KARAKTERISASI BIOKIMIA DAN AMOBILISASI GLUKOSA OKSIDASE DARI ASPERGILLUS NIGER IPBCC PADA ELEKTRODA PASTA KARBON TERMODIFIKASI TITI ROHMAYANTI

KARAKTERISASI BIOKIMIA DAN AMOBILISASI GLUKOSA OKSIDASE DARI ASPERGILLUS NIGER IPBCC.08.610 PADA ELEKTRODA PASTA KARBON TERMODIFIKASI

TITI ROHMAYANTI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Karakterisasi Biokimia dan Amobilisasi Glukosa Oksidase dari Aspergillus niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2016 Titi Rohmayanti NIM G851140111

RINGKASAN TITI ROHMAYANTI. Karakterisasi Biokimia dan Amobilisasi Glukosa Oksidase dari Aspergillus niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan AKHIRUDDIN MADDU. Penggunaan enzim saat ini sangat luas diberbagai bidang, seperti bidang pangan, kesehatan, pertanian, maupun energi namun, Indonesia masih menjadi pengimpor enzim terbesar. Salah satu enzim yang banyak digunakan adalah glukosa oksidase (GOD). GOD merupakan enzim yang mengatalisis oksidasi dari β-Dglukosa menjadi D-glukono-δ-lakton dan hidrogen peroksida menggunakan molekul oksigen sebagai penerima elektron. GOD pada penelitian ini diproduksi langsung dari isolat lokal Aspergillus niger yang diisolasi dari tanaman pagar Dryobalanops di daerah Tarakan, Kalimantan Utara. Aplikasi dari GOD ke permukaan elektroda membutuhkan sistem amobilisasi. Proses amobilisasi enzim yang tepat dianggap dapat meningkatkan kinerja elektroda. Amobilisasi GOD ke nanofiber-polianilin pada permukaan elektroda pasta karbon diduga dapat meningkatkan konduktansi elektroda. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan karakteristik kinetika aktivitas GOD hasil pemurnian (NH4)2SO4 80% jenuh dan hasil amobilisasi GOD pada elektroda pasta karbon termodifikasi (EPKT) nanofiber polianilin. Penilitian ini terdiri atas sembilan tahap yakni: (1) Produksi dan isolasi GOD dari A.niger IPBCC.08.610; (2) Pemurnian GOD dengan (NH4)2SO4 80% jenuh; (3) Uji aktivitas GOD; (4) Kinetika GOD hasil pemurnian; (5) Optimasi ukuran diameter tembaga Elektroda Pasta Karbon (EPK); (6) Pengukuran voltamogram siklik elektroda pasta karbon (EPK) dan elektroda pasta karbon termodifikasi (EPKT); (7) Amobilisasi GOD pada EPKT; (8) Pengukuran voltamogram siklik EPKT teramobilisasi dan GOD yang tidak diamobilisasi; dan (9) Kinetika GOD teramobilisasi pada EPKT. Hasil penelitian diperoleh GOD dengan aktivitas tertinggi dihasilkan secara intraseluler oleh A.niger. Ekstrak kasar GOD intraseluler kemudian dimurnikan dengan pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh dan menghasilkan aktivitas spesifik sebesar 27.77 U/mg. Tingkat kemurnian yang dihasilkan mencapai 20.22 kali dari ekstrak kasarnya dengan yield sebesar 72.86%. Tembaga dengan diameter 3 mm memiliki nilai knduktansi yang lebih baik. Nanofiber polianilin meningkatkan konduktansi EPK sehingga lebih baik digunakan sebagai media amobilisasi glukosa oksidase. Metode amobilisasi dengan penambahan glutaraldehida sebagai agen pengikat silang GOD, dapat meningkatkan kinerja GODamo-IPB|EPKT. Karakteristik kinetika GOD yang teramobil pada elektroda dapat menurunkan nilai Km (3.1 mM) dan Imax yang dihasilkan besar (3.689 mA), sensitivitas yang tinggi 1.09 mA/mM dan range konsentrasi glukosa sebesar 0.2-2 mM. Range konsentrasi glukosa ini dapat digunakan dalam mendeteksi kadar glukosa dalam darah yakni sebesar 56.4 mg/dL selain itu, range ini juga dapat diaplikasikan dalam mendeteksi glukosa pada buah peach (0.9 mM). GODamo-IPB|EPKT pada penelitian ini berpotensi untuk dijadikan biosensor glukosa. Kata kunci: Aspergillus niger, glukosa oksidase, amobilisasi enzim, elektroda pasta karbon

SUMMARY

TITI ROHMAYANTI. Biochemistry Characterization and Immobilization Glukosa Oxidase from Aspergillus niger IPBCC.08.610 Onto Modified Carbon Paste Electrode. Supervised by LAKSMI AMBARSARI and AKHIRUDDIN MADDU. Enzyme production based on microorganism is one of progressive step in many fields such as food, agriculture, health and energy. One of widely used enzyme is glucose oxidase (GOx). GOx is an enzyme that catalyze the oxidation of β-D-glucose into D-gluconolactone and hydrogen peroxide. Nowadays, GOx was generally applied to biosensor and other commercial applications. In this research, GOx was produced directly from local Aspergillus niger which was isolated from local vine Dryobalanops in Tarakan, East Borneo, Indonesia. GOx is very interesting to be utilized as an electron transfer agent in biosensor because it has specific substrate with high specificity. Glucose utilization as a substrate is very convenient because glucose is abundant and sound. GOx application onto electrode in biosensor system needs immobilization process. The immobilization process of appropriate enzyme can elevate electrode performance. GOx immobilization into polyaniline-nanofiber at carbon pasta electrode surface is presumably to rise electrode conductance in biosensor. Nanometer-sized polyaniline widens electrode surface so that its application may be more economically efficient. The aim this research is to analyze biochemistry characteristic of GOx to apply as glucose biosensor This research has seven objectives that include the following: (1) GOx production and isolation from A.niger IPBCC.08.610; (2) GOx purification using saturated (NH4)2SO4 80%; (3) GOx activity assay; (4) Enzyme kinetics equation; (5) Optimation of diameter size carbon paste electrode (CPE); (6) Measurement of CPE and modified carbon paste electrode (MCPE) cyclic voltamogram; (7) Immobilization of GOx into MCPE; (8) Measurement of MCPEimmobalization GOx and MCPE-unimmobalized GOx cyclic voltamogram performance; and (9) Immobilized GOx kinetics in MCPE. GOx had purity level of 20.22 times of crude extract. Polyaniline-nanofiber evolved CPE conductance, affectes itself as a better glucose oxidase immobilization media. Enzyme immobilization was done by adding glutaraldehyde as the crosslinker agent of GOD, increased GODimmo-IPB|MCPE performance. GODimmoIPB|MCPE is potential to be developed as glucosa biosensor because it possessed enough high Km, Imax, sensitivity, and glucose concentration range, those were respectively 2.86 mM, 3.8 mA, 1.09 mA/mM and 0.2-4 mM. Key words: Aspergillus niger; glucose oxidase; enzyme immobilization; carbon paste electrode

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KARAKTERISASI BIOKIMIA DAN AMOBILISASI GLUKOSA OKSIDASE DARI ASPERGILLUS NIGER IPBCC.08.610 PADA ELEKTRODA PASTA KARBON TERMODIFIKASI

TITI ROHMAYANTI

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:

Dr Nisa Rachmania, MSi

Judul Tesis

: Karakterisasi Biokimia dan Amobilisasi Glukosa Oksidase dari Aspergillus

niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon

Termodifikasi Nama

: Titi Rohmayanti

NIM

: 0851140111

Disetu ui oleh

j

Komisi Pembimbing

�·

Dr Laksmi Ambarsari, MS

Dr Akh

Ketua

�din Maddu, MSi Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Biokimia

Tanggal U ian: 19 Agustus 2016

j

Tanggal Lulus:

2 3 St� LO.i6

PRAKATA Alhamdulillah, puji syukur penulis ucapakan ke hadirat Allah SWT yang selalu melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis bisa menyelesaikan tesis yang berjudul “Karakterisasi Biokimia dan Amoblisasi Glukosa Oksidase dari Aspergillus niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi”. Penelitian ini dilakukan semata-mata berdasarkan pada firman Allah, yang artinya: “Katakanlah: “Perhatikanlah apa yang ada di langit dan di bumi. Tidaklah bermanfaat tanda-tanda kekuasaan Allah dan Rasul-rasul yang memberi peringatan bagi orang-orang yang tidak beriman” (QS. 10:101). Kata ‘Perhatikanlah’ dapat ditafsirkan sebagai ‘Lakukanlah Penelitian’. Ini merupakan suatu kalimat perintah dari Allah untuk melakukan penelitian di berbagai disiplin ilmu pengetahuan, terhadap apa yang ada dan terjadi dari alam raya sampai pada dasar bumi. Jika hal ini tidak dilakukan, maka tanda-tanda kebesaran Allah Rabbul ‘Alamin dan RasulRasul-Nya yang memberi peringatan tidak akan bermanfaat bagi manusia, yaitu bagi orang-orang yang tidak mempergunakan akal dan pikirannya dan keyakinan akan kebesaran agama Islam. Atas selesainya penlitian dan penyusunan tesis ini, Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Laksmi Ambarsari, MS dan Dr Akhiruddin Maddu, MSi yang telah memberikan bimbingan, arahan, kritik, dan sarannya selama penelitian dan penulisan tesis ini. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada orang tua tercinta dan keluarga atas doa-doa yang telah terlantunkan. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada seluruh dosen dan staf Program Studi Biokimia, staf laboratorium cendawan departemen Proteksi Tanaman, staf Bengkel Biofisika, dan staf Laboratorium Bersama departemen Kimia yang telah membantu dalam hal berdiskusi dan pengarahan selama penelitian serta teman-teman yang turut memberikan bantuan, dukungan, motivasi, dan semangat selama penelitian dan penulisan tesis. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan laporan penelitian ini, maka diharapkan kritik dan saran yang membangun untuk perbaikan dalam penulisan selanjutnya. Akhir kata penulis berharap tulisan ini dapat bermanfaat dan menjadi sumbangan pemikiran bagi pihak yang membutuhkan.

Bogor, September 2016 Titi Rohmayanti

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL

xii

DAFTAR GAMBAR

xii

DAFTAR LAMPIRAN

xii

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Hipotesis Penelitian

1 1 2 2 2 3

2 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Alat dan Bahan Prosedur Penelitian

3 3 4 4

4 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Pembahasan

8 8 14

5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran

25 25 24

DAFTAR PUSTAKA

25

LAMPIRAN

29

RIWAYAT HIDUP

38

DAFTAR TABEL 1 2 3 4 5 6

Jumlah Protein dan Aktivitas GOD Parameter Kinetika GOD Arus Oksidasi Puncak EPK Variasi Diameter Tembaga Arus Oksidasi Puncak EPK dan EPKT Arus Oksidasi Puncak Anoda GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT Parameter Kinetika GODamo-IPB|EPKT

8 9 10 11 12 14

DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6

Penentuan Kecepatan Awal Reaksi 8 Kurva Lineweaver-Burk 9 Voltamogram Siklik Kinerja EPK Variasi Diameter Tembaga 10 Voltamogram Siklik Kinerja EPK dan EPKT 11 Voltamogram Siklik Kinerja GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT 12 Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Arus GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT 13 7 Kurva Lineweaver-Burk GODamo-IPB|EPKT 14 8 Stabilitas GODamo-IPB|EPKT 14 Kompleks Polianilin-Glutaraldehid-GOD secara 9 Pembentukan Kovalen 21

DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bagan Alir Penelitian 29 Kurva Standar Glukosa dan Contoh Perhitungan kadar protein 30 Contoh perhitungan aktivitas GOD pengendapan amonium sulat 80% 31 Kinetika GOD raksi am sulat 32 Voltamogram siklik pengulangan EPK dan EPKT 33 Voltamogram siklik pengulangan GODIPB|EPKT 34 Kinetika GODamo-IPB|EPKT 35 Miselium A.niger, GOD ekstrak kasar, dan GOD 35 Elektroda pasta karbon 35 Alat potensiometer dan pengukuran elektroda 37

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Mikroorganisme yang ada di alam Indonesia masih perlu dioptimalisasi agar dapat dijadikan objek penelitian yang sangat potensial. Produksi berbagai macam enzim menggunakan mikroorganisme merupakan salah satu hal yang dapat dikembangkan. Penggunaan enzim saat ini sangat luas diberbagai bidang, seperti bidang pangan, kesehatan, pertanian, maupun energi. Ironisnya, sampai saat ini Indonesia belum dapat memproduksi sendiri dan sepenuhnya masih bergantung pada produk impor (Saryono 2008). Salah satu enzim yang banyak digunakan dan dijual secara komersil adalah glukosa oksidase (GOD). GOD merupakan enzim yang mengatalisis oksidasi dari β-D-glukosa menjadi D-glukono-δ-lakton dan hidrogen peroksida menggunakan molekul oksigen sebagai penerima elektron. D-glukono-δ-lakton lalu terhidrolisis secara non-enzimatis menjadi asam glukonat dan FADH2-enzim yang tereduksi dioksidasi kembali oleh molekul oksigen (Sabir et al. 2007). Enzim ini banyak digunakan dalam industri untuk produksi asam glukonat dan sumber hidrogen peroksida dalam pengawetan makanan (Ahmad et al. 2007). Selain itu, enzim ini juga digunakan dalam biomedis untuk penentuan kadar glukosa darah. Penetapan kadar glukosa darah menggunakan GOD baik secara kolorimetri maupun amperometri lebih unggul dibandingkan dengan metode non-enzimatik lainnya karena GOD memiliki spesifitas substrat yang tinggi terhadap β-D-glukosa (Ahmad et al. 2007). GOD juga memiliki bilangan putaran dan kestabilan yang tinggi (Sherbenny et al. 2005). Penggunaan GOD saat ini dikembangkan juga dalam aplikasi enzymatic fuel cell (EFC) (Sabir et al. 2007). EFC merupakan salah satu jenis dari sel biofuel yang menggunakan enzim sebagai biokatalis yang dapat mengubah energi biokimia menjadi energi listrik secara langsung. Nithiyaa et al. (2012) menemukan bahwa Aspergillus niger merupakan sumber GOD yang paling baik karena enzim yang dihasilkan bersifat sangat stabil. Penelitian Putri (2011) melaporkan bahwa isolat lokal A. niger IPBCC.08.610 berpotensi menghasilkan GOD. Berdasarkan Triana (2012) GOD yang dihasilkan dari A. niger IPBCC.08.610 memiliki aktivitas total sebesar 92.87 U yang terendapkan dengan baik pada (NH4)2SO4 80% jenuh dan konsentrasi substrat untuk mencapai kecepatan maksimum (Km) sebesar 46 mM dengan laju maksimum (vmaks) 11 U/mg. Selain itu, pada penelitian Selena (2014) aktivitas total GOD yang diproduksi dari isolat lokal A. niger setelah dilakukan pemurnian dengan kromatografi kolom filtrasi gel sebesar 126.41 U dengan nilai Km sebesar 39 mM. GOD yang diproduksi langsung dari isolat lokal A.niger IPBCC.08.610 koleksi Departemen Biologi IPB yang diisolasi dari serasah tanaman pagar Dryobalanops di daerah Tarakan, Kalimantan Utara ini belum dikarakterisasi dan diaplikasikan lebih lanjut pada elektroda. Aplikasi dari GOD ke permukaan elektroda untuk sensor dan sel biofuel membutuhkan sistem amobilisasi. Proses amobilisasi enzim yang tepat dianggap dapat meningkatkan kinerja elektroda karena enzim dapat digunakan secara berulang tetapi tetap stabil dan pemisahan antara produk dengan enzim dalam larutan terjadi lebih mudah. Untuk mencapai efisiensi dalam mentransfer elektron,

2 penggunaan GOD sering dikombinasikan dengan senyawa mediator pada elektroda. Pasta karbon yang dimodifikasi oleh nanofiber-polianilin digunakan dalam penelitian ini sebagai mediator. Karbon dianggap memiliki biokompatibilitas, stabilitas, dan konduktifitas (tidak korosif) yang baik sehingga tidak mempengaruhi kinerja biologis (Surianty 2014). Polianilin merupakan bahan umum yang digunakan dalam pembuatan elektroda pada biosensor, biofuel sel, dan aplikasi super kapasitor dalam bentuk nano komposit. Berdasarkan Maddu et al. (2008), nanofiber-polianilin disintesis dalam bentuk garam emeraldin dengan metode interfasial polimerisasi. Penambahan polianilin ke dalam pasta karbon bertujuan untuk menangkal ruang kosong antara partikel grafit sehingga dapat meningkatkan konduktifitas listrik pada elektroda karena elektron akan ditransfer secara terus menerus. Amobilisasi GOD ke nanofiber-polianilin pada permukaan elektroda pasta karbon dapat digunakan sebagai bioanoda dalam aplikasi biofuel sel. GOD akan bergerak ke permukaan elektroda menggunakan glutaraldehid sebagai penghubung (Ambarsari et al. 2016). Perumusan Masalah Saat ini kebutuhan GOD semakin meningkat sehubungan dengan pemanfaatannya sebagai biosensor glukosa dan bioanoda dalam biofuel sel. Ironisnya Indonesia masih mengimpor enzim tersebut. Padahal iklim tropis dengan tingkat kelembaban tinggi sangat mendukung pertumbuhan A. niger yang merupakan sumber yang paling baik dalam menghasilkan GOD. Selain itu, karakteristik biokimia GOD dari A. niger IPBCC.08.610 dan amobilisasinya pada elektroda pasta karbon termodifikasi belum diketahui dan dianalisis untuk dapat diaplikasikan lebih lanjut. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian adalah untuk mendapatkan karakteristik biokimia GOD hasil pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh yang dibandingkan dengan GOD hasil amobilisasi menggunakan glutaraldehida pada elektroda pasta karbon termodifikasi nanoserat polianilin. Manfaat Penelitian Melalui penelitian ini, diharapkan dapat memberikan informasi mengenai karakteristik biokimia glukosa oksidase dari A. niger IPBCC.08.610 dan amobilisasinya pada elektroda pasta karbon termodifikasi sehingga dapat dijadikan panduan dalam aplikasi GOD pada biosensor glukosa. Hipotesis Hipotesis penelitian adalah terdapat GOD hasil amobilisasi pada EPKT yang memiliki karakteristik biokimia yang lebih baik, efisien, dan ekonomis dibandingkan GOD hasil pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh sehingga dapat diaplikasikan sebagai biosensor glukosa.

3

2 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini berlangsung selama 9 bulan (September 2015 - Juni 2016). Adapun tempat penelitian dilaksanakan di Laboratorium Penelitian Biokimia FMIPA, Laboratorium Cendawan Departemen Proteksi Tanaman FAPERTA, Laboratorium bersama Departemen Kimia FMIPA, dan Bengkel Departemen Fisika FMIPA. Alat dan Bahan Alat Pengukuran voltamogram siklik menggunakan potensiostat eDAQ EA163 yang dilengkapi program EChem v2.1.0, elektroda Ag|AgCl, dan elektroda Pt|Ti. Peralatan lainnya antara lain alat-alat gelas, laminar air flow, neraca analatik, tabung sentrifus, sentrifus (Beckman USA Mode J2-21), pipa kapiler, kawat tembaga, pipet mikro, pipet volumetrik, mortar, pH meter (HANNA pH 21 pH/Mv meter), penangas dan stirrer, autoklaf TOMY High Pressure Steam Sterilizer ES315, microplate COSTAR 96 , serta SPEKTROstar® Nano BMG LABTECH. Bahan Biakan isolat Aspergillus niger (IPBCC 08.610) koleksi Departemen Biologi IPB yang diisolasi dari tanaman pagar di daerah Tarakan, Kalimantan Utara, nanofiber-polianilin, glutaraldehida 2.5%, karbon grafit, orto-dianisidin dan hidrogen peroksida (H2O2). Bahan-bahan lainnya terdiri atas media Potato Dextrose Agar (PDA), sukrosa, pepton, (NH4)2HPO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, CaCO3, (NH4)2SO4 (ammonium sulfat), glukosa, pasir kuarsa, akuades steril, bufer (natrium fosfat 0.1 M pH 6.0; fosfat sitrat 0.1 M pH 5.6; kalium fosfat 0.1 M pH 7.0, asetat 0.1 M pH 4.5), reagen Bradford, standar Bovine Serum Albumin (BSA), akuabides, parafin, serbuk grafit, KCl 0.1 M, dan kalium ferisianida (Fe(CN)6), pipa kapiler dan tembaga elektroda berdiameter 1 mm dan 3 mm. Prosedur Penelitian Produksi GOD (Modifikasi Singh dan Verma 2010) Produksi GOD diawali dengan penyiapan media penyegaran, starter dan produksi untuk A. niger. Bahan untuk media penyegaran adalah 1 gram PDA dilarutkan dalam 25 mL akuades. Komposisi media starter, yaitu 0.4 g/L (NH4)2HPO4; 0.2 g/L KH2PO4; 0.2 g/L MgSO4.7H2O; 10 g/L pepton; dan 70 g/L sukrosa. Bahan-bahan untuk membuat media starter dilarutkan dalam 200 mL akuades. Perbandingan larutan media dan labu Erlenmeyer yaitu 1:5. Media starter dibagi dalam sepuluh Erlenmeyer 100 mL masing-masing diisi dengan 20 mL media starter. Media produksi mengandung 0.4 g/L (NH4)2HPO4; 0.2 g/L KH2PO4; 0.2 g/L MgSO4.7H2O; 40 g/L CaCO3; 3.3 % sukrosa; dan 0.35 % glukosa. Media diatur pada pH 5.5 dengan penambahan larutan H3PO4 1 M. Sebanyak sepuluh labu

4 Erlenmeyer 1 L disiapkan dan masing-masing diisi dengan 180 mL media produksi. Setiap media disterilisasi dalam autoklaf 1210C selama 15 menit. Sebanyak satu ose spora A. niger dipindahkan ke dalam agar-agar miring PDA dengan metode cawan gores. Kemudian, agar-agar miring diinkubasi dalam suhu ruang selama 3 hari. Spora dari stok media agar-agar miring isolat A. niger sebanyak satu ose ditumbuhkan dalam media starter lalu diinkubasi pada suhu 300C dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam. Selanjutnya subkultur tersebut dimasukkan sebanyak 10% dari volume media produksi. Kemudian diinkubasi pada suhu 300C kecepatan 120 rpm selama 40 jam. Setelah inkubasi, biakan berupa miselium dipisahkan dari media pertumbuhan dengan cara disaring menggunakan kain kasa. Hasil saringan berupa supernatan merupakan GOD ekstrak kasar ekstraseluler. Berat miselium yang dihasilkan ditimbang dan digunakan untuk tahap isolasi. Isolasi GOD dari A. niger (Modifikasi Firman dan Aryantha 2003) Enzim dalam sel diisolasi dengan cara penggerusan menggunakan mortar steril dalam suhu 40C. Miselium hasil penyaringan digerus sampai halus menggunakan pasir kuarsa dengan perbandingan 1:1. Sel yang telah lisis ditambahkan dengan bufer natrium fosfat 0.1 M pH 6.0, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 g suhu 40C selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar GOD intraseluler. Ekstrak kasar diukur kadar protein dan aktivitasnya lalu dilakukan tahap pemurnian dengan amonium sulfat. Pemurnian GOD (Modifikasi Sherbeny et al. 2005) Pemurnian GOD dilakukan melalui pengendapan dengan (NH4)2SO4 80% jenuh. Larutan dihomogenisasi kemudian didiamkan selama semalam pada suhu 4oC, kemudian disentrifus pada kecepatan 12000 g dengan suhu 4oC selama 20 menit. Fraksi yang terendapkan dilarutkan dalam 1 mL bufer fosfat sitrat 0.1 M pH 5.6. Setiap fraksi yang diperoleh diukur kadar protein dan aktivitasnya. Uji Aktivitas Glukosa Oksidase (Modifikasi Bergmeyer 1988) Pereaksi pada pengujian aktivitas enzim terdiri atas 33.3 µL larutan glukosa 10% (b/v) yang didiamkan selama 1 jam setelah pembuatan agar terjadi mutarotasi, 160 µL o-dianisidin (6.6 mg o-dianisidin dalam 100 mL bufer kalium fosfat 0.1 M pH 7), dan 20 µL hidrogen peroksidase 1 mg/mL dicampurkan dalam microplate. Larutan diaduk selama 10 detik kemudian dibiarkan setimbang pada suhu ruang. Nilai absorbannya diukur pada panjang gelombang 436 nm sebagai A0 hingga stabil. Setelah itu, ditambahkan 20 µL GOD pada campuran dan diukur peningkatan nilai absorbannya setiap 30 detik selama 5 menit pertama pada panjang gelombang 436 nm sebagai At. Laju awal ditentukan saat laju linear maksimum tercapai. Waktu tercapainya laju awal digunakan sebagai waktu pengukuran untuk fraksi enzim lainnya. Aktivitas enzim ditentukan melalui persamaan berikut. Aktivitas enzim (U/mL) =

(At-Ao) x Vtotal (μL) x Faktor Pengenceran ε maks x d x Venzim (μL) x t

5 Unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menggunakan satu mikromol substrat per menit pada kondisi optimum. Keterangan: At = absorbansi pada menit ke-t A0 = absorbansi pada menit ke-0 ε = koefisien ekstingsi o-dianisidin (8.3 mM-1 cm-1) d = tebal larutan t = waktu inkubasi (menit) Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976) Sebanyak 100 μL sampel ditambahkan 100 μL reagen Bradford, diaduk, lalu diinkubasi selama 10 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 595 nm. Kurva standar dibuat dari larutan Bovine Serum Albumin (BSA). Konsentrasi BSA yang digunakan adalah 0.0025-0.2 mg/mL. Persamaan garis kurva standar digunakan untuk menentukan kadar protein sampel. Penentuan Kinetika GOD (Modifikasi Odenbunmi dan Owalude 2007) Penentuan kinetika enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim pada variasi konsentrasi substrat. Substrat yang digunakan adalah glukosa dengan konsentrasi 8-100 mM. Hasil yang diperoleh dimasukkan ke dalam kurva Michaelis-Menten dengan sumbu x sebagai konsentrasi substrat (S) dan sumbu y sebagai aktivitas enzim (V). Melalui kurva Michaelis-Menten, dipilih variasi konsentrasi substrat dengan aktivitas yang meningkat secara signifikan untuk membuat kurva Lineweaver-Burk. Kurva Lineweaver-Burk dibuat dari setengah kecepatan maksimum dengan menghubungkan satu per konsentrasi substrat (1/S) sebagai sumbu x dan satu per aktivitas enzim (1/V) sebagai sumbu y. Persamaan yang diperoleh dari kurva tersebut digunakan untuk menentukan Km dan vmaks. Pengukuran Voltamogram Siklik Elektroda Pasta Karbon (EPK) dan Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi (EPKT) (Colak et al. 2012) Preparasi EPK dan EPKT. EPK disiapkan dengan mencampurkan 100 µL parafin dan 0.15 gram serbuk grafit di dalam mortar hingga menjadi pasta. Selanjutnya, pasta karbon tersebut dimasukkan ke dalam tabung elektroda yang disiapkan dari kaca kapiler dengan variasi ukuran diameter tembaga 1 mm dan 3 mm (Tang et al. 2014). Kemudian nilai arus terbaik EPK dari ukuran diameter tembaga dimodifikasi dengan penambahan nanofiber polianilin (EPKT) sebanyak 2 mg polianilin yang dicampur ke dalam mortar dengan 100 µL parafin dan 0.15 g serbuk grafit. Selanjutnya, masing-masing pasta karbon tersebut dimasukkan ke dalam tabung elektroda dengan ukuran dimeter terbaik dan panjang karbon pasta masing-masing 10 mm (Saglam et al. 2015). Pengukuran Voltamogram Siklik Kinerja EPK dan EPKT. EPK dan EPKT (elektroda kerja secara bergantian) bersama elektroda Ag|AgCl (elektroda pembanding) dan elektroda platina (elektroda pelengkap) dimasukkan ke dalam gelas kaca 10 mL yang berisi 3 mL larutan kalium klorida (KCl) 3 M. Ketiga

6 elektroda kemudian disambungkan dengan tiga kabel berbeda yang telah terhubung dengan potensiostat. Setelah itu, voltamogram siklik yang terbentuk diamati dan dianalisis nilai arus serta potensial maksimumnya menggunakan menu “Data pad”. Amobilisasi Glukosa Oksidase pada EPKT (Modifikasi Colak et al. 2012) Sebanyak 50 µL GOD hasil pengendapan amonium sulfat 80% ditambahkan dengan 1 mg BSA, 50 µL bufer asetat 0.1 M pH 4.5, dan 30 µL glutaraldehid 2.5%. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro dan dikocok perlahan. Kemudian diteteskan di atas permukaan EPKT sebanyak 5 µL. Elektroda yang menggunakan GOD teramobil dari isolat lokal disimbolkan dengan GODamoo IPB|EPKT. Selanjutnya, GODamo-IPB|EPKT tersebut dikeringkan pada suhu 4 C. Setelah kering, lalu dicuci beberapa kali dengan bufer asetat pH 4.5 untuk menghilangkan enzim yang tidak teramobil. Elektroda disimpan dalam lemari pendingin refrigerator pada suhu 4oC. Pengukuran Voltamogram Siklik Kinerja EPKT dengan GOD Teramobil dan GOD Tidak Teramobil (Modifikasi Colak et al. 2012) Elektroda kerja yang akan diukur terdiri atas dua jenis yaitu GODamodan GODIPB|EPKT (GOD dari isolat lokal IPB yang tidak diamobilisasi) untuk melihat perbedaan nilai arus yang dihasilkan dari GOD yang teramobil dan GOD yang tidak teramobil. Kedua elektroda kerja tersebut secara bergantian dimasukkan ke dalam gelas kaca 10 mL yang berisi 3 mL larutan uji (1 mL larutan bufer asetat 0.1 M pH 4.5 yang ditambah 1 mL kalium ferisianida 0.1 M dan 180 µL larutan glukosa 1 mM) bersama elektroda Ag|AgCl (elektroda pembanding) dan elektroda platina (elektroda pelengkap). Ketiga elektroda (kerja, pembanding, dan pelengkap) kemudian disambungkan dengan tiga kabel berbeda yang telah terhubung dengan potensiostat. Setelah itu, voltamogram siklik yang terbentuk diamati dan dianalisis nilai arus serta potensial maksimumnya menggunakan menu “Data pad”. IPB|EPKT

Kinetika Glukosa Oksidase Teramobil pada EPKT (modifikasi Ambarsari 2016) Voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT diukur dalam 1 mL larutan bufer asetat 0.1 M pH 4.5 yang ditambah 1 mL kalium ferisianida 0.1 M dan 180 µL larutan standar glukosa dengan konsentrasi 0.2-8 mM. Penentuan parameter kinetika elektroda GODamo-IPB|EPKT ditentukan dengan terlebih dahulu dibuat kurva linieritas dari kurva Michaelis-Menten, lalu daerah linieritas yang diperoleh kemudian dibuat plot Lineweaver-Burk, kemudian ditentukan nilai Km dan Imaks. GODamo-IPB|EPKT dengan nilai arus terbaik pada kondisi kinetika diukur stabilitasnya selama tiga bulan.

7

3 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil GOD Intraseluler, Ekstraseluler, dan Laju Reaksi Awal GOD yang dihasilkan oleh isolat lokal A.niger IPBCC.08.610 merupakan enzim intraseluler. Hal ini dibuktikan dari hasil uji aktivitas enzim intraseluler melalui proses lisis miseliumnya lebih tinggi dibandingkan aktivitas enzim ekstraseluler. Aktivitas ekstrak kasar GOD intraseluler sebesar 1.31 U/mL sedangkan aktivitas ekstrak kasar GOD ektraseluler hanya 0.17 U/mL. Biomassa yang dihasilkan oleh A.niger berupa sel bulat berukuran cukup besar dan berwarna putih (Lampiran 8). Biomassa berupa miselium ini kemudian dilisis menggunakan pasir kuarsa untuk mengeluarkan enzim yang terdapat di dalam sel. Pengukuran aktivitas GOD dilakukan dengan menentukan kecepatan reaksi awal (Vo) terlebih dahulu. Kecepatan awal reaksi ditentukan berdasarkan laju linear maksimum pada kurva yang menghubungkan antara waktu dan absorbansi pengujian enzim (Gambar 1). Kecepatan awal reaksi GOD diperoleh sebesar 0.95/menit dengan nilai absorbansi setimbang yaitu 0.95. Setelah laju awal reaksi enzim diketahui, aktivitas sampel diukur dengan waktu pengukuran 1 menit. 2

Absorban λ436

1.5

1

0.5

0 0

60

120

180

240

Waktu (detik)

300

360

Gambar 1 Penentuan kecepatan awal reaksi (V0) Fraksi GOD Ekstrak Kasar dan Pengendapan (NH4)2SO4 80% Jenuh Produksi GOD dilakukan pada 3 liter media dengan waktu fermentasi selama 40 jam. Ekstrak kasar GOD yang diperoleh lalu digunakan untuk tahap pemurnian dengan (NH4)2SO4 80% jenuh. Tabel 1 menunjukkan jumlah protein dan aktivitas yang dimiliki GOD ekstrak kasar dan fraksi pengendapan amonuium sulfat. Dari 3 liter volume media, dihasilkan 200 mL ekstrak kasar GOD dan dari volume ekstrak kasar tersebut dihasilkan 15 mL GOD fraksi pengendapan dengan amonium sulfat 80%. Protein yang dihasilkan pada GOD ekstrak kasar sebesar 193.92 mg dan menurun hingga 6.99 mg saat diendapkan oleh (NH4)2SO4 80% jenuh. Kurva standar glukosa untuk menghitung protein ditunjukkan pada Lampiran 2. Ekstrak

8 kasar GOD dari isolat lokal A. niger (IPBCC.08.610) diketahui memiliki aktivitas spesifik sebesar 1.349 U/mg dengan yield sebesar 100%. GOD ekstrak kasar diendapkan dengan fraksi amonium sulfat yang memiliki tingkat kejenuhan 60%80%. Fraksi pemurnian dengan (NH4)2SO4 80% jenuh memiliki aktivitas spesifik yang lebih tinggi yaitu sebesar 27.77 U/mg dan yield 72.86% dengan tingkat kemurnian hingga 20.22 kali dari ekstrak kasarnya. Perhitungan aktivitas GOD dapat dilihat pada Lampiran 3. Tabel 1 Jumlah protein dan aktivitas GOD intraseluler dari A.niger IPBCC.08.610 Fraksi Aktivitas [Protein] Volume Aktivitas Protein Aktivitas (U/mL) (mg/mL) (mL) Total (U) Total (mg) spesifik (U/mg) 1 1.31 0.97 200 261.68 193.92 1.34 2 12.71 0.46 15 190.66 6.99 27.77 Fraksi 1 : Ekstrak kasar GOD intraseluler Fraksi 2 : GOD pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh

Yield Kemurnian (%) (kali) 100 72,86

1.00 20.22

Kinetika Glukosa Oksidase Kinetika aktivitas enzim yang melebihi nilai konsentrasi substrat akan membentuk kurva hiperbola rektangular atau kurva dari Michaelis-Menten (Gambar 2). Pada kurva ini terjadi peningkatan aktivitas enzim seiring dengan peningkatan konsentrasi glukosa yang digunakan. Konsentrasi glukosa yang digunakan yaitu 8-100 mM. Aktivitas enzim pada konsentrasi glukosa yang rendah meningkat secara linier terhadap konsentrasi. Akan tetapi, pada konsentrasi glukosa melebihi 0.06 M, laju peningkatan aktivitas enzim mengalami penurunan terhadap konsentrasi. Kurva tersebut kemudian di plot ke dalam kurva Lineweaver-Burk yang merupakan metode umum untuk menghitung nilai Km. Persamaan Lineweaver-Burk digunakan untuk menentukan kinetika GOD dari A.niger (IPBCC.08.610).

Gambar 2 Kurva Michaelis-Menten pengaruh konsentrasi substrat glukosa dan aktivitas GOD

9 Persamaan linier Lineweaver-Burk (Gambar 3) digunakan untuk menentukan nilai Km dan Vmaks. Dari kurva tersebut diperoleh persamaan garis y= 0.0027x+0.0482 dengan regresi linier sebesar 99.23%. Persamaan tersebut menunjukkan hubungan antara 1/konsentrasi glukosa terhadap 1/aktivitas enzim. Berdasarkan tabel 2 nilai vmaks dan Km GOD isolat A. niger (IPBCC.08.610) hasil pengendapan amonium sulfat 80% yang diperoleh sebesar 20.747 U/mg dan 56 mM. Konsentrasi glukosa sebesar 56 mM merupakan jumlah glukosa yang dibutuhkan untuk mencapai setengah kecepatan maksimum GOD. Parameter lain yang digunakan untuk mempelajari kinetika dari suatu enzim adalah kcat atau bilangan putaran. Nilai kcat GOD dari fraksi amonium sulfat 80% diperkirakan sekitar 53 s-1. Efisiensi fraksi enzim yang dihasilkan yaitu 0.95 s-1 mM-1. Perhitungan kinetika kimia GOD hasil pengendapan amonium sulfat ditunjukkan pada Lampiran 4.

Gambar 3 Kurva Lineweaver-Burk linieritas antara konsentrasi substrat glukosa dan aktivitas GOD Tabel 2 Parameter kinetika GOD Fraksi GOD Am. Sulfat 80%

Vmax (U mg-1) 20.747

Km (mM) 56

Kcat (s-1) 53

Efisiensi (s-1 mM-1) 0.95

Voltamogram Siklik EPK dan EPKT Pengukuran voltamogram siklik diperlukan untuk mengetahui kinerja elektroda dalam mendeteksi pergerakan elektron dari suatu reaksi oksidasi-reduksi yang terjadi dalam teknik sensor. Hasil ini memvisualisasikan besar arus yang dihasilkan oleh sel elektrokimia sebagai fungsi potensial. Sel elektrokimia yang dimaksud terdiri atas elektroda kerja (EPK dan EPKT), elektroda pelengkap (Pt|Ti), dan elektroda pembanding (Ag|AgCl) dalam larutan elektrolit yang diberi potensial. Pada setiap siklus dalam voltamogram siklik, puncak arus oksidasi muncul saat pemayaran depan yang dimulai dari titik -2 V menuju titik 2 V kemudian berbelok kembali menuju titik -2 V dengan laju pemayaran sebesar 100 mV/s. Larutan elektrolit yang digunakan yaitu larutan KCl 3 M. Gambar 4 menunjukkan

10 voltamogram siklik EPK dengan variasi ukuran diameter tembaga sebesar 1 mm dan 3 mm. EPK dengan diameter tembaga 3 mm memiliki nilai arus yang lebih besar dibandingkan 1 mm yaitu 0.362 mA dan tegangan potensial sebesar 0.695 V (Tabel 3). EPK berdiameter tembaga 3 mm selanjutnya dimodifikasi dengan penambahan nanofiber polianilin (EPKT). Masing-masing elektroda dilakukan sebanyak tiga kali ulangan (Lampiran 5). Tabel 3 Arus oksidasi puncak anoda EPK ukuran diameter 1 mm, panjang 10 mm dan EPK ukuran diameter 3 mm, panjang 10 mm Ukuran Elektroda (mm) EPK1mm EPK3mm

Potensial maksimum (V) 0.435 0.695

Arus maksimum (A) 0.228 x 10-3 0.362 x 10-3

Gambar 4 Voltamogram siklik kinerja EPK dengan variasi ukuran diameter tembaga pada laju pemayaran 100 mVs-1, potensial 2 V, Initial E -1000 mV, final E -1000 mV, upper E 2000 mV, dan lower E -2000 mV. E = tegangan, I = arus, EPK1mm, ------- EPK3mm Voltamogram siklik yang terbentuk dari EPK dan EPKT menunjukkan kinerja dari kedua elektroda tersebut terhadap larutan KCl 3 M. Gambar 5 menunjukan voltamogram siklik EPK dan EPKT yang memiliki peningkatan arus dan rentang potensial yang lebih besar pada voltamogram siklik EPKT. Peningkatan arus dan potensial yang lebih besar diikuti dengan perbedaan luas daerah voltamogram siklik. Luas daerah voltamogram siklik mengindikasikan kualitas konduktansi (daya hantar listrik) atau kerapatan arus yang tinggi. Hal ini

11 dikarenakan pada EPKT terdapat penambahan modifikasi polianilin yang berbentuk nanofiber. Nanofiber polianilin yang digunakan pada penelitian ini adalah hasil sintesis dari penelitian Ambarsari et al. (2016) dan tidak dilakukan karakterisasi ulang. Ambarsari et al. (2016) menyebutkan ukuran nanofiber polianilin ini sekitaar 110-120 nm, berbentuk butiran kasar, dan berwarna hijau tua kecokelatan. Morfologi polianilin yang disintesis secara polimerisasi interfasial tersebut diamati menggunakan mikroskop elektron (SEM). Selain luas daerah voltamogram siklik, nilai arus oksidasi maksimum yang dihasilkan juga menjadi parameter lain untuk menunjukkan kualitas elektroda dalam menghantarkan elektron. Pemilihannya didasarkan reaksi dominan yang terjadi pada reaksi katalitik oleh GOD, yakni reaksi oksidasi. Peningkatan nilai arus oksidasi pada EPKT dibandingkan EPK diikuti dengan peningkatan potensial. Pada pengujian voltametri siklik dengan EPK, larutan KCl 3 M teroksidasi sempurna pada potensial 0.69 V dan menghasilkan arus 0.36 mA. Sementara itu, larutan KCl 3 M dengan menggunakan EPKT sebagai elektroda kerja, baru teroksidasi sempurna pada potensial 0.99 V dan menghasilkan arus 1.10 mA (Tabel 4).

Gambar 5 Voltamogram siklik kinerja EPK dan EPKT pada laju pemayaran 100 mVs-1, potensial 2 V, Initial E -1000 mV, final E -1000 mV, upper E 2000 mV, dan lower E -2000 mV. E = tegangan, I = arus, EPK, ------- EPKT Tabel 4 Arus oksidasi puncak anoda EPK dan EPKT Sampel EPK EPKT

Potensial maksimum (V) 0.69 0.99

Arus maksimum (A) 0.36 x 10-3 1.10 x 10-3

12 GOD Teramobilisasi pada Elektroda EPKT kemudian digunakan sebagai media amobilisasi enzim. Teknik amobilisasi enzim dalam matriks polimer (polianilin) dengan polimerisasi pada elektrokimia hanya melibatkan penerapan potensial yang sesuai pada elektroda dalam pelarut yang cocok terhadap monomer dan enzim. Polimer konduktif memiliki kemampuan untuk mentransfer elektron yang dihasilkan oleh reaksi redoks dari analat sehingga dapat terbaca pada potensiostat. Gambar 6 menunjukkan voltamogram siklik dari dua elektroda kerja yakni EPKT dengan GOD teramobil menggunakan glutaraldehida 2.5% (GODamo-IPB|EPKT) dan tanpa glutaraldehida (GODIPB|EPKT) dengan scan rate 100 mV/s. Masing-masing elektroda dilakukan tiga kali ulangan (Lampiran 6). Perbandingan voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT dengan GODIPB|EPKT memiliki nilai puncak arus oksidasi dan rentang potensial yang berbeda. Luas voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT lebih besar dibandingkan GODIPB|EPKT. Hal ini menunjukkan EPKT dengan penambahan GOD teramobil menggunakan glutaraldehida bersifat lebih konduktif. Puncak arus okidasi GODamo-IPB|EPKT yang ditunjukkan pada tabel 5 berada pada 3.92 mA dengan potensial maksimum sebesar 1.5 V sementara GODIPB|EPKT pada 1.93 mA dengan potensial maksimum sebesar 1.7 V. GODamo-IPB|EPKT dipilih sebagai elektroda dengan respon terbaik berdasarkan nilai puncak arus oksidasi dan rentang potensial yang lebih besar pada voltamogram sikliknya. Larutan elektrolit yang digunakan yaitu Kalium Ferisianida (K3Fe(CN)6).

Gambar 6 Voltamogram siklik kinerja GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT pada laju pemayaran 100 mVs-1, potensial 2 V, Initial E -1000 mV, final E 1000 mV, upper E 2000 mV, dan lower E -2000 mV. E = tegangan, I = arus, GODIPB|EPKT, GODamo-IPB|EPKT

13 Tabel 5 Arus oksidasi puncak anoda GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT Sampel Potensial maksimum (V) Arus maksimum (A) GODIPB|EPKT 1.7 1.93 x 10-3 GODamo-IPB|EPKT 1.5 3.92 x 10-3

Parameter Kinetika Enzim teramobil pada EPKT Penentuan parameter kinetika GOD diperlukan untuk mengetahui karakteristik dari aktivitas GOD tersebut sebagai elektroda enzim, yang dapat digunakan sebagai informasi dasar untuk pengembangan selanjutnya. Parameter kinetika GOD yaitu nilai Km dan Imaks ditentukan berdasarkan hasil dari uji kinerja GODamo-IPB|EPKT terhadap konsentrasi substrat glukosa yang divariasikan pada rentang konsentrasi 0.2 – 8.0 mM secara siklik voltametri. Voltamogram siklik yang dihasilkan dari kinerja GODamo-IPB|EPKT terhadap variasi konsentrasi glukosa yang diuji dapat dilihat pada Gambar 7. Voltamogram siklik tersebut menunjukkan terbentuknya puncak oksidasi dari elektroda tersebut. Parameter kinetika, terlebih dahulu ditentukan dengan kurva MichaelisMenten dan kurva linieritas hubungan antara konsentrasi glukosa dan nilai arus oksidasi elektroda GODamo-IPB|EPKT. Kurva Michaelis-Menten diperoleh dengan menghubungkan nilai arus yang dihasilkan pada puncak oksidasi dalam voltamogram siklik elektroda GODamo-IPB|EPKT terhadap konsentrasi substrat glukosa yang diuji. Berdasarkan kurva Michaelis-Menten yang dapat dilihat pada Gambar 6, ketika konsentrasi glukosa di bawah 2 mM, kinerja elektroda GODamoIPB|EPKT terhadap substrat terus mengalami peningkatan seiring dengan peningkatan konsentrasi glukosa namun, ketika konsentrasi glukosa mencapai 2 mM aktivitas GOD mulai mencapai maksimum, sehingga peningkatan konsentrasi glukosa yang lebih tinggi dari 2 mM tidak memberi pengaruh yang signifikan terhadap nilai arus oksidasi yang dihasilkan oleh elektroda GODamo-IPB|EPKT. Konsentrasi glukosa pada konsentrasi terendah yakni 0.2 mM menghasilkan nilai arus sebesar 0.413 mA dan konsentrasi 2 mM menghasilkan nilai arus sebesar 3.869 mA. Kurva linieritas antara konsentrasi substrat glukosa terhadap nilai arus elektroda GODamo-IPB|EPKT ditentukan berdasarkan kurva Michaelis-Menten (Gambar 8). Daerah linier dari kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT yakni setengah dari kecepatan maksimum berada pada rentang konsentrasi 0.2 – 1.6 mM, dengan nilai regresi 98.6% (Gambar 8). Persamaan Lineweaver-Burk dalam penentuan nilai Km dan Imaks ditentukan berdasarkan kurva linieritas yang diperoleh pada Gambar 6. Berdasarkan persamaan tersebut, diketahui bahwa Km dan Imaks untuk aktivitas GOD dalam EPKT nanofiber polianilin masing-masing sebesar 2.88 mM dan 3.869 mA dengan bilangan putaran (Kcat) sebesar 13 s-1. Sensitivitas yang dimiliki sebesar 1.09 mA/mM (Tabel 5). Waktu respon untuk menghasilkan puncak arus maksimum sebesar 25 detik. Perhitungan kinetika kimia GODamo-IPB|EPKT ditunjukkan pada Lampiran 7.

14

Gambar 7 Pengaruh konsentrasi substrat glukosa terhadap nilai arus elektroda GODamo-IPB|EPKT

Gambar 8 Kurva Lineweaver-Burk dalam penentuan parameter kinetika Tabel 6 Parameter kinetika elektroda GODamo-IPB|EPKT Elektroda GODIPB-amobil/ EPKT3,10

Kcat (s-1) 13

Range [glukosa] (mM) 0.2-1.6

Sensitivitas (mA mM-1) 1.09

Km (mM) 2.88

Imaks (mA-1) 3.869

15 Kemudian konsentrasi substrat 2 mM diuji stabilitas elektrodanya. Hasil ini ditunjukkan pada Gambar 9. Elektroda setelah disimpan selama satu bulan lalu dilakukan pengukuran, nilai arus menurun menjadi 3.22 mA. Dua bulan berikutnya nilai arus juga menurun menjadi 1.1 mA, dan pada bulan ketiga nilai arus semakin menurun menjadi 0.2 mA.

Gambar 9 Stabilitas GODamo-IPB|EPKT selama tiga bulan

Pembahasan GOD Intraseluler, Ekstraseluler, dan Laju Awalnya GOD yang dihasilkan oleh A.niger dapat berupa enzim ekstraseluler maupun intraseluler (Simpson 2005). GOD yang dihasilkan oleh isolat lokal ini merupakan enzim intraseluler. Hal ini ditunjukkan pada GOD instraseluler memiliki aktivitas enzim yang lebih besar. Pemanenan biomassa dilakukan dengan penyaringan menggunakan kain kasa. Enzim diisolasi dengan cara lisis mekanik terhadap biomassa yang dihasilkan. Miselia A. niger digerus menggunakan mortar dengan bantuan pasir kuarsa untuk mempermudah proses lisis. Proses lisis ini merupakan ciri dari enzim tipe instraseluler. Selain itu, kapang memiliki dinding sel yang lebih tebal dibandingkan bakteri yang menyebabkan proses difusi GOD dari dalam sel ke luar sel lebih sulit sehingga GOD intraseluler lebih tinggi dibandingkan ekstraseluler (Indriani 2015). Ekstrak kasar yang diperoleh dari kultur lalu diukur aktivitas dan konsentrasi proteinnya. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa GOD pada isolat A. niger (IPBCC.08.610) lebih banyak diproduksi sebagai enzim intraseluler. Hal ini sesuai dengan pernyataan Sabir et al. (2007) bahwa GOD pada Aspergillus sp. merupakan enzim intraseluler, berbeda dengan GOD pada Penicillium sp. yang banyak ditemukan dalam bentuk enzim ektraseluler.

16 Sumber nutrisi bagi A. niger yaitu sumber C. Sukrosa salah satu sumber C, bertindak sebagai induser. Lampiran 8 menunjukkan bahwa sukrosa yang berada di luar sel memberikan sinyal kepada Aspergillus niger. Sukrosa terlebih dahulu dipecah menjadi senyawa yang lebih sederhana untuk dapat masuk kedalam membran sel, yaitu dengan bantuan GOD. Dalam membran sel, DNA memberikan sinyal kepada mRNA untuk mengkode terbentunya asam-asam amino penyusun GOD. Ribosom merupakan tempat penyusunan terbentuknya GOD. Setelah GOD terbentuk, GOD disekresikan keluar membran sel untuk membantu pemecahan sukrosa. Proses pembentukan GOD akan terus berjalan, apabila masih terdapat nutrisi terutama sumber karbon (Indriani et al. 2015). Produksi GOD dilakukan pada dua media yang berbeda. Media pertama merupakan media starter yang mengandung pepton, glukosa, (NH4)2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O. Media kedua merupakan media produksi yang terdiri atas sukrosa, glukosa, CaCO3, (NH4)2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O. Sumber karbon yang digunakan dalam media produksi berupa sukrosa dan glukosa. Sukrosa yang digunakan untuk media lebih banyak dibandingkan glukosa. Hal ini dikarenakan menurut Bankar et al. (2009) sukrosa merupakan substrat yang dapat merangsang produksi GOD dengan lebih optimal. Konsentrasi glukosa yang tinggi mengakibatkan penurunan massa miselia, pH kultur, dan konsentrasi GOD (Simpson 2005). Konsentrasi glukosa optimal untuk produksi GOD pada A. niger mutant G-13 yaitu 8% sedangkan konsentrasi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 0.35%. Berdasarkan penelitian Sabir et al. (2007) yang menggunakan berbagai macam sumber karbon dalam produksi enzim GOD dari Penicillium notatum didapat bahwa penggunaan sukrosa dalam media menunjukkan aktivitas GOD yang dihasilkan paling tinggi dibandingkan penggunaan maltosa, glukosa, fruktosa, dan pati. Media yang digunakan pada penelitian ini memiliki konsentrasi CaCO3 4% dan pH 5.5. Konsentrasi CaCO3 yang optimum untuk produksi GOD menurut Hatzinikolaou et al. (1996) adalah 4%. Simpson (2005) melaporkan bahwa CaCO3 merupakan penginduksi yang kuat dalam pembentukan GOD pada A. niger. Berdasarkan penelitian Hatzinikolaou et al. (1996) didapat bahwa aktivitas enzim glukosa-6-fosfat isomerase sebagai enzim glikolisis lebih tinggi pada media tanpa CaCO3 sedangkan aktivitas GOD dan katalase cukup rendah. Penambahan CaCO3 mengakibatkan peningkatan aktivitas GOD dan katalase seiring dengan penurunan aktivitas glukosa-6-fosfat isomerase. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa adanya CaCO3 mengubah jalur metabolik A. niger dari glikolisis menjadi jalur pentosa fosfat, yang dapat meningkatkan jumlah glukosa oksidase (Simpson 2005). Berdasarkan penelitian Khurshid et al. (2011), pH optimum untuk produksi GOD pada A. niger adalah 5.5. Produksi glukosa oksidase selama fermentasi dapat berlangsung pada pH minimal 4 (Simpson 2005). Konsentrasi KH2PO4 dan MgSO4 yang digunakan dalam media produksi pada penelitian ini yaitu 0.02%. Khurshid et al. (2011) menyatakan bahwa aktivitas GOD maksimum terjadi pada konsentrasi KH2PO4 0.4% dan kemudian menurun pada konsentrasi lebih dari itu. Selain itu peningkatan konsentrasi MgSO4 mulai dari 0.01% mengakibatkan penurunan aktivitas GOD sehingga penggunaan MgSO4 harus seminimal mungkin. Hamid et al. (2003) juga menyatakan bahwa penambahan Mg2+ pada media merupakan inhibitor kuat pada produksi GOD.

17 (NH4)2HPO4 dengan kadar 0.2 % merupakan sumber fosfor yang baik bagi pertumbuhan A. niger karena dapat meningkatkan aktivitas glukosa oksidase. Pengukuran aktivitas GOD dilakukan dengan menentukan kecepatan reaksi awal (Vo) terlebih dahulu. Pada tahap awal reaksi, tidak dihasilkan produk, tetapi pada tahap reaksi berikutnya, reaksi balik menjadi lebih penting pada saat mendekati kesetimbangan. Konsentrasi substrat linear seiring dengan pertambahan waktu, kemudian aktivitas enzim juga menurun karena enzim menjadi jenuh terhadap substrat. Akhirnya enzim dihambat oleh produk yang terbentuk atau menjadi lambat aktivitasnya. Pengukuran aktivitas biasanya dilakukan segera setelah reaksi dimulai untuk menghindari terjadinya pengurangan laju akibat pengurangan substrat dan penumpukan produk (Metzler 2003). Oleh karena itu aktivitas enzim (V) ditentukan oleh vo ketika pengaruh tersebut sangat kecil. Kecepatan awal reaksi (Vo) ditentukan berdasarkan laju linear maksimum pada kurva yang menghubungkan antara waktu dan absorbansi pengujian enzim. Kecepatan awal reaksi GOD diperoleh sebesar 0.95/menit. Setelah laju awal reaksi enzim diketahui, aktivitas masing-masing sampel diukur dengan waktu pengukuran 1 menit. Waktu ini ditentukan berdasarkan waktu yang menunjukkan terjadinya laju linear tertinggi pada reaksi enzim (to). Prinsip pengujian enzim GOD berdasarkan oksidasi β-D-glukosa oleh GOD dengan bantuan oksigen menjadi β-D-glukono-δ-lakton dan hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida yang terbentuk digunakan untuk mengoksidasi substrat kromogen pada reaksi kedua dengan GOD menghasilkan perubahan warna. Perubahan warna kemudian diamati secara spektrofotometri (Sukhacheva et al. 2004). Pada penelitian ini menggunakan orto-dianisidin sebagai substrat kromogen. Perubahan warna yang terjadi diukur pada panjang gelombang 436 nm. Warna yang dihasilkan yakni merah muda. Larutan glukosa yang digunakan didiamkan terlebih dahulu selama 1 jam agar terjadi mutarotasi menjadi β-D-glukosa (Simpson 2005). GOD Fraksi Ekstrak Kasar dan Pengendapan Amonium Sulfat Produksi GOD dilakukan pada 3 liter media dengan waktu fermentasi selama 40 jam. Ekstrak kasar diperoleh dari hasil isolasi A. niger (IPBCC 08.610) yang ditumbuhkan dalam media produksi setelah melalui tahap inkubasi selama 40 jam. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Khursid et al. (2011) menyebutkan bahwa waktu produksi GOD paling maksimal dilakukan dalam waktu 48 jam. Optimasi waktu produksi A. niger (IPBCC 08.610) juga dilakukan oleh Triana (2012), aktivitas total GOD yang dihasilkan pada 48 jam lebih tinggi daripada waktu produksi selama 72 jam, nilai yang diperoleh yaitu sebesar 134.21 U dan 103.72 U. Pada penelitian ini, aktivitas total ekstrak kasar yang diperoleh lebih tinggi daripada yang diperoleh oleh Triana (2012) yaitu sebesar 261.68 U. Unit merupakan satuan dari aktivitas enzim. Unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menggunakan satu mikromol substrat per menit pada suhu dan temperatur tertentu. Perbedaan waktu optimum inkubasi ini dikarenakan suhu yang digunakan pada penelitian ini lebih tinggi yaitu 370C dengan kecepatan agitasi 120 rpm. Suhu yang lebih tinggi dianggap mampu mempercepat pertumbuhan A.niger yang optimum pada suhu 25-370C (Decamps et al. 2012). Produksi GOD tidak hanya dipengaruhi oleh faktor media dan waktu produksinya saja, melainkan terdapat faktor lain seperti aerasi dan agitasi, suhu dan

18 pH produksi. Pada penelitian ini aerasi dan agitasi pada saat produksi sangat penting diperhatikan karena fungsi aerasi dan agitasi adalah untuk mensuplai kebutuhan oksigen yang dibutuhkan untuk kapang sebagai mikroorganisme aerobik obligat (Simpson 2005). Pada produksi GOD dari A. niger isolat lokal (IPBCC 08.610) yang dilakukan pada penelitian ini, kecepatan agitasi yang digunakan adalah 120 rpm dengan perbandingan aerasi sebesar 1 : 5, penentuan aerasi dan agitasi tersebut merujuk pada penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh Singh dan Verma (2010) dan Khurshid e al. (2011). Tingkat aerasi dan agitasi mempengaruhi kecepatan konsumsi oksigen dan ketersediannya selama proses kultivasi berlangsung. Laju konsumsi O2 oleh A.niger ketika masa produksi cukup tinggi. Oksigen yang tidak mencukupi menyebabkan berkurangnya hasil dari produk mikroorganisme seperti enzim (Jafari et al. 2007). Enzim dapat mempercepat reaksi kimiawi dengan sempurna bila berada dalam suhu optimumnya, namun bila suhu operasi menyimpang dari suhu optimum maka aktivitas enzim akan menurun. Penyimpangan pH medium juga dapat menimbulkan pertumbuhan dan metabolisme mikroba terhenti dikarenakan protein dalam struktur enzim dan sistem transport yang terdapat pada membran sel berubah. (Bankar et al. 2009). Ekstrak kasar enzim yang diperoleh lalu digunakan untuk tahap pemurnian dengan amonium sulfat. Tahap ini merupakan langkah awal pemurnian enzim yang berfungsi meningkatkan konsentrasi protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan memisahkan protein target dari sebagian kontaminan yang tidak diinginkan. Peningkatan kemurnian yang cukup signifikan menunjukkan bahwa tingkat kejenuhan 80% amonium sulfat optimum untuk mengendapkan protein GOD. Sherbeny et al. (2005), Triana (2012), dan Selena (2014) menyatakan hal yang sama, yaitu amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 80% optimum dalam meningkatkan kemurnian GOD. Perbedaan tingkat kejenuhan amonium sulfat berhubungan dengan jumlah asam amino hidrofilik dan hidrofobik yang terdapat pada permukaan protein enzim. Protein enzim yang memiliki lebih banyak asam amino hidrofilik membutuhkan konsentrasi garam yang lebih tinggi untuk mengendapkannya karena permukaan protein yang hidrofilik berinteraksi kuat dengan air sehingga diperlukan ion-ion dari garam dalam jumlah yang lebih banyak untuk mengganggu interaksi tersebut. Sebaliknya, jika protein enzim mengandung lebih banyak asam amino hidrofobik, jumlah amonium sulfat yang diperlukan lebih sedikit (Anwar 2006). Amonium sulfat yang sudah dihaluskan ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam enzim sambil diaduk agar konsentrasi amonium sulfat dapat merata saat berinteraksi dengan enzim. Aktivitas enzim dan konsentrasi protein tertinggi pada fraksi amonium sulfat 80% menunjukkan bahwa GOD yang dihasilkan memiliki sifat hidrofilik yang tinggi sehingga diperlukan kejenuhan amonium sulfat yang tinggi untuk membuatnya mengendap. Asam amino pada GOD dari A. niger mengandung lebih banyak histidin, arginin, dan tirosin serta lebih sedikit lisin dan fenilalanin dibandingkan GOD dari P. Amagasakiense (Simpson 2005). Glukosa oksidase banyak mengandung asam amino serin, glisin, asam glutamat, asam aspartat, dan alanin (Sherbeny et al. 2005). Glisin dan alanin termasuk asam amino dengan gugus R yang bersifat hidrofobik. Tirosin termasuk dalam asam amino dengan gugus-R aromatik yang bersifat hidrofobik namun masih mengandung gugus hidroksil yang hidrofilik. Serin,

19 histidin, asam glutamat, asam aspartat, dan arginin merupakan asam amino yang bersifat polar atau hidrofilik (Nelson dan Cox 2008). Kinetika Glukosa Oksidase Persamaan linier Lineweaver-Burk digunakan untuk menentukan konstanta kinetika GOD dari A. niger (IPBCC.08.610). Gambar 7 menunjukkan pengaruh GOD terhadap aktivitas spesifik GOD. Berdasarkan hasil tersebut terlihat bahwa terjadi peningkatan aktivitas enzim seiring dengan peningkatan konsentrasi glukosa yang digunakan. Aktivitas enzim pada konsentrasi glukosa yang rendah meningkat secara linear terhadap konsentrasi. Akan tetapi pada konsentrasi glukosa melebihi 0.06 M, laju peningkatan aktivitas enzim mengalami penurunan secara progresif terhadap konsentrasi. Mekanisme reaksi enzimatis secara umum ditunjukkan sebagai berikut:

Laju pembentukan kompleks enzim-substrat (EA) lebih cepat dibandingkan reaksi penguraiannya menjadi enzim bebas (E) dan produk (P) (Rogers dan Gibon 2009). Pada saat konsentrasi substrat (A) rendah maka enzim akan banyak dalam kondisi bebas sehingga dengan peningkatan substrat akan menyebabkan kesetimbangan bergeser ke arah EA yang mengakibatkan terjadi peningkatan pembentukan EA. Saat semua enzim telah membentuk kompleks dengan substrat akibat konsentrasi substrat yang tinggi, penambahan substrat tidak lagi memberikan pengaruh pada peningkatan aktivitas enzim akibat terjadinya kondisi enzim yang jenuh oleh substrat (Nelson dan Cox 2008). GOD yang dihasilkan dari pengendapan amonium sulfat 80% memiliki nilai Km dan vmaks yang diperoleh berturut-turut adalah 56 mM dan 20.747 U/mg. Konsentrasi glukosa sebesar 56 mM merupakan jumlah glukosa yang dibutuhkan untuk mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Nilai Km GOD dari A. niger (Sigma Type VIII) hasil fraksi pemurnian kromatografi kolom yaitu sebesar 30 mM (Kalisz et al. 1991). Nilai Km yang diperoleh masih relatif lebih tinggi. Semakin tinggi nilai Km maka semakin rendah afinitasnya terhadap substrat, dalam hal ini yaitu β-D-glukosa. Nilai vmaks yang diperoleh relatif masih sangat rendah dibandingkan nilai vmaks GOD dari A. niger (Sigma Type VIII), yaitu 458 U/mg (Kalisz et al. 1991). Semakin tinggi vmaks suatu enzim maka semakin tinggi kecepatan yang bisa dicapai oleh enzim tersebut. Hal ini dikarenakan pemurnian yang dilakukan pada penelitian ini masih parsial baru sampai tahap pengendapan amonium sulfat sehingga diduga masih terdapat protein-protein lain selain protein target. Parameter lain yang digunakan untuk mempelajari kinetika dari suatu enzim adalah kcat atau bilangan putaran. Bilangan putaran enzim merupakan jumlah molekul substrat yang diubah menjadi produk per satuan waktu pada satu molekul enzim saat enzim tersebut jenuh oleh substrat (Nelson dan Cox 2008). Bobot molekul enzim perlu diketahui untuk menentukan bilangan putaran. Jika diasumsikan bahwa enzim GOD yang dihasilkan pada penelitian ini memiliki bobot molekul yang sama dengan enzim GOD yang dihasilkan oleh A. niger (Sigma Type

20 VII) yaitu 157 kDa (Kalisz et al. 1991), maka nilai kcat GOD fraksi hasil pengendapan amonium sulfat ini diperkirakan sekitar 53 s-1. Nilai ini masih sangat rendah dibandingkan kcat GOD fraksi kromatografi kolom dari A. niger (Sigma Type VII), yaitu 920 s-1 (Kalisz et al. 1991). Semakin besar nilai kcat maka semakin cepat proses katalisis terjadi (Rogers & Gibon 2009). Efisiensi fraksi enzim yang dihasilkan masih sangat kecil yaitu 0.95 s-1 mM-1 jika dibandingkan dengan efisiensi GOD fraksi kromatografi kolom dari A. niger (Sigma Type VII) yaitu 31 s-1 mM-1. Hal ini dikarenakan GOD yang dihasilkan pada penelitian ini belum murni karena hanya melalui tahap pemurnian sampai pengendapan amonium sulfat sehingga perlu dilakukan pemurnian lebih lanjut untuk meningkatkan bilangan putaran tersebut, seperti pemurnian dengan menggunakan kromatografi kolom. Semakin murni enzim tersebut maka aktivitas spesifiknya semakin tinggi sehingga vmaks semakin tinggi yang berdampak pada semakin tinggi pula kcat. Efisiensi enzim merupakan perbandingan dari kcat/Km dan dapat diartikan sebagai nilai dari spesifisitas substrat. Saat kcat lebih besar dari k-1, proses katalisis berlangsung dengan sangat cepat dan efisiensi enzim bergantung pada kemampuannya untuk mengikat substrat (Rogers & Gibon 2009). Semakin tinggi efisiensinya maka enzim tersebut semakin tinggi spesifisitasnya terhadap substrat tersebut. Voltamogram Siklik EPK dan EPKT Perubahan konduktansi EPK dievaluasi dengan mengukur voltamogram sikliknya menggunakan metode voltametri siklik. Metode ini dapat mengevaluasi reaksi elektrokimia yang terjadi di permukaan antarmuka larutan elektrolit dengan elektroda (Zhu et al. 2012). Pengukuran didasarkan pergerakan elektron antara elektroda kerja dan elektroda pelengkap. Pada elektroda kerja yang berperan sebagai anoda, komponen larutan elektrolit dioksidasi sempurna menjadi bentuk tereduksi pada potensial tertentu sehingga elektron yang dilepaskan terbaca sebagai puncak arus oksidasi. Selanjutnya, elektron yang dilepaskan tersebut ditransfer menuju elektroda pelengkap (Pt|Ti) dengan bantuan larutan elektrolit dan direduksi menjadi bentuk teroksidasi kembali (Wang 2006). Ukuran tembaga mempengaruhi proses transfer elektron. Selain elektroda kerja dan elektroda pelengkap, elektroda pembanding juga diperlukan dalam teknik ini. Elektroda jenis ini nilai potensialnya telah diketahui dan bersifat stabil yakni tidak dipengaruhi oleh komposisi sampel. Elektroda ini berfungsi mengontrol potensial elektroda kerja dalam pengukuran voltametri siklik. Elektroda Ag|AgCl digunakan sebagai elektroda pembanding karena konstruksinya yang sangat sederhana dan bebas dari merkuri. Ketiga elektroda dalam sel elektrokimia berada pada posisi berurutan yakni elekroda Ag|AgCl (R), elektroda kerja (W), dan elektroda Pt|Ti (C) agar antara elektroda kerja dengan elektroda pelengkap dapat membentuk sirkuit elektron dan meminimalkan hambatan serta ketidakstabilan potensial (Lampiran 10). Elektroda kerja yang digunakan pada penelitian ini yakni elektroda pasta karbon. Pasta karbon merupakan elektroda murah, permukaannya dapat diperbaharui, permukaannya berpori, dan dapat dibuat dalam bentuk yang kecil serta memiliki keunggulan yakni rentang potensial yang luas, inert, dan cocok untuk digunakan untuk bermacam-macam sensor (Surianty 2014). Desain elektroda ditunjukkan pada Lampiran 9. Tembaga memiliki nilai konduktansi yang baik.

21 Selain itu penggunaan tembaga lebih murah dibandingkan logam lain yang dapat menghantarkan elektron seperti emas dan perak. Tembaga dengan ukuran 3 mm memiliki nilai arus yang lebih tinggi dibandingkan 1 mm hal ini dikarenakan daya hantar yang dihasilkan lebih besar sehingga nilai arus yang didapat juga besar. EPK dengan ukuran diameter tembaga 3 mm selanjutnya dimodifikasi dengan nanoserat polianilin. Modifikasi EPK dengan penambahan nanoserat polianilin bertujuan meningkatkan daya hantar listriknya (konduktansi) (Dhand et al. 2008). Perbandingan nilai arus oksidasi maksimum antara EPK dengan EPKT pada penelitian ini sebesar 2:3 berbeda dengan penelitian Ambarsari (2016) dengan yang memiliki perbandingan 1:6. Perbedaan ini dipengaruhi jarak antara elektroda kerja dengan elektroda pelengkap. Jarak keduanya perlu dijaga sedekat mungkin agar meminimalkan hambatan dan ketidakstabilan dalam sel elektrokimia (Scholz et al. 2010). Selain itu perbedaan ini juga dipengaruhi oleh ukuran elektroda. Pada penelitian ini digunakan elektroda dengan ukuran diameter 3 mm dan panjang pasta karbon 10 mm. sementra pada penelitian Ambarsari (2016) digunakan ukuran diameter 8 mm dan panjang pasta karbon 3 mm. Perbedaan ukuran ini akan menyebabkan perbedaan transfer elektron sehingga berpengaruh pada nilai arus dan potensial. Peningkatan nilai arus oksidasi maksimum EPKT disebabkan nanofiber polianilin yang digunakan sebagai polimer pemodifikasi EPK. Polianilin sebagai polimer konduktif juga meningkatkan luas permukaan dan kepadatan pasta karbon dalam menerima serta mentransfer elektron (Gospodinova dan Terlemezyan 1998). Konduktivitas polianilin dapat ditentukan dengan mengukur tahanan listrik bahan (R) yang dinyatakan sebagai beda potensial setiap satuan arus listrik sementara konduktivitas dapat dinyatakan dengan hubungan R terhadap luas penampang setiap satuan jarak elektroda (Indayaningsih et al. 1997). Kombinasi polianilin dengan bahan organik atau anorganik lain dapat menghasilkan material baru yang tidak hanya meningkatkan sifat mekanik tetapi juga sifat lain tergantung material yang ditambahkan. Penambahan polianilin pada karbon dilakukan agar tidak ada ruang kosong antara partikel grafit yang satu dengan yang lainnya, sehingga polinilin yang ditambahkan masuk dalam rongga kosong antara partikel grafit, hal ini meningkatkan konduktivitas listrik pada elektroda yang dibuat karena jalannya elektron tidak terputus. Grafit pada komposit berfungsi sebagai penguat dan memperkecil gesekan serta meningkatkan ketahanan arus (Gradiniar 2013). Komposit elektroda pasta karbon telah banyak digunakan untuk aplikasi elektroanalitik sejak diperkenalkan oleh Adams pada tahun 1958, karena sifat konduktif, terbarukan dan untuk fabrikasi secara elektrokimia sangat sederhana dan murah (Colak 2012). Luas voltamogram siklik mengindikasikan kualitas konduktansi (daya hantar listrik) suatu elektroda. Luas voltamogram siklik yang sempit mengindikasikan suatu elektroda memiliki kerapatan arus yang sangat rendah karena bersifat kurang konduktif (konduktansi rendah) dan sebaliknya (Zhu et al. 2012). Hal ini menunjukkan EPK dengan luas voltamogram siklik yang sempit bersifat kurang konduktif. Namun, pasta karbon yang dimodifikasi dengan penambahan polianilin menghasilkan voltamogram siklik yang lebih luas sehingga bersifat lebih konduktif dibandingkan EPK. Nilai potensial yang dihasilkan oleh EPK dan EPKT pada penelitian ini leboh kecil dibandingkan potensial redoks KCl yang memiliki nilai 1.36 V untuk Cl- dan 2.92 V untuk K+ sehingga arus redoks yang terbaca tidak

22 berasal dari larutan KCl 1 M. hasil yang didapat ini sesuai dengan penelitian Ambarsari (2016) yang menyatakan polianilin pada EPKT dapat meningkatkan kinerja EPK. GOD Teramobilisasi pada Elektroda Teknik amobilisasi enzim adalah teknik yang digunakan agar enzim tidak bergerak. Tujuan amobilisasi adalah untuk mengendalikan pergerakan enzim secara total atau sebagian pada bagian pasta karbon elektroda dan meningkatkan aktivitas enzim. Metode ikatan silang didasarkan pada pembentukan ikatan kimia, seperti pada metode ikatan kovalen, tetapi tidak menggunakan matriks yang tidak larut. Enzim yang diamobilisasi dengan metode ini sering bersifat gel sehingga sukar ditangani. Pada penelitian agen pengamobil menggunakan glutaraldehid. Proses ini didasarkan pembentukan kompleks secara kovalen antara polianilin-glutaraldehidenzim. Gugus amina pada enzim berikatan dengan glutaraldehid sebagai agen pengikat silang sedangkan gugus amina pada rantai polianilin terikat dengan gugus C=O pada glutaraldehid melalui reaksi kondensasi yang melepaskan molekul air (Gambar 8). Pengikatan gugus amina oleh glutarahdehida terjadi terhadap asam amino lisin atau hidroksilisin (Singh et al. 2005). Selain glutaraldehida, komponen lain dalam amobilisasi enzim pada penelitian ini yakni bufer asetat dengan pH 4.5 dan Bovine Serum Albumine (BSA) (Adeloju dan Lawal 2011). pH dalam amobilisasi bertujuan mengondisikan pH lingkungan enzim yang sesuai dengan pH optimum elektroda. Hal ini didasarkan proses amobilisasi yang dapat mengubah nilai pH optimum enzim karena perubahan daya terionisasi asam amino pada sisi aktif enzim (Colak et al. 2012). Sementara itu, fungsi penambahan BSA adalah sebagai agen penstabil. Campuran larutan teramobil dalam permukaan pasta karbon melalui peristiwa adsorbsi fisik. Hasilnya, permukaan pasta karbon elektroda tampak sebagian terlapisi komponen amobil yang telah kering. Sifat dari enzim amobil berbeda dengan enzim yang terdapat bebas dalam larutan dan tergantung dari metode amobilisasi. Proses amobilisasi pada GOD dapat meningkatkan kestabilan aktivitas GOD, yang ditunjukkan dengan aktivitas GOD menjadi lebih stabil pada suhu tinggi dengan aktivitas yang optimum dibandingkan dalam kondisi bebas yang optimum pada suhu sekitar 25-370C (Simpson et al. 2007). Karakteristik enzim dapat berubah jika sisi aktif mengalami perubahan konformasi sebagai hasil interaksi elektrostatik dengan molekul substrata tau produk. Selain itu, enzim yang diamobilkan akan mengalami perubahan komposisi yang dimungkinkan akibat dari sisi aktif enzim yang berikatan dengan matriks sehingga mengakibatkan berkurangnya katalitik enim tersebut. Puncak arus oksidasi pada voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT menggambarkan reaksi pembentukan asam glukonat telah berlangsung sempurna pada elektroda kerja. Sementara itu, puncak arus reduksi menggambarkan pemecahan hidrogen peroksida menjadi oksigen pada elektroda pelengkap. Jumlah puncak maksimum pada voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT terdapat satu reaksi oksidasi dan satu reaksi reduksi telah terjadi pada sel elektrokimia (Singh et al. 2005) hal ini menunjukkan pembacaan arus oksidasi sangat stabil sehingga hanya muncul satu puncak arus reduksi-oksidasi. Perbedaan voltamogram siklik menunjukkan kinerja GODamo-IPB|EPKT lebih baik daripada GODIPB|EPKT.

23 Konsentrasi enzim berbanding lurus dengan aktivitas enzim. Hal ini menguatkan hipotesis pengikatan gugus amina GOD pada polianilin memerlukan glutaraldehida.

Gambar 10 Pembentukan kompleks polianilin-glutaraldehid-GOD secara kovalen (Singh et al. 2005) Enzim yang diamobilisasi dapat kehilangan aktivitasnya karena beberapa hal yaitu beberapa enzim mungkin diamobilisasi pada matriks dengan konfigurasi sedemikian rupa sehingga menghambat kontak antara substrat dengan sisi aktif enzim. Gugus reaktif pada sisi aktif enzim mungkin ikut terikat pada matriks. Molekul enzim selama pengikatan mungkin berubah menjadi konfigurasi inaktif. Kondisi reaksi selama pengikatan mungkin menyebabkan denaturasi atau inaktivasi enzim. Stabilitas enzim teramobil tergantung dari lingkungan mikro yang dapat menyebabkan protein dasar dari enzim terdenaturasi atau tetap stabil. Pada penelitian ini amobilisasi enzim mampu meningkatkan aktivitas GOD yang ditunjukkan pada tingginya nilai arus. Hal ini mengindikasikan teknik amobilisasi yang digunakan tepat seingga pengikatan sisi aktif GOD dan substrat dapat optimal. Parameter Kinetika Enzim teramobil pada EPKT Karakteristik aktivitas GOD dapat diketahui melalui penentuan parameter kinetikanya, yaitu nilai Km dan Imaks. Parameter kinetika tersebut ditentukan melalui pengujian pengaruh konsentrasi substrat terhadap kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT yang diamati secara elektrokimia siklik voltametri. Aktivitas GOD sangat memungkinkan untuk diamati secara elektrokimia karena terdapat reaksi reduksi oksidasi yang dikatalisis oleh GOD tersebut. Sinyal berupa elektron tersebut terdeteksi secara elektrokimia dalam bentuk arus yang tercatat dalam bentuk voltamogram siklik. Nilai arus menggambarkan laju reaksi katalis enzim terhadap glukosa. Laju reaksi sebenarnya bergantung pada jumlah total enzim yang berada dalam bentuk kompleks enzim-substrat (ES). Terdapat tiga keadaan pengaruh konsentrasi substrat terhadap kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT. Pertama, Pada konsentrasi substrat yang rendah ([S] < Km), jumlah enzim dalam bentuk kompleks ES sedikit dan sebagian besar enzim dalam kondisi bebas. Hal ini menyebabkan laju reaksi pembentukan produk berlangsung lambat, yang ditunjukkan dengan nilai arus yang diperoleh kecil (Fadhilah 2013). Seiring peningkatan konsentrasi substrat, maka jumlah kompleks ES yang terbentuk meningkat, yang menyebabkan terjadi peningkatan laju reaksi pembentukan produk, sehingga nilai arus yang diperoleh semakin besar. Namun, pada konsentrasi substrat yang tinggi ([S] > Km), peningkatan konsentrasi glukosa tidak akan meningkatkan laju reaksi secara signifikan. Hal ini karena pada konsentrasi tinggi, hampir sebagian besar enzim telah berada dalam bentuk kompleks ES, dan laju reaksi telah mencapai maksimum (vmaks). Sehingga

24 peningkatan konsentrasi substrat yang lebih tinggi lagi tidak akan menghasilkan peningkatan nilai arus yang signifikan. Dalam kondisi tersebut enzim telah mencapai kondisi jenuh (Fadhilah 2013). Kurva Michaelis-Menten pada Gambar 8 menggambarkan ketiga keadaan tersebut sebagai pengaruh dari konsentrasi substrat terhadap kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT, yang menunjukkan bahwa terjadi peningkatan nilai arus yang dihasilkan seiring dengan peningkatan konsentrasi substrat. Hal ini berarti terjadi peningkatan kompleks ES, sehingga laju reaksi enzim masih meningkat. Namun, pada konsentrasi glukosa diatas 2 mM tidak terjadi peningkatan arus yang signifikan, yang berarti laju reaksi telah mencapai maksimum. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas GOD sebagai elektroda enzim mencapai keadaan jenuh saat konsentrasi glukosa lebih besar dari 2 mM. Berdasarkan kurva Michaelis-Menten tersebut dapat ditentukan nilai Km dari kinerja elektroda GOD/EPKT. Penentuan nilai Km dan Imaks berdasarkan daerah linier pada kurva Michaelis-Menten. Sehingga dapat diperoleh nilai Km dan Imaks yang lebih akurat. Daerah linier tersebut berada pada rentang 0.2 – 1.6 mM dengan nilai regresi (r2) sebesar 0.986. Daerah linier tersebut kemudian dikonversi 1 1 ke dalam kurva Lineweaver-Burk ( vs I ). Nilai Km dan Imaks yang diperoleh [S] berdasarkan analisis persamaan Lineweaver-Burk, masing-masing sebesar 2 mM dan 3.869 mA. Nilai Km dari elektroda GOD pada penelitian ini yakni 2.88 mM jauh lebih besar dengan nilai Km dari elektroda GOD pada penelitian Colak et al. (2012) yaitu sebesar 0.61 mM. Nilai Imaks yang diperoleh pada penelitian ini juga lebih besar yaitu 3.86 mA dibandingkan nilai Imaks yang diperoleh Colak et al. (2012) yang sebesar 1.22 μA/min. Begitupun dengan penelitian Ambarsari (2016) yang memiliki nilai Km lebih rendah yaitu sebesar 0.70 mM dan Imaks lebih besar yaitu 4.24 mA. Hal ini menunjukkan bahwa kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT pada penelitian ini lebih baik, karena walaupun nilai Km yang tinggi, tetapi dapat menghasilkan nilai arus atau laju reaksi maksimum yang besar. Namun Km yang dihasilkan pada penelitian ini lebih besar dari Ambarsari et al. (2016). Berdasarkan Brown et al. 2010 jika nilai Km suatu enzim tinggi, maka diperlukan konsentrasi substrat yang tinggi untuk mencapai setengah laju reaksi maksimum. Hal ini berarti bahwa enzim tersebut memiliki afinitas atau kemampuan untuk terikat substrat yang rendah, sehingga efisien jika diaplikasikan dalam teknologi fuel cell karena enzim fuel cell membutuhkan Km yang tinggi agar diperoleh kerapatan daya yang tinggi. Nilai Km pada penelitian ini dikonversi ke dalam satuan mg/dL dan diperoleh nilai Km sebesar 56.4 mg/dL. Jika elektroda GODamo-IPB|EPKT tersebut akan diaplikasikan sebagai biosensor glukosa dalam bidang medis seperti pengukuran kadar glukosa darah, maka elektroda ini cukup berpotensi. Berdasarkan nilai K m tersebut, elektroda GODamo-IPB|EPKT potensial untuk dapat mendeteksi kadar glukosa darah dalam kondisi normal, hiperglikemia, hingga kondisi hipoglikemia. Kadar glukosa darah normal manusia sekitar 70 – 110 mg/dL, dan kondisi glukosa darah dikatakan dalam keadaan hipoglikemia jika kadar glukosa dibawah 60 mg/dL dan dalam keadaan hiperglikemia jika kadar glukosa diatas 270 mg/dL. Elektroda ini juga berpotensi diaplikasikan dalam pengukuran kadar glukosa dalam buah untuk mendeteksi tingkat kematangan buah. Jika elektroda ini akan diaplikasikan pada sel bio fuel diperlukan optimasi dan karakterisasi performance pada elektroda.

25 Uji stabilitas elektroda menunjukan daya tahan penggunaan elektroda selama jangka waktu tertentu yang dilihat dari nilai arus yang dihasilkan. Pada Gambar 9 menunjukkan nilai arus elektroda menurun pada bulan pertama hingga bulan ketiga. Penurunan terjadi secara signifikan. Berdasarkan Tang et al. 2015 ikatan silang glutaraldehida dengan GOD dan polianilin dapat meningkatkan stabilitas elektroda yang memliki stabilitas hingga 70 hari. Namun, pada penelitian ini stabilitas elektroda tidak mencapai jangka waktu satu bulan. Hal ini dikarenakan proses penyimpanan elektroda pada larutan buffer asetat pH 4.5 mempengaruhi penurunan nilai arus. Diduga penyimpanan elektroda di dalam buffer asetat mengalami proses transfer elektron antara GOD dan ion-ion yang terdapat pada larutan buffer asetat sehingga pada saat pengukuran terjadi kejenuhan pentransferan elektron dari GOD.

4 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Karakteristik biokimia GOD dari A. niger (IPBCC.08.610) meliputi aktivitas enzim, kinetika GOD hasil pengendapan (NH4)2SO4 80% dan kinetika GOD teramobil pada elektroda pasta karbon. Aktivitas GOD lebih tinggi dihasilkan secara intraseluler (1.31 U/mL) dengan laju reaksi awal satu menit. GOD terendapkan dengan baik pada pengendapan 80% (NH4)2SO4 jenuh dengan aktivitas spesifik sebesar 27.77 U/mg dan kemurniannya mencapai 20.22 kali dari ekstrak kasarnya. Nanofiber polianilin dapat meningkatkan konduktansi EPK. Metode amobilisasi dapat meningkatkan arus GODamo-IPB|EPKT (3.869 mA). Amobilisasi GOD pada EPKT dapat meningkatkan afinitas enzim-substrat (Km=2.88 mM) dibandingkan hasil pengendapan (NH4)2SO4 80% (Km=56 mM). Bilangan putaran atau turnover GOD yang diamobilisasi pada EPKT juga meningkat dari 53 s-1 menjadi 13 s-1. Amobilisasi GOD pada EPKT dapat memperkecil konsentrasi substrat namun meningkatkan kecepatan maksimum reaksi yang terlihat dari nilai Km dan Vmax sehingga EPKT lebih ekonomis dan efisien. GODamo-IPB|EPKT memiliki sensitivitas sebesar 1.09 mA mM-1 dengan range konsentrasi substrat 0.22 mM. GODamo-IPB|EPKT berpotensi untuk dijadikan biosensor glukosa darah dengan konsentrasi pendeteksi sebesar 54.6 mg/dL. Range konsentrasi substrat GODamo-IPB|EPKT juga berpotensi untuk dijadikan biosensor glukosa dalam mendeteksi tingkat kematangan pada buah. Dalam aplikasi sebagai bioanoda fuel cell dibutuhkan optimasi dan karakterisasi performance elektroda. Saran Uji stabilitas elektroda perlu dilakukan dalam kondisi kering, suhu 4oC, dan kondisi tertutup tanpa direndam dalam larutan buffer asetat pH 4.5 agar tidak menurunkan nilai arus elektroda. Optimasi konsentrasi enzim dan glutaraldehida serta uji kemampuan elektroda untuk dilakukan secara berulang-ulang (repeatability dan reproducibility) juga perlu dilakukan agar dapat meningkatkan performance elektroda dalam aplikasi biosensor maupun biofuel sel. Optimasi suhu dan pH GOD IPBCC08.610 pada EPKT juga diperlukan.

26

DAFTAR PUSTAKA Adeloju SB, Lawal AT. 2011. Fabrication of a bilayer potentiometric phosphate biosensor by cross-link immobilization with bovine serum albumin and glutaraldehyde. Analytica Chimica Acta. 691:89-94. Ahmad A, Syaiful A, Firman Ap, Patong AR. 2007. Imobilisasi enzim glukosa oksidase dari Penicillium sp-3 galur lokal. Indo J Chem. 7:97-104. Ambarsari L, Setyawati I, Kurniasih R, Kurniatin PA, Maddu A. Immobiliation of glucose oxidase on modified-carbon-paste-electrodes or microfuel cell. Indones J Chem. 1:1-16. Anwar YAS. 2006. Produksi dan karakterisasi enzim tanin asil hidrolase dari Aspergillus niger [tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, IPB. Bankar SB, Bule MV, Singhal RS, Ananthanarayan L. 2009. Optimization of Aspergillus niger fermentation for the production of glucose oxidase. Food Biopro Technol 2:344-352. Bergmeyer HU. 1988. Methods of enzymatic analysis. Edisi ke-3. Vol. II: Samples, reagents, assesment of result. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal biochem. 72(1): 248-254. Brown S, Muhamad N, Simcock DC. 2010. Estimating enzyme kinetic parameters from apperent Km and Vmax. Int J Chem Bio Eng. 3(4):195-200. Colak O, Arslan H, Zengin H, Zengin G. 2012. Amperometric detection of glucose by polyaniline-activated carbon composite carbon paste electrode. Int J Electrochem Sci. 7:6988-6997. Dhand C, Arya SK, Datta M, Malhotra BD. 2008. Polyaniline-carbon nanotube composite film for cholesterol biosensor. Anal Biochem. 83: 194-199. Decamps K, Joye I, Haltrich D, Nicolas J, Courtin C, Declour J. 2012. Biochemical characteristics of Trametes multicolor pyranose oxidase and Aspergillus niger glucose oxidase and impications or their unctionality in wheat lour dough. Food Chemistry. 131:1485-1492. Fadhilah R. 2013. Biosensor glukosa menggunakan gdh-fad yang diimobilisasi pada nanopartikel zeolit secara elektrokimia [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Fiedurek J, Rogalski J, Lklezuk Z, Leonwicz A. 1986. Screening and mutagenesis of moulds for improvement of glucose oxidase production. Enzyme Microb Technol. 8: 734 – 736. Firman P, Aryantha INP. 2003. Eksplorasi dan isolasi enzim gluksoa oksidase dari fungi imperfeksti (genus Penicilium dan Aspergillus) indigenus. Pertemuan Imnial Tahunan (PIT) Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia; Bandung 29-30 Agustus 2003. Gradiniar RA. 2013. Pengaruh penambahan karbon terhadap sifat mekanik dan konduktivitas listrik komposit karbon/epoksi sebagai pelat bipolar polimer elektrolitmembran sel bahan bakar Polymer Exchange Membrane (PEMFC). Teknik Pomits. 2(1):2337-3539). Gospodinova N, Terlemezyan L. 1998. Conducting polymers prepared by oxidative polymerization: polyaniline. Prog Polym Sci. 23: 1443-1484.

27 Hamid M, khalil-ur-Rehman, Zia MA, Asghar M. 2003. Optimization of various parameters for the production of glucose oxidase from rice polishing using Aspergillus niger. Asian Network Sci Infor Biotechnol 2:1-7. Hatzinikolaou et al. 1996. A new glucose oxidase from Aspergillus niger characterization and regulation studies of enzyme and gene. Appl Microbiol Biotechnol. 46:371-381. Indayaningsih N, Sudjono HK, Sukirman E, Hairudin U. 1997. Pembuatan dan pengukuran sifat listrik bahan Ag-β-Al2O3. Prosiding Pertemuan Ilmiah Sains Materi [Internet]. Jakarta (ID): BATAN. hlm 296-300; [diunduh 2015 Agus 17]. Tersedia pada: digilib.batan.go.id. Indriani DO, Syamsudin LN, Sriherfyna FH, Wardani AK. 2015. Invertase of Aspergillus niger with solid state fermentation method and the application in industry: A Review. Jurnal pangan dan Agroindustri. 3(4):1405-1411. Jafari A.R, Sarrafzadeh M.H, Alemzadeh I, Vosoughi M. 2007. Effect of stirer speed and aeration rate on the production of glucose oxidase by Aspergillus niger. Journal of Biological Sciences 7(2): 270-275. Khurshid S, Kashmiri MA, Quershi Z, Ahmad W. 2011. Optimization of glucose oxidase production by Aspergillus niger. African Journal of Biotechnology 10(9): 1674-1678. Kalisz HM, Hecht HJ, Schomburg D, Schmid RD. 1991. Effects of carbohydrate depletion on the structure, stability, and activity of glucose oxidase from Aspergillus niger. Biochem. Biophys. Acta 1080: 138-142. Maddu A, Wahyudi ST, Kurniati M. 2008. Sintesis dan Karakterisasi Nanoserat Polianilin. Nanosains dan Nanoteknologi. 1(2):74-78. Metzler DE. 2003. Biochemistry – The Chemical Reactions of Living Cells.14 Burlington: Elsevier Academic Pr. Nelson DL, Cox MM. 2008. Lehninger Principles of Biochemistry. New York: W.H. Freeman and Company. Nithiyaa P, Nurain Mz, Umi KY, Salleh B. 2012. Diversity and morphological characteristics of Aspergillus species and Fusarium species isolated fromcornmeal in Malaysia. Pertanika Journal Tropis Agriculture Sci. 35(1):103-116. Odenbunmi EO, Owalude SO. 2007. Kynetic and thermodynamic studies of glucose oxidase catalyzed oxidation reaction of glucose. J. Appl.Sci.Environt.Manage. 11: 95-100. Putri RP. 2011. Produksi dan pemurnian enzim glukosa oksidase (EC 1.1.3.4) dari isolat Aspergillus niger (IPBCC.08.610). [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Rogers A, Gibon Y. 2009. Enzyme kinetics: Theory and practice. Schwender J, editor. Di dalam: Plant Metabolic Networks.Upton: Springer Science, Business Media B.V. Sabir S, Bhatti HN, Zia MA, Sheikh MA. 2007. Enhanced Production of glucose oxidase using Penicillium notatum and rice polish. Biotechnol. 45(4): 443-446. Saglam O, Kiilkaya B, Uysal H, Dilgin Y. 2016. Biosensing o glucose in low injection analysis system based on glucose oxidase-quantum dot modified pencil graphite electrode. Talanta. (147): 315-321.

28 Saryono. 2008. Isolasi dan karakterisasi inulase dari Aspergillus niger Gmn11.1 galur lokal. J Natur Indonesia 11: 19-23. Scholz F, Bond AM, Compton RG, Fiedler DA, Inzelt G, Kahlert H, Lovric SK, Lohse H, Lovric M, Marken F, Neudeck A, Retter U, Stojek Z. 2010. Electroanalytical Methods Second Edition. Berlin (DE): Springer. Selena E. 2014. Pemurnian dan Karakterisasi Glukosa Oksidase dari Isolat Lokal Aspergillus niger (IPBCC.08610) [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sherbeny El G Shindia, Sheriff† YMMM. 2005. Optimization of various factors affecting glucose oxidase activity produced by Aspergillus niger. Int J Agri Biol. 7: 953 - 958. Simpson C. 2005. Isolation, purification and characterization of a novel glucose oxidase from Penicillium canescens Tt42 [tesis]. Grahamstown (ID): Rhodes University. Simpson C, Jordaan J, Gardiner NS, Whiteley C. 2007. Isolation, purification and characterization of novel glucose oxidase from Penicillium sp. CBS 120262 optimally active at neutral Ph. Protein Express Purif. 51: 260266. Singh S, Pratima RS, MK Pandey, BD Malhotra. 2005. Covalent immobilization of cholesterol esterase and cholesterol oxidase on polyaniline films for application to cholesterol biosensor. Analytica Chimica Acta. 568(2006): 126-132. Singh J, Verma N. 2010. Partition of glucose oxidase from Aspergillus niger in aqueous two-phase systems based on salt and polyethylene glycol. Braz. Sukhacheva MV, Davydova ME, Netrusov AI. 2004. Production of Penicillium funiculosum 433 glucose oxidase and its properties. Appl Biochem Microbiol 40: 25-29. Surianty. 2014. Enymatic fuel cell (FEC) menggunakan bioanoda komposit karbon-nanopartikel polianilin yang teramobilisasi glukosa oksidase (GOD) [tesis]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Tang W, Li L, Zeng X. 2015. A glucose biosensor based on the synergistic action of nanometer-sized TiO2 and polyaniline. Talanta. 131:417-423. Triana R. 2012. Pemurnian dan karakterisasi enzim glukosa oksidase dari isolat lokal Aspergillus niger (IPBCC.08.610) [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Wang HJ, Zhou CM, Peng F, Yu H. 2007. Glucose biosensor based on platinum nanoparticles supported sulfonated-carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Int J Electrochem Sci. 2:508-516. Zhang H, Wang J, Gao X, Wang Z, Wang S. 2014. The electrochemical activity of polyaniline: an important issue on its use in electrochemical energy storage devices. Synthetic Metals. 187: 46-51. Zhu J, Chen M, Qu H, Zhang X, Wei H, Luo Z, Colorado HA, Wei S, Guo Z. 2012. Interfacial polymerized polyaniline/graphite oxide nanocomposites toward electrochemical energy storage. Polymer. 53: 5953-5964.

29

LAMPIRAN

30 Lampiran 1 Bagan alir penelitian Produksi dan isolasi enzim GOD dari isolat lokal A.niger Uji aktivitas dan kadar protein GOD ekstrak kasar dan fraksi ammonium sulfat Fraksinasi amonium sulfat 20-80%

Penentuan parameter kinetika enzim

Pembuatan EPK dan EPKT dengan variasi ukuran diameter dan panjang pasa karbon

Uji kinerja EPK variasi diameter tembaga (1 mm dan 3 mm)

Uji kinerja EPK terbaik dan EPKT

Amobilisasi GOD pada EPKT dengan variasi konsentrasi glutaraldehid 2.5%

Uji kinerja GOD/EPKT terhadap pengaruh konsentrasi glukosa (0.2-8 mM) secara voltametri

Penentuan parameter kinetika enzim

Uji Stabilitas EPKT

31 Lampiran 2 Kurva Standar Glukosa dan Contoh Perhitungan Kadar Protein Tabel 1 Kurva Standar protein [BSA] (µg/mL) 0.00 2.50 12.5 25.0 50.0 75.0 100 150 200

A blanko 0.045 0.344 0.411 0.482 0.611 0.744 0.867 1.119 1.363

A terukur 0.045 0.151 0.218 0.297 0.427 0.545 0.673 0.933 1.173

A terkoreksi 0.00 0.106 0.173 0.252 0.382 0.500 0.628 0.888 1.128

Contoh perhitungan kadar protein fraksi amonium sulfat 80% y = 0.0053x + 0.0872 1.3225 = 0.0053x + 0.0872 x = 233.075 µg/mL Kadar protein = 233.075 µg/mL x FP = 233.075 µg/mL x 2 = 0.466 mg/mL Protein total

= 0.466 mg/mL x 15 mL = 6.99 mg

32 Lampiran 3 Contoh perhitungan aktivitas GOD pengendapan amonium sulfat 80% Aktivitas (

U

mL

ΔA x volume total x FP menit

) =

=

8.3 x volume enz im 0.4847−0.0451 x 300 x 6 0.5

8.3 x 10

= 12.711 U/mL Aktivitas total (U) = 12.711 U/mL x 15 mL = 190.669 U Aktivitas spesipik = Yield (%)

= =

190.669 U 6.99 mg

= 27.277 U/mg

aktivitas total praksi aktivitas ekstrak kasar 190.669 U 261.687 U

x 100%

x 100%

= 72.861% Tingkat Kemurnian

aktivitas spesipik praksi

= aktivitas spesipik ekstrak kasar =

27.277 U/mg 1.349 U/mg

= 20.22 kali

33 Lampiran 4 Kinetika GOD hasil pengendapan amonium sulfat 80% [glukosa] (M) 1/[glukosa](M-1) V (U mg-1) 1/V (U-1 mg) 0.008 125 1.57 0.64 0.012 83.33 2.13 0.47 0.016 62.5 2.61 0.38 0.02 50 3.08 0.32 0.024 41.67 3.59 0.28 0.028 35.71 3.91 0.26 0.032 31.25 4.36 0.23 0.04 25 5.2 0.19 y = 0.0027x + 0.0482 1

𝐾𝑚

1

1

= 𝑉𝑚𝑎𝑘𝑠 [𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎] + 𝑉𝑚𝑎𝑘𝑠 𝑉𝑜 1 Vmaks

= 0.0482

Vmaks = 20.747 U/mg 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑘𝑠

= 0.0027

Km = 0.056 M = 56 mM µ𝑔 𝑒𝑛𝑖𝑚/𝑚𝑙

[Et] = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝑒𝑛𝑖𝑚 (µ𝑔/𝑚𝑜𝑙 Asumsi bobot molekul = 157 kDa = 157 x 103 µg/ml [Et] =

149.15 𝑥 1000 µ𝑔/𝑚𝑙 157 𝑥 1000 µ𝑔/𝑚𝑙

Bilangan putaran = Bilangan putaran =

= 0.95 µmol/ml

𝑉𝑚𝑎𝑘𝑠 [𝐸𝑡] 20.747 µ𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡−1 𝑥 149.15 𝑚𝑔 𝑚𝑙−1 0.95 µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑙

= 3180 menit-1 = 53 s-1

34 Lampiran 5 Voltamogram siklik pengulangan EPK dan EPKT

(a)

(b) Gambar Voltamogram siklik pengulangan EPK diameter tembaga 3mm (a); dan EPKT diameter tembaga 3mm (b).

Tabel Nilai arus dan tegangan EPK dan EPKT Elektroda Ulangan EPK 1 2 3 EPKT 1 2 3

Tegangan (V) 0.435 0.965 0.665 0.830 0.925 0.990

Arus (mA) 0.228 0.205 0.365 0.974 0.863 1.100

Arus Tertinggi 0.365

1.100

35 Lampiran 6 Voltamogram siklik pengulangan GODIPB|EPKT dan GODamoIPB|EPKT

(a)

(b) Voltamogram siklik pengulangan GODIPB|EPKT (a); dan GODamo-IPB|EPKT (b)

Tabel Nilai arus dan tegangan EPK dan EPKT Elektroda Ulangan GODIPB|EPKT 1 2 3 GODamo1 IPB|EPKT 2 3

Tegangan (V) 1.490 1.670 1.705

Arus (mA) 1.503 1.855 1.930

Arus Tertinggi 1.930

1.365 1.405 1.500

3.269 3.460 3.980

3.980

36

Lampiran 7 Kinetika GODamo-IPB|EPKT 1/[glukosa](M-1) 5.00 2.50 1.67 1.25 1.00 0.83 0.71 0.62 0.55 0.50

[glukosa] (M) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

I (mA) 0.413 0.688 0.831 1.116 1.350 1.569 2.371 2.671 2.972 3.869

Contoh perhitungan Km dan vmaks GODamo-IPB|EPKT y = 0.5795x + 0.201 1 Km 1 1 = + Vo Vmaks [glukosa] Vmaks 1 = 0.201 Vmaks Vmaks = 4.975 U/mg Km = 0.5795 Vmaks

Km = 2.88 mM Sensitivitas =

𝐴𝑟𝑢𝑠 𝑡𝑒𝑟𝑡𝑖𝑛𝑔𝑔𝑖−𝐴𝑟𝑢𝑠 𝑡𝑒𝑟𝑒𝑛𝑑𝑎ℎ [𝑆]𝑡𝑒𝑟𝑡𝑖𝑛𝑔𝑔𝑖−[𝑆]𝑡𝑒𝑟𝑒𝑛𝑑𝑎ℎ

=

3.869 𝑚𝐴−0.413 𝑚𝐴 2𝑚𝑀−0.2 𝑚𝑀

= 1.92 mA/mM Bilangan putaran = Bilangan putaran =

𝑉𝑚𝑎𝑘𝑠 [𝐸𝑡] 4.975 µ𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡−1 𝑥 149.15 𝑚𝑔 𝑚𝑙−1 0.95 µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑙

= 781.075 menit-1 = 13 s-1

1/I (mA-1) 3.025 1.651 1.335 0.967 0.784 0.672 0.437 0.386 0.346 0.332

37 Lampiran 8 Biakan A.niger, GOD ekstrak kasar, dan GOD raksi pengendapan ammonium sulat 80%

(a) (b) (c) Biakan A.niger (a); GOD ekstrak kasar (b); dan GOD fraksi amonium sulfat 80% (c)

Glukosa oksidase

Gambar mekanisme A.niger menghasilkan GOD (Indriani et al. 2015)

38 Lampiran 9 Elektroda pasta karbon

Pasta karbon Pipa kapiler

tembaga 1mm

3mm

(a) (b) Elektroda dengan ukuran diameter tembaga 1mm dan 3mm (a); dan Elektroda dengan diameter tembaga 3mm dan panjang pasta karbon 10mm (b)

Lampiran 10 Alat potensiometer dan pengukuran elektroda pada larutan uji

(a)

(b)

Alat potensiometer (a); dan pengukuran ketiga elektroda pada larutan elektrolit

Amobilisasi GOD pada EPKT

39

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Serang pada tanggal 6 Oktober 1990 sebagai anak ketiga dari empat bersaudara, pasangan M. Yamin dan Siti Rohimah. Pendidikan sarjana ditempuh oleh Penulis di Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor pada tahun 2008 melalui jalur USMI dan lulus pada Maret 2013. Pada tahun 2014, penulis diterima di Departemen Biokimia pada Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor (IPB). Selepas mengenyam pendidikan S1 Biokimia, Penulis mengerjakan proyek di Laboratorium Bioteknologi LIPI, Cibinong. Selanjutnya Penulis bekerja di Laboratorium Biokimia Balai Besar Biogen. Penulis juga pernah menjadi Guru Bahasa Inggris di Sekolah Alam Cendikia. Sebelum memasuki kuliah pascasarjana, Penulis aktif di kegiatan masyarakat sebagai Pendamping Kader Posyandu (PKP) atau penyuluh kesehatan di Kecamatan Dramaga. Selama mengikuti perkuliahan pascasarjana penulis pernah menjadi asisten praktikum S1 mata kuliah Biokimia Umum; dan Teknologi Asam Nukleat juga asisten prarktikum S2 mata kuliah Keteknikan Biokimia; dan mata kuliah Kinetika dan Aplikasi Enzim. Selain itu, penulis juga bekerja sebagai supervisor Beastudi Etos Dompet Duafa Wilayah Bogor. Tulisan-tulisan ilmiah yang pernah dibuat oleh penulis diantaranya MAPASA (Metode Pengembangan Sistem Pendidikan Berbasis Aplikasi Sains Peningkat Daya Kreatifitas dan Inovasi Siswa di SDN Carangpulang 1 Kabupaten Bogor); Pemanfaatan Ekstrak Kunyit (Curcuma domestica Val.) dari berbagai daerah di Indonesia sebagai Antioksidan dan Antiinflamasi; Karakterisasi ketahanan galur cabai mutan somaklonal (M4) hasil kultur in vitro yang di kombinasi dengan mutagen kimia ems terhadap Chilli veinal mottle virus; Analisis Oligosakarida hasil hidrolisis Amilase dari Pati Kentang Hitam Menggunakan di Balai Besar Biogen Laboratorium Biokimia sp.; Penentuan glukosa pada buah menggunakan metode terbarukan berbasis glukosa oksidase dari kapang lokal Aspergillus niger IPBCC.08.610; Glukosa oksidase dari Aspergillus niger IPBCC.08.610 pada permukaan elektroda pasta karbon termodiikasi sebagai biosensor glukosa.