Kérdések és megoldások Immunhisztokémiai eljárások. Az eredmények interpretálása. Kerekasztal moderátor
Péter Ilona
Dako Workshop A Frank Diagnosztika Kft. és az Országos Onkológiai Intézet szervezésében Budapest 2013. december 6.
Immunhisztokémia / Immuncitokémia módszer a szövetekben vagy sejtekben fellelhető antigének kimutatása specifikus antigén-antitest felismerés útján
Immunhisztokémia indikációk a mindennapi daganat diagnosztikában • • • • • •
eredet meghatározása fenotípus biológiai viselkedés proliferációs készség jellemzése terápiás célpont kimutatása kórokozók kimutatása
Immunhisztokémiai eljárások A bemutatásra kerülő esetek feldolgozása Módszerek: • Rutin szövettani feldolgozás /Hematoxilin-Eosin festés/ • Immunhisztokémia: Indirekt envision detektáló rendszer (Dako A/S) Ventana Immunhisztokémiai festő automata készülék
Vizsgált antigének: calcitonin, CD10, CD20, CD56, CD99 chromogranin, E-cadherin, estrogén receptor (ER) HER2(c-erbB-2/neu), Helicobacter pylori, Ki67 (MIB1), MDM2, Melan-A, p53 protein, progesteron receptor (PR), S100
Immunhisztokémiai reagensek elvárások a mindennapi gyakorlatban
Antitestek • specificitása
→ 100%
• szenzitivitása
→ 100 %
Lehetőségek / Korlátok
Eredet meghatározása Szövetspecifikus antigén kimutatása Elsődleges daganat TTF-1 • pajzsmirigy szövet • tüdő szövet • egyes endokrin daganatok Thyreoglobulin, Prostata specifikus antigén TG
TTF-1
Áttét
?
MIB-1
Pajzsmirigy, hyalinizáló trabeculáris tumor
TPO
TTF1
TG
Csontvelő, pajzsmirigyrák áttéte
Bőr, soliter neurofibroma (Meissner test)
S100
CD68
Nyelvgyök, invaziv laphámrák és nyirokcsomóba adott áttéte
CK/AE1/AE3
Nyirokcsomóban melanoma malignum áttéte
MelanA
Fenotípus Daganat differenciáldiagnosztika •Immunpanel értelme •Algoritmusok helye a diagnosztikában Áttéti / Ismeretlen eredetű daganatok (CK; S100; LCA; Vimentin) (CK7-CK20)
CD10 expresszió jelentősége CD10 100 kDa transzmembrán protein Expresszálódik ép nyiroktüszőben (centrocyta) az éretlen T és B precursor sejtekben (eltűnik a sejtek érési folyamata során) a precursor B sejt eredetű acut lymphoblastos leukémiában (ALL) T sejtes ALL–ban is megjelenhet érett B sejtes leukémiában, beleértve myeloma multiplexben is lymphomákban vese glomerulus és tubulus sejtjeiben fibroblastokban epe canaliculusokban endometrialis stroma sejtjeiben
CD10
Ép nyiroktüsző
Világossejtes veserák
CD10
CD10 pozitív endometrialis cystadenofibroma borderline komponenssel
CD10
ER
Ki67
• endometriumban pozitív: stromalis sejt • endometrialis cystadenofibromában pozitív: stroma sejt és morula hámsejt Toki T és mtsai: CD10 is a marker for normal and neoplastic endometrial stromal cells. Int J Gynecol Pathol. 2002; 21:41-47.
Biológiai viselkedés
p53 oncoprotein (DO7 klón) A vad és a mutáns típusú p53 proteinnel reagál pozitív sejtek aránya / reakció intenzitása: clonalis expresszió → malignitás
Bőr, basalioma p53
fokális, szórványos expresszió → regeneráció p53
Pajzsmirigy, follicularis carcinoma
TTF1
Proliferációs készség Mitózis szám / Ki67 / DNS tartalom Ki67 (MIB-1) A Ki67 antigén nagy nuclearis protein (345, 395 kDa) • a sejt ciklus aktív fázisaiban (G1, S, G2 és M fázisban) expresszálódik, • a nyugvó sejtekben (G0 fázisban) nem mutatható ki. A szövettani diagnosztikában és a sejtbiológiai vizsgálatokban a normál és daganatos sejtek növekedési frakciói monitorozhatók.
Proliferációs készség Mitózis szám / Ki67 / DNS tartalom Ép nyiroktüsző
nuclearis expresszió > proliferációs aktivitás jele Ki67 (MIB-1)
membránhoz kötött reakció > pajzsmirigy, hyalinizáló trabecularis tumor Ki67 (MIB-1)
Ranjbari N és mtsa: The Ki-67/MIB-1 index level and recurrence of papillary thyroid carcinoma. Med Hypothesis 2013; 80: 311-314. Hirokawa M, Carney JA: Cell membrane and cytoplasmic staining for MIB-1 in hyalinizing trabecular adenoma of the thyroid gland. Am J Surg Pathol 2000; 24:575-578
CD56 (123C3 klón) expresszió jellemzői Kimutatható • a természetes ölő sejtekben (NK) • a perifériás vérben keringő CD4+ és CD8+ T sejtekben • neuroblastoma,
• kis sejtes tüdőrák, • pajzsmirigy normál folliculus hám, adenoma, follicularis rák sejtjeiben, Pajzsmirigy, follicularis rák
CD56 CD56
Vékonybél, plexus, glia sejtek
A szokásos papillaris rákban általában nem expresszálódik Demellawy DE és mtsai: Application of CD56, p63, CK19 in immunohistochemistry in the diagnosis of papillary carcinoma of the thyroid. Diagn Pathol. 2008;3:5-17.
Terápiás célpont kimutatása Emlő tumorokban A jelenleg elérhető célzott terápiás kezelések célpontjai • hormonreceptorok: ER, PR • EGFR/HER 2
ER
PR
HER-2
Mihály Zs és mtsa: HER2-pozitív emlőtumorok célzott terápiájában alkalmazott szerek és a terápiás válasz előrejelzése. Magyar Onkológia; 2013; 57: 147-156. Dank M és mtsa: Monoklonális antitest-terápia emlőrákban. Magyar Onkológia2013; 57 157-165.
ER/PR % meghatározása Quick vagy Allred pontrendszer pozitivitás szemiquantitatív meghatározásához pozitív daganatsejtek aránya
/
reakció intenzitása
pontszám
pontszám
0%
0
Negatív reakció
0
<1 %
1
Enyhe reakció
1
1-10 %
2
Közepes intenzitású reakció
2
11-33 %
3
Kifejezett intenzitású reakció
3
34-66 %
4
67-100 %
5
az együttes pontszám 0 és 8 közötti lehet, 3 alatt negatívnak lehet tartani a daganatokat (emlő) klinikai jelentősége: prognosztikai és prediktív (hormonkezelés) faktor Allred DC, Harvey JM és mtsai: Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis. Mod Pathol 1998; 11:155-168. Yamashita, H., Ando Y, és mtsai: Immunohistochemical evaluation of hormone receptor status for predicting response to endocrine therapy in metastatic breast cancer. Breast Cancer 2006;13:74-83.
E-Cadherin
ER Emlő, invaziv ductalis carcinoma
PR
Immunhisztokémiai HER2 expresszió értékelése pozitív sejtek aránya (%) / reakció intenzitása (+/0) cut-off érték klinikai jelentősége: prediktív (target terápia)
Emlő, invaziv ductalis carcinoma
HER-2
HER2 immunhisztokémiai vizsgálatának
értékelése 3+
komplett erős intenzitású membránfestődés a sejtek >30 %-ában 2+ komplett közepes intenzitású membránfestődés a sejtek>10%-ában, illetve komplett erős membránfestődés a sejtek >10%-ában, de kevesebb, mint 30 %-ában 1+ komplett gyenge membránfestődés a sejtek >10 %-ában 0 <10%-ban észlelt pozitívitás, inkomplett festődés, vagy a festődés hiánya Az emlőrák patológiai diagnosztikája, feldolgozása és kórszövettani leletezése (2009) Cserni Gábor és mtsai II. Emlőrák Konszenzus; 2009, Kecskemét
Immunhisztokémiai HER2 expresszió értékelése pozitív sejtek aránya (%) / reakció intenzitása (+/0) cut-off érték klinikai jelentősége: prediktív (target terápia)
Emlő, invaziv ductalis carcinoma
HER-2
Immunhisztokémia eredmények értékelése pozitív vagy negatív reakció * qualitativ értékelés * becsült vagy mérésen alapuló %-os arány meghatározása (guideline, nyomvezető segítségével) specifikus vagy nem specifikus reakció
Immunhisztokémia Hibalehetőségek keresése
Nem specifikus pozitív festődés és háttérfestődés Ajánlás: Csökkenteni kell az elsődleges és /vagy másodlagos antitest koncentrációját
Malignus kis kereksejtes tumor, core biopszia
CD99
Immunhisztokémia Hibalehetőségek keresése Nincs jel Antitest szintjén Antitest kompatibilitás:
Ajánlás Koncentráció növelése; Elsődleges és / vagy másodlagos antitest inkubációs idő növelése; Ellenőrizni kell, hogy az elsődleges és a másodlagos antitestek kompatibilisek-e.
Szövetek fixálása: Túlfixált a preparatum! Elégtelen fixáláskor: a preparatum szélén éles sötét csík jelenik meg, a közepe nem festődik. Nem megfelelő permeabilitási körülmények!
0,5-1,0% Triton detergens a pufferben oldva segítheti az antitest szövetbe jutását.
Emlő, invaziv ductalis carcinoma ER
excisio
ER
core biopszia
Emlő, invaziv ductalis carcinoma
ER, ismételt reakció ER, hamis negatív
ER + kontroll
Rhabdomyosarcoma/dedifferenciált liposarcoma, core biopszia
CD99
MDM2
CT
Pajzsmirigy, medulláris carcinoma
CT
CT
Natív
Oxálsav, más néven: sóskasav, etán-disav. Képlete: HOOC-COOH
Chr-A
HP Gyomor biopszia, Helicobacter pylori kimutatása, immunhisztokémiai módszerrel
HP
HP
Összefoglalás Az immunhisztokémiai reakciók eredményének értékelése és interpretálása: • mi volt az eredeti kérdésfeltevés a reakció elvégzése előtt; • a várható pozitív vagy negatív eredményt kaptuk-e; • az immunhisztokémiai reakció minősége az elvártaknak megfelel-e, ha nem, meg kell keresni a hiba forrását; • A hamis pozitív és hamis negatív reakciók kiszűrése az immunhisztokémiai laboratóriumban minden reakciónál: pozitív és negatív kontrollok, belső szöveti kontrollok biztosítása és külső intézetekkel kontroll lehetőség kialakítása.
Összefoglalás, folytatás Az immunhisztokémiai reakciók értékelésekor a szokásostól eltérő eredmény interpretálásohoz, ha technikai hiba nem áll fenn a
szakirodalom további gondos átnézése indokolt, − a még nem ismert újabb adatok felkutatása, − a helyes diagnózis felállítása céljából.
Köszönöm a figyelmet!
