KAFR: ÚÈINNÁ LÁTKA S NEZNÁMÝM MECHANIZMEM PÙSOBENÍ

Pùvodní práce

KAFR: ÚÈINNÁ LÁTKA S NEZNÁMÝM MECHANIZMEM PÙSOBENÍ CAMPHOR: AN EFFECTIVE COMPOUND WITH AN UNKNOWN MECHANISM OF ACTION LENKA MARŠÁKOVÁ1,2, VIKTORIE VLACHOVÁ2 Univerzita Karlova, Pøírodovìdecká fakulta, Katedra fyziologie živoèichù, Praha 2 AV ÈR, Fyziologický ústav, Praha

1

SOUHRN Nìkteré pøírodní terpenoidní látky velmi úèinnì modulují aktivitu specifických receptorù, které patøí ke skupinì TRP (transient receptor potential) iontových kanálù. Tyto strukturálnì pøíbuzné receptory jsou exprimovány na volných nervových zakonèeních primárních nociceptorù, kde zprostøedkovávají pøevod bolestivých podnìtù na nervovou signalizaci. Modulaèní vlastnosti terpenoidù jsou proto intenzivnì studovány z hlediska slibných pøístupù pro vývoj nových látek modulujících bolest. Pro nociceptory je charakteristická pøítomnost dosud nejvíce prozkoumaného zástupce TRP iontových kanálù, vaniloidního receptoru 1 (TRPV1). Tento receptor je z evoluèního hlediska klíèovou molekulou v pøenosu nociceptivních signálù z periferie do centrálního nervového systému. TRPV1 je aktivován nejen podnìty vyvolávajícími bolest, jakými jsou zvýšená teplota, snížené pH, kapsaicin, ale také látkami bolest nepùsobícími. Takovouto látkou je monoterpen kafr. I pøesto, že pøesný molekulární mechanizmus pùsobení není znám, má využití kafru z dùvodu jeho analgetických a protizánìtlivých vlastností v tradièní medicínì dlouhou historii. V nedávné dobì byl popsán úèinek kafru na TRPV1 iontový kanál, spoèívající v aktivaci a následné silné desenzitizaci. Tato schopnost kafru by mohla být spoleènì s modulací dalších zástupcù TRP rodiny iontových kanálù pravdìpodobnou podstatou jeho analgetických vlastností. K cílenìjšímu využití tìchto vlastností je však zapotøebí znalost pøesnìjšího mechanizmu pùsobení a jeho dalších potenciálních bunìèných a molekulárních cílù. Pøedmìtem tohoto èlánku je nejen shrnout známé vlastnosti a možnosti využití kafru, ale pøedevším uvést nejnovìjší poznatky a otázky, kterými se zabývá základní výzkum smìøující k odhalení mechanizmu úèinku kafru na senzorické neurony. Klíèová slova: TRPV1, kafr, kapsaicin, vaniloidní receptor, nocicepce

SUMMARY Some of natural terpenoid compounds very effectively modulate the activities of specific receptors that belong to the TRP (transient receptor potential) ion channel family. These structurally related receptors are expressed on the free nerve endings of primary afferent neurons that mediate the transduction of painful stimuli on neural signaling. Modulation properties of terpenoids are therefore intensively studied on purpose of promising developing new compounds modulating pain. Nociceptors are characteristic by the presence of the most representative receptor of the TRP ion channel family, the vanilloid receptor 1 (TRPV1). From evolutionary point of view, this channel is a key molecule in the transduction of nociceptive signals from periphery to the central nervous system. TRPV1 is activated not only by the stimuli that produce pain, such as increased temperature, decreased pH, capsaicin, but also by substances that do not evoke painful sensation. One such substance is the monoterpenoid compound camphor. Although the exact molecular mechanism of its action is unknown, it has a long history of use due to its analgesic and anti-inflammatory properties in traditional medicine. Recently, the modulatory effects of camphor on TRPV1 channel were described and activation followed by a subsequent strong desensitization have been demonstrated both in native and heterologous expression systems. This camphor ability, together with the modulation of some other representatives of the TRP ion channel receptor family, is thought to underlie some of its analgesic properties. For the rational use of camphor, it is necessary to have more accurate knowledge regarding its mechanism of action and to consider other potential cellular and molecular targets. The aim of this article is not only to summarize well-known characteristics and applications of camphor in traditional medicine, but also review the recent findings and questions of the basic research dealing with the mechanisms of camphor action on sensory neurons. Key words: TRPV1, camphor, capsaicin, vanilloid receptor, nociception

Úvod Využívání úèinku léèivých rostlin je pravdìpodobnì stejnì staré jako lidstvo samo. Rostlinné látky sloužily èlovìku jako jediný zdroj k léèbì onemocnìní až do 18. století. Rozvoj farmaceuticko-chemického prùmyslu a výroba syntetických léèiv vytlaèila fytofarmaka na nìjaký èas do pozadí. Situace se však zmìnila zejména v souvislosti s hlubším poznáním bunìèných a molekulárních mechanizmù fyzio16

logických procesù a s dramatickým rozvojem genomických technologií. V souèasné dobì jsou látky rostlinného pùvodu stále èastìji souèástí moderní medicíny a zásadním zpùsobem pøispívají k rozvoji nových terapeutických pøístupù a léèiv. Pro jejich klinické využití je však nezbytné znát jejich pøesné molekulární cíle a mechanizmus pùsobení. Díky souèasnému stavu vìdeckého poznání jsou mnohé pùvodní pøedstavy o mechanizmech pùsobení pøírodních BOLEST  ROÈNÍK 15  2012  ÈÍSLO 1

Vlastnosti kafru byly podrobnì charakterizovány nejen z hlediska bioaktivních úèinkù, ale také v souvislosti s jeho typickými fyzikálními a chemickými vlastnostmi (box 1). Zejména je známa schopnost kafru ovlivòovat aktivitu membránovì vázaných enzymù snížením fluidity, zmìnou anizotropie a povrchového náboje membrán (Turina et al., 2006). V chemickém prùmyslu se kafr používá pøi výrobì jiných terpenických látek, výbušnin, pøi výrobì celuloidu z nitrocelulózy èi jako složka repelentù, lakù a barev. Mimoøádnou pozornost však pøitahuje tato látka napøíklad také v oblasti vývoje moderních nanotechnologií šetrných k životnímu prostøedí, kde je využívána jako zdroj unikátního botanického uhlovodíku k výrobì nanovláken (Kumar et al., 2007). Kafr je podobnì jako jiné monoterpeny vysoce hydrofobní látkou, která zmìnami fyzikálních vlastností bunìèné membrány vyvolává zmìny aktivity rùzných membránových receptorù (Park et al., 2001). Tato schopnost kafru podstatným zpùsobem velmi komplikuje možnost identifikace specifických míst na cílových molekulách, protože není jen záležitostí interakce typu „receptor-ligand“, ale zahrnuje také prostøedí okolní membrány.

BOLEST  ROÈNÍK 15  2012  ÈÍSLO 1

Výsledky naší laboratoøe ukazují, že mezi velmi dùležité receptory inhibované kafrem se øadí nikotinické acetylcholinové receptory (nAChR). Inhibice proudových odpovìdí vyvolaných acetylcholinem nebo nikotinem byla zjištìna v heterologních expresních systémech, a to jak pro krysí neuronální 3β4, tak pro lidský embryonální typ svalového nikotinického receptoru (Krusek et al., 2011). Na základì modulace tìchto receptorù by mohla být vysvìtlena zatím neobjasnìná toxicita kafru pøi jeho požití: jednou z pøíèin by mohla být právì inhibice nAChR jako klíèového receptoru nervosvalového spojení, neboś otrava kafrem je doprovázená epilepsií a záchvaty. Na druhou stranu by mohl kafr jako inhibitor nAChR být slibným kandidátem pro terapeutické využití, napø. pøi léèbì závislosti na nikotinu (Park et al., 2001). Slabé potenciaèní úèinky kafru byly prokázány také u GABA receptorù, které jsou spoleènì s glycinovými receptory hlavními inhibièními receptory úèastnícími se synaptického pøenosu v CNS, což pøedstavuje jeden z možných mechanizmù analgetických úèinkù kafru (Hall et al., 2004). Podle nejnovìjších poznatkù mùže být analgetický úèinek kafru zprostøedkován specifickou skupinou iontových kanálù, které jsou exprimovány na periferních zakonèeních primárních aferentních senzorických neuronù (nociceptorù) a nìkteré také na keratinocytech (obr. 1). Tato rodina strukturálnì pøíbuzných iontových kanálù je oznaèována „transient receptor potential“ (dále jen TRP). Fyziologicky se TRP receptory uplatòují ve vnímání teplotních, chemických a osmotických podnìtù a kafr nìkteré z tìchto receptorù velmi úèinnì moduluje. Molekulární cíle kafru Základní pøedpoklad pøežití organizmu je dán jeho schopností reagovat na zmìny okolního prostøedí. Vìtšina živoèichù má pro tyto úèely vyvinutý specializovaný detekènì-obranný systém, který je složen z nociceptorù. Nociceptory jsou schopny detekovat rùzné typy podnìtù, odlišit neškodné od zdraví škodlivých a následnì vyvolat adekvátní odpovìï. Tato schopnost nociceptorù je závislá na jejich kapacitì, respektive na expresi specializovaných proteinù zajišśujících tento proces. K tomuto úèelu je na jejich membránách exprimována øada iontových kanálù citlivých na rùzné chemické, mechanické a fyzikální podnìty. Mezi tyto proteiny patøí i teplem aktivovaní zástupci TRP iontových kanálù vèetnì vaniloidního receptoru (TRPV1). V roce 2011 Mishra a kolegové publikovali výsledky studie na myších s ablací TRPV1 genové linie (Mishra et al., 2011). Dospìlé myši se pøekvapivì vyznaèovaly nejen ztrátou teplotní citlivosti, ale i citlivosti chladové, aniž by byla porušena schopnost reagovat na mechanické podnìty. Pokusy potvrdily nejen deleci TRPV1 receptorù, ale také absenci chladem aktivovaných receptorù TRPM8 a TRPA1. Souèasnì nepodpoøily roli TRPV1 receptorù v mechanické citlivosti. Dominantní exprese TRPV1 receptorù bìhem embryogeneze slouží pøi postnatálním vývoji zøejmì k jejich diferenciaci na øadu dalších receptorových subtypù exprimujících se na somatosenzorických neuronech. Zajímavým zjištìním bylo, že koexprese TRPV1 receptoru s jeho deriváty není nezbytná, pouze 25 % neuronù exprimujících TRPM8 obsahuje i TRPV1. Kromì nociceptorù je na kera17

Pùvodní práce

látek èasto pøehodnocovány; objev nových proteinových struktur a zjištìní jejich vysoce specifické citlivosti k tìmto látkám zahájily souèasnou etapu intenzivního farmakologického výzkumu, jehož cílem je vývoj nových úèinných lékù. Kafr je pøírodním monoterpenem, který je po tisíciletí používán pøedevším v Japonsku, Koreji, Indonésii, Èínì, Jižní Americe a v arabských zemích nejen pro svou charakteristickou aromatickou vùni jako souèást kosmetických pøípravkù, nápojù a jídel, ale zejména k léèebným úèelùm. Využití si našel pøedevším v tradièním léèitelství díky svým analgetickým, antiseptickým, protizánìtlivým a protisvìdivým úèinkùm. Nejèastìji je kafr aplikován ve formì mastí, gelù a inhalátorù na zmírnìní bolestí zad, zánìtù, revmatických obtíží, pøi osteoartritidì, respiraèních onemocnìních, ale také pøi léèbì oparù, bradavic, hemeroidù èi únavì svalù. Aplikace kafru na kùži vyvolává typický pocit tepla doprovázený pozmìnìným vnímáním chladu (Green, 1990). Díky své lipofilicitì je kùží a sliznicí kafr rychle vstøebáván, zpùsobuje lokální prokrvení a urychluje tak zánìtlivou reakci (box 1). V Èeské republice je podle informací poskytovaných Státním ústavem pro kontrolu léèiv kafr evidován jako úèinná látka u dvou léèivých pøípravkù a u ètyø jako látka pomocná (8. 8. 2011). Léèivé pøípravky obsahující kafr jsou užívány pøi onemocnìních dýchacích cest resp. pøi kašli, nachlazení a chøipce, ve formì masti jsou indikovány pøi bolestech svalù a kloubù, k reflexní terapii bolestivých stavù dermatických a subdermatických oblastí. Dalšími indikacemi jsou paliativní terapie algických stavù kloubù pøi artritidì, periartritidì a jiných revmatických bolestech, vèetnì bolestivých stavù mìkkých tkání a doplòková léèba dny. Jako pomocná látka je kafr pøítomen také v pøípravku pro zmírnìní pocitu únavy svalù, kloubù a urychlení regenerace pohybového ústrojí, proti kašli, v nosním spreji pøi nachlazení a alergické rýmì, ale také v šamponu pøi léèbì pedikulózy.

Pùvodní práce

tinocytech exprimován také další zástupce vaniloidních receptorù TRPV3. Vlastností spojující výše zmínìné receptory je kromì teplotní aktivace i jejich modulace kafrem. Kafr je znám jako aktivátor savèích TRPV1, TRPV3 a TRPM8 receptorù; naproti tomu pùsobí jako inhibitor TRPA1 (Macpherson et al., 2006; Moqrich et al., 2005; Xu et al., 2005). Za analgetické úèinky kafru je pravdìpodobnì zodpovìdná souhra jeho úèinkù na jednotlivé typy iontových kanálù, která je druhovì konzervovaná (Xu et al., 2005). Díky novým poznatkùm o schopnosti kafru modulovat specifické proteinové struktury na nociceptorech je poznání pøesného mechanizmu jeho úèinku velmi slibným smìrem výzkumu možností léèby periferních forem bolesti.

Obrázek 1: Schéma pùsobení kafru prostøednictvím TRP iontových kanálù. Kafr je pøírodní monoterpen (struktura znázornìna vpravo nahoøe), pùvodnì byl získáván ze skoøicovníku kafrového a používán v tradièní medicínì na celou øadu onemocnìní (napø. na bolesti kloubù, zad atd.). Kafr byl prokázán jako modulátor nìkolika zástupcù TRP rodiny iontových kanálù exprimovaných na periferních zakonèeních aferentních senzorických neuronù (TRPV1, TRPM8, TRPA1) a na keratinocytech (TRPV3).

Dosud bylo identifikováno více než 50 zástupcù TRP rodiny iontových kanálù s rozmanitými biofyzikálními a fyziologickými funkcemi v celé øadì organizmù vèetnì kvasinek, èervù, octomilky, myši a èlovìka. Kromì TRP kanálù v kvasinkách se tito zástupci dìlí do sedmi podrodin: TRPC, TRPV, TRPM, TRPA, TRPN (absence u myší a èlovìka), TRPP a TRPML (Li et al., 2011; Nilius et al., 2005). Kromì rozmanitých funkcí jsou savci schopni díky tìmto kanálùm rozeznávat teploty v øádech od extrémní zimy (∼ -10 oC) až k extrémnímu teplu (∼ 60 oC). TRPV1 je aktivován teplotou pøesahující 43 oC, která u zdravého èlovìka pøedstavuje bolestivý podnìt. Spoleènì s dalšími èleny TRP iontových kanálù – TRPV2 (>53 oC), TRPV3 (> 33 oC), TRPV4 (> 25 oC), TRPM8 (< 23 oC) a TRPA1 (< 17 oC) – pokrývají celý teplotní rozsah, a jsou proto oznaèovány teplotními senzory organizmu (Clapham, 2003). Vaniloidní receptor 1 (TRPV1) byl v roce 1997 identifikován jako receptor, který je na nociceptorech specificky aktivován pálivou substancí chilli paprièek, kapsaicinem (Caterina et al., 1997). Tato látka je typická svým analgetickým úèinkem, na nìmž se zøejmì podílí schopnost 18

kapsaicinu desenzitizovat TRPV1 kanál (Szolcsanyi, 2004). Vazebné místo pro kapsaicin i mechanizmus pùsobení rùzných vaniloidù a kompetitivních antagonistù na TRPV1 kanál jsou pomìrnì podrobnì probádány (více následující èást). S úspìchem je nyní analgetického úèinku kapsaicinu využíváno pøi léèbì lokálních neuralgií. Na èeském trhu jsou ve formì náplastí k dostání dva léèivé pøípravky s kapsaicinem. Úloha ostatních TRP iontových kanálù v nocicepci a v pøenosu bolestivé signalizace je však zatím mnohem ménì známa a je pøedmìtem zejména základního výzkumu. Struktura TRPV1 I pøes velkou snahu vìdcù získat terciární strukturu vysokého rozlišení celého TRPV1 kanálu je v souèasnosti známa jen jeho N-terminální cytoplazmatická èást tvoøená ankyrinovými doménami (Lishko et al., 2007). Pomocí elektronové kryomikroskopie byla získána struktura celého kanálu s nízkým rozlišením (19 Å). Tato struktura obsahuje transmembránovou èást i cytoplazmatické èásti TRPV1 kanálu podobající se tvarem „zavìšené gondole“, vytváøející na cytoplazmatické stranì membrány dutinu pro vstupující ionty (Moiseenkova-Bell et al., 2008). Na základì homologie TRP iontových kanálù s draslíkovými kanály, jejichž krystalová struktura je známa, a podle strukturálních modelù TRPV1 kanálu podpoøených funkèními studiemi je kanál komplexem ètyø stejných podjednotek (homotetramer). Každá jeho podjednotka je tvoøena šesti transmembránovými doménami (S1-S6), hydrofobní klièkou mezi pátou a šestou doménou, C- a N-terminálními cytoplazmatickými konci. Hydrofobní klièka mezi S5 a S6 je zèásti tvoøena krátkým helixem, který spoleènì s identickými èástmi dalších tøí podjednotek vytváøí selektivní pór kanálu, jímž procházejí ionty (obr. 2). Jako oblasti dùležité pro vazbu vaniloidù byly prokázány aminokyseliny v druhé, tøetí a ètvrté transmem-

Obrázek 2: Pohled shora do póru TRPV1 kanálu. Strukturní uspoøádání homotetramerního TRPV1 kanálu složeného z transmembránových helixù jednotlivých podjednotek oznaèených èísly (1–6) a z C- a N-koncù smìøujících do cytoplazmy. Klièky mezi pátým a šestým transmembránovým segmentem obsahující pórové helixy (znázornìny modøe) tvoøí hydrofobní kavitu umožòující prùchod Ca2+ a jednomocných kationtù do buòky. Chilli paprièky vyznaèují oblast druhého až ètvrtého transmembránového helixu vázající kapsaicin.

BOLEST  ROÈNÍK 15  2012  ÈÍSLO 1

Pùvodní práce

bránové doménì (R491, Y511, S512, M547, W549, T550), ale i nìkteré aminokyseliny na cytoplazmatických koncích (Touska et al., 2011; Wong et al., 2009). Souèasné poznatky o mechanizmu pùsobení kafru Do roku 2005 nebyla známa žádná práce zabývající se molekulárním mechanizmem pùsobení kafru. Tým autorù Haoxing Xu a spol. (Xu et al., 2005) poprvé ukázal, že kafr je schopen aktivovat heterolognì exprimovaný TRPV1 kanál, a to v daleko vyšší koncentraci (EC50 >3 mM), než je v pøípadì klasického agonisty kapsaicinu (EC50 = 0,3 μM). Aktivace TRPV1 kanálu kafrem je pøitom nezávislá na vazebném místì pro vaniloidy, neboś kafr je schopen vyvolat odpovìï receptoru i v pøítomnosti kompetitivního inhibitoru kapsazepinu, a to i v pøípadì mutantního receptoru necitlivého na kapsaicin. Aèkoli kafr aktivuje TRPV1 kanál ménì úèinnì než kapsaicin, desenzitizace vyvolaná kafrem je mnohem rychlejší a úèinnìjší. V této studii autoøi také ukázali, že kafr naopak inhibuje savèí TRPA1 receptor, který se spoleènì s TRPV1 nachází na membránách èásti neuronù ganglií zadních koøenù míšních (Xu et al., 2005). Souèasnì ve stejném roce jiná skupina ukázala, že kafr aktivuje také TRPV3 kanály exprimované na keratinocytech, nikoli však na senzorických neuronech (Moqrich et al., 2005). Bylo však také zjištìno, že opakovaná aplikace kafru vyvolává senzitizaci TRPV3 kanálù, což tedy nevysvìtluje analgetické vlastnosti této látky. Ve studii naší laboratoøe jsme se experimentálnì zabývali charakterizací kafrových odpovìdí zprostøedkovaných TRPV1 kanálem ve snaze nalézt místo, kde kafr s tímto receptorem interaguje (Marsakova et al., 2012). Využili jsme srovnání úèinkù kafru s lépe popsanými úèinky kapsaicinu, modulátorù a dalších aktivátorù TRPV1, jakými jsou napø. zvýšená teplota nebo okyselení vnìjšího prostøedí (obr. 3). Elektrofyziologickými technikami jsme zjistili, že v HEK293 buòkách, které exprimují TRPV1 receptor, kafr v koncentracích vyšších než ∼1 mM vyvolává membránové proudy, což odpovídá koncentracím ∼10 % používaným v mastích a jiných úèinných pøípravcích.

Obrázek 3: Membránové proudy vyvolané teplotní aktivací TRPV1 kanálù. Záznamy elektrofyziologických odpovìdí TRPV1 kanálù získané v heterologním expresním systému HEK293T (z angl. human embryonic kidney) pomocí metody patch clamp. K teplotní a chemické stimulaci kanálù v nepøítomnosti (vlevo) a v pøítomnosti kafru (vpravo, zelený proužek) byl použit perfúzní systém, který zajišśuje rychlou výmìnu roztokù a pøesné øízení teploty v bezprostøedním okolí bunìk. TRPV1 kanály byly aktivovány ohøátím roztoku nad 43 °C (prùbìh teploty vyznaèen èervenì). V pøítomnosti kafru dochází pøi aktivaci teplem k nárùstu membránových proudù, což je charakteristické pro alosterické pùsobení agonistù. Proudy byly snímány z celé buòky. Membránový potenciál byl udržován na -70 mV.

S ohledem na výsledky této studie a vzhledem k pozorované rychlosti kafrové aktivace byla jako jeden z možných kandidátù zodpovìdných za modulaci TRPV1 receptoru kafrem v naší studii vybrána helikální oblast mezi pátou a šestou transmembránovou doménou (obr. 6). Tato oblast je obecnì pokládána za souèást vrátkovacího mechanizmu

Základními charakteristikami odpovìdí TRPV1 kanálu vyvolaných kafrem jsou relativnì rychlá kinetika aktivace (1,7 ± 0,2 s), rychlý prùbìh akutní desenzitizace (T50 = 3,7 ± 0,3 s, na membránovém potenciálu -70 mV), velmi rychlá deaktivace (230 ± 18 ms; n = 17–26) a koncentraèní závislost aktivace o polovièní úèinné koncentraci pøibližnì 3 mM (obr. 4). Mechanizmus pùsobení kafru na TRPV1 kanál je typicky stavovì závislý. V pøípadì, že jsou nejdøíve TRPV1 kanály aktivovány kapsaicinem, je kafr schopen opakované potenciace kapsaicinové odpovìdi, a to do maximální hodnoty, tedy amplitudy dosahující výše odpovìdi TRPV1 kanálu na 10 μM kapsaicin (obr. 5). Vnìjší pór se úèastní kafrem zprostøedkovaných dìjù V pùvodní studii autorù laboratoøe profesora Davida Claphama v Bostonu z roku 2005 bylo zjištìno, že pro vyvolání kafrové odpovìdi nejsou dùležité oblasti TRPV1 receptoru zodpovìdné za vazbu kapsaicinu, tedy oblast druhé až ètvrté transmembránové domény (Xu et al., 2005).

BOLEST  ROÈNÍK 15  2012  ÈÍSLO 1

Obrázek 4: Membránové proudy vyvolané aktivací TRPV1 kanálù kafrem. Aktivace kafrem je koncentraènì závislá. Nízká koncentrace kafru (1 mM) vyvolala malou odpovìï, která nevykazovala žádnou desenzitizaci. Naopak vyšší koncentrace (10 mM) rychle aktivuje a desenzitizuje TRPV1 kanály. Délka aplikace kafru bìhem pokusu je nad záznamem vyznaèena zelenì. Membránový potenciál byl udržován na -70 mV.

19

Pùvodní práce Box 1: Charakteristika kafru

20

BOLEST  ROÈNÍK 15  2012  ÈÍSLO 1

Obrázek 5: Typický prùbìh potenciace kapsaicinové odpovìdi kafrem. Kafr potencuje kapsaicinem saturovaný TRPV1 kanál, míra potenciace se pøibližuje maximální hodnotì aktivace. Po opakované aplikaci vysoké koncentrace kapsaicinu (10 μM) kafr potencuje a následnì rychle blokuje aktivitu TRPV1 kanálù.

TRPV1 kanálu a je souèasnì nezbytná pro aktivaci a potenciaci TRPV1 protony. Kritickou roli tohoto pórového helixu v kafrové citlivosti TRPV1 se nám podaøilo prokázat pomocí zámìny helixu za analogický helix receptoru TRPV2, který je homologní s TRPV1 a není citlivý na kafr. Jako pravdìpodobné místo interakce TRPV1 receptoru s kafrem byla úloha pórového helixu podpoøena také výsledky získanými pomocí poèítaèového modelování, které simuluje vazbu

Závìr Nejnovìjší experimentální pøístupy výzkumu nervové soustavy na bunìèné a molekulární úrovni umožòují získávat podrobné informace o struktuøe a funkci membránových receptorù, o mechanizmech jejich aktivace a o fyziologické úloze, kterou tyto receptory hrají v nocicepci. Souèasné poznatky o strukturálních a funkèních vlastnostech TRPV1 kanálu potvrzují, že tento receptor pøedstavuje klíèovou molekulární strukturu, jejímž prostøednictvím senzorické neurony rozpoznávají podnìty ohrožující organizmus a jež se za patofyziologických podmínek podílejí na vzniku chronické bolesti. Pøes nezmìrné úsilí badatelù v mnoha laboratoøích celého svìta zùstává zatím mnoho otázek týkajících se fyziologického významu ostatních TRP iontových kanálù nezodpovìzeno. Zatím nevíme, zda v pøirozeném prostøedí

Obrázek 6: Pøedpokládaná místa dùležitá pro modulaci TRPV1 receptoru kafrem. Vlevo: Úèinky kafru na TRPV1 receptor nejsou pravdìpodobnì zprostøedkovány S2-S4 doménou, vèetnì vazebného místa pro kapsaicin (èervená struktura). Pomocí molekulárnì modelovacích metod byla navržena dvì hypotetická místa interakce proteinové struktury lidského TRPV1 s kafrem (zelená struktura). Prvním predikovaným místem bylo na intracelulární stranì místo exponované lipidùm, nacházející se mezi S1 a S2 transmembránovými doménami. Druhá navržená oblast byla pøímo v póru, na helixu spojujícím S5 a S6 domény. Velmi podobné výsledky byly získány pøi modelování krysího ortologu TRPV1 receptoru. Z experimentù zamìøených na studium obecného vlivu kafru na membránové fosfolipidy není však vylouèen ani mechanizmus nepøímý, a to modulace TRPV1 receptoru prostøednictvím fosfatidylinositolu-4,5-bisfosfátu (PIP2, hnìdo-èerná struktura). Na C-konec TRPV1 receptoru se váže zakotvující protein AKAP79/150 (modrá barva), který prostøednictvím svých vazebných míst pro proteinkinázy A (PKA), C (PKC) a fosfatázu 2B (PP2B) reguluje aktivitu tohoto receptoru. Vpravo: Sekvenèní srovnání pórového helixu TRPV1 s dalšími dvìma zástupci vaniloidních receptorù. Modøe jsou zvýraznìny konzervativní aminokyseliny, mezi zástupci citlivými na kafr, TRPV1, TRPV3 a receptorem TRPV2 necitlivým na kafr. BOLEST  ROÈNÍK 15  2012  ÈÍSLO 1

21

Pùvodní práce

ligandu na homologní model receptoru. Druhým pravdìpodobným místem interakce kafru s TRPV1 receptorem je na základì modelu oblast mezi první a druhou transmembránovou oblastí, tyto predikce však bude v dalším výzkumu tøeba dùkladnì provìøit. Výsledky našich studií podporují hypotézu pøímé aktivace TRPV1 receptoru kafrem bez úèasti vaniloidního místa, a to za pøispìní pórového helixu mezi pátou a šestou transmembránovou doménou. Kafrové odpovìdi by mohly být odrazem rychlé zmìny konformace (pøeklápìní) pórového helixu. Na rozdíl od desenzitizace vyvolané kapsaicinem je kafrem vyvolaná desenzitizace TRPV1 rychlejší, inteznivnìjší a nezávislá na extracelulární koncentraci Ca2+. Pøi aktivaci kafrem se také zøejmì zásadnì neuplatòuje úloha fosfolipidù, kináz a fosfolipáz, jako je tomu v pøípadì kapsaicinu.

Pùvodní práce

je úèinek kafru zprostøedkován zejména TRPV1 receptory, nebo zda se uplatòuje prostøednictvím jiných receptorù, napø. TRPV3 nebo TRPA1. Vzhledem k silné schopnosti zvyšovat aktivitu TRPV1 kanálu v pøítomnosti nízkých, podprahových koncentrací jiných agonistù (napøíklad endogenních vaniloidù, jakými jsou napøíklad anandamid a N-arachidonoyl-dopamin; Starowicz et al., 2007), nebo pøi zvýšené teplotì, mùže být fyziologicky relevantním úèinkem potenciace, nikoliv aktivace. Výzkum smìøující k odhalení mechanizmu úèinku kafru na senzorických neuronech není motivován jen snahou objasnit benefièní úèinky látek, které jsou již po tisíciletí využívány, ale pøedevším zájmem o hlubší porozumìní mechanizmùm chronických bolestivých stavù a cílené hledání prostøedkù pro jejich léèení.

10. Marsakova L, Touska F, Krusek J, Vlachova V. Pore helix domain is critical to camphor sensitivity of TRPV1. Anesthesiology. 2012; doi:097/ ALN.0b013e318249cf62.

Práce byla podpoøena Grantovou agenturou Èeské republiky (305/09/0081), grantem GA UK 25409 a Výzkumným projektem AV ÈR (AV0Z 50110509).

15. Park TJ, Seo HK, Kang BJ, Kim KT. Noncompetitive inhibition by camphor of nicotinic acetylcholine receptors. Biochem Pharmacol. 2001;61:787-793.

11. Mishra SK, Tisel SM, Orestes P, Bhangoo SK, Hoon MA. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 2011;30:582-593. 12. Moiseenkova-Bell VY, Stanciu LA, Serysheva, II, Tobe BJ, Wensel TG. Structure of TRPV1 channel revealed by electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:7451-7455. 13. Moqrich A, Hwang SW, Earley TJ, Petrus MJ, Murray AN, Spencer KS, Andahazy M, Story GM, Patapoutian A. Impaired thermosensation in mice lacking TRPV3, a heat and camphor sensor in the skin. Science. 2005;307:1468-1472. 14. Nilius B, Voets T, Peters J. TRP channels in disease. Sci STKE. 2005;2005:re8.

16. Starowicz K, Nigam S, Di Marzo V. Biochemistry and pharmacology of endovanilloids. Pharmacol Ther. 2007;114:13-33. Literatura:

17. Szolcsanyi J. Forty years in capsaicin research for sensory pharmacology and physiology. Neuropeptides. 2004;38:377-384.

1. Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 1997;389:816-824.

18. Touska F, Marsakova L, Teisinger J, Vlachova V. A „cute“ desensitization of TRPV1. Curr Pharm Biotechnol. 2011;12:122-129.

2. Clapham DE. TRP channels as cellular sensors. Nature. 2003;426:517524.

19. Turina AV, Nolan MV, Zygadlo JA, Perillo MA. Natural terpenes: selfassembly and membrane partitioning. Biophys Chem. 2006;122:101-113.

3. Green BG. Sensory characteristics of camphor. J Invest Dermatol. 1990;94:662-666.

20. Wong GY, Gavva NR. Therapeutic potential of vanilloid receptor TRPV1 agonists and antagonists as analgesics: Recent advances and setbacks. Brain Res Rev. 2009;60:267-277.

4. Hall AC, Turcotte CM, Betts BA, Yeung WY, Agyeman AS, Burk LA. Modulation of human GABAA and glycine receptor currents by menthol and related monoterpenoids. Eur J Pharmacol. 2004;506:9-16.

21. Xu H, Blair NT, Clapham DE. Camphor activates and strongly desensitizes the transient receptor potential vanilloid subtype 1 channel in a vanilloid-independent mechanism. J Neurosci. 2005;25:8924-8937.

5. Krusek J, Kaniakova M, Marsakova L, Vyskocil F. Monoterpenes camphor and menthol inhibit nicotinic acetylcholine receptors. Paper presented at: Nicotinic Acetylcholine Receptors 2011; May 2011, 2011; Hinxton. 6. Kumar, M., Ando, Y. Carbon nanotubes from camphor: An environment-friendly nanotechnology, Journal of Physics: Conference Series. 2007;61:643-646. 7. Li M, Yu Y, Yang J. Structural biology of TRP channels. Adv Exp Med Biol. 2011;704:1-23. 8. Lishko PV, Procko E, Jin X, Phelps CB, Gaudet R. The ankyrin repeats of TRPV1 bind multiple ligands and modulate channel sensitivity. Neuron. 2007;54:905-918. 9. Macpherson LJ, Hwang SW, Miyamoto T, Dubin AE, Patapoutian A, Story GM. More than cool: promiscuous relationships of menthol and other sensory compounds. Mol Cell Neurosci. 2006;32:335-343.

22

RNDr. Viktorie Vlachová, DrSc. Fyziologický ústav AV ÈR, v.v.i. Vídeòská 1083 142 20 Praha 4 E-mail: [email protected] Do redakce pøišlo: 4. 10. 2011 K publikaci pøijato: 22. 12. 2011

BOLEST  ROÈNÍK 15  2012  ÈÍSLO 1