KROMATOGRAFI PARTISI Definisi : Teknik kromatografi berdasarkan partisi komponen/solut antara fase diam cairan pada permukaan penyangga padat dengan fase gerak Fase diam tidak saling campur dengan fase gerak Komponen terpisah karena masing-masing memiliki koefisien partisi yang berbeda
KROMATOGRAFI PARTISI Fasa diam: Cairan yang melapisi partikel penyangga
Penyangga: kieselguhr, selulosa, silika gel , alumina C8, C18 Fasa gerak: Cairan yang tidak dapat campur dengan fasa diam tidak dapat teradsorpsi pada penyangga fasa diam Sampel: Berbeda kelarutannya dalam fasa diam Komponen yang lebih besar kelarutannya dalam fasa diam tertahan lebih lama Koefisien partisi (Kd) = [X]A/[X]B ● Nisbah konsentrasi zat terlarut dalam dua pelarut yang tidak saling campur, pada saat kesetimbangan ● Berubah bila suhu berubah
konsentrasi zat terlarut dalam fasa diam koefisien partisi = --------------------------------------------------konsentrasi zat terlarut dalam fase gerak
Bila suatu zat mempunyai Kd = 5 diperlukan fasa gerak sebesar 5x volume kolom untuk mengelusi seluruh senyawa keluar dari kolom
Volume kolom dibuat sekecil mungkin sesuai dengan yang benar-benar dibutuhkan untuk pemisahan komponen Semakin sedikit fase gerak yang diperlukan, semakin sedikit pelarut yang harus diuapkan; proses pemekatan semakin cepat
Ilustrasi mekanisme partisi (pemisahan ) dalam kolom, Koefisien Partisi dan Teori Pelat P A+ P
P A B
P
B+P
P
Analat mengandung A (Kd=1) dan B (Kd=0,67), fasa mobil P
P
Jika masing-masing ada 1000 molekul, ada fase gerak masing-masing terpartisi Asumsi : Vd =Vg A : 500 pada fasa diam, 500 pada fasagerak B: 400 pada fasa diam, 600 pada fase gerak Elusi lebih lanjut(tambahan fasa gerak segar) Zat terpartisi lebih lanjut Seluruh zat A maupun B terelusi terpisah
A250-250 (fd-fg) B: 160-240 dan 240-360 (fd-fg)
Kromatografi partisi fasa normal Fasa diam: hidrofilik Fasa gerak : hidrofobik Pasangan fasa diam dan fasa gerak: daya saling melarutkan kecil Kromatografi partisi fasa terbalik Fasa diam: hidrofobik
Fasa gerak : hidrofilik Pemisahan ion-ion logam
II
I
1 2 3 4 5
Solut A (nilai (Kd=1) terdistribusi dalam fase diam (kolom I) dan fase gerak (kolom II)
A =1 A= 0,5 0.5
0.25 0.25 0.25
0.25
0.125
0.125 0.25 0.25
0.125 0.125
Soal : Berapa fraksi A pada saat fase gerak “mengisi “ pelat no 4 Berapa untuk solut B bila Kd B = 0.6
Perkembangan dalam kolom saat dua analit dipisahkan
Konsentrasi analit pada berbagai jarak dari titik injeksi
Kolom partisi • Fase diam dan fase gerak merupakan zat cair • Pada kolom partisi umumnya suatu pelarut tidak campur air diadsorpsi pada suatu padatan inert, sebagai cairan fasa diam • Larutan analit ditempatkan pada bagian atas kolom, kemudian dicuci dengan pelarut kedua hingga analit keluar dari kolom • Pelarut kedua= fase gerak = eluen =bisa berupa campuran pelarut mungkin juga yang mengandung bufer
KROMATOGRAFI ADSORPSI MK KROMATOGRAFI I D3 ANALISIS KIMIA kuliah minggu ke 8
KROMATOGRAFI ADSORPSI ♦ Jenis dan sifat adsorbent ♦ Jenis dan sifat eluen ♦ Kelakuan kromatografi zat
♦ Reaksi samping pada kromatografi ♦ Kromatografi adsorpsi berbagai zat
Adsorbent • Sifat : 1. Polaritas relatif : Kekuatan untuk mengadsorpsi spesies tertentu. 2. Kapasitas adsorpsi : jumlah gr solut yang dapat diadsorpsi per gr adsorbent
1.Polaritas adsorbent polar tertentu (untuk mengadsorpsi gugus polar) -COOH > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > =C=O > -COOR > -OCH3 > -CH=CHUntuk Arang (charcoal)?
2. Kapasitas adsorpsi Diuji dengan pewarna → jenuh Arang aktif > silika gel > alumina asam > alumina basa > Cr2O3 > ZnS > Al2O3 > CaF2 > CaO
Penggolongan adsorben ~ Kapasitas adsorpsi meningkat
Lemah Sukrosa Pati Inulin Talc Na2CO3
Medium CaCO3 Ca3(PO4)2 Mg3(PO4)2
Kuat Mg Silikat aktif Alumina aktif Arang aktif Mg Oksida aktif
Hesse: Charcoal > silika gel > floridin > alumina asam > alumina basa > Cr2O3 > ZnS > Al2O3 > CaF2 > CaO
Adsorbent Anorganik • Alumina Al2O3 - Kehalusan partikel ±7µ - Biasa tercampur dgn Na karbonat & Nabikarbonat Δ
Na aluminat
Na+ dapat ditukar dengan kation
Alumina basa
- Dicuci dgn asam HCl Cl- dapat ditukar dengan anion
Bauksit Al2(OH)4
Alumina asam
Pemisahan hidrolisit chitin gula
• Magnesia MgO
Pengganti alumina
Magnesium silikat
Kalsium hidroksida
Kalsium karbonat
Xantophyl, pigmen lain
Dikalsium fosfat
karoten
Trikalsium fosfat
enzim
Kalsium oksalat
Zinc karbonat
Silika gel
Gula, steroid karotenoid
antraquinon karotenoid Sterol, asam lemak, gliserida, karbohidrat, asam amino
Adsorbent Organik Digunakan untuk pemisahan zat hidrofilik (asam amino, asam nukleat, gula
●Selulosa & turunannya: Senyawa aromatik , pemanis, asam ketokarboksilat, antrakuinon ●Pati ● Sukrosa ● Manitol
● Dekstran
Adsorbent Spesifik • Silika gel dengan lubang pori spesifik Silika gel + zat (misal : metil orange) • Kolom urea
Asam lemak rantai lurus → adsorpsi
Asam lemak bercabang → lewat • Kolom histon
DNA teradsorpsi, RNA tidak
• Kolom selulosa + azofenols
enzim
ELUEN Daya elusi ≈ adsorben
Adsorben polar asam/basa > asam organik > piridin > air > metanol > etanol > propanol > aseton > dikloroetana > etil asetat > kloroform; dietil eter > diklorometana > benzena; toluena > karbon tetraklorida > sikloheksana > heksana > petroleum eter
Kemurnian eluen Pengotor dalam eluen
Elusi terganggu
●Pelarut organik : Kering; redestilasi ●Pelarut yang mengandung peroksida: Pada kolom alumina, peroksida tertahan Fungsi fasa diam terganggu ●Pelarut berhalogen : Bila ada Na2CO3 /K2CO3 terbentuk HCl bebas
Kelakuan kromatografi zat Proses kromatografi: Interaksi fasa diam-zat-fasa gerak
Sifat adsorben (fasa diam), sifat zat, dan sifat eluen berpengaruh Posisi pita zat (pada kromatografi kolom)/spot (pada KLT) bervariasi
Sifat Adsorbent dan Struktur Kimia Zat yang diadsorpsi Strain(1948): karotenoid Posisi karotenoid pada kolom sukrosa, celite, magnesia sukrosa
celite
magnesia
Zeaksantin
Zeaksantin
Rhodoksantin
Lutein
Lutein
Lycopene
Cryptoksantin
Cryptoksantin
Zeaksantin
Rhodoksantin
Rhodoksantin
Lutein
Lycopene
Lycopen
Cryptoksantin
β-carotene
β-carotene
β-carotene
α-carotene
α-carotene
α-carotene
…. β-karotena
α -karotena
…….. Likopena OH
Zeaksantin OH
OH
OH
Rubiksantin
OH
OH
Lutein
Sukrosa: afinitas terhadap OH- > ikt ganda berkonjugasi Kriptoksantin (1 OH) teradsorpsi lebih kuat daripada lycopene (+ 2 ikatan ganda) dan rodhoksantin ( + 2 CO + 1 ikatan ganda) Magnesia: afinitas terhadap OH- < ikt ganda berkonjugasi
α dan β-carotene (Δ posisi 1=) Zeaksantin dan lutein (Δ posisi 1=)
terpisah
Lycopene(13=) teradsorpsi lebih kuat daripada zeaksantin (11= , 2OH)
celite
sukrosa
magnesia
Susunan Kimia dan Kromatografi Kromatografi dengan media anorganik ~ adsorpsi Daya untuk diadsorpsi : ~ ikatan ganda gugus OH ∑ Ikatan ganda ↑ ∑ OH ↑
Adsorptivitas ↑
aldehid dan keton < alkohol hidrokarbon < ester < keton/aldehid
Gugus fungsi
adsorbabilitas ↑
asam dan basa > alkohol, tiol > aldehid, keton > zat berhalogen, ester > hidrokarbon tak jenuh > hidrokarbon jenuh
R-COOH R-CONH2 R-OH R-NH2 R-NH-Ac R-O-Ac R-COOCH3 R-N(CH3)2R-O-B2 R-NO2 R-O-CH3 R-H
Subtituen: Halogen < nitro < arilamino < alkilamino < amino
H O
2
H H
O
CH3
6 O
CH3
H
CH3
O
CH3
5 O
4
O
O
HO
H3C
O
O H O
CH3
O
CH3
O
3 O
1
O
O
O
O
O
hidroksimetilantraquinon Kekuatan adsorpsi 1<2; 3<4; 5<6
Zat manakah yang lebih kuat teradsorbsi pada silika: 2-nitroresorsinol dan m/p-nitrofenol 2-hidroksiantraquinon dan 1,4,5,8-tetrakudroksiantraquinon
CH3
Posisi Relatif Zona pada Kolom • ~ adsorpsi ~ struktur kimia sifat adsorbent sifat eluen/solvent
1 2 3 4
• Efek solven → jenis celite sukrosa
petroleum/benzena klorofil b, neoksantin p/b + 25% aseton neoksantin, klorofil b 1,2-dikloroetana
fukoksantin, violaksantin
petroleum + 0,5% metanol
violaksantin, fukoksantin
Posisi zona pada kolom
• Efek impuritis
Sedikit alkohol dalam solvent sukrosa
petroleum
klorofil a, fukoksantin
petroleum + 0,5% amil alkohol fukoksantin, klorofil a
• Efek pH → senyawa polar
selulosa
amonia fluorosein, bromofenol biru asam/netral bromofenol biru, fluoroseein
• Efek konsentrasi konsentrasi ↑
kecepatan gerak ↑
• Efek suhu sukrosa
95O C
klorofil a, lutein
20O C
lutein, klorofil a
Reaksi Sekunder karena Adsorbent • Alumina Yang berisi alkali bebas reaksi sekunder Saponifikasi Auto oksidasi Deasetilasi Destruksi Dekomposisi Hidrasi Transformasi Isomerasi
gliserida asam lemak gula vitamin A,K insektisida rotenon porifin monosiklik keton bisiklik keton 10-nitroantron → 10-nitroantanol
Reaksi Sekunder
• Silika Isomerasi
terpen hidrokarbon monogliserida sterol
• Charcoal Aminolisis
asam amino
Oksidasi asam amino Dekomposisi
► PENGERTIAN ►SARINGAN MOLEKUL DAN JENISNYA
►ELUEN DAN SISTEM ELUSI ► APLIKASI KROMATOGRAFI EKSLUSI
PENGERTIAN Kromatografi ekslusi/filtrasi/permeasi Pemisahan molekul pada Kromatografi cairan berdasarkan perbedaan ukuran , bentuk molekul
Sampel Molekul kecilr
Molekul besar
Bila terlalu besar, tidak masuk ke pori eksklusi
awal
elusi
Ekslusi Ditolaknya partikel karena ukurannya lebih besar dari pori sehingga tidak masuk pori
Limit ekslusi Batas ukuran molekul terbesar yang dapat dipisahkan pori gel filtrasi, (ukuran yang lebih besar serentak ke luar kolom) Limit inkslusi Batas ukuran molekul terkecil yang dapat dipisahkan pori gel filtrasi, (ukuran yang lebih kecil dielusi serentak ke kuar kolom)
♦ Sephadex lipofilik
○ Sephadex LH-20 dan LE-60 ○ Bila diperlukan pelarut organik ○ Fasa gerak: digunakan untuk sistem buffer aq, pelarut organik polar, campuran pelarut aq. ○ Fraksinasi lipid, steroid, asam lemak, hormon, vitamin
MEDIA GEL FILTRASI/SARINGAN MOLEKUL ● Sephadex ♦ Cross linking (CL) dextran-epiklorohidrin CL
Nomor G Swelling ♦ Swelling (penggembungan) dipengaruhi oleh: Derajat CL, Kekuatan ion, Jumlah bahan organik modifier pH, ♦ Aplikasi: protein, peptida, asam nukleat, polisakarida ♦ Kestabilan pada pH tertentu G-10 sp G-25 stabil pada pH 2-13 G-50 sp G-200 satabil pada pH 2-10 ♦ Fasa gerak: larutan garam aq
dekstran
Ephichlorohydrin 1kloro,2,3 ephoxypropana
● Sephacryl ♦ Dextran alil dan N,N'-metilena-bis-akrilamida ♦ Tersedia dalam bentuk pre-swollen ♦ Fasa gerak: mengandung pelarut organik, surfaktan mis 1%SDS, urea 8M, guanidin hidroklorida 6M ♦ sepachryl S-400 dan S-500: pemisahan polisakarida dan makromolekul lain
♦ Sepachryl S-1000: pemisahan fragmen restriksi DNA, polisakarida sangat besar, proteoglikan
● Superdex ♦ agarosa dan dextran ♦ Fraksinasi protein dengan laju alir tinggi
● Biogel ♦ Biogel A: CL agarosa ♦ Biogel B: CL poliakrilamida
Kisaran Bobot molekul
Sephadex
globular
Kisaran Bobot molekul
linier
globular
linier
G-10
<700
<700
Sepharosa
G-15
<1500
<1500
6B/CL-6B
104 – 4x106
104 – 1x106
1000-5000
100-5000
4B/Cl-4B
6x104 – 2x107
3x104 – 5x106
2B/CL-2B
7x104 - 4x107
10x104 2x107
S-200 Spfn
5000– 25x104
1000-8x104
Medium
S-300 Spfn
10000-1.5x106
2000-4x105
Fine
S-400 Spfn
20000-8x106
10000-2x106
Superfine
S-500 Spfn
40000-2x107
S-1000 Spfn
5x105->108
G-25
Coarse Medium Fine
Superfine G-50
Coarse
G-75
Sephacryl 1500-30000
3000-80000 Superfine
G-100
G-150
G-200
1000-150000
5000-150000 5000-600000
Superfine
1000-100000
4000-100000 5000-300000
Superfine
1000-50000
3000-70000 4000-150000
Superfine
500-10000
5000-250000
1000-200000
• Gel dengan kemampuan memisahkan pada kisaran BM lebih rendah akan memiliki nomor G lebih kecil untuk sephadex sementara untuk sephacryl akan memiliki nomor S lebih tinggi (benar atau salah) • Kisaran BM pemisahan molekul untuk suatu tipe gel tertentu lebih besar untuk molekul globular dibandingkan molekul linier (benar atau salah) Soal era create
Sephadex ● Ukuran partikel
40-120 μm (G-10, G-15, G75-200 bukan superfine) 100-300 μm (coarse), 50-150 μm (medium), 20-80 μm (fine) dan 10-40 μm (superfine) Coarse Medium Fine Superfine
Untuk filtrasi yang perlu laju alir cepat pada tekanan rendah
Untuk tujuan preparatif Untuk kolom dengan resolusi tinggi dan KLT
● Stabilitas kimia sephadex ○ tidak larut dalam semua pelarut (kecuali telah terdegradasi) ○ Stabil dalam air, larutan garam, pelarut organik, larutan basa dan asam lemah.
○ Pada larutan asam kuat, ikatan glikosida pada matrix gel terhidrolisis ○ Tidak berubah sifat dalam HCl 0,1 M selama 1-2 jam, dan dalam HCl 0,02M selama 6 bulan. ○ pereaksi yang bersifat oksidator merusak struktur gel
● Stabilitas fisika sephadex ○ dapat disterilisasi, 30 menit, 120oC. Pemanasan dengan T>1200C sephadex rusak membentuk karamel ○ Derajat ikatan silang tinggi (G-10 dan G-15), kaku, hanya untuk laju alir rendah ○ Derajat ikatan silang rendah (G-200 & G-150) dapat dipadatkan
● Sifat kromatografis sephadex ○ selektivitas Tiap tipe G punya batas kisaran BM berbeda ▪ Molekul dengan BM>limit ekslusi tertinggi, tidak ditahan, keluar lebih dulu ▪ Molekul kecil masuk ke pori gel, ditahan dan keluar lebih dulu yang berukuran besar ▪ Molekul-molekul < limit eksklusi terkecil,
masuk ke pori gel, ditahan sangat lama dan keluar paling akhir tanpa pemisahan jelas
○ Penyimpangan sifat • Molekul kecil pada G dengan ikatan silang tinggi (G-10 & G-15) mengalami penyimpangan elusi, tidak selalu seperti aturan elusi
•Ada interaksi ionik dan interaksi aromatik Senyawa aromatik berinteraksi dengan sephadex & terelusi paling akhir (Interaksi bertambah bila pelarutnya metanol dan etanol)
Gugus karboksil pada sephadex ; interaksi dengan contoh bermuatan Zat bermuatan positif ditahan, negatif keluar (tidak ditahan)
Diatur dengan mengubah kekuatan ionik dan pH, dapat dihilangkan dg pelarut fenol-asam asetatair & urea 8M
Dihilangkan dengan pelarut berkekuatan ionik tinggi (>0,02M)
APLIKASI KROMATOGRAFI EKSKLUSI ● Analisis campuran molekul dengan BM berbeda ○ Pemisahan rafinosa, maltosa, glukosa, menggunakan
sphadex, pH 7 laju alir 5 ml/menit, eluen H2O ○ Pemisahan berbagai protein/enzim
○ Pemisahan asam nukleat dari nukleotida
● Desalting ○ Pembebasan garam dan senyawa berBM rendah dari
molekul makro
● Penentuan Bobot molekul ○ Bobot molekul protein, dextran, etilenaglikol
sukrosa
250 3,0
230 2,5
190 170
2,0
150 130
1,5
110 90 Blue dextran
70 104
105 Bobot molekul
106
Gambar: volume eluesi sebagai fungsi dari bobot molekul protein pada sephedex G-200, pH 7,5
1,0
Ve/V0
Volume elusi (mL)
210
Kurva kalibrasi untuk penetapan bobot molekul pada kromatografi ekslusi
Preparasi Kolom Filtrasi Gel ● Sephacryl, superdex, superosa, sepharosa Preswollen tapi mengandung etanol20% sebagai pengawet Perlu dilarutkan dalam eluen sebelum dimasukkan ke kolom ● Sephadex, Bio-Gel-P
Harus digembungkan/dikembangkan dulu dengan eluen dalam waktu tertentu
Jenis gel
Volume pack (ml/g ±10%
Waktu hidrasi (jam) 20oC
100oC
Sephadex G10
2-3
3
1
Sephadex G15
2,5-3,5
3
1
Sephadex G25
4-6
6
2
Sephadex G50
9-11
6
2
Sephadex G75
12-15
24
3
Sephadex G100
15-20
28
5
Sephadex G150
18-20*; 20-30
72
5
Sephadex 200
20-25*; 30-40
75
5
Bio-GelP-2
3
4
Bio-Gel P-4
4
4
Bio-Gel P-6
6,5
4
Bio-Gel P-10
7,5
4
Bio-Gel P-30
9
4
Bio-Gel P-60
11
4
Bio-Gel P-100
12
4
Saringan Molekul Anorganik: Zeolit Struktur Zeolit: ○Molekul tetrahedral yang bergabung, ada rongga rongga besar yang dihubungkan oleh saluran kecil.
○Penampang lintang saluran kecil menentukan ukuran molekul yang dapat masuk ke rongga ○ Ukuran & posisi ion logam (mis Na, Ca) dalam kristal zeolit & jaringan rangka tetrahedral alumina silikat zeolit, menentukan diameter efektif saluran kecil
○Tipe zeolit ◊ tipe saringan molekular 4A: [Na12(AlO2)12(SiO2)12 molekul <4A spt H2O, CO2, H2S, SO2 dan hk 2C masuk ke rongga ◊ tipe saringan molekular 5A: 4A yang punya K & Ca sbg pengganti Na) Etana, alkohol 4C, nasuk rongga Siklopropana , senyawa aromatik tidak masuk rongga
◊ tipe 10X dan 13X: Na8(AlO2)80(SiO2)106
Soal kromatografi Ekslusi • Waktu hidrasi dipengaruhi oleh suhu saat hidrasi dilakukan, makin tinggi suhu makin lama waktu yang diperlukan (benar atau salah) • Bila ingin membuat kolom Sephadex G25 dengan ketinggian 15 cm pada kolom gelas dengan diameter 1,5 (a) berapa gram sephadex yang dibutuhkan • Jawab : volume = luas diameter x tinggi kolom = R2 = 3.14 x 0.75 cm x 0.75 cm x 15 cm = 26.5 ml ; volume paking 4-6 ml/g untuk menghasilkan 26,5 ml gel jadi diperlukan = 26,5 ml x 1 gram resin kering/4-6 ml = 4.4-6,6 gram • (b) berapa jumlah tersebut bila diameter kolom 3 cm Soal era create
Soal Polifinil standar dengan berbagai bobot molekul dianalisis melalui kromatografi ekslusi mengasilkan data sebagaimana pada tabel Suatu sampel yang mengadung polyfinil dianalisis dan menghasilkan volume retensi sebesar 8.45 Perkirakan bobot molekul sampel
Soal penetapan bobot molekul dengan kromatografi ekslusi • Suatu kolom sephadex G-70 dengan dimensi 25 x 35 cm2 memberikan hasil sebagai Tabel berikut : • Tentukan bobot molekul suatu zat yang terelusi dengan volume eluen 76.5 ml
protein
Mr
Ribonuklease 13.700
Volume eluen (ml) 109.5
Aldolase
158.000 55.0
Blue dextran
2 x 107
Ovalbumin
4.7 x103 71.8
53.1
Pemisahan protein dengan kromatografi ekslusi
protein
Mr
Volume eluen (ml)
Ribonuklease
13.700
109.5
Aldolase
158.000
55.0
Blue dextran
2 x 107
53.1
Ovalbumin
4.7 x 103
71.8
KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION PERTEMUAN MINGGU 12,13 14 D3 KIMIA 2009
KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION • • • • •
PRINSIP BAHAN PENUKAR ION PEMILIHAN PENUKAR ION REGENERASI PENUKAR ION PEMBUATAN KOLOM PENUKAR ION DAN APLIKASI SAMPEL • PEMISAHAN SENYAWA BM RENDAH • PEMISAHAN SENYAWA BM TINGGI • KROMATOGRAFI PERTUKARAN LIGAN
PRINSIP KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION • Pemisahan molekul bermuatan berdasarkan kesetimbangan antar ion immobil dan ion mobil dengan muatan berlawanan • Ion immobil berikatan kovalen dengan matrik polimer fasa diam; • counter ion – menetralkan ion immobil – dapat dipertukarkan dengan ion bermuatan sejenis • Penukar kation : ion immobil – /counter ion + • Penukar anion : ion immobil +/ counter ion -
PRINSIP KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION
+
A-
A-
+
+
B+ B-
APA
+ +
3B-
+
PA
B++
PA = Penukar Anion M+ M+ -
- N+
3A-
- N+
M+
PK
-
+ 3N+ PK = Penukar Kation
PK
-
N+ ++
3M+
PRINSIP KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION PA suatu penukar anion; terdiri dari matrik yang memiliki ion immobil (muatan + atau suatu kation). Kation ini dinetralkan dengan cara mengikat anion A- (suatu ion counter). Pada reaksi pertukaran anion A- digantikan oleh anion B-, anion A- suatu ion mobil, B- pun disebut ion mobil karena kemudian dapat ditukar lagi dengan anion yang lain anion lain yang kekuatan pengikatannya terhadap ion immobil lebih besar juga selanjutnya dapat mengusir B- dari posisi terikat (B lepas dari), demikian seterusnya dengan anion-anion lainnya.
BAHAN KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION Resin Bahan fase diam dalam kromatografi pertukaran ion berupa manik terbuat dari kopolimer polistirena yang mengandung ikatan silang (cross linkage) divinil benzen Suatu gugus bermuatan (gugus fungsional) terikat pada matrik/resin menentukan sifat bahan : sebagai PA atau PK; kuat atau lemah. Jumlah ikatan silang menentukan sifat bahan resin, untuk pemisahan molekul Mr besar atau kecil
BAHAN KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION Resin sintetik pertama • Diaplikasikan pada proses demineralisasi, pengolahan air, recovery ion dalam limbah • Matriks hidrofobik • Crosslinking tinggi porositas kecil tidak bisa untuk protein/makromolekul Untuk biologi: • selulosa, hirofilik, tidak merusak protein • Kapasitas rendah
Contoh aplikasi PA dan PK pada pengolahan/pemurnian air Misal : Air dengan ion Cldan Na+
Air dengan OH- Na+
1
3
2 PA
Air dengan OH- Na+
PK
4 Air dengan OH- H+ (air murni)
Pemurnian air dengan resin penukar ion 1. Reaksi pada kolom penukar anion (PA)
2. Reaksi pada kolom penukar kation
Rz+OH- +Cl- Rz+Cl+ OH-
Rz-H+ + Na+ Rz-Na+ + H+
Rz+ OH- : resin penukar anion dengan counter ion OHRz+Cl : resin penukar anion dengan counter ion ClTerjadi pertukaran ion Cl oleh OH-, air yang keluar kolom tidak mengadung Cl-
PK ?
Bahan penukar ion X X X
Gugus fungsional bermuatan + atau Matrix : silika, resin (polistirena, polieter) polisakarida (selulosa, dekstran, agarosa)
berikut Tabel : Penukar ion yang umum, jenis penukar, matrik, gugus fungsi dan contoh produk
Penukar ion yang umum tipe
matrix
Gugus fungsi
Asam lemah (PK)
As poliakrilat Polistiren Selulosa Dextran Agarosa
-COO-CH2COO-CH2COO-CH2COO-CH2COO-
Asam kuat (PK)
Polistiren Dextran Polistiren Polistiren
-SO3-CH2-CH2-CH2-SO3-CH2-CH2-SO3-CH2-CH2-CH2-SO3-
Produk komersial
Amberlite, SP-Sephad Poros S Poros SP
Penukar ion yang umum tipe
matrix
Gugus fungsi
Produk komersial
Basa lemah (PA)
Polistiren Dekstrosa Dekstran Agarose
-CH2NH+R2 -CH2CH2NH+(CH2CH3)2 -CH2CH2NH+(CH2CH3)2 CH2CH2NH+(CH2CH3)2
Amberlite IR45 DEAE Sephacryl DEAE Sepha DEAE Sepha
Basa kuat (PA)
Polistiren Selulosa Dextran
-CH2N+(CH2)2 -CH2-CH2N+(CH2CH3)3 -CH2-CH2N+(CH2CH3)2 CH2-CH(OH)CH3 Kuarterner ionpolietilamin
Biorad AG-1 Cellex T ClAE sephadex
Polistiren
Poros SP
Bahan penukar ion
• • • •
Gugus fungsional bermuatan Gugus asam kuat : RSO2O-, H+ Gugus basa kuat : R-N+(R’)3,OHTerionisasi sempurna Gugus asam lemah : RCOO-,H+ Gugus basa lemah : amina (RN+H3,OH-)
sufonat gugus fungsional pembentuk asam kuat ; amonium kuarterner gugus fungsional pembentuk basa kuat terionisasi sempurna
Karbonil gugus fungsional pembentuk asam lemah; amina gugus fungsional pembentuk basa lemah terionisasi sebagian, tergatung pH lingkungan
Gugus Fungsional Bermuatan
Bahan penukar ion
• Sifat penting penukar ion • Jenis gugus : menentukan Tipe, kekuatan dan Kapasitas • Gugus fungsi Penukar Anion (PA) – amino etil (AE) – dietilaminoetil (DEAE) – quarternary aminoetil (QAE) • Gugus fungsi Penukar Kation (PK) – karboksimetil (CM) – phospho – sulphoproyl (SP) penukar ion kuat terionisasi sempurna pada kisaran pH yang luas, kapasitas tidak bergantung pH,
Bahan penukar ion
Gugus fungsi bermuatan • AE --OCH2CH2NH3+ • DEAE --OCH2CH2NH+(CH2CH3)2 • QAE --OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 • CM • Phospho • SP
--OCH2COO--PO4H2--CH2CH2CH2SO3-
• •
Soal Bahan Penukar ion : Diketahui informasi suatu bahan penukar sebagai berikut: kopolimer stiren divinil benzen, gugus fungsional sulfonat contoh nama dagang Dowex 50 W X8 (kopolimer stiren dengan DVB 8%). Benar atau salah atau Mana yang benar dari pilihan berikut : 1. Jenis PK atau PA 2. Gugs fungsi kuat/ lemah 3. Lebih tinggi porositasnya dibandingkan kopolimer yang sejenis dengan 20%DVB 4. Dapat menukar Mg2+, tidak menukar Cl5. Afinitas terhadap Cd2+> K+ 6. Kapasitas total ~ jumlah HSO3-/ gram bahan 7. Suatu bahan hidrifob/hidrofil 8. Matrik penukar bahan alami/ bahan sintetik 9. Kapasitas total pada pH 5 = kapasitas pada pH 10
Kapasitas Pertukaran • Kemampuan untuk mengambil counter ion yang dapat ditukar • Jumlah gugus bermuatan/gram penukar ion (kapasitas total) • Kapasitas tersedia = kapasitas yang benar-benar ada saat perlakuan dipengaruhi oleh – Gugus fungsional (ascessibility) – Konsentrasi eluen – Sifat counter ion – Selektifitas gugus fungsi – pH eluen (terutama untuk penukar ion lemah)
Kapasitas Pertukaran • Kapasitas break through = kapasitas satu kolom, dipengaruhi oleh laju eluen, kapasitas meningkat dengan menurunnya laju. • Ukuran butir juga mempengaruhi kapasitas
Kapasitas Pertukaran • PA atau PK kuat – Kapasitas tak bergantung pH – Kapasitas pertukaran tetap – Sulfonat dan amonium quarterner • PA atau PK lemah – Kapasitas bergantung pH – COO- (CM) : penukar kation bila pH cukup tinggi untuk disosiasi –COOH kisaran kerja pH 5 -14 – Amina tersier : penukar anion bila pH rendah (asam) gugus bermuatan + pada N kisaran kerja pH 1 - 9
Kapasitas pertukaran Ilustrasi Kapasitas tersedia dan kapaitas total: • Suatu PK akan ditentukan kapasitas penukarannya terhadap ion Cd2+ yang terdapat dalam dua contoh yang berbeda, (1) air laut dan (2) larutan kadmium nitrat 50 ppm • Kapasitas PK terhadap Cd2+ pada (1) > (2) sebab contoh 2 selain mengadung Cd2+ juga mengandung kation lain yang sama-sama dapat terikat pada gugus fungsional, (PK tidak selektif pada kation Cd) • Bila digunakan PK lemah, kapasitas pada keduanya lebih besar pada pH 10 dibandingkan pada pH 3 (pada pH rendah ionisasi gugus fungsional pada matrik tidak sempurna
• Asam sangat lemah tidak ditahan oleh resin penukar anion dengan basa lemah
Kapasitas pertukaran • Jumlah total ekivalen H+ yang dipertukarkan per unit volume atau unit massa resin • Nilainya bergantung tahanan zat terlarut sehingga hanya ion dengan kapasitas tinggi saja yang digunakan untuk pemisahan campuran yang kompleks/ karena kenaikan tahanan zat terlarut
Kesetimbangan pertukaran ion • resin-H+ + K+
larutan
resin-K+ + H+
larutan
• Koefisien selektivitas kK/H + + K K/H = (K )r (H ) (H+)r (K+)
• Afinitas (pengikatan K oleh resin) – muatan ion ( ) – ukuran ion tersovatasi ( – polarisabilitas ion ( )
)
Kesetimbangan pertukaran ion
Faktor pemisahan (retensi relatif) = Misalnya K+ dan Na+ dengan resin-H+
K/Na
=
K/Na =
kK/H
kNa/H kd1 kd2
= kK/Na
,
1, 2 = ion-ion dalam campuran
Kasetimbangan pertukaran ion Resin-H
NaCl
Resin-Na HCl
Resin-H + NaCl Resin-Na + HCl Donnan : Kesetimbangan antara bagian dalam resin dengan larutan di luar penggantian ion swelling
Kesetimbangan pertukaran ion Kation anorganik • Afinitas gol IA dan IIA meningkat dengan meningkatnya BA • Hidrasi ion mengurangi afinitas
Anion Anorganik dan Organik • Pada amberlite (poliamina) daya pertukaran hidroksida>sulfat>kromat>sitrat>tartrat>nitrat>arse nat>fosfat>molibdat>asetat=iodida=bromida>klori da>fluorida • Reaksi resin-Cl + Na-borat semua Cl terdesorpsi tanpa diganti borat
Aturan umum afinitas pertukaran ion • Pada C rendah dan T biasa, berlangsungnya pertukaran meningkat dengan meningkatnya valensi ion Na+
Aturan umum afinitas pertukaran ion • Potensial pertukaran oleh ion H+ dan OHbervariasi sesuai dg sifat gugus fungsi dan kekuatan asam/basa yang terbentuk antara gugus fungsi dan ion tsb. Semakin kuat asam/ basa, semakin rendah potensial pertukaran. • Pada penukar basa lemah, urutan pertukaran OH-> SO42-, CrO42->sitrat, tartrat > NO3-> AsO43>PO43->MoO4->asetat > I-, Br- = Cl-> F-.
Elusi • Ion yang terikat pada resin dielusi dengan cara – Displacement, oleh ion yang teradsorpsi lebih kuat – Larutan pekat ion lain – Pengkompleks • Konstanta kesetimbangan distribusi ion antara larutan dan resin Kd Koefisien distribusi
Kd =
Ms/massa resin
=
Ml/vol. larutan
Ms
Ml
V-larutan X massa-resin
Ms dan Ml fraksi M dalam resin dan larutan Faktor pemisahan =
Kd1 Kd2
Regenerasi Resin • Proses mengembalikan resin yang telah digunakan ke kondisi semula/sebelum digunakan • Jumlah bahan organik yang tetap berasosiasi dengan penukar ion setelah elusi: kolom dicuci dengan buffer atau garam kuat mis (NaCl) setimbangkan lagi • Kontaminan yang terikat kuat/ permanen pada resin bagian tersebut dibuang • Sisa resin dikeluarkan cuci
Pengepakan kolom Perhatikan bahan penukar ion : 1. Resin bekas jangan dibuangregenerasi simpan dalam wadah tertutup dan jaga tetap lembab 2. Pre Swell resin sebelum dipakai. 3. Resin kering akan mengembang dalam air (terutama 2x dan 4 x). Semakin tinggi derajat CL makin rendah pengembangannya 4. Resin direndam dalam air sampai volumenya tampak tidak bertambah lagi udara terjebak, lepas 5. Untuk pemisahan yang baik, gunakan resin yang kecil, semakin kecil pertukaran makin cepat.
Pengepakan kolom 6. Resin yg baru (dari botol) harus dibersihkan agar didapat hasil yang reproducible. Resin Pa. tidak perlu dibersihkan Cara Resin diekstraksi dalam soxhlet, Mula-mula dengan HCl 2-3M, sampai ekstrak jernih dilanjutkan dengan NaOH 2-3 N, sampai ekstrak jernih, dengan etanol 95% sampai ekstrak jernih bilas resin dengan air sampai air bilasan netral dan bebas garam jaga kelembaban.
resin
3
Cara 1 Kolom diletakkan vertikal 1. Glasswool pd bagian bawah 2. Diisi air ½ kolom
2
air
3. Resin dimasukkan sedikit2 1 5
4
air
4. Air dialirkan balik udara terusir
5. Aliran air dihentikan 6. Air yang berlebih dikeluarkan sisakan setinggi 2 mm
Bubur resin
Cara 2 1. Glasswool pada dasar kolom
2. Bubur kental resin 15-30 ml pelarut/ g resin kering, 6 ml pelarut/ g resin basah 1
3. Pelarut bubur dikeluarkan 3
Cara penyiapan Sampel • Sampel padat bebas garam larutkan dalam starting buffer atur pH • Sampel padat bergaram larutkan dalam starting buffer dialisis atau lewatkan pada media permeasi gel molekul besar bebas, garam terikat • aplikasi
Aplikasi sampel • Cara mengaplikasikan sampel ke kolom dapat memengaruhi pemisahan • Sampel tidak dalam kesetimbangan dengan buffer awal bisa terjadi gradien garam pola elusi non reproducible • Penambahan sampel tidak tepat puncak tidak simetris & recovery berkurang • V dan C tidak sesuai dg kapasitas kolom resolusi buruk • Cara :
Aplikasi
Pemisahan senyawa ber-Mr tinggi • Contoh pada pemisahan protein – Mr besar, – kestabilan ? – Buffer anion (fosfat/asetat) bila pakai penukar kation; buffer kation (tris) untuk penukar anion • Elusi – Gradien pH, bila pH > pI protein lepas / utk PK – Gradien garam selanjutnya perlu desalting
Aplikasi
Pemisahan senyawa ber-Mr rendah Senyawa Mr rendah dengan muatan sama • Kolom polistiren • Kolom dengan partikel kecil • Elusi pompa – Isokratik – Gradien
• Eluen – ion – gradien pH
Aplikasi
Pemisahan dan analisis asam amino dengan Amino Acid Analyzer • • • •
Digunakan kolom penukar kation asam kuat Cuplikan pada pH awal 2 asam amino + Elusi gradien, pH naik, Pada pH < pI asam amino sebagai kation, terikat pada resin PK • Pada pH ≥ PI a.amino netral atau negatif (anion) maka tidak terikat lagi pada PK, terelusi – Asam amino asam & netral keluar berurutan pKa1. – Asam amino basa keluar terakhir
• Deteksi : reaksi ninhidrin
Aplikasi
Pemisahan aldehida, keton, alkohol • ~CO + ion H-sulfit senyawa lainterikat kuat pada anion ex, • alkohol + H-sulfit keton dan aldehid terpisah dari alkohol • + air panas keton terpisah • + NaCl, (aldehida keluar kolom terahir)
Aplikasi
Pemisahan asam • kekuatan terhadap anion ex kuat elusi dengan asam kuat atau elusi gradien buffer & pH menurun asam paling lemah keluar paling cepat • Asam2 amino kation ex as amino pH < pI kation • Asam dengan kekuatan berbeda • Anion ex lemah asam dengan Ka kecil sedikit terikat: bila Ka < K ex asam bebas, HCN, borat, fosfat, sulfat, HCl
Aplikasi
Pemisahan sakarida/gula • Gula + ion borat kompleks (kestabilan =) monosakarida > disakarida terpisah, mono-sk (heksosa, pentosa, tetrosa) dipisah buffer borat gradien pH 7-10 •
Aplikasi
Kromatografi pertukaran ligan • Bentuk lain aplikasi kromatografi pertukaran ion contoh pemisahan macam2 kafein sbb : • Resin-Cu2+ pertama mengikat ligan NH3 ResinCu(NH3)42+ • Analat suatu ligan yg membentuk kompleks lebih kuat lalu dialirkan ligan NH3 terganti • R-Cu(HN3)42+ + 4kaf R-Cu(kaf)42+ + 4NH3 • Elusi dengan NH3 berlebih pengusiran kafein lagi : kafein yang kekuatan kompleksnya paling lemah akan terelusi paling dulu • R-Cu(kaf)42+ + NH3 (berlebih) R-Cu(NH3)42+ + Kaf …
Polimer/matrik penukar ion dengan gugus sulfonat CH=CH2
CH-CH
n
n SO3-
SO3-
Polistiren dg gugus sufonat
Bahan Penukar Ion
Bahan Penukar Ion
Contoh Polimer /matrik CH=CH2
CH-CH
n
n stiren
polistiren
Bahan Penukar Ion
CL = Cross linkage (= ikatan silang)
• Diperoleh dari kopolimerisasi • Misal : divinil benzen (DVB) dan polistiren (PS) CH CH=CH2
CH
C2H
CH
CH2
CH
CH=CH2
+
stiren
CH2
CH2
CH=CH2 divinilbenzen
Dowex…X4 = polistiren dengan 4% DVB
H2C-CH
HC-----CH2
C2H
Aplikasi pertukaran ion • 3 kelompok aplikasi ; pengolahan air, pemekatan dan pemisahan: • Contoh terapan pemisahan: • Dowex 2 untuk memisahkan campuran anion halogen dengan urutan F-,C-l,Br-, I- dengan NaNO3 pH 10,4 sebagai eluen • Dowex 50 dan amberlite120 sulfonated untuk pemisahan golongan alkali dan alkali tanah; Li+,Na+,K+ dengan eluen HC l0,7 M • Ca2+, Sr2+, Ba2+ eluen dengan eluen 1,2 M asam laktat
Aplikasi pertukaran ion • Pengaruh pH terhadap pemisahan asam amino • Tiga bentuk asam amino saling berkesetimbangan yang dipengaruhi pH, pada kondisi lebih basa dari PI asam amino bermuatan negatif, sebaliknya pada pH < PI • Asam amino bermuatan negatif dipertukarkan dengan PA
H R-C-C=O
ONH2
H
H R-C-C=O
-H+
pH > pI Bentuk anion pada pH . > PI
NH3+
O-
+H+
R-C-C=O
NH3+
OH
pH < pI
pI
Bentuk kation pada suasana lebih asam
Muatan bersih protein
+
PA
2
4
6
8
10 pH
PK
TITIK ISOELEKTRIK
PA penukar Anion
PK penukar Kation
Larutan contoh yang mengandung ion-ion: Mn2+, Ni2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, Zn2+.dilalukan pada kolom penukar anion Dowex 1. Ion ion Co2+, Cu2+, Fe3+, Zn2+ membentuk kompleks bermuatan negatif dengan ligan Cl-, Mg2+ dan Ni2+ tidak. Diketahui koefisien distribusi berbagai ion kompleks tersebut sebagai fungsi konsentrasi larutan HCl seperti gambar berikut (Gambar 16.7, Cristian,ed 4): Bagaimana urutan pemisahan kation-kation bila campuran tersebut dimasukan ke dalam kolom berisi Dowex 1 yang direndam dalam HCl 10 M dan dielusi menggunakan eluen larutan HCl dengan konsentrasi yang semakin kecil (elusi bergradien) Fe
4 8 [HCl]
Co
4
Cu
8
4
Zn
Ni
8 [M]s
D = koefisien distribusi,
Mn
D=
[M]m
[M]s, konsentrasi ion logam terikat di fase diam [M]m konsentrasi ion logam di fase gerak.
Jawab
• Ni2+ bukan anion, akan terelusi paling dulu dalam HCl 12 M, kemudian Mn2+ terelusi dalam HCl 6M, Co2+ pada HCl 4M, Cu2+ pada HCl 2,5M, Fe3+ terelusi pada HCl 0,5M dan Zn2+ pada konsentrasi 0,05 M.
Kesetimbangan pertukaran ion
[K+] pada resin
Koefisien distribusi, D atau Kd =
[K+] pada larutan
[RSO3-B+]s[H+] Kex = konstanta pertukaran = --------------------
[RSO3-H+]s[Na+] Kex >>> afinitas resin terhadap B+ besar B+ diikat H+, dilepas
Informasi label pada bahan penukar ion • Contoh : Strongly acidic, sufphonic acid, Na +, 20-50 mesh, medium porosity/8X, 4, meq/g dry. • Penukar kation, asam sulfonat, kation untuk ditukar Na+, ukuran melewati 20 mesh, tidak pada 50 mesh • 8X derajat ikatan silang, 8% DVB porositas medium • Kapasitas pertukaran: 4,4 meq/g resin
Detektor kromatografi penukar ion • Luaran suatu kolom penukar ion adalah ion- ion analat dapat dideteksi dengan konduktometer
Asam, amino basa asam amino basa
• • • • • • •
Asam amino asam Asam aspartat : R = CH2COOAsam glutamat : R = CH2-CH2COOAsam amino basa Lisinina : R = (CH2)4NH2 Arginina : R = (CH2)3NHC(NH2)(=NH) Histidina : R = CH2-C=CH \ asama amino asam dan basa // CH
