KARAKTERISATIE VAN BEENMERG-AFGELEIDE CANIENE MESENCHYMALE STAMCELLEN UIT DE TIBIA

VRIJWARINGSCLAUSULE

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 - 2015

KARAKTERISATIE VAN BEENMERG-AFGELEIDE CANIENE MESENCHYMALE STAMCELLEN UIT DE TIBIA door

Francis COMBES

Promotoren: Prof. Dr. Evelyne Meyer Dr. Evelien de Bakker Dr. Catharina De Schauwer

Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef © 2015 Francis Combes

DANKWOORD Deze thesis kon nooit worden uitgevoerd zonder de hulp van enkele mensen. Eerst en vooral had ik graag mijn promotoren bedankt voor de kans die ze me gegeven hebben om dit fascinerende onderzoeksveld te leren kennen. Hun ervaring en wijze inzichten waren essentieel om de focus van deze thesis niet uit het oog te verliezen. Ook de vele hulp van Kristel Demeyere had ik hier graag in de verf gezet. Om mijn volledige appreciatie te uiten aan Kristel, zou deze hele pagina kunnen gevuld worden, maar ik hou het kort. Bedankt voor zowel de administratieve als de praktische hulp in het labo.

Bedankt

voor

de

leerrijke

initiatie

in

de

flow

cytometrie

en

de

vliegensvlugge

concentratieberekeningen tijdens de voorbereidende stappen. Eveneens bedankt voor de aangename babbels tussendoor. Zonder Kristel was deze thesis onmogelijk. Aan de andere kant van de faculteit had ik graag alle mensen op de dienst Orthopedie bedankt. In het bijzonder de gebroeders Yves en Stijn Samoy. Heel erg bedankt voor de vlotte samenwerking tijdens de prelevaties van de stamcellen. Ook Professor Van Ryssen wordt bedankt voor haar goede opmerkingen en motivationele ondersteuning in het project. Er werd eveneens veel werk verricht op de dienst Voortplanting en Verloskunde. Daar had ik graag Petra Van Damme en Isabel Lemahieu hartelijk bedankt voor de bereiding van de vele soorten cultuurmedia, de goede raad tussendoor en de vriendelijke ontvangst. In die context mag Michiel de Keyser niet worden vergeten. Bedankt voor het gebruik van de stamcellen uit perifeer bloed en de leuke conversaties tijdens de mediaverversingen. Ook bedankt aan Jurgen De Craene en Yasmine Vanhevel voor de expertise wat betreft de histologische kleuringen op de dienst Morfologie. Hiernaast ook mijn uiting van appreciatie voor Johan en Suze. De studie Diergeneeskunde aan de UGent heeft mijn zicht op de wereld enorm verruimd. De ongelooflijke hulp die jullie hebben geboden op het thuisfront is allesbehalve evident te noemen. Jullie weten dat mijn studie, en bijgevolg deze thesis, zonder jullie niet had plaatsgevonden. Mijn oprechte dank daarvoor. Tot slot mijn eindeloze dank aan Stefanie. De onvoorwaardelijke steun die je me gaf tijdens deze nieuwe wending in mijn leven kan niet met genoeg woorden worden omschreven.

Inhoud ABSTRACT ................................................................................................................................................ 1 1. INLEIDING ....................................................................................................................................... 2 1.1. STAMCELLEN............................................................................................................................. 2 1.2. OORSPRONG VAN MSC ............................................................................................................ 4 1.3. KARAKTERISATIE VAN MSC....................................................................................................... 5 1.4. ALGEMENE EIGENSCHAPPEN EN FUNCTIES VAN MSC ............................................................. 5 Hematopoëtische functie van MSC.................................................................................................. 6 Trofische functie van MSC ............................................................................................................... 6 Immunomodulerende functies van MSC......................................................................................... 7 Migratiefunctie van MSC ................................................................................................................. 8 1.5. KLINISCHE STUDIES MET MSC .................................................................................................. 8 1.6. SAMENGEVAT ......................................................................................................................... 11 2. MATERIALEN EN METHODEN ................................................................................................. 12 2.1. PRELEVATIE ............................................................................................................................. 13 2.2. ISOLATIE EN CULTUUR ............................................................................................................ 15 2.3. KARAKTERISATIE ..................................................................................................................... 16 2.3.1. Adhesie aan plastic .............................................................................................................. 16 2.3.2. Osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie van cMSC ....................................... 16 2.3.3. Immunofenotypering ........................................................................................................... 17 3. RESULTATEN EN BESPREKING ............................................................................................... 21 3.1. PRELEVATIE, ISOLATIE EN CULTUUR VAN cMSC..................................................................... 21 3.1.1. Prelevatie van cMSC ............................................................................................................ 21 3.1.2. Isolatie van cMSC ................................................................................................................ 24 3.1.3. Cultuur van cMSC ................................................................................................................ 26 3.2. KARAKTERISATIE ..................................................................................................................... 27 3.2.1. Adhesie van cMSC aan plastic ............................................................................................. 27 3.2.2. Osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie van cMSC ....................................... 28 3.2.3. Immunofenotypering van cMSC .......................................................................................... 33 4. CONCLUSIE EN TOEKOMSTPERSPECTIEVEN ..................................................................... 39 Referenties ........................................................................................................................................... 43 APPENDIX .............................................................................................................................................. 53

ABSTRACT De orthopedie van de kleine huisdieren vormt één van de vele potentiële toepassingsdomeinen van caniene mesenchymale stamcellen (cMSC). Hoewel interessante functies worden toegeschreven aan cMSC, blijven fundamentele vragen over de ware aard van deze cellen een struikelblok vormen. Deze pilootstudie onderzoekt de mogelijkheid om cMSC te preleveren uit het beenmerg tijdens een Tibial Tuberosity Advancement, een chirurgische ingreep na ruptuur van de craniale kruisband bij honden. Hoewel het geobserveerde immunofenotypisch profiel van de veronderstelde cMSC conform is aan de literatuur, konden de verworven cellen op basis van de huidige criteria niet ondubbelzinnig als cMSC worden gekarakteriseerde. Zowel de onbeschikbaarheid van gevalideerde anti-caniene antistoffen als het niet kunnen aantonen van de vereiste drievoudige differentiatie lag aan de basis hiervan. Het verloop

van

deze

pilootstudie

werd

vooral

bepaald

door

een

sterk

beperkte

in

vitro

proliferatiecapaciteit van de verworven cellen. Hiervoor kunnen donorleeftijd, prelevatiemethode en blootstelling aan zuurstof mogelijks een verklaring bieden. Key words: Beenmerg, hond, immunofenotypering, Mesenchymale Stamcellen

1

1. INLEIDING

D

eze masterproef is opgesteld in het kader van het postdoctoraal onderzoek van Dr. Evelien de Bakker, waar getracht wordt om beenmerg-afgeleide caniene mesenchymale stamcellen (BM-

cMSC) te collecteren tijdens een chirurgische ingreep (tibial tuberosity advancement, TTA) ter correctie van een verworven ruptuur van de craniale kruisband. Deze stamcellen zullen, na opzuivering, verder therapeutisch worden ingezet in een klinische studie waar het effect ervan zal worden geëvalueerd in caniene peesletsels. Het werk dat in deze masterproef behandeld wordt, bouwt verder op een overzichtsartikel betreffende deze cMSC [1]. Echter, hier zullen de uitgevoerde methoden van staalname en verdere opzuivering, alsook het proces dat wordt gebruikt om de gewenste celpopulatie zo ondubbelzinnig mogelijk te karakteriseren meer in diepgang worden besproken. Om een vlotte leesbaarheid te verzekeren, wordt eerst de meest recente literatuur betreffende de algemene eigenschappen van MSC aangehaald. Daarna zal de huidige stand van zaken waar de karakterisering van cMSC zich nu in bevindt verder worden uitgebouwd, om uiteindelijk over te gaan tot een bespreking van de bekomen resultaten in deze studie. In de jaren '60 beschrijven Friedenstein et al. (1966) voor het eerst de aanwezigheid van MSC in het beenmerg bij de muis [2]. Over de jaren heen zijn er talrijke interessante functies toegeschreven aan deze adulte stamcellen. Dit heeft recent ook geleid tot het succesvol inzetten van cMSC in klinische studies bij de hond. Hoewel in deze studies veelbelovende resultaten bekomen worden, zijn ze vaak onvoldoende onderbouwd om eenduidig te worden geïnterpreteerd [1]. De criteria waaraan een stamcel moet voldoen om als humane MSC (hMSC) te worden beschouwd zijn weliswaar duidelijk gedefinieerd, maar zijn ook weinig specifiek [3]. Bovendien kan er in de diergeneeskunde tengevolge van een tekort aan gevalideerde antistoffen niet aan alle criteria van een MSC worden voldaan. De huidige aspecifieke definitie van een cMSC leidt bijgevolg tot heterogene celpopulaties. Naast endogene verschillen tussen deze stamcellen, zorgen de cultuuromstandigheden van in vitro expansie voor bijkomende veranderingen in de morfologie en de eigenschappen van cMSC [3]. Ook bestaan er nog veel onopgeloste vragen omtrent de werking en het gebruik van cMSC. Tot op heden wordt het inzetten van therapeutische stamcellen dan ook nog steeds als alternatief beschouwd voor de klassieke therapie. 1.1. STAMCELLEN Stamcellen worden gedefinieerd op basis van drie criteria: (1) de mogelijkheid bezitten om in het organisme een bepaald weefsel aan te leggen, (2) na celdeling dochtercellen vormen die identieke eigenschappen bezitten als de moederstamcel (dit proces wordt 'self-renewal' genoemd) en (3) uit andere dochtercellen progenitorcellen kunnen vormen die in staat zijn zich verder te differentiëren naar meer gespecialiseerde celtypes [4, 5]. Kortom, een stamcel vormt een onuitputtelijke bron van nieuwe cellen voor een weefsel. Er bestaan veel soorten stamcellen: deze worden, naargelang het ontwikkelingsstadium onderverdeeld in embryonale stamcellen (ESC, prenataal) of adulte stamcellen (ASC, postnataal).

2

Deze laatste hebben een cruciale functie in de normale turnover van een weefsel [6]. Een verdere onderverdeling van deze cellen kan gebeuren op basis van het vermogen om dochtercellen te produceren die op hun beurt kunnen ontwikkelen naar andere celtypes, de 'potentie' van een stamcel genoemd (Figuur 1). Totipotente stamcellen zijn in staat om een volledig nieuw organisme te produceren. Deze cellen kunnen enkel bekomen worden uit de zygote tot en met de 8-cellige morula. Eenmaal de morula verder ontwikkelt tot een blastocyst, bestaande uit de "inner cell mass" (ICM) die later het embryo zal vormen en de trofoblast die later de vruchtvliezen zal vormen, worden pluripotente stamcellen uit de ICM geïsoleerd. Deze kunnen geen vruchtvliezen meer vormen. Multipotente cellen daarentegen zijn stamcellen die in volgroeide weefsels te vinden zijn en in staat zijn tot self-renewal of differentiatie naar een beperkt aantal andere celtypes [4]. Voorbeelden van multipotente ASC zijn hematopoëtische stamcellen (HSC) in het beenmerg en MSC [5]. Oligopotente stamcellen zijn nog steeds in staat om enkele verschillende cellijnen te produceren, maar minder dan multipotente stamcellen. Tot slot zijn unipotente stamcellen slechts in staat om één type van cellijn te produceren [5]. Bijkomend is men er in geslaagd om caniene dermale fibroblasten te herprogrammeren tot caniene induced pluripotent stem cells (ciPSC) en deze verder om te zetten tot MSC [7]. De verworven ciPSC-MSC vertoonden een hoge proliferatiecapaciteit die niet afneemt naarmate het aantal in vitro passages stijgt, wat een groot nadeel bij klassieke MSC vormt [7].

Fig.1 Stamcellen worden onderverdeeld op basis van hun potentie om verschillende cellijnen te produceren [8]. ASC: adulte stamcel, MSC: mesenchymale stamcel. MSC werden initieel geassocieerd met het ontstaan van mesenchymale weefsels tijdens de embryogenese en in vitro konden deze cellen differentiëren naar meerdere cellijnen. Daarom werden ze bestempeld als 'mesenchymale stamcellen' [9]. Ze fungeren echter niet exclusief als stamcellen in het lichaam, maar oefenen in vivo vooral trofische, antimicrobiële en immunomodulerende functies uit [10]. Daarom wordt er soms naar gerefereerd met de term 'multipotente stromale cellen'. Geïsoleerde MSC vormen onder de correcte cultuuromstandigheden in een plastic recipiënt verschillende kolonies van vastgehechte, spoelvormige, op fibroblast lijkende cellen. Bijgevolg worden MSC, maar ook andere cellen met deze eigenschap soms aangeduid als 'colony forming units-fibroblastic' (CFU-F) [11]. Het is noodzakelijk om de beste methodologie te hanteren om uit deze CFU-F specifiek de gewenste MSC-populatie te isoleren en te karakteriseren alvorens deze cellen therapeutisch in te zetten. Bijkomend vormen MSC in vivo een heterogene groep van cellen, gaande van ongedifferentieerde MSC tot alle daaruit volgende types van progenitoren, precursoren en gedifferentieerde cellen [12, 13, 14].

3

1.2. OORSPRONG VAN MSC Meer en meer studies tonen aan dat MSC kunnen ontstaan uit een subpopulatie van perivasculaire pericyten die rondom microbloedvaten gelegen zijn (Figuur 2) [15]. Ook cellen uit de tunica adventitia van grotere bloedvaten zouden voorlopers van MSC kunnen zijn [16]. Deze MSC oefenen een lokale functie uit zonder veel systemische MSC recrutering [17]. Echter, er is al vaak aangetoond dat exogeen toegediende MSC in staat zijn om naar plaatsen van inflammatie of weefselschade te "homen", wat erop kan wijzen dat MSC intrinsiek ook de eigenschap bezitten om op langere afstand te worden gerecruteerd. Dit wordt bevestigd door verschillende chemokines (zoals stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), monocyte chemotactic protein 3 (MCP-3), chemokine (C-X-C motief) ligand 9 (CXCL9), CXCL16, chemokine (C-C motief) ligand 20 (CCL20), CCL25 en hepatocyte growth factor (HGF)) die zowel lokaal als systemisch in staat zijn om MSC te laten migreren [18, 19, 20, 21]. Er bestaat nog onduidelijkheid of alle pericyten MSC zijn, dan wel MSC een subpopulatie van pericyten zijn waarbij deze laatste een reservoir vormen voor weefselspecifieke progenitorcellen. Immers, geïsoleerde MSC (of pericyten) uit verschillende organen vertonen soms zeer verschillende differentiatiepotentialen [22]. Bij flowcytometrische bepaling van oppervlaktemerkers heeft men vastgesteld dat pericyten en MSC een zeer gelijkaardig immunofenotype bezitten [16]. Zo konden +

+

+

+

Crisan et al. (2008) bij humane pericyten (CD146 , α-SMA , NG2 , PDGF-Rβ , alkalische fosfatase

+

en negatief voor endotheliale, hematopoëtische en myogene merkers) die een lange tijd op cultuur gezet werden expressie van typische MSC-merkers vaststellen [15]. Daarenboven differentieerden de pericyten ook naar adipo-, chondro- en osteogene cellijnen [23]. De recente hypothese dat MSC hun oorsprong kennen in pericyten wordt verder ondersteund door hun aanwezigheid in vrijwel alle weefsels en door een correlatie van de hoeveelheid geïsoleerde MSC per weefsel met de dichtheid van bloedvaten in dat weefsel [10].

Fig.2 Scanning electron microscopische opname van pericyten. Pericyten (P) liggen rondom bloedvaten en vormen grote (zwarte pijl) en kleine (witte pijl) uitlopers. Bars 10 µm, bar in kader 1 µm [24].

4

1.3. KARAKTERISATIE VAN MSC De International Society for Cellular Therapy (ISCT) stelde in 2006 drie criteria op om hMSC ondubbelzinnig te karakteriseren: (1) plastic-adherentie in standaard cultuuromstandigheden, (2) expressie van celmembraanmerkers CD73, CD90 en CD105, maar geen expressie van CD11b of CD14, CD19, CD29a, CD34, CD45, HLA-DR en (3) de mogelijkheid tot differentiatie naar osteocyten, chondrocyten en adipocyten [25]. Deze criteria zijn echter enkel van toepassing op in vitro geëxpandeerde hMSC en houden weinig rekening met de inherente verschillen tussen hMSC onderling [25, 10]. Immers, subsets van MSC vertonen veel heterogeniteit in de expressie van hun oppervlakte-antigenen. Deze verschillen zijn waarschijnlijk het gevolg van invloeden van het perivasculaire micromilieu in de diverse weefsels [10]. Behalve de ongelijkheid tussen MSC in vivo, vormen niet-gestandaardiseerde methoden van isolatie en expansie van MSC in vitro een bijkomende bron van heterogeniteit. Dit wordt weerspiegeld in grote verschillen van MSC tussen laboratoria [26]. Zo wordt de hoeveelheid MSC beïnvloed door de prelevatieplaats, de donorleeftijd en de aanwezigheid van comorbiditeiten [27]. Verschillen in species, lot, cultuurtechniek en MSC-densiteit in initiële passages kunnen daarentegen leiden tot variabele proliferatiesnelheden [28, 29]. Tijdens opeenvolgende passages worden de telomeren van MSC progressief korter waardoor de MSC geleidelijk aan proliferatiecapaciteit verliezen tot ze cellulaire senescentie bereiken [30]. MSC uit vroege passages bezitten dus een groter actief vermogen en potentieel voor therapeutisch gebruik [28]. Na in vivo transplantatie van langdurige geëxpandeerde hMSC naar muizen werden echter geen indicaties van tumorvorming noch chromosomale abnormaliteiten aangetoond [30]. In de diergeneeskunde zijn de eerder vermelde ISCT-minimumcriteria nog niet opgesteld aangezien er meestal weinig species-specifieke monoklonale antistoffen beschikbaar zijn voor de immunofenotypering van MSC [31]. Dit heeft als gevolg dat er vaak gebruik wordt gemaakt van nietgevalideerde kruisreagerende antistoffen van andere species, zoals die van de muis of van de mens, waardoor nog geen consistente lijst van celmembraanmerkers voor de karakterisering van veterinaire MSC werd samengesteld [31, 1, 32]. 1.4. ALGEMENE EIGENSCHAPPEN EN FUNCTIES VAN MSC Aanvankelijk werd aan MSC een belangrijke rol toegekend als organisator van niches van hematopoëtische stamcellen [33]. Later werd duidelijk dat de functies van MSC zich niet limiteren tot een rol binnen het beenmerg. MSC reageren actief op weefselstress of -schade op een manier die sterk gelijkend is aan de wijze waarop cellen van het immuunsysteem reageren op contact met antigenen. Wanneer MSC exogeen worden toegediend, kunnen ze migreren ("homen") naar plaatsen waar weefselschade is opgetreden en bijgevolg ontstoken en beschadigde bloedvaten aanwezig zijn [27]. Eenmaal ter plaatse kunnen de MSC reageren op de omgeving en naargelang het micromilieu waarin ze zich bevinden een hoeveelheid mediatoren vrijstellen. Deze stimuleren vervolgens angiogenese, regeneratie en weefselremodelering. MSC kunnen ook andere cellen recruteren en het immuunsysteem zowel onderdrukken als activeren [27]. Tenslotte werden ook al antibacteriële eigenschappen gerapporteerd [27]. Endogene MSC oefenen in het lichaam vooral een lokale functie

5

uit waarbij pericyten worden geactiveerd tot MSC die na het uitoefenen van helende effecten op hun beurt terug naar pericyten worden omgezet [10]. De functie van deze pericyten, meer specifiek MSC, kan verschillen naargelang de locatie waar ze zich bevinden. Dit wordt weerspiegeld zowel in een verschil van expressie van cellulaire merkers, als in een verschil van differentiatiepotentieel [27]. Wanneer bijgevolg MSC geïsoleerd worden uit verschillende weefsels, dan worden ongelijke populaties bekomen. Bovendien kunnen MSC verder geactiveerd worden via interactie met beschadigde cellen of het micromilieu, zodat ze extra hoge gehaltes aan therapeutische factoren vrijstellen [34]. MSC zijn dus in staat om een plaats van weefselschade te herkennen en deze terug te helpen transformeren naar gezond functioneel weefsel [35]. Daarnaast kunnen deze stamcellen ook in vitro transdifferentiëren naar celtypes met morfologische, fenotypische en functionele eigenschappen van zowel endo-, ecto- als mesodermale oorsprong. Voorbeelden hiervan zijn neuronen, hepatocyten, renale en myoblastceltypes [35, 36, 37]. Deze inzichten verruimen zowel de potentiële werkingsmechanismen als de therapeutische doeleinden van cMSC. Hematopoëtische functie van MSC Initieel werd gedacht dat MSC hematopoëse-ondersteunende cellen waren. Na isolatie en transplantatie van MSC werden onder invloed van deze donorcellen immers hematopoëtische stamcellen van de gastheer aangetrokken en aangezet tot de vorming van bloedcellen [38]. Zo resulteerde een simultane transplantatie van deze stamcellen met hMSC in een sneller hematopoëtisch herstel bij muizen met beenmergsuppressie [39]. Eveneens vervullen MSC een rol in de preventie van graft-versus-host reacties na transplantatie van HSC [40]. Hoewel de wijze waarop hematopoëtische ondersteuning gebeurt nog niet helemaal gekend is [41], wordt toch algemeen aanvaard dat MSC in vivo een belangrijke rol vervullen als organisators van de HSC-niche [33]. Trofische functie van MSC MSC functioneren in het lichaam voornamelijk via de productie van een waaier aan cytokines, chemokines en groeifactoren (Figuur 3) [42]. In dat opzicht wordt naar MSC gerefereerd als 'de endogene apotheken voor beschadigd weefsel' [43]. Ze zijn niet alleen in staat om te differentiëren naar meerdere richtingen (multipotentie), een eigenschap die vooral in vitro wordt gezien, maar ze gaan

ook

apoptose

tegen,

remmen

de

vorming

van

littekenweefsel

en

stimuleren

de

weefselregeneratie via secretie van factoren zoals mitogene factoren (transforming growth factoralpha (TGF-α), TGF-β, hepatocyte growth factor (HGF), epithelial growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (FGF-2) en insulin-like growth factor-1 (IGF-1)) en angiogenetische factoren zoals vascular endothelial growth factor (VEGF), IGF-1 en angiopoietin-1 [10]. Angiogenese, mitogene invloeden, anti-apoptose en remming van littekenweefselvorming worden samen 'trofische effecten' genoemd. Daarenboven kunnen MSC ook immuunresponsen moduleren en vertonen ze antiinflammatoire eigenschappen [44].

6

Fig.3 Pericyten worden geactiveerd tot MSC door groeifactoren en chemokines in oplossing. Deze geactiveerde MSC reageren vervolgens op het micromilieu door middel van secretie van trofische, immunomodulatoire of antimicrobiële factoren. Eenmaal het micromilieu terug hersteld is in zijn oorspronkelijke staat, keren MSC terug naar hun initiële vorm als pericyten [10]. Immunomodulerende functies van MSC MSC ontsnappen aan T-cel herkenning, helpen het immuunsysteem om te schakelen naar een gunstigere balans tussen T-helper cel 1 (Th1) en Th2 cellen, en zorgen eveneens voor een grotere aanwezigheid van regulatorische T-cellen [45]. Naast de T- en B-cellen worden ook de antigeen presenterende cellen en natural killer cellen beïnvloed (Figuur 3) [46]. Extrapolatie van deze eigenschappen naar andere diersoorten moet met voorzichtigheid gebeuren aangezien reeds werd aangetoond dat deze niet identiek zijn voor verschillende species [47]. Het ontsnappen aan het immuunsysteem is een gevolg van een weinig tot niet tot expressie brengen van MHC-I, MHC-II en co-stimulatoire moleculen (CD40, CD40L, CD80, CD86). Dit noemt men samen de 'immunogeprivilegieerde' eigenschap van MSC en deze heeft als gevolg dat ze kunnen worden ingezet in allogene therapieën [25, 48, 49]. Bijkomend wordt de immunomodulerende functie van MSC niet gemedieerd via MHC, maar via de secretie van mediatoren. Dit maakt de noodzaak van matching van donoren met gastheren in het geval van allogene therapieën overbodig [49]. De immuno-geprivilegieerde eigenschap van MSC werd klinisch al vaak bevestigd, hoewel MSCafstoting ook al gerapporteerd werd [50]. In dat laatste verband kan de vraag gesteld worden of allogene MSC zullen differentiëren in vivo, wat hun MHC-expressie eventueel kan veranderen en ze zo alsnog een immuunreactie zullen uitlokken [10]. Dit laatste fenomeen werd reeds aangetoond in modellen waarbij de MHC-II expressie werd opgereguleerd in een inflammatoir milieu en bijgevolg de MSC toch werden herkend door het immuunsysteem van de gastheer [51]. Onlangs werd tenslotte vastgesteld dat MSC antimicrobiële effecten bezitten door secretie van cathelicidine (LL-37). Dit eiwit wordt normaal gesecreteerd door epitheelcellen en fagocyterende macrofagen en werkt antimicrobieel tegen zowel Gram-positieve als -negatieve bacteriën [52]. Wat betreft MSC-geïnduceerd

7

weefselherstel is er nog geen consensus bereikt of dit al dan niet het gevolg is van één van bovenstaande eigenschappen, of een combinatie daarvan [53]. Migratiefunctie van MSC Een bijzondere eigenschap van MSC is hun migratievermogen. Hoewel MSC vooral een lokale functie uitoefenen [17], werd reeds aangetoond dat exogeen toegediende MSC in staat zijn om naar plaatsen van inflammatie of weefselschade te "homen". Dit kan betekenen dat MSC intrinsiek de eigenschap bezitten om over een langere afstand te worden gerecruteerd. Zo werd beschreven hoe MSC chemotactisch worden aangetrokken naar ontstekingshaarden, beschadigde cellen, ischemische regio's, neoplasieën en hun metastasen [54, 55, 56, 57]. Dit wordt bevestigd door de aanwezigheid van verschillende chemokines (zoals stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), monocyte chemotactic protein 3 (MCP-3), chemokine (C-X-C motief) ligand 9 (CXCL9), CXCL16, chemokine (C-C motief) ligand 20 (CCL20), CCL25 en hepatocyte growth factor (HGF)) die zowel lokaal als systemisch in staat zijn om MSC te laten migreren [18, 19, 20, 21]. De migratie van exogeen toegediende MSC verloopt op een manier die sterk gelijkend is aan de migratie van leukocyten. MSC brengen gelijkaardige leukocytenmigratiemerkers tot expressie zoals groeihormoonreceptoren, chemo- en cytokinereceptoren, adhesiemoleculen en Toll-like receptoren (TLR) [58]. In vitro kan de migratiecapaciteit van hMSC gestimuleerd worden door groeifactoren (PDGF-BB, EGF en SDF-1α) [59]. In vivo worden de MSC vooral aangetrokken naar hypoxische en inflammatoire zones zoals het tumoraal micromilieu [60]. Deze tumorale micromilieus hebben een zeer heterogeen karakter waardoor de vrijstelling van chemotactische factoren per tumor verschilt. Analoog aan leukocyten kunnen MSC na extravasatie migreren naar de tumor door middel van gradiënten in groeifactoren, chemokines en andere chemotactische molecules [59]. Het exacte mechanisme van dit migrerend karakter is nog niet opgehelderd. Wel heeft men kunnen vaststellen dat het aantal in vitro passages en de duur van de cultuur een duidelijke negatieve impact heeft op de migratie-eigenschappen en morfologie van MSC, alsook de differentiatiecapaciteit en vitaliteit van de cellen [3]. Dit wordt eveneens bevestigd door verschillende onderzoekers die vastgesteld hebben dat vers geïsoleerde MSC superieure homingcapaciteiten vertonen in vergelijking met in vitro geëxpandeerde MSC [61, 62]. Daarenboven verhoogt in vitro voorbehandeling van geïsoleerde MSC met pro-inflammatoire cytokines, zoals Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), de migratie- en adhesiecapaciteit van MSC [59]. Toevoeging van RNA aan het cultuurmedium wordt door TLR3 op de MSC herkend en leidt eveneens tot deze effecten [59]. Er zijn echter nog maar weinig gegevens over hoe MSC kunnen migreren vanuit lokale weefsels naar de systemische circulatie, hetgeen een cruciaal proces is indien deze MSC vanuit verafgelegen weefsels gerecruteerd moeten worden [22]. 1.5. KLINISCHE STUDIES MET MSC Van alle adulte stamcellen worden MSC het frequentst ingezet in de regeneratieve (dier)geneeskunde [63], gaande van orthopedische toepassingen bij pees-, been- en kraakbeenletsels tot nietorthopedische toepassingen zoals wondheling, ischemische-, immuungemedieerde- en inflammatoire aandoeningen [1]. Aangezien er vaak gebruik wordt gemaakt van combinatietherapieën, er te weinig

8

controlegroepen aanwezig zijn en er geen statistische significantie wordt bereikt wegens te kleine steekproeven, zijn de overwegend positieve resultaten in de meeste gevallen echter moeilijk ondubbelzinnig te interpreteren [64]. Hoewel de klinische studies geen grote complicaties aan het licht brengen, wordt toch best voorzichtig omgegaan met deze therapieën daar geen informatie bekend is over de gevolgen ervan op lange termijn. De meeste humane studies worden uitgevoerd met autologe MSC uit beenmerg (BM-MSC) of vetweefsel (AD-MSC). Daarnaast worden allogene therapieën ook meer en meer toegepast [8]. In de studie van Spencer et al. (2012) werden BM-MSC en AD-MSC vergeleken [28]. Daarin werd aangetoond dat AD-MSC afkomstig uit het infrapatellaire vetkussen een vergelijkbaar differentiatievermogen en een gelijkaardige tot zelfs grotere expansiecapaciteit vertoonden dan BM-MSC. Ook de proliferatie- en differentiatiecapaciteit na cryopreservatie van beide bronnen was gelijklopend. Verse caniene AD-MSC uit het infrapatellaire vetkussen vormen dus een goed alternatief voor BM-MSC [28]. Verder moet er een onderscheid worden gemaakt tussen enerzijds in vitro geëxpandeerde, opgezuiverde producten zoals BM-MSC en AD-MSC, en anderzijds niet-geëxpandeerde producten zoals BM-concentraat en de Stromal Vascular Fraction (SVF) uit vetweefsel [44]. Zhang et al. (2012) vergeleken het effect van in vitro geëxpandeerde BM-MSC en niet-geëxpandeerde gekernde cellen uit het BM in een collageen II gel ('scaffold') op de heling van full-thickness kraakbeendefecten 4 en 8 weken na chirurgie [65]. Beide therapieën vertoonden een sterk verbeterde histologische heling ten opzichte van de negatieve controle en scaffold alleen. Aangezien het effect van beide celpopulaties statistisch niet significant verschillend was, lijkt een 'point-of-care' toepassing, waarbij het BM-aspiraat of de SVF tijdens dezelfde chirurgische ingreep wordt gebruikt, zeker klinisch haalbaar [65]. De invloed van de scaffold mag hier echter niet genegeerd worden. In een poging om beschadigd kraakbeen te herstellen maken veel studies gebruik van een injectie van gesuspendeerde MSC in de gewrichten. Dit geeft de MSC echter niet de mogelijkheid om zich in te bedden in het kraakbeen, waardoor de therapie zich limiteert tot een kortstondig anti-inflammatoir effect [66]. Daarentegen vertonen studies die gebruik maken van een matrix om de MSC beter op hun plaats te houden betere en langdurigere resultaten. Zeker wanneer er eveneens gebruik wordt gemaakt van bijkomende substanties zoals hyaluronzuur die de chondrogenese nog verder helpen ondersteunen [66]. Autoloog 'point-of-care' gebruik is ideaal aangezien dit problemen vermijdt met cross-matching, in vitro contaminatie en potentiële omvorming tot maligne cellen. Het BM-aspiraat of de SVF uit vetweefsel wordt in één chirurgische ingreep gepreleveerd en terug ingebracht zonder de risico's, kosten, tijd en negatieve effecten die in vitro expansie van MSC met zich meebrengt [10]. Limiterende factoren zijn echter de beperkte hoeveelheid MSC die men kan extraheren uit een patiënt wanneer geen in vitro expansie volgt, en MSC-deficiënties die kunnen optreden ten gevolge van directe of indirecte effecten van de ziekte zelf. Deze problemen worden omzeild wanneer gebruik wordt gemaakt van allogene MSC, maar afweerreacties en het verlies in functionaliteit ten gevolge van langdurige culturen kunnen een probleem vormen [27, 50, 3]. Er bestaan twee manieren om exogene MSC toe te dienen: lokaal of systemisch. Lokale toediening kan al dan niet met behulp van een scaffold gebeuren. Systemische toediening kan ofwel intraveneus (IV) ofwel intra-arterieel (IA) gebeuren (Figuur 4) [22]. Hoewel IV-toediening klinisch gemakkelijker uit

9

te voeren is, worden veel van de toegediende MSC ter hoogte van de longen gesekwesteerd, hetgeen het pulmonaire 'first-pass' effect genoemd wordt [61]. Bij IA-toediening wordt de dosis verminderd en verkleint het risico op pulmonaire embolie ten gevolge van de snellere verdunning [22]. De optimale manier om MSC toe te dienen is echter nog niet voldoende gekend [27]. Bij honden zijn nog maar enkele studies gepubliceerd over het therapeutisch gebruik van MSC en worden meestal been- en kraakbeenpathologieën behandeld [1]. In andere studies staat de hond model voor bepaalde pathologieën bij de mens. Voorbeelden hiervan zijn het gebruik van cMSC in de preventie van tussenwervelschijfdegeneratie en hun helende effecten op geïnduceerde myocard ischemie [67, 68]. In overeenstemming met humane studies is de efficiëntie van cMSC therapie eveneens moeilijk éénduidig te interpreteren [64]. Elke donor, autoloog of allogeen, is immers verschillend. Zo werd aangetoond dat de secretie van bioactieve moleculen door MSC een tienvoud kan verschillen tussen donoren van dezelfde leeftijd en geslacht [69]. Vele factoren hebben een invloed op de efficiëntie van de toegediende MSC. De ideale toe te dienen dosis is daarom nog niet gekend maar varieert naargelang het ziekteproces waartegen de MSC worden ingezet, de potentie en de efficaciteit van het toegediende MSC-preparaat [27]. In de humane geneeskunde worden vaak 1 tot 5 miljoen cellen per kilogram IV of lokaal toegediend [70]. Om deze hoeveelheid cellen te bekomen is meestal een in vitro expansie vereist [71]. Daarnaast zijn de hoeveelheid verkregen cellen per gram donorweefsel, de optimale weefselbron per klinische toepassing, de ideale route en timing van toediening, het al dan niet gebruik van scaffolds en het gebruik van autologe versus allogene MSC nog steeds niet gekend [53, 71]. Tenslotte is ook nog maar weinig geweten over de veiligheid van deze aanpak op lange termijn [1]. De effecten van therapeutische toegediende cellen kunnen immers niet zomaar worden uitgeschakeld.

Fig.4 IV versus IA toegediende MSC injecties in muizen waarvan in de rechter femur inflammatie werd geïnduceerd via radiatie (witte pijl). De toegediende MSC werden getransfecteerd met luciferase. IV toegediende MSC (links) blijven steken ter hoogte van de longen en zijn al na 1 week verdwenen uit het lichaam. IA toegediende MSC daarentegen (rechts) zijn na 3 weken nog steeds aanwezig en hebben zich geconcentreerd ter hoogte van de zone van inflammatie [22].

10

1.6. SAMENGEVAT Stamcellen leveren een onuitputtelijke bron van cellen voor weefsels, dit is cruciaal om de fysiologische turnover van weefsels in stand te houden. Mesenchymale stamcellen zijn een heterogene multipotente populatie van stamcellen die in vrijwel alle weefsels te vinden zijn. Naast deze endogene verschillen tussen de MSC, zorgt ook in vitro expansie voor bijkomende wijzigingen in zowel de morfologie, het immunofenotype en de eigenschappen van MSC. Deze stamcellen kennen waarschijnlijk hun oorsprong in perivasculair gelegen pericyten. Deze laatste kunnen geactiveerd worden tot migrerende MSC die de omschakeling van beschadigd weefsel naar normaal functioneel weefsel als doel hebben. De effecten van MSC worden vooral teweeg gebracht via trofische, antimicrobiële en immunomodulatoire eigenschappen. In de diergeneeskunde, en meer specifiek bij honden, heeft men dezelfde ambities als bij mensen om cMSC therapeutisch in te zetten. Echter, er moeten nog meer dan bij de mens vele fundamentele vragen worden opgelost omtrent de meest geschikte prelevatieplaatsen, isolatie- en cultuurmethode en het ondubbelzinnig karakteriseren van deze stamcelpopulatie. Ook moet er nog veel onderzoek worden verricht omtrent de mechanismen die deze MSC gebruiken om hun functies uit te oefenen. Verder zijn de klinische studies in dit veld veelbelovend, maar vaak onvoldoende onderbouwd om de resultaten ervan correct te kunnen interpreteren. In deze scriptie wordt getracht een bijdrage te leveren tot het beantwoorden van enkele van de fundamentele vragen over de identificatie van deze stamcellen.

11

2. MATERIALEN EN METHODEN

O

p de vakgroep Medische Beeldvorming en Orthopedie van de faculteit Diergeneeskunde werden acht honden van verschillende grote rassen geïncludeerd in deze studie. Deze honden werden

gediagnosticeerd met een partiële of complete unilaterale ruptuur van de craniale kruisband (Cranial Cruciate Ligament, CCL) en vertoonden op algemeen klinisch onderzoek geen abnormaliteiten. Alle patiënten werden behandeld via eenzelfde aangepaste tibial tuberosity advancement procedure, 'TTA rapid' genoemd. Deze techniek werd ontwikkeld op de vakgroep Medische Beeldvorming en Orthopedie van de Faculteit Diergeneeskunde [72]. Hierbij wordt een proximo-distale osteotomie ter hoogte van de craniale zijde van het tibiaal plateau uitgevoerd. Vervolgens wordt het craniale stuk van de tuberositas tibiae progressief naar craniaal geduwd om daarna een titaniumkooi in de ontstane ruimte te brengen en deze met schroeven vast te hechten aan de tibia. Deze techniek resulteert in een betere verdeling van de inwerkende krachten op het tibiaal plateau waardoor een verhoogde stabiliteit van het kniegewricht wordt bekomen. De verhoogde stabiliteit resulteert in een afgeremde verdere ontwikkeling van osteoarthrose (Figuur 5). Omwille van het grote ras, de goede gezondheid en het openen van het beenmerg tijdens de TTA rapid vormden deze acht patiënten de ideale beenmergdonoren.

Fig.5 Schematische voorstelling van het kniegewricht. Na uitvoering van de TTA rapid verdwijnt de voorwaartse afschuifkracht (vector a) op de tibia. Dit resulteert in een stabieler kniegewricht. (A) Femur, (B) patella, (C) tibia en (D) tuberositas tibiae. De patiënten worden gepremediceerd en onder anesthesie gebracht op basis van hun individuele noden. De aangetaste knie wordt geschoren vanaf de proximale femurregio tot aan de tarsus en aseptisch voorbereid. Zowel de metatarsi als phalangen worden bedekt met een steriel verband en de chirugische site wordt gedrappeerd met chirurgische doeken. Met de hond in ruglig wordt er een mediale huidincisie gemaakt vanaf de parapatellaire regio tot ongeveer 1 cm voorbij de tuberositas tibiae. Vervolgens wordt er via een laterale arthrotomie van het aangetaste kniegewricht de integriteit van de intra-articulaire structuren beoordeeld. Resten van de gescheurde CCL worden verwijderd en

12

de mediale meniscus wordt geïnspecteerd. Een intacte mediale meniscus wordt losgemaakt ter hoogte van het ligamentum meniscotibialis caudalis. Bij een reeds gescheurde mediale meniscus wordt het gescheurde deel verwijderd. Daarna wordt het kniegewricht terug gesloten met resorbeerbare monofilament hechtingen. Ter hoogte van de tuberositas tibiae worden de subcutane weefsels vrijgeprepareerd en de fascie opengemaakt. Een L-vormig hulpstuk dat voorzien is met een gleuf wordt via 2 nauwkeurig geplaatste pinnen op de juiste plaats gestabiliseerd en vervolgens gebruikt om de botzaag te begeleiden. De osteotomie wordt loodrecht op de sagitale vlakte van de tibia uitgevoerd, startend vanaf de distale regio van de tuberositas tibiae naar proximaal. Na de verwijdering van de botzaag, het L-vormig hulpstuk en de 2 bevestigingspinnen wordt de gecreëerde ruimte tussen het craniale deel van de tuberositas tibiae en de rest van de tibia progressief opengesperd via een ingebrachte botspreider die als hefboom wordt gebruikt. Indien nodig wordt er achtereenvolgend gebruik gemaakt van bredere botspreiders om de gewenste spreiding te verkrijgen. Deze handelingen gebeuren zeer geleidelijk om fracturen ter hoogte van de distale aanhechting van de tuberositas tibiae met de tibia te vermijden. Er wordt gebruik gemaakt van een speciaal meetinstrument om de afmetingen van de titaniumkooi te bepalen. De "oortjes" van deze kooi worden vervolgens licht omgeplooid tot de gewenste afbuiging wordt bekomen. Daarna wordt de titaniumkooi zorgvuldig ingebracht waarop maximaal contact met het onderliggende bot wordt verzekerd. Via 4 of 6 corticale schroeven wordt de titaniumkooi bevestigd aan de tibia (Figuur 6). De binnenkant van de kooi en de rest van het geopende bot worden tot slot opgevuld met een hydroxyl-apatiet botpasta (REDy HA Bone Paste 2.5cc, RITA LEIBINGER GmbH & Co, Neuhausen ob Eck, Germany). De incisie wordt daarna in verschillende lagen gesloten via de gebruikelijke methode.

Fig.6 Postoperatieve röntgenfoto van het kniegewricht. Hierop zijn de titaniumkooi en de corticale schroeven te zien. 2.1. PRELEVATIE Na het openen van de tibia en vóór het uitvoeren van de dieptemetingen om de gepaste titaniumkooi te kiezen worden twee methoden van beenmerg collectering uitgevoerd (Figuur 7). Een eerste beenmergstaal wordt bekomen via aspiratie. Daarbij wordt een 18 Gauge naald (1,5 inch Luer, TERUMO N.V. Leuven, Belgium) van craniodorsaal naar caudoventraal 1,5 cm diep in het geopende spongieus been gebracht. Op deze naald is een steriele 5 ml heparine-gecoate spuit gemonteerd.

13

Vervolgens wordt er meerdere malen geaspireerd om een visceuze hemorrhagische vloeistof te bekomen van variabel volume. Het aspiraat wordt daarna overgebracht in een EDTA-gecoat bloedbuisje en zachtjes heen en weer bewogen om een mooie verdeling van het aspiraat met de EDTA te bekomen. Een tweede beenmergstaal wordt gepreleveerd via curettage. Via een botcurette van 0,5cm diameter worden 3-4 oppervlakkige stalen bekomen ter hoogte van het geopende spongieus been. Deze worden één per één overgebracht in EDTA-gecoate bloedbuisjes, waar 0,5 ml 0,9% NaCl aan toegevoegd is. Het bloedbuisje wordt na inbrengen van alle monsters zachtjes heen en weer bewogen om een goede verdeling van het EDTA met de 0,9% NaCl en de stalen te bekomen. Vervolgens worden beide stalen steeds binnen het half uur in de hand tot aan het labo gedragen, waar direct wordt overgegaan tot opzuivering.

A1

A2

B1

B2

B3

B4

Fig.7 Beenmerg wordt geaspireerd uit de geopende tuberositas tibiae (A1) en wordt daarna overgebracht in een EDTA-gecoat bloedbuisje (A2). Bijkomend wordt er een oppervlakkige curettage uitgevoerd (B1) die via steriele manipulatie (B2) in een EDTA-gecoat bloedbuisje wordt gebracht (B3). Finaal wordt er aan het curettagestaal 0,9% NaCl toegevoegd om uitdroging te voorkomen (B4).

14

2.2. ISOLATIE EN CULTUUR Uitgaande van het protocol om equine MSC te isoleren uit navelstrengbloed [32] willen we in deze studie een protocol op punt stellen om cMSC te isoleren uit beenmerg. Het beenmergaspiraat werd telkens 1:1 verdund met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; Invitrogen). Deze verdunning werd voorzichtig bovenop een gelijk volume van Percoll gelegd (δ = 1.080 g/mL; GE Healthcare) en 15 minuten gecentrifugeerd aan 600g bij kamertemperatuur. Vervolgens werd de bekomen interfase gecollecteerd en 3x gewassen met HBSS door telkens 10 minuten te centrifugeren aan 200g. De uiteindelijke celpellet werd finaal terug in suspensie gebracht met 5 ml cultuurmedium gebaseerd op het medium beschreven door Koch et al. (bevat low glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium -7

(DMEM; Invitrogen), 30% Foetaal Kalf Serum (FKS; GIBCO), 10 M low dexamethasone, 50 mg/ml gentamycine, 10 ml/ml antibiotische/antimycotische oplossing, 250 ng/ml fungizone (alles van Sigma) en 2 mM ultraglutamine (Invitrogen)) en overgebracht in een T-25 cultuurfles [32]. Na 24u werden de niet-adherente cellen verwijderd door het vervangen van het medium. Tweemaal per week werden de culturen geëvalueerd op de aanwezigheid van adherente cellen bij het verversen van het cultuurmedium. Eenmaal uitgebreide kolonies werden waargenomen, werden de cellen losgemaakt van de plastic ondergrond m.b.v. 0,25% trypsine-EDTA (Sigma) en in een verhouding van 1:3 verder in cultuur gebracht in expansiemedium. Dit expansiemedium is identiek aan Koch's medium maar bevat geen dexamethasone. Om cMSC te isoleren uit het spongieus been werd het gecuretteerde spongieus beenstukje gedurende 10 min geïncubeerd met 0,25% Trypsine-EDTA (Sigma) bij 37°C. De enzymatische reactie werd daarna stilgelegd door toevoegen van FKS. Na het verwijderen van de weefselstukjes werd de bekomen celsuspensie 10 minuten gecentrifugeerd aan 300g bij kamertemperatuur. De celpellet werd in oplossing gebracht in 0.5 ml cultuurmedium en overgebracht in een 4-well plaat. De weefselstukjes zelf werden ook in een 4-well plaat in 0.5 mL cultuurmedium in cultuur gebracht. Eenmaal duidelijke kolonies met adherente cellen waargenomen werden, werden de cellen losgemaakt m.b.v. 0.25% trypsine en verder in cultuur gehouden zoals reeds beschreven. De viabiliteit en de concentratie van de cellen werd telkens geëvalueerd aan de hand van een Trypaanblauwkleuring die werd beoordeeld op een Neubauer hemocytometer (Figuur 8). Na 2 tot 3 passages werden de geëxpandeerde MSC ingevroren volgens een standaardprotocol waarbij de cellen worden afgekoeld van 4°C tot -40°C aan -1°C/min en van -40°C tot -140°C aan -10°C/min om vervolgens overgebracht te worden in vloeibare stikstof (-196°C). Het invriesmedium bestaat uit 10% FKS en 20% DMSO als cryoprotectans in low-glucose DMEM.

Fig.8 Trypaan Blauw kleuring en celtelling op de Neubauer hemocytometer.

15

2.3. KARAKTERISATIE Zoals vermeld in de inleiding van deze scriptie stelde de International Society for Cellular Therapy in 2006 drie criteria op om in vitro geëxpandeerde hMSC ondubbelzinnig te karakteriseren: (1) plasticadherentie in standaard cultuuromstandigheden, (2) expressie van celmembraanmerkers CD73, CD90 en CD105, maar geen expressie van CD14, CD19, CD29a, CD34, CD45, HLA-DR en (3) de mogelijkheid tot differentiatie naar osteocyten, chondrocyten en adipocyten [25]. In deze studie werd het behalen van deze drie criteria dan ook als beoogde doel gesteld. 2.3.1. Adhesie aan plastic Een eerste criterium waarmee MSC worden geïdentificeerd, is hun vermogen om te adhereren aan een ongecoate plastic ondergrond. De vastgehechte cellen vertonen een spoelvormig uitzicht en prolifereren tot kolonies, waarbij één gevormde kolonie wordt opgestart door één cel. In onze culturen werden de eerste CFU-F ten vroegste na 3 dagen opgemerkt. Eens er verschillende duidelijke kolonies van adherente cellen werden waargenomen, werden de cellen losgemaakt m.b.v. 0.25% trypsine-EDTA. De adhesie aan plastic en vorming van fibroblast-achtige kolonies garandeert echter niet dat deze cellen ook daadwerkelijk MSC zijn [73]. Bijgevolg zullen verdere methoden van karakterisatie dit eerste criterium moeten complementeren. 2.3.2. Osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie van cMSC Een tweede criterium om aan de definitie van MSC te voldoen is het vermogen van de geïsoleerde cellen om naar ten minste 3 verschillende cellijnen te differentiëren. Klassiek zijn dit osteogene, chondrogene en adipogene differentiaties. Drie cryotubes (2x beenmerg aspiraat en 1x beenmerg curettage) werden au bain-marie ontdooid bij 37°C. Direct na ontdooien werden de cellen in 10 ml geëquilibreerd expansiemedium gewassen en gecentrifugeerd (200g, 10 min, kamertemperatuur) om het DMSO te verwijderen. Vervolgens werd het supernatans afgegoten en de celpellet geresuspendeerd in 3 ml geëquilibreerd expansiemedium. Na een celtelling door middel van trypaanblauwkleuring werden de cellen verder geëxpandeerd in 6-well platen (osteogene en adipogene differentiatie) en 15 ml Falcon tubes (chondrogene differentiatie) (Tabel 1). Na een week expansie werden de cellen in 3 van de 6 wells onderworpen aan differentiatie (Tabel 2) terwijl de cellen in de resterende 3 wells werden gebruikt als negatieve controle in identieke volumes expansiemedium [32]. Voor de osteogene differentiatie werden eerst 3000 cellen/cm² per well aangebracht (28,8 x 10

4

cellen per well). Deze celsuspensie werd vervolgens aangevuld met expansiemedium tot er een totaalvolume van 2 ml werd bekomen. Een week later werd de differentiatie gestart door deze cellen 20 dagen in osteogeen inducerend medium op cultuur gehouden. Zowel in de testgroepen als de controlegroepen werd het medium elke 3-4 dagen ververst. Na deze differentiatie werd 1 testgroep en 1 controlegroep gefixeerd met 4% gebufferde formaldehyde in PBS en histologisch aangekleurd met Alizarine Red S. Adipogene differentiatie verliep op een gelijkaardige wijze als de osteogene differentiatie met 0,2 x 6

10

cellen in een totaalvolume van 2,88 ml per well. Ook hier werd aanvankelijk een week

16

geëxpandeerd in expansiemedium tot 90-100% confluentie werd bekomen alvorens in 3 van de 6 wells adipogene differentiatie te induceren. In de testgroep werd in 4 cycli een alternerend protocol gebruikt waarbij 3 dagen adipogeen inducerend medium werd afgewisseld met 1 dag adipogeen onderhoudsmedium, startend met het adipogeen inducerende medium. Na de 4 cycli werden de gedifferentieerde cellen nog 5 dagen in adipogeen onderhoudsmedium gehouden alvorens te fixeren in 4% formaldehyde in PBS en aan te kleuren met Oil Red O. De chondrogene differentiatie werd uitgevoerd in een 3D-cultuur ("micromass") waarbij per staal 3x 6

15 ml Falcon tubes voorzien van 0,25 x 10 cellen per tube in 0,5 ml expansiemedium. Na een zestal dagen werden de geëxpandeerde cellen 5 minuten gecentrifugeerd aan 150g bij kamertemperatuur. Na het afgieten van het supernatans werd 0,5 ml chondrogeen differentiatiemedium zorgvuldig op de cellen gebracht zonder de celpellet te verstoren. Elke 3-4 dagen werd dit medium ververst en na 21 dagen kon de chondrogene differentiatie worden geëvalueerd door middel van de celpellet fixatie via 4% formaldehyde in PBS en Alcian blauw kleuring op histologische 8 µm paraffinecoupes. Tabel.1 Geselecteerde differentiatiestalen Hond

Osteogeen

Labrador - 6 jaar

Adipogeen

3 wells: differentiatie

5 wells: differentiatie

3 wells: (-) controle

1 well: (-) controle

3 wells: differentiatie

3 wells: differentiatie

(aspiraat)

3 wells: (-) controle

3 wells: (-) controle

Berner Sennen - 7 jaar

1 well: differentiatie

1 well: differentiatie

1 well: (-) controle

1 well: (-) controle

(aspiraat) Weimaraner - 5 jaar

(curettage)

Chondrogeen 3 Falcon tubes

3 Falcon tubes

1 Falcon tube* 6

* Omwille van een tekort aan cellen betrof het slechts 0,125 x 10 cellen

Tabel.2 Gebruikte differentiatiemedia Medium

Samenstelling

Osteogeen

low glucose DMEM (Invitrogen), 10% FKS (GIBCO), 0.2mM L-ascorbic acid-2-phosphate (Fluka), 100nM dexamethasone, 10mM biglycerophosphate, 50 mg/ml gentamycine, en 10 ml/ml antibiotic antimycotic solution (alles van Sigma). Gebaseerd op het basaal differentiatiemedium (Lonza), aangevuld met 10 ng/mL Transforming Growth Factor β3 (Sigma). DMEM-LG (Invitrogen), 1 mM dexamethasone, 0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 10 mg/mL rh-insuline, 0.2mM indomethacin, 15% rabbit serum, 50 mg/ml gentamycine, en 10 ml/ml antibiotic antimycotic solution (alles van Sigma). * Adipogeen onderhoudsmedium: cf. het adipogeen inducerend medium zonder dexamethasone, indomethacin en 3-isobutyl-1-methylxanthine.

Chondrogeen Adipogeen

2.3.3. Immunofenotypering Een derde criterium voor de herkenning van hMSC bestaat uit een positieve (CD73, CD90, CD105) en negatieve

(CD14,

CD79α

(of

CD19),

CD29α,

CD34,

CD45,

MHC-II)

selectie

van

celoppervlaktemerkers [1]. In tegenstelling tot hMSC zijn er echter niet veel gevalideerde monoklonale antistoffen beschikbaar tegen cMSC oppervlakteantigenen. Daarom baseerde deze studie zich op een

17

recent gepupliceerde studie van Screven et al. (2014) waarin getracht werd een lijst op te stellen van commercieel beschikbare antistoffen. De antistoffen werden dan allemaal flow cytometrisch geëvalueerd en gevalideerd m.b.v. positieve en negatieve controles [31]. Echter, omwille van praktische en budgettaire beperkingen richtte deze masterproef zich op het gebruik van een specifieke selectie van deze gevalideerde antistoffen (Tabel 3). Eveneens werden negatieve controles geïncludeerd via het gebruik van isotypes. Deze isotypes werden verdund zodat de concentraties overeenstemden met de concentraties van de gebruikte antistoffen tegen de celoppervlakteantigenen. Wat betreft de positieve controles, vertrouwde deze pilootstudie op de studie van Screven et al. (2014) en werden deze bijgevolg niet opnieuw uitgevoerd. Tabel.3 Geselecteerde antistoffen per multicolorpanel Panel 1

2

3

Antistof (conjugaat)

Expressie

Isotype (conjugaat)

Volume (concentratie)

anti-canine CD90 (PE)

+

Rat IgG2b (PE)

5 µl (100 µg/ml)

anti-human CD14 (Alexa488)

-

Mouse IgG2a (Fitc)

5 µl (25 µg/ml)

anti-canine CD44 (FITC)

+

Rat IgG2a (Fitc)

10 µl (25 µg/ml)

anti-canine CD34 (PE)

-

Mouse IgG1 (PE)

2,5 µl (200 µg/ml)

anti-canine MHC I

+

Mouse IgG2a (PE)

50 µl (15 µg/ml)

*sec: F(ab')2fragment of goat anti-

*sec: 100 µl (2,5 µg/ml)

mouse IgG (PE) anti-canine MHC II (APC)

-

anti-human CD29 (APC)

+/-

Rat IgG2a (Fitc)*

5 µl (50 µg/ml)

Mouse IgG1 (APC)

20 µl (50 µg/ml)

*t.g.v. onbeschikbaarheid van een isotype in hetzelfde kanaal, werd hier de autofluorescentie als negatieve controle gebruikt. De aangegeven volumes werden aangelengd met PBS + 1% BSA tot 100µl per tube. PE: Phycoerythrin, FITC: Fluorescein isothiocyanate.

Omdat het BM-staalvolume beperkt was, werd geopteerd om de merkers zoveel mogelijk simultaan te meten in multicolorexperimenten. Op basis van de beschikbaarheid van de antistoffen en de geconjugeerde fluorochromen alsook de minimalisatie van 'spectral overlap' van de emissiespectra van de gekozen fluorochromen werden 3 multicolorpanels opgesteld (Tabel 3, Appendix 1). Bij de samenstelling hiervan werd ervoor gekozen om steeds minstens 1 positieve merker per panel te includeren. Hoewel het anti-CD29 antistof oorspronkelijk in panel 2 geplaatst werd, is deze ten gevolge van grote interferentie met de andere merkers tijdens de optimalisatie getracht apart op te meten. Echter, omwille van niet reproduceerbare resultaten werd dit antistof alsnog geëxcludeerd uit de studie. Tijdens de optimalisatie werden alle antistoffen eerst afzonderlijk geëvalueerd tegenover hun isotypes en de aanwezige cellulaire autofluorescentie in monocolorexperimenten. De resultaten uit deze experimenten stemden overeen met de resultaten in de multicolorexperimenten zodat interferentie t.g.v. sterische hinder na simultane incubatie van de verschillende antistoffen kon worden uitgesloten. Omwille van een tekort aan beschikbare BM-cMSC, werd voor de optimalisatie gebruik gemaakt van cMSC uit bloed. Deze bloed-cMSC waren afkomstig uit een parallelle studie in het kader

18

van een andere masterproef en werden geïsoleerd en gecultiveerd op een identieke wijze aan de methode beschreven in deze studie (Michiel de Keyser, 2015). Drie cryotubes (2x beenmergaspiraat en 1x beenmerg curettage) met veronderstelde cMSC werden ontdooid, gevolgd door een snelle neutralisatie van het cryoprotectans door middel van toevoeging van de celsuspensie aan 10 ml koud geëquilibreerd expansiemedium. Vervolgens werd de 15 ml Falcon tube 10 minuten gecentrifugeerd aan 200g op kamertemperatuur en geresuspendeerd in 12 ml expansiemedium. Daarna werden de cellen ten minste 1 dag geïncubeerd op een T75 cultuurfles om ze te laten bekomen van de ontdooiing. Na incubatie werd 0,25% Trypsine-EDTA (Sigma-Aldrich) ontdooid in een 37°C warmwaterbad tot deze een gelijkaardige temperatuur bereikte. Het cultuurmedium werd verwijderd uit de T75 cultuurfles, gevolgd door een wasstap met 7 ml PBS. Na het wassen werd 7 ml warme 0,25% Trypsine-EDTA aan de cellen toegevoegd en 5 minuten geïncubeerd aan 37°C. Vervolgens werd na de incubatie de loslating van de cellen geëvalueerd onder de microscoop. De trypsine werd geneutraliseerd worden door middel van toevoeging van 7 ml koud expansiemedium aan de cellen. Hierna werden de cellen collecteerd in 15 ml Falcon tubes en 5 minuten gecentrifugeerd op 450g, 4°C. Na afgieten van het supernatans werd de celpellet geresuspendeerd in 600 µl DMEM (Invitrogen) + 1% BSA (Sigma). Celtelling werd bekomen door 15 µl 0,1% Trypaanblauw in PBS met 15 µl van de celsuspensie te mengen, 1 minuut te incuberen op kamertemperatuur en daarvan een volume van 10 µl op een Bürker telkamer te brengen. Op basis van deze celtelling werden vervolgens de nodige hoeveelheid levende cellen gepipetteerd en in een flow cytometer (FCM) tube gebracht. Deze werd 5 minuten gecentrifugeerd op 450g, 4°C. Na controle op aanwezigheid van een celpellet werd het supernatans afgegoten en werd de celpellet 6

geresuspendeerd in blocking buffer (1 ml 15% geitenserum in DMEM per 10 cellen, Sigma) en 15 minuten geïncubeerd op ijs conform de studie van Screven et al. Daarna werd elke FCM tube voorzien 5

van 10 geblockte cellen en gecentrifugeerd (5 min, 450g, 4°C). Na centrifugatie werden de volumes primaire antistoffen toegevoegd aan de cellen en aangelengd met DMEM + 1% BSA zodat een totaalvolume van 100 µl werd bekomen (Tabel 3). De gebruikte antistofconcentraties werden overgenomen uit de studie van Screven et al. (2014). Deze concentraties kwamen meestal overeen met de indicaties van de producent. De FCM tubes werden daarna 30 minuten geïncubeerd in een donkere koelkast op 4°C. Na de incubatie werden de cellen 2x gewassen met 250 µl DMEM + 1% BSA. Na de laatste centrifugatiestap en de verwijdering van het supernatans werd de celpellet geresuspendeerd in 400 µl PBS. De primaire antistof tegen MHC I was echter niet geconjugeerd aan een fluorochroom en vereiste bijgevolg een incubatie met secundaire antistoffen. Ter controle van aspecifieke binding werd eveneens geïncubeerd met secundaire antistoffen zonder aanwezigheid van primaire anti-MHC I antistoffen. Deze controle werd in een eerste stap enkel geïncubeerd met 100 µl DMEM + 1% BSA. Na 30 minuten incubatie in een donkere koelkast van 4°C werden de secundaire antistoffen 1x gewassen met 250 µl DMEM + 1% BSA. Net zoals de primaire antistoffen werd de celpellet uiteindelijk geresuspendeerd in 400 µl PBS. Na een eerste meting werd 10 µl celdoodmerker (7-amino-actinomycine D (7-AAD), 100 µg/ml) toegevoegd aan de multicolorpanels en de celsuspensie zonder antistoffen om de viabiliteit van de cellen te kunnen inschatten. Deze werden 10 minuten geïncubeerd in een donkere koelkast alvorens te meten. Alle metingen werden uitgevoerd op

19

a

een BD FacsCanto™ flow cytometer met geoptimaliseerde instellingen (Voltages: FSC: 10 V, SSC: 320 V, FL1: 470 V, FL2: 418 V, FL3: 300 V, FL5: 445 V; FSC-W treshold: 50 000; FSC area scaling: 0,84). Voor de geoptimaliseerde compensatiewaarden wordt verwezen naar tabel 4. Tabel.4 Geoptimaliseerde compensatiewaarden van de flow cytometer voor BM-cMSC. %

FL1

FL2

FL5

FL3

FL1

0

6,76

0,47

0

FL2

1,21

0

0,08

39,74

FL5

0

0

0

0

FL3

0,15

2,67

1,76

0

Hier wordt de bovenstaande rij steeds afgetrokken van de linkerkolom.

a

De gebruikte BD FacsCanto™ I flow cytometer is uitgerust met 2 excitatielasers (een 488 nm solid state en een 633 nm HeNe laser) en bijhorende emissiefilters (FL) om de fluorochromen in aparte kanalen te detecteren (voor 488 nm: FL1, 530 ±15 nm; FL2, 585± 21 nm; FL3 (670-735 nm) en FL4 (780 ± 30 nm) en voor 633 nm: FL 5 660 ± 10 nm en FL6 780 ± 30 nm). De analyse werd uitgevoerd met FACSDiva software 5.0.1. In Appendix 1 wordt bijkomende technische toelichting gegeven.

20

3. RESULTATEN EN BESPREKING 3.1. PRELEVATIE, ISOLATIE EN CULTUUR VAN cMSC 3.1.1. Prelevatie van cMSC

D

e keuze tot prelevatie van beenmerg-afgeleide MSC (BM-MSC) uit de tuberositas tibiae kan zowel praktisch als theoretisch beargumenteerd worden. Eerst en vooral kadert deze

pilootstudie, onder leiding van promotor Dr. Evelien de Bakker, binnen een groter onderzoek van de vakgroep Medische Beeldvorming en Orthopedie in samenwerking met de onderzoeksgroep Biochemie. Dit laat ons toe om op een regelmatige basis patiënten te ontvangen die omwille van een orthopedisch probleem, in dit geval een ruptuur van de craniale kruisband, een chirurgische ingreep moeten ondergaan waarbij het beenmerg sowieso vrij komt te liggen. Hierdoor vormt het preleveren van cellen uit deze weefsels geen bijkomende ethische bezwaren. De overvloed aan gepubliceerde data over MSC afkomstig uit het beenmerg bij meerdere species vormt een valabel theoretisch argument [1]. Zo toonden Hodgkiss-Geere et al. (2012) aan dat BM-cMSC een grotere capaciteit bezitten dan cMSC uit andere weefsels om te differentiëren naar musculoskeletale celtypes. Deze eigenschap is essentieel wanneer het uiteindelijk doel van de geëxpandeerde cMSC het therapeutisch inzetten in peesletsels is [74]. Wat betreft de gebruikte chirurgische technieken bij de prelevatie van het beenmerg (zowel aspiratie als curettage) kunnen enkele opmerkingen worden gemaakt. Een TTA rapid procedure vereist het doorzagen van de tuberositas tibiae. Dit gebeurt via een oscillerend zaagblad dat wordt afgekoeld door middel van manuele irrigatie met 0,9% NaCl. Bijgevolg gebeurt de afkoeling niet gelijkmatig en kunnen er potentieel lokale pieken van hoge temperaturen ontstaan. Zo toonden James et al. (2014) recent aan dat zaagsnelheid en stuwkracht een groot effect hebben op de diepte van de waargenomen osteonecrose waarbij piektemperaturen rond de 100°C werden geregistreerd [75]. Andere auteurs registreerden dergelijke schadelijke temperaturen enkel wanneer geen irrigatie werd gebruikt [76], maar eerder toonden Farell et al. (2011) aan dat irrigatie geen significant impact heeft op de gegenereerde piektemperaturen in een klinische setup [77]. Doorzagen van de tuberositas tibiae kan dus mogelijks oppervlakkige necrose uitlokken. De aspiratie werd uitgevoerd op zo'n 1,5 cm diepte, maar er werd gecuretteerd aan de oppervlakte. De cellen afkomstig uit dit gecuretteerd weefsel kunnen potentieel aangetast zijn door hoge temperaturen. Opening van de tibia zorgt er bovendien voor dat het vacuüm binnenin het bot verloren gaat. Wanneer er dan geaspireerd wordt, treedt er een verlies van zuigkracht op aangezien ook buitenlucht door de openingen van het spongieus bot in de spuit kan terecht komen. Dit contact met de buitenlucht kan mogelijks een negatieve invloed uitoefenen op het verdere verloop van deze pilootstudie (zie sectie 3.1.2) [78]. Bijkomend moet er door het verlies aan zuigkracht meerdere malen na elkaar worden geaspireerd en gaat er relatief veel tijd verloren vooraleer het aspiraat in contact komt met de heparine.

21

22

6 jaar

6 jaar

5 jaar

7 jaar

4 jaar

9 jaar

9 jaar

8 jaar

Labrador

Golden Retriever

Weimaraner

Berner Sennen

Visla

Golden Retriever

Labrador

Canis Vulgaris

1

2

3

4

5

6

7

8

Leeftijd

Ras

Hond 13, 27, -

4.2 x 106

Aspiraat**

2x SB 2x SB na tryp 2x cellen na tryp 46.6x106

2x SB 2x SB na tryp 2x cellen na tryp 1,76 x 106

2x SB 2x SB na tryp 2x cellen na tryp 7 x 106

10,6 x 106

10 (SB), 21, 28

/

17(uit spong), 35, -

/

15 (SB), 22, 34

/

16, 30, 48

/

0.81 x 106

/

/

/

/

/

/

/

2 x (0,7 x 106) 0.34 x 106

/

/

Cultuur na 17 dagen stopgezet wegens geen nieuwe celdelingen.

Cultuur na 57 dagen stopgezet wegens geen nieuwe celdelingen.

Staalname door een andere chirurg. CFU-F-negatief na 20 dagen cultuur.

Cultuur na 61 dagen stopgezet wegens geen nieuwe celdelingen.

Coagulaten in de stalen. CFU-F-negatief na 25 dagen cultuur.

SB eerst 3x gewassen in PBS . Cultuur na 62 dagen stopgezet wegens geen nieuwe celdelingen.

Aspiratiebuisjes 1/5 gevuld met heparine, conform [90]. CFU-F-negatief na 26 dagen cultuur.

Celdelingen gestopt op 19 dagen na 2e splitsing (op 10-20% confluentie). Culturen stopgezet na 62 dagen.

Aspiratiebuisjes gecoat met heparine, transport in EDTA. Nadien teruggekomen met purulente infectie van het kniegewricht en koorts. Contaminatie

* SB = Spongieus bot, Tryp = Trypsinatie, ** Deze stalen werden verder gebruikt ter karakterisatie van de cellen.

Curettage

Aspiraat

Curettage

Aspiraat

Curettage

Aspiraat

Curettage

Aspiraat

14 (SB), 27, 45 + 56

8, 27, -

0.7 x 106

Aspiraat

Curettage**

/

/

Curettage

Aspiraat**

17.88 x 106

Spongieus bot getransporteerd in EDTA

0.23 x 106 0.19 x 106 2 x (1.13 x 106)

17 (na Tryp), 30, 48 + 59 9, 19, -

/

1.8 x 106

Aspiraat

Curettage

Geen anticoagulantia gebruikt. SB werd niet gewassen. CFU-F negatief na 27 dagen in cultuur. Transport in EDTA, aspiratiebuisjes waren niet gecoat met heparine. Celdelingen gestopt op 19 dagen na 1e splitsing (op 40-50% confluentie). Culturen stopgezet na 65 dagen.

/

Geen anticoagulantia gebruikt.

Opmerkingen

1x SB

2 x (1.3 x 106)

Aantal MSC ingevroren

Curettage

11, 30, -

Passagetijd (dagen)

Aantal cellen op cultuur gezet

Bron

Tabel.5 Isolatie en cultuur van veronderstelde BM-MSC uit de tibia na aspiratie en curettage.

Ook het proces om de tibia te openen en de twee botdelen progressief uit elkaar te verwijderen vraagt veel tijd, waardoor de vrijgestelde oppervlakte mogelijks kan opdrogen en hemostase vertonen. Dit kan de kwaliteit van vooral de curettage negatief beïnvloeden. Hierbij moet eveneens de tijd worden opgeteld van het manueel curetteren en het overbrengen naar een EDTA-buisje. Bijkomend laat de wijze waarop geaspireerd werd nog ruimte tot verbetering. In deze pilootstudie werd er bijvoorbeeld geen gebruik gemaakt van een naald met een stilet waardoor de naald sneller verstopt geraakte. Daarenboven werd de naald waarmee de heparine werd opgetrokken vervangen door een andere naald om het beenmergaspiraat te preleveren. Deze nieuwe naald werd bijgevolg niet geflusht met heparine waardoor het hemorrhagische aspiraat de kans kreeg om te stollen tijdens passage door die naald. Eén recente studie (2014) bij primaten hield wel rekening met beide aspecten [79]. In een andere studie op mensen raden Hernigou et al. (2013) aan om kleinere spuiten te gebruiken voor de aspiratie van beenmerg. Grotere spuiten zouden geen verhoogde celopbrengst opleveren, maar enkel zorgen voor dilutie door verhoogde opname van bloed. Om dezelfde reden wordt er ook aangeraden om de spuiten niet volledig te vullen tijdens aspiratie [80]. Deze auteurs toonden eveneens aan dat aspiraties op een afstand kleiner dan 1 cm van elkaar resulteerden in een verminderde celopbrengst [80]. Ook de lokatie van de beenmergprelevatie kan in vraag worden gesteld. Immers, de proximale tibia vormt geen routinematige punctieplaats om beenmerg te bekomen bij de hond (Figuur 9). Hoewel andere studies al eerder cMSC hebben kunnen isoleren uit het tibiaal-BM [81], was onze motivatie vooral van praktische aard aangezien de tuberositas tibiae sowieso wordt geopend tijdens een TTA rapid. Deze benadering is echter niet de enige mogelijkheid. Wanneer de relatieve hoeveelheid cMSC uit het BM vergeleken wordt met die van het infrapatellaire (IFP) vetweefsel uit de knie, blijkt dat het initiële aantal adherente cellen uit BM hoger is dan het aantal adherente cellen uit het IFP vetkussen [28].

De

IFP-

en

BM-MSC

vertonen

desondanks

gelijkaardige

expansiesnelheden

en

multipotentialiteit. Ook de proliferatie- en differentiatiecapaciteiten na cryopreservatie van beide bronnen zijn gelijklopend. Verse IFP-MSC vormen dus een goed alternatief voor BM-MSC [28]. Bovendien toont een andere studie aan dat het IFP vetkussen de hoogste densiteit aan cMSC bevat in vergelijking met andere intra-articulaire structuren uit de knie, waaronder de craniale kruisband en de synoviale aflijning van het kniegewricht. Ook vertoonden deze IFP-MSC de hoogste in vitro expansiesnelheid, multipotentialiteit, de hoogste expressie van weefselspecifieke genen en percentage van MSC immunofenotypes na in vitro differentiatie [82]. Er wordt geconcludeerd dat IFPMSC de beste bron vormt van adulte MSC in het kniegewricht van de hond. Daarenboven kunnen de cMSC uit het IFP vetweefsel evenwaardig worden beschouwd als BM-cMSC [82].

23

Fig.9 Overzicht van klinische toegankelijke beenmergpunctieplaatsen bij de hond: (A) de proximale humerus, net onder de tuberculum majus; (B) laterale benadering van het os ilium, net onder de crista iliaca; (C) dorsale benadering van het os ilium, op de crista iliaca; (D) de proximale femur, in de fossa trochanterica. Uit [1]. Het relatief hoge aantal startcellen geïsoleerd van enkele donoren (honden 5, 6 en 8; Tabel 5) kan waarschijnlijk worden verklaard door de verhoogde hoeveelheid heparine die in deze stalen is gebruikt. Dit brengt immers tijdens aspiratie een verhoogde bijmenging van bloed met zich. Bij donor 7 werd dergelijke overvloed aan startcellen niet opgemerkt. Echter, deze staalname werd uitgevoerd door een andere chirurg, wat er op kan wijzen dat ook de ervaring van de staalnemer een significante factor kan zijn in de hoeveelheid gepreleveerde cellen. Tot slot dient te worden opgemerkt dat bij donor 3 postoperatief een bacteriële artritis werd vastgesteld. Hoewel er op het moment van de staalname geen indicaties waren van infectie, vertoonde het curettagestaal tijdens cultuur tekenen van bacteriële contaminatie. Hiervoor zijn 3 mogelijke scenario's op te stellen: (1) de infectie was reeds aanwezig bij aanvang van de chirurgie; (2) de contaminatie werd tijdens de chirurgie opgelopen, bijvoorbeeld door onvoldoende steriliteit van het operatieveld of van de gebruikte materialen; (3) contaminatie van het staal tijdens transport naar het laboratorium. Deze derde optie kan worden uitgesloten want ze verklaart niet waarom ook de patiënt geïnfecteerd werd. Aangezien er tijdens de artrotomie geen macroscopische tekenen van infectie konden vastgesteld worden, lijkt de tweede optie dus het meest waarschijnlijk ondanks de uitgebreide voorzorgen en ervaring van de chirurg. 3.1.2. Isolatie van cMSC De methode van celisolatie is grotendeels gebaseerd op het eerder vermelde protocol voor equine MSC, maar is niet identiek [32]. Het verschil bevindt zich in de initiële stap van het isolatieprotocol. Aangezien de MSC van De Schauwer et al. (2011) afkomstig waren uit navelstrengbloed, werd een eerste selectie

uitgevoerd door deze cellen 20 minuten te centrifugeren aan 1000g bij

kamertemperatuur. Daarna werd de buffy coat gecollecteerd en 1:1 verdund in HBSS. Zo werden

24

overtollige en potentieel interfererende plasmabestanddelen en rode bloedcellen afgescheiden van de mononucleaire celfractie. Die eerste stap wordt echter overgeslagen in deze pilootstudie aangezien de verkregen stalen veel minder volumineus waren (1-2 ml beenmerg ten opzichte van 150 ml equin navelstrengbloed). De daaropvolgende stap van centrifugatie op een densiteitsgradiënt van Percoll, alsook alle andere stappen werden wel conform het protocol voor equine MSC uitgevoerd. De verminderde celopbrengst kan dus niet te wijten zijn aan deze licht aangepaste methode aangezien met het vereenvoudigde protocol er net potentieel meer cellen aanwezig zouden zijn. Omdat zowel de isolatie als de expansie van de cellen waarschijnlijk geen grote invloed hadden op het uiteindelijk aantal verkregen cellen, is onze hypothese dat vooral de manier van staalname kan worden aangewezen als oorzaak van het gelimiteerd aantal cellen in deze pilootstudie. De geobserveerde beperkte in vitro proliferatie kan deels worden toegewezen aan de kwaliteit van de cellen. Immers, aangezien een ruptuur van de craniale kruisband vooral voorkomt bij honden op oudere leeftijd, werd er in deze pilootstudie dan ook gebruikt gemaakt van beenmergstalen van oudere honden (n = 8, range 4 en 9 jaar; gemiddeld 6,8 jaar). Dit kan betekenen dat er minder MSC aanwezig zullen zijn in het bemonsterde weefsel dan bij jongere honden en dat de gepreleveerde MSC in vitro een verminderde proliferatiecapaciteit zullen vertonen [81, 83]. Eveneens is het te verwachten dat cellulaire senescentie sneller zal worden bereikt [83]. Deze trend werd ook waargenomen in deze pilootstudie. De BM-cMSC vertoonden immers een duidelijk verminderde proliferatiecapaciteit in vitro naarmate het aantal passages steeg

a

(Tabel 5). Hoe langer de

veronderstelde cMSC in cultuur werden gehouden, hoe minder snel ze in celaantal verdubbelden. Deze observatie kon in alle stalen van de 8 donoren worden opgemerkt. Een interessante opmerking hierbij is dat enkele onderzoeksgroepen al bij meerdere species hebben aangetoond dat MSC een betere expansie vertonen in hypoxische cultuuromstandigheden (Figuur 10) [84, 85]. Hypoxie zou daarbij geen snellere celdelingen induceren, maar er voor zorgen dat hMSC minder snel hun proliferatieve eigenschappen verliezen bij hogere celdensiteiten. Immers, de in deze pilootstudie gehanteerde 20% O2 tijdens celcultuur komt overeen met een 4-10x hogere zuurstofspanning dan deze aanwezig in de in vivo BM-stamcelniche, wat kan leiden tot oxidatieve stress en vervolgens vroeger optredende replicatieve senescentie, langere "population doubling times" en DNA schade [78]. Cultuur onder hypoxische omstandigheden kan leiden tot een 50x hogere celopbrengst tijdens de eerste 5 passages in vergelijking met normoxische cultuurcondities [86]. Intracellulaire accumulatie van Hypoxia-inducible Factors (HIF's) die fungeren als belangrijke transcriptiefactoren onder dergelijke omstandigheden zouden hierin een cruciale rol vervullen [87]. Eveneens zou de minimalisatie van de productie van schadelijke zuurstofradicalen uit de mitochondria tijdens hypoxie een significante invloed hebben op het in vitro gedrag van MSC [88]. Het is daarom onze hypothese dat de uitgevoerde zuurstofrijke aspiratie en curettage van beenmerg een potentieel negatieve invloed had op de geaspireerde cellen. De positieve invloed van verdere cultuur onder hypoxische omstandigheden zou zich onder andere uiten in een langere aanwezigheid van de typische spoelvormige morfologie van hMSC [84]. Immers, een oudere studie van Bruder et al. (1997) wees al

a

Omwille van het beperkte aantal in vitro passages (i.e. 2-3) van de cMSC in deze pilootstudie, kunnen er geen objectieve parameters zoals Population Doubling Time en Cell Doubling Number bepaald worden.

25

uit dat slankere spoelvormige hMSC een hogere proliferatiecapaciteit en differentiatiepotentieel vertoonden dan de brede, plattere hMSC die vaak worden gezien in latere passages [89]. Deze winst aan stamcellen na hypoxische cultuur kan ervoor zorgen dat de nodige hoeveelheid MSC om therapeutisch te worden ingezet sneller bereikt wordt zodat therapieën met autoloog ingezette MSC minder gehinderd worden door de langere tijd die in vitro cultuur opeist in vergelijking met allogene MSC.

Fig.10 Kolonievorming op een plastic ondergrond: 100 hMSC per plaat, 12 dagen expansie en aankleuring met Giemsa. Expansie onder hypoxische (5% O2) cultuurcondities (rechts) resulteert in meer CFU-F dan expansie onder normoxische (20% O2) condities (links). Bron: https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A15652 3.1.3. Cultuur van cMSC Zoals blijkt uit Tabel 5 is het beperkte aantal cellen één van de belangrijkste limitaties van deze pilootstudie. Het aantal geïsoleerde cellen en/of het aantal opgekweekte cellen lag meestal beneden de verwachtingen. Ook waren de resultaten zowel tussen de 8 donoren, als tussen het aspiraat en de curettage, zeer wisselvallig. Hiervoor kunnen meerdere oorzaken worden aangehaald. Zo kunnen de cultuurcondities in vraag worden gesteld. In dit onderzoek werd immers gebruik gemaakt van geoptimaliseerde isolatie- en cultuurcondities voor equine MSC afkomstig uit navelstrengbloed zoals beschreven door De Schauwer et al. (2011) [32]. Het lijkt voor de hand te liggen dat deze condities kunnen verschillen van de optimale condities voor BM-cMSC. Deze denkpiste moet echter sterk gerelativeerd worden aangezien cellen uit enkele stalen in deze pilootstudie toch in voldoende aantal werden geïsoleerd en/of in staat bleken om goed te groeien in deze condities. Bovendien groeiden cMSC geïsoleerd uit perifeer bloed, die bestudeerd werden in een parallelle pilootstudie (masterproef Michiel de Keyser, 2015) wel vlot in identieke condities. Dit sluit dus de veronderstelde speciesspecificiteit uit. De oorsprong van de onreproduceerbare resultaten moet bijgevolg waarschijnlijk in het gebruikte prelevatieprotocol gerelateerd aan BM als bron gesitueerd zijn zoals in sectie 3.1.1. werd besproken. De tegenvallende celopbrengsten lieten een vooropgestelde vergelijkende crossover studie tussen aspiraat- en curettagestalen uit eenzelfde donor niet toe. Hoewel de oudere leeftijd van de donoren deels de geobserveerde beperkte proliferatiecapaciteit kan verklaren, zijn er nog andere factoren in het staalnameproces die in acht moeten worden genomen. Zo is het aantal gepreleveerde stalen in deze pilootstudie (n = 8, zowel voor aspiraat als voor curettage) te beperkt om eenduidige conclusies

26

te kunnen trekken. Immers, bij lage steekproefgroottes kunnen stochastische factoren een grotere rol gaan spelen en gaat de statistische power van de studie achteruit. Zeker wanneer het protocol uit zoveel verschillende stappen bestaat die elk een bijdrage kunnen leveren tot het resultaat. In de geest van een 'pilootstudie' werden er bovendien ook soms op basis van eerder verkregen celaantallen aanpassingen van het bemonsteringsprotocol uitgevoerd. Zo werd het gebruik van transport op EDTA pas ingevoerd vanaf donor 2 en werd de aspiratie in aanwezigheid van heparine pas ingevoerd vanaf donor 3. Een interessante kanttekening hierbij is dat het beenmergaspiraat van hond 1 een goede celopbrengst opleverde, ondanks de aanwezigheid van stolling. Ook het volume van de heparine in het aspiratiebuisje werd soms aangepast in de hoop een vlottere aspiratie en een hoger aspiratievolume te bekomen. Aangezien dit een cruciale factor kon betekenen, werd dit volume later vastgelegd op 1/5

de

van het aspiratiebuisje, conform de studie van Chung et al. (2012) [90]. Tot slot

varieerde ook de uitvoerende chirurg. Al dient te worden opgemerkt dat beide chirurgen ervaren zijn in het nemen van beenmergstalen. 3.2. KARAKTERISATIE 3.2.1. Adhesie van cMSC aan plastic Wanneer MSC worden opgekweekt op een ongecoate plastic ondergrond, dan zijn ze in staat om zich erop vast te hechten en koloniegewijs celverdubbelingen te ondergaan. Dit eerste criterium in de karakterisatie van MSC werd al voorgesteld door Friedenstein et al. in 1970 en sindsdien onveranderd toegepast [11, 38]. De verhouding CFU-F ten opzichte van het totale aantal mononucleaire cellen in 4

5

zowel humane als caniene beenmergstalen wordt geschat op 1/10 tot 1/10 [14, 91]. Daarbij wordt elke gevormde kolonie in vitro verondersteld afkomstig te zijn van stamcellen en/of progenitoren aanwezig in het beenmergstaal [92]. Volledig gedifferentieerde cellen hechten zich dus niet vast aan plastic. Aangezien de densiteit waarmee de beenmergcellen op cultuur worden gezet laag is, zullen de afzonderlijke cellen elkaar initieel niet raken. Daardoor kan het aantal gevormde kolonies geassocieerd worden aan de fractie van stamcellen en/of progenitoren aanwezig in het totaal aantal gekernde cellen dat op cultuur werd gezet [92]. Een belangrijke opmerking is dat niet alle cellen uit CFU-F verdere stamceleigenschappen zullen vertonen [93]. Bijkomende criteria zijn dus essentieel om MSC correct te karakteriseren. Geïnspireerd op het gedrag van hematopoëtische stamcellen merkten Cordeiro-Spinetti et al. (2014) op dat intermediaire progenitoren sneller expansie zullen ondergaan in vitro [92]. Dit heeft als gevolg dat de cellen uit deze kolonies ook sneller klonaal uitputten. Daarentegen zullen minder gedifferentieerde stamcellen trager geactiveerd worden, maar putten ze minder snel klonaal uit. Op voorwaarde dat er genoeg tijd wordt voorzien zal deze laatste celpopulatie dus in staat zijn om grotere kolonies aan te leggen. Op deze wijze kan koloniegrootte geassocieerd worden met het stadium van differentiatie van de originele cel [92]. Wanneer dit concept wordt toegepast op deze pilootstudie, kan worden geobserveerd dat vele stalen inderdaad een aanvankelijk snelle groei vertoonden maar ook snel cellulaire senescentie bereikten (Tabel 5). Dit wijst er op dat de meeste cellen waarschijnlijk deel uitmaakten van een celpopulatie van progenitoren. Aangezien er na lange cultuurtijden geen aanleg

27

van nieuwe CFU-F kon worden opgemerkt, waren er waarschijnlijk weinig volledig ongedifferentieerde stamcellen aanwezig in de celculturen. Zoals aangehaald in sectie 3.1.1., kan de relatief oude leeftijd van de donoren hiervoor een verklaring zijn.

Fig.11 Lichtmicroscopisch beeld van representatieve veronderstelde caniene BM-afgeleide CFU-F na enkele weken expansie. Tijdens de expansie van CFU-F komen meerdere celvormen voor. Fasecontrast, 200x (links), 200x (midden) en 100x (rechts).

De expanderende cellen vertoonden een variërende morfologie gaande van spoelvormig tot meer kubusvormig met kleinere celuitlopers (Figuur 11) [94, 32]. Gothard et al. (2013) maken hierbij een verder onderscheid tussen cellen uit kolonies van intermediaire progenitoren, die eerder een groot stervormig uitzicht vertonen, en echte stamcellen, die vaak een slankere en spoelvormige morfologie hebben [95]. De simultane aanwezigheid van spoel- en stervormige cellen werd ook vaak geobserveerd in deze pilootstudie. Hier werd echter initieel weinig belang aan gehecht aangezien het moeilijk uit te maken was of de dikkere, stervormige cellen een aparte populatie vormen dan wel een verder stadium van de slanke spoelvormige cellen zijn. De biologische respons van MSC in cultuur alsook hun capaciteit om kolonies te vormen, is bovendien afhankelijk van de eigenschappen van het gebruikte FKS [96, 27]. In deze studie kregen de cellen 24u de tijd om zich vast te hechten, maar ook deze periode is mogelijks afhankelijk van de kwaliteit van het gebruikte FKS [96]. Daarom wordt het gebruikte FKS best aan een aantal kwaliteitsparameters onderworpen voor gebruik. Ook wordt binnen 1 studie bij voorkeur enkel gebruik gemaakt van FKS afkomstig van eenzelfde lot zodat de condities voor elke cultuur identiek zijn. Hiermee werd ook rekening gehouden in deze pilootstudie. Om deze biologische variatie te omzeilen vormt het gebruik van een combinatie recombinante groeifactoren een alternatief op het klassiek gebruik van FKS in cultuurmedia. Echter, kwalitatieve en kwantitatieve eigenschappen van de nodige groeifactoren die moeten worden ingeschakeld om FKS integraal te kunnen vervangen, zijn nog niet volledig gekend [92]. Ook vormt de economische factor in deze benadering een probleem [92]. Toch wordt er intensief verder gezocht naar waardige alternatieven voor FKS, zo kan lysaat van bloedplaatjes mogelijks een oplossing bieden [97]. 3.2.2. Osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie van cMSC Uit beenmerg geïsoleerde cellen van 3 honden werden ontdooid en op cultuur gezet, het betrof 2 aspiraatstalen (donor 1 en 3) en 1 curettagestaal (donor 4). De gewenste confluentie van 90-100% werd na 6 dagen expansie enkel bereikt in de wells bestemd voor adipogene differentiatie van 1 van de aspiraatstalen (donor 1). Op dag 13 werd er uit vrees voor cellulaire senescentie en

28

daaropvolgende loslating van de cellen beslist om ook de andere differentiaties op te starten (donor 3 en 4, Tabel 6). Tabel.6 Tijdsverloop van de confluentie tijdens de differentiatie

Beenmergstaal

Tijdstip (dagen)

Confluentie osteogeen (%)

Confluentie adipogeen (%)

Aspiraat 1

1

10

15

6

40

90-100

13

80

5

19

80

5

27

70

5-10

30

60

5-10

1

5

5

6

10

50

13

10

50

19

5-10

5

27

30

5

30

20-30

5

1

<5

<5

6

5

5

13

5

5

19

5-10

<5

27

5-10

<5

30

5-10

<5

Aspiraat 2

Curettage

De aanvang van de differentiatie wordt weergegeven via een donker kader. Tijdens deze drievoudige differentiaties kon in geen van de negatieve controles een grote terugval van de confluentie worden gezien. In één van de negatieve controlestalen van aspiraat (donor 3) werd zelfs een uitbreiding van het aantal CFU-F gezien na aanvang van de differentiatie. Dit wijst er op dat de uitgezette cellen in dat staal nog geen replicatieve senescentie bereikt hadden. In de andere 2 controlestalen (donor 1 en 4) konden daarentegen geen duidelijke celverdubbelingen meer worden aangetoond na de start van de differentiatie. Bijgevolg wordt het bereiken van de limiet van proliferatiecapaciteit sterk vermoed in deze beide stalen. De chondrogene differentiaties op de bodem van de 15 ml Falcon tubes konden tijdens cultuur niet microscopisch ingeschat worden. Opmerkelijk was de terugval naar 5% confluentie na de start van elk van de 3 adipogene differentiaties. Dit was het meest uitgesproken in het eerste aspiraatstaal, waar 90-100% confluentie in enkele dagen werd teruggedreven tot 5%. Dit kan erop duiden dat het adipogeen medium zeer selectieve groei toelaat waarbij enkel de cellen die over genoeg potentie beschikken om te transformeren naar adipocyten zullen expanderen. Aangezien dergelijke terugval van confluentie niet werd gezien in het osteogeen medium kan worden gesuggereerd dat het osteogeen medium minder specifiek expansie toelaat. Deze hypothese wordt verder ondersteund door de observatie van een

29

aantal traag expanderende kolonies na een tiental dagen expansie in adipogeen inducerend medium. Zoals vermeld is de tragere opkomst van een aantal CFU-F in het adipogeen medium mogelijks te wijten aan een tragere groei van minder gedifferentieerde stamcellen en progenitoren [92]. Bijgevolg kan het gebruikte adipogeen medium een ideale indicator zijn van het relatieve aantal ongedifferentieerde stamcellen in de totale celpopulatie waarbij dus enkel de cellen met voldoende adipogene potentie de kans krijgen om over een langere periode kolonies aan te leggen. De tragere opkomst van stamcellen kon dus beter worden opgemerkt tijdens de differentiatie dan tijdens de voorafgaande expansie. De periode van adipogene differentiatie was immers langer dan de periode van de expansie (18 versus 12 dagen). Een representatief voorbeeld van de subjectieve inschatting van confluentie wordt gegeven in Figuur 12.

A

B

C

D

Fig.12 Subjectieve inschatting van de confluentie: A: 5%, B: 30%, C: 70%, D: 90-100% Na 3-4 weken differentiatie in de bovenvermelde media werden zowel de gedifferentieerde cellen als de negatieve controles histologisch aangekleurd. Bij vergelijking met de data van De Schauwer et al. (2011) uit onze onderzoeksgroep, kon chondrogene differentiatie aangetoond worden op 2 van de 3 stalen [32]. Hierbij gaven cellen van het aspiraat een kwalitatief superieur beeld in vergelijking met de curretage (donor 3 en 4, Figuur 13). Dit resultaat moet echter voorzichtig worden geïnterpreteerd aangezien er omwille van een celtekort geen negatieve controles beschikbaar zijn. Het aspiraatstaal waar geen chondrogene micromassa kon worden aangetoond was gecontamineerd door een schimmel. Daarentegen kon er in geen enkel adipogeen of osteogeen gedifferentieerd staal worden aangetoond dat er differentiatie had plaatsgevonden. Figuur 14 geeft de verwachte resultaten weer, alsook hoe de cellen eruit zagen vóór en na histologische kleuring. Aangezien de drievoudige differentiatie één van de essentiële kenmerken is om als (c)MSC te worden beschouwd kunnen de bekomen cellen in deze pilootstudie onmogelijk onder deze term worden ingebracht. Anderzijds kan er op basis van deze negatieve adipogene en osteogene differentiatieresultaten niet zomaar worden besloten dat de oorspronkelijk aangebrachte cellen geen cMSC waren. Correcte differentiatie vereist

30

immers volledige confluentie met maximaal cel-cel contact alvorens over te schakelen van expansiemedium naar differentiatiemedium. Dit criterium diende in deze pilootstudie te worden verlaten omwille van het zeer beperkte proliferatievermogen van de gecultiveerde cellen. De chondrogene differentiatie gebeurde in een 3-dimensioneel 'micromass' systeem en vereiste dus geen confluente monolayer op plastic.

Fig.13 Lichtmicroscopische opname (400x) van Alciaan blauw aangekleurde glucosaminoglycanen in de chondrogeen gedifferentieerde celpellet van BM-aspiraat. Kader (F) van Figuur 14 geeft een microscopische weergave van het enige beenmergstaal (aspiraat van donor 1) dat volledige confluentie bereikte voor de differentiatie werd opgestart. Ten gevolge van de eerder besproken sterke terugval van confluentie naar 5% bij de gedifferentieerde cellen is enkel de negatieve controle van dat staal met voldoende confluentie overgebleven. Hierin werd duidelijk waargenomen dat dat de cellen in clusters over elkaar zijn gaan groeien en andere morfologische eigenschappen zijn gaan vertonen. Dit ander uitzicht is waarschijnlijk toe te schrijven aan differentiatie ten gevolge van een hoge mate aan cel-cel contact. Aangezien deze negatieve controle echter niet aankleurt met Oil Red O en er dus geen intracellulaire vetdruppels kunnen worden aangetoond, is deze vermeende differentiatie niet in de richting van adipocyten gebeurd. Desondanks kan dit wel een indicatie zijn dat het bereiken van volledige confluentie een essentiële stap is om over te gaan tot correcte differentiatie. Dezelfde redenering kan gemaakt worden voor de geslaagde chondrogene differentiaties. Vóór de differentiatie werden daarbij alle 15 ml Falcon tubes gecentrifugeerd zodat onderaan deze buisjes een 3-dimensionele micromassa van opeengepakte cellen werd gecreëerd. Tijdens de daaropvolgende differentiatie werd deze celmassa niet meer in suspensie gebracht. Bijgevolg vormde het gebrek aan cel-cel contact hier geen probleem en kon de chondrogene differentiatie optimaal verlopen. Door een gebrek aan cellen konden er geen negatieve controles worden voorzien voor de chondrogene differentiaties, wat ervoor zorgt dat de interpretatie van deze resultaten met de nodige voorzichtigheid moet gebeuren. De vermoedelijke aanwezigheid van chondrogene cellen kan dus wijzen op de aanwezigheid van cMSC in de differentiatietesten. Echter ten gevolge van een sterk gedaalde proliferatiecapaciteit kon volledige confluentie tijdens zowel osteogene als adipogene differentiatie niet bereikt worden. Dit vormde hoogst waarschijnlijk de reden waarom de cellen daarin geen verdere differentiatie ondergingen en er bijgevolg geen positieve histologische kleuringen konden worden aangetoond.

31

Osteogeen

Adipogeen

A

B

C

D

E

F

G

H

Fig.14 Lichtmicroscopisch beeld van de geïnduceerde cellen uit deze pilootstudie (A-F). Osteogeen geïnduceerde cellen vóór (A) en na (C) histologische kleuring met Alizarin Red. Adipogeen geïnduceerde cellen vóór (B) en na (D) histologische kleuring met Oil Red O. Aangekleurde osteogene (E) en adipogene (F) negatieve controles. Kader: close-up. Voorbeeld van Alizarin Red (G) en Oil Red O (H) aangekleurde cMSC uit Spencer et al [28].

32

De adipogene differentiaties waren dus duidelijk negatief. Op discrete lokaties werd echter wel een aantal cellen teruggevonden met intracellulaire adipogene vetdruppels (Figuur 15). Dit werd enkel opgemerkt op het eerste adipogeen gedifferentieerde aspiraat (hond 1). De geringe hoeveelheid aangekleurde vetdruppels kon echter niet overtuigen dat deze cellen daadwerkelijk adipocyten waren, niettemin konden ze wel dienen als een bescheiden positieve controle voor de kleuring.

Fig.15 Lichtmicroscopische opname (400x) van enkele Oil Red Oaangekleurde vetdruppels in het cytoplasma van cellen uit canien BMaspiraat (donor 1) na expansie in adipogeen inducerend medium. 3.2.3. Immunofenotypering van cMSC Zoals vermeld in de Materialen en Methoden baseerde deze pilootstudie zich op het recente artikel van Screven et al. (2014) waarin een overzicht wordt gegeven over gevalideerde commercieel beschikbare antistoffen om BM-cMSC te fenotyperen via flow cytometrie (technische aspecten, Appendix 1) [31]. Deze auteurs gebruikten onder andere een anti-humane CD29 antistof met kruisreactiviteit tegen het caniene CD29 en hun data suggereerde dat BM-cMSC CD29 negatief waren. De Schauwer et al. (2011) toonden echter aan dat equine MSC CD29 positief kunnen zijn [32]. Dit werd ook aangetoond op cMSC uit beenmerg en vetweefsel [36, 98]. Vieira et al. (2010) gebruikten een anti-caniene CD29 antistof, daarom werd in deze pilootstudie dan ook bijkomend geopteerd om een anti-caniene CD29 antistof te evalueren (Appendix 2). Het anti-caniene CD29 antistof toonde bij preliminaire tests echter onvoldoende werking voor flow cytometrie en werd daarom niet verder gebruikt. Omwille van de gelimiteerde hoeveelheid BM-cMSC werd de initiële optimalisatie van het flow cytometrisch protocol op perifeer bloed-cMSC uitgevoerd (masterproef Michiel de Keyser, 2015, data niet weergegeven). Deze veronderstelde bloed-cMSC vertoonden immers een betere in vitro expansie dan onze veronderstelde BM-cMSC waardoor er veel meer van deze cellen beschikbaar waren. Ter voorbereiding van de meting op de veronderstelde BM-MSC werden antistoffen tegen CD14, CD44, CD34, CD29, MHC I en MHC II met hun respectievelijke isotypes geëvalueerd in zowel mono- als multicolortesten

(panelsamenstelling,

zie

Materialen

en

Methoden).

Na

evaluatie

van

de

geconjugeerde antistoffen in aparte tubes werd de 'spectral overlap' en de daarbijhorende 'bleed through' van de emissiespectra in andere kanalen bepaald en vastgelegd in compensatiewaarden (Tabel 4 en Appendix 1). Er dient te worden opgemerkt dat op het moment van deze

33

immunofenotypische optimalisatie de identiteit van noch de veronderstelde bloed-MSC noch de veronderstelde BM-MSC microscopisch geverifieerd was via drievoudige differentiatie. Een eerste indicatie over de morfologische identiteit van de beschouwde cellen wordt gegeven a

door de FSC versus SSC dot plot, ook wel scatterplot genoemd. De FSC-W versus SSC-A

scatterplot is een uitzetting van de relatieve granulariteit ten opzichte van de relatieve grootte van de cellen en dus een weergave van de morfologische kenmerken van een celpopulatie. Op basis van hun lokalisatie kunnen de cellen eventueel verder worden afgebakend binnen een 'gate'. Onze strategie om de gewenste celpopulatie af te bakenen bestond uit de morfologische afbakening op de FSC-W versus SSC-A scatterplots. Daarop kon alleen een onderscheid gemaakt worden tussen het celdebris en één grote celpopulatie die niet objectief verder kon worden onderverdeeld in subpopulaties. Aangezien de celviabiliteit op alle stalen groter dan 90% was, werd geen verdere exclusie van de dode cellen uitgevoerd. Tot slot werd een meting als positief beschouwd indien de signaalpiek van de merker boven het signaal van het isotype lag (Appendix 3). Dit werd zowel visueel als kwantitatief (%) beoordeeld. Voor MHC I werd het secundaire antilichaam gebruikt om de mate van aspecificiteit te beoordelen. Omwille van onbeschikbaarheid van een isotype met hetzelfde conjugaat werd voor MHC II de aanwezige cellulaire autofluorescentie gebruikt (Appendix 3). Op de scatterplots uit deze pilootstudie konden we visueel meestal slechts één populatie afbakenen. De FSC-A versus SSC-A scatterplots van de cMSC uit Screven et al. (2014) vertoonden visuele gelijkenis met de scatterplots van de perifeer bloed-cMSC en deze van de BM-cMSC uit de curettage (Figuur 16 A versus B, C, D en F). Daarbij kon op de FSC-area versus SSC-area steeds een duidelijk afgescheiden celpopulatie worden geobserveerd met relatief lage granulariteit en matige celgrootte. Daarentegen werd in de scatterplot van de BM-cMSC uit het aspiraat veel minder duidelijk een dense celpopulatie gezien. Ook waren daarop de meeste cellen gelokaliseerd in een gebied met grotere celgrootte en granulariteit, en kwamen ze wijder verspreid voor op de scatterplots. Dit kan erop wijzen dat er een inherent morfologisch verschil is tussen de cellen uit het BM-aspiraat en de cellen uit de BM-curettage. De wijdere verspreiding bij deze laatste duidt bovendien op een grotere morfologische heterogeniteit (Figuur 16 D en G).

a

Forward Scatter (FSC) is een maat voor de celgrootte, Side Scatter (SSC) voor de celgranulariteit. Bij elke registratie van een event wordt een voltage puls gegenereerd. Van deze puls kan de oppervlakte onder de curve (area, A), de breedte (width, W) en de hoogte (height, H) worden bepaald. De weergegeven assen van een scatterplot kunnen zelf worden gekozen (zie ook Appendix 1).

34

A

B

C

D

E

F

G

Fig.16 FSC-A versus SSC-A en FSC-W versus SSC-A scatterplots van BM-cMSC uit Screven et al. (2014) (A). Dot plots van perifeer bloed-cMSC (B en E) uit deze pilootstudie. Dot plots van BM-cMSC uit de curettage (C en F) en het BM-aspiraat (D en G); vanaf B allen uit deze pilootstudie. Deze laatste vertonen duidelijk een ander morfologisch patroon. Wanneer de expressie van de gemeten celoppervlaktemerkers meer in detail worden bekeken, dan kan worden geobserveerd dat de meeste stalen een gelijklopend expressiepatroon vertonen als de BM-cMSC vermeld door Screven et al. (2014) (Tabel 7, representatieve histogrammen zie Appendix a

b

3). Alle stalen waren uniform positief voor CD90 én CD44 , waarbij de hoogste CD44 expressie werd c

geobserveerd op de cellen uit BM-curettage van hond 4. Ook MHC I werd op bijna alle stalen sterk positief bevonden, enkel op één van beide BM-aspiraatstalen kon geen MHC I expressie worden aangetoond. Dit laatste werd eveneens geobserveerd in de studie van Screven et al. (2014). Op geen d

e

enkel BM-staal kon de expressie van CD14 of MHC II worden aangetoond. Een representatief voorbeeld van de histogrammen na softwarematig bekomen overlay wordt weergegeven in Figuur 17 (meer voorbeelden, zie Appendix 3).

a

CD90 is een celoppervlakte eiwit van de immunoglobuline superfamilie, een populaire stamcelmerker. CD44 is een celoppervlakte glycoproteïne met een rol in celadhesie en celmigratie. c MHC I presenteert cytosolische peptiden aan cytotoxische Tcellen en inhibeert NK cellen. d CD14 is een pattern recognition receptor die net zoals TLR 4 oa. bacteriële lipopolysaccharide detecteert. e MHC II is aanwezig op antigeen-presenterende cellen en presenteert extracellulaire peptides na fagocytose. b

35

Tabel 7. Immunofenotypering van de veronderstelde BM-cMSC via flow cytometrie

merker CD90 CD14 CD34 CD44 MHC I MHC II

BM-MSC (Screven et al., 2014) ++ ++ ++/+/-

BM-MSC (aspiraat)

BM-MSC (curettage)

++(high,low)/+++ ++ +++/-

+++ +++ +++ -

-: <5%, +: 5-10%, ++: 10-40%, +++: > 40% [% = merker - iso]

MHC I (97,7%)*

MHC II (6,4%)**

Fig.17 Representatieve flow cytometrische histogrammen van veronderstelde BM-cMSC afkomstig van BM-curettage (hond 4). (Groen) Fluorescentiesignaal van het secundaire antilichaam (MHC I) of van de autofluorescentie (MHC II). (Rood) Fluorescentiesignaal van de merker. De vertikale lijn stelt de grens voor waarop onderscheid werd gemaakt tussen aspecifieke en specifieke binding van het antilichaam. Interpretatie van dergelijke immunofenotypische expressieprofielen wordt vaak afgewogen tegen de officieel vastgelegde merkers die hMSC moeten bezitten om als dusdanig te worden benoemd [25]. Echter, voor elk van deze vastgelegde merkers kan er een tegenargument worden opgesteld. De eerder vermelde aanwezigheid van CD29 (die afwezig zou moeten zijn volgens de ISCT-criteria) op a

vers geïsoleerde cMSC vormt hiervan een goed voorbeeld [36, 98]. Ook wordt CD34 bijvoorbeeld over het algemeen beschouwd als een goede merker voor hematopoëtische stamcellen en vasculaire progenitoren zodat MSC ondubbelzinnig negatief moeten zijn voor CD34. Hierover bestaat echter onenigheid in de literatuur. Immers, ook CD34 werd in enkele studies al geobserveerd op vers geïsoleerde MSC uit beenmerg en vetweefsel [99]. Daarenboven werd de verdwijning van CD34 tijdens celcultuur beschreven [99]. De afwezigheid van CD29 en CD34 op MSC zou dus eerder te wijten zijn aan de in vitro celcultuur dan dat het een karakteristieke eigenschap is van in vivo MSC. Deze discussies ontstaan vaak uit de misvatting dat bepaalde in vitro merkers overeenstemmen met in vivo merkers [100]. Hierop wordt verder ingegaan in de conclusie van deze masterproef. Op de histogrammen van de stalen van het BM-aspiraat valt vooral op dat er vaak partiële tot volledige ontdubbeling van het fluorescent signaal optreedt (Appendix 3). Dit is minder het geval in het a

CD34 is een celoppervlakte glycoproteïne met een rol in oa. cel-cel en cel-ECM adhesie, en wordt vaak gebruikt in de context van hematopoëtische stamcellen.

36

curettagestaal. Zoals aangehaald, kon er bij het BM-aspiraat eveneens een minder dense populatie worden geobserveerd op de scatterplots (Figuur 16 D en G). Zowel de grote morfologische heterogeniteit in de scatterplots als de aanwezigheid van partieel (zogenaamde "schouders", Appendix 3) tot volledig afgescheiden pieken op de histogrammen zijn sterk suggestief voor de aanwezigheid van meerdere celtypes of subpopulaties binnen de afgebakende celpopulatie in het BMaspiraat. Eveneens is het mogelijk dat de ontdubbeling van het fluorescent signaal te wijten is aan de aanwezigheid van celaggregaten. Deze passeren op een zeer dichte afstand voorbij de laser van de flow cytometer (Appendix 1) en worden geregistreerd als één event. Wanneer deze events dan worden geïnterpreteerd als afkomstig te zijn van 1 cel, dan leidt dit tot foute conclusies. Immers, het celaggregaat zal veel meer antistoffen gebonden hebben en bijgevolg een veel sterkere intensiteit van fluorescentie vertonen. Een goede manier om de aanwezigheid van celaggregaten in te schatten is via de visualisatie van de breedte van een puls. Zo zal een 'doublet' (of 2-cellig aggregaat) een 2x bredere puls vertonen dan een enkelvoudige cel. Dit kon niet worden geobserveerd op onze cellen. De vermoede aanwezigheid van 2 celpopulaties kon verder worden gestaafd wanneer de volledig ontdubbelde fluorescentiepieken apart werden gelabeld via een kleur en deze dan terug werden gevisualiseerd op de FSC versus SSC scatterplot (Figuur 18). Zo kon er bijvoorbeeld worden geobserveerd dat

de CD90-high cellen in het tweede staal van het BM-aspiraat een hogere

granulariteit (gekenmerkt door een hogere SSC) vertonen. Deze subpopulatie kon echter zonder immunokleuring niet objectief worden onderscheiden van de totale celpopulatie

A

B

C

D

F

G

H

A

E

Fig.18 Binnen de gebruikte gate (A) zijn er 2 celpopulaties aanwezig. De ene populatie vertoont een lage expressie van CD90 en de andere een hoge expressie (B). Wanneer er op basis van de fluorescentie aan deze 2 populaties een kleur wordt gegeven, dan kan er in de FSC versus SSC dot plot worden opgemerkt dat de CD90low populatie over de ganse gate voorkomt (E, groen) terwijl de CD90-high populatie eerder een hogere granulariteit bezit (F, rood). De gele populatie stelt de aspecifiek beschouwde cellen voor op basis van het isotype (D, geel). Aparte 'backgating' van de CD90-high populatie op basis van de hogere granulariteit (G) levert geen betere afscheiding van de CD90-high fluorescentiepiek op (H).

37

Een plausibele hypothese is dat deze moeilijk te onderscheiden celpopulaties bestaan uit enerzijds ongedifferentieerde cMSC en anderzijds uit verder gedifferentieerde progenitoren. Immers, beide populaties beantwoorden aan het immunofenotypisch profiel van cMSC volgens Screven et al. (2014). Dit kan ook de geobserveerde morfologische heterogeniteit in cultuur verklaren en sluit aan bij de eerder aangehaalde hypothese van Gothard et al. (2013) die stelt dat spoelvormige cellen een meer ongedifferentieerde status bezitten dan plattere hoekigere cellen [95]. Tot slot kan worden opgemerkt dat omwille van een tekort aan cellen er in deze pilootstudie geopteerd werd om de al dan niet aanwezige celoppervlaktemerkers te beoordelen via 'multicolor' panels. Het voordeel van multicolorpanels is dat de eventuele simultane aanwezigheid van meerdere positieve merkers nadien relatief tegenover elkaar kan beoordelen. Een nadeel ervan is de mogelijkheid op 'bleed through' van het ene emissiespectrum in een ongewenst kanaal. Dergelijke vals positieve waarden moeten dan worden berekend en afgetrokken worden van het fluorescentie signaal dat wordt opgevangen in dit kanaal. Zo daalt de gevoeligheid, wat nadelig is als zwakke fluorescentie moet worden gedetecteerd. Gebruik van 'monocolor' metingen omzeilt dit nadeel maar verhoogt de nodige hoeveelheid cellen drastisch en laat niet toe om de verschillende waargenomen signalen relatief ten opzichte van elkaar te evalueren.

38

4. CONCLUSIE EN TOEKOMSTPERSPECTIEVEN

P

relevatie van cMSC tijdens een chirurgische ingreep zoals de TTA rapid blijft aanlokkelijk omwille van praktische en ethische argumenten. Hoewel meerdere van de uitgevoerde stappen tot

karakterisatie nog geoptimaliseerd kunnen worden, suggereren de data van deze pilootstudie dat alternatieve prelevatiemethoden zeker moeten worden overwogen. Zo kan het besproken vacuümeffect worden behouden door de aspiratie uit te voeren vóór het openen van de tuberositas tibiae. Een tweede alternatief bestaat uit de prelevatie van cMSC uit het infrapatellaire vetweefsel [28]. Een vermoedelijk krtische factor in deze pilootstudie is de gevorderde leeftijd van de donoren. Aangezien leeftijd al meermaals is geassocieerd met een vermindering van het aantal gepreleveerde cellen en de daarop volgende capaciteit tot proliferatie, kan worden gesteld dat de gebruikte donoren allerminst een ideale populatie vormen. Allogeen inzetten van cMSC, de aanleg van stamcelbanken en de ontwikkeling van biotechnologieën om verworven MSC te reactiveren vormen mogelijke antwoorden hierop. Op termijn moet er worden gestreefd naar een gestandaardiseerd protocol voor de beenmergprelevatie via aspiratie. Ideaal worden relatief kleinespuiten gebruikt die niet volledig worden opgevuld tijdens elke aspiratie. Zowel de spuit als de gebruikte naald moeten vooraf gecoat worden met heparine, waarbij de spuit eventueel gevuld kan worden met een gestandaardiseerd volume heparine. Successieve aspiraties gebeuren best op een afstand groter dan 2 cm uit elkaar en de naald is ideaal gezien voorzien van een stilet. Een bijkomende verbetering kan bestaan uit het spiraalvormig achteruit trekken tijdens het aspireren waardoor de opening van de naald circulair het hele gebied rond de naald kan aspireren. Ook het overbrengen van het gehepariniseerd aspiraat naar EDTA-buisjes kan in vraag worden gesteld. Immers, mits correcte dosering van de heparine levert deze stap geen meerwaarde en kan bijgevolg weggelaten worden indien de aspiraatbuisjes zelf worden gebruikt voor transport van het beenmerg naar het laboratorium. De initiële expansie van geïsoleerde MSC wordt vaak beschreven in termen van CFU-F. Daarbij is CFU-F een relatief aspecieke term die zowel de stamcellen als de meer gedifferentieerde progenitoren omvat. Verder onderzoek is vereist om alle eigenschappen van deze CFU-F in kaart te brengen en ook de ideale cultuurcondities te bepalen waarin cellen maximale klonale expansie kunnen ondergaan. Het gebruik van betrouwbare alternatieven voor FKS [97] en het inzetten van hypoxische cultuurcondities bieden hiervoor boeiende perspectieven [78]. Niettemin vormen de adhesieve kenmerken van MSC aan plastic nog steeds een goede manier om op rudimentaire wijze een groot deel ongewenste cellen te verwijderen uit de initiële populatie. De identiteit van de bekomen cellen in deze pilootstudie laat nog veel ruimte tot discussie. Hoewel er plastic-adhesieve eigenschappen werden waargenomen en het expressiepatroon van de geëvalueerde celoppervlakte-merkers gelijkenissen vertoonde met de gebruikte referentiepublicatie [31], kan er zeker niet worden besloten dat deze cellen ondubbelzinning cMSC waren. In 2006 werden de criteria die moeten worden vervuld om een cel als hMSC te beschouwen vastgelegd door de International Society for Cellular Therapy (ISCT) [25]. In de diergeneeskunde probeert men diezelfde

39

criteria te hanteren [1, 101], maar de beschikbaarheid van gevalideerde antistoffen om deze celoppervlaktemerkers te identificeren vormt nog steeds een probleem [31]. Hierdoor moeten met name ook in studies van cMSC, zoals deze pilootstudie, steeds kanttekeningen worden geplaatst. Wanneer een gering aantal van de vereiste merkers afwezig blijkt te zijn, kunnen de geïsoleerde cellen mogelijks toch MSC zijn, maar mogen ze officieel niet als MSC worden beschouwd. De relevantie van de vastgelegde hMSC merkers kan daarenboven in vraag worden gesteld. Deze discussie is grotendeels terug te drijven naar de discrepantie tussen in vitro en in vivo MSC merkers [100]. Als modelvoorbeelden werden in sectie 3.2.3 de aanwezigheid van zowel CD29 als CD34 op in vivo MSC besproken. De ISCT-criteria vereisen echter de afwezigheid van beide merkers op hMSC. Een bijkomend voorbeeld wordt besproken in het onderzoek van Schnabel et al. (2014). Daarin is zowel aangetoond dat equine BM-MSC een variabele expressie van MHC II vertonen als dat gestimuleerde MHC II-negatieve equine MSC toch expressie kunnen vertonen van MHC II na contact met pro-inflammatoire cytokines zoals IFN-γ [102]. Verder kunnen de immunofenotypische expressiepatronen verschillen naargelang het bronweefsel waaruit de MSC worden gepreleveerd. Het gebruik van in vitro gevonden merkers om in vivo MSC te identificeren leidt vaak tot tegenstrijdigheden wat betreft het immunofenotype van MSC. Deze tegenstrijdigheden liggen dan op hun beurt aan de basis van wat nu in stijgende mate beschouwd wordt als de inherent aanwezige heterogeniteit tussen MSC. Hoewel er op deze manier periodiek zeer interessante hMSC merkers worden gevonden zoals Stro-1 [103], CD271 [104] en SSEA-4 [105], zijn er steeds MSC die niet aan dit profiel voldoen. Ook de ontdubbeling van de histogrammen in deze pilootstudie wijst in die richting. Desondanks blijven meerdere auteurs toch van mening dat er in vivo een homogene populatie aan MSC bestaat [100]. Alternatief kunnen andere methoden voor MSC karakterisatie zoals evaluatie van het mRNA expressiepatroon worden gebruikt. Deze methoden worden echter sterk beïnvloed door verdere processen zoals post-translationele modificatie en staan misschien nog meer dan de expressie van immunofenotypische eiwitmerkers onder de invloed van het veranderlijke micromilieu van cellen [31, 27, 106]. Zo toonde de studie van Screven et al. (2014) aan dat in tegenstelling tot de negatieve resultaten op flow cytometrie er via real-time PCR wél een activiteit van CD14, CD29, MHC-II en CD105 teruggevonden kon worden [31]. Wanneer dergelijke alternatieven worden gehanteerd in de karakterisatie van MSC lijkt een nog grotere nood tot grondige herziening van de in 2006 opgestelde ISCT-minimumcriteria onvermijdelijk. Mogelijks biedt het toepassen van functionele criteria in plaats van fenotypische criteria hiervoor een betere oplossing. Op het vlak van differentiatiecapaciteit moeten de beschouwde cellen in deze pilootstudie ondubbelzinnig afgekeurd worden als zijnde cMSC. Immers, wanneer de multipotentialiteit van een cel niet kan bewezen worden, dan kan men deze cel onmogelijk als stamcel benoemen. Het geobserveerde gebrek aan differentiatievermogen kon echter te wijten zijn aan de beperkte proliferatieve capaciteiten waardoor geen volledige confluentie werd bekomen. Immers, de chondrogene differentiaties, waar confluentie geen vereist criterium tot differentiatie is, konden wel onder enig voorbehoud worden aangetoond.

40

De belangrijkste reden van de beperkte celdeling ligt waarschijnlijk in de manier waarop de prelevatie is gebeurd. Immers, de gebruikte methode leverde waarschijnlijk veel stress op voor de cellen. Deze stress kan zowel mechanisch als conditioneel van aard zijn. Zo zal de abrupte omschakeling van een relatief zuurstofarm milieu in het beenmerg naar een zuurstofrijke omgeving gepaard gaan met gewijzigde expressiepatronen en hogere aanwezigheid van schadelijke zuurstofradikalen. Deze zuurstofradikalen kunnen dan op hun beurt een negatieve invloed uitoefenen op de verdere cultuureigenschappen van de MSC [78]. Aanvullend aan de osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie, zijn MSC ook in staat om in vitro te transdifferentiëren naar celtypes met morfologische, fenotypische en functionele eigenschappen van zowel endo-, ecto- en mesodermale oorsprong (bv. neuronen, hepatocyten, pancreas,

renale

en

myoblast

celtypes)

[8].

Behalve

het

ontwikkelen

van

allerhande

differentiatiemedia kunnen hiervoor ook alternatieve strategieën worden gebruikt. Zo beschrijven Barzilay et al. (2009) methoden waarop transdifferentiaties van MSC worden bekomen door een geforceerde expressie van transcriptiefactoren (TF) [107]. Verhoogde aanwezigheid van deze TF herprogrammeerde de MSC vervolgens naar insuline-producerende β-cellen, endotheliale en neuronale cellen. Deze benadering is gebaseerd op de overtuiging dat elk celtype kan geherprogrammeerd

worden

naar

een

ander

celtype.

Een

alternatieve

manier

waarop

transdifferentiatie kan bereikt worden, is via dedifferentiatie van MSC naar 'induced pluripotent stem cells' (iPS cells). Deze laatste methode is echter moeilijker uit te voeren en houdt een groter risico in op de vorming van teratoma's [107]. Desondanks zijn onderzoekers er in 2013 toch reeds in geslaagd om caniene fibroblasten te transformeren naar iPS cellen om deze vervolgens te differentiëren naar cMSC [7].

Samengevat beoogde deze pilootstudie de isolatie van cMSC uit beenmerg tijdens een orthopedische ingreep op de tibia. Hoewel dit type van adulte stamcellen niet ondubbelzinnig kon worden aangetoond, leverde het doorlopen proces naar mijn mening waardevolle informatie op. De toekomst van MSC in de diergeneeskunde en meer specifiek aan onze faculteit biedt veel perspectieven maar bevat nog veel onbeantwoorde vragen. Ik hoop dan ook een bescheiden bijdrage te hebben geleverd tot de reeds beschikbare informatie over cMSC, zodat de gefundeerde therapeutische inzet van deze cellen iets minder veraf komt te staan.

41

42

Referenties [1]

E. de Bakker, B. Van Ryssen, C. De Schauwer and E. Meyer, "Canine mesenchymal stem cells: state of the art, perspective as therapy for dogs and as a model for man," Veterinary Quarterly, 2014.

[2]

A. J. Friedenstein, I. I. Piatetzky-Shapiro and K. V. Petrakova, "Osteogenesis in transplants of bone marrow cells," Embryol Exp Morphol, vol. 16, p. 381–390, 1966.

[3]

W. Wagner, A. D. Ho and M. Zenke, "Different facets of aging in human mesenchymal stem cells," Tissue Eng Part B Rev, vol. 16, no. 4, p. 445–53, 2010.

[4]

U. Lakshmipathy and C. Verfaillie, "Stem cell plasticity," Blood Reviews, no. 19, pp. 29-38, 2005.

[5]

A. J. Wagers and I. L. Weissman, "Plasticity of adult stem cells," Cell, vol. 116, p. 639–648, 2004.

[6]

L. Fortier, "Stem cells: classifications, controversies, and clinical applications," Vet. Surg., vol. Sep–Oct, no. 34, p. 415–423, 2005.

[7]

D. J. Whitworth, J. E. Frith, T. J. Frith, D. A. Ovchinnikov, J. J. Cooper-White and E. J. Wolvetang, "Derivation of Mesenchymal Stromal Cells from Canine Induced Pluripotent Stem Cells by Inhibition of the TGFbeta/Activin Signaling Pathway," STEM CELLS AND DEVELOPMENT, vol. 00, pp. 1-13, 2014.

[8]

V. B. Fernández Vallone, M. A. Romaniuk, H. Choi, V. Labovsky, J. Otaegui and N. A. Chasseing, "Mesenchymal stem cells and their use in therapy: What has been achieved?," 2013, vol. 85, pp. 1-10, Differentiation.

[9]

A. Caplan, "Mesenchymal stem cells," J Orthop Res, vol. 9, p. 641–650, 1991.

[10] M. B. Murphy, K. Moncivais and A. I. Caplan, "Mesenchymal stem cells: environmentally responsive therapeutics for regenerative medicine," Experimental & Molecular Medicine, vol. 45, pp. 1-16, 2013. [11] A. J. Friedenstein, R. K. Chailakhjan and K. S. Lalykina, "The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells," Cell Tissue Kinet, vol. 3, no. 4, pp. 393-403, 1970. [12] D. Baksh, L. Song and R. S. Tuan, "Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy," Journal of Cellular and Molecular Medicine, vol. 8, p. 301–316, 2004.

43

[13] J. Ylostalo, N. Bazhanov and D. J. Prockop, "Reversible commitment to differentiation by human multipotent stromal cells in single-cell-derived colonies," Experimental Hematology, vol. 36, p. 1390–1402, 2008. [14] H. Castro-Malaspina and R. E. Gay, "Characterization of human bone marrow fibroblast colonyforming cells (CFU-F) and their progeny," Blood, vol. 56, no. 2, pp. 289-301, 1980. [15] M. Crisan, S. Yap and L. Casteilla, "A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs," Cell Stem Cell, vol. 3, no. 3, p. 301–313, 2008. [16] I. R. Murray, C. C. West, W. R. Hardy, A. W. James, T. S. Park, A. Nguyen, T. Tawonsawatruk, L. Lazzari, C. Soo and B. Péault, "Natural history of mesenchymal stem cells, from vessel walls to culture vessels," Cell. Mol. Life Sci., vol. 71, p. 1353–1374, 2014. [17] M. A. Maloney, R. A. Lamela and H. M. Patt, "The question of bone marrow stromal fibroblast traffic," Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 459, p. 190–197, 1985. [18] T. Kitaori, H. Ito and E. M. Schwarz, "Stromal cell-derived factor 1/CXCR4 signaling is critical for the recruitment of mesenchymal stem cells to the fracture site during skeletal repair in a mouse model," Arthritis and Rheumatism, vol. 60, no. 3, p. 813–823, 2009. [19] S. Schenk, N. Mal and A. Finan, "Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor," Stem Cells, vol. 25, no. 1, p. 245–251, 2007. [20] G. Chamberlain, H. Smith, G. E. Rainger and J. Middleton, "Mesenchymal stem cells exhibit firm adhesion, crawling, spreading and transmigration across aortic endothelial cells: effects of chemokines and shear," PLoS ONE, vol. 6, no. 9, 2011. [21] M. Iwasaki, M. Koyanagi and H. Kossmann, "Hepatocyte growth factor mobilizes non-bone marrow-derived circulating mesoangioblasts," European Heart Journal, vol. 32, no. 5, p. 627– 636, 2011. [22] T. J. Kean, P. Lin, A. I. Caplan and J. E. Dennis, "MSCs: Delivery Routes and Engraftment, CellTargeting Strategies, and Immune Modulation," Stem Cells International, pp. 1-13, 2013. [23] D. T. Covas, R. A. Panepucci and A. M. Fontes, "Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts," Exp Hematol, vol. 36, p. 642–654, 2008. [24] D. Jindatip, K. Fujiwara, T. Kouki and T. Yashiro, "Transmission and scanning electron microscopy study of the characteristics and morphology of pericytes and novel desminimmunopositive perivascular cells before and after castration in rat anterior pituitary gland," Anatomical Science International, vol. 87, no. 3, pp. 165-173, 2012.

44

[25] M. Dominici, B. K. Le, I. Mueller, I. Slaper-Cortenbach, F. Marini, D. Krause, R. Deans, A. Keating, D. Prockop and E. Horwitz, "minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement," Cytotherapy, vol. 8, p. 315–317, 2006. [26] A. D. Ho, W. Wagner and W. Franke, "Heterogeneity of mesenchymal stromal cell preparations," Cytotherapy, vol. 10, pp. 320-330, 2008. [27] A. M. DiMarino, A. I. Caplan and T. L. Bonfield, "Mesenchymal stem cells in tissue repair," frontiers in IMMUNOLOGY, vol. 4, pp. 1-9, 2013. [28] N. D. Spencer, "In vitro expansion and differentiation of fresh and revitalized adult canine bone marrow-derived and adipose tissue-derived stromal cells," The Veterinary Journal, vol. 191, pp. 231-239, 2012. [29] A. Tocci and L. Forte, "Mesenchymal stem cell: use and perspectives," The Hematology Journal, vol. 4, p. 92–96, 2003. [30] M. E. Bernardo, N. Zaffaroni, F. Novara, A. M. Cometa, M. A. Avanzini, A. Moretta, D. Montagna, R. Maccario, R. Villa, M. G. Daidone, O. Zuffardi and F. Locatelli, "Human bone marrow derived mesenchymal stem cells do not undergo transformation after long-term in vitro culture and do not exhibit telomere maintenance mechanisms," Cancer Research, vol. 67, p. 9142–9149, 2007. [31] R. Screven, E. Kenyon, M. J. Myers, H. F. Yancy, M. Skasko, L. Boxer, E. C. Bigley III, D. L. Borjesson and M. Zhu, "Immunophenotype and gene expression profile of mesenchymal stem cells derived from canine adipose tissue and bone marrow," Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 161, pp. 21-31, 2014. [32] C. De Schauwer, E. Meyer, P. Cornillie, S. De Vliegher, G. R. van de Walle, M. Hoogewijs, H. Declercq, J. Govaere, K. Demeyere, M. Cornelissen and A. Van Soom, "Optimization of the Isolation, Culture, and Characterization of Equine Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stromal Cells," TISSUE ENGINEERING: Part C, vol. 17, no. 11, pp. 1061-1070, 2011. [33] S. Mendez-Ferrer, T. V. Michurina, F. Ferraro, A. R. Mazloom, B. D. Macarthur, S. A. Lira, D. T. Scadden, A. Ma'ayan, G. N. Enikolopov and P. S. Frenette, "Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche," Nature, vol. 466, p. 829–834, 2010. [34] R. H. Lee, J. Y. Oh, H. Choi and N. Bazhanov, "Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair.," Journal of Cellular Biochemistry, vol. 112, p. 3073–3078, 2011. [35] V. B. Fernández Vallone, M. A. Romaniuk, H. Choi, V. Labovsky, J. Otaegui and N. A. Chasseing, "Mesenchymal stem cells and their use in therapy: What has been achieved?," Differentiation, vol. 85, pp. 1-10, 2013.

45

[36] N. M. Vieira, V. Brandalise, E. Zucconi, M. Secco, B. E. Strauss and M. Zatz, "Isolation, characterization, and differentiation potential of canine adipose-derived stem cells," Cell Transplant, vol. 19, p. 279–289, 2010. [37] H. Kamishina, J. Deng, T. Oji, J. A. Cheeseman and R. M. Clemmons, "Expression of neural markers on bone marrow-derived canine mesenchymal stem cells," Am J Vet Res, vol. 67, p. 1921–1928, 2006. [38] A. J. Friedenstein, R. K. Chailakhyan and N. V. Latsinik, "Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo," Transplantation, vol. 17, no. 4, pp. 331-340, 1974. [39] M. Bensidhoum, A. Chapel and S. Francois, "Homing of in vitro expanded Stro-1− or Stro-1+ human mesenchymal stem cells into the NOD/SCID mouse and their role in supporting human CD34 cell engraftment," Blood, vol. 103, no. 9, pp. 3313-3319, 2004. [40] M. W. Maijenburg, C. E. van der Schoot and C. Voermans, "Mesenchymal Stromal Cell Migration: Possibilities to Improve Cellular Therapy," STEM CELLS AND DEVELOPMENT, vol. 21, pp. 19-29, 2012. [41] N. Van Overstraeten-Schlogel, Y. Beguin and A. Gothot, "Role of stromal-derived factor-1 in the hematopoietic-supporting activity of human mesenchymal stem cells," European Journal of Haematology, vol. 76, pp. 488-493, 2006. [42] M. Gnecchi, Z. Zhang, A. Ni and V. J. Dzau, "Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy," Circ. Res., vol. 103, pp. 1204-1219, 2008. [43] A. Caplan and D. Correa, "The MSC: an injury drugstore.," Cell Stem Cell, vol. 9, pp. 11-15, 2011. [44] D. Borjesson and J. Peroni, "The regenerative medicine laboratory: facilitating stem cell therapy for equine disease.," The Journal of Laboratory and Clinical Medicine, vol. 31, no. 1, pp. 109123, 2011. [45] L. Bai, D. P. Lennon, V. Eaton, K. Maier, A. Caplan and S. D. Miller, "Human bone marrowderived mesenchymal stem cells induce Th2-polarized immune response and promote endogenous repair in animal models of multiple sclerosis," Glia, vol. 57, p. 1192–1203, 2009. [46] A. Tyndall, U. A. Walker, A. Cope, F. Dazzi, C. De Bari, W. Fibb, S. Guiducci, S. Jones, C. Jorgensen, K. Le Blanc, F. Luyten, D. McGonagle, I. Martin, C. Bocelli-Tyndall, G. Pennesi, V. Pistoia, C. Pitzalis, A. Uccelli, N. Wulffraat and M. Feldmann, "Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells: a review based on an interdisciplinary meeting held at the Kennedy Institute of Rheumatology Division, London, UK, 31 October 2005," Arthritis Res Ther, vol. 9, no. 1, p. 301, 2007. [47] T. Yi and S. U. Song, "Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells and their therapeutic applications," Arch Pharm Res, vol. 35, p. 213–221, 2012.

46

[48] G. Chamberlain, J. Fox, B. Ashton and J. Middleton, "Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing," Stem Cells, vol. 25, pp. 2739-2749, 2007. [49] F. E. Figueroa, F. Carrión, S. Villanueva and M. Khoury, "Mesenchymal Stem Cell treatment for autoimmune diseases: a critical review," Biol Res, vol. 45, pp. 269-277, 2012. [50] N. Eliopoulos, J. Stagg, L. Lejeune, S. Pommey and J. Galipeau, "Allogeneic marrow stromal cells are immune rejected by MHC class I- and class II-mismatched recipient mice," Blood, vol. 106, p. 4057–4065, 2005. [51] M. A. Matthay, "Advances and challenges in translating stem cell therapies for clinical diseases," Transl Res, vol. 156, pp. 107-11, 2010. [52] A. Nijnik and R. E. Hancock, "The roles of cathelicidin LL-37 in immune defences and novel clinical applications," Curr Opin Hematol, vol. 16, p. 41–47, 2009. [53] L. Fortier and A. Travis, "Stem cells in veterinary medicine," Stem Cell Research and Therapy, vol. 2, p. 9, 2011. [54] E. Spaeth, A. Klopp, J. Dembinski, M. Andreeff and F. Marini, "Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells," Gene Therapy, vol. 15, p. 730–738, 2008. [55] C. Chen, Y. Lee, S. Chiu, W. Shyu, M. Lee, S. Huang and H. Li, "The application of stem cells in the treatment of ischemic diseaeses," Histology and Histopathology, vol. 21, pp. 1209-1216, 2006. [56] D. Frisbie and R. Smith, "Clinical update on the use of mesenchymal stem cells in equine orthopaedics," Equine Veterinary Journal, vol. 42, pp. 86-89, 2010. [57] J. Kode, S. Mukherjee, M. Joglekar and A. Hardikar, "Mesenchymal stem cells: immunobiology and role in immunomodulation and tissue regeneration," Cytotherapy, vol. 11, no. 4, pp. 377391, 2009. [58] J. M. Karp and G. S. Leng Teo, "Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details," Cell Stem Cell, vol. 4, pp. 206-216, 2009. [59] A. Nakamizo, F. Marini, T. Amano, A. Khan, M. Studeny and J. Gumin, "Human bone marrowderived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas," Cancer Res, vol. 65, p. 3307– 3318, 2005. [60] H. F. Dvorak, "Tumors: wounds that do not heal: similarities between tumor stroma generation and wound healing," New England Journal of Medicine, vol. 315, no. 26, p. 1650–1659, 1986.

47

[61] U. M. Fischer, M. T. Harting and F. Jimenez, "Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect," Stem Cells and Development, vol. 18, no. 5, p. 683–691, 2009. [62] W. J. Rombouts and R. E. Ploemacher, "Primary murine MSC show highly efficient homing to the bone marrow but lose homing ability following culture," Leukemia, vol. 17, no. 1, p. 160– 70, 2003. [63] D. Chanda, S. Kumar and S. Ponnazhagan, "Therapeutic potential of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells in diseases of the skeleton," J Cell Biochem., vol. Oct 1, no. 111, pp. 249-257, 2010. [64] C. De Schauwer, E. Meyer, G. Van de Walle and A. Van Soom, "Current clinical applications of equine mesenchymal stem cells: update," Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, vol. 83, pp. 327-336, 2013. [65] Y. Zhang, F. Wang, J. Chen, Z. Ning and L. Yang, "Bone marrow-derived mesenchymal stem cells versus bone marrow nucleated cells in the treatment of chondral defects," Int Orthop, vol. 36, p. 1079–1086, 2012. [66] D. J. Whitworth and T. A. Banks, "Stem cell therapies for treating osteoarthritis: Prescient or premature?," The Veterinary Journal, vol. 202, pp. 416-424, 2014. [67] C. Stamm, B. Westphal, H. D. Kleine, M. Petzsch, C. Kittner, H. Klinge, C. Schumichen, C. A. Nienaber, M. Freund and G. Steinhoff, "Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration," Lancet, vol. 361, p. 45–46, 2003. [68] K. Serigano, D. Sakai, A. Hiyama , F. Tamura, M. Tanaka and J. Mochida, "Effect of cell number on mesenchymal stem cell transplantation in a canine disc degeneration model.," J Orthop Res, vol. 28, p. 1267–1275, 2010. [69] M. M. Cook, K. Futrega, M. Osiecki, M. Kabiri, B. Kul and A. Rice, "Micromarrows? 3D co-culture of haematopoietic stem cells and mesenchymal stromal cells," Tissue Eng Part C Methods, vol. 18, p. 319–28, 2012. [70] J. Wagner, T. Kean, R. Young, J. E. Dennis and A. I. Caplan, "Optimizing mesenchymal stem cellbased therapeutics," Curr Opin Biotechnol, vol. 20, p. 531–536, 2009. [71] A. H. Kisiel, L. A. McDuffee, E. Masaoud, T. R. Bailey, B. P. Esparza Gonzalez and R. Nino-Fong, "Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum," Am J Vet Res, vol. 73, p. 1305– 1317, 2012. [72] Y. Samoy, G. Verhoeven, T. Bosmans, E. Van de Vekens, E. de Bakker, P. Verleyen and B. Van Ryssen, "TTA Rapid: Description of the Technique and Short Term Clinical Trial Results of the First 50 Cases," Veterinary Surgery, vol. 9999, pp. 1-11, 2014.

48

[73] H. Castro-Malaspina, R. E. Gay, G. Resnick, N. Kapoor, P. Meyers, D. Chiarieri, S. McKenzie, H. E. Broxmeyer and M. A. Moore, "Characterization of human bone marrow fibroblast colonyforming cells (CFU-F) and their progeny," Blood, vol. 56, p. 289–301, 1980. [74] H. M. Hodgkiss-Geere, D. J. Argyle, B. M. Corcoran, B. Whitelaw, E. Milne , D. Bennett and S. A. Argyle, "Characterisation and differentiation potential of bone marrow derived canine mesenchymal stem cells," Vet J., vol. 194, p. 361–368, 2012. [75] T. P. James, G. Chang, S. Micucci, A. Sagar, E. L. Smith and C. Cassidy, "Effect of applied force and blade speed on histopathology of bone during resection by sagittal saw," Med Eng Phys, vol. 36, no. 3, pp. 364-370, 2014. [76] A. Bachelez and S. A. Martinez, "Heat generation by two different saw blades used for tibial plateau leveling osteotomies," J Am Anim Hosp Assoc, vol. 48, no. 2, pp. 83-8, 2012. [77] M. Farrell, A. Mathieson, P. Chung, J. Heller, S. P. Clarke, M. K. McDonald and A. Cardoni, "In vitro performance testing of two arcuate oscillating saw blades designed for use during tibial plateau leveling osteotomy," Vet Surg, vol. 40, no. 6, pp. 694-707, 2011. [78] N. Haque, M. Tariqur Rahman, N. Hayaty Abu Kasim and A. M. Alabsi, "Hypoxic Culture Conditions as a Solution for Mesenchymal Stem Cell Based Regenerative Therapy," The Scientific World Journal, p. 12, 2013. [79] M. Spångberg, P. Martinez, H. Fredlund, G. Karlsson Hedestam and C. Sundling, "A simple and safe technique for longitudinal bone marrow aspiration in cynomolgus and rhesus macaques," J Immunol Methods, vol. 408, pp. 137-141, 2014. [80] P. Hernigou, Y. Homma, C. Flouzat Lachaniette, A. Poignard, J. Allain, N. Chevallier and H. Rouard, "Benefits of small volume and small syringe for bone marrow of mesenchymal stem cells," Int Orthop, vol. 37, no. 11, pp. 2279-2287, 2013. [81] S. W. Volk, Y. Wang and K. D. Hankenson, "Effects of Donor Characteristics and Ex Vivo Expansion on Canine Mesenchymal Stem Cell Properties: Implications for MSC-Based Therapies," Cell Transplant, vol. 21, no. 10, pp. 1-22, 2012. [82] N. Zhang, M. A. Dietrich and M. J. Lopez, "Canine Intra‐Articular Multipotent Stromal Cells (MSC) From Adipose Tissue Have the Highest In Vitro Expansion Rates, Multipotentiality, and MSC Immunophenotypes," Veterinary Surgery, vol. 42, p. 137–146, 2013. [83] O. S. Beane, V. C. Fonseca, L. L. Cooper, G. Koren and E. M. Darling, "Impact of Aging on the Regenerative Properties of Bone Marrow-, Muscle-, and Adipose-Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells," PLoS ONE, vol. 9, no. 12, 2014. [84] W. L. Grayson, F. Zhao, B. Bunnell and T. Ma, "Hypoxia enhances proliferation and tissue formation of human mesenchymal stem cells.," Biochem Biophys Res Commun, vol. 358, pp. 948-953, 2007.

49

[85] E. M. Schuh, M. S. Friedman, D. D. Carrade, J. Li, D. Heeke, S. M. Oyserman, L. D. Galuppo, D. J. Lara, N. J. Walker, G. L. Ferraro, S. D. Owens and D. L. Borjesson, "Identification of variables that optimize isolation and culture of multipotent mesenchymal stem cells from equine umbilical-cord blood," AJVR, vol. 70, no. 12, pp. 1526-1535, 2009. [86] J. C. Estrada, C. Albo and A. Benguria, "Culture of human mesenchymal stem cells at low oxygen tension improves growth and genetic stability by activating glycolysis," Cell Death and Differentiation, vol. 19, no. 5, p. 743–755, 2012. [87] M. C. Brahimi-Horn and J. Pouysségur, "Oxygen, a source of life and stress," FEBS Letters, vol. 581, no. 19, p. 3582–3591, 2007. [88] F. Atashi, A. Modarressi and M. S. Pepper, "The Role of Reactive Oxygen Species in Mesenchymal Stem Cell Adipogenic and Osteogenic Differentiation: a Review," STEM CELLS AND DEVELOPMENT, vol. 00, p. 14, 2015. [89] S. P. Bruder, N. Jaiswal and S. E. Haynesworth, "Growth kinetics, self-renewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation," J. Cell. Biochem., vol. 64, pp. 278-294, 1997. [90] D. J. Chung, K. Hayashi, C. A. Toupadakis, A. Wong and C. E. Yellowley, "Osteogenic proliferation and differentiation of canine bone marrowand adipose tissue derived mesenchymal stromal cells and the influence of hypoxia," Res. Vet. Sci., vol. 92, pp. 66-75, 2012. [91] H. Kamishina, J. P. Farese, J. A. Storm, J. A. Cheeseman and R. M. Clemmons, "The frequency, growth kinetics, and osteogenic/adipogenic differentiation properties of canine bone marrow stromal cells," In Vitro Cell Dev. Biol. Anim., vol. 44, p. 472–479, 2008. [92] E. Cordeiro-Spinetti, W. de Mello, L. Siqueira Trindade, D. D. Taub, R. S. Taichman and A. Balduino, "Human bone marrow mesenchymal progenitors: perspectives on an optimized in vitro manipulation," frontiers in Cell and Developmental Biology, vol. 2, no. 7, pp. 1-8, 2014. [93] P. Bianco, P. G. Robey and P. J. Simmons, "Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays," Cell Stem Cell, vol. 2, no. 4, p. 313–319, 2008. [94] C. Csaki, U. Matis, A. Mobasheri, H. Ye and M. Shakibaei, "Chondrogenesis, osteogenesis and adipogenesis of canine mesenchymal stem cells: a biochemical, morphological and ultrastructural study," Histochem Cell Biol, vol. 128, pp. 507-520, 2007. [95] D. Gothard, J. I. Dawson and R. O. C. Oreffo, "Assessing the potential of colony morphology for dissecting the CFU-F population from human bone marrow stromal cells," Cell Tissue Res, vol. 352, pp. 237-247, 2013.

50

[96] S. A. Kuznetsov, M. H. Mankani, P. Bianco and P. G. Robey, "Enumeration of the colony-forming units–fibroblast from mouse and human bone marrow in normal and pathological conditions," Stem Cell Res., vol. 2, no. 1, pp. 83-94, 2009. [97] A. Laitinen, S. Oja, L. Kilpinen, T. Kaartinen, J. Möller, S. Laitinen, M. Korhonen and J. Nystedt, "A robust and reproducible animal serum-free culture method for clinical-grade bone marrowderived mesenchymal stromal cells," Cytotechnology, p. ahead of print, 2015. [98] H. Takemitsu, D. Zhao, I. Yamamoto, Y. Harada, M. Michishita and T. Arai, "Comparison of bone marrow and adipose tissue-derived canine mesenchymal stem cells," BioMed Central Veterinary Research, vol. 8, p. 150, 2012. [99] C.-S. Lin, H. Ning, G. Lin and T. F. Lue, "Is CD34 truly a negative marker for Mesenchymal Stem Cells?," Cytotherapy, vol. 14, no. 10, 2012. [100] E. Jones and D. McGonagle, "Human bone marrow mesenchymal stem cells in vivo," Rheumatology, vol. 47, p. 126–131, 2008. [101] C. De Schauwer, K. Goossens, S. Piepers, M. K. Hoogewijs, J. L. Govaere, K. Smits, E. Meyer, A. Van Soom and G. R. Van de Walle, "Characterization and profiling of immunomodulatory genes of equine mesenchymal stromal cells from non-invasive sources," Stem Cell Research & Therapy, vol. 5, p. 6, 2014. [102] L. V. Schnabel, L. M. Pezzanite, D. F. Antczak, J. M. Bevilaqua Felippe and L. A. Fortier, "Equine bone marrow-derived mesenchymal stromal cells are heterogeneous in MHC class II expression and capable of inciting an immune response in vitro," Stem Cell Research & Therapy, vol. 5, pp. 1-13, 2014. [103] P. J. Simmons and B. Torokstorb, "Identification of stromal cell precursors in human bonemarrow by a novel monoclonal-antibody, Stro-1," Blood, vol. 78, pp. 55-62, 1991. [104] E. A. Jones, S. E. Kinsey and A. English, "Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells.," Arthritis Rheum, vol. 46, pp. 3349-3360, 2003. [105] E. J. Gang, D. Bosnakovski, C. A. Figueiredo, J. W. Visser and R. C. Perlingeiro, "SSEA-4 identifies mesenchymal stem cells from bone marrow.," Blood, vol. 109, pp. 1743-1751, 2007. [106] A. Stolzing, E. Jones, D. McGonagle and A. Scutt, "Age-related changes in human bone marrowderived mesenchymal stem cells: consequences for therapies," Mech. Ageing Dev., vol. 129, pp. 163-173, 2008. [107] R. Barzilay, E. Melamed and D. Offen, "Introducing Transcription Factors to Multipotent Mesenchymal Stem Cells: Making Transdifferentiation Possible," Stem Cells, vol. 27, pp. 25092515, 2009.

51

52

APPENDIX Appendix 1. Flow cytometrie, technische aspecten

W

anneer cellen via hydrodynamische focusering één voor één voor een laser worden gebracht veroorzaken ze verstrooiing van het laserlicht. De lichtverstrooiing die opgevangen wordt door

een detector die zich op dezelfde lijn van de laser bevindt noemt men 'Forward Scatter' (FSC) en kan gerelateerd worden aan de grootte van de cel (Figuur A1). Een tweede detector wordt langs de zijkant van de cellen geplaatst en registreert het zijwaarts gereflecteerde laserlicht ('Side Scatter', SSC). SSC kan geassocieerd worden met de mate van complexiteit in een cel. De meest voorkomende oorzaak van dergelijke complexiteit is de aanwezigheid van granules in de cel, daarom wordt hoge SSC meestal geïnterpreteerd als hoge mate van granulariteit (Figuur A1).

Fig.A1

Fig.A2

De geregistreerde FSC en SSC kunnen visueel worden weergegeven op een grafiek, de 'scatterplot' genoemd. Hierbij moet echter worden opgemerkt dat de weergegeven puntjes op dergelijke grafiek niet noodzakelijk cellen voorstellen. Immers, wanneer het laserlicht onderbroken wordt kan er geen onderscheid worden gemaakt tussen cellen en andere structuren die dit veroorzaken (zoals luchtbellen of celdebris). Daarom wordt beter de term 'event' (gebeurtenis) gehanteerd om deze puntjes te bespreken. Aangezien de lokatie van deze events op een scatterplot bepaald wordt door de celgrootte (FSC) en de celgranulariteit (SSC), is ze een weergave van de morfologie van een cel. Celpopulaties met verschillende morfologie zullen dus op een andere plaats gelokaliseerd zijn op een scatterplot. Op basis van dit principe kan men dan cellen onderscheiden en identificeren (Figuur A2). Een derde manier waarop flow cytometers iets kunnen zeggen over de eigenschap van cellen is via het gebruik van fluorochromen. Fluorochromen zijn molecules die licht afgeven (emissie) wanneer ze worden gestimuleerd (excitatie) door invallend licht van lagere golflengte. Zo bestaan er veel verschillende fluorochromen die elk een verschillend emissiespectrum uitstralen wanneer ze geëxciteerd worden door eenzelfde laser. Verder onderscheid kan gemaakt worden via het gebruik van fluorochromen die een verschillende excitatielicht vereisen vooraleer ze emissie vertonen. Fluorochromen kunnen gekoppeld (geconjugeerd) worden aan antistoffen. Deze antistoffen kunnen ofwel rechtstreeks gericht zijn tegen een gewenst oppervlakteantigen ofwel gericht zijn tegen het contstant domein van een tweede antistof die gebonden is op het gewenste oppervlakteantigen. Men spreekt respectievelijk van directe en indirecte labeling van antigenen (Figuur A3). Alternatief bestaan

er ook molecules die zich intracellulair kunnen vasthechten op een welbepaalde structuur (zoals het DNA)

en

daarna

fluorescente

eigenschappen

gaan

vertonen

(probes).

De

gebruikte

celviabiliteitsmerker 7-AAD is hiervan een voorbeeld.

Fig.A3 Bij

de

samenstelling

van

multicolorexperimenten,

waar

meerdere

aan

fluorochromen

geconjugeerde antistoffen worden gebruikt per meting, moet er rekening worden gehouden met eventuele overlapping van de emissiespectra van de verschillende fluorochromen. Indien hiervoor niet wordt gecompenseerd kunnen vals positieve waarden worden bekomen. Figuur A4 toont de mate van theoretische overlap, ook wel 'bleed through' genoemd, van de in deze pilootstudie geselecteerde fluorochromen. Bijkomend wordt het bereik van de filters weergegeven. Deze filters bestaan uit dichroïsche spiegels die emissielicht van een bepaalde golflengte doorlaten terwijl licht van andere golflengtes naar een andere filter worden gespiegeld. Door de opeenvolging van in serie geplaatste filters wordt zo het emissielicht opgedeeld in verschillende gebieden die elk op een aparte detector worden geregistreerd. Deze detectoren worden de kanalen van de flow cytometer genoemd.

Fig.A4 Emissiespectra van de gekozen conjugaten met bijhorende filtergolflengten op een BD FacsCanto™ I flow cytometer. Een eerste laser (488nm solid state) exciteert de fluorochromen Alexa488, Fitc, PE en 7-AAD terwijl de tweede laser (633nm HeNe) APC exciteert. Alexa 488 en Fitc vertonen een identiek emissiespectrum. http://www.bdbiosciences.com/eu/applications/s/spectrumviewer. Tot slot kan de hoeveelheid opgevangen fluorescentie per kanaal (en dus per merker) worden weergegeven in histogrammen. Omdat antistoffen ook aspecifieke binding kunnen vertonen (bijvoorbeeld door aanwezigheid van Fc-receptoren op de gebruikte cellen) werd in deze studie

gebruik gemaakt van 'isotypes'. Dit zijn antistoffen van eenzelfde isotype en diersoort als de gebruikte antistoffen tegen de gewenste antigenen. De mate van binding van deze isotypes kan dus gebruikt worden als een indicatie van de hoeveelheid aspecifieke binding bij de merker-antistoffen. In Appendix 3 worden zowel de isotypesignalen als de merkersignalen van deze pilootstudie weergegeven.

Appendix 2. Titratie van anti-humane CD29 Als alternatief voor het anti-humane CD29 werd ook een anti-canine CD29 geëvalueerd op bloedMSC. Echter, de fabrikant kon de werking van het anti-canine CD29 antistof op flow cytometrie niet aantonen. Daarom werden eerst verschillende verdunningen van dit anti-canine CD29 antistof uitgetest (Tabel A1). Op geen enkel van de geteste concentraties kon de werking van dit antilichaam worden aangetoond. Hierbij moet worden vermeld dat het niet zeker was of de gebruikte cellen al dan niet positief waren voor CD29. Immers, de identiteit van deze cellen stond nog niet vast waardoor deze bloed-MSC niet de meest geschikte positieve controle waren. Eveneens is er nog geen consensus bereikt wat betreft het al dan niet aanwezig zijn van CD29 op BM-MSC. Tabel A1. Titratie van het anti-canien CD29 antilichaam

concentratie (µg/ml) 1 2 10 20 30

Percentage (%) positief voor merker 5,3 6,7 6,7 5,6 5,8

Signaal van merker bevat maximaal 5% vals positief signaal gebaseerd op het isotype.

Appendix 3. Flow cytometrie histogrammen

CD90 (98,5%)

CD44 (13,2%)

MHC I (96,7%)*

CD14 (0,9%)

CD34 (6%)

MHC II (3,2%)**

Fig.A5 Flow cytometrische histogrammen van veronderstelde BM-cMSC afkomstig van BMaspiraat uit hond 1. (Groen) Fluorescentiesignaal van isotype en (Rood) fluorescentiesignaal van merker. * Voor MHC I wordt het secundaire antilichaam weergegeven in het groen. ** Voor MHC II wordt de autofluorescentie weergegeven in het groen.

CD90 (88,1%)

CD44 (27,4%)

MHC I (3,2%)*

CD14 (0,6%)

CD34 (0,8%)

MHC II (0,1%)**

Fig.A6 Flow cytometrische histogrammen van veronderstelde BM-cMSC afkomstig van BMaspiraat uit hond 3. (Groen) Fluorescentiesignaal van isotype en (Rood) fluorescentiesignaal van merker. * Voor MHC I wordt het secundaire antilichaam weergegeven in het groen. ** Voor MHC II wordt de autofluorescentie weergegeven in het groen.

CD90 (97,3%)

CD44 (91,8%)

MHC I (97,7%)*

CD14 (4,7%)

CD34 (27,7%)***

MHC II (6,4%)**

Fig.A7 Flow cytometrische histogrammen van veronderstelde BM-cMSC afkomstig van BMcurettage uit hond 4. (Groen) Fluorescentiesignaal van isotype en (Rood) fluorescentiesignaal van merker. * Voor MHC I wordt het secundaire antilichaam weergegeven in het groen. ** Voor MHC II wordt de autofluorescentie weergegeven in het groen. *** De relatief sterk positieve waarde van CD34 is afkomstig van ruis, daarom wordt CD34 toch als negatief beschouwd.