskinesia. Eur Respir J 1999; 13: 1402-1405.

39

Gustafsson LE, Leone AM, Persson MG, Wiklund NP, Moncada S. Endogenous nitric oxide is present in the exhaled air of rabbits, guinea pigs and humans. Biochem Biophys Res Commun 1991; 181: 852-857.

40

Barker M, Kamboures MA, Rose-Gootron CM, Cooper DM, Blake DR. Comprehensive analysis of volatile organic compounds in human breath gas samples. Eur Resp J 2003; 22: suppl 45: 131s.

41

Shaul PW, North AJ, Wu LC, Wells LB, Brannon TS, Lau KS, Michel T, Margraf LR, Star RA. Endothelial nitric oxide synthase is expressed in cultured human bronchiolar epithelium. J Clin Invest 1994; 94: 2231-2236.

42 Mannick JB, Asano K, Izumi K, Kieff E, Stamler JS. Nitric oxide produced by human B lymphocytes inhibits apoptosis and Epstein-Barr virus reactivation. Cell 1994; 79: 1137-1146. 43 Kobzik L, Bredt DS, Lowenstein CJ, Drazen J, Gaston B, Sugarbaker D, Stamler JS. Nitric Oxide Synthase in Human and Rat Lung: Immunocytochemical and Histochemical Localization. Am J Respir Cell Mol Biol 1993; Vol. 9. pp. 371-377. 44 Saleh D, Ernst P, Lim S, Barnes PJ, Giaid A. Increased formation of the potent oxidant peroxynitrite in the airways of asthmatic patients is associated with induction of nitric oxide synthase: effect of inhaled glucocorticoid. FASEB J 1998; 12: 929-937.

60

45 Yates DH, Kharitonov SA, Robbins RA, Thomas PS, Barnes PJ. Effect of a nitric oxide synthase inhibitor and a glucocorticosteroid on exhaled nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 1995; 152: 892-896. 46 Kharitonov SA, Yates DH, Robbins RA, Logan-Sinclair R, Shinebourne EA, Barnes PJ. Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Lancet 1994; 343: 133-135. 47 Kharitonov SA, Chung FK, Evans DJ, O'Connor BJ, Barnes PJ. The elevated level of exhaled nitric oxide in asthmatic patients is mainly derived from the lower respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med 1996; 153: 1773-1780. 48 Silkoff PE, McClean PA, Slutsky AS, Furlott HG, Hoffstein E, Wakita S, Chapman KR, Szalai JP, Zamel N. Marked flow-dependence of exhaled nitric oxide using a new technique to exclude nasal nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 1997; 155: 260-267. 49 Lehtimaki L, Turjanmaa V, Kankaanranta H, Saarelainen S, Hahtola P, Moilanen E. Increased bronchial nitric oxide production in patients with asthma measured with a novel method of different exhalation flow rates. Ann Med 2000; 32: 417-423. 50 Kawamoto H, Takumida M, Takeno S, Watanabe H, Fukushima N, Yajin K. Localization of nitric oxide synthase in human nasal mucosa with nasal allergy. Acta Otolaryngol Suppl (Stockh) 1998;539:65-70. 51 Anonymous. Recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide in adults and children. Am J Respir Crit Care Med 1999;160: 2104-2117. 52 Kharitonov SA, Alving K, Barnes PJ. Exhaled and nasal nitric oxide measurements: recommendations. Eur Respir J 1997; 10: 1683-1693. 53 Barnes PJ, Kharitonov SA. Exhaled nitric oxide: a new lung function test. Thorax 1996; 233-237. 54 Jain B, Rubinstein I, Robbins RA, Leise KL, Sisson JH. Modulation of airway epithelial cell ciliary beat frequency by nitric oxide. Biochem Biophys Res Commun 1993; 191: 83-88. 55 Alving K, Weitzberg E, Lundberg JM. Increased amount of nitric oxide in exhaled air of asthmatics. Eur Respir J 1993; 6: 1368-1370.

61

56 Horváth I, Donnelly LE, Kiss A, Barnes PJ. Combined use of exhaled hydrogen peroxide and nitric oxide in monitoring asthma. Am J Resp Crit Care Med 1998;1 58: 1042-1046. 57 Maziak W, Loukides S, Culpitt SV, Sullivan P, Kharitonov SA. Exhaled nitric oxide in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157: 998-1002. 58 Kharitonov SA, Wells AU, O'Connor BJ, Cole PJ, Hansell DM, Logan-Sinclair RB, Barnes PJ. Elevated levels of exhaled nitric oxide in bronchiectasis. Am J Respir Crit Care Med 1995; 151: 1889-1893. 59 Horváth I, Loukides S, Wodehouse T, Barnes PJ. Comparison of exhaled and nasal nitric oxide and exhaled carbon monoxide levels in bronchiectatic patients with and without primary ciliary dyskinesia. Thorax. 2003; 58: 68-72. 60 Paredi P, Kharitonov SA, Loukides S, Pantelidis P, Du Bois RM, Barnes PJ. Exhaled nitric oxide is increased in active fibrosing alveolitis. Chest 1999; 115: 1352-1356. 61 Kharitonov SA, Yates D, and Barnes PJ. Increased nitric oxide in exhaled air of normal human subjects with upper respiratory tract infections. Eur Resp J 1995; 8: 295-297. 62 Ludviksdottir D, Janson C, Hogman M, Hedenstrom H, Bjornsson E, Boman G. Exhaled nitric oxide and its relationship to airway responsiveness and atopy in asthma: BHR-Study Group. Respir Med 1999; 93: 552-556. 63 Silvestri M, Spallarossa D, Yourukova VF, Battistini E, Fregonese B, Rossi GA. Orally exhaled nitric oxide levels are related to the degree of blood eosinophilia in atopic children with mild-intermitten asthma. Eur Respir J 1999; 13: 321-326. 64 Piacentini GL, Bodini A, Costella S, Vicentini L, Mazzi P, Sperandio S, Boner AL. Exhaled nitric oxide and sputum eosinophil markers of inflammation in asthmatic children. Eur Respir J 1999; 13: 1386-1390. 65 Baraldi E, Carra S, Dario C, Azzolin N, Ongarro R, Marcer G, Zacchello F. Effect of natural grass pollen exposure on exhaled nitric oxide in asthmatic children. Am J Respir Crit Care Med 1999; 159: 262-266.

62

66 Kharitonov SA, O'Connor BJ, Evans DJ, Barnes PJ. Allergen-induced late asthmatic reactions are associated with elevation of exhaled nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 1995; 151: 1894-1899. 67 Kharitonov SA, Yates DH, Barnes PJ. Inhaled glucocorticoids decrease nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Am J Respir Crit Care Med 1996; 153: 454457. 68 Bisgaard H, Loland L, Oj JA. NO in exhaled air of asthmatic children is reduced by the leukotriene receptor antagonist montelukast. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: 1227-1231. 69 Grasemann H, Michler E, Wallot M, Ratjen F. Decreased concentration of exhaled nitric oxide (NO) in patients with cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol 1997; 24: 173177 70 Balfour-Lynn IM, Laverty A, Dinwiddie R. Reduced upper airway nitric oxide in cystic fibrosis. Arch Dis Child 1996; 75: 319-322. 71 Kelley TJ, Drumm ML. Inducible nitric oxide synthase expression is reduced in cystic fibrosis murine and human airway epithelial cells. J Clin Invest 1998; 102: 1200-1207. 72 Gaston B, Drazen JM, Loscalzo J, Stamler JS. The biology of nitrogen oxides in the airways. Am J Respir Crit Care Med 1994; 149: 538-551. 73 Van der Vliet A, Eiserich JP, Shigenaga MK, Cross CE. Reactive nitrogen species and tyrosine nitration in the respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med 1999, 160: 1-9. 74 Gaston B, Reilly J, Drazen JM, Fackler J, Ramdev P, Arnelle D, Mullins ME, Sugarbaker DJ, Chee C, Singel DJ, Loscalzo J, Stamler JS. Endogenous nitrogen oxides and bronchodilator s-nitrosothiols in human airways. Proc Natl Acad Sc. USA 1993; 90: 10957-10961. 75 Klebanoff SJ. Reactive nitrogen intermediates and antimicrobial activity: role of nitrite. Free Radic Biol Med 1993; 14: 351-360. 76 Nycyk JA, Drury JA, Cooke RW. Breath pentane as a marker for lipid peroxidation and adverse outcome in preterm infants. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 1998; 79: F67-F69.

63

77 Paredi P, Kharitonov SA, Barnes PJ. Elevation of exhaled ethane concentration in asthma. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 1450-1454. 78 Paredi P, Kharitonov SA, Leak D, Ward S, Cramer D, Barnes PJ. Exhaled ethane, a marker of lipid peroxidation, is elevated in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 369-373. 79 Horvath I, Donnelly LE, Kiss A, Paredi P, Kharitonov SA, Barnes PJ. Elevated levels of exhaled carbon monoxide are associated with an increased expression of heme oxygenase-1 in airway macrophages in asthma: a new marker of oxidative stress. Thorax 1998; 53: 668-672. 80 Horvath I, Loukides S, Wodehouse T, Kharitonov SA, Cole PJ, Barnes PJ. Elevated levels of exhaled carbon monoxide in bronchiectasis: a new marker of oxidative stress. Thorax 1998; 53: 867-870. 81 Paredi P, Kharitonov SA, Barnes PJ. Faster Rise of exhaled breath temperature in asthma. Am J Respir Crit Care Med 2002; 165:181-184. 82 Baraldi E, Ghiro L, Piovan V, Carraro S, Zacchello F, Zanconato. Safety and success of exhaled breath condensate collection in asthma. Arch Dis Child 2003; 88(4):358-360. 83 Zieba M, Petrzkowich M, Kroczynka-Bednarek J, Grzelewska-Rzymowska I, Kwiatkowska S. Spirometric parameters during expired breath condensate collection in patients with COPD. Eur Respir J 2001; 18: suppl 33: 92s P666. 84 Horak F, Moeller A, Hall GL, Franklin PJ, Searles R, Lane Catherine, Stick SM. Expression of iNOS, exhaled NO and nitrite/nitrate in exhaled condensate in infants and toddlers with cystic fibrosis. Eur Respir J 2003; 22: suppl 45: 230s, P1544. 85 Carpagnano GE, Barnes PJ, Francis J, Wilson NM, Bush A, Kharitonov SA. Breath condensate pH in children with CF and asthma: a new non-invasive marker of airway inflammation? Eur Respir J 2003; 22: suppl 45: 232s, P1548. 86 Hunt FJ, Fang K, Malik R, et al. Endogenous airway acidification: implications for asthma pathophysiology. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161: 694-699. 87 Kostikas K, Papatheodorou G, Ganas K, Psathakis K, Panagou P, Loukides S. pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases. Am J Respir Crit Care Med 2002; 165(10): 1364-1370.

64

88 Anaev EK, Avdeev SN, Chuchalin AG. Assessment of the pH of breath condensate in pneumonia. Eur Respir J 2003; 22: suppl. 45: 447s, P2845. 89 Mulrennan SA, Ojoo JC, Kastelic JA, Morice AH, Rendington AE. Airway acidification and exhaled nitric oxide in cystic fibrosis. Eur Respir J 2003; 22: suppl 45: 514s, P3210. 90 Carpagnano EG, Uasuf C, Bellia V, Vignola AM. pH measurement in oral and nasal exhaled breath condensate in allergic rhinitis. Eur Respir J 2003; 22: suppl 45: 447s, P2846. 91 Antczak A, Kumanowska Z, Kasielski M. Inhaled glucocorticosteroids decrease hydrogen peroxide level in expired air condensate in asthmatic patients. Respir Med 2000; 94: 416-421. 92 Jobsis Q, Raatgeep HC, Hermans PW. Hydrogen peroxide in exhaled air is increased in stable asthmatic children. Eur Respir J 1997; 10: 519-521. 93 Dekhuijzen PN, Aben KK, Dekker I, Aarts LP, Wielders PL, van Herwaarden CL, Bast A. Increased exhalation of hydrogen peroxide in patients with stable and unstable chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1996; 154: 813-816. 94 Nowak D, Antczak A, Krol M, Pietras T, Shariati B, Bialasiewicz P, Jeczkowski K, Kula P. Increased content of hydrogen peroxide in the expired breath of cigarette smokers. Eur Respir J 1996; 9: 652-657. 95 Loukides S, Horvath I, Wodehouse T, Cole PJ, Barnes PJ. Elevated levels of expired breath hydrogen peroxide in bronchiectasis. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158: 991-994. 96 Jobsis Q, Raatgeep HC, Schellekens SL, Kroesbergen A, Hop WC, de Jongste JC. Hydrogen peroxide and nitric oxide in exhaled air of children with cystic fibrosis during antibiotic treatment. Eur Respir J 2000; 16: 95-100. 97 Baldwin SR, Simon RH, Grum CM, Ketai LH, Boxer LA, Devall LJ. Oxidant activity in expired breath of patients with adult respiratory distress syndrome. Lancet 1986; 1: 11-14.

65

98 Montuschi P, Corradi M, Ciabattoni G, Nightingale J, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased 8-isoprostane, a marker of oxidative stress, in exhaled condensate of asthma patients. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: 216-220. 99 Baraldi E, Ghiro L, Piovan V, Carraro S, Ciabattoni G, Barnes PJ, Montuschi P. Increased exhaled 8-isoprostane in childhood asthma. Chest 2003; 124(1): 25-31. 100 Montuschi P, Collins JV, Ciabattoni G, Lazzeri N, Corradi M, Kharitonov SA, Barnes PJ. Exhaled 8-isoprostane as an in vivo biomarker of lung oxidative stress in patients with COPD and healthy smokers. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 1175-1177. 101 Isola N, Csoma Zs, Kharitonov SA, Wilson R, Barnes PJ. Exhaled 8-isoprostane, a marker of oxidative stress, is increased in patients with bronchiectasis. Eur Respir J 2001; 18: suppl 33: 248s, P1697. 102 Carpenter CT, Price PV, Christman BW. Exhaled breath condensate isoprostanes are elevated in patients with acute lung injury or ARDS. Chest 1998; 114: 16531659. 103 Montuschi P, Ciabattoni G, Paredi P, Pantelidis P, Du Bois RM, Kharitonov SA, Barnes PJ. 8-isoprostane as a biomarker of oxidative stress in interstitial lung diseases. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158: 1524-1527. 104 Montuschi P, Ciabattoni G, Koch P. Profile of prostanoids in exhaled breath condensate in childhood asthma. Eur Respir J 2003; 22: suppl 45: 400s, P2582. 105 Montuschi P, Kharitonov SA, Carpagnano E, Culpitt SV, Russell R, Collins JV, Barnes PJ. Exhaled prostaglandin E2: a new biomarker of airway inflammation in COPD [abstract]. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: A821. 106 Hanazawa T, Kharitonov SA, Oldfield W, Kay AB, Barnes PJ. Nitrotyrosine and cystenyl leukotrienes in breath condensates are increased after withdrawal of steroid treatment in patients with asthma [abstract]. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: A919. 107 Hanazawa T, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased nitrotyrosine in exhaled breath condensate of patients with asthma. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 12731276.

66

108 Biernacki WA, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased leukotriene B4 and 8isoprostane in exhaled breath condensate of patients with exacerbation of COPD. Thorax 2003; 58(4): 294-298. 109 Carpagnano GE, Kharitonov SA, Gramiccioni RO, Barnes PJ. Increased inflammarory markers in the exhaled breath condensate of cigarette smokers. Eur Respir J 2003; 21(4): 589-593. 110 Carpagnano GE, Barnes PJ, Geddes DM, Hodson ME, Kharitonov SA. Increased LTB4 and interleukin-6 in exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167(8): 1109-1112. 111 Cunningham S, McColm JR, Pei Ho L, Greening AP, Marshall TG. Measurement of inflammatory markers in the breath condensate of children with cystic fibrosis. Eur Respir J 2000; 15: 955-957. 112 Shahid SK, Kharitonov SA, Wilson NM, Bush A, Barnes PJ. Increased interleukin4 and decreased interferon-gamma in exhaled breath condensate of children with asthma. Am J Respir Crit Care Med 2002; 165:1290-1293. 113 Bucchioni E, Blasi F, Fasano V, Valenti V, SA Kharitonov, Barnes PJ. Increased TNF-α in breath condensate and in serum of COPD subjects. Eur Respir J 2003; 22: suppl 45: 448s, P2850. 114 Bucchioni E, Blasi F, Fasano V, Galbiati S, Cavallaro G, Allegra L. TNF-α in exhaled breath condensate and in serum of scleroderma patients. Eur Respir J 2003; 22: suppl 45: 448s, P2851. 115 Huszár É, Vass G, Vizi É, Csoma Zs, Barát E, Herjavecz I, Horváth I. Adenosine in exhaled breath condensate in healthy volunteers and in patients with asthma. Eur Respir J 2002;20:1393-1398. 116 Vass G, Huszár É, Barát E, Valyon M, Kiss D, Pénzes I, Augusztinovicz M, Horváth I. Comparison of nasal and oral inhalation during exhaled breath condensate collection. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167: 850-855. 117 Corradi M, Folesani G, Andreoli R, Manini P, Bodini A, Piacentini G, Carraro S, Zanconato S, Baraldi E. Aldehydes and glutathione in exhaled breath condensate of children with asthma exacerbation. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167(3): 395399.

67

118 Hunt J, Byrns RE, Ignarro LJ, Gaston B. Condensed expirate nitrite as a home marker for acute asthma. Lancet 1995; 346: 1235-1236. 119 Formanek W, Inci D, Lauener RP, Wildhaber JH, Frey U, Hall GL. Elevated nitrite in breath condensate of children with respiratory diseases. Eur Respir J 2002; 19(3): 487-491. 120 Ichinose M, Sugiura H, Yamagata S, Koarai A, Shirato K. Increase in reactive nitrogen species production in chronic obstructive pulmonary disease airways. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 701-706. 121 Chambers DC, Tunnicliffe WS, Ayres JG. Acute inhalation of cigarette smoke increases lower respiratory tract nitric oxide concentrations. Thorax 1998; 53: 677679. 122 Corradi M, Montuschi P, Donnelly LE, Pesci A, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased nitrosothiols in exhaled in breath condensate in inflammatory airway diseases. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163: 854-858. 123 Corradi M, Kharitonov SA, Donnelly LE, Montuschi P, Pesci A, Barnes PJ. Elevated levels of nitrosothiols in breath condensate of healthy smokers. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: A857. 124 Bálint B, Kharitonov SA, Hanazawa T, Donnelly LE, Shah PL, Hodson ME, Barnes PJ. Increased nitrotyrosine in exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Eur Respir J 2001; 17(6): 1201-1207. 125 Gibson PG, Henry RL, Thomas P. Noninvasive assessment of airway inflammation in children: induced sputum, exhaled nitric oxide, and breath condensate. Eur Respir J 2000; 16: 1008-1015. 126 Pizzichini E, Pizzichini NM, Kidney JC. Induced sputum, bronchoalveolar lavage and blood from mild asthmatics: inflammatory cells, lymphocyte subsets and soluble markers compared. Eur Respir J 1998; 11: 828-834. 127 Nightingale JA, Rogers DF, Barnes PJ. Effect of repeated sputum induction on cell counts in normal volunteers. Thorax 1998; 53: 87-90. 128 Kemp JP, Dockhorn RJ, Shapiro GG, Nguyen HH, Reiss TF, Seidenberg BC, Knorr B. Montelukast once daily inhibits exercise-induced bronchoconstriction in 6- to 14-year-old children with asthma. J Pediatr 1998; 133: 424-428.

68

129 Knorr B, Matz J, Bernstein JA, Nguyen H, Seidenberg B, Reiss TF, Becker A. Montelukast for chronic asthma in 6- to 14-year-old children. JAMA 1998; 279: 1181-1186. 130 Becker G, Winsel K, Beck E, Neubauer G, Stresemann E. Breath condensate as a method of noninvasive assessment of inflammatory mediators from the lower airways. Pneumology 1997; 51(2): 456-459. 131 Woolley KL, Gibson PG, Carty K, Wilson AJ, Twaddell SH. Eosinophils apoptosis and the resolution of airway inflammation in asthma. Am J Respir Crit Care Med 1996; 154: 237-243. 132 Oh JW, Lee HB, Kim CR, Yum MK, Koh YJ, Moon SJ, Kang JO, Park IK. Analysis of induced sputum to examine the effects of inhaled corticosteroid on airway inflammation in children with asthma. Ann Allergy Asthma Immunol 1999; 82: 491-496. 133 Cai Y, Carty K, Henry RL, Gibson PG. Persistence of sputum eosinophilia in children with controlled asthma when compared with healthy children. Eur Respir J 1998; 11: 848-853. 134 Laviolette M, Ferland C, Comtois JF, Champagne K, Bosse M, Boulet LP. Blood eosinophil leukotriene C4 production in asthma of different severities. Eur Respir J 1995; 8, 1465-1472. 135 Hood PP, Cotter TP, Costello JF, Sampson AP. Effect of intravenous corticosteroid on ex vivo leukotriene generation by blood leucocytes of normal and asthmatic patients. Thorax. 1999; 54: 1075-1082. 136 Kharitonov SA, Yates DH, Barnes PJ. Inhaled glucocorticoids decrease nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Am J Respir Crit Care Med 1996; 153: 454457. 137 Nelson BV, Sears S, Woods J. Expired nitric oxide as a marker for childhood asthma. J Pediatr 1997; 130: 423-427. 138 Piacentini GL, Bodini A, Costella S, Vicentini L, Mazzi P, Sperandio S, Boner AL. Exhaled nitric oxide and sputum eosinophil markers of inflammation in asthmatic children. Eur Respir J 1999; 13: 1386-1390.

69

139 Larfars G, Lantoine F, Devynck MA, Palmblad J, Gyllenhammar H. Activation nitric oxide release and oxidative metabolism by leukotrienes B4,C4 and D4 in human polymorphonuclear leukocytes. Blood 1999; 93: 1399-1405. 140 Deykin A, Belostotsky O, Hong C, Massaro AF, Craig ML. Exhaled nitric oxide following leukotriene E4 and methacholine inhalation in patients with asthma. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 1685-1689. 141 Lee E, Robertson T, Smith J, Kilfeather S. Leukotriene receptor antagonists and synthesis inhibitors reverse survival in eosinophils of asthmatic individuals. Am Respir Crit Care Med 2000; 161: 1881-1886. 142 Alam R. Chemokines in allergic inflammation. J Allergy Clin Immunol 1997; 99: 273-277. 143 E. Lee, Lindo T, Jackson N, Meng-Choong L, Reynolds P, Hill A, Haswell M, Jackson S, Kilfeather S. Reversal of human neutrophil survival by leukotriene B4 receptor blockade and 5-lipoxygenase activating protein inhibitors. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: 2079-2085. 144 Arm JP, Walport JJ, Lee TH. Expression of complement receptor type 1 (CR1) and type 3 (CR3) on circulating granulocytes in experimentally provoked asthma. J Allergy Clin Immunol 1989; 83: 649-655. 145 Mita H, Yui Y, Taniguchi N, Yasueda H, Shida T. Increased activity of 5lipoxygenase in polymorphonuclear leukocytes from asthmatic patients. Life Sci 1985; 37: 907-914. 146 Sustiel A, Joseph B, Rocklin RE, Borish L. Asthmatic patients have neutrophils that exhibit diminished responsiveness to adenosine. Am Rev Respir Dis 1989; 140: 1556-1561. 147 Cox G. Glucocorticoid treatment inhibits apoptosis in human neutrophils. J Immunol 1995; 154: 4719-4725. 148 Balter MS, Eschenbacher WL, Peters-Golden M. Arachidonic acid metabolism in cultured alveolar macrophages from normal, atopic, and asthmatic subjects. Am Rev Respir Dis 1988; 138: 1134-1142. 149 Gibson PG, Norzila MZ, Fakes K, Simpson J, Henry RL. Pattern of airway inflammation and its determinants in children with acute severe asthma. Pediatr Pulmonol 1999; 28: 261-270. 70

150 Yamaoka KA, Kolb J-P. Leukotriene B4 induces interleukin 5 generation from human T lymphocytes. Eur J Immunol 1993; 23: 2392-2398. 151 Frangova V, Sacco O, Silvestri M, Oddera S, Balbo A, Crimi E, Rossi GA. BAL neutrophilia in asthmatic patients. Chest. 1996; 110: 1236-1242. 152 Loukides S, Kharitonov SA, Wodehouse T, Cole PJ, Barnes PJ. Effect of arginine on mucociliary function in primary ciliary dyskinesia. Lancet 1998; 352 (9125): 371-372. 153 Grasemann H, Gärtig SS, Wiesermann HG, Teschler H, Konietzko N, Ratjen F. Effect of L-arginine infusion on airway NO in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia syndrome. Eur Respir J 1999; 13: 114-118. 154 Lundberg JON, Nordvall SL, Weitzberg E, Kollberg H, Alving K. Exhaled nitric oxide in paediatric asthma and cystic fibrosis. Arch Dis Child 1996; 75: 323-326. 155 Ho LP, Innes JA, Greening AP. Nitrite levels in breath condensate of patients with cystic fibrosis is elevated in contrast to exhaled nitric oxide. Thorax 1998; 53: 680684. 156 Linnane SJ, Keating VM, Costello CM. Total sputum nitrate plus nitrite is raised during acute pulmonary infection in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 1998; 53: 680-684. 157 Grasemann H, Gaston B, Fang K. Decreased levels if nitrosothiols in the lower airway of patients with cystic fibrosis and normal pulmonary function. J Pediatr 1999; 135: 770-772. 158 Van Dalen CJ, Winterbourn CC, Senthilmohan R. Nitrite as a substrate and inhibitor of myeloperoxidase: implication for nitration and hypochlorous acid production at sites of inflammation. J Biol Chem 2000; 275: 11638-11644. 159 Jones KL, Bryan TYW, Jinkins PA, Simpson KL, Grisham MB, Owens MW, Milligan SA, Markewitz BA, Robbins RA. Superoxide released from neutrophils causes a reduction in nitric oxide gas. Am J Physiol 1998; 275: L1120-1126. 160 Jones KL, Hegab AH, Hillman BC, Simpson KL, Jinkins PA, Grisham MB, Owens MW, Sato E, Robbins RA. Elevation of nitrotyrosine and nitrate concentration in cyctic fibrosis sputum. Pediatr Pulmonol 2000; 30: 79-85.

71

161 Ji X. Hollocher TC. Reduction of nitrite to nitric oxide by enteric bacteria. Biochem Biophys Res Commun 1988; 275: L1120-L1126. 162 Murphy P, Sharp A, Shin J. Suppressive effects of ansamycins on inducible nitric oxide synthase expression and development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Res 2002; 67: 461-470. 163 Cole P. Pathophysiology and treatment of airway mucociliary clearance: a moving tale. Minerva Anaestesiol 2001; 67: 206-209. 164 Wilson NM, Bridge P, Spanevello A, Silverman M. Induced sputum in children: feasibility, repeatability, and relation of finding to asthma severity. Thorax 2000; 55(9): 768-774. 165 Horváth I, Barnes PJ. Exhaled monoxides in asymptomatic atopic subjects. Clin Exp Allergy 1999; 29: 1276-1280. 166 van Den Toorn LM, Prins JB, Overbeek SE, Hoogsteden HC, de Jongste JC. Adolescents in clinical remission of atopic asthma have elevated exhaled nitric oxide levels and bronchial hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 953-957. 167 Jatakanon A, Kharitonov SA, Lim S, Barnes PJ. Effect of differing doses of inhaled budesonide on markers of airway inflammation in patients with mild asthma. Thorax 1999; 54: 108-114.

72

10

Saját publikációk jegyzéke

Az értekezés témájában megjelent közlemények 1. Csoma Zs, Kharitonov SA, Balint B, Bush A, Wilson NM, Barnes PJ. Increased leukotriene in exhaled breath condensate in childhood asthma. Am J Respir Crit Care Med 2002; 166 (10):1345-1349. 2. Csoma Zs, Kharitonov SA, Donnelly LE, Balint B, Bush A, Wilson NM, Barnes PJ. Nitrogen oxide metabolites are not reduced in exhaled breath condensate of patients with primary ciliary dyskinesia. Chest 2003; 124: 633-638.

Az értekezésben fel nem használt közlemények 1. Vizi É, Huszár É, Csoma Zs, Böszörményi-Nagy Gy, Baráth E, Horváth I, Herjavecz I, Kollai M. Plasma adenosine concentration increases during exercise: a possible contributing factor in exercise-induced bronchoconstriction is asthma. J Allergy Clin Immunol. 2002; 109 (3): 446-448. 2. Huszár É, Vass G, Vizi É, Csoma Zs, Barát E, Molnár Világos Gy, Herjavecz I, Horváth I. Adenosine in exhaled breath condensate in healthy volunteers and in patients with asthma. Eur Respir J 2002; 20: 1393-1398.

Az értekezés témájával kapcsolatos előadáskivonatok 1. Csoma Zs, Kharitonov SA, Shahid SK, Balint B, Wilson NM, Bush A, Barnes PJ. Leukotrienes in exhaled breath condensate of children with asthma. Eur Respir J 2001; 18: Suppl 33: 39s, P358. 2. Csoma Zs, Kharitonov SA, Shahid SK, Donnelly LE, Balint B, Wilson NM, Bush A, Barnes PJ. Nitric oxide metabolites in exhaled breath condensate of children with primary ciliary dyskinesia. Eur Respir J 2001; 18: Suppl 33: 180s, P1276. 3. Shahid SK, Kharitonov SA, Csoma Zs, Bush A, Wilson NM, Barnes PJ. Reproducibility of cysteinyl-leukotriene measurements in exhaled breath condensate in children. Eur. Respir. J. 2001; 18: Suppl 33: 39s, P356.

73

Az értekezésben fel nem használt előadáskivonatok 1. Csoma Zs, Radics K, Herjavecz I, Horváth I. Exhaled carbon monoxide and nitric oxide in insect byte-induced allergy. Eur Respir J 1999; 14: Suppl 30: 170s, P1207. 2. Csoma Zs, Kharitonov SA, Balint B, Wilson NM, Bush A, Barnes PJ. 3nitrotyrosine levels in exhaled breath condensate in childhood asthma. Am J Respir Crit Care Med 2001; P711. 3. Csoma Zs, Kharitonov SA, Shahid SK, Balint B, Wilson NM, Bush A, Barnes PJ. Eicosanoids in exhaled breath condensate of children with primary ciliary dyskinesia. Eur Respir J 2001; 18: Suppl 33: 180s, P1277. 4. Shahid SK, Kharitonov SA, Csoma Zs, Bush A, Wilson NM, Barnes PJ. Exhaled 8isoprostane as a marker of airway inflammation in asthmatic children. Eur Respir J 2001; 18: Suppl 33: 39s, P357. 5. Bucchioni E, Kharitonov SA, Csoma Zs, Barnes PJ. Exhaled histamine is reduced following methacholine challenge in patients with asthma. Eur Respir J 2001; 18: Suppl 33: 165s, P1111. 6. Isola N, Kharitonov SA, Csoma Zs, Wilson R, Barnes PJ. Exhaled 8-isoprostane, a marker of oxidative stress is increased in patients with bronchiectasis. Eur Respir J 2001; 18: Suppl 33: 248s, P1697. 7. Bucchioni E, Kharitonov SA, Csoma Zs, Allegra L, Chung KF, Barnes PJ. Effect of methocholine and adenosine 5-monophosphate (AMP) challenge on the levels of histamine and cysteinyl-leukotrienes in exhaled breath condensate. Am J Respir Crit Care Med 2002; J13. 8. Bucchioni E, Csoma Zs, Polkey M, Collins JV, Cramer D, Allegra L, Barnes PJ, Kharitonov SA. Adenosine 5-triphosphate (ATP) is increased in exhaled breath condensate in COPD. Am J Respir Crit Care Med 2002; C116. 9. Csoma Zs, Vizi É, Huszár É. Post-exercise changes in FEV1 values and in adenosine concentrations in exhaled breath condensate in healthy subjects and patients with exercise-induced asthma. Eur Respir J 2002; 20: Suppl 38: 290s, P1838.

74

10. Huszár É, Vass G, Vizi É, Csoma Zs, Barát E, Herjavecz I, Horváth I. Measurement of adenosine in exhaled breath condensate in healthy volunteers and patients with asthma. Eur Respir J 2002; 20: Suppl 38: 423s, P2693.

75

11.

Összefoglalás

I. A vizsgálatban bizonyítottuk, hogy a cisz-LT magasabb koncentrációban van jelen a kilégzett levegő kondenzátumban az inhalációs szteroiddal kezelt enyhe és középsúlyossúlyos perzisztáló asztmás betegekben, míg enyhe intermittáló asztmában a mediátorok mennyiségében szignifikáns eltérés nem észlelhető az egészségesekkel összehasonlítva. Ezek az eredmények alátámasztják cisz-LT krónikus légúti gyulladásban betöltött szerepét, amely főként a súlyosabb, rendszeres preventív kezelést igénylő esetekben érvényesül és nagy adag inhalációs szteroid kezelés mellett is megfigyelhető. Az LTB4 asztma patomechanizmusában betöltött szerepéről kevés adat áll rendelkezésre. A vizsgálat eredményei alapján az LTB4 szerepet játszhat az enyhe és középsúlyos-súlyos perzisztáló asztmás betegek légúti gyulladásos folyamataiban. Felmerül annak a lehetősége is, hogy az asztma kezelésben jelenleg alapvető inhalációs szteroid kezelés azon túl, hogy csökkenti a gyulladásos folyamatok intenzitását, azok jellegét is befolyásolja és a neutrofilek, valamint az LTB4 jelentőségét erősíti. A vizsgálat eredményei alátámasztják azt a korábbi megfigyelést, hogy a kilégzett NO valószínűleg nem ad képet az asztmás betegek légútjaiban zajló gyulladásos folyamatok teljes spektrumáról. Az eredmények alapján az is megállapítható, hogy az asztmás betegek követésénél hagyományosan alkalmazott módszerek, mint a tünetek értékelése, fizikális vizsgálat, légzésfunkció nem minden esetben tükrözik megfelelően a légutakban zajló gyulladásos folyamatok intenzitását. II. A vizsgálat eredményei igazolták, hogy a szignifikánsan alacsonyabb kilégzett NO értékek ellenére az NO metabolitjainak koncentrációja PCD-ben nem tér el az egészségesekétől. Ennek megfelelően az alacsonyabb kilégzett NO értékek hátterében a NOS működésének defektusa mellett a fokozott NO metabolizmus szerepe is feltételezhető. Hatásos NOS inhibitorok és NO donorok alkalmazása, valamint az NO biokémiájának nem invazív módszerekkel történő további vizsgálatai tisztázhatják a NOS és az NO szerepét a betegség patomechanizmusában és új terápiás lehetőségek bevezetéséhez vezethet. PCD-ben a kilégzett és nazalis NO az egészségesekénél alacsonyabb és ez a csökkenés olyan mértékű, amely más betegségben nem fordul elő. Ennek megfelelően a kilégzett

76

és nazalis NO meghatározása alkalmas lehet a PCD-s eseteknek a visszatérő légúti infekciók miatt vizsgált betegcsoportból történő kiemelésére. Ezt követően, amennyiben a szükséges kiegészítő vizsgálatok a PCD diagnózisát megerősítik rendszeres kezeléssel,

pulmonológiai

és

fül-orr-gégészeti

károsodások kialakulása megelőzhető.

77

ellenőrzéssel

az

irreverzibilis

12.

Summary

I, Our results reflect that the levels of cys-LT are elevated in exhaled breath condensate collected from asthmatic patients with mild and moderate-to severe persistent disease treated with inhaled steroid. There was no significant increase in the levels of cys-LT in mild intermittent asthma. These results support the role of cys-LT in chronic airway inflammation in pediatric asthma, especially in more severe disease which require regular and in some cases high dose antiinflammatory therapy. The role for LTB4 in the pathomechanism of asthma is less known. According to our results LTB4 may be supposed to take part in the airway inflammation in patients with mild and moderate to severe asthma. Steroids decrease the intensity of airway inflammation in asthma and may also influence its composition enhancing the role of neutrophils and LTB4. Our results supported the previous finding that exhaled NO may not reflect the total scale of inflammatory processes in asthma. Symptoms, physical examination and lung function used in daily routine for controlling asthmatic patients do not always provide appropiate information about intensity of airway inflammation. II. Our results demonstrated that NO metabolites in exhaled breath condensate are not decreased in PCD compared to healthy control subjects despite the lower levels of exhaled NO. On the basis of these findings it may be speculated that defects of NOS activity and increased NO metabolism may take place in PCD leading to decreased exhaled NO levels. Studies with potent NOS inhibitors and NO donors and further investigation of NO biochemistry in the airways using non-invasive methods may make clear the role of NOS and NO in the pathomechanisms of PCD and may also lead to discover new possibilities in the therapy of this disease. Such a low levels of exhaled and nasal NO are not seen in patients with any other conditions. The measurement of exhaled and nasal NO might be used as a screening procedure to detect PCD among patients with recurrent chest infection. The diagnosis of PCD would then be confirmed by specific diagnostic tests. Regular treatment and controls by pulmonologists and ear-nose-throat specialists may prevent irreversible damage of upper and lower airways.

78