Introductie van typeringsmethoden
Klassificatie
Identificatie Typering
cursus Breda 2008
1
3 Domeinen
cursus Breda 2008
2
Taxonomie Domein, Familie, Genus, Species, Subspecies, Stam
Klassificatie
identificatie
typering
Voorbeeld: Domein: Bacteriën Familie/Phylum: Firmicuta (gram positieven) Genus: Staphylococcus Species: aureus Stam: toevoeging aan naam (Staphylococcus aureus mu50) cursus Breda 2008
3
Bij identificatie en typering worden mbv verschillende laboratorium technieken verschillen en overeenkomsten
tussen micro organismen bepaald
cursus Breda 2008
4
Moleculaire typering van microorganismen
•
Detecteren van identieke stammen
•
Determinatie van micro-organismen
•
Detecteren van antibioticum resistentie genen en/of virulentie factoren
•
Detecteren van overdracht van mobiele elementen
cursus Breda 2008
5
Strain characteristics
Mutations Recombinations Vertical transfer of genes
Horizontal transfer of genes
Some general definitions Mutation A heritable change in the sequence of nucleotides in DNA Mutation rate Bacteria: 1 in 106-107 to 1010-1011 Types of mutations Point mutations (transitions/transversions) Insertions (tandem)duplication Inversion Deletions
Effect of mutations
What’s the risk for typing?
Effect mutatie frequentie is species afhankelijk Intrinsieke variatie in species: Enterococcen, Salmonella, Neisseria Dit leidt tot een biologische variatie binnen dezelfde stam Diepte van typeringsmethode: hoe nauwkeuriger hoe meer verschillen
Aanpassing typeringstechniek door focus op stabiele genen (bijv. MLST)
De bacteriële cel
cursus Breda 2008
11
componenten
cursus Breda 2008
12
Typeringsmethoden Fenotypisch Biotypering Antibiogram typering Serotypering Faag typering Bacteriocine typering Eiwit profilering Multilocus isoenzyme electrophorese (MLEE) Biochemische Karakterisatie (Massa/Raman-)Spectrometrie
Genotypisch Non-amplificatie gebaseerd Amplificatie gebaseerd
cursus Breda 2008
13
Eiwit analyse
Seifert et al.
Cell envelope protein profiles of 20 Acinetobacter isolates
cursus Breda 2008
14
Genotypisch typeren
Fenotypisch typeren
cursus Breda 2008
15
Genotypische methoden Non-amplificatie gebaseerd: DNA-DNA reassociatie DNA sequencing Restrictie Fragment Lengte Polymorfisme (RFLP) Pulse Field Gel Electroforese (PFGE) Optical Mapping
cursus Breda 2008
16
Genotypische methoden Amplificatie gebaseerd 16S rDNA sequencing (identificatie) Multi Locus Sequence Typering (MLST) PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Arbitrarily Primed PCR (APPCR) Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Inter tRNA Sequence-PCR (ITS-PCR, tRNA) Inter 16S-23S rRNA-sequences
rep-PCR, MLVA, SNP
etc. etc. etc...........NGS....
cursus Breda 2008
17
Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Proteinase K Restriction enzymes
Agarose embedded bacteria with enzymes PFGE profile Fragment separation Embedded digested bacteria placed in agarose gel wells Electric Pulse Field separation
cursus Breda 2008
18
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Chromosomal DNA
Digestion with restriction enzymes
several enzymes several probes Fragment separation
Probe hybridisation Southern blot
Agarose gel
Nitrocellulose paper
Restriction analysis Most non-amplification based techniques rely on DNA digestion with restriction enzymes Enzymes recognize (palindromic) stretch of nucleotides: TAAT: MseI GAATTC : EcoRI GGGCCC: ApaI
decreasing frequency of digestion
increasing number of fragments
In general: Restriction fragment analysis has a high discriminatory power
RAPD Random amplified polymorphic DNA
CARRIED OUT WITH ONLY ONE PRIMER
Amplification at low annealings temperature with one primer
RAPD profile
Agarose gel separation
Quick & Dirty cursus Breda 2008
21
PCR-RFLP/ARDRA/ITS-PCR Specific amplification of one or more genes ARDRA profile PCR fragment
Digestion of PCR fragment with restriction enzyme(s)
Fragment separation in (agarose) gelmatrix
rep-PCR Geconserveerde repetitieve elementen BOX, ERIC, REP
verspreid aanwezig bij de meeste bacteriën
Stringente vermenigvuldiging van specifieke chromosomale regios
rep-PCR profile
(agarose) Gelelectrophorese cursus Breda 2008 Geautomatiseerd systeem: Diversilab
23
Example of a complete rep-PCR analysis 20
40
60
80
100
BOX
ERIC
REP
? 14 14 14 14 9 9 2 2 13 13 13 13 5 5 5 5 5 5 1 1 1 1 19 19 19 19 4 4 4 4 11 11 11 11 11 11 10 10 10 10 10 10 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 20 20 20 20 17 17 17 17
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) CHROMOSOMAAL DNA SIMULTANE knip en plak (restrictie & ligatie) AATTC G
G CTTAA
AATTC G
T AAT
CTCGTAGACTGCGTACCAATTC CATCTGACGCATGGTTAAG
T AAT
TAA T
TTACTCAGGACTCAT AATGAGTCCTGAGTAGCAG STRINGENTE AMPLIFICATIE TTACTCAGGACTCAT AATGAGTCCTGAGTAG
CTCGTAGACTGCGTACCAATTC GACTGCGTACCAATTC CATCTGACGCATGGTTAAG
AATGAGTCCTGAGTAGCAG PAGE
cursus Breda 2008
25
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) In fact a combination of RFLP & rep-PCR: restriction analysis combined with specific amplification
Presently there are several variations on the method Two main variations: High frequent-medium frequent DNA digestion on PAGE Medium frequent DNA digestion on agarose Selection of fragments analyzed on PAGE All fragments analyzed on Agarose Vos, et.al. NAR 1995
40 50 60 70 80 90
100
500bp
400bp
300bp
200bp
100bp 50bp
S. capitis S. capitis S. capitis S. capitis S. capitis S. capitis
S. capitis
S. capitis S. cap(ref S. cap(ref
S. aureus
S.aureus S. aureus
S. warneri
S. warneri S. epiderm
S. epidermidis
S. epiderm S. epiderm
S. haemolyticus
S. haemo
Example AFLP result
Agarose AFLP Chromosomal DNA
Digestion & ligation
One or more enzymes can be used Each enzyme with specific adaptor Fragments can be isolated from gel No expensive platform needed All fragments are amplified
Specific PCR amplification
Fragment separation
DNA sequencing MLST (Multi locus sequence typing) Specifieke vermenigvuldiging van delen van meerdere genen Primer labeling of ddNTP labeling primer
PCR reactie 1 3’
A C T G C T A C G T T
5’
dNTP dNTP dNTP dNTP + + + + ddATP ddTTP ddCTP ddGTP
PCR reactie 2
Verschillende huishoudgenen als evolutionaire klok Neisseria meningitidis: abcZ, adk, aroE, gdh, mtg, pdhC, pgm, pilA, pip, ppk, serC
cursus Breda 2008
A A C G T A G C A G T
3’
TGACGATGCAA TGACGATGCA
TGACGATGC TGACGATG TGACGAT TGACGA TGACG
TGAC TGA TG
5’
T
29
S. aureus specifieke typering: Proteïne A (Spa)
cursus Breda 2008
30
MLVA
Specifieke vermenigvuldiging van een of meerdere repeterende stukjes DNA Aantal repeats: 1,2,3,etc aantoonbaar Het aantal repeats bepaalt de uitslag PCR reactie 1
4
PCR reactie 2
2 Bijvoorbeeld: 1 2 5 7 2 4 6 8
1
Lengte van PCR product hangt af van aantal repeats en is stam specifiek cursus Breda 2008
31
Genus Species Subspec. Strain DNA-DNA reassociation
Speed Ease Platf. Typ. Flex. € >>24h
16S rDNA sequencing
24h
RAPD
8h
PFGE
-
n.a.
n.a./I
H
+
S
D/I
H
+++
A
C/T
H
48h
++
A
D/IT
H
Diversilab (rep-PCR)
24h
+++
A
D/T
SS
AFLP
24h
+++
A/S
DC/IT
H
MLST
48h
++
S
D/IT
SS
MLVA
24h
+++
A/S
D/T
SS
Raman Spectrometry
48h
+++
n.a.
D/IT
SS
Optical mapping
48h
+
n.a.
D/IT
H
SNP analyse
24h
+
S
DT
SS
Pathotypering Aantonen specifieke genen (bijv. resistentie of virulentie)
Aantonen overdracht mechanisme (bijv. integronen,plasmiden) Aantonen puntmutatie (bijv. ESBL genen)
cursus Breda 2008
33
Specifieke genen: toxinen, resistentie, epidemiologische markers
Mobiele fragmenten: Transposons, Integronen, Plasmiden, insertie elementen
Technieken: MLPA (checkpoints), sequencing, SNP, smeltcurve, Microarray Ook integratie in andere methoden: mecA in MLVA
Smeltcurve analyse PCR resultaat
INcI1
FIB
Diverse plasmiden: IncI1, Col E, FIB, FIC, etc. =22
SNP Single Nucleotide Polymorphism(s)
Mostly used in human genetics for:
- Allelic discrimination (homo/heterozyg.) - Point mutation detection (BRCA1/2)
Microbiological SNP applications -Microbiology: Antibiotic resistance (point mutations) ESBL genes e.g. (not checkpoint system) -Strain typing (stable SNPs) Advantages: - applicable on clinical samples - useful for non-cultivable strains
E.g. Coxiella burnetii
SNP 2011
38
SNP analyse
Twee amplificatie primers met twee probes Elke probe gelabeld met verschillend fluorofoor Punt mutatie in het midden van de probe Eindpunt meting Signaal verhouding bepaald conclusie
SNP 2011
40
SNP 2011
42
SNP techniques Real Time PCR (probe differences) Pyrosequencing SNaPshot analysis Mass spectrometry (MALDI-TOF)
Rolling circle DNA Micro-array MLPA (checkpoints)
Enkele toevoegingen -Spoligotyping: Discrimination between M.tuberculosis strains
-Riboprinter: Combination of ARDRA & ITS-PCR
- rep-PCR vs REP-PCR
SMT 2013
45
Terminologie Typeerbaarheid (Typeability): de bruikbaarbaarheid van een methode om tot een type aanduiding te leiden (= % typeerbare stammen) Onderscheidend vermogen (Discriminatory power): de resolutie van de methoden om onafhankelijke stammen te onderscheiden Overeenkomst met andere typeermethoden (Concordance): de mate van overeenkomst met epidemiologische waarnemingen Reproduceerbaarheid (Reproducibility): reproduceerbaarheid van de methode onafhankelijk van de tijd.
Toepasbaarheid (Flexibility): het aantal verschillende species dat met de methode getypeerd kan worden
SMT 2013
46
Wanneer gebruik je nu welke methode?
-Afhankelijk van vraagstelling -Waar ligt de prioriteit: Snelheid? Nauwkeurigheid? -Flexibiliteit? - Typeerbaarheid?
Niveau van identificatie/typering Mondiaal Continentaal (Europees) Nationaal Regionaal Lokaal (Ziekenhuis)
Juiste techniek hangt af van niveau cursus Breda 2008
47
Palleroni (1983): “In spite of all the progress, the concept of bacterial species still remains as elusive as ever”
