2-1 KONSEP KROMATOGRAFI

BAB 2. KROMATOGRAFI

2-1

KONSEP KROMATOGRAFI Pengertian Awal Kroma = warna; Graf (grafi) = tulisan, gambar Teknik kromatografi diartikan sebagai suatu metoda yang digunakan untuk memisahkan campuran komponen atau fraksi sejenis menjadi unit-unit yang terpisah satu dengan yang lain yang didasarkan pada perbedaan sifat masing-masing.

Perbedaan

yang

dimaksud

dapat

berupa

perbedaan

kelarutannya di dalam pelarut, perbedaan kemampuannya menyerap atau terikat pada komponen lain, perbedaan muatan ionik, ukuran molekul, dan lain sebagainya. Sejarah Kromatografi Seorang ilmuwan botani dan Rusia, Michael Tswett, pada tahun 1906 dengan suatu percobaan dapat mernisahkan zat warna hijau yang terdapat pada daun menjadi beberapa komponen. Karoten (kuning oranye/pucat), feofitin (him keabu-abuan, kadang-kadang tidak tampak), klorofil-b (hijau tua), klorofil-a (biru kehijauan), dan xantofil (kuning) dapat dipisahkan melalui tabung yang diisi dengan bubuk kalsium karbonat dan dielusi dengan petroleum eter. Teori Dasar 1.

Polaritas: sifat yang menunjukkan kecenderungan suatu senyawa untuk mengumpul/mengelompok pada satu kutub.

2.

Besarnya polaritas dinyatakan dengan konstanta dielektrika (suatu tetapan yang menunjukkan besarnya gaya saling tarik antara dua muatan elektrik pada suatu jarak tertentu di dalam ruang vakum atau di dalam suatu medium pada suhu tertentu).

3.

Seri eluotropik berbagai pelarut, suatu daftar yang menunjukkan besarnya konstanta dielektrika berbagai senyawa. Udara = 1,00 ; Heksan = 1,874 ; klorobenzena = 5,9 ; ammonia cair = 15,5 ; air = 80,2 ; asam sianida = 95.

4.

Dua atau lebih pelarut organik dapat dicampur untuk mendapatkan polaritas tertentu. Micible (misibel) adalah pelarut-pelarut yang dapat bercampur satu sama lain tetapi tidak saling melarutkan. Immicible (imisibel) adalah pelarut-pelarut yang tidak dapat bercampur dan tidak saling melarutkan satu terhadap yang lain.

Universitas Gadjah Mada

5.

Prinsip “like disolve like”: senyawa atau komponen yang polaritasnya sama atau hampir sama akan selalu bersama-sama, tetapi yang polaritasnya berbeda akan selalu berjauhan, ada jarak, atau saling menolak.

6.

Percobaan Craig mengembangkan pemisahan komponen-komponen dalam pelarut melalui suatu tangki (kolom).

Istilah Dalam Kromatografi 1. Fase diam (stationer phase), yaitu bahan yang digunakan dalam kromatografi yang tidak bergerak dan membentuk pelat-pelat teoritis. Fase diam dapat berupa padatan, cairan, ataupun gas. 2. Fase bergerak (moving phase, mobile phase), yaitu bahan yang digunakan dalam kromatografi yang kedalamnya dilarutkan (terdapat) campuran komponen yang akan dipisahkan, yang bergerak sepanjang fase diam. Fase bergerak dapat berupa cairan maupun gas. 3. Penyangga atau matrik (support), yaiu bahan padat yang digunakan pada kromatografi untuk menahan fase diam yang berupa cairan atau gas supaya tidak bergerak. 4. Penyerap (sorbent), yaitu bahan padatan yang berfungsi sebagai penyangga sekaligus sebagai fase diam. 5. Solut (solute), adalah komponen-komponen yang terdapat dalam bentuk campuran dalam pelarut yang akan dipisahkan melalui sistem kromatografi. 6. Pengembang (developer) atau eluen (eluent), adalah pelarut/larutan yang digunakan untuk mengelusi carnpuran komponen yang sudah ada di dalam sistem kromatografi supaya dapat bergerak sepanjang pelat-pelat teoritis (kolom). 7. Eluat, yaitu pengembang atau eluen yang keluar dan sistem kromatografi yang secara periodik mengandung komponen-komponen yang sudah terpisahkan. 8. Elusi ialah pekerjaan atau usaha untuk menjalankan komponenkomponen dalam pelarut untuk bergerak sepanjang kolom dalam sistem kromatografi dengan cara mengalirkan eluen. 9. Pemuatan (loading) sampel, yaitu pekeijaan menempatkan sejumlah larutan sampel yang mengandung komponen-komponen yang akan dipisahkan ke dalam ruang sampel yang ada pada peralatan kromatografi.


10. Volume retensi (retention volume, void volume, hold-up volume), ialah jumlah larutan pengelusi (fase bergerak) yang memenuhi rongga-rongga dan pori-pori dalam kolom (matrik). 11. Volume bed (bed volume) adalah jumlah larutan pengelusi ditambah dengan volume kolom. 12. Volume pengelusi (elution volume) ialah jumlah larutan pengeluasi yang harus ditambahkan ke dalam sistem kromatografi untuk menghasilkan (mengeluarkan dari kolom) sebuah puncak kromatogram. 13. Kolom adalah sejumlah matnik yang dimasukkan ke dalam tabung untuk kromatografi. 14. Kromatogram adalah respon detektor dalam bentuk grafik di antara sumbu respon versus waktu retensi atau dalam bentuk noda-noda di atas bahan penyerap atau fase diam. Sistem dalam Kromatografi 1. Sistem partisi, ialah pemisahan komponen yang didasarkan atas perbedaan polaritas pada matrik (fase diam). Sistem ini terjadi pada kromatografi yang menggunakan fase diam dan fase bergeraknya berupa cairan, fase diam dan fase bergeraknya berupa gas, fase diam berupa cairan sedangkan fase bergerak berupa gas, atau fase diam berupa gas sedangkan fase diamnya berupa cairan. 2. Sistem adsorpsi, ialah pemisahan komponen yang didasarkan pada kecenderungan komponen-komponen mengadakan adsorpsi pada matrik (fase diam). Sistem ini terjadi pada kromatografi yang menggunakan fase diam berupa padatan sedangkan fase bergeraknya berupa cairan atau gas. 3. Sistem normal (normal phase) yaitu kromatografi yang menggunakan fase diam bersifat polar dan fase bergeraknya bersifat non-polar. 4. Sistem sungsang atau sistem terbalik (reversed phase) jika dalam kromatografi digunakan fase diam bersifat non-polar sedangkan fase bergeraknya bersifat polar. 5. Sistem penukar ion (ion exchange) ialah sistem kromatografi yang menggunakan dasar perbedaan muatan antara komponen yang dipisahkan dengan muatan matriknya. 6. Sistem afinitas ialah pemisahan komponen dengan kromatografi yang mendasarkan pada perbedaan afinitas (kemampuan bergabung) untuk mengadakan ikatan dengan fase diam.


7. Sistem penyaring molekuler (molecular sieve) atau sistem ekslusi bentuk (size exclussion) jika pemisahan komponen didasarkan pada perbedaan ukuran (bentuk) atau berat molekulnya. Pada sistem ini molekul-molekul yang besar (berat molekul tinggi) akan keluar terlebih dahulu karena molekul-molekul yang kecil mengadakan retensi sementara waktu di dalam pori-pori matrik. 8. Sistem pasangan ion (ion pairing) jika ke dalam sistem kromatografi ditambahkan bahan atau komponen yang dapat merubah tegangan ionik pada matrik atau eluen atau keduanya. Kromatografi ini sering digabungkan dengan kromatografi fase normal atau kromatografi fase sungsang. Jenis/Tipe Kromatografi 1. Kromatografi kertas adalah kromatografi yang menggunakan kertas dengan sifat-sifat tertentu sebagai alat sekaligus media untuk memisahkan campuran komponen dalam pelarut. 2. Kromatografi lapis tipis ialah kromatografi yang menggunakan matrik yang dibentuk berupa lapisan tipis pada permukaan lempeng benda padat seperti kaca, aluminium, atau plastik sebagai media untuk memisahkan campuran komponen dalam pelarut. 3. Kromatografi kolom yaitu kromatografi yang menggunakan matrik yang dimasukkan ke dalam tabung sehingga membentuk kolom yang digunakan sebagai media untuk memisahkan campuran komponen dalam pelarut. Tipe kromatografi kolom di dalam praktek dapat merupakan: a. Kromatografi kolom partisi yaitu kromatografi yang menggunakan fase diam berupa cairan yang diadsorpsikan pada permukaan partikelpartikel matrik dalam kolom dan menggunakan fase bergerak berupa cairan. b. Kromatografi kolom adsorpsi yaitu kromatografi yang menggunakan fase diam berupa padatan sekaligus sebagai matrik yang dimasukkan ke dalam suatu tabung dan menggunakan fase bergerak berupa cairan. c. Kromatografi gel

yaitu

kromatografi

yang

menggunakan

bahan

penyangga padatan sebagai penyaring molekuler komponen. d. Kromatografi gas cairan yaitu kromatografi kolom yang mengunakan fase diam berbentuk cairan dan fase bergerak berbentuk gas.


e. Kromatografi gas padatan yaitu kromatografi kolom yang menggunakan fase diam berupa padatan dan fase bergerak berupa gas. f.

Kromatografi kolom tekanan tinggi yaitu kromatografi kolom partisi atau adsorpsi yang menggunakan tekanan tinggi untuk mempercepat laju gerakan larutan pengelusi dan pemisahan komponen. Dalam praktek misalnya adalah HPLC (high performance liquid chromatography).

4. Elektroforesis adalah pemisahan komponen-komponen yang didasarkan pada perbedaan muatan ion antara satu komponen dengan yang lain melalui suatu matrik di dalam lingkungan medan listrik. Sebagian ahli memandang elektroforesis tidak termasuk dalam golongan kromatografi. 5. Kombinasi

kromatografi

dengan

elektroforesis

atau

dengan

spektrofotometri. Hukum Distribusi

K = koefisien distribusi = koefisien partisi = kelarutan relatif; k = konsentrasi solut

Faktor Retardasi (Rf) Jika Vs dan Vm masing-masing adalah banyaknya (volume) fase diam dan fase bergerak, maka pada fase bergerak:

Dan pada fase diam,


c = faktor kapasitas (besarnya setara dengan rasio jumlah solut yang berada di dalam fase diam dan yang berada di dalam fake bergerak)

Di dalain praktek Rf digunakan untuk menentukan lokasi solut dalam sistem kromatografi:

Vh = volume eluen yang diperlukan untuk mengisi kolom (hold-up volume) Vr = volume eluen yang diperlukan untuk kromatogram (volume retensi). mengelusi keluarnya Pada kromatografi kertas dan lapis tipis lainnya besarnya Rf:

As = L x W= luas fase diam pada pada kertas atau lapis tipis Lm = jarak yang ditempuh oleh fase bergerak Ls

= jarak yang ditempuh oleh fase diam

W = lebar kertas atau lapis tipis

Pada kromatografi kolom besarnya Rf:

Rf dapat diekspresikan sebagai rasio jarak tempuh solut (Am) dan jarak tempuh fase bergerak/larutan pengelusi (Am+KAs) pada kertas atau lapis tipis, yaitu:

Waktu Retensi Waktu retensi (tr) = lamanya solut tinggal di dalam sistem kromatografi = waktu yang diperlukan untuk mengeluarkan solut dan dalam ke luar kolom = waktu


yang diperlukan untuk membentuk puncak kromatogram sejak sampel diaplikasikan.

L =

panjang kolom, F = kecepatan solut

bergerak

melalui kolom

(mengekspresikan kecepatan aliran fase bergerak), tm = waktu yang diperlukan solut untuk menempuh jarak di dalam kolom sampai keluar dan kolom. Jika kecepatan mengalir fase bergerak konstan, maka:

sehingga Rf dalam sistem kolom dapat ditentukan berdasarkan:

Jumlah pelat teoritis (n) dapat dihitung (lihat Gambar): Teori Lapisan (Pelat)

Ekivalensi pelat teoritis (EPT), high equivalent to a theoritical plate (HETP) = rasio antara panjang kolom dengan jumlah pelat teoritisnya,

Jika nilai ekivalensi pelat teoritis kecil maka menguntungkan karena akan menghasilkan kromatogram yang ideal.


Menurut Van Deemter dan Gidding:

A = konstanta “Eddy diffusion”, B = konstanta difusi longitudonal C = konstanta keseimbangan dinamis F = kecepatan aliran linear fase bergerak.

Efisiensi Kromatografi

Menurut Van Deemter dan Gidding:

Resolusi

R

= resolusi

Atr

= jarak antara dua puncak yang memisah

WA = lebar garis dasar puncak A WB = lebar garis dasar puncak B


Pengaruh berbagai faktor terhadap resolusi kromatogram. (a) Pemisahan pada kolom pendek dengan sedikit lapisan teoritis. (b) Kondisi (a) tetapi suhu dinaikkan, resolusi bertambah baik. (c) Pemisahan pada kolom panjang dengan lapisan teoritis banyak. (d) Kondisi (c) tetapi suhu dinaikkan, resolusi bertambah baik. Tailing Dan Fronting


Tipe-tipe kromatogram (a) kromatogram berbentuk kurva Gaussian yang terbentuk pada kromatografi kolom, (b) kromatogram berbentuk noda (spot) yang terbentuk pada kromatografi kertas dan lapis tipis. Dalam praktek sering terjadi tailing dan fronting, salah satu sebabnya adalah terlalu banyak sampel dimuatkan pada sistem (overloading).

Identifikasi dan Analisis Kuantitatif Evaluasi secara kuantitatif dilakukan sesudah evaluasi kualitatif. 1. Dengan menggunakan alat yang disebut dengan planimeter. 2. Dengan menghitung berat kromatogram. 3. Dengan menghitung luas kromatogram. 4. Dengan mengukur tinggi dan lebar kromatogram pada tengah-tengah ketinggiannya, kemudian mengalikan keduanya satu dengan yang lain. 5. Dengan menggunakan integrator/recorder yaitu alat yang bekerja secara elektronik yang dirancang secara khusus untuk keperluan tersebut (penghitungan luas kromatogram).

Presisi metoda pengukuran kromatogram


Standar Merupakan faktor koreksi untuk memperoleh konsentrasi yang sebenarnya 1. Metoda standar eksternal jika pengelusian standar dan sampel dilakukan terpisah (sendiri-sendiri) dengan kolom dan kondisi yang sama. Senyawasenyawa yang digunakan sebagai standar sama dengan komponenkomponen yang ada pada sampel sehingga waktu retensi standar dan sampel akan sama. Untuk menghitung konsentrasi komponen dalam sampel:

Kurva standar hubungan antara luas area dengan konsentrasi 2. Metoda standar internal jika standar dan sampel dielusikan bersama-sama pada kolom yang sama. Standar yang digunakan merupakan senyawa seri dari komponen-komponen sampel dan yang kromatogramnya tidak muncul pada sampel (senyawa yang digunakan untuk standar internal tidak terdapat pada sampel). 3. Metoda spiking ialah penggunaan standar internal dimana senyawa yang digunakan sebagai standar internal terdapat di dalam sampel. 2-2

KROMATOGRAFI KOLOM PARTISI Sistem partisi, ialah pemisahan komponen yang didasarkan atas perbedaan polaritas pada matrik (fase diam). Sistem ini terjadi pada kromatografi yang menggunakan fase diam dan fase bergeraknya berupa cairan, fase diam dan fase bergeraknya berupa gas, fase diam berupa cairan sedangkan fase bergerak berupa gas, atau fase diam berupa gas sedangkan fase diamnya berupa cairan. Peralatan Kromatografi kolom partisi menggunakan suatu tabung yang terbuat dari kaca, nilon, fiberglass, atau logam tahan karat. Pada bagian bawah (dasar)


tabung diberi penahan (glasswool dan atau pasir) untuk menahan bahan penyangga supaya tidak keluar dan tabung. Di bagian bawah tabung terdapat pipa bergaris tengah kecil, dapat dilengkapi dengan keran yang dapat dibuka atau ditutup untuk mengalirkan atau menghentikan aliran pelarut dan dalam tabung. Tabung kemudian diisi dengan kolom yang sudah disiapkan terlebih dahulu. Tinggi kolom paling sedikit 20 kali diameternya. Pada bagian atas tabung ditempatkan reservoir eluen. Cara mengoperasikan peralatan adalah dengan mengelusi sampel yang diletakkan di atas kolom. Elusi dihentikan jika diperkirakan semua komponen telah terpisahkan. Bahan Penyangga (Matrik = Kolom) Bahan penyangga dan sifatnya yang banyak digunakan pada kromatografi kolom partisi antara lain seperti pada Tabel 1. Tabel 1 Bahan penyangga komersial untuk kromatografi kolom


Preparasi Bahan Penyangga Untuk bahan penyangga berupa tanah diatome atau gel silika, maka bahan penyangga ini harus dicampur dengan fase diam yang akan digunakan dengan perbandingan 0,5-1,0 bagian fase diam dengan 1,0 bagian bahan penyangga. Pencampuran harus baik, misalnya dengan menggunakan mortar atau blender sehmgga akan dihasilkan semacam pasta atau bubur yang tidak terlalu basah tetapi juga tidak kering. Fase diam yang akan digunakan kemudian ditambahkan berlebihan pada pasta tersebut sehingga terjadi sluri. Setelah itu sluri dimasukkan tabung, sluri diaduk dengan pengaduk berbentuk cakram yang diameternya lebih kecil sedikit daripada diameter tabung. Pada pusat cakram diberi tangkai panjang. Jika cakram dimasukkan ke dalam tabung dan digerakkan berkali-kali sepanjang tabung ke atas dan ke bawah, maka cakram akan dapat bergerak leluasa, dan sluri akan dapat bergerak melalui sela-sela cakram dengan dinding tabung. Gerakan cakram harus perlahanlahan, dilakukan beberapa kali. Sesudah itu cakram diambil dan kelebihan fase diam dikeluarkan melalui mulut tabung yang terletak di bagian dasar tabung. Untuk kolom selulosa, maka bubuk selulosa direndam ke dalam aseton. Campuran kemudian dituangkan ke dalam tabung. Kelebihan aseton dikeluarkan melalui mulut tabung yang terletak di bagian dasar tabung. Kolom kemudian dicuci dengan fase bergerak sampai teijadi keseimbangan. Kadangkadang sebelum dicuci dengan fase bergerak, dicuci terlebih dahulu dengan air berlebihan. Teknik Elusi Ada beberapa cara mengeluasi sampel. Yang pertama dengan cara bertahap (batch elution atau stepwise elution), yaitu mengelusi kolom dengan suatu jenis pelarut (dapat merupakan campuran dua macam atau lebih pelarut) sampai sejumlah volume eluat tertentu dikumpulkan, kemudian elusi dilanjutkan dengan jenis pelarut lain dengan cara yang sama, demikian seterusnya dengan jenis pelarut yang lain lagi sampai selesai. Keuntungan dengan menggunakan cara ini adalah mudah dilakukan penyeimbangan (conditioning) kolom. Dengan demikian fraksi fraksi yang ingin dipisahkan dapat dielusi dengan sesedikit mungkin eluen. Cara yang kedua adalah mengalirkan eluen secara berterusan (continuous elution). Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan pompa peristaltik atau


secara sederhana dengan meletakkan tangki penyedia freservoir) pelarut tepat di atas kolom. Cara yang ketiga adalah mengelusi kolom dengan dua macam atau lebih pelarut sekaligus dengan rasio yang berubah selama elusi. Cara ini lazim disebut sebagai pengelusian bertingkat (gradient elution). Dengan cara ini konsentrasi suatu pelarut dapat dinaikkan atau diturunkan secara bertahap selama proses elusi berlangsung. Jadi seandainya eluen yang digunakan terdiri atas dua macam pelarut, A dan B, maka konsentrasi A dapat dibuat naik secara bertahap sedangkan konsentrasi B secara otomatis akan menurun, atau dibuat sebaliknya. Yang dapat dibuat bertingkat bukan hanya rasio antara pelarutpelarut yang digunakan tetapi juga misainya dapat konsentrasi garam, nilai pH, polaritas, dan sebagainya. Pelaksanaan elusi bertingkat dapat dikerjakan dengan dua tanghki yang dihubungkan menjadi satu. Tangki kedua dilengkapi dengan keran untuk mengeluarkan isinya, yang terhubungkan dengan kolom. Tipe kenaikkan bertingkatnya dapat berbeda jika ukuran tangki pertama dan kedua berbeda. Jika ukuran kedua tangki sama besarnya, maka perubahan gradien akan tetap (konstan) atau mengikuti garis linear. Jika ukuran tangki pertama lebih besar atau lebih kecil daripada ukuran tangki kedua, maka perubahan gradien masing-masing pelarut akan berlangsung makin menurun atau menaik, tidak mengikuti garis linear.


Penggunaan Kromatografi kolom partisi banyak digunakan untuk memisahkan berbagai komponen yang terdapat dalam bahan pangan dan pakan termasuk juga bahan hasil pertanian pada umumnya, antara lain: 1.

Asam-asam lemak C2-C8, dengan fase diam campuran air dan asam sulfat dengan perbandingan tertentu, dan fase bergerak campuran kloroform dan n-butanol.

2.

Senyawa-senyawa

golongan

lipida,

dengan

fase

diam

campuran

trikiorometan dan alkana dan fase bergerak 2-propana. 3.

Karbohidrat dan glukosida dengan fase diam 1,2-etanadiol monometileter dan fase bergerak 2-propana.

4.

Golongan fenol dengan fase diam berupa air dan fase bergerak campuran metanol, n-butanol, dan kloroform.

5.

Untuk memisahkan aidrin-dieldrin (keduanya adalah insektisida) dengan fase diam nitrometan dan fase bergerak n-heksana.

2-3 KROMATOGRAFI KOLOM ADSORPSI

Berbeda dengan kromatografi partisi, maka dalam kromatografi adsorpsi yang menjadi fase diam adalah berupa padatan yang sekali gus juga berperan sebagai penyangga. Permukaan partikel-partikel penyangga mempunyai sifat aktiv yang dapat mengikat komponen-komponen atau molekul-molekul tertentu. Pengikatan komponen-komponen tersebut dapat disebabkan karena interaksi ionik (elektrostatik), gaya Van der Wals, atau tenaga-tenaga lainnya mau pun kombinasinya. Selama kromatografi berlangsung akan terjadi penyerapan molekul-molekul yang dipisahkan (solut) yang terdapat dalam larutan pada permukaan

penyangga.

Kekuatan

penyerapan

dipengaruhi

oleh

sifat

penyangga dan solut. Pada umumnya penyangga merupakan komponen yang mempunyai polaritas tinggi, sehingga penyerapan solut pada permukaan penyangga sangat tergantung pada polaritas solut. Komponen-komponen yang mempunyai polaritas tinggi akan terikat kuat pada permukaan penyangga, sedangkan yang polaritasnya rendah kurang kuat atau tidak terikat pada permukaan penyangga. Sebagai bahan penyangga harus dipilih sesuai dengan komponen-komponen yang akan dipisahkan. Dalam praktek pada umumnya sering digunakan


alumina yang dapat digunakan untuk memisahkan hanipir semua komponen organik. Sifat eluen atau pelarut juga berpengaruh pada kromatografi adsorpsi. Umumnya digunakan pelarut yang polaritasnya rendah. Kekuatan pelarut mengelusi komponen-komponen yang terikat pada penyangga meningkat dengan meningkatnya polaritas.

Peralatan Pada kromatografi kolom adsorpsi juga digunakan tabung seperti halnya pada kromatografi kolom partisi dan cara penyiapannya juga tidak berbeda dengan penyiapan kolom partisi. Partikel-partikel penyangga dibuat sluri dengan menggunakan pelarut yang akan digunakan sebagai fase bergerak, kemudian dimasukkan ke dalam tabung dan dibiarkan beberapa waktu lamanya supaya partikel-partikel penyangga mengendap. Cara memuatkan sampel, teknik mengelusi, dan pengumpulan fraksifraksi, serta cara-cara analisisnya sama dengan yang telah diterangkan pada kromatografi kolom partisi. Komponen yang keluar kolom terlebih dahulu tergantung pada sistem kromatografi yang digunakan. Pada kromatografi adsorpsi dengan sistem fase normal, maka yang keluar kolom lebih awal adalah komponen yang mempunyai sifat lebih nonpolar daripada komponen-komponen yang membentuk puncak kromatogram lebih akhir. Sebaliknya pada kromatografi adsorpsi dengan sistem fase sungsang, maka yang membentuk puncak kromatogram lebih awal adalah komponen yang bersifat lebih polar danpada yang kemudian.

2-4 KROMATOGRAFI GEL

Pada kromatografi gel, partikel-partikel yang dipisahkan berupa molekulmolekul berdasarkan pada ukurannya. Oleh karenanya kromatografi gel sering kali disebut dengan kromatograli penyaring molekuler. Yang bertindak sebagai penyaring adalah suatu kolom gel yang dipersiapkan dan bahan-bahan tertentu, misalnya dekstran. Perbedaannya dengan penyaringan biasa adalah bahwa dalam kromatografi gel molekul-molekul yang berukuran besar akan lobs lebih dahulu, sedangkan molekul-molekul yang kecil ukurannya akan muncul lebih akhir.


Bahan Penyangga (Kolom) Suatu gel adalah jaringan tiga demensi yang biasanya mempunyai struktur acak dan suatu komponen bahan. Persyaratan utama gel yang dapat digunakan pada kromatografi gel adalah yang inert, artinya tidak bereaksi dengan atau mempengaruhi sifat-sifat molekul-molekul yang dipisahkan atau dengan komponen-komponen pelarut atau larutan penyangga yang digunakan. Di samping itu gel juga harus tidak bermuatan (positif atau negatif) . Tiga macam gel yang banyak digunakan pada kromatografi gel adalah dekstran, agarosa, dan poliakrilamida. Dekstran merupakan polisakarida dengan sub-unit penyusunnya adalah glukosa. Komponen-komponen dekstran adalah glukosa yang membentuk ikatan satu sama lain dan bercabang pada ikatan β-1,6glikosidik. Gel dekstran banyak dijual beikan dengan nama komersial antara lain Sephadex yang dibuat oleh Pharmacia Fine Chemicals, Inc. Agar merupakan polisakarida yang diperoleh dan tanaman rumput laut yang berwarna merah. Ada dua jenis agar, yaitu agarosa yang berisfat netral dan agaropektin yang mengandung gugus asam (gugus karboksilat, -COOH) dan gugus sulfat. Agarosa merupakan polimer D-galaktosa dan 3,6-anhidro- 1galaktosa, membentuk gel melalui ikatan hidrogen yang ada. Agarosa diperdagangkan dengan berbagai nama, antara lain Sepharose yang diproduksi oleh Pharmacia Fine Chemicals, Inc. dan Biogel yang diproduksi oleh Bio-Rad Laboratories. Agaropektin jarang digunakan dalam kromatografi gel. Gel poliakrilarnida dibuat dengan mencampur akrilamida (CH2+=CH-CO-NH2) dengan

N,N’-metilenabisakrilamida

(H2C=CH-C(=O)-NH-CH2-NH-

C(=0)-

CH=CH2). Salah satu gel poliakrilamida yang dipasarkan adalah Bio-gel-P yang diproduksi oleh Bio-Rad laboratories. Penyiapan kolom untuk kromatogrfai gel hampir tak ada bedanya dengan penyiapan kolom untuk kromatografi adsorpsi atau partisi. Berikut ini diberikan beberapa petunjuk cara menyiapkan kolom dan beberapa gel. 1. Gel dekstran.- Butiran-butiran dekstran (BM ± 40.000) sebanyak 500g dicampur dengan 200m1 aquades dan 300ml larutan 5N NaOH. Selanjutnya 135g epiklorohidrin ditambahkan sambil dilakukan pengadukkan. Campuran kemudian dipanaskan pada suhu 400C sambil terus diaduk sampal menjadi sluri, yang kemudian dapat dituangkan ke dalam tabung kromatografi. Setelah 1 jam biasanya kolom siap untuk digunakan.


2. Gel agarosa.- Agar dicampur dengan aquades sehingga memperoleh konsentrasi seperti yang diinginkan. Kemudian dilakukan pemanasan pada suhu 1200C selama 20 menit dengan menggunakan otoklav. Setelah itu didinginkan sampai tampak larutan gel mulal menjadi kental (viscus), dan segera dimasukkan ke dalam tabung kromatografi. hasil kolom akan menjadi lebih baik, jika larutan gel dalam keadaan panas disaring terlebih dahulu dengan menggunakan penyaring hampa. Setelah itu filtrat gel dibiarkan agak dingin lalu dimasukkan ke dalam tabung kromatografi. 3. Gel poliakrilamida.- Akrilamida sebanyak 57g dan N,N’metilenabisakrilamida sebanyak 3g dilarutkan bersama-sama 500 ml air (aquades). Udara di dalam air terlebih dahulu sudah harus dihilangkan dengan cara degassing selama ± 10 menit. Air juga dapat diganti dengan larutan penyangga (buffer) yang sama dengan yang akan digunakan untuk mengelusi kolom, tetapi pH larutan penyangga hendaknya sedikit di atas nilai 6,0 dan telah dilakukan degassing selama 2-3 menit. Adanya oksigen di dalam air atau larutan penyangga dapat menghambat polimerisasi akrilamida. Degassing dapat dilakukan dengan cara menghembuskan gas nitrogen atau hidrogen melalui pipa berdiameter kecil ke dalam air atau larutan penyangga, atau dengan cara menghampakan udara di dalam wadah yang berisi air atau larutan penyangga tersebut. Kemudian 1 ml dimetilaminopropionitril dan 1 g ammonium

persulfat

ditambahkan

ke

dalamnya

sambil

dilakukan

pengadukan. Sluri kemudian dimasukkan ke dalam tabung kromatografi. Biasanya dalam waktu 10 menit kolom sudah siap untuk digunakan, tetapi lebih baik (dianjurkan) menggunakannya setelah beberapa jam kemudian. Kromatografi gel mempunyai keuntungan dan kerugian antara lain dalam operasinya gel hampir tak dipengaruhi oleh suhu, pH, tegangan ionik, dan komposisi larutan penyangga. Pengaruh adsorpsi hampir tidak ada sehingga tidak mempengaruhi sifat-sifat komponen yang dipisahkan. Pada kromatografi gel, pita-pita (daerah, zona) pemisahan lebih tegas dan sempit daripada yang terjadi pada teknik-teknik kromatografi lainnya. Gaya gravitasi mempengaruhi kecepatan pemisahan. Oleh karena itu kromatografi gel berjalan lambat. Molekul-molekul yang kecil akan tidak muncul atau munculnya memerlukan waktu yang sangat lama. Untuk mengatasi hal tersebut

dapat

diberikan

tekanan

untuk

mempercepat

aliran

eluen.

Kromatografi gel merupakan cara yang terbaik untuk memisahkan komponen-


komponen berdasarkan berat molekulnya dengan recovery sempurna ( 100%), mempunyai reprodusibeitas (hasil yang sama pada banyak pengulangan) tinggi, dan dapat digunakan untuk keperluan analisis dan preparatif dan memerlukan waktu yang pendek serta tanpa memerlukan biaya yang mahal. Komponen-komponen dengan selisih berat molekul kecil dapat dipisahkan dengan cara ini dengan hasil yang sangat balk.

Penggunaan Pada umumnya kromatografi gel digunakan untuk mengestimasi berat molekul komponen-komponen bahan. Untuk ini diperlukan beberapa standar dengan berat molekul yang bervariasi dan diketahui. Dalam praktek, yang sering dikerjakan adalah menggunakan standar dengan berat molekul 103-106 dalton. Standar dilarutkan dalam pelarut kemudian dielusikan ke dalam kolom. Standar dengan berat molekul tinggi akan keluar membentuk puncak kromatogram terlebih dahulu, makin kecil berat molekulnya akan lama membentuk puncakpuncak kromatogram, dan yang paling kecil berat molekulnya akan keluar membentuk puncak kromatogram paling akhir. Dengan demikian akan dapat dibuat suatu kurva yang menunjukkan hubungan antara waktu retensi dengan berat molekul. 2-5 KROMATOGRAFI GAS

Ada dua macam kromatografi gas, yaitu kromatografi gas cairan (gas liquid chromatography,

GLC)

dan

kromatografi

gas

padatan

(gas

solid

chromatography, GSC). Fase diam pada kromatografi gas cairan adalah cairan yang mempunyai titik didih tinggi yang ditahan/diikatkan pada penyangga. Pemisahan komponen pada kromatografi gas cairan asarkan pada proses sorpsi partisi. Pada kromatografi gas padatan diam yang digunakan adalah padatan yang sekaligus berfungsi gai bahan penyerap.


Peralatan

Fase Diam Persyaratan untuk fase diam harus innert terhadap sampel, bahan penyangga, dan bahan tabung, dan tidak mudah menguap (nonvolatile), stabil pada suhu operasi kromatografi, mempunyai kemurnian tinggi, tidak tercampur oleh bahan lain. Fase diam ada yang bersifat polar misalnya poliester yang berat molekulnya tinggi, golongan ester, carbowax, amin, dan yang berisfat non-polar misalnya hidrokarbon, minyak (lemak), silikon. Pada penggunaannya sebaiknya digunakan fase diam yang mempunyai sifat kimiawi mirip dengan komponenkomponen yang dipisahkan. Perbedaan polaritas akan menyebabkan tailing atau fronting. Pemisahan hidrokarbon dengan menggunakan squalane atau lemak siikon DC200, Pemisahan komponen-komponen yang mempunyai polaritas yang bervariasi, diperlukan beberapa kali uji coba fase diam dengan menggunakan fase bergerak yang berbeda-beda sebelum digunakan untuk sampel.


Tabel 2. Berbagai jenis fase diam untuk kromatografi gas

Fase Bergerak Merupakan gas pembawa yang ditempatkan dalam tabung bertekanan tinggi (rata-rata 40 psi) untuk menghasilkan kecepatan aliran gas 10-100cm3/menit. Gas pembawa harus murni (tidak mengandung uap air, hidrokarbon, atau gasgas lain). Yang populer adalah nitrogen, gas argon, gas helium, dan gas hidrogen. Penggunaanya tergantung pada jenis detektor yang digunakan, ketersediaan gas, dan biaya/harga. Bahan Penyangga Fungsi bahan penyangga untuk kromatografi gas cairan adalah sebagai bahan yang mengikat/menahan fase diam berbetuk cairan atau gas, sedangkan pada kromatografi gas padatan berfungsi sebagai fase diam. Persyaratan untuk bahan penyangga adalah innert, murni (tidak tercampur bahan lain, dan logam,


tidak mengandung silanol (Si-OH)). Sebelum digunakan bahan penyangga hams dicuci dengan larutan asam atau basa untuk menghilangkan cemaran logam, dilakukan silanasi untuk mengubah gugus Si-OH menjadi Si-O-Si(CH3)3. silanasi dapat dilakukan dengan mencuci bahan penyangga dengan dimetil dikiorosilan atau dengan heksametildisilazan. Bahan penyangga pada kromatografi gas cairan yang populer adalah tanah diatome dan silika yang di dalam perdagangan dipasarkan sebagai celite, chromosorb, dan stermachol. Bahan penyangga pada kromatografi gas padatan umumnya adalah gel silika atau bahan-bahan yang digunakan untuk kolom pada kromatografi gel. Makin kecil partikel bahan penyangga akan makin tinggi efesiensinya. Bahan penyangga berukuran 80/ 100 mesh - 100/200 mesh banyak digunakan untuk kolom yang bergaris tengah 3mm atau 0,1251n, bahan penyangga berukuran 40/60 mesh — 60/80 mesh digunakan untuk kolom yang bergaris tengah lebih besar (misalnya 6mm atau O,25in). Jumlah fase diam yang dapat ditahan oleh bahan penyangga berpengaruh pada pemisahan. Jumlah 15-30% w/w akan menghasilkan lapisan film yang tebal, pemisahan sukar terjadi, jumlah 1-10% w/w merupakan jumlah yang ideal, pemisahan sempurna, sedangkan jumlah kurang dan 1% menyebabkan sampel overloading, dapat menyebabkan tailing atau pun fronting. Kolom Kolom yang dapat digunakan pada kromatografi gas ada dua macam, yaitu kolom tertutup (packed column) dan kolom terbuka(open-tubular column atau capillary column). Kolom tertutup berukuran panjang 1- 20m, diameter 3-10mm atau

0,125-0,375in.

Garis

tengah

kolom

sangat

menentukan

kapasitas/kemampuannya. Kolom tertutup umumnya mempunyai lapisan teoritis kurang daripada 10.000 (rata-rata 1000- 3000/ 1m). Kolom terbuka berukuran panjang 10-50m, diameter 0,2-1,2mm. Cara preparasi kolom terbuka ada dua macam, yaitu “wallcoated open tubular” (WCOT, melapisi langsung dinding bagian dalam tabung dengan fase diam berbentuk cairan) dan supportcoated open tubular” (SCOT, melapisi dinding bagian dalam tabung dengan sluri campuran bahan penyangga dengan fase diam). WCOT bergaris tengah 0,25mm, panjang 50- 150m, ketebalan lapisan fase diam 1pm. SCOT bergaris tengah rata-rata 0,5mm, panjang 16m, jumlah lapisan teoritis 600.000 (rata-rata


1000-4000/ 1 m). SCOT yang berupa kolom kapiler panjangnya dapat mencapai 3000m dengan diameter kolom < 0, 1 mm. Kelebihan kolom kapiler dibanding kolom lainnya adalah pemisahan komponen menjadi lebih tegas, lebih reprodusibel, dan lebih efisien. Kolom ditempatkan di dalam oven. Suhu oven merupakan suhu kolom dan dapat diprogram dan suhu rendah sampai suhu tinggi. Pemrograman dan suhu tinggi ke rendah tidak umum dikerjakan. Suhu kolom bisa sama bisa tidak sama dengan suhu injection port. Dapat digunakan prekolom yang ditempatkan sebelum kolom. Injection Port Tempat untuk memasukkan sampel (cair) dinamakan injection port. Cara memasukkan sampel dapat secara on-column injection atau secara flash evaporation (biasanya hanya digunakan untuk sampel yang mempunyai titik didih sangat tinggi). Hexaport adalah ijection port untuk sampel berbentuk gas, sedangkan injection splitter adalah injection port untuk kolom kapiler. Jumlah sampel tergantung pada kemampuan/kapasitas kolom dan kepekaan detektor. Kapasitas kolom kapiler rata-rata 0,01µl. Sampel berbentuk cairan (larutan) encer cukup 0,1-10µl, sedangkan sampel berbentuk gas : 1-10ml. Jika digunakan kolom kapiler, maka jumlah sampel cairan cukup 10-3 - 10-2pl. Prekolom dapat menampung sampel sampai 20µl. Splitter dapat memasukkan sampel ke dalam kolom kapiler 0,05-0,0001 dan banyaknya sampel yang diinjeksikan. Untuk memasukkan sampel ke dalam kolom dapat digunakan automatic sampler. Keuntungannya dapat menghindari terjadinya gelembung udara dalam siring yang jika diinjeksikan adanya gelembung udara dapat menyebabkan kromatogram tidak sempurna, dapat mengurangi sisa sampel yang tertinggal, mengukur jumlah sampel lebih tepat, dapat menghasilkan kromatogram yang reprodusibel dan lebih presisi daripada jika dilakukan secara manual. Dengan alat ini juga dapat dilakukan pekerjaan lainnya sementara pemuatan sampel berlangsung. Detektor Fungsi detektor adalah mendeteksi komponen-komponen yang dipisahkan setelah melalui kolom. Berbagai macam detektor dapat digunakan, antara lain:


1.

Thermal conductivity detector (TCD) .- Disebut pula katharometer. Peralatannya terdiri atas sepasang benang logam yang membentuk suatu jembatan “Wheatstone”. Cara kerjanya berdasarkan ketergantungan kecepatan kehilangan panas bahan pada konduktivitas panasnya dan komposisi gas Iingkungannya. Kepekaan TCD tergantung pada perbedaan konduktivitas panas antara gas pembawa dalam keadaan murni dan gas pembawa yang telah digunakan untuk mengelusi kolom sehingga sudah mengandung

komponen-komponen

dan

sampel.

Makin

besar

perbedaannya makin besar pula sensitivitasnya. TCD jarang digunakan untuk keperluan analisis kuantitatif. Menghasilkan data yang reliabel, sensitivitasnya moderat (sedang) saja dan bervariasi untuk masing-masing komponen yang berbeda. Sensitivitas akan menjadi sangat besar jika digunakan gas hidrogen atau helium. Kelemahan TCD kepekaannya non-linear, berubah dengan perubahan suhu dan kecepatan aliran gas. 2.

Flame ionization detector (FID).- Prinsip kerja berdasarkan adanya hubungan bahwa konduktivitas elektris suatu gas secara Iangsung proposional dengan konsentrasi partikel (komponen) yang bermuatan yang terdapat di dalamnya . FID mempunyai sensitivitas yang sangat tinggi, reliabelitasnya juga tinggi, dapat digunakan untuk hampir semua komponen organik kecuali asam format, udara, dan gas-gas organik lainnya. Kepekaan FID untuk komponen-komponen organik proposional pada atom karbon yang teroksidasi, sehingga kalau tidak dicermati kadang-kadang menghasilkan interpretasi yang salah. FID tidak respon terhadap gugusgugus karbon yang teroksidasi seperti misalnya gugus karbonil dan karboksil. Juga tidak mempunyai respon terhadap eter, gugus halogen, gugus amin, gugus hidroksil, komponen inorganik yang berasal dan senyawa-senyawa tersebut yang mudah terionisasi pada api campuran udara

dan

hidrogen.

Terhadap

gas-gas

karbon

monooksida,

karbondioksida, karbondisuffida (CS2), sulfurdioksida (SO2), hidrogen sulfida (H2S), ammonia (NH3), NO2, NO, N2O, SiF4, dan SiC14, FID kurang menunjukkan sensitivitasnya sehingga hal ini sangat menguntungkan jika bahan-bahan organik runutan (trace) yang terdapat pada sampel dianalisis. Respon FID sangat dipengaruhi oleh kecepatan aliran gas pembawa, suhu pembakaran, perbedaan potensial gas pembawa, suhu pembakaran, dan


perbedaan potensial antara kutub-kutub elektroda. Suhu operasi FID ratarata berkisar antara 100-400oC. 3.

Electron capture detector (ECD).- Prinsip kerjanya berdasarkan perbedaan kemampuan molekul (komponen) dalam eluat untuk menangkap elektron yang dihasilkan oleh suatu elektroda radioaktif, yang mengakibatkan perubahan (penurunan) aliran listrik yang dapat diubah menjadi puncakpuncak kromatogram.

4.

Hidrogen flame detector (HFD) .- Hanya digunakan jika gas hidrogen sebagai gas pembawa (fase bergerak). Prinsip kerjanya mendeteksi perubahan warna gas hidrogen pada pembakaran. Dalam keadaan murni, pembakaran gas hidrogen tidak memberikan warna. Dalam keadaan mengandung

komponen,

pembakaran

gas

hidrogen

menghasilkan

perubahan warna, yang intensitasnya (tingginya nyala dan luminositas nyala)

tergantung

pada

konsentrasi

komponen.

Dengan

suatu

thermocouple dapat diukur suhu nyala atau dengan suatu sel foto dapat diukur kekuatan lumennya. Perlu dicatat bahwa detektor ini tidak sensitif terhadap komponen-komponen anorganik. 5.

Gas density detector (GDD).- Tidak begitu populer, tetapi mempunyai kelebihan tanpa memerlukan kalibrasi pada penggunaannya untuk analisis kuantatif. Prinsip kerjanya seperti TCD, yaitu mengalirkan gas pembawa melalui

suatu

benang

logam

sirkuit

yang

membentuk

jembatan

Wheatstone. Sensitifitas detektor proposional terhadap perbedaan densitas sedangkan respon merupakan fungsi linear dan konsentrasi komponen.

2-6 KROMATOGRAFI KOLOM TEKANAN TINGGX (HIGH PERFORMANCE LIQUID KROMATOGRAPHY, HPLC)

Kelemahan pada kromatografi kolom, baik yang partisi, adsorpsi, atau pun kromatografi gel, adalah waktu operasinya yang lama. Selain itu waktu yang lama dapat memberikan peluang kemungkinan terjadinya perubahan sifat pada komponen atau sampel. Dengan memberikan tekanan yang tinggi, maka aliran eluen melewati kolom dapat dipercepat sehingga waktu operasi dapat diperpendek. HPLC sangat fleksibel penggunaannya, dapat digunakan untuk memisahkan dan menganalisis hampir semua komponen atau senyawa dalam bahan. Berdasarkan tekanan yang tinggi yang dipergunakan pada HPLC, maka


seringkali

HPLC

diartikan

sebagai

kepanjangan

dan

high

pressure

chromatography. Tekanan yang digunakan pada HPLC dapat mencapai 5.000psi, bahkan beberapa alat dirancang menggunakan sampai 10.000psi. Oleh karena HPLC merupakan pengembangan dan kromatografI kolom, maka tergantung pada kolom digunakan HPLC dapat merupakan kromatografi kolom partisi, tografi kolom adsorpsi, kromatografi gel, kromatografi penukar ion Peralatan HPLC Peralatan HPLC dapat digambarkan secara skematik sebagai berikut.

Peralatan kromatografi tekanan tinggi (HPLC) Satu unit peralatan HPLC terdiri atas beberapa komponen, yaitu tangki penyedia pelarut fase bergerak freservoir), pompa tekanan tinggi, monitor tekanan, injector, kolom, detektor, dan kolektor. HPLC dioperasikan pada tekanan

tinggi,

rata-rata

8.000psi,

tetapi

beberapa

peralatan

HPLC

dioperasikan pada tekanan yang lebih besar lagi. . Tekanan yang dihasilkan oleh pompa harus dapat diamati, dan ini dilakukan dengan peralatan yang dapat memngendalikan (memonitor) secara langsung besarnya tekanan. Dengan adanya monitor tekanan, maka besarnya tekanan dapat dikendalikan. Berbeda dengan tempat pemuatan sampel yang digunakan pada kromatografI gas, pada HPLC tempat pemuatan sampelnya hams dapat tekanan yang tinggi sehingga semua sampel yang dapat masuk ke dalam kolom. Alat yang


digunakan untuk memasukkan sampel pada HPLC dilengkapi dengan katup injeksi. Alat demikian mempunyai dead volume nol dan dapat menahan tekanan sampai 5.000psi. Kolom untuk HPLC dikemas dalam tabung baja tahan karat atau bahan lain yang inert, dan tahan tekanan tinggi. Kolom ditempatkan di dalam ruang yang bersuhu tetap (konstan). Jenis kolom yang digunakan tergantung komponenkomponen yang dipisahkan, sistem kromatografi (pasangan ion, normal, sungsang), jenis kromatografi (partisi, adsorpsi, size exlusion, afinitas, penukar ion, dil.). Di dalam perdagangan dikenal berbagai macam kolom, misalnya LiChrosorb, LiChrospher, Perisorb, dan iain sebagainya. Untuk

mendeteksi

komponen

yang

memisah

digunakan

detektor.

Refraktometer merupakan detektor yang digunakan untuk menera pemisalan karbohidrat, sedangkan spektrofotometer (uv, uv-vis) merupakan detektor yang paling banyak digunakan untuk menera protein dan turunannya. Untuk keperluan ini panjang gelombang yang digunakan pada umumnya adalah 220nm, 254nm, atau 280nm. Detektor fluorometer digunakan untuk mendeteksi steroida, vitamin, nukleotida, amin. Kolektor atau penampung eluat digunakan untuk menampung eluat yang sudah melalui detektor. Beberapa peralatan lainya dapat digabungkan, misalnya alat pencatat data (recorder), pengontrol pompa dan pemrogram operasi. 2-7 KROMATOGRAFI KERTAS DAN LAPIS TIPIS

Peralatan Teknik kromatografi dapat dilakukan pada pelat yang dilapisi dengan bahan penyangga. Sebagai pelat dapat digunakan kertas, kaca, lembaran aluminium, atau fiberglass. Khusus jika kertas yang digunakan, maka kertas berfungsi ganda, yaitu sebagai pelat sekaligus sebagai bahan penyangga. Kertas merupakan selulosa yang dapat menyerap eluen sehingga sistem yang terjadi adalah partisi. Meski pun demikian peristiwa adsorpsi juga terjadi pada kromatografi kertas. Jenis kertas yang digunakan pada umumnya adalah kertas Whatman No. 4, 54, 540, 31, dan No. 17, atau jenis kertas lainnya yang semacam. Perlu diketahui bahwa kerapatan dan ketebalan kertas akan berpengaruh pada kecepatan aliran eluen, sehingga juga akan berpengaruh pada kesempurnaan pemisahan komponen-komponen. Ukuran kertas yang


umum digunakan adalah 20 x 20 cm atau 10 x 20 cm. Pada kromatografi lapis tipis, bahan penyangga dilapiskan pada pelat kaca, logam, atau fiberglass. Bahan penyangga dapat berupa oksida, oksida hidrat atau bentuk garam. Sebagai bahan penyangga yang populer digunakan pada kromatografi lapis tipis adalah golongan aluminium oksida, gel silika, kieselguhr, dan selulosa. Cara preparasinya adalah mula-mula dengan membuat sluri yaitu mencampur bahan penyangga dengan aquades. Setelah itu dengan alat khusus sluri dilapiskan pada permukaan pelat sehingga mempunyai ketebalan yang sama. Sebelum digunakan lapis tipis harus dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 120C selama 60 menit untuk aktivasi. Kini telah banyak lapis tipis yang diperjual belikan dalam keadaan siap untuk digunakan, baik yang dilapiskan pada pelat kaca, aluminium mau pun fiberglass. Gerakan dan pemisahan komponen juga tergantung pada jenis pelarut (eluen) yang diguriakan. Eluen dapat terdiri atas satu macam pelarut atau campuran dan dua atau lebih pelarut, tetapi makin banyak campuran pelarut akan sulit menjenuhkan lingkungan pelat. Juga perlu diingat bahwa campuran pelarut harus saling tidak melarutkan atau bersifat immisibel, tetapi sampel harus mempunyai kelarutan yang tinggi pada eluen. Eluen yang mudah menguap dan tidak meninggalkan noda pada kertas pada umumnya lebih baik digunakan. Contoh beberapa pelarut yang sering digunakan pada kromatografi kertas dan lapis tipis adalah: 1. Untuk pemisahan asam amino digunakan pelarut campuran fenol dan air (larutan jenuh), campuran n-butanol, asam cuka dan air (4: 1 :5 atau 12:3:5), campuran n-butanol, piridin dan air (1:1:1). 2. Untuk pemisahan golongan karbohidrat digunakan pelarut campuran dan etilasetat, piridin, dan air (2 : 1 :2), campuran etilasetat, propanol dan air (6: 1:3), campuran etilasetat, asam cuka dan air (3:1:3). 3. Untuk pemisahan asam lemak digunakan campuran n-butanol dan larutan 1 ,5M ammonia (larutan jenuh). Pemuatan Sampel Sampel sebelum diaplikasikan pada kertas atau lapis tipis harus dibuat larutan dahulu. Larutan sampel kemudian diteteskan pada kertas atau lapis tipis pada salah satu tepinya dengan jarak kurang lebih 2, 5 cm dan tepi. Tetesan sampel diusahakan sekecil mungkin, maka sebaiknya menggunakan pipa kapiler, pipet


mikro, atau siring (spet, jarum suntik berukuran mikro). Sebelum dielusi tetesan sampel dikering anginkan, jika perlu dapat dikerjakan dengan menghembuskan udara dengan kipas angin atau alat pengering rambut (hair drier). Yang perlu dijaga adalah selama pengeringan tidak terjadi perubahan sifat sampel, oleh karena itu sebaiknya pengeringan dilakukan pada suhu kamar. Teknik Elusi (Pengembangan) Ada tiga macam teknik elusi, yaitu pengembangan secara ascending, descending, dan radial atau horizontal. Teknik ascending merupakan cara yang paling sederhana. Kertas atau lapis tipis sesudah diberi sampel, tepinya setinggi kurang lebih 2,5cm dicelupkan pada eluen yang ditempatkan di dalam bejana. Eluen akan meresap pada kertas atau bahan penyangga dan bergerak naik secara kapileri sampai pada ketinggian yang dikehendaki. Teknik descending merupakan kebalikan dari teknik ascending. Eluen dialirkan dari tepi kertas bagian atas dimana sampel diaplikasikan. Eluen akan bergerak mengalir (meresap) ke bawah melalui kertas atau bahan penyangga secara perlahan-lahan sampai batas yang dikehendaki. Jika dibanding dengan teknik ascending, maka teknik descending lebih cepat elusinya oleh karena faktor gravitasi berpengaruh pada kecepatan aliran eluen dan gerakan komponen yang memisah. Ada satu hal yang perlu mendapat perhatian pada teknik descending, yaitu cara mengalirkan eluen dan atas ke bawah. ini dapat ditempuh dengan menghubungkan kertas atau lapis tipis dengan kertas saring yang dicelupkan pada tangki atau bejana penyedia eluen. Pada teknik radial atau horizontal, sampel diteteskan di sekitar pusat kertas atau lapis tipis. Eluen dialirkan tepat melalui tengah-tengah kertas sehingga peresapan atau gerakan eluen akan menyebar ke arah radial.


Ada pun metoda pengembangannya ada dua cara, yaitu metode satu arah (one way direction) dan metoda dua arah (two ways direction). Pada metoda satu arah, kertas atau lapis tipis dikembangkan melalui satu sisinya di mana sampel dimuatkan. Sedangkan pada metoda dua arah, kertas atau lapis tipis yang telah dikembangkan, dilakukan pengembangan sekali lagi melalui tepi siku-siku kertas atau lapis tipis (lihat gambar).

Metoda pengembangan

Metoda pengembangan

satu arah

dua arah


Pengembangan dikerjakan di dalam suatu tangki atau bejana dan kaca sepaya tampak dan luar, dan ditutup sehingga ruang di dalam tangki akan jenuh dengan uap eluen. Kejenuhan ruangan termasuk faktor keberhasilan pemisahan. Visualisasi Hasil Setelah perrnukaan eluen mencapai batas yang ditentukan, kertas atau lapis tipis diambil (diangkat) dan dikeluarkan dari dalam tangki, kemudian dikeringkan pada suhu kamar sampai semua eluen menguap. Tempat komponen yang memisah dapat diketahui dengan visualisasi. Ada beberapa teknik visualisasi yang dapat dikerjakan tergantung pada jenis dan sifat komponen yang dipisahkan. Visualisasi secara fisik dapat dilakukan dengan sinar ultra violet atau dengan pengeringan pada suhu tinggi. Visualisasi dengan penyinaran atau dengan pengeringan menyebabkan timbulnya warna pada komponen. Aflatoksin misalnya akan tampak bersinar putih kehijauan dengan sinar ultra violet. Visualisasi dapat pula secara kimiawi yang dapat dilakukan dengan nyemprotkan suatu larutan atau senyawa yang dapat mengadakan reaksi dengan komponen sehingga timbul wama. Kombinasi visualisasi secara kimiawi dan secara fisik sering kali juga dilakukan, misalnya pada suhu 100oC, maka warna ungu akan timbul. Tabel 3. Reagent kromogenat untuk visualisasi kromatogram pada teknik kromatografi kertas dan lapis tipis


Interpretasi Secara kualitataif dapat dilakukan dengan menghitung faktor retardasinya. Rf diekspresikan sebagai rasio jarak tempuh solut dan jarak tempuh larutan pengelusi pada kertas atau lapis tipis, yaitu:

Untuk mengetahui jenis komponen yang memisah, Rf sampel dicocokan gan Rf standar yang dielusi dengan cara yang sama. Interpretasi secara kuantitatif dilakukan untuk mengetahui jumlah masingmasing komponen yang memisah. Hal ini dapat dilakukan dengan mengukur atau menghitung luas noda yang terbentuk, menimbang potongan masingmasing noda, menganalisis potongan noda secara kimiawi.

2-8 LATIKAN PEMAHAMAN MATERI KROMATOGRAFI 1.

Urutkan senyawa-senyawa organik tersebut di bawah ini berdasarkan polaritasnya! a.

Karbohidrat : fruktosa, glukosa, laktosa, sukriosa, amiosa, manosa, triosa, selulosa, galaktosa, ribosa.

b.

Asam amino: sistein, tirosin, lisin, glism, arginin, glutamin.

c.

Protein : insulin, tripsin, aktin, albumin, pepsin, amilase, hemoglobin, kasein, ovomukosin, glisinin.

d.

Lipida : asam linoleat, asam oleat, asam butirat, kolesterol, asam arakhidat, asam kaprat, /3-karoten, r-karoten asam asetat.

2.

Apa bedanya kromatografi adsorpsi dan kromatografi partisi!

3.

Operasi kromatografi kolom dan suatu solut menghasilkan satu puncak kromatogram dengan waktu retensi 50 menit. Berapakah banyaknya lapisan

teoritis

pada

sistem

tersebut

kromatografi

tersebut,

jika

kromatogram yang terjadi berbentuk simetris dengan lebar dasar 5 menit? 4.

Jika larutan sampel dielusikan pada suatu kolom menghasilkan tiga puncak kromatogram dengan waktu retensi masing-masing 20 menit, 24 menit, dan 30 menit, dengan lebar dasar masing-masing 1 menit, 2 menit, dan 5 menit, sedangkan responnya adalah 2,4, 1,9 dan 2,8.


a. Gambarkan perkiraan kromatogramnya! b. Hitung banyaknya lapisan teoritis! c. Interpretasikan efesiensi kolom? 5.

Hitung EPT pada soal no. 3, jika panjang kolom 1 m dan diameternya 2,5cm!

6.

Kromatografi terhadap glukosa dan fruktosa menghasilkan waktu retensi 1,5 menit dan 2,5 menit dengan lebar dasar 0,5 menit pada suatu kolom dengan lapisan teoritis 4000. a.

Berapakah resolusinya jika suatu sampel mengandung kedua komponen tersebut?

b.

Anggap bahwa waktu retensi tidak berubah. Hitung banyaknya lapisan teoritis yang diperlukan untuk menghasilkan resolusi sebesar 1,0!

7.

Konstanta Van Deemter untuk suatu kolom dengan 4000 pelat teoritis yang dioperasikan pada suhu 150°C diketahui A=0,O8cm, B=0, 15cm2/detik, dan C=0,03 detik. Berapakah kecepatan aliran fase bergerak pada sistem kromatografi ? Berapakah nilai minimum ekivalensi pelat teoritis?

8.

Jelaskan faktor-faktor yang diperlukan untuk menghasilkan kromatografi yang ideal ! Mengapa dalam praktek sulit diperoleh kondisi tersebut?

9.

Dua senyawa A dan B mempunyai koefisien distribusi masing-masing 4,9 dan 4,6 pada suatu kolom. Senyawa yang mana terelusi terlebih dahulu jika dipisahkan dengan sistem kromatografi tersebut ? Jelaskan mengapa demikian!

10. Mengapa dapat terjadi tailing dan fronting pada kromatogram dan bagaimana cara mengatasinya? 11. Sampel biji legum dengan kandungan lemak 4% dipreparasi untuk dikaji komposisi asam lemaknya. Dan 0,5ml lemak yang diaplikasikan pada kromatografi kolom partisi diperoleh delapan puncak yang diperkirakan terdiri atas asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh. Berikut disampaikan data kromatografi. Hitung komposisi relatif dan komposisi sesungguhnya dan masing-masing komponen!


12. Jelaskan cara-cara yang dapat digunakan untuk mengelusi suatu kolom kromatografi! 13. Desain suatu kromatografi kolom untuk memisahkan karbohidrat dengan menggunakan fase diam etanadiol monoetileter dan fase bergerak propana. 14. Komponen fenol dan daun teh dipisahkan dengan kromatografi kolom partisi dengan menggunakan fase diam air, fase bergerak campuran metanol, n-butanol, dan kloroform, dengan matrik bubuk selulosa. Terangkan jenis fenol yang dapat dipisahkan dan gambarkan perkiraan kromatogramnya jika kandungan semua jenis fenol sama. 15. Kromatografi gel (kolom) digunakan untuk menera berat molekul peptidapept.ida yang diperoleh dan proses hidrolisis protein. Kolom apa saja yang dapat digunakan ? Bagaimana operasional teknik analisisnya? 16. Apa saja persyaratan yang diperlukan sebagai bahan penyangga yang digunakan pada kromatografi gas? 17. Bagaimana teknik elusi pada HPLC dan kromatografi lapis tipis? 18. Berikut adalah kromatogram standar asam amino penyusun protein yang dikromatografi dengan HPLC sistem fase normal. Anda diminta untuk membaca dan menginterpretasikan kromatogram tersebut!


Kondisi kromatografi : kolom Zorbax HN2 (250x4,6mm I.D.), fase bergerak 10mM kalium fosfat pH 4,3 (A) dan avetonitril-air 50:7 v/v (B), kecepatan 2m1/menit, suhu 35°C. 1. PHE, 2. LEU, 3. ISO, 4. MET, 5. TYR, 6. VAL, 7. PRO, 8. ALA, 9. HYDROXYPROLIN, 10. THR, 11, GLY, 12. SER, 13. HIS, 14. CYS, 15. ARO, 16. LYS, 17. HYDROXYLYSINE, 18. GLU, 19. ASP. 19. Terangkan “ step by step” bagaimana memisahkan golongan karbohidrat (glukosa, fruktosa, dil.) dengan menggunakan teknik kromatografi lapis tipis.


2-1 KONSEP KROMATOGRAFI

Recommend Documents