KARAKTERISASI PARAMETER MICHAELIS-MENTEN ENZIM PAPAIN KOMERSIAL PAYA

KARAKTERISASI PARAMETER MICHAELIS-MENTEN ENZIM PAPAIN KOMERSIAL “PAYA” Mathias Elsson, Anondho Widjanarko, Muhamad Sahlan Program Studi Teknologi Bioproses, Fakultas Teknik, Universitas Indonesia, Depok 16424, Indonesia, Rekayasa Bioproses, Departemen Teknik Kimia Email: [email protected]

Abstrak Saat ini penggunaan enzim semakin meningkat, baik untuk penelitian maupun untuk industri. Hal ini terjadi akibat kemajuan dalam berbagai bidang seperti teknologi fermentasi, rekayasa genetika, dan teknologi aplikasi enzim. Salah satu jenis enzim yang sangat banyak digunakan dan berperan penting dalam aplikasi bioteknologi dan industri adalah enzim protease, yang mana yang banyak digunakan adalah enzim papain. Enzim papain merupakan enzim proteolitik hasil isolasi dari getah penyadapan buah papaya atau bisa juga berasal dari daun pohon pepaya (Carica papaya L.) Di pasar sudah dijual enzim komersial merk “Paya” yang berfungsi sebagai pengempuk daging dengan harga yang murah, akan tetapi enzim papain ini tidak murni dan tidak diketahui aktivitasnya. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menguji konsentrasi enzim papain dan kasein yang terlarut dengan menggunakan metode uji kadar protein Lowry. Dari konsentrasi awal enzim papain dan kasein sebagai substratnya masing-masing adalah 20000 ppm didapatkan konsentrasi enzim papain terlarut sekitar 71,069 ppm dan konsentrasi kasein terlarut sebesar 764,8276 ppm. Hasil dari percobaan pertama ini digunakan untuk percobaan kedua, yaitu untuk mengukur dan mengetahui parameter-parameter kinetika enzim yaitu Km dan Vmaks dari enzim papain ini. Selain itu, penelitian ini juga bertujuan untuk Didapatkan nilai Km dan Vmaks sebesar masing-masing 248,68 ppm dan 1,514 ppm kasein/menit.

MICHAELIS-MENTEN PARAMETERS CHARACTERIZATION OF COMMERCIAL PAPAIN ENZYME “PAYA” Abstract The use of enzymes is increasing nowadays, both for research and for industry. This happens due to the advances in various fields such as fermentation technology, genetic engineering, and enzyme applications technology. One kind of enzymes that is very widely used and plays an important role in biotechnology and industrial applications is a protease enzyme, especially papain enzyme. Papain enzyme is a proteolytic enzyme which is isolated from papaya fruit sap tapping or it could be derived from the leaves of papaya (Carica papaya L.). Actually in the market, there is already a commercial papain enzyme called "Paya" which serves as a meat tenderizer with a relatively cheap price, but the enzyme papain was not pure and has unknown activity. Therefore, this study aims to examine the levels of dissolved papain enzyme and casein as the substrate by using the Lowry protein assay method. The initial concentration of papain enzyme and casein respectively 20000 ppm, and from that concentration we found that the concentration of dissolved papain enzyme and dissolved casein are respectively 71.069 ppm and 764.8276 pppm. The results from the first experiment are used for the second experiment which is to measure and determine the enzyme kinetics parameters Km and Vmax of that commercial papain enzyme with casein as the substrate. From this research, we found that the Km and Vmax of this commercial papain enzyme respectively 248.68 ppm dan 1.514 ppm casein/minute. Keywords: casein, commercial papain enzyme “Paya”; enzyme kinetics; Lowry protein assay method

Karakterisasi parameter michaelis ..., Mathias Elsson, FT UI, 2015

Pendahuluan Saat ini penggunaan enzim semakin meningkat, baik untuk penelitian maupun untuk industri. Hal ini terjadi akibat kemajuan dalam berbagai bidang seperti teknologi fermentasi, rekayasa genetika, dan teknologi aplikasi enzim. Salah satu jenis enzim yang sangat banyak digunakan dan berperan penting dalam aplikasi bioteknologi dan industri adalah enzim protease. Enzim protease atau disebut juga enzim proteolitik adalah enzim yang bersifat spesifik untuk mengurai atau memecah protein. Enzim protease dapat dihasil oleh banyak sumber baik itu mikroorganisme atau pun dari tumbuhan, buah-buahan, dsb. Penggunaan enzim protease sangat efektif dan menguntungkan. Sebagai contoh dalam industri pangan, enzim protease dimanfaatkan untuk pengolahan susu, roti, biskuit, proses pematangan keju, pengempuk daging, dan pembuatan produk dari kedelai. Selain pada industri pangan, enzim protease juga digunakan dalam beberapa aplikasi industri seperti deterjen, farmasi, produk-produk kulit, dan proses pengolahan limbah industri. Salah satu jenis enzim protease yang banyak digunakan dalam industri dan juga bidang penelitian adalah enzim papain. Enzim papain merupakan enzim proteolitik hasil isolasi dari getah penyadapan buah papaya atau bisa juga berasal dari daun pohon pepaya (Carica papaya L.). Selain mengandung papain sebanyak 10%, getah buah pepaya juga tersusun atas enzim kimopapain dan lisozim sebesar 45% dan 20% (Winarno 1983). Aktivitas enzim papain cukup spesifik karena papain hanya dapat mengkatalisis proses hidrolisis dengan baik pada kondisi pH serta suhu dalam kisaran waktu tertentu. Papain biasanya aktif pada nilai pH antara 5.0 hingga 7.0 dengan titik isoelektrik 8.75 dan suhu 50 hingga 60°C. Keaktifan papain berkurang hingga 20% apabila dipanaskan pada suhu 75°C selama 30 menit dan 50% pada pemanasan menggunakan suhu 76 hingga 85°C selama 56 menit pada pH 7. Enzim papain digunakan untuk pengempukan daging, pembuatan hidrolisat protein, bahan penjernih pada industri minuman bir, industri tekstil, industri penyamakan kulit, industri farmasi dan kosmetik, dan lain-lain. Papain biasanya diperdagangkan dalam bentuk serbuk putih kekuningan dan harus disimpan di bawah suhu 4oC (Fitriani, 2006). Enzim papain murni yang diperdagangkan harganya relatif mahal, sedangkan biasanya untuk penelitian agar dapat menghemat maka menggunakan enzim papain yang diekstrak langsung dari getah pepaya ataupun dari daun pepaya.


Sebenarnya di pasaran sudah dijual enzim komersial merk “Paya” yang berfungsi sebagai pengempuk daging dengan harga yang relatif murah, akan tetapi enzim papain ini tidak murni melainkan sudah dicampur dengan bahan lainnya seperti gula dan garam. Kekurangan dari enzim komersial merk Paya ini selain karena sudah campuran adalah karena enzim papain ini tidak diketahui aktivitasnya, padahal enzim papain komersial ini telah dipakai dalam beberapa penelitian. Penelitian ini bertujuan untuk mengukur dan mengetahui parameter-parameter kinetika enzim yaitu Km dan Vmaks dari enzim papain ini dengan substrat berupa kasein. Selain untuk mengukur dan mengetahui parameter-parameter kinetika enzim, penelitian ini juga bertujuan untuk menguji kadar protein dalam enzim papain komersial ini dan juga kasein sebagai substratnya dengan menggunakan metode uji kadar protein Lowry. (Lowry OH, 1951) Gambar 1 di bawah ini adalah enzim papain komersial “Paya” dan kasein yang digunakan dalam penelitian ini.

Gambar 1. Enzim Papain Komersial “Paya” dan Kasein yang Digunakan

Penelitian mengenai karakterisasi enzim sebenarnya sudah sejak lama dan sangat banyak dilakukan, banyak metode juga yang digunakan yang telah dipublikasikan. Untuk penelitian dari beberapa tahun yang lalu hingga saat ini di Indonesia misalnya yaitu pada tahun 2006 dilakukan penelitian mengenai isolasi dan karakterisasi ekstrak kasar enzim bromelin dari batang nanas oleh Herdyastuti dengan menggunakan metode fraksinasi. Pada tahun 2007 dilakukan penelitian mengenai produksi dan karakterisasi enzim β-endoxilanase dari bakteri sistem intestinal rayap oleh Ratnadewi dengan menggunakan metode elektroforesis. Tahun 2013 kemudian juga dilakukan penelitian karakterisasi ekstrak kasar enzim polifenoloksidase dari udang windu yang dilakukan oleh Made Suhandana dkk dengan menggunakan larutan buffer secara bertingkat. Penelitian mengenai purifikasi enzim papain dilakukan pada tahun 2000 oleh Monti dkk dari Brazil, kemudian penelitian mengenai karakteristik enzim papain pada tahun 2007 oleh


Oktaviani RA. Pada tahun 2013 dilakukan penelitian mengenai karakteristik aktivitas enzim papain kasar oleh Khamim Nugroho dkk, dan juga pada tahun 2014 dilakukan karakterisasi enzim papain dari daun pepaya oleh Zusfahair dkk. Hampir keseluruhan dari penelitian mengenai penggunaan enzim dan karakteristik enzim yang telah dilakukan di atas biasanya didahului dengan proses ektraksi enzim itu sendiri dari sumbernya baik itu tanaman, bakteri, dsb.

Tinjauan Teoritis Di dalam sistem biologis, reaksi kimia yang terjadi di dalamnya selalu melibatkan sebuah katalis. Katalis ini dikenal sebagai katalis biologis atau disebut juga dengan biokatalisator yang berupa protein yang sangat spesifik yang disebut dengan enzim. Enzim saat ini sudah banyak dan akan terus dikembangkan di dalam industri kimia. Pengembangan ini ditujukan untuk mengurangi konsumsi energi proses serta menghilangkan senyawa-senyawa pengotor dalam produk suatu proses. Kata enzim berasal dari bahasa Yunani, “enzyme” yang berarti di dalam sel. Pada tahun 1876, Willy Kuchne mendefinisikan enzim sebagai fermen (ragi) yang bentuknya tidak tentu dan tidak teratur yang dapat bekerja tanpa adanya mikroba dan dapat bekerja di luar mikroba. Definisi ini kemudian berubah pada tahun 1897 setelah seorang peneliti bernama Buchner melakukan penelitian lanjutan di mana dikatakan bahwa enzim dapat diproduksi oleh mikroba atau bahkan bahan lainnya seperti hewan dan tumbuhan, serta enzim dapat diisolasi dalam bentuk murni. Enzim merupakan senyawa protein yang dapat mengkatalisis seluruh reaksi kimia dalam sistem biologis. Semua enzim murni yang telah diamati sampai saat ini adalah protein. Aktivitas katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. (Dianty Rosirda Dewi Kurnia, 2010) Karena berfungsi sebagai katalis biologis, maka enzim dapat mempercepat reaksi biologis, mulai dari reaksi yang sederhana hingga reaksi yang sangat rumit sekalipun. Prinsip kerja enzim adalah dengan cara menempel pada prmukaan molekul zat-zat yang bereaksi sehingga hal tersebut akan mempercepat proses reaksi. Hal ini dapat terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah reaksi tersebut berlangsung. Enzim akan mengikat molekul substrat untuk kemudian membentuk kompleks enzim substrat yang


bersifat sementara dan kemudian akan terurai menjadi enzim bebas dan produknya. (Lehninger, 1995)

Berdasarkan biosintesisnya, enzim dibedakan menjadi enzim konstitutif dan enzim induktif. Enzim konstitutif adalah enzim yang selalu tersedia di dalam sel mikroba dalam jumlah yang relatif konstan, sedangkan enzim induktif adalah enzim yang ada dalam jumlah sel yang tidak tetap, tergantung pada adanya induser. Enzim induktif ini jumlahnya akan bertambah sampai beberapa ribu kali bahkan lebih apabila dalam medium mengandung substrat yang menginduksi, terutama bila substrat penginduksi merupakan satu-satunya sumber karbon (Lidya dan Djenar, 2000). Berdasarkan tempat bekerjanya, enzim dapat dibedakan dalam 2 golongan, yaitu endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim disebut juga enzim intraseluler, dihasilkan di dalam sel yaitu pada bagian membran sitoplasma dan melakukan metabolisme di dalam sel. Eksoenzim (enzim ekstraseluler) merupakan enzim yang dihasilkan sel kemudian dikeluarkan melalui dinding sel sehingga terdapat bebas dalam media yang mengelilingi sel dan bereaksi memecah bahan organic tanpa tergantung pada sel yang melepaskannya (Soedigdo, 1988). Saat ini enzim sebagai biokatalis telah banyak diaplikasikan secara komersial untuk prosesproses industri. Terdapat beberapa enzim penting yang digunakan pada dunia industri dalam jumlah yang besar, yaitu enzim yang menghidrolisis karbohidrat, enzim yang bekerja pada pektin, enzim yang bekerja pada minyak dan lemak serta enzim pengurai protein. Jenis enzim yang banyak digunakan di industri antara lain amilase, protease, katalase, isomerase dan penicillin asilase. Enzim yang digunakan untuk keperluan analitik antara lain glucose oxidase, galactose oxidase, alcohol dehydrogenase, hexokinase, muramidase dan cholesterol oxidase. Enzim yang digunakan untuk obat-obatan antara lain asparaginase, protease, lipase, dan streptokinase (Crueger dan Crueger, 1984). Enzim memiliki keunggulan sifat, antara lain mempunyai aktivitas yang tinggi, efektif, spesifik dan ramah lingkungan (Lidya dan Djenar, 2000), sedangkan menurut Saktiwansyah (2001), enzim memiliki sifat yang khas, yaitu sangat aktif walaupun konsentrasinya amat rendah, sangat selektif dan bekerja pada kondisi yang ramah (mild), yaitu tanpa temperatur atau tekanan tinggi dan tanpa logam yang umumnya beracun. Hal inilah yang menyebabkan reaksi yang


dikatalisis secara enzimatik menjadi lebih efisien dibandingkan dengan reaksi yang dikatalisis oleh katalis kimia (August, 2000). Enzim mempunyai kekhususan aktivitas, yaitu peranannya sebagai katalis hanya terhadap satu reaksi atau beberapa reaksi yang sejenis saja. Jadi dapat melibatkan beberapa jenis substrat (Winarno, 1986). Sifat spesifik (spesifisitas enzim) didefinisikan sebagai kemampuan suatu enzim untuk mendiskriminasikan substratnya berdasarkan perbedaan afinitas substrat-substrat untuk mencapai sisi aktif enzim (August, 2000). Sifat spesifinitas ini dapat dimanfaatkan untuk tujuan reaksi atau jenis produk yang diharapkan. Sifat ini sangat menguntungkan karena tidak akan dijumpai reaksi-reaksi samping, sehingga lebih ramah lingkungan. Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim akan dipengaruhi oleh konsentrasi substrat. Pengaruh berbagai konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal jika konsentrasi enzim dijaga konstan dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini.

Gambar 2. Pengaruh Konsentrasi Substrat Terhadap Kecepatan Awal Reaksi Enzimatik Sumber: Lehninger, 1990

Dari gambar di atas dapat dilihat bahwa pada konsentrasi substrat yang sangat rendah maka kecepatan reaksipun akan rendah, akan tetapi kecepatan ini akan meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Jika diuji pengaruh konsentrasi substrat yang terus meningkat setiap saat kita mengukur kecepatan awal reaksi yang dikatalisis ini maka akan ditemukan bawa kecepatan akan meningkat dengan nilai yang semakin kecil hingga pada akhirnya akan tercapat titik batasan di mana setelah titik ini terlewati maka kecepatan reaksi akan hanya bertambah sangat kecil seiring dengan penambahan konsentrasi substrat. Setinggi apapun konsentrasi substratnya setelah titik ini tercapai, kecepatan reaksi akan mendekati namun tidak akan pernah


mencapai garis maksimumnya. Inilah yang disebut dengan kecepatan maksimum (Vmaks) di mana enzim sudah jenuh akan substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat lagi. Perilaku di atas diperlihatkan oleh hampir semua enzim sehingga pada tahun 1903 Victor Henri berkesimpulan bahwa enzim bergabung dengan molekul substrat untuk membentuk suatu kompleks enzim substrat sebagai suatu tahapan yang memang harus dilalui dalam proses katalisis oleh enzim. Pemikiran ini kemudian menjadi sebuah teori umum kerja enzim dan disebarluaskan, terutama oleh Leonor Michaelis dan Maud Menten pada tahun 1913. Mereka mengemukakan bahwa enzim (E) awalnya bergabung dengan substratnya (S) dalam suatu reaksi reversibel (dapat balik) membentuk kompleks enzim substrat (ES) yang mana reaksi ini berlangsung relatif cepat. E + S ↔ ES Kompleks enzim substrat ini kemudian terurai dalam suatu reaksi reversibel yang kedua yang mana berjalan lebih lambat disbanding reaksi reversibel yang pertama tadi untuk menghasilkan produk (P) dari reaksi tersebut dan juga enzim bebas seperti awal. ES ↔ P + E Pada setiap saat dalam reaksi enzimatik, enzim terdapat dalam dua bentuk yaitu dalam bentuk yang sudah terikat dengan substrat dan juga yang masih bebas atau tidak terikat. Kecepatan reaksi ini menjadi maksimum ketika semua enzim dapat terikat dengan substrat dan yang tidak terikat jumlahnya sangat sedikit. Hal ini akan dapat tercapai pada saat konsentrasi substrat tinggi, karena menurut hokum aksi massa, kesetimbangan reaksi akan bergeser ke kanan ketika konsentrasi substrat meningkat. Jika konsentrasi substrat ditingkatkan sampai ke batas yang cukup tinggi, semua enzim bebas akan terubah menjadi bentuk ES. Pada reaksi reversibel yang kedua dalam siklus katalitik ini, kompleks ES terus-menerus dan dengan cepat terurai, menghasilkan produk dan enzim bebas. Namun jika konsentrasi S cukup tinggi, maka enzim bebas segera akan berikatan dengan molekul substrat yang lain. Pada keadaan ini, tercapai suatu keadaan imbang, dengan enzim yang senantiasa jenuh oleh substratnya dan tercapai kecepatan maksimum. Pada Gambar 2 yang memperlihatkan hubungan di antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik dapat dilihat sukarnya menyatakan konsentrasi substrat yang diperlukan untuk mencapai Vmaks dari pendekatan terhadap kecepatan reaksi yang semakin mendekati kecepatan maksimum Vmaks. Namun demikian, karena kurva yang menyatakan hubungan ini memiliki bentuk umum yang sama bagi hampir semua enzim (kurva ini berbentuk


hiperbola), Michaelis dan Menten mendefinisikan suatu tetapan, yang dinyatakan sebagai Km, yang bermanfaat dalam menyatakan hubungan yang tepat di antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik. Km atau tetapan Michaelis-Menten, dapat didefinisikan secara sederhana sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Nilai Km merupakan unsur kunci di dalam persamaan Michaelis-Menten dan bersifat khas bagi setiap enzim dengan menggunakan substrat tertentu yang spesifik pada kondisi pH dan temperatur tertentu. Hipotesis Michaelis-Menten secara sederhana dapat dituliskan sebagai berikut:

Keterangan:

E

= enzim bebas

S

= substrat

ES

= kompleks enzim substrat

P

= produk

k1

= tetapan kesetimbangan reaksi pembentukan ES

k2

= tetapan kesetimbangan reaksi penguraian ES

k3

= tetapan kesetimbangan reaksi pembentukan produk

Laju reaksi awal suatu reaksi enzimatis dapat dituliskan sebagai V = k3 [ES], karena baik [ES] maupun k3 tidak dapat diukur langsung maka untuk menghitung V harus dicari terlebih dahulu besaran-besaran lainnya yang dapat diukur langsung. Pada keadaan tunak (steady state) berlaku [E] = [E]0 – [ES], maka: Laju pembentukan ES = k1 [E] [S] = k1 {[E]0 – [ES]} [S] Laju penguraian ES

= k2 [ES] + k3 [ES]

Untuk reaksi reversibel, laju pembentukan ES sama dengan laju penguraian ES sehingga k1 {[E]0 – [ES]} [S] = k2 [ES] + k3 [ES] dan didapatkan:

Di mana

!! !!! !!

= !! (konstanta Michaelis-Menten yang nilainya menunjukkan afinitas

antara enzim dan substrat) sehingga akan diperoleh persamaan:


Jika [S] besar sehingga enzim E semuanya menjadi ES, maka [ES] ≈ [E]0 dan akibatnya k3 [E]0 = Vmaks sehingga persamaan Michaelis-Menten secara matematika dinyatakan dalam persamaan: !! =

!!"#$ [!] !! + [!]

Keterangan: V0

= kecepatan awal pada konsentrasi substrat [S]

Vmaks

= kecepatan maksimum

Km

= konstanta Michaelis-Menten enzim bagi substrat tertentu

Persamaan di atas merupakan persamaan kecepatan bagi suatu reaksi enzimatik satu substrat, merupakan suatu pernyataan mengenai hubungan kuantitatif di antara kecepatan reaksi awal V0, kecepatan maksimum Vmaks dan konsentrasi substrat awal yang dihubungkan melalui tetapan Michaelis-Menten Km. Persamaan Michaelis-Menten merupakan dasar bagi semua aspek kinetika kerja enzim. Jika nilai Km dan Vmaks diketahui, kecepatan reaksi suatu enzim pada setiap konsentrasi substrat dapat dihitung. Hampir semua reaksi enzimatik, termasuk reaksi dengan dua atau lebih substrat dapat dianalisa secara kuantitatif dengan teori Michaelis-Menten. Kenyataan ini telah memberikan bukti kuat bahwa enzim mengkatalisis reaksi dengan menggabungkan substratnya dalam waktu sementara, jadi menurunkan energi aktivasi keseluruhan reaksi. Pembentukan kompleks enzimsubstrat seringkali dapat dideteksi secara langsung dengan metode fisiko-kimia, yaitu melalui perubahan spektrum absorbsi enzim tersebut yang bersifat khas, ketika substratnya ditambahkan. (Dianty Rosirda Dewi Kurnia, 2010) Transformasi yang umum digunakan adalah dengan membuat kebalikan dari kedua sisi persamaan Michaelis-Menten, sehingga diperoleh hubungan: 1 !! + [!] = !! !!"#$ [!] Persamaan di atas kemudian dapat disederhanakan menjadi: 1 !! 1 1 = + !! !!"#$ [!] !!"#$ Persamaan di atas lebih dikenal dengan persamaan Lineweaver-Burk.


Pada penelitian ini digunakan enzim papain komersial “Paya” yang diperjualbelikan sebagai pengempuk daging. Enzim papain ini merupakan enzim papain kasar yang telah dicampur dengan gula dan garam yang diproduksi oleh Enzyme Development Enterprise di Jakarta, Indonesia. Enzim papain merupakan enzim proteolitik hasil isolasi dari getah penyadapan buah pepaya (Carica papaya L.). Selain mengandung papain sebanyak 10%, getah buah pepaya juga tersusun atas enzim kimopapain dan lisozim sebesar 45% dan 20% (Winarno 1983). Papain tersusun atas 212 residu asam amino yang membentuk sebuah rantai peptida tunggal dengan bobot molekul sebesar 23.000 g/mol. Rantai ikatan tersebut tersusun atas arginin, lisin, leusin, dan glisin (Harrison et al. 1997). Aktivitas enzim papain cukup spesifik karena papain hanya dapat mengkatalisis proses hidrolisis dengan baik pada kondisi pH serta suhu dalam kisaran waktu tertentu. Papain biasanya aktif pada nilai pH antara 5,0 hingga 7,0 dengan titik isoelektrik 8,75 dan suhu 50 hingga 60°C.

Metode Penelitian Penelitian ini dibagi menjadi dua tahapan. Tahap pertama dari penelitian ini adalah untuk menguji kadar protein yang terlarut dalam enzim papain dan juga kasein sebagai substratnya. Penelitian tahap kedua adalah untuk menghitung parameter-parameter aktivitas enzim papain komersial “Paya” dengan menghitung konstanta Michaelis-Menten dan juga kecepatan maksimum dari reaksi yang dikatalisis enzim papain ini. Berikut ini merupakan diagram alir dari penelitian yang dilakukan:

Gambar 3. Diagram Alir Penelitian Tahap Pertama


Gambar 4. Diagram Alir Penelitian Tahap Kedua

Penelitian tahap pertama dilakukan untuk menguji kadar protein yang terlarut dalam enzim papain dan juga kasein sebagai substratnya. Untuk menguji kadar protein ini, digunakan metode Lowry sebagai berikut. •

Larutan protein standar (Bovin Serum Albumin 200 µg/mL) dan akuades dicampurkan dengan jumlah tertentu (berdasarkan Tabel 3.1) dalam tabung reaksi sehingga diperoleh berbagai konsentrasi antara 20 – 120 mg dalam larutan standar 1 mL. Tabel 1. Penentuan Kadar Protein dengan Menggunakan Metode Lowry

Konsentrasi (mg/L) Standar BSA (mL) Sampel (mL) Akuades (mL) Larutan Biuret (mL) Reagen Folin (mL)

Blanko 1

20 0,1

40 0,2

Larutan Standar 60 80 100 0,3 0,4 0,5

120 0,6

0,9

0,8

0,7

0,4

0,6

0,5

3 0,3


Sampel 0,1 0,9

Di dalam tabung lain dicampurkan juga sampel protein (sampel protein pertama

•

adalah enzim papain komersial “Paya”, sampel protein kedua adalah kasein) dan akuades sehingga volume total larutan sampel adalah 1 mL. Tambahkan larutan biuret (1 mL larutan CuSO4 1% dan 1 mL larutan NaK-Tartrat

•

1% dimasukan ke dalam 100 mL larutan Na2CO3 2%) sebanyak 3 mL ke dalam masing-masing tabung reaksi. •

Segera kocok dengan menggunakan alat vortex mixer.

•

Larutan campuran tadi diinkubasi pada suhu kamar selama tepat 10 menit menggunakan stopwatch dan waktu dihitung pada saat menambahkan biuret. Setelah tepat 10 menit diinkubasi, masukan reagen Folin Ciocalteau 1N sebanyak

•

0,3 mL ke dalam masing-masing tabung reaksi. •

Segera kocok dengan menggunakan alat vortex mixer.

•

Larutan tadi kemudian diinkubasi kembali pada suhu kamar selama 30 menit setelah penambahan reagen Folin. Serapan masing-masing larutan diukur tepat pada menit ke-30 pada panjang

•

gelombang 750 nm. Penelitian tahap kedua dilakukan untuk menghitung parameter-parameter aktivitas enzim papain komersial “Paya” dengan menghitung konstanta Michaelis-Menten dan juga kecepatan maksimum dari reaksi yang dikatalisis enzim papain ini. Berikut adalah langkah-langkah yang digunakan untuk menentukan aktivitas enzim: •

0,5 mL larutan enzim ditambah dengan 0,5 mL larutan 0,05 M buffer fosfat pH 7, kemudian dipreinkubasi pada suhu 37oC selama 5 menit.

•

Lalu tambahkan juga 0,5 mL substrat (dibuat dalam 5 variasi konsentrasi, mulai dari 191,2075 ppm, 95,604 ppm, 47,802 ppm, 23,901 ppm, dan 11,95 ppm yang didapatkan dengan cara mengencerkan larutan substrat yang sama dengan yang dipakai pada percobaan pertama), setelah itu inkubasi pada suhu 37oC selama 10 menit.

•

Untuk menghentikan reaksi, maka tambahkan 1 mL 0,4 M asam trikloroasetat (TCA)

•

Setelah itu disentifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 30 menit


•

Setelah disentrifugasi, sebanyak 0,5 mL filtrat ditambah dengan 2,5 mL 0,5 M natrium karbonat, dan setelah itu dipreinkubasi selama 10 menit.

•

Langkah selanjutnya adalah dengan menambahkan dengan 0,5 mL reagen Folin Ciocalteau, inkubasi kembali selama 30 menit.

•

Langkah terakhir adalah dengan membaca optical density-nya pada 660nm. (Blanko yang digunakan adalah larutan enzim dengan perlakuan yang sama kecuali penambahan TCA dilakukan sebelum penambahan substrat)

Hasil dan Pembahasan Sebagaimana ditelah dijelaskan di bab sebelumnya bahwa penelitian ini dilakukan dalam dua tahap, yaitu yang pertama adalah untuk menguji kadar protein yang terlarut dalam enzim papain dan juga kasein sebagai substratnya. Uji kadar protein terlarut ini dilakukan dengan menggunakan metode Lowry dengan membuat terlebih dahulu larutan standar menggunakan Bovin Serum Albumin (BSA). Langkah yang harus dilakukan pada penelitian tahap pertama adalah mempersiapkan larutan standar BSA dengan berbagai konsentrasi sesuai Tabel 1, membuat larutan biuret, dan membuat reagen Folin. Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansi dengan menggunakan spectroquant pada panjang gelombang 750 nm. Dari prosedur metode penelitian tahap pertama ini didapatkan data dan diplot menjadi kurva standar seperti di bawah ini:


Kurva Larutan Standar BSA 0.400 y = 0.0029x + 0.0062 R² = 0.993

0.350 Absorbansi

0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 0

20

40

60

80

100

120

140

Konsentrasi (ppm)

Gambar 5. Grafik Kurva Standar BSA

Gambar 5 di atas merupakan grafik dari kurva larutan standar BSA dengan berbagai konsentrasi sesuai dengan Tabel. Persamaan garis yang didapatkan dari kurva tersebut akan digunakan untuk menghitung konsentrasi dari enzim papain terlarut dan juga konsentrasi kasein terlarut. Untuk melakukan uji kadar protein Lowry, semua harus dilakukan dengan sangat teliti sehingga kurva standar yang terbentuk memiliki nilai regresi minimal 0,99. Dengan nilai regresi adalah 0,993 maka kurva standar di atas sudah memenuhi syarat tersebut. Pengukuran absorbansi sampel enzim dan kasein dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan, sedangkan pengukuran absorbansi larutan standar untuk membuat kurva standar hanya sekali dilakukan. Dari data nilai absorbansi sampel enzim papain yang didapatkan kemudian dirata-rata dan hasilnya adalah: ! = !" + ! ! = 0,0029! + 0,0062 0,2123 = 0,0029! + 0,0062 0,2061 = 0,0029! ! = 71, 069 !!"


Jadi, konsentrasi enzim papain terlarut rata-rata adalah sebesar 71,069 ppm. Dari data nilai absorbansi sampel kasein yang didapatkan dari pengenceran 10 kali kemudian dirata-rata dan hasilnya adalah: ! = !" + ! ! = 0,0029! + 0,0062 0,228 = 0,0029! + 0,0062 !=

0,228 − 0,0062 ! !"#$%& !"#$"#%"&'# 0,0029 !=

0,228 − 0,0062 ! 10 0,0029

! = 764,8276 !!" Jadi, konsentrasi substrat terlarut rata-rata adalah sebesar 764,8276 ppm. Dari perhitungan konsentrasi enzim papain terlarut dan juga konsentrasi kasein terlarut dapat disimpulkan bahwa konsentrasi yang terlarut tersebut sangat kecil bila dibandingkan dengan konsentrasi awal enzim papain dan kasein yang digunakan. Rata-rata konsentrasi enzim papain terlarut adalah sebesar 71,069 ppm dari konsentrasi awal 20000 ppm, sedangkan rata-rata konsentrasi kasein terlarut lebih besar yaitu 764,8276 ppm dari konsentrasi awal 20000 ppm. Hal ini menunjukkan jumlah enzim papain maksimal yang dapat menghidrolisis kasein sebagai substratnya. Selain itu konsentrasi kasein terlarut hasil perhitungan juga menunjukkan jumlah kasein sebagai substrat maksimal yang dapat dihidrolisis oleh enzim papain komersial “Paya”. Dari jumlah konsentrasi enzim papain “Paya” yang terlarut inilah yang akan digunakan sebagai jumlah konsentrasi enzim untuk mengukur Km dan Vmaks. Konsentrasi rata-rata kasein terlarut juga akan digunakan sebagai larutan kasein pada percobaan kedua di mana konsentrasi larutan substrat divariasikan menjadi 764,8276 ppm, 382,415 ppm, 191,2075 ppm, 95,604 ppm, 47,802 ppm, 23,901 ppm, dan 11,95 ppm. Penelitian tahap kedua dilakukan untuk menghitung parameter-parameter aktivitas enzim papain komersial “Paya” dengan menghitung konstanta Michaelis-Menten dan juga kecepatan maksimum dari reaksi yang dikatalisis enzim papain ini. Langkah yang dilakukan untuk memulai


penelitian tahap kedua ini adalah dengan membuat larutan buffer fosfat, mempersiapkan kasein dengan berbagai konsentrasi yaitu 764,8276 ppm, 382,415 ppm, 191,2075 ppm, 95,604 ppm, 47,802 ppm, 23,901 ppm, dan 11,95 ppm. Untuk mendapatkan variasi konsentrasi di atas maka perlu dilakukan pengenceran larutan kasein 764,8276 ppm dan menambahkan larutan buffer fosfat hingga volume total tertentu. Larutan enzim yang digunakan juga sama dengan yang dipakai pada percobaan pertama di mana berdasarkan hasil rata-rata absorbansinya dan kemudian dimasukkan ke dalam persamaan garis kurva standar BSA maka didapatkan konsentrasinya adalah sebesar 71,069 ppm. Pengukuran absorbansi sampel dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan yang kemudian

1/V

dirata-rata hasilnya dan diplot menjadi sebuah grafik seperti di bawah ini. 16.0000 14.0000 12.0000 10.0000 8.0000 6.0000 4.0000 2.0000 0.0000 0.0000

y = 164.250x + 0.6606 R² = 0.999

0.0200

0.0400

0.0600

0.0800

0.1000

1/[S] (ppm)

Gambar 6. Grafik Nilai Rata-rata Absorbansi Terhadap Konsentrasi Substrat

Untuk mendapatkan Km dan Vmaks digunakan persamaan garis pada grafik di atas, yaitu: ! = !" + ! ! = 164,25! + 0,6606 1 !! 1 1 = + ! !!"#$ ! !!"#$ 1 !!"#$

= 0,6606


!!"#$ = 1,514 !!" !"#$%& !"#$% !! = 164,25 !!"#$ !! = 164,25 1,514 !! = 248,68 !!" Jadi, Km dan Vmaks dari enzim papain ini adalah berurutan sebesar 248,68 ppm dan 1,514 ppm kasein/menit. Hal ini menunjukkan bahwa kecepatan maksimum dari enzim papain komersial “Paya” untuk menghidrolisis kasein sebagai substratnya adalah sebesar 1,514 ppm/menit. Selain itu, hal ini juga berarti sebanyak apapun konsentrasi substrat nantinya ditambahkan maka kecepatan reaksi hanya mendekati dan tidak akan pernah mencapai kecepatan maksimum ini. Inilah titik di mana enzim sudah jenuh akan substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat lagi. Nilai Vmaks ini cukup kecil bila dilihat dari konsentrasi substrat terlarut rata-rata adalah sebanyak 764,48276 ppm, maka dibutuhkan waktu yang cukup lama untuk enzim papain ini menghidrolisis seluruh substrat yang ada. Dari konsentrasi enzim papain yang digunakan dan juga lima variasi konsentrasi substrat kasein yang digunakan didapatkan nilai Km yang besar secara angka namun kecil jika dikonversikan, yaitu sekitar 248,68 ppm atau 3,316 µM (dengan berat molekul kasein sebesar 75000 gr/mol), sedangkan nilai Vmaks akan menjadi 0,020187 µM kasein/menit. Km menunjukkan konsentrasi substrat di mana tercapai setengah dari Vmaks. Sebagai perbandingan, pada tahun 1998, Sowmya Ganapathi-Desai dkk dari Universitas Kentucky USA meneliti enzim papain yang diimobilisasi, yang mana enzim papain tersebut memiliki nilai Km dan Vmaks masing-masing sebesar 500 µM dan 7,6 µM/menit. Ruben Monti dkk pada tahun 2000 melakukan penelitian enzim papain yang diambil dari getah segar pepaya yang mana hasilnya memiliki nilai Km dan Vmaks rata-rata masing-masing sebesar 19,825 µM dan 1336,5 µM/menit. Dari hasil konversi nilai nilai Km dan Vmaks di atas dapat dibandingkan bahwa nilai nilai Km dan Vmaks dari enzim papain komersial “Paya” ini jauh lebih kecil dibandingkan dengan enzim papain yang diimobilisasi dan juga enzim papain yang berasal dari getah pepaya segar. Nilai Km yang kecil ini berarti enzim


memiliki afinitas yang tinggi terhadap substrat, oleh karena itu kompleks ES akan kuat dan kesetimbangan akan berjalan ke arah kompleks ES.

Kesimpulan Kesimpulan dari penelitian ini adalah sebagai berikut: §

Konsentrasi enzim papain komersial “Paya” dan substrat kasein terlarut dari hasil rata-rata adalah masing-masing sebesar 71,069 ppm dan 764,8276 ppm. Nilai konsentrasi enzim papain terlarut ini kemudian digunakan untuk penelitian tahap kedua.

§

Nilai Km dan Vmaks dari enzim papain komersial “Paya” dari hasil rata-rata adalah masingmasing sebesar 248,68 ppm dan 1,514 ppm kasein/menit, artinya: o Nilai Km yang kecil ini berarti enzim memiliki afinitas yang tinggi terhadap substrat. o Kecepatan maksimum dari enzim papain komersial “Paya” untuk menghidrolisis kasein sebagai substratnya adalah sebesar 1,514 ppm kasein/menit. o Nilai Km menunjukkan konsentrasi substrat di mana akan tercapai setengah Vmaks, dari percobaan ini didapatkan nilainya adalah 248,68 ppm. o

Jika dibandingkan dengan beberapa penelitian terdahulu tentang enzim papain maka nilai nilai Km dan Vmaks dari enzim papain komersial “Paya” ini jauh lebih rendah.

Saran Sebaiknya penelitian ini dilanjutkan dan dilakukan dengan lebih teliti lagi agar didapatkan hasil yang mungkin lebih baik untuk kemajuan penelitian dan ilmu pengetahuan.

Daftar Referensi August EG. 2000. Kajian Lipase Amobil dari Aspergillus niger Pada Pembuatan MAG yang Bersifat Antibakteri dari Minyak Kelapa [tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor Crueger W, dan Crueger A. 1984. Biotechnology, A Text Book of Industrial Microbiology. Sunderland: Sinaeur Associates, Inc.


Dianty RDK. 2010. Studi Aktivitas Enzim Lipase dari Aspergillus niger Sebagai Biokatalis pada Proses Gliserolisis Untuk Menghasilkan Monogliserol [tesis]. Semarang: Universitas Diponegoro Fitriani V. 2006. Getah Sejuta Manfaat Edisi April 2006. Jakarta: PT. Trubus Swadaya Harrison MJ, Burton NA, dan Hiller IH. 1997. Catalytic mechanism of the enzyme papain: prediction with a hybrid quantum mechanical or molecular mechanical potential. Journal of American Chemical Society. 199:12285-12291. Herdyastuti N. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Ekstrak Kasar Enzim Bromelin dari Batang Nanas. Surabaya: Universitas Negeri Surabaya Khamim NI. 2013. Karateristik Aktivitas Proteolitik Enzim Papain Kasar. Malang: Universitas Brawijaya Lehninger AL. 1990. Dasar-dasar Biokimia. Maggy Thenawidjaja, penerjemah. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry. Jakarta: Penerbit Erlangga. Lidya B. dan Djenar NS. 2000. Dasar Bioproses. Jakarta: Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi DEPDIKNAS Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, dan Randall RJ. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagant. J. Biol. Chem. 193:265-275. Made S. 2013. Karakterisasi Ekstrak Kasar Enzim Polyphenoloxydase dari Udang Windu. Bogor: Institut Pertanian Bogor Monti R, Carmelita AB, Hendrique CT, dan Jonas Contiero. 2000. Purification of Papain from Fresh Latex of Carica Papaya. Brasil: Departamento de Bioquimica e Tecnologia Quimica. Universidade Estadual Paulista. Oktaviani RA. 2007. Karakterisasi Papain Dari Getah Pepaya. Malang: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Brawijaya. Ratnadewi AAI, Handayani W, dan Ni Nyoman TP. 2007. Produksi dan Karakterisasi Enzim βendoxylanase dari Bakteri Sistem Intestinal Rayap. Jember: Universitas Jember Saktiwansyah. 2001. Karakterisasi Enzim Lipase Intraseluler dengan Aktivitas Esterifikasi dari Kapang Rhizopus oryzae TR32. Bogor: Institut Pertanian Bogor Soedigdo P. 1988. Isolasi dan Pemurnian Enzim. Bandung: Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut Teknologi Bandung


Sowmya GD. 1998. Kinetics and Active Fraction Determination of a Protease Enzyme Immobilized on Functionalized Membranes: Mathematical Modeling and Experimental Results. Kentucky: University of Kentucky Winarno FG. 1983. Enzim Pangan. Jakarta: Gramedia. Zusfahair. 2014. Karakterisasi Papain dari Daun Pepaya. Purwokerto: Universitas Jenderal Soedirman


KARAKTERISASI PARAMETER MICHAELIS-MENTEN ENZIM PAPAIN KOMERSIAL PAYA

Recommend Documents