Kadmium, ólom, szelén és ón meghatározása emberi agymintákból grafitkemencés atomabszorpciós módszerrel

SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

Kadmium, ólom, szelén és ón meghatározása emberi agymintákból grafitkemencés atomabszorpciós módszerrel

Doktori (Ph.D.) értekezés

SZOBOSZLAI NORBERT

Témavezető: Dr. Andrási Erzsébet és Dr. Barcza Lajos D.Sc.

ELTE, Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék

Budapest, 2002

Tartalomjegyzék

Oldal Bevezetés ....................................................................................................................

1

1. Irodalmi áttekintés................................................................................................

3

1.1. A vizsgált elemek biológiai szerepe ....................................................................

3

1.1.1. Szelén ...............................................................................................................

3

1.1.2. Kadmium ..........................................................................................................

7

1.1.3 Ólom .................................................................................................................

9

1.1.4. Ón ....................................................................................................................

11

1.2. A grafitkemencés atomabszorpciós spektroszkópia ..........................................

13

1.3. Cd, Pb, Se, Sn meghatározása emberi eredetű mintákból .................................

19

2. Kísérleti rész .......................................................................................................

23

2.1. Kísérleti körülmények .......................................................................................

23

2.1.1. A mérőberendezés ..........................................................................................

23

2.1.2. A felhasznált vegyszerek ................................................................................

24

2.2. Mintakezelés ......................................................................................................

26

2.2.1. Mintavétel ......................................................................................................

26

2.2.2. Mintatárolás ...................................................................................................

28

2.2.3. A minta szárítása ...........................................................................................

28

2.2.4. Feltárás ..........................................................................................................

30

2.2.4.1. Feltárás Parr-bombában .............................................................................

31

2.2.4.2. Feltárás mikrohullámú készülékkel ...........................................................

31

3. Eredmények és értékelésük ..............................................................................

35

3.1. GF-AAS módszer kifejlesztése ........................................................................

35

3.1.1. Az ólom és a kadmium meghatározása .........................................................

35

3.1.2. Szelén meghatározása ...................................................................................

37

3.1.3. Ón meghatározása .........................................................................................

42

3.2. Analitikai teljesítmény .....................................................................................

45

3.3. A mérési módszer hitelesítése ..........................................................................

47

3.3.1. Biológiai standard referenciaanyagok analízise ............................................

47

i

3.3.2. Szelén meghatározása neutronaktivációs módszerrel.......................................

48

3.4. A két feltárási technika összehasonlítása ............................................................

48

3.5. A különböző agyterületek elemkoncentrációi és a hozzájuk tartozó szórásértékek..............................................................................................................

49

3.6. A két agyi félteke elemkoncentrációinak összehasonlítása ...............................

55

3.7. Esszenciális és nem esszenciális elemek eloszlásának vizsgálata .....................

55

Eredmények megbeszélése és összefoglalás ..........................................................

57

Angol és magyarnyelvű összefoglalás (summary) ................................................

60

Irodalomjegyzék .....................................................................................................

62

Saját közlemények jegyzéke...................................................................................

72

Köszönetnyilvánítás.................................................................................................

74

ii

Bevezetés Az utóbbi évtizedekben jelentősen megváltozott a nyomelemek élettani szerepével kapcsolatos tudásanyag. Az analitikai módszerek fejlődése következtében a korábbiaknál nagyságrendekkel kisebb koncentrációkat tudunk meghatározni, egyre több elemről derül ki a biológiai rendszerekben betöltött szerepe, kölcsönhatásuk az élő szervezetekkel és ezek mechanizmusa. A kutatások alapján számos elem toxikusnak, míg más elemek esszenciálisnak bizonyultak. Az

általunk

vizsgált

négy

elem

biológiai

jelentőségét

széleskörűen tanulmányozzák napjainkban is. Az ólom és a kadmium toxikus nyomelemek, melyeket a fokozódó ipari termelés mind nagyobb mennyiségben halmoz fel környezetünkben. Az emberi szervezetbe jutva kis koncentrációban is káros hatásokat okoznak, melyek mechanizmusa még nem teljesen ismert. A szelén több enzimrendszerünkben

is

jelenlevő

esszenciális

elem,

biokémiai

antioxidáns funkciója miatt szerepe a rákkutatásban is felmerült. Az ón biológiai szerepéről nagyon kevés adat áll még rendelkezésre. A kémiai elemzés során döntő kérdés, hogy a meghatározandó komponens mellett jelenlevő egyéb, a mérést zavaró anyagok hogyan befolyásolják

a

mérés

érzékenységét,

megbízhatóságát.

Minél

nagyobb a kísérő anyagok (mátrix) mennyisége a mérendő elemhez képest,

annál

nehezebb

a

mérés

megbízhatóságát,

valamint

reprodukálhatóságát biztosítani, azaz az optimális mérést kivitelezni. Az elemzést akkor tudjuk elvégezni, ha az alkalmazott módszer érzékenysége

és

kimutatási

határa

megfelelő.

A

nyomelemek

meghatározásához szükséges, hogy a módszer kimutatási határa a ng/g (ppb – parts per billion) koncentráció tartományban illetve ez alatt legyen. Igen kis anyagmennyiségek mérésére jól használható a grafitkemencés atomabszorpciós spektrometria (GF-AAS – graphite furnace atomic absorption spectrometry). A mérés elve, hogy a gázhalmazállapotú atomok fényelnyelése arányos a koncentrációval.

1

Az AAS technika bevezetésekor alkalmazott láng atomforrással szemben a grafitkemence előnye, hogy a mintagőz tartózkodási ideje a fényútban 2-3 nagyságrenddel nagyobb, ami nagy érzékenységet és alacsony kimutatási határt eredményez. Az ELTE Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszékén dr. Andrási Erzsébet vezetésével évek óta folyik emberi agyminták vizsgálata. A korábbi kísérletek során behatóan tanulmányozták a mintavételi, -tárolási, -elõkészítési eljárásokat, valamint vizsgálták a különbözõ mérési metodikák alkalmazhatóságát emberi agyrészek nyomelemtartalmának meghatározására. A kutatások egyrészt az ún. elsõdleges idegrendszeri elváltozásban nem szenvedõk agyrészeinek vizsgálatára irányult, másrészt az egyes idegrendszeri betegségek (pl. Glioblastoma multiforme, Parkinson-kór, Alzheimer-kór, Sclerosis multiplex)

és

a

nyomelem-koncentrációk

változásai

közötti

lehetséges összefüggést vizsgálták [1, 2, 3, 4, 5]. Jelen dolgozat témája GF-AAS módszer kidolgozása kadmium, ólom, szelén és ón meghatározására emberi agymintákból, és ezen elemek normál koncentrációinak megállapítása. A kísérletek során tanulmányoztuk a különböző feltárási technikák alkalmazhatóságát agyminták esetén. Vizsgáltuk a kísérő anyagoknak a mérendő elemek atomabszorpciós jelére kifejtett hatását. Optimáltuk a vizsgálat körülményeit az abszorbancia-idő, az előhevítési és az atomizációs görbék

felvételével.

nemzetközi

Az

standard

elemzések

pontosságának

ellenőrzésére

referencia

anyagokat

használtunk.

Tanulmányoztuk az elemek eloszlásának jellegzetességeit az emberi agyban, és meghatároztuk az un. normál átlagértékeket.

2

1. Irodalmi áttekintés 1.1. A vizsgált elemek biológiai szerepe 1.1.1. Szelén A szelén a természetben négy különböző oxidációs állapotban fordul

elő,

elemi

szelén(0),

szelenid(-2),

szelenit(+4)

vagy

szelenát(+6) [6]. A szervetlen szelénvegyületek jelentős mértékben szaporodhatnak fel természetes vizekben. A növények általában szelenát

formájában

veszik

fel,

majd

aminosavakba

építik,

a

gabonafélék és a zöldségek is tartalmaznak szerves kötésű szelént. A szelént felhasználják színanyagként az üveg-, és a kerámiaiparban, fényérzékenysége miatt napelemekben, fotoelektronikai eszközökben, félvezető tulajdonsága miatt az elektronikai iparban [7]. A szelén az emberi szervezetbe a táplálékkal kerül be, amit nagymértékben

befolyásol

a

talaj

szeléntartalma.

Azokon

a

területeken, ahol a termőföldek szeléntartama alacsony, általános szelénhiány alakul ki, például Kína bizonyos területein. Ausztriai mérés

a

gabonák

szeléntartalmát

400

µg/kg-nak

mutatta.

Spanyolországi mérés alapján a gabonákban mérhető szelén 2-78 µg/kg között változik, a becsült napi szelénbevitel 15,4 µg/fő [8]. A szelén az ember számára esszenciális nyomelem. Az első enzim, amelyben szelén létezését igazolták a glutation peroxidáz volt 1973-ban [9]. Azóta számos fehérjéből izoláltak szelént, ezeket összefoglaló

néven

szelenoproteineknek

nevezzük.

A

szelenoproteinekben a szelén a ciszteinhez vagy a metioninhez kötődik, ezeket ″szelenocisztein″ és ″szelenometionin″ néven külön aminosavaknak tekintjük. Ma tizenegy szelenoproteint ismerünk: négyféle glutation peroxidáz, szelenoprotein P, szelenoprotein W, háromféle

iodothyronin

dejodináz,

thioredoxin

reduktáz,

szelenofoszfát szintetáz. A glutation peroxidázok általános funkciója

3

a szervezetben lévő peroxidok redukciójának elősegítése, vagyis sejtvédő hatás. A klasszikus vagy sejten belüli glutation peroxidáz [10] képes a hidrogén-peroxid, vagy bármely szerves peroxid redukciójára is. A bevitt szelén ebben az enzim formában raktározódhat is. Az enzim aktivitása csökken szelénhiányos táplálkozás következtében, ezért mérése használható a szervezet szelénállapotának meghatározására. A plazma vagy sejten kívüli glutation peroxidáz a vese proximális

tubulusaiban

szintetizálódik,

1987-ben

szintetizálták

emberi plazmából [11]. Funkciója a sejten belüli enzimhez hasonló. Ezen enzim aktivitása is csökken szelénhiány hatására. A gasztrointesztinális glutation peroxidázt a gyomorból, a májból, és a bélrendszerből mutatták ki, feltételezhetően fontos szerepet játszik az emésztés során képződő lipidhidroperoxidok elleni védelemben [12]. Kimutatták, hogy szelénhiányban szintézise kiemelt jelentőségű. A foszfolipid hidroperoxid glutation peroxidáz redukálja a zsírsavakból képződő peroxidokat a sejtmembránokban, és védi az alacsony sűrűségű lipidfrakciót (low density lipoprotein - LDL) az oxidációtól. Az oxidált LDL szerepe ismert az arterioszklerózis kialakulásában, az érfal endotélium sejtjei és makrofágjai felveszik az LDL-eket, így a betegség első lépéseiben játszik fontos szerepet [13]. A szelenoprotein P is a plazmában levő szelenoprotein [14]. Pontos

funkciója

bizonyított

a

még

nem

peroxidok

ismert,

állatkísérletekben

elleni

védelemben,

szerepe

illetve

a

szeléntranszportban. Úgy tűnik, hogy a szelenoproteinek közül a szelenoprotein P szintézisének elsődleges prioritása van szelénhiány esetén. A

szelenoprotein

W a

fehér

harántcsíkolt

izomszövetben,

szívben, kisebb mennyiségben a májban található, szelénhiányos

4

állapotban az un. white muscle disease betegség jelentkezhet [15]. Funkciója nem ismert, feltételezik az antioxidáns hatást. A

thyroid

dejodinázok

a

tiroxin-trijódtironin

átalakulásért

felelősek, itt is szelenocisztein formában épül be a szelén az enzimbe [16].

Ennek

a

rendszernek

a

szelénszükséglete

kisebb,

mint

a

glutation peroxidázoké és a hiánybetegség is ritkább. A tioredoxin reduktázt az emberi T sejtekből azonosították, itt is

az

antioxidáns

hatás

dominál.

Kimutatták,

hogy

a

dehidroaszkorbinsavat aszkorbinsavvá redukálja, s így biztosítja a máj aszkorbinsav tartalmát [17]. Szelénhiányos állapotban az enzim aktivitása csökken, s ezzel magyarázzák a rákos betegségre való hajlam és a szelénhiány közötti összefüggést. A

szelenofoszfát

szintetáz

a

szelenoproteinek

képzésében

résztvevő enzim, a szelénfoszfát képződését katalizálja, amely az aktivált állapot a további reakciókhoz. Az

első

bizonyított

eset,

hogy

szelénhiány

a

betegséget

okozhat, a Kínában évtizedek óta ismert Keshan-kór [18]. A betegség fő tünete a kardiomiopátia, az enyhébb szívműködési zavaroktól az akut szívelégtelenségig. Kína más területein, a délnyugat-északkeleti régióban az un. Kashin-Beck betegség fordul elő [19], amely főként csontrendszeri betegség, s porcelhalással, hiányos csontfelépüléssel, és osteoartrosissal jár. Mindkét esetben igazolták a szelénhiányos táplálkozást, és szelén bevitelével jelentős javulást értek el, a betegségek

előfordulási

gyakorisága

drasztikusan

csökkent.

A

betegségek kialakulásához más tényezők is szükségesek, a Keshanbetegséget egy Coxsackie-vírus és a szelénhiány együtt okozza [20]. Humán vizsgálatok szelénhiányos állapotról az 1980-as évekből származnak, ekkor még a mesterséges tápszerek nem tartalmaztak szelént.

A

fő

tünetek:

izomgyengeség,

fáradékonyság

valamint

mozgási nehézségek [21]. A ma alkalmazott tápszerek 50-100 µg/kg szelént tartalmaznak.

5

A szelén nagy mennyiségben toxikus elem [22]. Krónikus mérgezés esetén a fő tünetek a haj, a bőr, és a körmök elváltozásai, a bőr vörös színű, fölpuffadt, hólyagos, a haj hullik és töredezik, idegrendszeri tünetek is jelentkeznek: ingerültség és fáradékonyság. Fatális akut esetben hányás, hasi fájdalom lép fel, melyet a motoros idegrendszer súlyos zavarai követnek, görcsök s végül bénulás következik be. 1984-ben az Egyesült Államokban egy szelénpótló készítmény szeléntartalma 150µg helyett átlagosan 27mg volt, több halálesetet okozva [23]. Olaszországban 2065 embert vizsgáltak, akik hosszú ideig nagymennyiségű szervetlen szelént tartalmazó ivóvizet ittak. 11 év alatt a rosszindulatú daganatok mortalitása 17 %-kal nőtt, kiemelkedően a bőr- és a bélrendszeri daganatoké. Az érrendszeri betegségeket illetően a cerebrovasculáris halálozási arány nőtt, míg a koronária betegségeké csökkent [24]. Szelénhiány több betegség kialakulásában is szerepet játszhat. Összefüggést találtak a kardiovaszkuláris betegségek előfordulása, és a vérben mérhető alacsony szelénszint között [25]. A szelén hiánya a glutation

peroxidázok

zsírsavakból

származó

csökkent

aktivitását

peroxidok

okozza,

ezáltal

felszaporodhatnak,

a

mely

feltételezhetően e betegségek kialakulásáért felelős egyik faktor. A rák és a szelén közötti kapcsolat intenzív kutatás alatt áll [26, 27]. Nagy dózisú szelént állatkísérletekben hatékonynak találtak bizonyos tumorok ellen, jóval nagyobb dózisban, mint amennyi az enzimek optimális aktivitásához szükséges. A rákos betegségek nagyobb gyakoriságát igazolták szelénhiányban, bár az eredmények nem egyértelműek. Egy 10 éves kísérletsorozat után azt találták, hogy a szelén nem gyógyítja a bőrrákos betegeket, de napi 200µg szelén csökkenti a tüdő-, a vastagbél- és a prosztatarák mortalitását [28]. A kontrolcsoporthoz

viszonyítva,

minden

csökkenést 44%-osnak találták.

6

ráktípust

tekintve

a

1.1.2. Kadmium A kadmium toxikus elem [29], biológiai rendszerekben a cinket és

a

rezet

kibocsátása

helyettesítheti. a

világon

Az

ipari

évente

termelés

17000

éves

tonna.

kadmium

Felhasználják

színanyagnak a festékgyártásban, stabilizátornak a műanyagiparban, akkumulátorokban

elektródként

és

az

acélgyártásban

korrózióvédelemre. A cigaretták kadmiumtartalma jelentős, napi egy csomag évi 1 mg terhelést jelent. Állatkísérletben cigarettafüst hatására a tüdő, a máj és a vese kadmiumtartalma nőtt [30]. Az emberi szervezetbe élelmiszerekkel, cigarettafüsttel, ipari területeken a szennyezett por belélegzésével kerül. Felszívódása a bélrendszerből 5% körüli, a tüdőből meghaladhatja az 50%-ot. A keringésből gyorsan eltűnik, a szervezetben található összes kadmium fele a májban, illetve a vesében található. Biológiai felezési ideje rendkívül hosszú, 10-30 év, ezért kismennyiségű kadmium folyamatos bejutása is lassan növeli a szervezet összes kadmium tartalmát. A kadmiumot egy

kis

molekulatömegű

fehérje,

a

metallotionein

köti

meg

a

szervezetben, egy gyakorlatilag inert komplex képződik, s ebben a formában tárolódik. A szabad kadmium a szervezetben kötődhet szerves tiol-, foszfát-, klorid-, karboxil-csoporthoz egyaránt. A glutationt és más szulfhidril-csoportokkal rendelkező fehérjéket megköti, így nő a szabad oxidatív anyagok (szuperoxid-ion, hidrogén-peroxid, hidroxilgyök) mennyisége, melyek felelősek a kadmium toxikus hatásainak (DNS-törés, membránkárosodás) nagy részéért [31]. Ezek a hatások antioxidánsokkal kivédhetőek [32]. Számos enzimben a kadmium a rezet vagy a cinket helyettesítheti, megváltoztatva annak hatását. Kimutatták,

hogy

kalmodulinhoz

is

a és

kadmium

kalciumagonistaként

kiváltja

a

kalmodulinfüggő

kötődhet

a

aktivációs

reakciókat. Ez a hatás kalmodulingátlókkal vagy kalciumcsatornablokkolókkal megakadályozható [33]. A kalmodulin számos enzimnek

7

az aktivátora, így az említett mechanizmus lehet felelős a kadmium toxikus hatásainak egy részéért. A kadmiummérgezés tünetei a felszívódás helyétől, a dózistól, a

környezeti

és

a

táplálkozási

tényezőktől

függenek.

Akut

mérgezéseknél az elsődlegesen érintett szövet károsodik (a tüdőilletve a bélhám), többszöri expozíciót követően a vese- és a máj károsodása is tapasztalható. Akut kadmiummérgezés főleg az iparban fordul elő kadmiumtartalmú gőz vagy por belélegzésekor, a tünetek émelygés, mellkasi fájdalom, szédülés, légzési nehézségek, majd tüdőödéma alakul ki, ami súlyos esetekben halálhoz vezet. Orális mérgezés esetén hányás, hasmenés illetve hasi görcsök jelentkeznek s a halál oka metabolikus acidózis. A krónikus kadmiummérgezés leghíresebb esete az itai-itai betegség [34]. Az 1940-es években Japánban történt nagyszámú mérgezés

oka

az

volt,

hogy

egy

ólom-cink-kadmium

bánya

szennyvizét rizsföldekre vezették, s a rizs akkumulálta a kadmiumot. A mérgezés során észlelt tünetek az izületi- és az izomfájdalmak, a csontleépülés, a csonttörés, valamint a vese károsodása volt (a betegség neve a fájdalomra utal). Főként idősebb nők betegettek meg. Más

esetekben

feltételezhetően

ritka

a

ebben

csontrendszer az

esetben

más

ilyen

fokú

elváltozása,

tényezők

is

szerepet

játszottak. A kadmium csontrendszeri hatását vizsgálva igazolták, hogy a kadmium közvetlenül hat a csontszövetre, csökkenti a csont kalciumtartalmát

és

növeli

az

oszteoklasztok

aktivitását

[35].

Kismennyiségű kadmium folyamatos belélegzése először krónikus bronchitist, majd az alveólusok károsodásával emphysemát okoz. A vitálkapacitás

csökken,

a

reziduális

térfogat

nő,

mely

tünetek

klinikailag mérhetőek. A pulmonáris toxicitás az α-1-antitripszin szintézis

gátlásával

van

összefüggésben.

A

krónikus

kadmiummérgezés fő támadáspontja a vese kéregállománya, az első tünet

a

proteinuria,

majd

aminosavak,

glukóz,

és

foszfát

is

megjelennek a vizeletben. A vesetoxicitás mechanizmusa ismert. A

8

vérkeringésben levő kadmium-metallotionein komplex filtrálódik, majd

endocitózissal

sejtjeibe.

A

visszaszívódik

komplexet

a

lizoszómális

vese

proximális

enzimek

tubulus

elbontják,

a

felszabaduló kadmium indukálja a sejtet metallotionein szintézisét. Amennyiben a kadmium mennyisége meghaladja a 200 µg/g értéket, a kadmium-metallotionein komplex kialakulása nem elegendő, és az érintett sejtek elpusztulnak [36]. A kadmium rákkeltő hatása mind állatkísérletekben, mind a humán adatok alapján bizonyítást nyert, az IARC (International Agency for Research on Cancer) carcinogénnek nyilvánította [37]. Ez a hatás a kadmium direkt genotoxicitásán alapul. Emberi vizsgálatok igazolták, hogy a kadmium tüdőrákot okozhat [38], szerepe más daganatok (prosztata-, gyomor-, májrák) kialakításában is felmerült. A legújabb epidemiológiai vizsgálatok nem találtak összefüggést tartós kadmiumexpozició és a rákos betegségek előfordulása között [39].

1.1.3 Ólom Az

ólom

környezetünkben

általánosan

előforduló

elem,

felhasználja: a kohászat, az akkumulátorgyártás, a festékgyártás, és a nyomdászat

[40,

41].

Megtalálható

az

edények

zománcaiban,

a

vízvezetékekben, és a lakkokban. A benzinekhez adott tetraetil-ólom ólom-dioxid formában kerül a levegőbe. Az ólomtartalmú benzinek használatát ma már több országban korlátozzák. Az emberi szervezetbe orálisan és a levegővel juthat be, a szerves ólomvegyületek átjutnak a bőrön is. A bélnyálkahártyán az orálisan bejutott ólom 8-10 %-a szívódik fel, míg gyermekekben ez az érték 40% is lehet. Angliai mérés alapján 1997-ben a napi ólombevitel 0,026 mg, mely a korábbihoz képest jelentős csökkenést jelent az ólomtartalmú festékek betiltásával, és az ólommentes benzin elterjedésével

[42].

A

tüdőből

gyakorlatilag

9

teljes

mértékben

felszívódik, ezért a mérgezések többsége ólomtartalmú gőzök vagy porok

belégzéséből

vörösvértestekbe

ered.

kerül,

A

majd

vérkeringésbe a

vesében,

került illetve

ólom a

a

májban

kumulálódik. Innen néhány hónap alatt a teljes ólommennyiség 95%-a a csontokba kerül, ahol a kalcium-hidroxiapatitban a kalciumot helyettesíti [43]. A csontban tárolódó ólom inaktív, de patológiás állapotokban és kalciumhiányban kiáramlása fokozódik. Terhesség alatt ez különösen veszélyes, mert átjut a placentán is. Eliminációja nagyon lassú, biológiai felezési ideje 20-30 év. Az epével ürült ólom újra visszaszívódik, a vese által kiválasztott mennyiség is csekély. Ennek fő oka, hogy a vérkeringésben a sejtes elemekhez kötődik, vagyis nem jut be a glomeruláris filtrátumba. Ha a napi ólombevitel meghaladja az 1 mg-ot, ez a mennyiség már krónikus mérgezéshez vezet. Az ólom a szervezetben a szabad szulfhidril-csoportokhoz kötődik, s ezáltal bénítja az ezen csoportot tartalmazó enzimeket. Részletesen vizsgálták a hem bioszintézisében betöltött szerepét [44]. Az ólom gátolja az ALA-dehidratázt, a koprogén-oxidázt és a ferroketalázt, kisebb mértékben pedig az uroporfirinogén szintetázt. A gátolt enzimek szubsztrátjai felszaporodnak, illetve az enzimek aktivitása csökken, ezeket mérve lehetőség nyílik az ólommérgezés korai felismerésére. Ez különösen fontos, mivel kimutatták, hogy a gyermekekben 10µg/dl ólom már szellemi károsodáshoz vezethet [45].

Az

ALA-dehidratáz

aktivitásának

logaritmusa

fordítottan

arányos az ólomkoncentrációval, az akivitás mérése 10-50 µg/dl ólomtartományban jól használható [46]. Ennél magasabb ólomszintnél az enzim szintézise fokozódik. Olyan embereknél akiknél genetikai okok miatt hiányzik az ALA-dehidratáz, az ólommérgezés a hemszintézis elégtelenségét eredményezi. A cinkhez kötött protoporfirin, és

a

koproporfirin

mennyisége

egyenesen

arányos

a

vér

ólomkoncentrációjával, melyek szintén alkalmasak ólommérgezés igazolására [44].

10

Az akut ólommérgezés tünetei a gyomor- és a bélrendszer nyálkahártyájára

kifejtett

összehúzó

hatás

miatt

a

hányás,

a

hasmenés, a hasi fájdalom, illetve súlyos esetben a sokkos állapot. A felszívódott proximális

ólom vesekárosodást tubulussejtek.

A

idéz

elő

krónikus

mivel

mérgezés

károsodnak tünetei

a

igen

változatosak. A bőr szürke, a fogakon sötét csík jelenik meg (PbS lerakódás), jellemző az étvágytalanság, fémes íz érzete a szájban, valamint székrekedés, és bélgörcsök. Jellemző a kéz feszítőizmainak bénulása, ez a motoros beidegzés károsodásának következménye. A vérnyomás emelkedik, anaemia jelentkezik a vérképzés károsodása miatt. Az idegrendszeri tüneteket demielinizáció, és axondegeneráció okozza,

melyek

súlyos

megnyilvánulása

az

encephalopathia.

Gyakoriak az izületi fájdalmak. A vesekárosodás albuminuriát, és haematuriát okoz. 1.1.4 Ón Az ón a talajban µg/g, vizekben ng/g koncentrációban van jelen [47].

Bizonyos

növényekben

koncentrálódik,

mely

nincs

összefüggésben a talajtartalommal. Tengeri állatok szervezetében (csigák, tüskésbőrűek) nagy mennyiségben koncentrálódik, de nem bizonyított sem a növényekben, sem az állatokban, esszenciális volta. Ónvegyületeket használnak a konzervgyártásban, stabilizátorként a műanyaggyártásban, a műtrágyákban, a biocidek előállításánál, a festékgyártásban és a kozmetikai iparban.

Az emberi szervezetbe

konzervekből, ón tartalmú flakonokból, és csomagolásra használt fóliákból orálisan jut be. Franciaországban vizsgálták élelmiszerek óntartalmát,

mely

azt

mutatta,

hogy

a

konzervekből

vett

élelmiszerminta óntartalma 76,6 ± 36,5 µg/g. Védőlakkréteggel ellátott konzerv esetén lényegesen alacsonyabb értéket találtak 3,2 ± 2,3 µg/g az eredmény. A friss élelmiszer óntartalma ezzel szemben mindössze 0,03 µg/g [48]. Emberben a thymusban találtak magasabb koncentrációt, ezért feltételezik, hogy a csecsemőmirigy termel egy

11

vagy több ónkötő vegyületet, s ezáltal az ónnak szerepe lehet az immunrendszerben [49]. Az ón már a születéstől fogva mérhető, de a fémek

többségével

ellentétben

mennyisége

nem

növekszik

az

életkorral. Állatkísérletben kimutatták, hogy ónhiányos táplálás (17 ng/g ón) növekedési zavart okoz patkányokban [50], de a mai napig sem

találtak

olyan

enzimet

vagy

biokémiai

folyamatot,

ahol

kimutatható lenne ón jelenléte. Mind

a

Sn(II)-,

mind

a

Sn(IV)-sóknak

a

bélből

való

felszívódása rossz, 1-5 % körüli [51]. Orális toxicitásuk alacsony, állatkísérletek szerint az 50%-os letális dózis (LD 5 0 ) értéke 700-1200 µg/g. Szerves ón(IV) vegyületek toxicitása jelentősen nagyobb is lehet,

trietilón(IV)

szénatomszámának

esetében

6

növekedésével

Nagymennyiségű ón

irritálja

a

mg/kg,

de

toxicitása bélrendszert,

az

alkilcsoport

jelentősen

csökken.

növekedési

zavart,

anaemiát okoz, valamint csökken a keringő hemoglobinszint. Az ólomhoz hasonlóan gátolja a koprogenázt, így nő a koproporfirin mennyisége [52]. A szerves származékok hepato- és neurotoxikusak. Ón tartalmú por tartós belélegzése pneumoconiosist okoz, lerakódik a tüdőben,

de

nincs

sem

fibrosis,

sem

légzésfunkció-csökkenés.

Krónikus mérgezése nem ismert, ennek fő oka, hogy gyorsan távozik a szervezetből a széklettel és a vizelettel. Nincs megfigyelhető karcinogén, mutagén, illetve teratogén hatása. Számos ónvegyület tumorellenes aktivitását vizsgálták [47], melyek szerkezetileg R 2 SnO, R 2 Sn(OH)X, (XR 2 Sn) 2 O, R 2 SnX 2 L 2 képletekkel jellemezhetőek, ahol R = alkil-csoport, X = halogén, L = kétfogú ligandum oxigén vagy nitrogén donor atommal. Nagyszámú vegyület szintézise, illetve ezek in vitro és in vivo vizsgálata van folyamatban, de a terápiában még nem kerültek felhasználásra.

12

1.2. A grafitkemencés atomabszorpciós spektroszkópia Az

1900-as

évek

elején

készítettek

először

a

mai

grafitküvettákhoz hasonló eszközöket [53]. A King által használt cső 20 cm hosszú volt, külső átmérője 16mm, a belső átmérő 5 mm. Először elektromos ívfűtést alkalmaztak 30 A áramerősséggel és 220 V

feszültséggel,

ellenállásként

majd

kapcsolták

a

későbbi

verziónál

az

áramkörbe,

a

mai

a

grafitcsövet

műszereknél

is

alkalmazott fűtési technikát alkalmazva. Ez az eszköz már sok hasonlóságot

mutat

grafitkemencével.

az

A

50

küvettát

évvel

később

emissziós

készült

spektrumok

első

felvételére

használták, molekulasávok azonosítására és jellemzésére, illetve atomvonalak

meghatározására.

Kvantitatív

vizsgálatra

nem

volt

alkalmas, mivel a minta párolgása nem volt tökéletes, a gőztérben lévő atomszám nem függött a mintában levő elemmennyiségtől. Ebben

az

időben

az

atomok

vizsgálatánál

emissziós,

míg

a

molekuláknál abszorpciós technikákat alkalmaztak. 1955-ben Walsh [54] vetette fel az atomabszorpciós spektrum analitikai felhasználásának lehetőségét, és néhány évvel később készültek el L’vov [55] és Massmann [56] tervei alapján az első kvantitatív célra is használható grafitkemencék. A készülékeknek az iparban való elterjedéshez a következő feltételeknek kellett eleget tenniük: teljes legyen az atomizálás, az abszorbeáló atomok gyorsan képződjenek, az atomok megfelelő hosszú ideig tartózkodjanak a mérőtérben, illetve a mérés után teljesen eltávozzanak a mérőtérből, rövid

legyen

a

ciklusidő,

valamint

a

bemérhető

mintatérfogat

elegendő legyen a megfelelő kimutatási határ eléréséhez, további feltételek a készülék könnyű kezelhetősége, és a költséghatékonyság. Az

atomizáló

követelmények:

a

küvetta jó

anyagával

elektromos

13

szemben

vezetőképesség,

támasztott a

magas

olvadáspont, hogy a nehezen párolgó elemek is atomizálódjanak, a gyors fűtéssel és a mintából származó reaktív anyagokkal szembeni rezisztencia, impermeábilisnak kell lennie a mintából származó gázhalmazállapotú anyagokra, hogy a mérendő anyag megfelelő ideig maradjon a fényútban, nagy tisztaság és a kis költséggel történő egyszerű előállíthatóság. Bár az atomizálók többsége különböző technikával előállított grafitból készült, kétféle fémet, a molibdént, és a wolframot is sikerrel használták fel atomizálók anyagaként. A grafit felületét magas hőmérsékleten (2500

o

C) szénhidrogénnel,

általában metánnal kezelik, így un. pirolitikus réteget hoznak létre, mely a grafitcső élettartamát nagymértékben megnöveli [57]. Az eljárás

jelentősen

csökkenti

a

küvetta

felületi

reaktivitását,

porozitását, és a mérés során fellépő karbidképződést. Kísérleteztek teljesen pirolitikus grafitból készült csövekkel, de ezek a pirolitikus réteggel bevont grafitcsövekhez képest nem mutattak különösebb előnyöket,

viszont

az

előállításuk

jelentősen

költségesebbnek

bizonyult. A grafitcső, mint elektrotermikus atomizáló (ETA) jellemzője, hogyan változik illetve oszlik el a hőmérséklet a grafitcsőben a különböző fűtési szakaszokban [58]. Főként ezek a paraméterek határozzák

meg

az

atomizáció

hatékonyságát,

ezzel

a

mérés

érzékenységét, a háttérabszorbanciát, illetve a lehetséges zavaró hatások

mértékét.

A

térbeli

és

időbeni

hőmérséklet-eloszlások

vizsgálata alapvető az atomizálók fejlesztéséhez. Az atomizálók fűtése általában elektromos árammal történik. Az áramerősség függ a feszültségtől, a fűtendő cső hosszától, a keresztmetszet felületétől, és az anyagi minőségtől. A szükséges áramerősség 500 A is lehet az 1000 o C/s fűtési ráta eléréséhez. Nagy hőmérsékleti állapotban a fűtőegységnek ellensúlyoznia kell a hőmérsékleti sugárzásból és a hővezetésből származó hőveszteséget. E faktoroknak, melyek az atomizáló

fűtésének

dinamikáját

14

meghatározzák,

mind

saját

hőmérsékletfüggésük

van,

ezért

még

az

egyszerű

geometriával

rendelkező atomizálók hőmérsékletprofilja is igen komplex. Kezdetben

a

két

grafitkónusz,

amelyeken

keresztül

az

áramvezetés történik a grafitcsövek két végére került, ezeket a csöveket ″végein fűtött grafitcső″-nek - ″end-heated” - nevezzük. Egyszerű

felépítésük

használják.

Az

miatt

ilyen

ezeket

típusú

a

csövek

csöveket fő

gyakran

problémája,

ma

is

hogy

az

előkezelési és az atomizációs hőmérsékleten hőmérsékleti gradiens lép fel a cső hosszirányában. A hőmérsékletkülönbség a cső szélei és a közepe között gyors fűtésnél (1000 o C/s) 2000 o C hőmérsékleten 200 o C, az atomizálás hőmérsékletén pedig már 400-600 o C is lehet. A cső különböző részein lévő alacsonyabb hőmérsékletek az elpárolgott anyag

kondenzálódását

illetve

adszorpcióját

okozzák.

Ha

az

atomizációt hosszan tartó magas hőmérsékletű előhevítés előzi meg, és a minta atomizációja egy növekvő hőmérsékletű térben valósul meg,

az

abszorbancia

meghatározandó áthidalására

elem

L’vov

nem

lesz

arányos

a

Ennek

a

mennyiségével. egy

grafitlapnak,

az

mintában

levő

problémának

un.″platform″-nak

az a

használatát javasolta [59]. A platformot a csőben helyezik el, a két széle hozzáér a cső falához, de tulajdonképpen a gáztérben foglal helyet, s erre injektálják a mérendő anyagot. A platformos cső hőmérsékleti tulajdonságai nem különböznek jelentősen a platform nélkülitől, viszont a platform hőmérséklete csak lassan követi a grafitcső hőmérsékletét, mivel maga a cső fűti. A csőfalhoz képest a platformról történő párolgás időben lassabban történik magasabb hőmérsékleten. Mivel a platform és a belső gáz hőmérséklete közel azonos, időben izoterm állapotról beszélhetünk, viszont a csőben fellépő hőmérsékletgrádiens megmarad, így térben nem izoterm az állapot. Többféle platformtípust próbáltak ki, újabban a csőprofilhoz illeszkedő un. integrált platformok használata terjedt el, melyeket a csővel együtt gyártanak és pirolitikus grafitréteggel vonnak be. Az

15

így

készült

platformok

homogén

felülettel,

kiemelkedő

rezisztenciával és jó fűtési tulajdonságokkal jellemezhetőek. A GFAAS optimális működéséhez szükséges feltételeket Slavin dolgozta ki, megalkotva az STPF (Stabilized Temperature Platform Furnace) koncepcióját [60]. Ezek szerint az atomabszorpciós készülék optimális működéséhez szükséges feltételek a következők: pirolitikus bevonattal felfűtés,

ellátott az

grafitcső,

integrált

pirolitikus

L’vov

abszorbancia

platform,

mérése,

a

gyors

megfelelő

háttérkorrekció és a kémiai módosítók használata, valamint a gyors digitális jelfeldolgozás. A

kémiai

módosítók

(chemical

modifier-matrix

modifier)

használatát Ediger vezette be 1975-ben [61]. Kémiai módosítónak nevezzük azt az anyagot, melyet a mintához (és a standardokhoz) adagolva a mérésnél fellépő zavaró hatást vagy hatásokat csökkenti vagy megszünteti. A módosítók lehetnek szervetlen sók, szerves anyagok, fémek szerves komplexei, gázok, oxidatív és reduktív, savas és bázikus természetű anyagok. Hatásukat a mérendő elemre és/vagy a mátrixra fejtik ki. Leggyakrabban a mérendő elem termikus stabilizálása a cél, ilyenkor lehetőség nyílik hosszabb ideig tartó előhevítési lépcső beiktatásával a zavaró anyagok elpárologtatására, ilyen hatást fejtenek ki a Pd- és a Mg-sók [62, 63]. Ritkábban a módosító a mérendő anyag párolgási tulajdonságait javítja, ilyen módosítóknak a karbidképző és a nehezen párolgó elemek esetén van jelentősége.

A

másik

lehetőség,

befolyásolja.

Amennyiben

hőmérsékletét,

a

rendszerből, lehetőség,

bontás

erre hogy

a

módosító

a

csökkenti

során

klasszikus

hogy

távoznak példa

az

módosító a a

a

mátrix zavaró

mátrixot párolgási

anyagok

NH 4 NO 3 [64].

megváltoztatja

a

mátrix

a

További kémiai

szerkezetét, s így olyan vegyület jön létre, amely által okozott interferencia lényegesen kisebb. Schlemmer és Welz [65] foglalták össze azokat a kritériumokat, amelyeknek egy univerzális módosító meg kell feleljen:

16

• a meghatározandó elem hőmérséklet-stabilitását biztosítania kell, hogy a bontási hőmérséklet legalább 1000 o C legyen, • minél több elemhez használhatónak kell lennie, •

nagy

tisztaságban

előállítható

legyen,

nem

tartalmazhatja

a

mérendő elemet mérhető koncentrációban, sem más elemet nagy koncentrációban, • használata nem csökkentheti a grafitcső élettartamát, • nem okozhat zavaró hatást az elemek mérése során. Megvizsgálták az eddig használt módosítókat, és az általuk vizsgált 9 elem esetében úgy találták, hogy a Pd(NO 3 ) 2 és a Mg(NO 3 ) 2 módosítók

együttes

használata

minden

említett

követelménynek

egyenlőtlenségeinek

kiküszöbölésére

megfelel. A

hőmérséklet

térbeli

dolgozták ki a ″keresztben fűtött″ (side-heated) grafitcsöveket, ahol a fő problémát az elektromos érintkezés megvalósítása jelentette. A Frech [66] által készített integrált kontaktussal ellátott grafitcső (integrated contact cuvette - ICC) jelentett áttörést 1986-ban, amely kereskedelmi forgalomba is került, némi módosítás után a Perkin Elmer cég gyártja integrált platformmal: keresztben fűtött grafit atomizáló (transverse heated graphite atomizer - THGA) néven. Ennél a megoldásnál a gáz és a platform hőmérséklete gyorsabban követi

a

cső

falának

hőmérsékletét,

ezáltal

jelentősen

tovább

csökkentve a zavaró hatásokat. Mivel a cső teljes hosszában – kivéve a

csővégeken

-

közel

izoterm,

lecsökkennek

a

kondenzációból

származó interferenciák és a nehezen párolgó elemeknél tapasztalt memóriaeffektus. Frech és L’vov módosították a THGA csövet oly módon, hogy peremmel látták el a cső végét (end cap) [67]. Ezzel növelték a cső végeinek hőmérsékletét ami további közelítést jelent a térben

egyenletes

hőmérséklet-eloszlás

eléréséhez.

A

perem

ezenkívül megakadályozza a mérendő elem diffúzióját a csővégeken, s így növeli az érzékenységet és csökkenti a kimutatási határt.

17

A

GF-AAS

módszer

kezdetben

egyszerre

csak

egy

elem

mérésére volt alkalmas. Az első kiterjedt vizsgálatok, melyek több elem egyidejű mérését szolgálták Harnly nevéhez fűződnek [68]. Harnly az abszorbanciacsúcsok és a görbe alatti területek függését tanulmányozta különböző atomizációs és bontási hőmérsékleteknél. Kilenc elemet vizsgálva (Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, V, Zn) azt találta, hogy a megengedhető maximális bontási hőmérséklet a Zn mérésénél 500 o C, míg a minimális atomizációs hőmérséklet a Mo és a V

mérésénél

2700 o C.

Összehasonlítva

a

Zn

mérésnél

ideális

paraméterekkel, ezen körülmények között a Zn abszorbanciája 50%ra

csökkent

platform

alkalmazásával,

míg

csőfalról

történő

atomizálás esetén 5%-ra. A vizsgálatokból kiderült, hogy a végein fűtött csövek nem megfelelőek sokelemes mérések kivitelezésére. A THGA megjelenése után, a detektor [69] és az optikai rendszer fejlesztésével készült el az első, egyszerre 6 elemet mérni képes atomabszorpciós készülék [70]. Kiterjedt kutatások folynak napjainkban is az atomabszorpciós fényforrások fejlesztésére. A lézersugárzás kiváló spektroszkópiai tulajdonságait már a 80-as években igazolták [71], de az akkori technikák

magas

költsége

és

veszélyessége

megakadályozta

elterjedésüket. A dióda lézerek (DL) megjelenésével és tömeges ipari elterjedésével új lehetőség nyílt felhasználásukra. Az eddig használt fényforrásokkal szemben (vájtkatódlámpa - hollow cathod lamp HCL, elektród nélküli kisülési cső - electrodless discharge lamp EDL), a DL a következő előnyös tulajdonságokat mutatja [72]: •

a

kibocsátott

fény

intenzitása

legalább

egy

nagyságrenddel

nagyobb, jobb az intenzitás, és a hullámhossz stabilitása, amely nagyon kis abszorbanciák mérésére is lehetőséget nyújt, • a sávszélesség közelítően két nagyságrenddel kisebb, ami a kalibráció

lineáris

koncentráció-tartományának

lehetővé,

18

növelését

teszi

• csak egy hullámhosszon emittál fényt, lehetőség nyílik a műszer felépítésének egyszerűsítésére, nincs szükség monokromátorra, • a hullámhossz egyszerűen változtatható, nem szükséges minden elemhez külön lámpa. A

módszer

fő

hátránya,

hogy

a

GF-AAS

méréseknél

gyakran

alkalmazott 190-315 nm hullámhossztartomány - a kereskedelmi forgalomban lévő műszernél - még nem elérhető. A fejlesztések másik iránya, ahol az utóbbi időben jelentős előrelépés történt a folytonos spektrumot sugárzó lámpák (continuum source CS) fényforrásként való alkalmazása. A klasszikus AAS műszerekben

használatos

felbontóképességük

miatt

monokromátorok alkalmatlanok

gyenge

CS-AAS

mérés

kivitelezésére. Becker-Ross és Florek munkái alapján készült nagy felbontású monokromátor (double-échelle monochromator - DEMON) [73, 74] és detektor (charge coupled device - CCD) nagy felbontása nyitotta meg az utat a CS-AAS fejlődése felé. A technika lehetővé teszi az abszorpciós vonal szélein történő mérést, így a GF-AAS dinamikus

tartománya

5-6

nagyságrendre

növelhető,

s

ezáltal

kiküszöbölődik a GF-AAS módszer fő hátránya, valamint csökkennek a kimutatási határok. A detektor részletes információt szolgáltat az analitikai vonal környezetéről, mely az eddigieknél pontosabb és megbízhatóbb háttérkorrekciós eljárás kidolgozását teszi lehetővé.

1.3. Cd, Pb, Se, Sn meghatározása emberi eredetű mintákból A vizsgált elemek meghatározása emberi eredetű mintákból nyomelem-analitikai módszerekkel lehetséges. A 1.táblázatban a leggyakrabban alkalmazott módszerek kimutatási határait foglaltuk össze. A táblázatból kitűnik, hogy az atomabszorpciós technikák (oldatos, szuszpenziós, hidrid-generációs) által elérhető kimutatási határok jól összevethetőek

más hatékony módszerek kimutatási

19

határaival (neutron aktivációs analízis - NAA, induktív csatolású plazma tömegspektrometria - ICP-MS). A GF-AAS technika előnye, hogy a telepítési és működési költsége jelentősen alacsonyabb, mint a két említett technikáé. Mestek és mtsai. emberi vérmintákat vizsgálva megállapították

a

szelén

analízise

során

különböző

mérési

eljárásokkal elérhető kimutatási határokat emberi vérmintákból [75]. Méréseik alapján az ICP-MS metodika kimutatási határa (6 ng/g) alig marad

el

a

HG-AAS

(hidrid

fejlesztéses

atomabszorpciós

spektrometria), illetve a GF-AAS módszerek 8 illetve 14 ng/g értékeitől. Chiba és mtsai különböző biológiai referenciaanyagokban a NAA és a GF-AAS eljárásokat hasonlították össze ón esetében [76]. Mindkét módszert kielégítőnek találták, az értékek jó egyezést mutatnak. Japán kutatók ICP-MS és GF-AAS mérési eredményeket vetettek össze vér és élemiszermintákban kadmium, illetve ólom mérése során [77]. Azt találták, hogy az ICP-MS mérések 10-20%-kal alacsonyabb

értékeket

adnak,

amelyet

valószínűleg

a

minták

mátrixától eredő zavaró hatások okoznak. 1. táblázat A vizsgált elemek kimutatási határai különböző mérési technikák esetén emberi minták analízise során (ng/g; száraz tömegre vonatkoztatva) módszer

Cd

Pb

Se

Sn

GF-AAS oldat

1,5-3

3-11,5

14-60

15-20

GF-AAS

30

50

70

-

-

-

8-10,4

-

NAA

1

-

2

100

ICP-MS

0,14

3,8

6

-

szuszpenzió HG-AAS hidridképzés

- nincs adat

20

A GF-AAS eljárásokat három fő típusra oszthatjuk fel. Az első esetben a minta nedves roncsolás után kerül mérésre, a roncsolószer oxidatív sav vagy savelegy, a roncsoló lehet hagyományos bomba vagy

mikrohullámú

berendezés.

Ducros

és

mtsai.

a

klasszikus

feltárási módszert (magas hőmérséklet, zárt bomba) hasonlították össze a legmodernebb nyitott rendszerű mikrohullámú technikával [78], s a mért adatok jó egyezést mutattak. A második esetben szilárd mintát [79] vagy szuszpenziót állítanak elő [80, 81]. A szilárd minta por

formában

kerül

szuszpenzióstabilizáló kevernek

a

bemérésre.

anyagot

mintához,

és

az

(Triton oldathoz

Szuszpenzió X-100,

Viscalex

hasonlóan

a

esetén HV30)

grafitcsőbe

injektálják. Ezek a módszerek főként a folyékony minták (vér, vérplazma, vizelet) analízisére alkalmasak, de a szilárd minták megfelelő porítása után is alkalmazhatóak (pl. haj). A szuszpenziós technikák kimutatási határa általában valamivel nagyobb, mint az oldatos

technikáké.

A

harmadik

eljárás

a

HG-AAS

módszer

alkalmazása szelén analízisére [75, 82]. Bár a kimutatási határ is jobb mint a GF-AAS technikánál, az eljárás fő előnye, hogy gyakorlatilag mátrixmentes

mérést

tesz

lehetővé.

A

GF-AAS

méréseknél

alkalmazott kémiai módosítók: szelén mérésekor: Pd [80], Ni[80], Pd-Ni [83]; ólom esetén: Mg-Rh [84], Pd-Mg [85], NH 4 H 2 PO 4 NH 4 NO 3 [86]; kadmium mérésénél: NH 4 H 2 PO 4 -NH 4 NO 3 [86], Pd-Mg [85]; míg az ón analízisekor: aszkorbinsav [87] Spanyol kutatók a nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfiát ICP-MS

rendszerrel

összekötve

használtak

fel

szelén

meghatározására emberi vizeletből [88]. Így lehetőség nyílt a szelén speciációs vizsgálatára (szelenometionin, szelenocisztein, Se(IV), Se(VI) tartalom) rendkívül alacsony oldatbeli kimutatási határral (Se(IV) esetén 0,5 ng/g). Rahman és mtsai. atomfluoreszcenciás eljárást dolgoztak ki öt elem, köztük a szelén meghatározására emberi hajmintából, a szelén kimutatási határa 2 ng/g [89]. A 2,3diaminonaphtalene (DAN) szelénnel alkotott komplexe alkalmasnak

21

bizonyult

molekula-fluoreszcencián

alapuló

koncentráció

meghatározásra vér és vizeletmintákban [90]. Lengyel kutatók a kadmium

és

az

ólom

meghatározására

voltammetriás

eljárást

dolgoztak be hajmintából [91], míg kínai kutatók az ón mérésére vérmintából [92]. Az ASV (anódos sztripping voltammetria) eljárások kimutatási határa elérte az 1 ng/g értéket, és alkalmasnak bizonyult speciációs

vizsgálatok

kivitelezésére

is.

TXRF

(totálreflexiós

röntgenfluoreszcenciás spektrometria) módszerrel ólom és szelén meghatározást végeztek el magyar és német kutatók különböző emberi mintákból [93, 94], Pb esetén 100 ng/g, míg Se analízisekor 50 ng/g kimutatási határt értek el. A

2.

táblázatban

foglaltuk

össze

a

különböző

emberi

szövetekben talált irodalmi elemkoncentrációkat. 2. táblázat Emberi minták Cd, Pb, Se, Sn tartalma (ng/g; száraz tömegre vonatkoztatva) minta

Cd

Pb

Se

Sn

haj [81, 91]

<300

<3000

540

-

fog [79]

19-95

1,43-6,32

-

-

vér [82]

0,1-0,8

<160

<60

-

máj [95]

854,3

-

165,8

78-1122

vese [95]

6722,1

-

434,3

-

tüdő [96]

-

-

3-574

-

agy [97]

100-300

100-500

115-222

30-100

- nincs adat

22

2. Kísérleti rész 2.1. Kísérleti körülmények 2.1.1. A mérőberendezés A

vizsgálatokat

grafitkemencés

Perkin

Elmer

atomabszorpciós

SIMAA

6000

spektrométerrel

típusú

végeztük.

A

grafitküvetták Perkin Elmer THGA elnevezésű, végein peremezett (end capped) és perem nélküli (non end capped) keresztfűtésű grafitcsövek voltak, melyek integrált platformot tartalmaztak. A készüléket optikai rendszere (Tetrahedral Echelle Polychromator, fókusztávolság 0,5m) és detektora (Solid-state Detector, diódasoros 60 dióda) multielemes mérésre teszi alkalmassá, egyszerre hat elem mérhető. Fényforrásként vonalas spektrumot sugárzó, elemspecifikus EDL

(Electrodless

Discharge

Lamp)

lámpákat

használtunk,

a

beállítási paramétereket a 3. táblázat tartalmazza. 3. táblázat A fényforrás paraméterei Elem lámpa

Lámpaáram

hullámhossz

spektrális

típus

[mA]

[nm]

[nm]

Cd

EDL

230

228,8

0,7

Pb

EDL

450

283,3

0,7

Se

EDL

290

196,0

2,0

Sn

EDL

325

286,3

0,7

sávszélesség

Az inert körülményeket - külső gázként - argon 500 cm 3 /min áramlási

sebességgel

kiküszöbölésére

a

biztosította.

műszerbe

beépített

A

háttérabszorbancia

Zeeman

longitudinális

háttérkorrektort alkalmaztuk. Az oldatokat Perkin Elmer AS-72

23

típusú

automatikus

mintaadagolóval

jutattuk

a

grafitcsőbe.

Az

injektált térfogat 5-20 µl között változott. 2.1.2. A felhasznált vegyszerek A

mérésekhez

szükséges

oldatok

elkészítéséhez

a

4.

táblázatban felsorolt vegyszereket használtuk. 4. táblázat A felhasznált vegyszerek Elem

Vegyszer

Felhasználás

Gyártó

Cd

AAS mix

standard oldat

GFAAS mixed standard (Perkin Elmer) c C d = 5mg/l

Pb

AAS mix

standard oldat

GFAAS mixed standard (Perkin Elmer) c P b = 100mg/l

Se

AAS mix

standard oldat

GFAAS mixed standard (Perkin Elmer) c S e = 100mg/l

Sn

AAS mix

standard oldat

Tin standard solution (Merck) c S n = 1g/l

Pd

Pd(NO 3 ) 2

kémiai módosító

Palladium – modifier (Merck) c P d = 10 g/l

Mg

Mg(NO 3 ) 2

kémiai módosító

Magnesium-matrix modifier (Merck) c M g 10g/l

PO 4

3-

NH 4 H 2 PO 4

kémiai módosító

suprapur (Merck)

A minták feltárásához, illetve a standard és a módosító oldatok hígításához

65%-os salétromsavat használtunk (Merck suprapur). A

feltáráshoz alkalmazott 30%-os hidrogén-peroxid szintén suprapur tisztaságú volt (Merck). A vizsgálatokhoz alkalmazott vizet Millipore

24

Milli-Q RG típusú készülék állította elő, s az így nyert ionmentes víz fajlagos ellenállása 18 MΩcm. Az agymintákat Adam Equipment WA 210 típusú analitikai mérlegen mértük le. A mintákat feltárás előtt achát mozsárban porítottuk. A salétromsav és a hidrogénperoxid pontos adagolását Dispensette easy calibration típusú (0,5-5 ml térfogatú)

kézi

adagoló

használata

biztosította.

A

boroszilikát

üvegből készült mérőlombikokat (5, 10, 25, 50 cm 3 térfogatú, A jelű) az

EPA

(Environmental

Protection

Agency)

szabványnak

megfelelően, 1:1 arányú HNO 3 és víz, illetve HCl (Merck suprapur) és víz elegyekkel, majd nagytisztaságú vízzel tisztítottuk. A feltárásokkal párhuzamosan vak oldatokat is készítettünk, melyek

salétromsavat,

hidrogénperoxidot

és

vizet

tartalmaztak,

ezeket a mintákkal megegyező módon kezeltünk. Az összehasonlító oldatokat

a

4.táblázatban

található

Perkin

Elmer

GFAAS

mix

standard (ón esetében az ón standardoldat) hígításával készítettük. Törzsoldatként 1 mg/l koncentrációjú oldatokat használtunk, melyet hűtőszekrényben tároltunk. A mérésekhez használt standard oldatok a törzsoldat megfelelő hígításával készültek, melyeket csak egy napig tároltunk.

A

módosított

kalibrációs

abszorbancia

függvényében

és

a

görbe

felvételénél

értékeket

legkisebb

a

ábrázoltuk

négyzetek

vak a

értékekkel

koncentráció

módszerével

egyenest

illesztettünk. Kísérleteink

pontosságának

ellenőrzéséhez

NIST

(National

Institute of Standards and Technology) Bovine liver 1577a, DORM – 2 (National Research Council of Canada, Dogfish Muscle), IAEA – 155 (International Atomic Energy Agency, Wheypowder) típusú referenciaanyagokat használtunk.

25

2.2. Mintakezelés 2.2.1. Mintavétel Kísérleteinkhez az agymintákat az Országos Traumatológiai Intézetbõl és a Balassa kórházból kaptuk. Az analízishez, illetve a következtetések levonásához feltétlenül szükséges, hogy pontosan meghatározott anatómiai területekrõl kerüljenek ki a minták, így a mintavételt neuropatológus szakemberek végezték . Az agyrészek salétromsavval és ioncserélt vízzel tisztított polietilén dobozba, majd - lehetõség szerint - azonnal mélyhûtõbe kerültek, hogy a diffúziós és a bomlási folyamatokat a minimálisra csökkentsük. A minták az agy harminc különböző területéről származtak, mindkét féltekéből külön történt

a

mintavétel.

A

5.

táblázat

mutatja

be

a

vizsgált

agyterületeket és azok funkcióit. 5. táblázat A vizsgált agyrészek, illetve azok funkciói sorszám

Agyterület

funkció

1.

lobus occipitalis

látóközpont

2.

caput nuclei caudati

mozgató központ

3.

putamen

mozgató központ

4.

globus pallidus

mozgás koordináció

5.

thalamus

pályák átkapcsolódása

6.

pulvinar thalami

multiszenzoros központ

7.

gyrus hyppocampus

emlékezés, tanulás

8.

cerebellum

mozgáskoordináció

9.

genu corpus callosi

a két féltekét összekötő pályák

10.

cortex cerebri

kognitív funkciók

11.

nucleus ruber

felszállópályák átkapcsolódása

12.

substancia nigra

felszállópályák átkapcsolódása

13.

ammonszarv

emlékezés, tanulás

14.

entoriális terület

kognitív funkciók

15.

frontális parasaggitalis vegetatív funkciók

26

kéreg 16.

frontális basalis kéreg

17.

lobulus

vegetatív funkciók

parietalis szomatoszenzoros központ

superior 18.

lobulus

parietalis szomatoszenzoros központ

inferior 19.

vermis cerebelli

egyensúly, helyzetérzékelés

20.

corpus amygdale

emlékezés, tanulás

21.

corpus mamillare

emlékezés, tanulás

22.

gyrus

frontalis primer mozgató központ

superior 23.

gyrus frontalis medius

szaglás

24.

gyrus frontalis inferior szemmozgatás

25.

gyrus

temporalis hallás, beszéd

medius 26.

gyrus

temporalis hallás, beszéd

inferior 27.

gyrus cinguli

emlékezés, tanulás

28.

colliculus superior

fényre kiváltott reflexek gátlása

29.

corpus pineale

hormonális tevékenység

30.

nucleus

basalis érzőközpont

Meynert A minták ún. normál emberekbõl származtak. A mintavétel szempontjából azok az emberek számítanak normálnak, akiknél ún. elsõdleges idegrendszeri elváltozás mind az anamnézis, mind a patológiai vizsgálat alapján kizárható volt. Az 5. táblázatot tanulmányozva láthatjuk, hogy a mintavétel során

a

mozgató

rendszer

(piramis-,

extrapiramidális-rendszer,

koordináció), az általános és specifikus érzõrendszer, valamint a limbikus rendszer (tehát érzelmi szféra, memória stb.) egyaránt érintve volt.

27

2.2.2. Mintatárolás Az emberi agyszövetek vizsgálata során a mintakezelés fontos lépése a minták tárolása, hiszen a boncolást gyakorlatilag sohasem követi az azonnali mintafeldolgozás. A minták legbiztonságosabban tömegállandóságig szárított formában tarthatók el, mivel ez gátat szab

a

szerves

anyag

bomlásának,

és

az

aktív

transzport

megszűnésével előtérbe kerülő passzív diffúziónak. Arra azonban nincs

lehetõségünk,

hogy

a

boncolás

helyszínén

elvégezzük

a

szárítást, tehát megoldást kellett találni arra, hogy a minta eltartható legyen, amíg a szárításra sor kerül. Eleinte a mintákat formalinnal fixálták, ez természetesnek látszott, hiszen a kórházak és a patológiai intézetek is ezt teszik, de kiderült, hogy a formalinos tárolás analitikai problémákat okozhat, melyek a következõek: • a formalin szennyezései beoldódnak a mintába. • a mintából kioldódnak egyes elemek a formalinba. • a különbözõ területek között diffúzió lép fel (amennyiben az egész agyat egyben tárolják) [98]. A másik megoldás a mélyhûtéssel történõ tárolás. A korábbi kísérletek során meghatározták a mélyhûtés idejének

függvényében

az elemkoncentrációkat, és azt találták, hogy a módszer kiválóan alkalmas

tárolásra,

s

amellett,

hogy

egyszerû

és

biztonságos,

megbízhatóbb adatokat szolgáltat mint a formalinban fixált minták. A kísérletek alapján kiderült, hogy a minta -18C körüli hõmérsékleten akár hónapokig is eltartható anélkül, hogy számolnunk kellene a szennyezõdés és a kioldódás veszélyével (ma már csak ezt a módszert alkalmazzuk) [99].

28

2.2.3. A minta szárítása A mélyhûtve tárolt (nedves) mintákat tömegük mérése után szárítószekrényben tömegállandóságig szárítottuk. A szárítás tiszta kristályosító csészében, 105 o C-on 36 órán keresztül történt. Így könnyen kezelhetõ, tárolásra alkalmas anyagot kaptunk. A szárított minta tömegét lemértük. A szárítási faktorok számítása (ezek az ún. F-faktorok) a következõ képlettel történik: F = (száraz tömeg/nedves tömeg)

*100

A mélyhûtéssel tárolt minták százalékban megadott F-értékeit, illetve a formalinban tárolt, valamint a friss minták faktorait foglaltuk össze a 6. táblázatban. 6. táblázat Néhány agyrész százalékban kifejezett átlagos szárítási faktorai különbözõ tárolási módok esetén Minta

friss minta

mélyhűtött minta formalinban tárolt minta

caudatum

17,79

18,01

16,27

putamen

20,34

19,64

17,25

pallidum

23,14

23,71

23,68

thalamus

20,21

21,04

18,66

hyppocampus

16,16

16,77

18,31

nucleus ruber

27,43

26,06

23,05

substancia

21,50

21,66

21,68

nigra

Az adatokat összevetve azt láthatjuk, hogy a mélyhûtött minták F-értékei gyakorlatilag megegyeznek a friss mintákéval, míg a formalinozott minták szárítási faktorai több agyrészben is jelentõs eltérést mutatnak.

29

A

továbbiakban

a

szárított

mintákkal

dolgoztunk

tovább,

melyeknek elõnye, hogy szinte korlátlan ideig eltarthatók, és az eredmények jól hasonlíthatók a friss minták adataihoz. A szárított mintákat szobahőmérsékleten polietilén anyagú fiolákban tároltuk. 2.2.4. Feltárás Az

elemkoncentrációk

analitikai

eljárások

meghatározására

általában

szolgáló

megkövetelik

a

mûszeres

szerves

anyag

elroncsolását, miután a legtöbb technika folyékony mintát igényel. Azonban nincsen általánosan alkalmazható eljárás a szilárd biológiai minták oldatbavitelére. Az Intézetben folyó kutatások korábbi szakaszában történtek kísérletek az agyminták száraz roncsolására, de ez nem bizonyult sikeresnek,

mert

a

hamvasztást

követõen

a

viszonylag

nagy

széntartalmú anyagot nem lehet tökéletesen feloldani, valamint magas hőmérsékleten egyes elemek eltávozhatnak a mintából. A másik lehetõséget a nedves roncsolás jelenti. A nedves roncsolásnál erõs oxidálószerekkel történik a minta lebontása. Erre a célra legjobban az erõs oxidáló savak (HNO 3 , H 2 SO 4 ) váltak be, mivel desztillációval könnyen tisztíthatók, bomlási maradékaik viszonylag könnyen eltávolíthatók az oldatból, a feltárási idõ pedig rövidebb, mint a hamvasztás esetén. A módszer hátránya a minta

hígulása

és

a

nagytisztaságú

vegyszerek

használatának

szükségessége. Az

atmoszférikus

nyomás

helyett

hamar

elterjedt

a

nagynyomású bombák használata, melynek elõnyeit az alábbiakban foglalhatjuk össze: • tiszta feltárószer alkalmazása esetén csekély a szennyezõdés esélye, •

atmoszférikusnál

forráspontjánál

nagyobb

nyomáson,

magasabb

tehát

hõmérsékleten

erélyesebben támadja a mintát,

30

a az

feltárószer oxidálószer

• a zárt rendszer miatt a feltárás során nincs anyagveszteség, • a teflonbetét kémiailag inert. A feltárásokat két módszerrel végeztük, nagynyomású Parrbombában, illetve mikrohullámú feltáróberendezéssel. 2.2.4.1. Feltárás Parr-bombában A bomba anyaga teflon, mely nagymértékben ellenáll a HF, a HCl, a HNO 3 és más erõs ásványi savaknak, még a forráspontjuk feletti hõmérsékleten is, anélkül, hogy az illékonyságból eredõ vesztességgel számolnunk kellene. Ellentétben a fém-, az üveg-, vagy a

kerámia-edényzettel,

a

teflonból

készült

bombák

alkalmasak

nyomelemek mérésére, mivel nincs elemkioldódás. A teflonedényt egy sav- és hõálló acélból készült fémtestbe kell

helyezni,

tömítõgyûrû

alkalmazása

nélkül.

A

tömítõgyûrû

szerepét egy rúgós zárórész látja el, mely az edényt szorosan zárja mind a fûtési fázis, mind a hûlési periódus alatt. Az edényt tilos teletölteni, üres térnek mindig maradnia kell a minta felett. Általános szabály, hogy szervetlen mintából maximálisan 1 gramm roncsolható 12 cm 3 savtérfogattal, így 150 o C-on a nyomás nem lépi túl a megengedett értéket. Szerves anyagok esetében jelentõsen kisebb mennyiségekkel szabad csak dolgozni, a szerves anyag tömege maximum 0,1 gramm lehet, s a koncentrált HNO 3 mennyisége nem haladhatja meg a 3,0 cm 3 -t. Az Intézetben korábban vizsgálták a különbözõ savak, a különbözõ

koncentrációjú

salétromsav,

illetve

a

savkeverékek

roncsolási hatásfokát [100], s 0,1 gramm száraz agyminta feltárásához 2,5 cm 3 65% HNO 3 bizonyult elég hatékonynak. Az agyminták roncsolása szárítószekrényben 150 o C-on két órán keresztül történt. Az eljárás zöldes színû, kivétel nélkül tiszta oldatot eredményezett, melyet ezután ionmentes vízzel 5,00 cm 3 -es mérõlombikba mostunk át, és jelre állítottunk.

31

2.2.4.2. Feltárás mikrohullámú készülékkel A

mikrohullám

olyan

elektromágneses

sugárzás,

melynek

frekvenciája 300 és 300000 MHz közé esik. Az általa hordozott energia akkor szabadul fel, ha valamilyen anyagban elnyelődik. Az elnyelt mikrohullámú sugárzás megváltoztatja a molekulák forgási és rezgési állapotát, de nem okoz változást a molekulaszerkezetben. A mikrohullámú sugárzásnak kitett anyag felmelegedésének sebessége az anyag mikrohullámabszorpciós koefficiensétől (MWAK) függ. A MWAK az anyag azon képességét fejezi ki, hogy milyen mértékben abszorbeálja adott hőmérsékleten a mikrohullámú sugárzást. Minél nagyobb a MWAK, annál kevésbé képes a mikrohullám áthatolni az anyagon. A mikrohullámok áthatolása végtelen a mikrohullámú energiával szemben átlátszó anyagok esetében, nulla a reflektív anyagoknál (pl. fémek), és véges az abszorptív anyagokra. A mikrohullám elnyelődésének két fő mechanizmusa az ionos vezetés és a dipol rotáció. Ionos vezetés jön létre az oldott ionok migrációja

következtében,

melyet

az

alkalmazott

mikrohullám

elektromos tere hoz létre. Az ionmigráció elektromos áramot hoz létre,

amely

az

oldat

ellenállása

következtében

a

minta

felmelegedését okozza. Az ionos vezetésből származó abszorpció függ az oldott ionok ekvivalens vezetőképességétől, ami pedig a koncentráció és a hőmérséklet függvénye. Dipol rotációnak nevezzük a minta állandó vagy indukált dipólusmomentummal rendelkező molekuláinak átrendeződését, amelyet a mikrohullámú elektromos tér hoz létre. Ahogy az elektromos térerősség nő, a polarizált molekulák sorbarendeződnek,

ahogy

a

térerősség

csökken,

a

molekulák

rendezetlensége visszaáll. A 2450 MHz-es frekvencián a molekulák sorbarendeződése és a rendezetlen állapot visszaállása 2,45 billiószor játszódik le egy másodperc alatt, ami rendkívül gyors melegedést eredményez.

A

dipol

rotáció

által

létrehozott

melegedés

a

hőmérséklet és a minta viszkozitásának a függvénye. A minta kémiai

32

tulajdonságai befolyásolják a melegedés mértékét. A legfontosabb változók a következőek: • ionkoncentráció, • a minta hőmérséklete, • a mikrohullám frekvenciája. Ezek a változók egymástól nem függetlenek. Általában a dipol rotációval elnyelt energia a legtöbb vizes oldatban a hőmérséklet emelkedésével csökken, viszont az ionos vezetéssel elnyelt energia nő

a

hőmérséklet

emelkedésével.

Ezért

ha

egy

ionos

oldatot

melegítünk mikrohullámú energiával, kezdetben a dipol rotáció lesz a domináns, a hőmérséklet emelkedésével ez az arány megváltozik, és az ionos vezetés kerül előtérbe. A két mechanizmus százalékos aránya

függ

az

ionok

ekvivalens

vezetőképességétől

és

a

koncentrációjuktól. Ha az ionkoncentráció alacsony, akkor a teljes fűtés alatt a dipol rotáció lesz a meghatározó. A mikrohullámú sugárzás frekvenciája hatással van mind a fűtés sebességére, mind a mikrohullámok

behatolási

mélységére.

Minél

nagyobb

a

minta

MWAK értéke az alkalmazott frekvencián, annál kevésbé hatol át a sugárzás a mintán. A mikrohullámú feltáráshoz Milestone MLS-1200 Mega típusú készüléket használtunk, melynek jellemzői a következőek: • szabályozható kimenő teljesítmény, maximum 1000W, • TFM edények a memóriaeffektus csökkentésére, • nagyméretű munkatér, egyidejűleg hat minta tárható fel, • gyors hűtési lehetőség. Ennél a feltárási módnál is maximálisan 1g minta tárható fel 10 cm 3 savoldattal. Az agyminták magas zsírtartalmuk miatt a nehezen roncsolható

anyagok

közé

tartoznak,

kísérleteink

alapján

következő roncsolási program bizonyult megfelelőnek (7. táblázat).

33

a

7. táblázat A mikrohullámú feltárás lépései 1.lépés

2.lépés

3.lépés

4.lépés

5.lépés

teljesítmény 250W

0W

250W

400W

650W

idő

1 perc

8 perc

5 perc*

5 perc*

1 perc

*impulzus üzemmód Analitikai pontossággal bemért 0,1g anyaghoz hozzáadtunk 2,5 cm 3 65%-os HNO 3 -t és 0,5 cm 3 30%-os H 2 O 2 -t, majd a fenti programmal tártuk fel a mintákat. A H 2 O 2 hozzáadásával csökkent a feltárás ideje, és kevesebb nitrózus gőz fejlődik. A feltárás után kapott tiszta és színtelen oldatokat 5,00 cm 3 -es mérőlombikba mostuk, és ionmentes vízzel jelre állítottuk.

34

3. Eredmények és értékelésük 3.1. GF-AAS módszer kifejlesztése 3.1.1. Az ólom és a kadmium meghatározása Az

ólom

módszerrel

és

a

kadmium

valósítottuk

meg.

mérését A

multielemes

két

elem

(szimultán)

hasonló

párolgási

tulajdonságai miatt lehetséges a két elem egymás melletti mérése. A mátrix

jelenlétében

(pirolízis)

és

felvételekor

az

tanulmányoztuk

a

atomizációs

görbéket.

atomizációt

állandó

Welz-féle Az

előkezelési

előkezelési

hőmérsékleten

görbék

tartva

egyre

növekvő hőmérsékleten végeztük el az előkezelést. Az atomizációs görbe felvételekor pedig az optimális előkezelési hőmérsékletet alkalmazva növekvő hőmérsékleteken atomizáltunk. A hőmérséklet függvényében ábrázoltuk a kapott abszorbanciaértékeket (1. és 2. ábra). Optimális előkezelési hőmérsékletnek a pirolízis görbe lineáris szakaszának

legmagasabb,

hőmérsékletnek

az

míg

az

atomizációs

optimális

atomizációs

lineáris

szakaszának

görbe

legalacsonyabb pontját tekintettük. Módosítóként az irodalomban ajánlott 50µg NH 4 H 2 PO 4 -t és 3µg Mg(NO 3 ) 2 -t használtuk [101].

0,12 0,1 0,08

Pb pyr Pb ato

0,06 0,04 0,02

Hőmérséklet (oC)

35

00 18

00 16

00 14

00 12

00 10

0 80

0 60

0

0 40

Integrált abszorbancia (s)

Pb

1. ábra Az ólom előkezelési és atomizációs görbéi 50µg NH 4 H 2 PO 4 t és 3µg Mg(NO 3 ) 2 módosító jelenlétében (pyr – előkezelési, ato – atomizációs görbe)

Cd Integrált abszorbancia (s)

0,3 0,25 0,2

Cd pyr Cd ato

0,15 0,1 0,05

18 00

16 00

14 00

12 00

10 00

80 0

40 0

60 0

0

Hőméséklet (oC)

2.

ábra

A

kadmium

előkezelési

és

atomizációs

görbéi

NH 4 H 2 PO 4 -t és 3µg Mg(NO 3 ) 2 módosító jelenlétében

50µg

(pyr –

előkezelési, ato – atomizációs görbe) Az

1.

és

2.

ábrán

az

ólom és

a

kadmium multielemes

módszerrel felvett előkezelési és atomizációs görbéi láthatóak. A előkezelési

hőmérsékletet

o

400-1500

C

között,

az

atomizáció

hőmérsékletét 900-1800 o C között változtattuk. A 2. ábrából kitűnik, hogy a kadmium párolgása már 600

o

C felett megkezdődik, ezért

ennél magasabb bontási hőmérséklet nem alkalmazható. A kadmium atomizációja 1400 o C-on már teljes, viszont az ólom atomizációjához nagyobb

hőmérséklet,

igényeinek kísérletek

megfelelő alapján

hőmérsékletet

1600

o

1600

szükséges.

optimális

600 o

C

C-nak

o

C-nak,

A

előkezelési az

választottuk

szimultán

hőmérsékletet

optimális [102].

a

atomizációs A

8.táblázat

tartalmazza a mérés során alkalmazott hőmérsékleti programot.

36

mérés

8. táblázat Hőmérsékleti program az ólom és kadmium méréséhez Lépés

Hőmérséklet ( o C)

Emelkedési idő (s)

Szárítás 1 Szárítás 2 Előkezelés Atomizáció Kiizzítás

110 130 600 1600 2450

1 15 10 0 1

Tartási idő (s) Belső gázáramlási sebesség (cm 3 /min) 30 250 40 250 20 250 5 0 3 250

3.1.2. Szelén meghatározása A szeléntartalom meghatározásánál az irodalomban biológiai minták vizsgálatához ajánlott mátrix módosítókat (Ni, Pd, Pd/Mg) tanulmányoztuk [103]. A módosítók közül a közül a palládiumot találtuk

leghatásosabbnak

a

háttér

okozta

zavaró

hatások

kiküszöbölésére. Az alábbi kísérletsorozattal megállapítottuk azokat a körülményeket melyek a kismennyiségű szelén mérését lehetővé teszik.

Megvizsgáltuk

a

Pd

növekvő

koncentrációinak

az

atomabszorpciós jelre gyakorolt hatását 5, 10, 15, 20 µg Pd esetében. Az integrált abszorbancia értékek nem változtak lényegesen, míg az abszorbancia

tranziensek

lefutása

a

Pd

koncentrációjának

növekedésével jelentősen javult. A Se abszorbancia – idő görbéinek lefutását (atomizációs tranziensek) a 3. ábra mutatja. A kísérletek alapján, 5 µg Pd módosítónál viszonylag nagy háttérabszorbancia csúcs (0,45) detektálható, amely érték a Pd módosító mennyiségének növelésével előnyösen csökkenthető (0,29). Bár a háttér integrált abszorbancia

értéke

nem

változik,

a

háttércsúcs

nagyon

kis

mértékben eltolódik a Se jeléhez képest. A Pd módosító növekvő mennyisége adagolásakor

befolyásolja két

jól

a

Se

tranziens

elkülönülő

alakját

csúcs

is.

látható,

5

µg

Pd

melyek

csúcsmaximuma 1,35 illetve 1,82 s. A tranziens megjelenési ideje 0,85 s, mely 2,3 s után visszatér az alapvonalhoz. A Pd növekvő mennyiségével növekszik a tranziens megjelenési ideje, 20 µg Pd

37

esetén kb. 1 s és a két csúcs kiszélesedik, s átfedésbe kerül egymással. A tranziens lefutó éle elhúzódóvá válik (20 µg Pd esetén 4

s),

ami

megfelel

a

vizsgált

atomok

adszorpciójának

és

deszorpciójának a kondenzált Pd felületén [104]. Kis mennyiségű magnézium

hozzáadása

nem

javította

a

görbék

lefutását,

nagy

mennyiségben adagolva viszont a háttérabszorbanciát jelentősen megnövelte.

Se 10 ug Pd

0,5

0,5

0,4

0,4

Abszorbancia

Abszorbancia

Se 5 ug Pd

0,3 0,2 0,1 0

-0,1 0

1

2

3

4

0,3 0,2 0,1 0

5

-0,1 0

Idő (s)

1

0,4 Abszorbancia

Abszorbancia

0,5

0,4 0,3 0,2 0,1 0 2

3

4

5

4

5

Se 20 ug Pd

0,5

1

3

Idő (s)

Se 15 ug Pd

-0,1 0

2

4

5

0,3 0,2 0,1 0 -0,1 0

1

2

3

Idő (s)

Idő (s)

3. ábra Szelén abszorbancia tranziensek 5-20µg Pd módosító jelenlétében, kék - agyminta Se jele 100 ppb Se hozzáadásakor, piros - háttérjel

38

Továbbiakban megvizsgáltuk a Pd különböző módosulatainak hatását az előkezelési görbékre. Az előkezelési hőmérsékletet 8001700 o

o

C között változtattuk, míg az atomizáció hőmérsékletét 2100

C-ra állítottuk be. Három esetet vizsgáltunk. Az első esetben 20µl

1%-os palládium oldatot injektáltunk az agymintához és argon gázt használtunk belső gázként, nem redukált (non red) módosító. A hőmérsékleti programot a 9.táblázat tartalmazza.

9. táblázat

Hőmérsékleti program a Se mérésénél nem redukált

módosító alkalmazásakor az előkezelési görbe felvételéhez (non red) Lépés

Hőmérséklet

Emelkedési idő Tartási

( o C)

(s)

(s)

idő Belső gázáramlási sebesség (cm 3 /min)

Szárítás 1

120

1

60

250

Szárítás 2

200

10

20

250

Előkezelés

800-1700

10

30

250

Atomizáció 2100

0

5

0

Kiizzítás

1

3

250

2450

A második esetben a szárítási, és az előhevítési lépcsők alatt 5% H 2 gázt kevertünk az argonhoz, a Pd mennyisége ebben az esetben is 20µg volt, ez az eset az un. redukált módosító (red mod) alkalmazása. A pirolízis lépcső tartási idejét ekkor kettébontottuk. Az első lépésben az argonhoz kevert H 2 gázt áramoltattuk át a rendszeren, majd az előkezelés végén tiszta argont alkalmaztunk, előkészítve az atomizációt. A hőmérsékleti program lépéseit a 10. táblázatban foglaltuk össze.

39

10.

táblázat

Hőmérsékleti

program

az

előkezelési

görbe

felvételéhez (red mod) Lépés

Hőmérséklet o

( C)

Emelkedési idő Tartási (s)

(s)

idő Belső gázáramlási sebesség (cm 3 /min)

Szárítás 1

120

1

60

250*

Szárítás 2

200

10

20

250*

Előkezelés 1 800-1700

10

20

250*

Előkezelés 2 800-1700

0

10

250

Atomizáció

2100

0

5

0

Kiizzítás

2450

1

3

250

* 95% Ar, 5% H 2 belső gáz A harmadik esetben termikusan előredukált (thermally prereduced, pre red) módosítót alkalmaztunk, amelyet úgy nyertünk, hogy a minta adagolása előtt 20µg Pd-t tartalmazó palládium-nitrát oldatot injektáltunk a grafitcsőbe, s azt 1000

o

C-on palládiummá

redukáltuk. Ezután injektáltuk be a mintaoldatot szobahőmérsékletre hűtve a kemencét, (pre red). Az alkalmazott hőmérsékleti program a 11. táblázatban látható.

40

11.

táblázat

Hőmérsékleti

program

az

előkezelési

görbe

felvételéhez (pre red) Lépés

Hőmérséklet

Emelkedési idő Tartási

( o C)

(s)

(s)

idő Belső gázáramlási sebesség (cm 3 /min)

Szárítás 1

120

1

30

250

Szárítás 2

140

10

30

250

Előkezelés 1* 1000

5

20

250

Szárítás 3

120

10

60

250

Szárítás 4

200

5

20

250

Előkezelés 2

800-1700

10

30

250

Atomizáció

2100

0

5

0

Kiizzítás

2450

1

3

250

* szobahőmérsékletre hűtés, majd a minta bemérése a lépés végén

0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0

Se redmod Se nonred

00 17

00 16

00 15

00 14

00 13

00 12

00 11

00 10

90

80

0

Se prered

0

Integrált abszorbancia (s)

Se előkezelési görbék

Hőmérséklet (oC)

4. ábra Se előkezelési görbék különböző állapotú Pd módosítók esetén

41

A Se előkezelési görbéit a különböző állapotú Pd módosítók esetén a 4. ábrán ábrázoltuk. A görbék alapján levonhatjuk azt a következtetést,

hogy

az

előredukált

(pre

red)

Pd

módosító

alkalmazásával nagyobb integrált abszorbancia jelek kaphatók, és magasabb

a

megengedhető

előkezelési

hőmérséklet.

Hasonló

eredményre jutottak orosz kutatók más típusú minták analízise során [105]. A legnagyobb megengedhető előkezelési hőmérsékletnek 1200 o

C-ot, a legkisebb megengedhető atomizációs hőmérsékletnek pedig a

2100

o

C-ot találtuk. A kalibrációt savas összehasonlító oldatokkal

végeztük. A meghatározás során minden mérési pontban a mintákhoz ismert mennyiségű Se-t tartalmazó oldatot adtunk, és meghatároztuk a visszanyerés értékét ellenőrizve ezzel a módszer megbízhatóságát [106].

3.1.3. Az ón meghatározása Ón esetében is megvizsgáltuk a Pd módosító abszorbanciajelre gyakorolt hatását, s azt tapasztaltuk, hogy nagyobb mennyiségű (20 µg) palládium a háttérabszorbancia jelentős növekedését okozza, viszont a palládiummal együtt alkalmazott magnézium a mátrix okozta zavaróhatást jelentős mértékben csökkenti. Ón esetében is tanulmányoztuk a palládium növekvő mennyiségének az atomizációs tranziensre gyakorolt hatását (5. ábra). Az ón esetében a Pd módosító - mint a Se esetében is - a háttérabszorbancia csúcsmagasságát csökkentette

és

csekély

mértékben

eltolta,

5

µg

Pd

esetén

a

csúcsmagasság 0,13, míg 20 µg Pd módosítót alkalmazva 0,087. A csúcsmaximum

eltolódása

kismértékű

1,15-ről

1,3s.

A

Pd

koncentráció növelésével egy második háttércsúcs jelenik meg, mely a módosító mennyiségének további növelésével jelentősen nő, a teljes háttér integrált értéke 5 µg Pd-nál 0,0476, 20 µg-nál már 0,0647. Az

42

ón abszorbancia csúcsmaximum megjelenési ideje nő, mely a Pd mennyiségének

növelésével

csökken.

Az

integrált

abszorbancia

értéke kismértékben nő, a jel elhúzódóvá válik - hasonlóan a szelénhez - 20 µg Pd alkalmazása során 5 másodperc múlva már nem tér vissza az alapvonalhoz. Kismennyiségű magnézium hozzáadása (3 µg)

a

háttér

jelentős

mennyiségének

csökkenését

további

abszorbanciát.

A

növelése

mérések

során,

eredményezi, viszont

5µl

2%

a

növeli Pd-t

és

magnézium a

háttér-

0,6%

Mg-t

tartalmazó módosító oldatot használtunk (10 µg Pd és 3 µg Mg).

Sn 5 ug Pd

Sn 10 ug Pd 0,14 Abszorbancia

Abszorbancia

0,14 0,1 0,06 0,02 -0,02 0

1

2

3

4

0,1 0,06 0,02 -0,02 0

5

Sn 15 ug Pd

Sn 20 ug Pd

Abszorbancia

Abszorbancia

0,06 0,02

4

5

1

2

3

4

5

3

4

5

0,1 0,06 0,02 -0,02 0

Ón

abszorbancia

1

2

Idő (s)

Idő (s)

ábra

3

0,14

0,1

5.

2 Idő (s)

0,14

-0,02 0

1

Idő (s)

tranziensek

5-20µg

Pd

módosító

jelenlétében, kék - agyminta Se jele 100 ppb Se addíciójakor, piros - háttérjel

43

A további kísérletek során a szelénhez hasonlóan az ón esetén is vizsgáltuk a különböző Pd módosítóknak a pirolízis görbére való hatását.

A

hőmérsékleti

programok

hasonlóak

az

előbb

bemutatottakhoz, csak az atomizáció hőmérséklete változott, 2300 o

C-ra.

Az

előhevítés

hőmérsékletét

800

o

C-tól

1800

o

C-ig

változtattuk. Az eredményeket a 6. ábrán láthatjuk [106].

0,12 0,1 0,08

Sn redmod

0,06

Sn nonred

0,04

Sn prered

0,02

90 0 10 00 11 00 12 00 13 00 14 00 15 00 16 00 17 00 18 00

0 80 0

Integrált abszorbancia (s)

Sn előkezelési görbék

Hőm é rséklet (oC)

6. ábra Sn előkezelési görbék különböző állapotú Pd módosítók esetén A 6. ábrán látható, hogy az előredukált (pre red) palládium o

alkalmazása az ón integrált abszorbancia értékét 1100-1800 előkezelési hőmérséklet esetén csökkenti és 1300

o

C

C felett már

vesztességgel kell számolni. A nem redukált (non red) palládium alkalmazásakor alacsony előkezelési hőmérsékleten (800-1100

o

C)

jelentős abszorbancia-csökkenés látható. Az optimális előkezelési hőmérséklet mind a redukált (red mod) , mind a nem redukált (non

44

red) módosító esetében 1500

o

C. A redukált módosító esetén az

integrált abszorbancia értéke 800-1500

o

C között alig változik, így

magas előhevítési hőmérséklet alkalmazható. Méréseink során a szárítás,

illetve

alkalmaztunk

a

az

előkezelés

palládium

alatt

belső

redukciójának

gázként

H2

elősegítésére.

gázt Az

alkalmazott hőmérsékleti programot a 12. táblázat tartalmazza. 12. táblázat Hőmérsékleti program az ón méréséhez Lépés

Hőmérséklet ( o C)

Szárítás 1 Szárítás 2 Előkezelés 1 Előkezelés 2 Atomizáció Kiizzítás * 95% Ar, 5%

120 200 1500 1500 2300 2450 H 2 belső gáz

Emelkedési idő (s) 1 10 10 1 0 1

Tartási idő (s) Belső gázáramlási sebesség (cm 3 /min) 60 250* 20 250* 20 250* 10 250 5 0 3 250

3.2. Analitikai teljesítmény Az elemek salétromsavas összehasonlító oldatokkal felvett kalibrációs görbéinek adatait, és a mérések analitikai teljesítmény adatait a 13. táblázatban foglaltuk össze. A kimutatási határt a vak szórásának

háromszoros

értékéből

határoztuk

meg,

majd

átszámítottuk száraz tömegre. Az érzékenység az 1% abszorpcióhoz (0,044A) tartozó tömegmennyiség. A visszanyerést a mérések során a mintához adagolt ismert mennyiségű standard mérésével határoztuk meg.

45

13. táblázat Kadmium, ólom, szelén, ón kalibrációs görbéinek adatai és analitikai teljesítmény értékei Elem Kalibrációs görbe Korrelációs együttható

Kimutatási határ

Érzékenység

Szórás

Visszanyerés

meredeksége (s)

(R)

(µg/kg)

(pg)

(RSD%)

(%)

Cd

0,0336

0,9983

1,5

1,32

<2%

85-95

Pb

0,0013

0,9985

11,6

32

<5%

95-105

Se

0,0013

0,9995

59,8

40

<5%

80-90

Sn

0,0012

0,9993

15,3

60

<10%

110-130

46

3.3. A mérési módszer hitelesítése Egy analitikai meghatározás pontossága két úton állapítható meg. Az egyik lehetőség, hogy ugyanazon minták elemkoncentrációit más független módszerrel is vizsgáljuk, a másik lehetőség, hogy standard referenciaanyag analízisét végezzük el [107]. 3.3.1. Biológiai standard referenciaanyagok analízise Emberi

agyból

készült

nemzetközi

referenciaanyag

nem

létezik. Az analízis pontosságának ellenőrzésére három különböző referenciaanyagot használtunk. A NIST Bovine Liver 1577a és a DORM-2

standard

meghatározás

referenciaanyagok

hitelesítésére,

bizonyultak

mivel

ezek

alkalmasnak

a

elemkoncentrációi

összevethetőek az agymintákban mérhető értékekkel, és a mátrixuk is hasonló. Mérési eredményeink a hiteles értékekkel jó egyezést mutatnak, amint az a 14. táblázat adataiból kitűnik. Az ón értékek csak információs jellegűek, hiteles adatokat nem adnak meg. 14. táblázat Referencia vizsgálatok (ng/g; száraz tömegre vonatkoztatva) elem NIST Bovine

NIST

DORM-2

DORM-2

IAEA-155

IAEA-155

Bovine

hiteles érték

mért érték

hiteles

mért érték

Liver 1577a Liver 1577a

érték

hiteles érték mért érték Cd

440 ± 60

380

43 ± 8

45

16.0 ± 3.5

19

Pb

135 ± 15

143

65 ±7

100

104 ± 33

89

Se

710 ± 70

720

1400 ±90

1250

64 ± 13

15

Sn*

<2**

<5**

23

8

-

-

47

*

Sn esetében egyik referenciaanyag sem ad meg hiteles értéket, a

feltüntetett adat ′′information value′′, a mért értékek szórása (RSD%) Cd<1%, Pb, Se, Sn<5% **

Kimutatási határ alatti értékek

3.3.2. Szelén meghatározása neutronaktivációs módszerrel A szelén eredmények ellenőrzésére alkalmunk nyílt neutronaktivációs analízis elvégzésére néhány agyminta esetén. A 15. táblázatból látható, hogy a különböző módszerekkel meghatározott szelén értékek jó egyezést mutatnak. 15. táblázat Se eredmények három különböző agyterület esetén GF-AAS és NAA módszerrel (ng/g; száraz tömegre vonatkoztatva) agyterület

GF-AAS

NAA

gyrus frontális medius 530

520

lobulus

610

parietalis 590

superior corpus callosum

270

250

a mérések szórása (RSD%) <5% (GF-AAS), <10% (NAA)

3.4. A két feltárási technika összehasonlítása A különböző feltárási technikákkal nyert koncentrációértékeket mutatja be a 16.táblázat. Az adatok jó egyezéséből levonható az a következtetés, hogy az új módszerként alkalmazott mikrohullámú eljárás alkalmas agyminták feltárására. A mikrohullámú módszer előnye, hogy jóval gyorsabb, két óra feltárási idő helyett húsz perc szükséges, és egyszerre hat minta tárható fel.

48

16. táblázat A két feltárási technika összehasonlítása, Parrbombával (P) és mikrohullámú feltárással (M) kapott adatok Se és Sn elemek analízisekor (ng/g; száraz tömegre vonatkoztatva, n=3) elem

Pulvinar

Pulvinar

Thalamus

Thalamus

thalami

thalami

P

M

P

M

Se

540

560

450

430

Sn

160

150

40

40

A Se értékek szórása (RSD%) <5%, az Sn értékeké <10%. 3.5. A különböző agyterületek elemkoncentrációi és a hozzájuk tartozó szórásértékek A

17.táblázatban

mutatjuk

be

a

különböző

személyekből

származó egyes agyrészek mérési eredményeit a mért elemekre illetve a hozzájuk tartozó szórásértékeket. Az átlagértékeket a x á t l = ∑x i /n, a szórást a s 2 = Q/n-1; Q = ∑(x i -x á t l ) 2 , a relatív szórást a V = 100s/x á t l összefüggésekből számítottuk, (x = értékek, x á t l = átlagérték, s = szórás, V = relatív szórás, n = adatok száma). Egyes agyrészekben - a rendelkezésre álló kis anyagmennyiség miatt - nem minden elemet tudtunk meghatározni, így a 17. táblázatban csak azok az agyrészek szerepelnek, ahol mind a négy elemre vannak mérési eredményeink. A

táblázatból

látható,

koncentrációértékeinek

hogy

a

szórása

kadmium, különböző

az

ólom

egyedek

és

az

ón

ugyanazon

agyrészeinek átlagát tekintve olyan nagy, hogy ezekre az elemekre a normál átlagértékek nem adhatóak meg. Ugyanakkor a szelén esetén a relatív szórás 5-15 % közötti, tehát ebben az esetben az átlagértékek valódi

tartalommal

bírnak.

Hangsúlyozni

kell

azonban,

hogy

statisztikai következtetések levonásához a jelenlegi meghatározások száma csekély.

49

17. táblázat Az egyes agyterületek elemkoncentrációi (ng/g; száraz tömegre vonatkoztatva) agyterület

Cd

Pb

Se

Sn

caput nuclei caudati

126

476

329

94

caput nuclei caudati

151

251

409

109

caput nuclei caudati

161

183

382

63

átlagérték

144

303

373

89

szórás

18

153

41

23

relatív szórás [%]

12

51

11

26

putamen

241

172

647

179

putamen

103

408

586

31

putamen

263

354

563

27

putamen

177

129

536

140

putamen

186

388

499

121

átlagérték

194

290

566

100

szórás

62

130

56

68

relatív szórás [%]

32

45

10

68

globus pallidus

107

350

630

18

globus pallidus

104

509

511

191

50

átlagérték

106

430

571

105

szórás

2

112

84

122

relatív szórás [%]

2

26

15

117

thalamus

266

405

529

51

thalamus

359

307

656

34

thalamus

222

1074

559

86

átlagérték

282

595

581

57

szórás

70

417

66

27

relatív szórás [%]

25

70

11

47

pulvinar thalami

270

416

492

28

pulvinar thalami

352

213

503

37

pulvinar thalami

186

344

529

123

pulvinar thalami

164

244

539

160

pulvinar thalami

302

410

547

154

átlagérték

255

325

522

100

szórás

79

94

24

64

relatív szórás [%]

31

29

5

63

gyrus hyppocampus

180

731

420

80

gyrus hyppocampus

152

312

390

140

51

gyrus hyppocampus

81

169

471

43

átlagérték

138

404

427

85

szórás

51

292

41

49

relatív szórás [%]

37

72

10

58

corpus callosum

201

223

270

90

corpus callosum

83

244

255

218

corpus callosum

125

149

285

28

átlagérték

136

205

270

112

szórás

60

50

15

97

relatív szórás [%]

44

24

6

87

cortex cerebri

154

112

540

250

cortex cerebri

206

280

425

37

cortex cerebri

181

134

449

141

cortex cerebri

151

194

594

147

átlagérték

173

180

502

144

szórás

26

75

79

87

relatív szórás [%]

15

42

16

61

nucleus ruber

76

73

410

166

nucleus ruber

121

356

464

37

52

nucleus ruber

211

176

501

166

nucleus ruber

299

582

416

177

átlagérték

177

297

448

137

szórás

99

223

43

67

relatív szórás [%]

56

75

10

49

entoriális terület

132

196

388

139

entoriális terület

151

197

392

74

átlagérték

142

197

390

107

szórás

13

0,7

3

46

relatív szórás [%]

9

0,004

0,007

43

frontális parasagittalis

167

179

623

280

82

182

621

29

76

244

579

110

261

740

561

52

átlagérték

147

336

596

118

szórás

87

271

31

113

relatív szórás [%]

59

81

5

96

kéreg frontális parasagittalis kéreg frontális parasagittalis kéreg frontális parasagittalis kéreg

53

lobulus parietalis

43

178

465

19

105

141

488

132

69

180

592

81

100

174

527

65

71

222

592

28

átlagérték

78

179

533

65

szórás

25

29

58

45

relatív szórás [%]

33

16

11

70

lobulus parietalis

184

192

526

112

66

312

618

28

átlagérték

125

252

572

70

szórás

83

85

65

59

relatív szórás [%]

67

34

11

85

superior lobulus parietalis superior lobulus parietalis superior lobulus parietalis superior lobulus parietalis superior

inferior lobulus parietalis inferior

az egyes értékek szórása (RSD%) Cd, Pb, Se<5%, Sn<10%

54

3.6. A két agyi félteke elemkoncentrációinak összehasonlítása Összehasonlítva ugyanazon agyrészek elemkoncentrációit a bal és a jobb féltekén (18. táblázat) kitűnik, hogy az esszenciális szelén koncentrációja mindkét féltekéből hasonló, ami összhangban van más esszenciális elemek méréseivel [106]. Az ón értékek esetén viszont jelentős különbségek tapasztalhatók a féltekék között. Ilyen nagyfokú és

rendszertelen

eltérésekre

derült

fény

a

toxikus

elemek

vizsgálatakor is (Cd, Pb) [102], ami arra mutat, hogy az ón nem esszenciális elem, mivel az esszenciális elemek koncentrációja csak szűk határok között mozog, a sejtekbe történő bejutás és kiürülés szabályozott folyamat. 18. táblázat A Se és az Sn koncentrációja putamenből mindkét agyi féltekéből, (ng/g; száraz tömegre vonatkoztatva, n=3) páciens

Se

Sn

A bal oldal

662

40

A jobb oldal

647

31

B bal oldal

499

27

B jobb oldal

536

51

C bal oldal

563

91

C jobb oldal

541

162

A Se értékek szórása (RSD%) <5%, az Sn értékeké <10%. 3.7.

Esszenciális

és

nem

esszenciális

elemek

eloszlásának

vizsgálata Az 7. ábrán összehasonlítottuk az esszenciális szelén, és a toxikus ólom és kadmium koncentrációit két agyterületben különböző személyek

esetén.

Látható,

hogy

a

szelén

értékek

mindkét

agyterületben átlagértékkel jellemezhetők, azaz a különböző emberek

55

ugyanazon

agyterületeiben

hasonló

normál

koncentráció-értékek

mérhetőek. A toxikus elemek értékei ellenben igen nagy eltéréseket mutatnak mind a különböző személyekben ugyanazon agyterületek, mind a vizsgált személyek különböző agyterületei között, s így normál átlagértékeket nem tudunk megadni.

800,00 700,00 600,00 500,00

Cd Pb Se

400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 A

A

A

A

A

B

B

Se Pb Cd B

B

7. ábra Cd, Pb Se koncentrációja két agyterület (A-putamen, B-frontális parasaggitalis kéreg, n=5)

56

Eredmények megbeszélése és összefoglalás Az ELTE Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszékén évek óta folyik emberi agyminták vizsgálata. A korábbi kísérletek során behatóan

tanulmányozták

eljárásokat,

valamint

alkalmazhatóságát

a

mintavételi,

vizsgálták emberi

a

-tárolási,

különböző

agyrészek

-előkészítési

mérési

metodikák

nyomelem-tartalmának

meghatározására (ICP-AES, NAA, GF-AAS). Az

analitikai

korábbiaknál

módszerek

nagyságrendekkel

fejlődése kisebb

következtében

koncentrációkat

a

lehet

meghatározni, egyre több elemről derül ki hogy kölcsönhatásban vannak az élő szervezetekkel. Az utóbbi időben egyre jelentősebb teret kap a biokémiai, elemanalitikai kutatásokban a szervezetbe beépülő toxikus fémek (kadmium, ólom) vizsgálata. A szelén kiemelt helyet foglal el nemcsak a toxikológiai munkákban, de a szervezetre gyakorolt feltételezett jótékony hatásai miatt is. Az ón biológiai szerepéről nagyon kevés adat áll még rendelkezésre. Jelenlegi

munkánk

célja

az

volt,

hogy

grafitkemencés

atomabszorpciós módszert dolgozzunk ki emberi agyminták kadmium, ólom, szelén és ón tartalmának meghatározására, tanulmányozzuk a különböző feltárási technikákat, meghatározzuk ezen elemek normál koncentrációit,

illetve

tanulmányozzuk

az

elemek

agyterületek

közötti eloszlását. Összehasonlítottuk

a

Parr-bombával

feltárt

minták

elemkoncentrációit a mikrohullámú energiával feltárt mintákéval és nem tapasztaltunk különbséget. A mikrohullámú feltárás időigénye jelentősen kevesebb, így ez bizonyult hatékonyabbnak. A mátrix okozta zavaró hatásokat az előhevítési és atomizációs hőmérsékletek optimálásával küszöböltük ki. A

Cd

kidolgozni.

és

az

Pb

Vizsgáltuk

esetében az

sikerült

előhevítési

57

szimultán és

az

módszert

atomizációs

hőmérsékletnek az atomabszorpciós jelre gyakorolt hatását, 5 µg NH 4 H 2 PO 4 , és 3 µg magnéziumot tartalmazó Mg(NO 3 ) 2 módosítók jelenlétében. A kísérletek alapján 600 o C előhevítési és 1600 o C atomizációs hőmérséklet bizonyult optimálisnak. Szelén esetében megvizsgáltuk a kémia módosító növekvő koncentrációinak az atomabszorpciós jelre gyakorolt hatását 5, 10, 15, 20 µg Pd esetében. Az integrált abszorbancia értékek nem változtak lényegesen, míg az abszorbancia tranziensek lefutása a Pd koncentrációjának növekedésével jelentősen javult. Vizsgáltuk a Pd különböző

módosulatainak

(redukált,

nem

redukált,

előredukált)

hatását az előkezelési görbékre. Szelén

meghatározására

kémiai

módosítóként

µg

20

palládiumot tartalmazó palládium-nitrátot alkalmaztunk. A módosítót 1000

o

C-on palládiummá redukálva, ún. ″thermally pre-reduced″

módosító

használatával

a

háttér

csökkenését,

valamint

az

atomabszorpciós csúcsalak javulását tapasztaltuk. Az előkezelési hőmérséklet 1200

o

C-nak, az atomizációs hőmérséklet 2100

o

C-nak

adódott. Az ón mérésénél belső gázként Ar helyett 95% Ar és 5% H 2 összetételű gázt alkalmaztunk. Mg nélküli Pd módosító használatával a mátrix okozta zavaró hatás jelentős mértékben megnövekedett. Nagyobb mennyiségű Mg módosító adagolása a háttér-abszorbancia növekedését eredményezi. 10 µg Pd és 3 µg Mg alkalmazásával 1500 o

C előkezelési és 2300 o C atomizációs hőmérsékletet értünk el. A mérések relatív standard deviációja (RSD%) Cd <1%, Pb, Se

<5%,

Sn

esetében

<10%.

Az

előhevítési

hőmérsékletek

és

a

mátrixmódosító reagensek optimálását, az integrált abszorbancia zavarásmentes mérését a hozzáadott standardot tartalmazó mintákra mért visszanyerési értékekkel igazoltuk. Cd, Pb elemek esetében a visszanyerés 90-105%-nak, Se-re 80-90%-nak, Sn-ra 105-120%-nak bizonyult.

58

A mérések pontosságát nemzetközi biológiai referenciaanyagok (NIST

SRM

1577/a,

DORM-2,

IAEA-155)

analízise,

és

szelén

esetében független módszer (neutronaktivációs analízis) alkalmazása igazolta. Az agyminták szárazanyagra vonatkoztatott átlagos nyomelem koncentrációi a következők: Cd: 80-300 ng/g, Pb: 100-500 ng/g, Se: 500-600 ng/g, Sn: 30-120 ng/g. Az eredmények az elemek nemhomogén eloszlását mutatják. Az esszenciális szelén koncentrációja hasonló a két félteke megfelelő területein. A toxikus elemek (Cd, Pb, Sn) jelentős koncentráció-eltéréseket mutatnak a különböző emberek ugyanazon agyrészeiben és a két agyi félteke között is, így ezekre az elemekre normál átlagértékek nem állapíthatóak meg. A különböző személyekből származó nagy koncentráció különbségek feltehetően a környezetből történő különböző akkumulációnak tulajdonítható. A szelén értékek szórása 15% alatt marad az egyes agyterületek vizsgálatakor, de a normál átlagértékek megadásához nagyszámú további vizsgálat szükséges.

59

Determination of cadmium, lead, selenium and tin in human brain by graphite furnace atomic absorption spectrometry Norbert Szoboszlai Supervisors: Erzsébet Andrási Dr., Lajos Barcza Dr. Eötvös Loránd University, Department of Inorganic and Analitical Chemistry Semmelweis University School of PH. D. Studies Modern trends in pharmaceutical sciences Trace elements play a key role in a variety of processes necessary for life. Various studies have shown that a define correlation exists between trace element content and many common diseases. In the present study our first aim was to work out a graphite furnace atomic absorption spectrometry (GF-AAS) method to determine the Cd, Pb, Se and Sn concentrations at trace level in human brain samples. Our second goal was to study different digestion techniques, and to determine the normal concentrations of these elements in different brain regions. In the case of the Cd and the Pb simultaneous method was carried out. In the case of the selenium pd-nitrate was used as a chemical modifier. The decrease of the background and the improvement of the shape of the atomic absorption peak were experienced using the ″thermally prereduced″ modifier (reduction of the Pd-nitrate to Pd on 1000 oC). The pre-treatment temperature was 1200 oC, the atomization temperature was 2100 oC. For Sn measuring instead of Ar, 95% Ar and 5% H2 gas was used as an internal gas, applying 10 µg Pd + 3 µg Mg were recognized as the most appropriate techniques. The average concentrations of the brain samples (dry weight): Cd: 80-300 ng/g, Pb: 100-500 ng/g, Se: 500-600 ng/g, Sn: 30-120 ng/g. The present results show a non-homogeneous distribution of the essential element (Se) in normal human brain. Corresponding regions in both hemispheres of one human brain show almost identical concentration for this element. In the case of toxic elements (Pb, Cd, Sn) an average value in different brain regions can not be established because of the high variability of individual data.

60

Kadmium, ólom, szelén és ón meghatározása emberi agymintákból grafitkemencés atomabszorpciós módszerrel Szoboszlai Norbert Témavezető: Dr. Andrási Erzsébet és Dr. Barcza Lajos ELTE, Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A gyógyszerészeti tudományok korszerű kutatási irányai Az utóbbi időben egyre jelentősebb teret kap az elemanalitikai kutatásokban a szervezetbe beépülő toxikus fémek (kadmium, ólom) vizsgálata. A szelén kiemelt helyet foglal el a szervezetre gyakorolt feltételezett jótékony hatásai miatt. Az ón biológiai szerepéről nagyon kevés adat áll még rendelkezésre. Jelenlegi munkánk célja az volt, hogy grafitkemencés atomabszorpciós módszert dolgozzunk ki emberi agyminták kadmium, ólom, szelén és ón tartalmának meghatározására. Célul tűztük ki továbbá a különböző feltárási technikák tanulmányozását, valamint ezen elemek normál koncentrációinak meghatározását a különböző agyi régiókban. A Cd és az Pb esetében sikerült szimultán módszert kidolgozni. Szelén esetében kémiai módosítóként 20 µg előredukált palládiumot tartalmazó palládiumnitrátot alkalmaztunk. Az előkezelési hőmérséklet 1200 oC-nak, az atomizációs hőmérséklet 2100 oC-nak adódott. Az ón mérésénél belső gázként Ar helyett 95% Ar és 5% H2 összetételű gázt alkalmaztunk. 10 µg Pd és 3 µg Mg alkalmazásával 1500 o

C előkezelési és 2300 oC atomizációs hőmérsékletet értünk el. Az agyminták szárazanyagra vonatkoztatott átlagos nyomelem koncentrációi

a következők: Cd: 80-300 ng/g, Pb: 100-500 ng/g, Se: 500-600 ng/g, Sn: 30-120 ng/g. Az eredmények az elemek nem-homogén eloszlását mutatják. Az esszenciális szelén koncentrációja hasonló a két félteke megfelelő területein. A toxikus elemek (Cd, Pb, Sn) jelentős koncentráció-eltéréseket mutatnak a különböző emberek ugyanazon agyrészeiben és a két agyi félteke között is, ami feltehetően a környezetből történő akkumulációnak tulajdonítható.

61

Irodalomjegyzék [1] E. Andrási, É. Farkas, H. Scheiber, A. Réffy, L. Bezúr. Al, Zn, Cu, Mn and Fe levels in brain in Alzheimer’s disease. Archives of Gerontology and Geriatrics. 21 (1995) 89-97. [2] E. Andrási, J. Nádasdi, Zs. Molnár, L. Bezúr, L. Ernyei. Determination of main and trace element contents in human brain by NAA and ICP-AES methods. Biological Trace Element Research. 26/27 (1990) 691-698. [3] E. Andrási, É. Farkas S. Igaz, K. Tóth. Brain B, P and S concentrations in Alzheimer’s disease. Clinical Neuroscience. 51 (1998) 37-38. [4] E. Andrási, É. Farkas, L. Almási, N. Szoboszlai. Earth alkali element imbalances in brain of Alzheimer’s disease patients. Clinical Neuroscience. 49 (1996) 25-26. [5] E. Andrási, É. Farkas, D. Gawlik, U. Rösick, P. Bratter. Brain iron and zinc contents of german patients with Alzheimer disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 2 (2000) 17-26. [6] D.G. Barceloux. Selenium. Journal of Toxicology–Clinical Toxicology. 37 (1999) 145-172. [7] S.R. Stapleton. The selenium conundrum. Cellular and Molecular Life Sciences. 57 (2000) 1823-1824. [8] J.P. Diaz-Alercón, M. Navarro-Alercón, H. Lopez-Garcia de la Serana, M.C. Lopez-Martinez. Determination of selenium in cereals, legumes and dry fruits from southeastern Spain for calculation of daily dietary intake. The Science of The Total Environment. 184 (1996) 183-189. [9] J.T. Rotruck, A.L. Pope, H.E. Ganther, A.B. Swanson, D.G. Hafeman, W.G. Hoekstra. Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science. 179 (1973) 588-590. [10] J.R. Arthur. The glutathion peroxidase. Cellular & Molecular Life Sciences. 57 (2000) 1825-1835.

62

[11] K. Takahashi, J.W. Avissar, H.Cohen. Purification and characterization of human plasma glutathion peroxidase: a selenoglycoprotein distinct from the known cellular enzyme. Archives of Biochemistry & Biophysics. 256 (1987) 677-686. [12] K. Wingler, R. Brigelius-Flohe. Gastrointestinal glutathione peroxidase. Biofactors. 10 (1999) 245-249. [13] P. Holovet, D. Collen. Oxidized lipoproteins in atherosclerosis and thrombosis. Faseb Journal. 8 (1994) 1279-1284. [14] V. Mostert. Selenoprotein P: properties, functions, and regulation. Archives of Biochemistry & Biophysics. 376 (2000) 433-438. [15] Q.P. Gu, Y. Sun, L.W. Ream, P.D. Whanger. Selenoprotein W accumulates primarily in primate skeletal muscle, heart, brain and tongue. Molecular & Cellular Biochemistry. 204 (2000) 49-56. [16] J. Köhrle. The deiodinase family: selenoenzymes regulating thyroid hormone availability and action. Cellular & Molecular Life Sciences. 57 (2000) 1853-63. [17] J.M. May, S. Mendiratta, K.E. Hill, R.F. Burk. Reduction of dehydroascorbate to ascorbate by the selenoenzyme thioredoxin reductase. The Journal of Biological Chemistry. 272 (1997) 22607-22610. [18] Keshan Disease Research Group. Observations on effect of sodium selenite in prevention of Keshan disease. Chinese Medical Journal. 92 (1979) 471-476. [19] R. Moreno-Reyes, C. Suetens, F. Mathieu, F. Beyaux, D. Zhu, M.T. Rivera, M. Boelaert, J. Neve, N. Perlmutter, J. Vanderpas. Kashin-Beck osteoarthropathy in rural Tibet in relation to selenium and iodine status. New England Journal of Medicine. 339/16 (1998) 1112-1120. [20] M.A. Beck, P.C. Kolbeck, L.H. Rohr, Q. Shi, V.C. Morris, O.A. Levander. Benign human enterovirus becomes virulent in selenium-deficient mice. Journal of Medical Virology. 43 (1994) 166-170. [21] M.R. Brown, H.J. Cohen, J.M. Lyons, T.W. Curtis, B. Thunberg, W.J. Cochran, W.J. Klish. Proximal muscle weakness and selenium deficiency associated with long-term parenteral nutrition. The American Journal of Clinical Nutrition. 43 (1986) 549-554.

63

[22] A.M. Fan, K.W. Kizer. Selenium. Nutritional, toxicologic, and clinical aspects. West Journal of Medicine. 153 (1990) 160-167. [23] K. Helzlsouer, R. Jacobs, S. Morris. Acute selenium intoxication in the United States. Federation Proceedings. 44 (1985) 1670. [24] M. Vinceti, G. Nacci, E. Rocchi, T. Cassinadri, R. Vivoli, C. Marchesi, M. Bergomi. Mortality in a population with long-term exposure to inorganic selenium via drinking water. Journal of Clinical Epidemiology. 53 (2000) 1062-1068. [25] J. Virtamo, E. Valkeila, G. Alfthan, S. Punsar, J.K. Huttunen, M.J. Karvonen. Serum selenium and the risk of coronary heart disease and stroke. American Journal of Epidemiology. 122 (1985) 276-282. [26] G. N. Schrauzer. Anticarcinogenic effects of selenium. Cellular and Molecular Life Sciences. 57 (2000) 1864-1873. [27] M. Vinceti, S. Rovesti, M. Bergomi, G. Vivoli. The epidemiology of selenium and human cancer. Tumori. 86 (2000) 105-118. [28] L.C. Clark, G.F. Combs, B.W. Turnbull, E.H. Slate, D.K. Chalker. Effects of selenium supplementation for cancer prevention in patients with carcinoma of the skin. Journal of American Medical Association. 276 (1996) 1957-1963. [29] P.L. Goering, M.P. Waalkes, C.D. Klaassen. Handbook of experimental pharmacology 115. Toxicology of metals. Springer, New York 1994 189-214. [30] T. Kakeekal, S.B. Lall, G. Dan. Cadmium accumulation in the lung, liver and kidney of rats chronically exposed to cigarette smoke. Journal of Forensic Medicine and Toxicology. 15 (1998) 1-4. [31] J. Stohss, D. Bagchi, E. Hassoun, M. Bagchi. Oxidative mechanism in the toxicity of chromium and cadmium ions. Journal of Environmental Pathology and Oncology. 20 (2001) 77-88. [32] Z.A. Shaikh, T.T. Vu, K. Zaman. Oxidative stress as a mechanism of chronic cadmium-induced hepatotoxicity and renal toxicity and protection by antioxidants. Toxicology & Applied Pharmacology. 154 (1999) 256-263. [33] F. Lermioglu, A. Bernard. Effect of calmodulin inhibitors and verapamil on the nephrotoxicity of cadmium in rat. Toxicology Letters. 95 (1998) 9-13. [34] M. Kasuya. Recent epidemiological studies on itai-itai disease as a chronic cadmium poisoning in Japan. Water Science and Technology. 42 (2000) 147-154.

64

[35] C. Wang, M.H. Bhattacharyya. Effect of cadmium on bone calcium and 45Ca in nonpregnant mice on a calcium-deficient diet: evidence of direct effect of cadmium on bone. Toxicology & Applied Pharmacology. 120 (1993) 228-239. [36] C. Dorian, V.H. Gattone, C.D. Klaassen. Renal cadmium disposition and injuries as a result of accumulation of cadmium-metallothionein by the proximal convoluted tubules – a light microscopic autoradiography study with 109CdMT. Toxicology & Applied Pharmacology. 114 (1992) 173-181. [37] IARC Beryllium, cadmium, mercury, and exposures in the glass manufacturing industry. International Agency for Research on Cancer monographs. 58 (1993) Lyon, France 119-238. [38] L. Stayner, R. Smith, M. Thun, T. Schorr, R. Lemen. A dose-response analysis and quantitative assessment of lung cancer risk and occupational cadmium exposure. Annual Epidemiology. 2 (1992) 177-194. [39] K. Arisawa, A. Nakano, H. Saito, X. J. Liu, M. Yokoo, M. Soda, T. Kola, T. Takahashi, K. Kinoshita. Mortality and cancer incidence among a population previously exposed to environmental cadmium. International Archives of Occupational and Environmental Health. 74 (2001) 255-262. [40] D. R. Williams. An introduction to bio-inorganic chemistry 1976 [41] S. Srianujata. Lead – the toxic metal to stay with human. Journal of Toxicological Sciences. 2 (1998) 237-240. [42] G. Ysart, P. Müller, M. Croasdale, H. Crews, P. Robb, M. Baxter, C. L’Argy, N. Harrison. 1997 UK total diet study – Dietary exposures to aluminium, arsenic, cadmium, chromium, copper, lead, mercury, nickel, selenium, tin and zinc. Food Additives and Contaminants. 17 (2000) 775-786. [43] A.C. Aufderheide, L.E. Wittmers Jr. Selected aspects of the spatial distribution of lead in bone. Neurotoxicology. 13 (1992) 809-819. [44] J. S. Woods. Handbook of experimental pharmacology 115. Toxicology of metals. Springer, New York 1994 27-38. [45] S.J. Pocock, D. Ashby, M.A. Smith. Lead exposure and children’s intellectual performance. International Journal of Epidemiology. 16 (1987) 57-67.

65

[46] P. Sithisarankul, M. Cadorette, C.T. Davoli, J.R. Servint, J.J. Chisolm, P.T. Strickland. Plasma 5-aminolevulinic acid concentration and lead exposure in children. Environmental Research. 80 (1999) 41-49. [47] L. Nagy, A. Szorcsik, K, Kovács. Tin compounds in pharmacy and nutrition. Acta Pharmaceutica Hungarica. 70 (2000) 53-71. [48] G. H. Biego, M. Yoyeux, P. Hartemann, G. Debry. Determination of dietary tin intake in an adult french citizen. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 36 (1999) 227-232. [49] N. Cardanelli. Tin and the thymus gland: a review. Thymus. 15 (1990) 223-231. [50] K. Yokoi, M. Kimura, Y. Itokawa. Effect of dietary tin deficiency on growth and mineral status in rats. Biological Trace Element Research. 24 (1990) 223-231. [51] K.A. Winship. Toxicity of tin and its compounds. Adverse Drug Reactions & Acute Poisoning Reviews. 7 (1988) 19-38. [52] J. Chmielnicka, G. Zareba, E. Polkowska-Kulesza, M. Najder, A. Korycka. Comparison of tin and lead toxic action on erythropoietic system in blood and bone marrow of rabbits. Biological Trace Element Research. 36 (1993) 73-87. [53] A.S. King. The production of spectra by an electrical resistance furnace in hydrogen atmosphere. Astrophysical Journal. 27 (1908) 353-357. [54] A. Walsh. The application of atomic absorption spectra to chemical analysis. Spectrochimica Acta. 7 (1955) 108-117. [55] B.V. L’vov. An investigation of atomic absorption spectra by complete vaporization of substance in a graphite cell. Spectrochimica Acta. 17B (1961) 761768. [56] H. Massmann. Comparison of atomic absorption and atomic fluorescence in graphite cuvettes. Spectrochimica Acta. 23B (1968) 215-226. [57] W. Huettner, C. Busche. Structure and reactivity of carbon materials used in atomization furnaces. Fresenius Journal of Analytical Chemistry. 323 (1986) 674680. [58] W. Frech. Recent developments in atomizers for electrothermal atomic absorption spectrometry. Fresenius Journal of Analytical Chemistry. 355 (1996) 475486.

66

[59] B. V. L’vov. Electrothermal atomization – the way toward absolute methods of atomic absorption analysis. Spectrochimica Acta. 33B (1978) 153-193. [60] W. Slavin, D.C. Manning, G. R. Carnrick. The stabilized temperature platform furnace. Atomic Spectroscopy. 2 (1981) 137-145. [61] R.D. Ediger. Atomic absorption analysis with the graphite furnace using matrix modification. Atomic Absorption Newsletter. 14 (1975) 127-130. [62] N. Zhe-ming, S. Xiao-quan. The reduction and elimination of matrix interferences in graphite furnace atomic absorption spectrometry. Spectrochimica Acta. 42B (1987) 937-949. [63] W. Slavin, D.C. Manning, G.R. Carnrick. Magnesium nitrate as a matrix modifier in the stabilized temperature platform furnace. Analytical Chemistry. 54 (1982) 621-624. [64] L. Ebdon, A. Lechotycki. The determination of cadmium in environmental samples by slurry atomization graphite furnace atomic absorption spectrometry using platform and matrix modification. Microchemical Journal. 36 (1987) 207-215. [65] G. Schlemmer, B. Welz. Palladium and magnesium nitrates, a more universal modifier for graphite furnace atomic absorption spectrometry. Spectrochimica Acta. 41B (1986) 1157-1165. [66] W. Frech, D.C. Baxter, B. Hütsch. Spatially isothermal graphite furnace for atomic absorption spectrometer using side-heated cuvettes with integrated contacts. Analytical Chemistry. 58 (1986) 1973-1977. [67] W. Frech, B.V. L’vov. Matrix vapours and physical interference effects in graphite

furnace

atomic

absorption

spectrometry

II.

Side-heated

tubes.

Spectrochimica Acta. 48B (1993) 1371-1379. [68] J.M. Harnly, J. S. Kane. Optimization of electrothermal atomization parameters for simultaneous mulielement atomic absorption spectrometry. Analytical Chemistry. 56 (1984) 48-54. [69]

B. Radziuk, G. Rödel, M. Zeiher, S. Mizuno, K. Yamamoto. Solid state

detector

for

simultaneous

multi-element

electrothermal

atomic

absorption

spectrometry with Zeeman-effect background correction. Journal of Analitical Atomic Spectrometry. 10 (1995) 415-422.

67

[70] B. Radziuk, G. Rödel, H. Stenz, H. Becker-Ross, S. Florek. Spectrometer system

for

simultaneous

multi-element

electrothermal

atomic

absorption

spectrometry using line sources and Zeeman-effect background correction. Journal of Analitical Atomic Spectrometry. 10 (1995) 127-136. [71] H. Falk. Analytical capabilities of atomic spectrometric methods using tunable lasers: a theoretical approach. Prog. Analytical Spectroscopy. 3 (1980) 181-208. [72] K. Niemax, A. Zybin, C. Schnürer-Patschan, H. Groll. Semiconductor diode lasers in atomic spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (1996) 351-356. [73] S. Florek, H. Becker-Ross. High-resolution spectrometer for atomic spectrometry. Journal of Analitical Atomic Spectrometry. 10 (1995) 145-147. [74] H. Becker-Ross, S. Florek. Echelle spectrometers and charge-coupled devices. Spectrochimica Acta 52B (1997) 1367-1376. [75] O. Mestek, M. Suchanek, Z. Vodickova, B. Zemanova, T. Zima. Comparison of the suitability of various atomic spectroscopic techniques for the determination of selenium in human whole blood. JAAS. 12 (1997) 85-89. [76] M. Chiba, V. Iyengar, R.R. Greenberg, T. Gills.

Determination of tin in

biological materials by atomic absorption spectrophotometry and neutron activation analysis. Science of the Total Environment. 148 (1994) 39-44. [77] Z.W. Zhang, S. Shimbo, N. Ochi, M. Eguchi, T. Watanabe, C.S. Moon, M. Ikeda. Determination of lead and cadmium in food and blood by inductively coupled plasma mass spectrometry: a comparison with graphite furnace atomic absorption spectrometry. Science of the Total Environment. 205 (1997) 179-187. [78] V. Ducros, D. Ruffieux, N. Belin, A. Favier. Comparison of two digestion methods for the determination of selenium in biological samples. Analyst. 119 (1994) 1715-1717. [79] T. Nakamura, T. Kusata, H. Matsumoto, J. Sato. Atomic absorption spectrometric determination of cadmium and lead in human and artificial teeth by direct atomization technique. Analytical Biochemistry. 226 (1995) 256-262. [80] N. Campillo, P. Vinas, I. Lopez-Garcia, M. Hernandez-Cordoba. Selenium determination

in

biological

fluids

using

68

Zeeman

background

correction

electrothermal atomic absorption spectrometry. Analytical Biochemistry. 280 (2000) 195-200. [81] P. BermejoBarrera, A.M. Pineiro, T.R. Barbeito, J.M. Pineiro, A. BermejoBarrera. Use of aqueous slurry sampling for the determination of lead in human hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry. Talanta 43 (1996) 1099-1107. [82] A. Alegria, R. Barbera, R. Farre, E. Ferrer, MJ. Lagarda, M.A. Torres. Optimization of selenium determination in human milk and whole blood by flow injection hydride atomic absorption spectrometry. Journal of AOAC International. 81 (1998) 457-461. [83] T.H. Lin, W.C. Tseng, S.Y. Cheng. Direct determination of selenium in human blood plasma by graphite furnace atomic absorption spectrophotometry and clinical application. Biological Trace Element Research. 64 (1998) 133-149. [84] X.N. Dong, Y. Nakaguchi, K. Hiraki. Determination of chromium, copper, iron, manganese and lead in human hair by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Analytical Sciences. 14 (1998) 785-789. [85] J. Alvarado, R. Moreno, A.R. Cristiano. Determination of Cd, Cr, Cu, Pb and Zn in human semen by graphite furnace atomic absorption spectrometry after microwave sample dissolution. Journal of Trace Elements & Electrolytes in Health & Disease. 5 (1991) 173-180. [86] K.S. Subramanian, J. C. Meranger, J. E. Mackeen. Graphite furnace atomic absorption spectrometry with matrix modification for determination of cadmium and lead in human urine. Analytical Chemistry. 55 (1983) 1064-1067. [87] T.Itami, M. Ema, H. Ameno, H. Kawasaki. Simple determination of tin in biological materials by atomic absorption spectrometry with a graphite furnace. Journal of Analytical Toxicology. 15 (1991) 119-122. [88] M. A. Quijano, A. M. Gutierez, M. C. Perez-Conde, C. Cámara. Determination of selenium species in human urine by high performance liquid chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry. Talanta 50 (1999) 165-173.

69

[89] L. Rahman, W.T. Corns, D.W. Bryce, P.B. Stockwell. Determination of mercury, selenium, bismuth, arsenic, antimony in human hair by microwave digestion atomic fluorescence spectrometry. Talanta 52 (2000) 833-843. [90] I. Harrison, D. Littlejohn, G.S. Fell. Improved molecular fluorescence method for the determination of selenium in biological samples. Analyst 121 (1996) 16411646. [91] W. Wasiak, W. Ciszewska, A. Ciszewski. Differential pulse anodic stripping voltammetric determination of lead, cadmium, zinc and copper in human hair samples of persons in permanent contact with a polluted workplace environment. Analytica Chimica Acta. 335 (1996) 201-207. [92] Z. Q. Gao, K. S. Siow. Adsorptive stripping differential pulse voltammetric determination of trace amounts of tin in biological samples. Analytical Sciences. 12 (1996) 267-271. [93] Z. Tar, I. Varga, A. Török, P. Ress. Determination of micro- and macroelements in human serum and colon tissue samples. VII. Italian-Hungarian Symposium on Spectrochemistry Abstracts. (1995) 91. [94] L. Benninghoff, D. von Czarnowski, E. Denkhans, K. Lemke. Analysis of human tissues by TXRF. Application of chemometrics for diagnostic cancer recognition. Spectrochimica Acta 52B (1997) 1039-1046. [95] B. Tiran, E. Karpf, A. Tiran. Age dependency of selenium and cadmium content in human liver, kidney and thyroid. Archives of Environmental Health. 50 (1995) 242-246. [96] T. Kraus, G. Quidenus, K.H. Schaller. Normal values for arsenic and selenium concentrations in human lung tissue. Archives of Environmental Contamination & Toxicology. 38 (2000) 384-389. [97] A. Ejima, C. Watanabe, H. Koyama, K. Matsuno, H. Satoh. Determination of selenium in the human brain by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Biological Trace Element Research. 54 (1996) 9-21. [98] Suhajda Mónika Szakdolgozat (1991) ELTE Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék

70

[99] E. Andrási, L. Orosz, L. Bezúr, L. Ernyei, Zs. Molnár. Normal human brain analysis. Microchemical Journal 51 (1995) 99-105. [100] Tenczer Tamás Szakdolgozat (1986) ELTE Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék [101] M. Hoenig, A. Cilissen. Performances and practical applications of simultaneous multi-element electrothermal atomic absorption spectrometry the case of the SIMAA 6000. Spectrochimica Acta 52B (1997) 1443-1449. [102] E. Andrási, S. Igaz, N. Szoboszlai, É. Farkas, Zs. Ajtony. Several methods to determine heavy metals in the human brain. Spectrochimica Acta 54B (1999) 819825. [103] E. Bulska, K. Pyrzynska. Comparison of chemical modifiers for the determination of selenium by electrothermal atomic absorption spectrometry. Spectrochimica Acta 52B (1997) 1283-1291. [104] W. Frech, K. Li, M. Berglund, D.C. Baxter. Effect of modifier mass and temperature gradients on analyte sensitivity in electrothermal atomic absorption spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 7 (1992) 141-145. [105] A.B. Volynsky, V. Krivan. Comparison of various forms of palladium used as chemical modifiers for the determination of selenium by electrochemical atomic absorption spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 11 (1996) 159164. [106] N. Szoboszlai, E. Andrási, Zs. Ajtony, I. Császma. Determination of selenium and tin in human brain by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Mikrochimica Acta. 137 (2001) 81-86. [107] E. Andrási, N. Szoboszlai, S. Igaz, K. Tóth. Quality control in element analysis of plant materials. Microchemical Journal. 58 (1998) 262-271.

71

Saját közlemények jegyzéke

1. Szakdolgozat: Cu, Zn, Mn, Fe, Mg agyi koncentrációinak változása az életkor függvényében − A Sclerosis multiplex betegség. 2. E. Andrási, É. Farkas, N. Szoboszlai, L. Almási. Earth alkali element inbalances in brain of Alzheimers disease patients. Clinical Neuroscience 49 (1996) 25−26. 3. E. Andrási, N. Szoboszlai, S. Igaz, K. Tóth. Quality control in element analysis of plant materials. Microchemical Journal 58 (1998) 262-271. 4. E. Andrási, S. Igaz, N. Szoboszlai, É. Farkas, Zs. Ajtony. Several methods to determine heavy metals in the human brain. Spectrochimica Acta Part B 54 (1999) 819-825. 5. N. Szoboszlai, E. Andrási, Zs. Ajtony, I. Császma. Determination of selenium and tin in human brain by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Mikrochimica Acta 137 (2001) 81-86. Konferencia anyagok: 1. Andrási E., Farkas É., Szoboszlai N., Almási L., Earth alkali element inbalances in brain of Alzheimers disease patients, 3rd Hungarian Congress on Alzheimers Disease, Budapest 1996, Abstracts p.14.

72

2. E. Andrási, N. Szoboszlai, É. Farkas, L. Almási, Intercomparison run IAEA−331 for the determination of trace elements in spinach and cabbage (poszter), 8th. Hungarian Italian Symposium on Spectrochemistry, Debrecen 1997 3. N. Szoboszlai, E. Andrási, S. Igaz, Zs. Ajtony. Determination of trace elements in human brain by GF-AAS (poszter), 3rd. European Furnace Symposium, Prága 1998 Abstracts p/II 12. 4. N. Szoboszlai, Zs. Ajtony, E. Andrási, Cs. Bélavári, Simultaneous determination of Cd, Pb, and Cr in human brain samples using graphite furnace atomic absorption spectrometry (poszter), CSI XXXI, Pre-Symposium on Electrothermal Atomization and Vaporization Technique in AAS, OES and ICP-MS, Nevsehir 1999, Abstracts p.62. 5. N. Szoboszlai, E. Andrási, Zs. Ajtony, I. Császma,

Determination of trace

amounts of selenium and tin in human brain samples by transversely heated graphite atomizer for atomic absorbtion spectrometry (poszter), CSI XXXI, Ankara 1999, Abstacts p.452. Magyar Spektrokémiai Vándorgyűlés 1. Szoboszlai N., Andrási E., Farkas É., Tóth K.,

Emberi agyminták

elemtartalmának meghatározása GF-AAS és ICP-MS módszerrel (előadás) MSV 41 Budapest 1998 2. Szoboszlai N., Andrási E., Ajtony Zs., Emberi agyminták kadmium, króm, ólom, szelén és ón tartalmának meghatározása GF-AAS módszerrel (poszter) MSV 42 Veszprém 1999

73

Köszönetnyilvánítás Köszönetet mondok Dr. Orbán Miklós tanszékvezető egyetemi tanár úrnak, hogy doktori értekezésem elkészítését tanszékén lehetővé tette. Hálával köszönöm Dr. Andrási Erzsébet egyetemi adjunktusnak, témavezetőmnek, áldozatos munkáját, szakmai és emberi iránymutatását. Köszönetemet fejezem ki Dr. Ajtony Zsolt egyetemi docensnek, hogy a GF-AAS méréseket tanszékén lehetővé tette és a munkámat végigkisérő építő bírálataiért. Megköszönöm Dr. Réffy Antalnak és Dr. Papp Mátyásnak, hogy az agymintákat rendelkezésünkre bocsátották. Köszönöm Dr. Bencs Lászlónak a MTA Szilárdtestfizikai és Optikai Kutatóintézete tudományos munkatársának szakmai és emberi támogatását.

74