Invasie van zandfilters door allochtone micro-organismen

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2012 – 2013

Invasie van zandfilters door allochtone micro-organismen

Sofie De Vriendt Promotor: Prof. Dr. Ir. Nico Boon Tutoren: Ir. Karen De Roy en Dr. Jessica Benner

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Bio-ingenieurswetenschappen: Landbouw

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2012 – 2013

Invasie van zandfilters door allochtone micro-organismen

Sofie De Vriendt Promotor: Prof. Dr. Ir. Nico Boon Tutoren: Ir. Karen De Roy en Dr. Jessica Benner

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Bio-ingenieurswetenschappen: Landbouw

AUTEURSRECHT ‘De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie’.

‘The author and the promoters give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis’.

Gent, 7 Juni 2013

PROMOTOR: Prof. Dr. Ir. Nico Boon

AUTEUR: Sofie De Vriendt

I

WOORD VOORAF Een jaar onderzoek bij LabMET mogen uitvoeren, was voor mij een hele ervaring. Het was een heel aangename, leerrijke, interessante en uitdagende periode van mijn studententijd. Onderzoek loopt echter niet altijd volgens plan. De “weersomstandigheden” in het laboratorium waren dan ook veranderlijk: Soms ontgoocheling maar ook vreugde wanneer een experiment slaagde. In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dr. Ir. Nico Boon bedanken voor het vrijmaken van dit interessant onderwerp, voor de motivatie en nuttige inzichten tijdens de maandelijkse meetings. Daarnaast wil ik ook mijn tutoren Karen De Roy en Jessica Benner bedanken: Voor me wegwijs te helpen in het labo, de ondersteuning, tips, hulp, aanmoedigingen bij het uitvoeren van de verschillende experimenten, het kritisch lezen van mijn thesis en zoals een mental coach er altijd zijn voor mij! Ook Joeri Coppens wil ik bedanken, voor de practische hulp en begeleiding bij de opgroei van bacteriën, en alle nuttige tips omtrent de ‘wereld van stikstof’. Sam Van Nevel wil ik ook bedanken voor de tips bij het opgroeien van de zandfilterbacteriën. De groep thesisstudenten, we waren in het begin collega’s maar al snel zijn we vrienden geworden. Ook hen wil ik bedanken voor de aangename tijd tussen de muren van het labo en er buiten. In het bijzonder wil ik Jelke, Nelle, Tess, Benjamin, Floor en Kim bedanken voor de aanmoedigingen, aangename pauzes en hulp in het labo. De sfeer in het labo en bijhorende koffieruimte was altijd aangenaam! Het was dan ook met plezier dat ik elke dag naar het labo ging. Bij deze wil ik elke doctoraat, postdoctoraat en het technisch personeel bedanken voor de tips en toffe babbels. Bedankt Renee voor de dagelijkse koffie! Naast de LabMETgroep hielpen ook andere vakgroepen mij bij het uitvoeren van mijn thesis. Onder meer de vakgroep ‘Gewasbescherming’ op de faculteit bio-ingenieurswetenschappen wil ik bedanken voor het ter beschikking stellen van de Powerwave X Spectrofotometer, de vakgroep ‘Soil & water management’ van de KULeuven voor de isolatie van de nodige bacteriën en Avecom voor het verlenen van hulp bij de zandkolommen. En ook de vakgroep ‘Microbiologie en biochemie’ op de faculteit wetenschappen wil ik bedanken voor de samenwerking in verband met de high-throughput methodes en de practische uitleg omtrent ammoniumoxiderende en nitrietoxiderende bacteriën. In het bijzonder Kim Heylen en Evie De Brandt wil ik hiervoor bedanken. Ook mijn vrienden, ouders, broer en zus wil ik bedanken om mij te steunen en er door te sleuren tijdens moeizamere momenten. Bert, Iris en Dorien verdienen hiervoor ook een dikke merci!

II

INHOUDSTABEL Auteursrecht ......................................................................................................................................................................... I Woord vooraf ...................................................................................................................................................................... II Afkortingen ....................................................................................................................................................................... VII Samenvatting .................................................................................................................................................................. VIII Abstract ................................................................................................................................................................................ IX

LITERATUURSTUDIE 1.

Inleiding................................................................................................................................................................ 11

2.

Drinkwater .......................................................................................................................................................... 11

3.

Productie van drinkwater ............................................................................................................................. 12 3.1.

Algemeen productieproces ................................................................................................................. 12

3.2.

Zandfilters .................................................................................................................................................. 13

3.3.

De microbiële gemeenschap in een zandfilter ............................................................................ 15

3.3.1.

De vorming van een biofilm ........................................................................................................... 15

3.3.2.

Functionaliteit ..................................................................................................................................... 15

3.3.2.1.

Nitrificatie en denitrificatie....................................................................................................... 15

3.3.2.1.1.

Nitrificatie ........................................................................................................................................ 16

3.3.2.1.2.

Denitrificatie ................................................................................................................................... 17

3.3.2.2.

IJzeroxidatie .................................................................................................................................... 17

3.3.2.3.

Mangaanoxidatie ........................................................................................................................... 17

3.3.2.4.

Afbraak organische verbindingen .......................................................................................... 18

3.3.2.5.

Afname van de microbieel beschikbare fosfaten ............................................................. 18

3.4.

4.

Desinfectie ................................................................................................................................................. 19

3.4.1.

Chloor...................................................................................................................................................... 19

3.4.2.

Chloordioxide ...................................................................................................................................... 19

3.4.3.

Chlooramines ....................................................................................................................................... 19

3.4.4.

Ozon ......................................................................................................................................................... 20

3.4.5.

Ultraviolet ............................................................................................................................................. 20

Biologische invasie........................................................................................................................................... 20 4.1. 4.1.1.

Invasie van een zandfilter ................................................................................................................... 20 Positieve effecten ............................................................................................................................... 21 III

4.1.2. 4.2.

Negatieve effecten ............................................................................................................................. 21 Rol van de gemeenschapsstructuur ................................................................................................ 22

4.2.1.

Effect van de rijkdom........................................................................................................................ 22

4.2.2.

Effect van de gelijkheid .................................................................................................................... 23

4.2.3.

Biodiversiteit ....................................................................................................................................... 24

5.

Besluit.................................................................................................................................................................... 24

6.

Doelstelling ......................................................................................................................................................... 25

MATERIAAL & METHODE 1.

Het optimaliseren en ontwikkelen van high-throughput methodes ........................................... 27 1.1.

Nitriet ........................................................................................................................................................... 27

1.1.1.

Inleiding ................................................................................................................................................. 27

1.1.1.

Methode ................................................................................................................................................. 27

1.2.

Nitraat .......................................................................................................................................................... 27

1.2.1.

Inleiding ................................................................................................................................................. 27

1.2.2.

Methode ................................................................................................................................................. 27

1.3.

Ammonium ................................................................................................................................................ 28

1.3.1.

Inleiding ................................................................................................................................................. 28

1.3.2.

Methode ................................................................................................................................................. 28

1.3.2.1.

Nessler protocol............................................................................................................................. 28

1.3.2.2.

OPA-sulfiet protocol ..................................................................................................................... 28

1.3.2.3.

Berthelot protocol......................................................................................................................... 29

1.4.

Ijzer ............................................................................................................................................................... 29

1.4.1.

Inleiding ................................................................................................................................................. 29

1.4.2.

Methode ................................................................................................................................................. 29

1.5.

Mangaan...................................................................................................................................................... 30

1.5.1.

Inleiding ................................................................................................................................................. 30

1.5.2.

Methode ................................................................................................................................................. 30

1.6.

Chemische zuurstofvraag .................................................................................................................... 30

1.6.1.

Inleiding ................................................................................................................................................. 30

1.6.2.

Methode ................................................................................................................................................. 31

1.6.2.1.

Chemiluminescentie methode ................................................................................................. 31

1.6.2.2.

Spectrofotometrische methode ............................................................................................... 31 IV

2.

Functionaliteitbepaling van de zandfilterbacteriën ........................................................................... 31

3.

Invasie van artificiële zandfiltergemeenschappen ............................................................................. 32

3.1.

Analyses met de flow cytometer ........................................................................................................... 32

3.1.1.

Live/Dead analyse .................................................................................................................................. 32

3.1.2.

GFP analyse met de flow cytometer ................................................................................................ 33

3.2. 4.

Experiment ..................................................................................................................................................... 33 Inoculatie van de zandfilterkolommen.................................................................................................... 34

4.1.

Opstelling ................................................................................................................................................... 34

4.2.

Tracer experiment .................................................................................................................................. 36

4.3.

Experiment ................................................................................................................................................ 36

4.3.1.

Voedingsstroom.................................................................................................................................. 36

4.3.2.

Stress factor .......................................................................................................................................... 37

4.3.3.

Invasie..................................................................................................................................................... 37

4.4.

Moleculaire analyse van de zandbiofilm ....................................................................................... 38

4.4.1.

DNA-extractie ...................................................................................................................................... 38

4.4.2.

Agarose gel............................................................................................................................................ 39

4.4.2.1.

Inleiding ............................................................................................................................................ 39

4.4.2.2.

Methode ............................................................................................................................................ 39

4.4.3.

qPCR ........................................................................................................................................................ 39

4.4.3.1.

Inleiding ............................................................................................................................................ 39

4.4.3.2.

Methode ............................................................................................................................................ 40

RESULTATEN 1.

High troughput methodes ............................................................................................................................. 42 1.1.

Nitriet ........................................................................................................................................................... 42

1.2.

Nitraat .......................................................................................................................................................... 43

1.3.

Ammonium ................................................................................................................................................ 43

1.4.

Ijzer ............................................................................................................................................................... 47

1.5.

Mangaan...................................................................................................................................................... 47

1.6.

Chemische zuurstofvraag .................................................................................................................... 48

2.

Artificiële zandfiltergemeenschappen ..................................................................................................... 49

2.1.

Invasie versus gelijkheid .......................................................................................................................... 49

2.2.

Functionaliteit ............................................................................................................................................... 52 V

3.

Invasie-experiment van de zandkolommen .......................................................................................... 55

3.1.

Hydraulische retentietijd ......................................................................................................................... 55

3.2.

Nitrificatie ....................................................................................................................................................... 56

3.2.1.

Test 1: Een hoge recirculatiesnelheid ............................................................................................ 56

3.2.2.

Test 2: Een lage recirculatiesnelheid .............................................................................................. 58

3.2.2.1.

Functionaliteit ..................................................................................................................................... 58

3.2.2.2.

Moleculaire analyse........................................................................................................................... 62

3.2.2.2.1.

Resultaten ............................................................................................................................................. 62

DISCUSSIE 1.

Optimalisatie high-throughput methodes.............................................................................................. 64

2.

Zandfiltergemeenschappen .......................................................................................................................... 69

3.

Zandfilters op laboschaal .............................................................................................................................. 72

4.

Conclusies ............................................................................................................................................................ 76

5.

Toekomstig onderzoek................................................................................................................................... 77

REFERENTIES

VI

AFKORTINGEN TOC: Total Organic Carbon = Totaal organische koolstof AOB: Ammoniumoxiderende bacterie NOB: Nitrietoxiderende bacterie COD: Chemical Oxygen Demand = Chemische zuurstofvraag MAP: Microbially Available Phosphorus = Microbieel beschikbare fosfaten BAM: 2,6 dichlorobenzamide UV: Ultraviolet GFP: Green Fluorescent Protein DO: Dissolved Oxygen HRT: Hydraulische Retentie Tijd IC: Ion Chromatografie PI: Propidium Iodide DMSO: Dimethyl sulfoxide EDTA: Ethyleendiaminetetra-azijnzuur TE: Tris- EDTA TAE: Tris-Acetaat-Ethyleen PCR: Polymerase Chain Reaction CDTA: Cyclohexaan-1,2-diaminetetra-azijnzuur

VII

SAMENVATTING Zandfiltratie is een cruciale stap tijdens de productie van drinkwater. Onder meer de aanwezige micro-organismen bepalen de functionaliteit van de zandfilter. Deze micro-organismen leven samen in een complexe biofilm rond de zandkorrels en in de toplaag. Eén van de belangrijke taken bij drinkwaterzuivering is het verhinderen dat pathogenen terecht komen in het drinkwater. Invasieve soorten hebben echter niet altijd negatieve effecten, maar kunnen ook positieve effecten hebben op de zandfilterfunctionaliteit. Bij

dit

onderzoek

werden

26

artificiële

zandfiltergemeenschappen

gecreëerd.

De

zandfiltergemeenschap kende een hogere invasiegevoeligheid bij een oneven verdeling van de residentiële bacteriën. Een even gemeenschap is namelijk meer resistent tegenover invasie door de overlap van de bronnen. Bij dit invasie-experiment werd ook rekening gehouden met de identiteit van de dominante soorten. De identiteit van een dominante soort blijkt uit dit onderzoek namelijk een belangrijke factor te zijn om invasie al dan niet te kunnen verhinderen. Dit fenomeen is waarschijnlijk te verklaren door middel van het competitie-effect. Hierbij bestaat er een sterkere competiviteit tussen soorten met gelijkaardige eigenschappen waardoor een invasieve soort uit de gemeenschap kan worden weg gecompetiteerd. De aanwezigheid van een dominante soort bepaalt bijkomend ook de functionaliteit van de zandfiltergemeenschap. Bij een oneven gemeenschap werd een hogere ammoniumoxidatie waargenomen. Waarbij invasie dit fenomeen zelfs versterkte. Het invasie-experiment van de synthetische zandfiltergemeenschappen werd daarnaast ook geëxtrapoleerd naar tien kleinschalige zandfilters. Deze filters werden geïnoculeerd om uiteindelijk nitrificatie te bekomen. De functionaliteit van deze filters bleek echter niet stabiel. Er was een grote variatie op te merken tussen de verschillende kolommen en een duidelijke nitrificatie werd niet waargenomen. Ook invasie zorgde voor geen duidelijke effecten op de zandfilterfunctionaliteit. In volgend onderzoek is dus nog verder optimalisatie nodig van deze kleinschalige zandfilters. Opdat de stalen van de verscheidene experimenten snel, efficiënt en accuraat bepaald konden worden, werden zes high-throughput methodes ontwikkeld. Deze methodes zijn betrouwbaar in drinkwatermedia, waarvan de ammonium – en nitrietmethodes de resultaten van de respectievelijke standaardkits sterk benaderen.

VIII

ABSTRACT Sand filtration is an important step during drinking water treatment. The functionality of this sand filter is determined by the presence of micro-organisms that are living together in a complex biofilm. One of the important goals during drinking water treatment is to avoid the presence of water borne pathogens in drinking water. Like these pathogens, invaders can have negative effects on the functionality of a sand filter. But invasive species do not always have a negative impact. It is even possible that they accelerate the functionality of a sand filter. In the lab, 26 artificial sand filter communities with a different evenness were created. The communities with an uneven distribution or with one dominant species were much more vulnerable for invasion. Probably, even communities are more resistant to invasion because of the niche overlap of the sources. During this experiment, the impact of the invader was also determined by the identity of the dominant species present. Some dominant species were capable of competing out the invader, others not. Probably, species that are similar to each other like a native and a non-native species, can compete out the non-native one. The dominant species also dominate the functionality of a sand filter community. Ammonium oxidation was more present in an uneven community. Even invasion by Pseudomonas putida accelerated the oxidation of ammonium. The invasion experiment of the artificial sand filter communities was done in parallel with the invasion of ten lab scale sand filters. These filters were inoculated to obtain a good functionality, called nitrification. But the functionality was not clear. Some ammonium oxidation was present, but there was a lot of variation between the different columns. Even invasion did not change anything to the functionality. It remained unclear if these invaders were actually still present in the columns or not. To be able to determine the ion concentration of samples of the different experiments, highthroughput methods were created. These methods are an efficient, cheap and fast way to determine low concentrations. These methods are very accurate in minimal water media. Even the ammonium and nitrite protocols are very comparable with known standard kits.

IX

Literatuurstudie

1. INLEIDING Gezond en veilig drinkwater is een basisbehoefte voor iedereen op deze wereld. In 1917, tijdens de Mar del Plata conferentie, werd voor het eerst de basisbehoefte omtrent drinkwater beschreven (Gleick & Iwra, 1996): All people, whatever their stage of development and their social and economic conditions are, have the right to have access to drinking water in quantities and of a quality equal of their basic needs. Decennia lang werden verscheidene drinkwaterbehandelingen toegepast om veilig drinkwater te bekomen. Reeds 6000 jaar geleden gebruikten de Grieken koolfilters, kookten ze het water en werd het water blootgesteld aan zonlicht om een betere drinkwaterkwaliteit te bekomen. In 1892, tijdens een cholera uitbraak in Duitsland, werd voor het eerst een trage zandfilter toegepast (Ashbolt, 2004). Zandfiltratie is een eenvoudige, goedkope en efficiënte manier voor het zuiveren van water. Hierdoor worden deze filters ook toegepast in ontwikkelingslanden (ElTaweel & Ali, 2000). Deze landen kennen namelijk nog steeds problemen om de bevolking te voorzien van veilig drinkwater. Het drinkwater bevat hoge concentraties colliforme bacteriën die diarree veroorzaken, soms zelfs met de dood tot gevolg (Ashbolt, 2004). Wereldleiders erkenden dit probleem en stelden de Millenium Development Goals op in 2000. Hierbij dient tegen 2015 het aantal mensen die niet beschikken over veilig drinkwater gehalveerd te worden (OECD, 2006). In Vlaanderen wordt de kwaliteit van het drinkwater sterk gecontroleerd door middel van chemische en microbiële parameters (VMM, 2010). Hierbij dient de kwaliteit te voldoen aan de Europese Richtlijn 80/778/EEG die maximumwaarden opstelt voor 61 parameters (Belgaqua, 2012). De drinkwaterkwaliteit is niet alleen afhankelijk van het zuiveringsproces zelf, maar ook van het distributienetwerk, de watertorens en andere schakels in het drinkwaternetwerk voordat het drinkwater terecht komt bij de consument (VMM, 2010).

2. DRINKWATER De voornaamste bronnen van drinkwater zijn grondwater en oppervlaktewater (USEPA, 2012). Vooraleer deze geschikt zijn voor consumptie dienen ze te worden behandeld om schadelijke en andere ongewenste stoffen te verwijderen. Grondwater is reeds gedeeltelijk gezuiverd door filtratie doorheen de grondlagen. Door de lage zuurstofconcentraties in grondwater kunnen metalen zoals ijzer en mangaan echter niet oxideren waardoor deze opgelost blijven. Dit zorgt voor een onaangename geur en kleur, waardoor ook voor grondwater waterzuivering nodig is. Vooraleer

oppervlaktewater

drinkbaar

is,

moet

dit

gezuiverd

worden

in

een

waterzuiveringsinstallatie. Waterzuivering heeft als doel om veilig en gezond drinkwater te bekomen. Hierbij moet het drinkwater voldoen aan de Europese eisen (EU,1998). De Europese ‘Drinking water directive’ is een richtlijn opdat veilig drinkwater beschikbaar is voor menselijke consumptie. Het water dient vrij te zijn van micro-organismen, parasieten en 11

andere oplosbare componenten die de gezondheid van de mens kunnen schaden. De drinkwaternormen vormen de basis van deze richtlijn en stellen maximumeisen voor enkele belangrijke parameters in drinkwater (EEA, 2004); (Tabel 1). Tabel 1: Enkele belangrijke drinkwaternormen(EU, 1998).

Parameter Arseen Boor Bromaat Cadmium Koper Cyanide Fluoride Lood Kwik Nikkel Nitraat Nitriet Pesticiden Aluminium Ammonium IJzer Mangaan Sulfaat Natrium Chloride Vinylchloride Tetrachlooretheen en trichlooretheen Trihalomethanen Totaal Organische Koolstof (TOC ) Escherichia coli Pathogene micro-organismen pH Oxideerbaarheid

Drinkwaternorm 10 µg/L 1.0 mg/L 10 µg/L 5.0 µg/L 2.0 mg/L 50 µg/L 1.5 mg/L 10 µg/L 1.0 µg/L 20µg/L 50 mg/L 0.50 mg/L 0.10 µg/L 200 µg/L 0.50 mg/L 200 µg/L 50 µg/L 250 mg/L 200 mg/L 250 mg/L 0.50 µg/L 10 µg/L 100 µg/L Geen abnormaliteiten 0 /100 ml Afwezig ≥ 6,5 en ≤ 9,2 5 mg /L O2

3. PRODUCTIE VAN DRINKWATER Drinkwater wordt geproduceerd na het doorlopen van een zuiveringsproces. Hierbij zijn verschillende opeenvolgende behandelingen mogelijk. In het volgende onderdeel wordt een algemeen productieproces besproken dat het meest relevant is voor deze thesis.

3.1. ALGEMEEN PRODUCTIEPROCES Opdat het waterzuiveringsproces (Figuur 1) optimaal kan verlopen, wordt afval eerst uit het water gezeefd. Na deze zeving bestaat de eerste fase bij drinkwaterzuivering dikwijls uit coagulatie en flocculatie. Hierbij worden vaste partikels verwijderd uit het water (USEPA, 2012). Coagulatie is een chemisch proces waarbij chemicaliën zorgen voor interactie van vele 12

kleine partikels tot grote partikels. Aluminiumzouten, ijzerzouten en organische polymeren zijn de meest gebruikte chemicaliën (Betancourt & Rose, 2004). Flocculatie is een fysisch proces waarbij nog grotere partikels of vlokken gevormd worden door interparticulaire krachten (LeChevallier & Au, 2004). Coagulatie en flocculatie worden bevorderd door het water te mengen in een tank met draaischroeven (USEPA, 2012).

Figuur 1: Overzicht van een waterzuiveringsproces (DenverWater,2012).

Sedimentatie is de tweede fase in het zuiveringsproces. Het water rust 2 tot 4 uur (USEPA, 2012). Hierbij worden de vloeibare en vaste fase van elkaar gescheiden. Onder invloed van de zwaartekracht sedimenteren de vlokken en andere partikels (LeChevallier & Au, 2004). Deze behandeling is een eerste poging voor het verwijderen van onder andere protozoa (Betancourt & Rose, 2004). Filtratie zorgt in de derde fase voor een daling van het aantal micro-organismen (Betancourt & Rose, 2004). Het is een efficiënte barrière tegenover waterpathogenen (LeChevallier & Au, 2004). Het filterbed kan bestaan uit zand, diatomeeën aarde, granulair geactiveerde kool, of een combinatie van verschillende filterbedmaterialen (Betancourt & Rose, 2004; USEPA, 2012). In de laatste fase wordt het water gedesinfecteerd door middel van chloor, ozon of ultraviolet licht om de laatst levende micro-organismen, virussen en ééncelligen te doden (Betancourt & Rose, 2004; USEPA, 2012).

3.2. ZANDFILTERS Zandfilters worden reeds decennia gebruikt voor het behandelen van drinkwater. Het is een efficiënte, goedkope en betrouwbare filtratietechniek (Aslan & Cakici, 2007). De filters verwijderen organisch materiaal, protozoa, virussen, micro-organismen en eventuele waterpathogenen (Huisman et al., 1974). De filtratie is gebaseerd op zowel fysische als biologische mechanismen (Jellison et al., 2000). Organische partikels worden verwijderd door trekkrachten in de poriën, adsorptie en sedimentatie op de zandkorrels, en door coagulatie tijdens het filterproces (Betancourt & Rose, 2004). De biologische zuivering is gebaseerd op de bacteriële activiteit in de zandfilter. 13

Figuur 2: De opbouw van een open zandfilter in dwarsdoorsnede (Huisman et al., 1974).

Een zandfilter is standaard opgebouwd uit vijf lagen (Figuur 2). Het supernatans is het water dat wordt gefilterd. Naast de zwaartekracht zorgt ook de druk van dit waterreservoir voor migratie van water doorheen het zandbed (Huisman et al., 1974). Het zandbed is het filtratiemedium dat ondersteund wordt door een steenlaag en drainagesysteem waarlangs het gefilterde water wordt verwijderd (Huisman et al., 1974). De belangrijkste eigenschappen van het zandbed zijn de grootte en uniformiteit van de zandkorrels (WHO, 2012). Op de top van het zandbed ontwikkelt zich de schmutzdecke. Deze roodbruine laag is een biofilm, rijk aan afgebroken organisch materiaal, ijzer, mangaan en silica die functioneert als een filter. De microbiële biomassa is belangrijk voor afbraak en adsorptie van onder andere het organisch materiaal (Jellison et al., 2000; Eighmy et al., 1992; Rubiyatno et al., 2012). Opdat een zandfilter organisch materiaal en waterpathogenen efficiënt kan verwijderen, dient deze eerst te rijpen. Hierbij groeien micro-organismen in de filter. Ze vormen de schmutzdecke en een biofilm rond de zandpartikels. Agglomeratie, sedimentatie, interne drukken en tegenwerkende krachten doen de filter verder fysisch rijpen. Het rijpen van een filter kan eventueel versneld worden door toevoegen van specifieke agentia (Jellison et al., 2000). Op basis van de zandpartikelgrootte en de doorstroomsnelheid kan men twee zandfiltertypes onderscheiden. Trage zandfilters zijn opgebouwd uit een fijn zandbed, de zandpartikels hebben een diameter van ongeveer 0.2 mm (El-Taweel & Ali, 1999). Er worden lage doorstroomsnelheden gebruikt, variërend tussen 1 en 8 m3/m2/dag (Arndt & Wagner, 2003). Deze zandfilter is gevoelig voor samenklitten van de zandpartikels. Dit fenomeen wordt veroorzaakt door de biofilm rond de zandkorrels en de kleine zandkorrels zelf. De retentietijd van het water wordt verhoogd door deze koekvorming. Hierdoor kan het zuurstofgehalte dalen en dus ook de zuiveringsefficiëntie (Rolland et al., 2009). Bij snelle zandfilters worden grotere zandkorrels met een diameter tussen 0.6 en 2 mm gebruikt. Hierdoor zijn de poriën tussen de partikels groter en kunnen hogere filtratiesnelheden gebruikt worden, namelijk 100 tot 475 m3/m2/dag (Arndt & Wagner, 2003). Het samenklitten van de zandpartikels heeft bij deze zandfilter echter een positief effect op de filtratie-efficiëntie. Het zorgt voor een langere retentietijd van het water, waardoor de contaminanten minder diep

14

worden meegenomen doorheen de zandfilter. De poriën blijven na samenklitten voldoende groot, waardoor het zuurstofgehalte niet daalt (Rolland et al., 2008).

3.3. DE MICROBIËLE GEMEENSCHAP IN EEN ZANDFILTER Zoals eerder vermeld spelen biologische processen een belangrijke rol bij zandfiltratie. De bacteriën die hiervoor verantwoordelijk zijn, leven in de schmutzdecke en andere biofilms. Ze gebruiken koolstof van het aanwezige organische materiaal als energiebron en produceren hierbij bijproducten die door micro-organismen verder in de zandfilter worden gebruikt als energiebron (Huisman et al., 1974).

3.3.1. DE VORMING VAN EEN BIOFILM Een biofilm functioneert als een beschermende matrix voor micro-organismen. Deze laag is opgebouwd uit moleculen van bacteriële oorsprong, waaronder extracellulaire polymeren. Vanuit deze matrix nemen micro-organismen nutriënten op uit het water die doorheen de zandfilter stromen. Op deze manier zorgt een biofilm voor een zuiverende werking (Flemming, 2002). Een biofilm is ook een mogelijk habitat van pathogene micro-organismen. Door de biofilm zijn deze micro-organismen beschermd tegen desinfectantia, en dus moeilijk te verwijderen uit de zandfilter (Flemming, 2002).

3.3.2. FUNCTIONALITEIT Biologische afbraakprocessen zijn de sleutel voor het bekomen van de optimale functionaliteit van een zandfilter. Microbiële activiteit omvat de afbraak van organisch materiaal en de oxidatie van verscheidene componenten. Een belangrijk onderdeel hierbij is de identificatie van de aanwezige micro-organismen in een zandfilter. De kwaliteit van het drinkwater na zandfiltratie wordt onder andere bepaald door de fysiologie en de structuur van de microbiële gemeenschap (Hendel et al, 2001).

3.3.2.1. NITRIFICATIE EN DENITRIFICATIE Nitraat en nitriet zijn van nature aanwezig in grond – en oppervlakte water (VMM, 2010). Deze bronnen worden echter gecontamineerd met nitraat en nitriet door overbemesting, effluenten van dierlijke mest en septische tanken. Hoge concentraties nitraat veroorzaken eutrofiëring van natuurlijke waterbronnen en gezondheidsproblemen. Nitraat wordt in het spijsverteringskanaal namelijk omgezet tot het toxische nitriet en nitrosamines die kankerverwekkend zijn (Aslan & Cakici, 2007). Ook hoge ammoniumconcentraties in drinkwater zijn ongewenst. Ammonium zorgt voor een onaangename geur en smaak van het drinkwater. Bijkomend wordt nitriet gevormd tijdens nitrificatie en kunnen deze hoge ammoniumconcentraties de groei van waterpathogenen stimuleren (van der Wielen et al., 2009).

15

3.3.2.1.1. NITRIFICATIE Nitrificatie is een aeroob proces waarbij ammonium wordt geoxideerd tot nitriet en vervolgens tot nitraat. Dit gebeurt respectievelijk door ammoniumoxiderende bacteriën (AOB) en nitrietoxiderende bacteriën (NOB) (Madigan et al., 2009; van der Wielen et al., 2009; Tao et al., 2012). Zowel AOB’s als NOB’s zijn gramnegatieve, chemoautotrofe bacteriën die anorganische substraten gebruiken als elektronendonor. Anorganische koolstof zoals carbonaten worden geïncorporeerd in de biomassa (Hagopian & Riley, 1998). AOB’s en NOB’s leven in een symbiotische biofilm waarbij AOB’s het substraat leveren voor NOB’s (Tränckner et al., 2008); (Figuur 3).

Figuur 3: Schematisch overzicht nitrificatie door AOB’s en NOB’s (Madigan et al., 2009).

Nitrificerende bacteriën bevatten enzymen in het intern membraansysteem die een oxiderende werking hebben. De AOB’s oxideren ammoniak tot hydroxylamine, met het enzym ammoniakmono-oxygenase. Het gevormde hydroxylamine wordt door hydroxylamine oxidoreductase omgevormd tot nitriet. Nitriet is in aerobe omstandigheden een belangrijke stikstofbron voor NOB’s. Deze oxideren nitriet tot nitraat door middel van nitrietoxidase (Madigan et al., 2009). In het effluent van een goed werkende zandfilter wordt dus geen nitriet meer terug gevonden (Stembal et al., 2005). De genera Nitrosomonas, Nitrobacter en Nitrospira omvatten de belangrijkste nitrificerende bacteriën van een zandfilter (Stembal et al., 2005; Blackburne et al., 2007; Tränckner et al., 2008). AOB’s kennen een optimale groei bij 30°C, 10 mM ammoniumzouten en bij pH 8 (Koops et al., 2006). De exogene reactiemechanismen worden weergegeven volgens vergelijking (a) en (b). De eerste reactie wordt ook nitritie genoemd, de tweede reactie nitratie (Hagopian & Riley, 1998): (a) (b)

16

3.3.2.1.2. DENITRIFICATIE Onder anaerobe omstandigheden wordt nitraat door denitrificerende bacteriën gereduceerd tot stikstofgas (Figuur 4). Op deze manier wordt nitraat verwijderd uit drinkwater. Hierbij is een trage zandfilter de meest efficiënte methode.

Figuur 4: Schematisch overzicht van de denitrificatie pathway (Aslan & Cakici, 2007; Madigan et al., 2009).

Voor een optimale denitrificatie, is een C/N verhouding van 1.8 gewenst (Aslan & Cakici, 2007). Enkele belangrijke denitrificerende bacteriën behoren tot de genera Pseudomonas, Alcaligenes en Hypomicrobium (Neef et al., 1996).

3.3.2.2. IJZEROXIDATIE IJzer komt terecht in het water door het oplossen vanuit nabijgelegen rotsen en andere gesteentes (Dvorak et al., 2007). Indien de ijzerconcentratie de drinkwaternorm overschrijdt, wordt een rode neerslag gevormd en heeft het water een onaangename metalige smaak (Sharma et al., 2001). In een zandfilter wordt ijzer geoxideerd van Fe2+ tot Fe3+ (Madigan et al., 2009). Deze oxidatie kan zowel chemisch als biologisch verlopen. Een onderscheid is echter moeilijk te maken. De belangrijkste ijzeroxiderende bacteriën behoren tot Gallionella spp. en Leptothrix spp. Deze bacteriën groeien optimaal in aerobe omstandigheden, bij neutrale pH en een gemiddelde temperatuur van 13 °C (de Vet et al., 2011). Volgens Wolthoorn et al. (2004) kunnen ijzeroxiderende bacteriën een positief effect hebben op nitrificatie.

3.3.2.3. MANGAANOXIDATIE Mangaan is aanwezig in grond- en oppervlaktewater onder de vorm van Mn2+en Mn4+ (Hope & Bott, 2004). Mangaan zorgt, net zoals ijzer, voor een metaalsmaak van het drinkwater (Vandenabeele et al., 1992). En mangaanoxides vormen een donkerbruine neerslag in het water. Bijkomend zijn hoge mangaanconcentraties vaak gecorreleerd met verstoringen van het zenuwstelsel. Oxidatie kan het overtollige mangaan uit het water verwijderen (Vandenabeele et al., 1995). De spontane oxidatie van Mn2+ tot Mn4+ verloopt echter traag. Een zandfilter kan mangaan pas efficiënt verwijderen na 3 tot 6 maand rijpen (Frischherz et al., 1985). Mangaan oxiderende bacteriën, zoals Leptothrix sp., Gallionella sp. en Siderocapsa sp., synthetiseren mangaanoxiden die neerslaan op de zandpartikels (Hope & Bott, 2004; Pacini et al., 2005). 17

Mangaanoxidatie vindt plaats tijdens de stationaire groeifase van deze bacteriën (Vandenabeele et al., 1995). Nitriet inhibeert echter de oxidatie, waardoor mangaanoxidatie enkel plaats vindt in een zandfilter nadat ammonium en nitriet volledig geoxideerd zijn (Vandenabeele & Vande Woestyne et al., 1995). De vorming van een mangaanoxiderende gemeenschap in een zandfilter wordt verhinderd indien het water hoge ijzerconcentraties bevat. IJzeroxiderende bacteriën groeien tot 50 keer sneller en verdringen zo de mangaanoxiderende bacteriën (Vandenabeele et al., 1992).

3.3.2.4. AFBRAAK ORGANISCHE VERBINDINGEN In drinkwater zijn organische koolstof en fosfor de limiterende nutriënten voor microbiële groei. Indien het water een hoog gehalte organisch materiaal bevat, wordt fosfor de limiterende factor voor bacteriële groei (Lehtola et al., 2001; Lehtola et al., 2002). Hoge concentraties overblijvend organisch materiaal na filtratie kunnen dus aanleiding geven tot bacteriële hergroei in het distributiesysteem. Bijkomend veroorzaakt het een onaangename geur en smaak van het water. Het is dus belangrijk dat deze organische componenten verwijderd worden tijdens filtratie (Chen et al., 2007). De chemische zuurstofvraag is een maat voor de hoeveelheid zuurstof dat nodig is om organisch materiaal af te breken (Hu & Yang, 2004). De totale chemische zuurstofvraag (Chemical oxygen demand, COD) wordt op basis van fysische mechanismen verwijderd tijdens zandfiltratie. Hierbij zijn sedimentatie en filtratie van de partikels belangrijk. De chemische zuurstofvraag in oplossing wordt daarentegen verwijderd door microbiële afbraak in aerobe delen van de zandfilter. Hierbij spelen de heterotrofe bacteriën in een biofilm rond de zandpartikels een belangrijke rol (Achak et al., 2009). In een goed werkende zandfilter wordt ongeveer 90% van de chemische zuurstofvraag verwijderd (Rodgers et al., 2005; Healy et al., 2007; Achak et al., 2009).

3.3.2.5. AFNAME VAN DE MICROBIEEL BESCHIKBARE FOSFATEN Fosfor is een essentieel element voor alle bacteriën. Het element is aanwezig in de bacteriële cellen en is noodzakelijk voor de groei, activiteit en regulatie (de vet et al., 2012). Fosfaten worden verwijderd tijdens zandfiltratie door neerslag met calcium, aluminium of ijzer, en door adsorptie op ijzer- of aluminiumhydroxiden. Bijkomend spelen fosfaten een belangrijke rol bij ijzeroxidatie in de zandfilter (Erickson et al., 2007; de vet et al., 2012). Zoals eerder vermeld, is de verwijdering van fosfor van belang om bacteriële hergroei in het distributienetwerk te vermijden (Lehtola et al., 2001). Fosfor wordt gemodificeerd tijdens coagulatie en wordt zo onbeschikbaar voor bacteriën (Lehtola et al., 2002). Niet alle fosfaten zijn namelijk beschikbaar voor micro-organismen. Enkel de ionische orthofosfaten behoren tot de microbieel beschikbare fosfaten (Microbially available phosphorus, MAP); (Scherrenberg et al., 2008). Een kleine toename van MAP zorgt reeds voor een sterke microbiële hergroei (Lehtola et al., 2001). Te lage MAPconcentraties (< 25 µg PO4-P/L) kunnen echter de functionaliteit van de zandfilter beïnvloeden. De AOB’s groeien trager en nitrificatie wordt geïnhibeerd (de vet et al., 2012).

18

3.4. DESINFECTIE Desinfectie wordt voor of na zandfiltratie toegepast voor het doden van micro-organismen (Schoenen, 2002).

3.4.1. CHLOOR Chloor werd voor het eerst toegepast als desinfectans in 1886 tijdens de typhoid epidemie (Schoenen, 2002). Het gas reageert met water tot hydrochloorzuur en HClO. Deze laatste componenten dissociëren tot OCl- en H+, waarbij HClO en OCl- reactief zijn tegenover microorganismen. Deze reactieve componenten reageren met zwavelverbindingen van bacteriële eiwitten, met als gevolg dat de ademhaling, het glucosetransport en de ATP-synthese stoppen. De chloorcomponenten reageren ook met purine en pyrimidine basen, en veroorzaken zo genetische defecten die lethaal zijn voor de pathogenen (LeChevallier & Au, 2004). Zowel zandfiltratie als een desinfectiebehandeling met chloor reduceren het aantal pathogenen. Doch kennen beide een verschillende efficiëntie. Indien het te behandelen water een hoog aandeel pathogenen bevat, kunnen enkele zandfilterparameters worden aangepast opdat de meeste pathogenen efficiënt worden verwijderd. Dit is echter niet het geval bij chloorbehandelingen. Het toedienen van een hogere dosis chloor, betekent niet dat alle pathogenen vernietigd zijn (Schoenen, 2002). Enkele bacteriën zijn namelijk resistent tegenover de reactieve chloorcomponenten. Vaak zijn dit sporenvormende bacteriën die desinfectie overleven als spore, en grampositieve bacteriën aangezien deze een dikkere celwand hebben dan gramnegatieve bacteriën (LeChevallier & Au, 2004). De belangrijkste gevormde bijproducten na een chloorbehandeling zijn trihalomethanen en halogene componenten (Boorman et al., 1999; LeChevallier & Au, 2004). In totaal worden meer dan 300 bijproducten gevormd. Enkele hiervan kunnen kanker veroorzaken. Hierdoor werd naar alternatieve desinfectantia gezocht, zoals chloordioxide, chlooramines en ozon. Alhoewel bij deze alternatieve desinfectiemethodes ook bijproducten worden vrijgesteld (Boorman et al., 1999; Richardson et al., 2000).

3.4.2. CHLOORDIOXIDE Chloordioxide is goed oplosbaar in water en kent een gelijkaardige werking als de reactieve chloorcomponenten. Chloordioxide reageert met belangrijke membraaneiwitten en enzymes, zonder trihalomethanen en halogene componenten te vormen (LeChevallier & Au, 2004). De gevormde bijproducten zijn chloraten en chloriden. Of deze componenten op lange termijn carcinogeen zijn, is onbekend (Boorman et al., 1999).

3.4.3. CHLOORAMINES Chlooramines reageren met membraangebonden enzymes, en doden zo de pathogenen. Virussen worden trager geïnactiveerd dan bacteriën doordat chlooramines trager reageren met de purine en pyrimidine basen dan met de membraaneiwitten (LeChevallier & Au, 2004). Chlooramines vormen dezelfde halogene bijproducten als chloor, maar de bijproducten zijn in lagere concentraties aanwezig (Boorman et al., 1999; Richardson et al., 2000).

19

3.4.4. OZON Ozon wordt zowel als oxidans en desinfectans gebruikt. Ozon is onstabiel in water en dissocieert in een hydroxylradicaal en een ozonmolecule (von Gunten, 2003). De ozonmolecule penetreert het bacterieel celmembraan en reageert met de cytoplasmatische organellen. Hierbij worden nucleïnezuren afgebroken waardoor de pathogeen gedood wordt. Bacteriën zoals Escherichia coli zijn gevoelig voor ozonbehandelingen. Cystes zijn daarentegen resistent (Camel & Bermond, 1998). De gevormde bijproducten zijn aldehyden, ketonen en andere zuurstofrijke verbindingen (Richardson et al., 2000). Bromaat is het belangrijkste bijproduct dat carcinogene eigenschappen heeft (von Gunten, 2003). Ozon zorgt echter wel voor een toename van de MAP en organische koolstof in het drinkwater, waardoor de kans op microbiële hergroei toeneemt (Lehtola et al., 2001).

3.4.5. ULTRAVIOLET Ultraviolet licht of UV licht heeft golflengtes tussen 40 en 400 nm, waarbij UV-B en UV-C van belang zijn voor het doden van micro-organismen (LeChevallier & Au, 2004). Desinfectie met UV licht produceert in vergelijking met chemische desinfectiemethodes geen toxische bijproducten, de contacttijd is korter en een UV behandeling is meer efficiënt voor het doden van virussen. De efficiëntie van een UV desinfectie wordt bepaald door de UV dosis en de mate waarbij bacteriële aggregaten worden gevormd (Hassen et al., 2000).

4. BIOLOGISCHE INVASIE Biologische invasie wordt gedefinieerd als het per toeval of bewust verplaatsen van nieuwe soorten van het ene gebied naar het andere, waarbij ze een belangrijke abundantie kennen in hun nieuwe niche (van der Putten et al., 2007). Invasie omvat dus twee belangrijk stappen: Het transport naar een nieuwe locatie en de lokale toename van de invasieve soort (Shea & Chesson, 2002). Invasieve soorten introduceren nieuwe eigenschappen in de residentiële gemeenschap, zoals stikstoffixatie en kunnen de functionaliteit van de oorspronkelijke gemeenschap verstoren (van der Putten et al., 2007), ook die van een zandfiltergemeenschap. Het bestuderen van het invasieeffect is dus van belang om een optimale drinkwaterkwaliteit te behouden (Koivunen et al., 2003).

4.1. INVASIE VAN EEN ZANDFILTER De invasiegevoeligheid van een zandfilter wordt onder meer bepaald door interacties tussen biologische en fysische parameters. Belangrijke fysische parameters zijn onder meer de temperatuur van het te behandelen water, het O2-en CO2-gehalte in de filter (Davis et al., 2005). De mate waarmee een invasieve soort een gemeenschap succesvol kan invaderen wordt bepaald door het aantal indringers, de timing waarbij de invasieve soorten in de bacteriële gemeenschap terecht komen, beschikbaarheid van koolstofbronnen, interacties tussen de aanwezige soorten, de eigenschappen van de residentiële bacteriële soorten, aanwezigheid van stress, diversiteit en gemeenschapsstructuur (Miller et al., 2002, De Roy et al., 2013). Sommige invasieve soorten produceren toxines, hebben een hogere efficiëntie voor het gebruik van koolstofbronnen en 20

kennen genentransfer waardoor ze zich sneller aanpassen aan de nieuwe omgeving (Litchman, 2010).

4.1.1. POSITIEVE EFFECTEN In planten- en dierengemeenschappen zorgt invasie niet altijd voor negatieve gevolgen in deze gemeenschappen. Zo kunnen invasieve planten een belangrijk habitat worden voor bedreigde residentiële diersoorten (Davis et al., 2011). Ook bij zandfilters kan invasie gewenst zijn om een optimale zandfilterwerking te bekomen bij het verwerken van onder andere afvalwater. Een voorbeeld hiervan is bioaugmentatie. Bioaugmentatie is een methode waarbij doelbewust een commerciële mix van autrotrofen, heterotrofen, facultatieve anaeroben en/of aeroben aan de zandfilter worden toegevoegd. Hierdoor stijgt de rijkdom en dus ook de functionaliteit van de zandfiltergemeenschap (Stephenson D. & Stephenson T., 1992). De mate waarmee bioaugmentatie succesvol verloopt wordt bepaald door de mate van aanhechting, retentie en ontwikkeling van de toegevoegde bacteriën (Bouchez et al., 2000). Bioaugmentatie wordt reeds toegepast om onder meer een betere microbiële nitrificatie (Rittmann & Whiteman, 1994; Satoh et al., 2003), fosforverwijdering (Oerther et al., 1998) en BAM (2,6 dichlorobenzamide) afbraak te bekomen bij het behandelen van afvalwater (Jacobsen et al., 2012). Maar bio-augmentatie werkt echter niet altijd efficiënt. Volgens Lynch et al. (1987) en Mc Clure et al. (1991) is het aantal toegediende bacteriën te klein om een significant effect waar te nemen op de werking van de zandfilter. Goldstein et al. (1985) stelt ook dat de competitie met de residentiële zandfilterbacteriën te groot is, waardoor de groei van de toegediende bacteriën wordt geïnhibeerd. Bijkomend kan de activiteit van deze toegediende bacteriële mix geïnhibeerd worden door een abrupte overgang van hoge opgroeitemperaturen naar een lagere temperatuur (ongeveer 10 °C) van de zandfilter (Head & Oleszkiewicz, 2004).

4.1.2. NEGATIEVE EFFECTEN Desondanks de mogelijk positieve effecten, wordt biologische invasie meestal beschouwd als de grootste bedreiging van de lokale biodiversiteit van terrestrische en aquatische ecosystemen (Mooney & Hobbs, 2000; Sala et al., 2000). De indringer kan een parasiet of pathogeen zijn die competiteert met voedselbronnen en ruimte van de residentiële micro-organismen (Vitousek, 1990). Invasie veroorzaakt hierdoor een verandering van de gemeenschapssamenstelling en diversiteit. Als gevolg wijzigt ook de functionaliteit van het ecosysteem (Vitousek & D’Antonio, 1996; Grosholz et al., 2000; Mack et al., 2000; Simberloff, 2011). Invasieve planten kunnen onder andere de voedselketen zodanig veranderen waardoor de samenstelling van de gehele plantgemeenschap wijzigt (Levin et al., 2006). Ondergronds, kunnen invasieve organismen de bodemsamenstelling wijzigen waardoor de fitness van de residentiële soorten afneemt en zo één van de bodemfuncties, namelijk de stikstofcyclus wordt verstoord (Asner & Vitousek, 2005; Hawkes

et

al.,

2005;

Jordan

et

al.,

2008).

Bijkomend

kan

deze

gewijzigde

gemeenschapssamenstelling de invasie van andere indringers bevorderen. Dit fenomeen wordt inter-specifieke cross-facilitatie genoemd (Jordan et al., 2008). Hierdoor kan een invasionele meltdown ontstaan: Indien de impact op een gemeenschap van enkele invasieve soorten samen groter is dan wanneer elke soort de gemeenschap afzonderlijk zou invaderen (Simberloff & Von 21

Holle, 1999). De impact van een invasieve soort kan worden weergegeven met behulp van onderstaande vergelijking (c; Parker et al., 1999): (c) Met I de totale impact van de invasieve soort, R de plaats die deze soort inneemt (m 2), A de abundantie (cel aantal per m2) en E die het effect per eenheid invader weergeeft.

4.2. ROL VAN DE GEMEENSCHAPSSTRUCTUUR De mate waarmee een gemeenschap gevoelig is voor invasie wordt bepaald door zowel de soortenrijkdom als de gelijkheid van deze gemeenschap (Hillebrand et al., 2008); (Figuur 5).

Figuur 5: Schematische weergave van de rijkdom en de gelijkheid van een gemeenschap. Elke andere vorm stelt een andere bacteriële soort voor.

4.2.1. EFFECT VAN DE RIJKDOM Soortenrijkdom definieert het aantal soorten die aanwezig zijn in een gemeenschap (Wittebolle et al., 2009; Figuur 5). Naarmate een gemeenschap een hoge soortenrijkdom en genetische rijkdom kent, zijn deze over het algemeen meer resistent tegenover invasie (Symstad, 2000; Hodgson et al., 2002; Kennedy et al., 2002; Jousset et al., 2011). Ook Eisenhauer et al. (2012) stellen dat functionele diverse gemeenschappen beter omgaan met nieuwe soorten, en hun functionaliteit behouden na invasie. Drie mechanismen liggen aan de basis van deze hypothese. Hoe meer soorten aanwezig zijn, hoe groter de kans dat bacteriën aanwezig zijn die invasie helpen overwinnen. Dit wordt het dominantie effect genoemd (Huston, 1997). Ten tweede, naarmate meer bacteriële soorten aanwezig zijn, worden meer verschillende koolstofbronnen gebruikt. Een hogere residentiële soortenrijkdom veroorzaakt een daling van de totale bronnenen ruimtebeschikbaarheid. Invasieve bacteriën overleven onder deze omstandigheden dus moeilijker door het competitie effect (Stachowicz et al., 1999; Naeem et al., 2000; Hodgson et al., 2002; Bruno et al., 2003). Ze kunnen bijgevolg enkel overleven op koolstofbronnen die niet worden geconsumeerd door de residentiële bacteriën (van Elsas et al., 2012). Ten derde kunnen 22

positieve interacties tussen bacteriën de resistentie tegenover invasie verhogen (Hodgson et al., 2002). Van Nevel et al. (2013) toonden aan dat invasie in oppervlaktewater moeizamer verloopt dan in drinkwater, door de hogere microbiële soortenrijkdom die heerst in oppervlaktewater. Andere studies daarentegen stelden dat er geen verband bestaat tussen soortenrijkdom en mate van invasie (Peart & Foin, 1985) of dat de soortenrijkdom van de gemeenschap zelfs een positief effect heeft op invasie (Dunstan & Johnson, 2004; Robinson et al., 1995). Dit positief verband wordt verklaard door 2 mechanismen. Ten eerste worden sommige soortenrijke hotspots gekenmerkt door soorten met een snelle turnover waardoor de invasiekans toeneemt. Ten tweede kunnen interspecifieke interacties tussen residentiële en invasieve soorten invasie bevorderen. De residentiële soorten creëren hierbij een aangenamer invasiemilieu (Stachowicz et al., 2002; Bruno et al., 2003). Er heerst echter nog onzekerheid over dit positief verband. Men dient namelijk ook rekening te houden met extrinsieke factoren die kunnen verschillen tussen de zogenaamde hotspots (Stachowicz & Byrnes, 2006).

4.2.2. EFFECT VAN DE GELIJKHEID De gelijkheid is een maat voor de relatieve abundantie. Een gemeenschap met een lage gelijkheid wordt gedomineerd door 1 of enkele soorten (Wittebolle et al., 2009; Figuur 5). De gelijkheid wordt grafisch weergegeven door middel van de Lorenz curve (Rousseau et al., 1999). De Gini coëfficiënt is een bijpassende indicator die de graad van gelijkheid beschrijft en is evenredig met het oppervlakte tussen de Lorenzcurve en de perfecte evennesslijn (Figuur 6). Hoe hoger de Gini, hoe meer de Lorenzcurve afwijkt van de ideale evennesslijn, hoe meer oneven of dominant de bacteriële gemeenschap is (Wittebolle et al., 2009).

Figuur 5: Verscheidene Lorenzcurves variërend van een even tot oneven gemeenschap (Wittebolle et al., 2009)

Een even gemeenschap is minder gevoelig voor invasie doordat meer verschillende niches zijn ingenomen. Naarmate deze gemeenschap meer oneven wordt, neemt de kans op invasie toe. Dominante soorten nemen maar een beperkt aantal type niches in, waardoor de vrije niches gevoelig worden voor invasie (Hillebrand et al., 2008). Ook De Roy et al. (2013) toonden aan dat 23

de graad van gelijkheid en de mate van invasie negatief gecorreleerd zijn indien de residentiële gemeenschap zich in een stressloze omgeving bevindt. Indien de soortenrijkdom een constante is, zorgt een hogere gelijkheid voor een hogere invasie-resistentie. Dit fenomeen wordt verklaard door niche-overlap van de koolstofbronnen. Wanneer de residentiële gemeenschap zich echter onder stresscondities bevindt, heeft de gelijkheid van deze gemeenschap geen invloed op de mate van invasie. Enkel het initieel aantal invasieve cellen bepaalt dan de graad van invasie (De Roy et al., 2013). Een oneven gemeenschap kan echter ook een lagere kans op invasie hebben. Hierbij wordt invasie verhinderd doordat de dominante soorten zelf een ongunstige omgeving creëren voor invasieve soorten (Hillebrand et al., 2008).

4.2.3. BIODIVERSITEIT Biodiversiteit is een combinatie van soortenrijkdom en gelijkheid (Rousseau et al., 1999; Wittebolle et al., 2009). De biodiversiteit beïnvloedt de functionaliteit van een gemeenschap en de productiviteit die hiermee verbonden is op twee manieren. Ten eerste, naarmate meer soorten aanwezig zijn, neemt het gebruik van verschillende koolstofbronnen toe en dus ook de productiviteit. Ten tweede, heeft elke soort een verschillend belang in de bacteriële gemeenschap. Gemeenschappen met een hoge soortenrijkdom kennen dus een hogere productiviteit aangezien de kans groter is dat belangrijke soorten aanwezig zijn (Bell et al., 2005).

5. BESLUIT In de literatuur werd reeds veel beschreven over zandfilters. Deze filters zijn vandaag een belangrijk onderdeel in een waterzuiveringsproces. Er is echter weinig onderzoek verricht over het effect van invasie op zandfilterbacteriën, in het bijzonder de negatieve en neutrale invasieeffecten.

24

6. DOELSTELLING

Figuur 6: De verschillende onderzoeksfasen van deze thesis.

Het doel van deze thesis is het onderzoeken van invasie-effecten op de functionaliteit en diversiteit van een zandfiltergemeenschap (Figuur 6). Opdat de functionaliteit op een snelle en accurate manier kan worden bepaald, worden verscheidene high-throughput methodes ontwikkeld en geoptimaliseerd (1). Deze methodes worden gebruikt om lage concentraties NO2-, NO3-, NH4+, Mn2+, Fe2+ en COD te bepalen. Hierbij zijn NO2-, NO3- en NH4+ de belangrijkste ionen. Onder meer de functionaliteit van geïsoleerde zandfilterbacteriën wordt bepaald aan de hand van deze methodes (2). Eens de functionaliteit van de bacteriën gekend is, worden 26 artificiële zandfiltergemeenschappen gecreëerd met een variërende gelijkheid. Deze gemeenschappen worden geïnvadeerd door een GFP (Green Fluorescent Protein) gelabelde bacterie (3). Hierbij zal het verband tussen een variërende gelijkheid en invasie onderzocht worden, en de invloed dat deze invasie heeft op de functionaliteit van de gemeenschap. Naast het creëren van synthetische zandfiltergemeenschappen, worden kleinschalige zandfilters geïnoculeerd met een commercieel AOB-NOB mengsel. Hierbij wordt het effect van een variabele voedingsstroom op de activiteit en biodiversiteit van het aanwezige inoculum onderzocht. En in een tweede fase wordt ook een stressfactor, namelijk invasie, geïntroduceerd en wordt de invloed

hiervan

op

de

bacteriële

gemeenschap

bestudeerd

(4).

25

Materiaal & Methode

1. HET OPTIMALISEREN EN ONTWIKKELEN VAN HIGH-THROUGHPUT METHODES 1.1. NITRIET 1.1.1. INLEIDING Voor de high-throughput bepaling van nitriet werd gebruik gemaakt van een colorimetrisch assay gebaseerd op de methode van Montgomery en Dymock (1961). De callibratiecurve is lineair tot 60 µM NO2--N (Montgomery & Dymock, 1961). Bij verder onderzoek van deze thesis dienen lage concentraties nitriet bepaald te worden. De detectielimiet van de Montgomery reactie werd dus bepaald. Daarnaast werd deze high-throughput methode vergeleken met een nitrietkit (Macherey-Nagel Nanocolor, Test 0-68 en Test 0-69).

1.1.1. METHODE Voor de Montgomery reactie wordt gebruik gemaakt van twee reagentia. Reagens 1 bestaat uit 0.2 M KHSO4 en 0.02 M sulfanilzuur in gedestilleerd water. Reagens 2 is een 1.55 mM N(1naphtyl)ethyleendiaminehydrochloride oplossing in gedestilleerd water. Voor het opstellen van de callibratiecurve werd een stockoplossing van 7.14 mM NO2--N gemaakt (7.14 mM NaNO2 in gedestilleerd water). Een standaardreeks werd opgesteld variërend van 7.14 µM NO2--N tot 71.4 µM NO2--N. In een 96-well plaat werd 200 µl staal (al dan niet verdund om de maximale lineaire concentratie niet te overschrijden) gebracht waaraan 50 µl reagens 1 werd toegevoegd. Dit werd 15 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Na incubatie werd 50 µl reagens 2 toegevoegd, en werd de 96-well plaat 30 minuten geïncubeerd in een donkere omgeving. De absorbantie werd gemeten bij 540 nm met de Powerwave X spectrofotometer.

1.2. NITRAAT 1.2.1. INLEIDING Nitraat werd bepaald volgens de salicylzuurmethode (Cataldo et al., 1975). Hierbij reageert salicylzuur onder zure omstandigheden met nitraat tot de vorming van nitrosalicylzuur. Een chromofoor wordt gevormd bij pH 12. Om nitrietinterferentie te vermijden, wordt een verzadigde sulfonische zuuroplossing toegediend. Hierbij wordt nitriet omgevormd tot stikstofgas.

1.2.2. METHODE Zoals reeds vermeld in de inleiding, zijn drie reagentia nodig. Het eerste reagens is een verzadigde aminobenzeen sulfonische zuuroplossing. Reagens 2 is een 5 % (w/v) salicylzuuroplossing in 98 % zwavelzuur. Reagens 3 is een 4 M NaOH oplossing. Een standaardreeks werd opgesteld van 0.5 mM tot 6.43 mM NO3--N. Hiervoor werd een stockoplossing van 0.14 M NO3--N gebruikt. In een 96-well plaat werd achtereenvolgens 1 µl reagens 1, 20 µl reagens 2 en 4 µl staal (al dan niet verdund) toegevoegd. De plaat werd 10 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur en 27

afgeschermd van licht met aluminiumfolie. Na de incubatie werd voorzichtig 200 µl van het derde reagens toegevoegd en werd de plaat een tweede keer, 10 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. De absorbantie werd gemeten bij 420 nm met de Powerwave X spectrofotometer.

1.3. AMMONIUM 1.3.1. INLEIDING Tijdens de optimalisatie van de spectrofotometrische ammoniumbepaling werd eerst gebruik gemaakt van het Nesslerprotocol. Hierbij reageert ammonium met mercury in een basische oplossing tot een bruin- oranje complex (Leonard, 1963). Ook de OPA-sulfietmethode werd uitgetest bij lage ammoniumconcentraties (Amornthammarong & Zhang, 2008). Tijdens deze reactie zorgt sulfiet voor reducerende omstandigheden, waardoor ammonium reageert met phtaldialdehyde tot een geel complex. Uiteindelijk werd geopteerd ammonium te bepalen volgens een aangepaste Berthelotreactie, ook wel de ammonium-salicylzuurmethode genoemd (Bucur et al., 2006). Hierbij wordt ammonium onder basische omstandigheden omgezet tot ammoniak. Deze laatste reageert met hypochloriet tot chlooramine. De kleurreactie wordt gekatalyseerd door natriumnitroprusside. Ook deze high-throughput methode werd vergeleken met een bestaande ammoniumkit (HACH Lange, LCK 304).

1.3.2. METHODE 1.3.2.1.

NESSLER PROTOCOL

Opdat de Nessler reactie kan doorgaan zijn twee reagentia nodig. Het eerste reagens is een kaliumnatriumtartraatoplossing: 1.7 M kaliumnatriumtartraat. Het tweede reagens of het Nessler reagens bestaat uit NaOH, KI en HgI2. Eerst werd een 4 M NaOH oplossing gemaakt in 0.5 liter gedestilleerd water. Daarnaast werd in een tweede maatbeker 0.4 M KI en 0.22 M HgI2 opgelost in 100 ml gedestilleerd water. Deze oplossing werd langzaam in de NaOH oplossing gebracht. De oplossing werd troebel en uiteindelijk aangelengd tot 1 liter. In een 96-well plaat werd achtereenvolgens 250 µl staal, 5 µl reagens 1 en 5 µl Nessler reagens 2 gepipetteerd. De absorbantie werd gemeten bij 450 nm met de Tecan Sunrise spectrofotometer.

1.3.2.2.

OPA-SULFIET PROTOCOL

Bij de OPA-sulfietmethode dienen twee reagentia gemaakt te worden. Het eerste reagens bevat 25 mM ortho-phtaldialdehyde, opgelost in 20 ml methanol en 80 ml Milli-Q water. Reagens 2 bevat 10 mM sulfiet in 5 mM HCHO. Beide reagentia worden net voor gebruik in gelijke verhouding met elkaar gemengd. In een 96-well plaat werd achtereenvolgens 10 µl staal en 150 µl van het reagensmengsel toegediend. De 96-well plaat werd afgeschermd van licht door middel van aluminiumfolie en 5 minuten geschud op een vortex. Vervolgens werd de 96-well plaat 20 minuten geïncubeerd bij 65 °C en werd de absorbantie gemeten bij 420 nm met de Powerwave X spectrofotometer.

28

1.3.2.3.

BERTHELOT PROTOCOL

Deze Berthelotreactie heeft twee reagentia nodig. Reagens 1 is een 125 mM NaOH oplossing, opgelost in 8 ml 2.5 % NaClO en 92 ml MilliQ water. Het tweede reagens bevat 0.072 M salicylzuur, 0.125 M NaOH en 0.03 M natriumnitroprusside. Een standaardreeks werd opgesteld, variërend tussen 5.6 µM en 1.11 mM NH4+-N. Een commerciële ammoniumoplossing van 55 M NH4+-N werd hiervoor gebruikt als stockoplossing. In een 96-well plaat werd 160 µl verdunning gepipetteerd en achtereenvolgens 45 µl reagens 1 en 35 µl reagens 2. Deze methode is gevoelig voor kleine variaties bij het pipetteren, vandaar dat geen multipipet werd gebruikt. De absorbantie werd gemeten bij 700 nm met de Powerwave X spectrofotometer.

1.4. IJZER 1.4.1. INLEIDING Een colorimetrische high-throughput methode voor het bepalen van ijzerconcentraties werd geoptimaliseerd en is gebaseerd op de phenanthroline methode (Viollier et al., 2000; Braunschweig et al., 2012). Hierbij wordt het aanwezige Fe3+ initieel gereduceerd tot Fe2+ aan de hand van hydroxylaminehydrochloride. Eén mol Fe2+ reageert vervolgens in basisch milieu met drie mol phenanthroline tot een oranje-rood complex. Een reeks testen in een 96-well plaat werden uitgevoerd om optimale resultaten te bekomen.

1.4.2. METHODE De

phenanthrolinereactie

heeft

drie

reagentia

nodig.

Reagens

1

is

1.4

M

hydroxylaminehydrochloride opgelost in 1 M HCL. Reagens 2 is een 7 mM phenanthroline oplossing en reagent 3 is een 1.2 M ammoniumacetaat-buffer, op pH 9.5 gebracht met NH4OH. Een Fe2+ callibratiecurve werd opgesteld met een stockoplossing van 1.79 mM Fe2+ (2.21 mM ijzer(II)chloridetetrahydraat in 0.5 M HCl). De Fe3+ stockoplossing bevatte 1.79 mM Fe3+(2.43 mM ijzer(III)chloridehexahydraat in 0.5 M HCl). De Fe2+/Fe3+ stockoplossing was een 1:1 mengsel van de Fe2+ stockoplossing en Fe3+ stockoplossing. Ook de verdunningsreeksen werden met 0.5 M HCl verdunt, om spontane oxidatie van Fe2+ naar Fe3+ te verhinderen. In een 96-well plaat werd 50 µl staal en 75 µl van reagens 1 gepipetteerd. Opdat de reductie volledig kon doorgaan, was 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur nodig. Na incubatie werd 150 µl reagens 2 en 50 µl reagens 3 toegevoegd. De absorbantie werd na maximum 5 minuten gemeten bij 490 nm met de Powerwave X spectrofotometer.

29

1.5. MANGAAN 1.5.1. INLEIDING De high-throughput methode voor het bepalen van lage mangaanconcentraties is gebaseerd op de formaldoxime methode (Chiswell & O’Halloran, 1991). Hierbij vormt formaldoxime een complex met mangaan onder basische omstandigheden. Een nadeel is echter dat ook ijzer wordt gecomplexeerd door formaldoxime. Het ijzer wordt ontkoppeld van het formaldoximecomplex door middel van EDTA en een hydroxylaminehydrochloride oplossing.

1.5.2. METHODE Bij deze colorimetrische methode zijn vier reagentia nodig. Het FAD reagens bevat 115 mM hydroxylaminehydrochloride in 4 ml formaldehyde (30 %) en 96 ml Milli-Q water. Het tweede reagens is een 15 % NH3 oplossing. Het FAD en NH3 werden vervolgens gemengd in een 5:2 verhouding. NH4OH werd gebruikt om dit mengsel tot een pH van 8.8 te brengen. De pH dient voor een optimale mangaanbepaling gelegen te zijn tussen 8.8 en 9.8 (Brewer & Spencer, 1971). Het mengsel kan niet bewaard worden, en werd steeds voor gebruik gemaakt. Het derde reagens bevatte 3.62 M EDTAzout in milli-Q water. En tenslotte werd een 10 % hydroxylaminehydrochloride oplossing gebruikt. Een stockoplossing van 1.82 mM Mn werd gemaakt (0.307 g/l MnSO4.H2O in milli-Qwater) voor het opstellen van de callibratiecurve. In een 96-well plaat werden achtereenvolgens 250 µl staal, 20 µl FAD/NH3 mengsel, 10 µl EDTA en 20 µl hydroxylamine toegevoegd. Na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur, werd de absorbantie gemeten bij 450 nm met de Powerwave X spectrofotometer.

1.6. CHEMISCHE ZUURSTOFVRAAG 1.6.1. INLEIDING De chemische zuurstofvraag stelt de hoeveelheid zuurstof voor die nodig is om een koolstofbron volledig te oxideren (Goh & Lim, 2008). Koolstofbronnen zoals glucose worden door de hoge incubatietemperatuur

en

het

oxidans

kaliumpermanganaat

geoxideerd

tot

CO2.

Kaliumpermanganaat werd in overmaat toegediend, waarna na incubatie de overblijvende hoeveelheid kaliumpermanganaat spectrofotometrisch werd bepaald. De spectrofotometrische bepaling van de chemische zuurstofvraag is gebaseerd op de flow injectie methode volgens Dan et al. (2005) en Vallejo-Pecharromán et al. (1999). Een flow injectie methode gecombineerd met chemiluminescentie werd eerst getest. Hierbij wordt de overmaat kaliumpermanganaat, na incubatie,

geoxideerd

bij

injectie

van

glutaraldehyde,

waarbij

een

lichtsignaal

of

chemiluminescentie wordt gemeten (Yao et al., 2009).

30

1.6.2. METHODE 1.6.2.1.

CHEMILUMINESCENTIE METHODE

In een eppendorfje (2 ml) werd achtereenvolgens 1 ml staal, 200 µl H2SO4 (5M) en 100 µl KMnO4 (0.01 M) toegediend. Deze epjes werden gedurende 50 minuten geïncubeerd bij 98 °C in een thermoblock. Na incubatie werden de epjes 2 minuten afgekoeld op ijs en werd 100 µl overgepipetteerd in een aangepaste chemiluminescentie-96-well plaat (Greiner black). Chemiluminescentie werd gemeten met de Tecan infinite M200 pro. Met behulp van een injectiepomp werd 100 µl glutaraldehyde (1 %) in de welletjes geïnjecteerd met een injectiesnelheid van 300 µl/s. Na 0.1 seconde werd het chemiluminescentie signaal gemeten.

1.6.2.2.

SPECTROFOTOMETRISCHE METHODE

Het eerste reagens is een 0.6 M H2SO4 oplossing. Kaliumpermanganaat werd gebruikt als oxiderend reagens. Een stockoplossing KMnO4van 10 mM in 0.6 M H2SO4 werd een uur opgewarmd bij 80 °C. Na afkoelen tot kamertemperatuur, werd de oplossing gefilterd doorheen een 0.45 µm filter. Het derde reagens, namelijk 1 mM KMnO4, werd bekomen door de gefilterde stockoplossing te verdunnen met 0.6 M H2SO4. In een 2 ml eppendorf werd achtereenvolgens 800 µl verdunning, 200 µl (0.6 M) H2SO4 en 200 µl (1 mM) KMnO4 gebracht. Deze werden 50 minuten geïncubeerd bij 80 °C in een thermoblock. De eppendorfjes dienen open geïncubeerd te worden, opdat CO2 kan ontsnappen (Yao et al., 2008). Na incubatie, werden de eppendorfjes onmiddellijk 2 minuten overgebracht op ijs om de reactie te stoppen (Goh & Lim, 2006). In een 96-well plaat werd 100 µl van de geïncubeerde oplossing gepipetteerd. De overmaat aan kaliumpermanganaat werd gemeten met de Powerwave X spectrofotometer bij 525 nm. Een callibratiecurve werd opgesteld met een stockoplossing van 0.01 M glucose.

2. FUNCTIONALITEITBEPALING VAN DE ZANDFILTERBACTERIËN Reeds 40 zandfilterbacteriën werden geïsoleerd van op een zandfilter in een drinkwaterbedrijf te Kluizen en Sinaai. Deze bacteriën werden opgegroeid in R2A medium (Massa et al., 1998). Dit medium bevat 0.5 g/L gistextract, 0.5 g proteose peptone, 0.5 g caseine hydrolysaat, 0.5 g/L oplosbaar zetmeel, 2.78 mM C6H12O6, 2.7 mM C3H3NaO3, 1.72 mM K2HPO4 en 0.42 mM MgSO4. Het R2A medium heeft echter een complexe samenstelling die sterk interfereert met de ontwikkelde high-throughput methodes. Daarom werd gezocht naar een minimaal groeimedium waarbij voldoende groei en waarbij weinig interferentie aanwezig is bij het uitvoeren van de high-throughput protocols. Het minimaal medium bestond hierbij uit gedestilleerd water dat op een C:N:P verhouding van 100:10:1 werd gebracht. In totaal werd 1.25 mM NaHCO3-C, 0.1 mM NH4+-N, 4.84 mM K2HPO4-P en 0.1 % v:v spoorelementen toegediend. De oplossing met spoorelementen bevatte 0.02 mM MnSO4, 0.8 mM H3BO3, 0.15 mM ZnSO4, 0.03 mM (NH4)6Mo7O24, 3.5 mM FeSO4 en 0.1 mM CuSO4. In een 96-well plaat werd 280 µl van het minimaal medium en 20 µl inoculum toegediend. Elke bacterie werd in triplicaat op de plaat geïnoculeerd. Daarnaast waren er voldoende blanco’s verspreid op de 96-well plaat om rij- en kolomeffecten te kunnen uitsluiten. Na inoculatie werd 31

de plaat afgedekt met een PCR-film om verdamping van het water te vermijden. Na 5 dagen incubatie bij 28 °C werd de overgebleven NH4+-N en de geproduceerde NO2--N en NO3--N concentraties bepaald. Het gehalte NH4+-N en NO2--N werden spectrofotometrisch bepaald volgens de eerder beschreven methodes. De hoeveelheid NO3-- N werd bepaald door middel van IC (Ion Chromatografie: 761 Compact IC, Metrohm). De concentraties NO3--N bevonden zich namelijk onder de detectielimiet van de salicylzuurmethode. Voor de analyse met behulp van de IC werd 10 ml gefilterd staal (0.22 µm) in de IC-tubes gebracht en eventueel verdund met Milli-Q water zodat de ionconcentraties zich tussen 0.01 en 23 mg NO3--N/L bevond.

3. INVASIE VAN ARTIFICIËLE ZANDFILTERGEMEENSCHAPPEN 3.1. ANALYSES MET DE FLOW CYTOMETER Flow cytometry is een snelle, accurate en quantitatieve methode voor het analyseren van bacteriën in drinkwater (Hammes et al., 2008). Hierbij kan men onder meer het celaantal bepalen (Hammes & Egli, 2005) en cellen onderscheiden van elkaar op basis van bepaalde celeigenschappen, na een specifieke kleuring (Hoefel et al., 2003).

3.1.1. LIVE/DEAD ANALYSE Bij het opstarten van de flow cytometer werd deze eerst grondig gereinigd. De flow cytometer is voldoende gereinigd indien het celaantal in de laatst gemeten staal gefilterd Evian (0.22 µm) minder dan 100 cellen/17 µL bedraagt. Het aantal levende bacteriële cellen in de effluentstalen werd geanalyseerd op basis van een Live/Dead kleuring. Deze stalen werden indien nodig verdund met een filtergesteriliseerde fysiologische oplossing (0.15 M NaCl; 0.22 µm), zodat het celaantal ongeveer 105– 107/ml bedroeg. Aan de (verdunde) stalen werd 1 % v:v viabiteitskleuring, ook wel Live/Dead kleuring genoemd. Deze oplossing bestaat uit Propidium Iodide (PI) en SYBR® Green I (De Roy et al., 2012): PropidiumIodide is een membraan-impermeabele kleurstof dat in elke 4e of 5e basenpaar intercalleert, zowel bij DNA als RNA (Gasol & Del Giorgio, 2000). Deze fluorescente kleuring wordt gebruikt bij het bepalen van het aantal dode of beschadigde cellen. De kleurstof kan de nucleïnezuren namelijk enkel bereiken doorheen een beschadigd membraan. SYBR ® Green I detecteert daarentegen alle cellen, zowel levend als dood en bindt zowel het DNA als het RNA (Lebaron et al., 1998). De kleuroplossing werd verkregen door een PI stockoplossing (20 mM PI in dimethyl sulfoxide (DMSO)) 50 keer en de SYBR ® Green I stockoplossing (10.000 keer geconcentreerd in DMSO) 100 keer te verdunnen in 0.22 µm gefilterd DMSO. De stalen werden na de Live/Dead kleuring 10 minuten geïncubeerd bij 37 °C om een optimale kleuring te bekomen. Het aantal levende/beschadigde cellen werd gemeten met de flow

32

cytometer Accuri met volgende instellingen. Data werden geanalyseerd met de BD C Sampler Software. Limiet: 30 seconden, 17 µl Snelheid: Medium Drempelwaarde: FL1-H 500 en FSC-H 6500

3.1.2. GFP ANALYSE MET DE FLOW CYTOMETER Het aantal GFP gelabelde cellen van de invaders werd bepaald door middel van de flow cytometer. De flow cytometer werd bij het opstarten gereinigd. De stalen werden opnieuw verdund indien nodig, met filtergesteriliseerde fysiologische oplossing (0.15 M NaCl, 0.22 µm) zodat het celaantal ongeveer 105 – 107/ ml bedroeg. Het aantal GFP gelabelde cellen werd gemeten door middel van de flow cytometer Accuri en de BD C Sample Software, met volgende instellingen: Limiet: 30 seconden, 17 µL Snelheid: Medium Drempelwaarde: FSC 6000 en SSC 1000

3.2. EXPERIMENT Tien zandfilterbacteriën werden geselecteerd van de 40 geïsoleerde zandfilterbacteriën. Na 5 dagen incubatie van deze monoculturen in het eerder beschreven minimaal medium (gedestilleerd water met C-, N- en P- bron), werd een Live/Dead analyse uitgevoerd met de flow cytometer. Rekening houdende met het aantal levende cellen, werden 26 artificiële zandfiltergemeenschappen gecreëerd met een verschillende gelijkheid, uitgedrukt aan de hand van de Gini coëfficiënt. De Gini coëfficiënt varieerde hierbij tussen 0 en 1. Van elke zandfiltergemeenschap werd 1,5 ml gepipetteerd in deep-well 96-well platen met welletjes met een maximum volume van 2 ml. Elke zandfiltergemeenschap werd hier ook als triplicaat in de 96-well plaat gebracht. Er waren voldoende blanco’s verspreid op de 96-well plaat om rij- en kolomeffecten te kunnen uitsluiten. De blanco’s bevatten het minimaal medium zonder inoculum. In

totaal

werden

drie

96-well

platen

opgesteld.

De

eerste

plaat

bevatte

de

zandfiltergemeenschappen zonder invasie, en is dus de blancoplaat. De twee andere platen bevatten de zandfiltergemeenschappen, geïnvadeerd met 1 % GFP-gelabelde invaders. Dit geeft de mogelijkheid om de invaders kwantitatief te onderscheiden van de aanwezige autotrofen. Het aantal GFP-gelabelde cellen in het inoculum, voor invasie, werd bepaald met de flow cytometer. Opdat een maximale fluorescentie aanwezig zou zijn voor een optimale GFP-analyse, werd het inoculum vóór deze analyse 1 dag bij 4 °C bewaard. Uiteindelijk werd de tweede plaat geïnvadeerd met de modelpathogeen Pseudomonas putida en de derde plaat met een belangrijk waterpathogeen Enterobacter aerogenes. De 96-well platen werden afgedekt met een PCR-film om verdamping van het waterige medium te voorkomen en werden geïncubeerd bij 28 °C. Na 1 dag incuberen werd staal genomen. De 96-well platen met deze stalen werden 1 dag bij 4 °C bewaard zodat het GFP-signaal zich optimaal kon ontwikkelen. 33

Het percentage invaders aanwezig in de zandfiltergemeenschappen, na incubatie en koele bewaring werd opnieuw bepaald met de flow cytometer. Daarnaast werd na 2 dagen incubatie, ook staal genomen zodat de functionaliteit van de zandfiltergemeenschappen kon worden bepaald. De NO2--N en NH4+-N concentraties werden bepaald met eerder beschreven high-throughput methodes. De NO3--N concentraties werden bepaald door middel van IC (761 Compact IC, Metrohm).

4. INOCULATIE VAN DE ZANDFILTERKOLOMMEN 4.1. OPSTELLING

Figuur 7: De experimentele set-up van 1 zandkolom.

De gehele experimentele opstelling bestond uit tien gelijkaardige zandkolommen. Om een duidelijk overzicht te behouden, wordt in figuur 7 de opstelling weergegeven van slechts één zandkolom. De zandkolom (1) is een cilinder van plexiglas, met 26 mm diameter en een hoogte van ongeveer 6 cm. De kolom werd opgevuld met een grof zandtype dat ook wordt gebruikt bij snelle zandfilters in de praktijk. Elke kolom bevatte 44 g zand waarbij het zandbed 5 cm hoog was. Boven deze zandlaag was een waterlaagje aanwezig van ongeveer 1 cm. Onder de zandlaag werden 10 glaspartikels gebracht om verstopping van de kolomuitlaat door zandkorrels te vermijden. De zandkolom was zowel onderaan als bovenaan afgesloten met rubberen stoppen die elk 1 cm hoog zijn. Het effluent van de zandkolom werd gemengd met de voedingsoplossing in het mengvat (4). Dit mengvat is een glasbeker (volume 10 ml) afgesloten met een rubberen stop. De voedingsoplossing (6) werd naar het mengvat gepompt door middel van de influentpomp (5). Het effluent werd naar het mengvat gepompt door middel van de recirculatiepomp (3). 34

Vooraleer het effluent de recirculatiepomp echter bereikt, passeert deze de flow-through cell (2). Hier is er de mogelijkheid om de conductiviteit en DO (Dissolved Oxygen) te meten. Deze parameters werden gemeten met behulp van Consort DIS (C3020). Na het doorlopen van deze flow-through cell splitst het effluent zich. Een deel van het effluent komt via de recirculatiepomp in het mengvat terecht. Het vloeistofmengsel van het mengvat wordt getransporteerd naar het influent van de zandkolom (7). Een ander deel van het effluent verlaat het systeem (8) waar staal kan genomen worden om eventueel de functionaliteit van de zandfilterbacteriën te bepalen. De systeemvloeistof verplaatst zich doorheen het systeem doordat een overdruk wordt gecreëerd in het totale systeem. Een zandkolom wordt in detail weergegeven in figuur 8 en de systeemparameters worden weergegeven in tabel 2.

Figuur 8: Een detailfoto van één zandkolom. Tabel 2: Systeemeigenschappen geldig bij de tien zandkolommen.

Eigenschappen

Gegevens

Aantal dagen gecirculeerd

81

Zanddiepte (cm)

5

Drooggewicht zand per kolom (g)

44

Effectief volume (ml)

30 %

Supernatans water diepte (cm)

1

Debiet influent (l/uur)

0.042

Recirculatiedebiet Test 1 (l/uur)

1.920

Recirculatiedebiet Test 2 (l/uur)

0.564

Temperatuur omgeving

17-20 C 35

4.2. TRACER EXPERIMENT Vooraleer de tien zandkolommen werden opgestart, werd een tracertest uitgevoerd. Hierdoor kon de hydraulische retentietijd (HRT) in het totale systeem worden bepaald. Een zoutoplossing, 2 g/L NaCl, werd gebruikt als tracer en de concentratie hiervan in het effluent werd gemeten als de elektrische conductiviteit. De elektrische conductiviteit werd gemeten door Consort (C3020), waarbij de datalogger ingesteld stond op 30 seconden. Onder meer de hydraulische retentietijd, zowel experimenteel als theoretisch werden met elkaar vergeleken. Hierbij werd gebruik gemaakt van volgende vergelijkingen (Levenspiel, 1999):

Met

als de tracerconcentratie op een bepaald tijdstip in het effluent en

de initiële

tracerconcentratie in het influent, namelijk 2 g/L NaCl. De hydraulische retentietijd, HRT of is de verandering van de tracerconcentratie in het effluent vergeleken met de initiële tracerconcentratie, per tijdseenheid.

4.3. EXPERIMENT 4.3.1. VOEDINGSSTROOM Na het succesvol verlopen van de tracertesten, werden de zandkolommen aangesloten op de voedingsstroom. De tien kolommen werden geïnoculeerd met een commercieel AOB en NOB mengsel, verkregen van Avecom. Per kolom werd ongeveer 15 ml inoculum toegediend. De exacte hoeveelheid toegediende cellen is echter niet gekend doordat enkele verliezen optraden bij het sluiten van de zandkolommen. De voedingsoplossing bestond uit gedestilleerd water dat op een C:N:P verhouding van 100:10:1 werd gebracht. In totaal werd 1.25 mM NaHCO3-C, 0.1 mM NH4+-N, 4.84 mM K2HPO4-P en 0.1 % v:v spoorelementen toegevoegd. De verhouding NaCO3/N dient ongeveer 12 te zijn. De

kolommen

en

andere

systeemonderdelen

werden

volledig

opgevuld

met

de

voedingsoplossing alvorens de pompen werden opgestart. Het is hierbij belangrijk dat geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn om een overdruk te kunnen garanderen. Er werd zoveel mogelijk staal genomen waarbij het ammonium- en nitrietgehalte werd bepaald door middel van de eerder beschreven high-throughput methodes. Het nitraatgehalte werd bepaald door middel van IC doordat de NO3--N concentraties zich onder de detectielimiet bevonden van de eerder vermelde nitraat-high-throughput methode. Bijkomend werd ook een Live/Dead kleuring uitgevoerd met de flow cytometer Accuri.

36

4.3.2. STRESS FACTOR Nadat de aanwezige AOB’s en NOB’s een biofilm hadden gevormd en enige bacteriële activiteit vertoonden, werd de helft van de zandkolommen blootgesteld aan een variabele voedingsstroom. Hierbij kregen de eerste vijf kolommen afwisselend de normale voedingsstroom zoals eerder vermeld met onder meer 1.5 mg NH4+-N/L, en een aangepaste voedingsstroom zonder NH4+-N/L, met enkel K2HPO4-P, carbonaat en de spoorelementen. De laatste 5 kolommen bleven de constante voedingsstroom met 1.5 mg NH4+-N/L behouden.

4.3.3. INVASIE In een laatste fase werden de kolommen geïnvadeerd met een GFP gelabelde invader. Dezelfde invaders van bij de zandfiltergemeenschappen werden gebruikt: de modelpathogeen Pseudomonas putida en een belangrijk waterpathogeen Enterobacter aerogenes. Voor invasie werd ook hier het aantal GFP-gelabelde cellen bepaald aan de hand van flow cytometrie nadat het inoculum 1 dag bij 4 °C werd bewaard. Figuur 8 toont een overzicht van het totale experiment met de tien zandkolommen.

Figuur 9: Overzicht van het invasie-experiment met de tien zandkolommen. C= Controle, P= Invasie van de zandkolom met Pseudomonas putida en EA= Invasie van de zandkolom met Enterobacter aerogenes.

De toegediende invaders maakten 1 % uit van de totale microbiële populatie aanwezig in de zandkolommen. Doordat de exacte hoeveelheid bacteriële cellen aanwezig in de kolommen niet gekend is, werd de bacteriële kolompopulatie op volgende wijze geschat: Staal: 5 zandkorrels per kolom, ongeveer op 1 cm diepte genomen. Aan elk eppendorfje, met deze korrels, werd 200 µl gefilterde fysiologische oplossing toegevoegd (0.15 M NaCl ;0.45 µm). 37

De biofilm werd van de zandkorrels losgemaakt door de eppendorfjes te vortexen, 5 minuten in een ultra sound bad (Elmasonic, S 30 H) te behandelen bij kamertemperatuur en nadien opnieuw te vortexen. Op dit waterig staal werd een Live/Dead analyse uitgevoerd waardoor het celaantal per 5 zandkorrels (nat gewicht) gekend is. Aangezien enkel het initieel droog zandkorrelgewicht per kolom gekend is (namelijk 44 g), werden de eppendorfjes met de 5 zandkorrels 24 uur gedroogd in een droogoven bij 120 °C. Hierdoor kon het celaantal per 5 zandkorrels (droog gewicht) worden bepaald en omgerekend worden naar de totale zandkolom.

4.4. MOLECULAIRE ANALYSE VAN DE ZANDBIOFILM 4.4.1. DNA-EXTRACTIE Per zandkolom werden drie zandstalen (elk gemiddeld 0.5 g) genomen en bewaard in een FastPrep tube. Na toevoegen van 1 ml fysiologische oplossing (0.15 M NaCl) per tube, werden alle tubes 10 minuten gecentrifugeerd bij 10000 rpm. Het supernatans werd verwijderd waardoor een microbiële pellet op de zandkorrels achterbleef. In een eerste fase bij deze DNA-extractie werd aan de pellet 200 mg glaspartikels en 1 ml lyse buffer toegevoegd. Deze buffer bestond uit 100 mM Tris (pH 8), 100 mM EDTA (Ethyleendiaminetetra-azijnzuur);(pH 8), 100 mM NaCl, 1 % w:v polyvinylpyrrolidone en 2 % w:v natrium dodecyl sulfaat. Deze buffer werd uiteindelijk op pH 7 gebracht met HCl. De tubes met de glaspartikels en buffer werden twee keer 60 seconden behandeld in de FastPrep bij een snelheid van 6 m/s. Hierna werden de tubes nog eens 2 minuten gecentrifugeerd bij 10000 rpm. Het bekomen supernatans werd overgepipetteerd in een 1.5 ml eppendorf en 500 µl fenoloplossing werd toegevoegd. Fenol zorgt namelijk voor de neerslag van de aanwezige eiwitten. Na het toedienen van fenol werden de eppendorfjes energetisch met de hand geschud en opnieuw 2 minuten gecentrifugeerd bij 10000 rpm. Het bekomen supernatans werd naar een nieuw 1.5 ml eppendorf gepipetteerd en 700 µl chloroform werd toegediend. Chloroform zorgt voor het wegwassen van eventueel overblijvend fenol. De eppendorfjes werden terug energetisch met de hand geschud en 1 minuut gecentrifugeerd bij 10000 rpm. Het bekomen supernatans werd verdeeld in twee eppendorfjes (1.5 ml) omdat het totale volume in de volgende fasen het totale volume van een eppendorf zou overschrijden. In elk eppendorfje werd daarom 450 µl van het supernatans gepipetteerd. Hierbij werd 45 µl natriumacetaat (3 M) en 450 µl isopropanol toegevoegd. Isopropanol verandert de polariteit van de waterige fase naar een meer organisch medium. De tubes werden hierna voorzichtig een aantal keren omgedraaid en 1 uur bij - 20 °C geïncubeerd. Deze incubatie zorgt ervoor dat meer DNA kan worden geëxtraheerd. Een lage temperatuur zorgt namelijk voor een lagere oplosbaarheid van het DNA. Na incubatie werden de tubes 30 minuten gecentrifugeerd bij 4 °C en 10000 rpm. Het supernatans werd verwijderd en de pellets werden gedroogd door de geopende tubes op de bench te laten drogen. Dit drogen is noodzakelijk zodat het isopropanol volledig verwijderd is. De pellet werd hierna opnieuw opgelost in 50 µl TE –buffer (Tris – EDTA).

38

4.4.2. AGAROSE GEL 4.4.2.1.

INLEIDING

Om na te gaan of de DNA extractie geslaagd was en er dus DNA aanwezig was in de opgeloste pellet werd een gelelektroforese uitgevoerd. Hierbij wordt het DNA in een elektrisch veld gebracht met een positieve en een negatieve pool. Aangezien de aanwezige fosfaten van het DNA negatief geladen zijn, migreert het DNA naar de positieve pool. Eén van de factoren die de migratiesnelheid van het DNA bepaalt, is de grootte van het DNA. Hoe kleiner het DNA, hoe sneller deze migreren doorheen de gel. De DNA-bandjes werden gevisualiseerd met ethidiumbromide dat zich tussen de DNA-strengen nestelt.

4.4.2.2.

METHODE

Een oplossing van 0.5 g agarose en 50 ml (Tris-Acetaat-EDTA) TAE buffer werd opgekookt in een microgolfoven totdat een heldere oplossing verkregen werd. Nadat de oplossing afgekoeld was tot ongeveer 50 °C werd 1 µl ethidiumbromide toegevoegd en voorzichtig geschud om luchtbellen te vermijden. Deze oplossing werd in de gelhouder met gelkammetje gehouden en afgekoeld gedurende 20 minuten. Nadat de gel gevormd is, werd deze overgeplaatst in een gelelektroforesetoestel, gevuld met 0.5 x TAE buffer. Het eerste en laatste gelgaatje werd gevuld met de DNA ladder. De overige gelgaatjes werden opgevuld met de eigen DNA-stalen. Deze stalen zijn een mengsel van 5 µl van de opgeloste pellet in TE buffer en 1 µl ladingsbuffer. Het gelelektroforesetoestel werd aangesloten op 100 volt en werd ongeveer 30 minuten gelopen. Na scheiding van het DNA, werd deze gevisualiseerd door middel van UV belichting van het ethidiumbromide.

4.4.3. QPCR 4.4.3.1.

INLEIDING

PCR (Polymerase Chain Reaction) is een veel gebruikte methode om DNA te amplificeren opdat verdere moleculaire analyses mogelijk zijn (van Pelt-Verkuil et al., 2008). Hierbij kan men verschillende fasen onderscheiden. Tijdens denaturatie wordt het dubbelstrengig DNA gesplitst tot enkelstrengig DNA, waaraan de primer zich later aan hecht. Het aanhechten van de primer aan een DNA streng wordt ook annealing genoemd. Wanneer de temperatuur stijgt, zal de primer de tweede streng vervolledigen waardoor opnieuw dubbelstrengig DNA ontstaat. Tijdens deze stap gebeurt dus de elongatie. Deze cyclus wordt telkens herhaald tijdens het PCR proces totdat een reagens limiterend wordt en een plateaufase wordt bereikt. Na elke cyclus is het aantal DNA dus verdubbeld. Quantitatieve PCR of qPCR is een manier waarbij het aantal DNA van een bacterie kan worden bepaald. Een qPCR voor AOB’s en NOB’s werd uitgevoerd. SYBR® Green I werd hierbij gebruikt om het dubbelstrengig DNA te visualiseren.

39

4.4.3.2. METHODE Een mastermix werd aangemaakt en bestond uit 1250 µl buffer, 600 µl PCR-water en 75 µl van elke primer. De gebruikte primers worden weergegeven in Tabel 3. In een 96-well plaat werd 20 µl van deze mastermix en 5 µl van de DNA-stalen toegevoegd. De DNA-stalen waren allemaal 1/10 verdund in PCR-water. In de plaat werd ook een standaardreeks geplaatst van 10-2 tot 10-8 kopieën per µl. Voor de standaardreeks van AOB’s werd een Escherichia coli bacterie met een plasmide dat een DNA fragment met een specifiek gen bezit voor AOB’s gebruikt. De standaardreeks voor NOB’s en 16 s rDNA werd opgesteld met een rRNA en is dus niet genspecifiek. Naast een standaardcurve werden ook blanco’s aan de 96-well plaat toegevoegd. Uiteindelijk werd de plaat 1 minuut gecentrifugeerd bij 4000 rpm en in het PCR toestel geplaatst (ABI Prism 7000). De gebruikte tijd en temperaturen worden weergegeven in Tabel 3. Tabel 3: De gebruikte primers en het gebruikte tijd en temperatuur programma bij de qPCR.

Bacterie AOB

Primer

Tijd en temperatuur programma

amoA- 1F:GGGGTTTCTACTGGTGGT

(1) 2 min, 50 °C; 10 min, 95 °C

amoA-2R:CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC

(2) 30 sec, 94 °C; 30 sec, 55 °C; 45 sec 60 °C (40x) (3) 15 sec, 95 °C; 20 sec, 60 °C; 15 sec, 95 °C

NOB

NSR 1113F: CCTGCTTTCAGTTGCTACCG

(1) 2 min, 50 °C; 10 min, 95 °C

NSR 1264R: GTTTGCAGCGCTTTGTACCG

(2) 1 min, 95 °C; 1 min, 50 °C; 1 min, 60 °C (40x) (3) 15 sec, 95 °C; 20 sec, 60 °C; 15 sec, 95 °C

40

Resultaten

1. HIGH TROUGHPUT METHODES De high-throughput methodes beschreven in het hoofdstuk Materiaal & Methode, werden geoptimaliseerd voor deze thesis. Doordat deze thesis handelt over drinkwaterzuivering werd aandacht besteed aan de drinkwaternormen en werden de high-throughput methodes ontwikkeld in gedestilleerd water. De accuraatheid van deze metingen wordt weergegeven door middel van de standaardcurves en bijhorende R². De high-throughput methodes van nitriet en ammonium werden vergeleken met een bestaande kit.

1.1. NITRIET In figuur 10 is de standaardcurve weergegeven van nitriet in gedestilleerd water volgens de Montgomery methode. De curve is lineair van 0.008 tot 0.84 mg NO2--N/L en kan hierdoor concentraties meten kleiner dan de drinkwaternorm, aangeduid als de stippellijn in figuur 10. De standaardcurve heeft een R² van 0.9986 en is dus een accurate methode.

Absorbantie gemeten bij 540 nm

1,6 y = 1,4086x + 0,0196 R² = 0,9986

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

0,2

0,4 0,6 0,8 Concentratie (mg NO2--N/L)

1

1,2

Figuur 10: De standaardcurve voor nitrietbepaling. De drinkwaternorm voor nitriet wordt weergegeven door middel van de verticale stippellijn en bedraagt 0.03 mg NO2--N/L. Drie herhalingen per standaard werden gemeten. De standaardafwijking wordt weergegeven op de grafiek door middel van foutevlaggen.

De accuraatheid van de nitriet-high-throughput methode werd vergeleken met een commerciële nitrietkit (Macherey-Nagel Nanocolor, Test 0-68 en Test 0-69); (Figuur 11). De gemeten concentratie van elke methode wordt weergegeven in functie van de werkelijke concentratie van de standaardreeks. Bij een perfecte meting liggen de waarden dus op een diagonaal met vergelijking

. De Montgomery methode heeft een R² van 0.9957 en vergelijking . Met de nitrietkit werd een R² van 0.9788 en vergelijking

verkregen. Beide methodes hebben een vergelijking die dicht aanleunt bij

. De

gemeten concentraties van beide methodes zijn dan ook bijna hetzelfde. De Montgomery methode is dus een betrouwbaar protocol in minimaal medium.

42

0,12 Gemeten concentratie (mg NO2+-N/L)

0,1 0,08

Nanocolor nitrietkit

0,06

Montgomery methode

0,04 0,02 0 0

0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 + Concentratie standaardreeks (mg NO2 -N/L)

Figuur 11: De Montgomery methode werd vergeleken met een nanocolor nitrietkit (MachereyNagel). De diagonaal illustreert de perfecte verhouding van de standaardconcentratie op de gemeten concentratie. De nitrietkit werd niet uitgevoerd in triplicaat, de Montgomery methode echter wel. De standaardafwijking wordt weergegeven als foutevlaggen op de grafiek.

1.2. NITRAAT In figuur 12 is de standaardcurve weergegeven voor het bepalen van nitraat volgens de nitraatsalicylzuurmethode. De verdunningsreeks werd opgesteld in gedestilleerd water. De curve is lineair van 6 tot 90 mg NO3--N/L en kan daardoor concentraties meten lager dan de drinkwaternorm. De drinkwaternorm is in figuur 12 aangeduid als de stippellijn. Het is een

Absorbantie gemeten bij 420 nm

accurate methode, de curve heeft namelijk een R² van 0.9992. 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

y = 0,0091x - 0,007 R² = 0,9992

0

20

40 60 Concentratie (mg NO3--N/L)

80

100

Figuur 12: De standaardcurve voor nitraatbepaling. De drinkwaternorm voor nitraat wordt weergegeven door middel van de verticale stippellijn en bedraagt 11.3 mg NO 3--N/L. Drie herhalingen per standaard werden gemeten. De standaardafwijking wordt weergegeven op de grafiek door middel van foutevlaggen.

1.3. AMMONIUM Verschillende ammoniumprotocols werden getest om zo de beste methode te selecteren om ammoniumconcentraties lager dan de drinkwaternorm te bepalen. De Nesslermethode, de OPAsulfiet methode en de aangepaste Berthelotmethode werden getest. 43

Absorbantie gemeten bij 450 nm

01 y = 0,0523x + 0,0889 R² = 0,9926

01 00 00 00 00 00 0

1

2 3 4 5 + Concentratie (mg NH4 -N/L)

6

7

8

Figuur 13: De standaardcurve voor ammoniumbepaling met behulp van de standaard Nesslermethode. De drinkwaternorm voor ammonium wordt weergegeven door middel van de verticale stippellijn en bedraagt 0.38 mg NH4+-N/L. Drie herhalingen per standaard werden gemeten. De standaardafwijking wordt weergegeven op de grafiek door middel van foutenvlaggen.

Figuur 13 toont de standaardcurve verkregen met de Nesslermethode. De curve is lineair tot zeker 8 mg NH4+-N/L. Hogere concentratie werden niet gemeten wegens irrelevant voor deze thesis. De stippellijn geeft de drinkwaternorm weer en illustreert de mogelijkheid om concentraties lager dan de drinkwaternorm te bepalen. De curve heeft een R² van 0.9926 en kan als een accurate methode beschouwd worden. Doch vlakken de datapunten rond de drinkwaternorm af ten opzichte van de overige datapunten bij hogere concentraties. De standaardcurve verkregen met de OPA-sulfietmethode is weergegeven in figuur 14. De curve heeft een R² van 0.9931, wat goed is. Maar de standaardafwijkingen zijn groot en bij lage concentraties worden negatieve absorbanties bekomen. De detectielimiet bedraagt namelijk 2.8 mg NH4+-N/L waardoor concentraties lager dan de drinkwaternorm niet kunnen bepaald worden. De grijze datapunten geven de significante waarden weer. Vanaf 2.8 mg NH4+-N/L

Absorbantie gemeten bij 420 nm

worden de absorbanties negatief (groene datapunten). 0,014 0,012 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0 -0,002 0 -0,004

y = 0,0013x - 0,0026 R² = 0,9931

2

4

6

8

10

12

Concentratie (mg NH4+-N/L) Figuur

14:

De

OPA-sulfietmethode

werd

ook

getest

voor

de

spectrofotometrische

ammoniumbepaling. De verticale stippellijn geeft de drinkwaternorm (0.38 mg NH 4+-N/L) weer. Per standaard werden drie herhalingen gemeten. De foutenvlaggen op de grafiek toont de bijhorende standaardafwijking.

44

Een derde high-throughput methode voor de bepaling van ammonium wordt weergegeven in figuur 15. De methode is gebaseerd op de ammonium-salicylzuurmethode, ook de aangepaste Berthelotreactie genoemd. De standaardcurve is lineair van 0.2 tot 8 mg NH4+-N/L en kan daardoor concentraties meten lager dan de drinkwaternorm. De drinkwaternorm is in figuur 15 aangeduid als de stippellijn. De standaardcurve werd opgesteld in gedestilleerd water en kent in dit minimaal medium een goede accuraatheid, namelijk een R² van 0.9994.

Absorbantie gemeten bij 700 nm

3 y = 0,2941x + 0,1113 R² = 0,9994

2,5 2 1,5 1 0,5 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

Concentratie (mg NH4+-N/L) Figuur 15: De standaardcurve voor ammoniumbepaling verkregen met de aangepaste Berthelotreactie. De drinkwaternorm voor ammonium wordt weergegeven door middel van de verticale stippellijn en bedraagt 0.38 mg NH4+-N/L. Drie herhalingen per standaard werden gemeten. De standaardafwijking wordt weergegeven op de grafiek door middel van foutenvlaggen.

De optimale golflengte waarbij de absorbantie dient gemeten te worden werd bepaald (Figuur 16). Daarnaast werd ook de volgorde van de reagentia onderzocht. De optimale golflengte bedraagt 700 nm. Bijkomend werd de hoogste absorbantie bekomen indien salicylzuur als tweede reagens werd toegediend. 3

Absorbantie

2,5 2

Reagens B + Reagens A

1,5 1 Reagens A + Reagens B

0,5 0 600

650

700

750

800

Golflengte (nm) Figuur 16: Bepalen van de optimale golflengte en volgorde van de reagentia. Reagens A is de NaOH/ NaClO oplossing. Reagens B is de salicylzuuroplossing. Deze metingen werden uitgevoerd met een stockoplossing van 5 mg NH4+-N/L.

45

De Berthelotmethode werd vergeleken met een commerciële ammoniumkit (HACH Lange, LCK 304) om de betrouwbaarheid na te gaan. De gemeten concentratie van elke methode wordt in figuur 17 weergegeven in functie van de werkelijke concentratie van de standaardreeks. Bij een perfecte meting liggen de waarden dus op een diagonaal met vergelijking

. De ammonium-

salicylzuurmethode heeft een R² van 0.9985 en vergelijking

. Met de

ammoniumkit werd een R² van 0.999 en vergelijking

Gemeten concentratie (mg NH4+-N /L)

benaderen de vergelijkingen

bekomen. Ook hier

.

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Berthelot methode Ammonium kit

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Concentratie standaardreeks (mg

0,7

0,8

0,9

NH4+-N/L)

Figuur 17: De Berthelotmethode werd vergeleken met een ammoniumkit. De verdunningen werden enkel in triplicaat uitgevoerd voor de salicylzuurmethode. De diagonaal illustreert de perfecte verhouding van de standaardconcentratie op de gemeten concentratie.

De

Nesslermethode

werd

vergeleken

met

de

Berthelotmethode

ammoniumconcentraties te bepalen (Figuur 18). Enkel drinkwaternorm (0.38 mg

NH4+-N/L)

de concentraties

om

lage

rond de

worden hier dus weergegeven. De standaardcurve van de

Berthelotmethode is steiler en heeft een hogere R². 0,3 y = 0,3286x + 0,0011 R² = 0,9962

Absorbantie

0,25 0,2

Berthelot methode

y = 0,0568x + 0,083 R² = 0,9105

0,15

Nessler methode

0,1 0,05 0 0

0,2 0,4 0,6 0,8 Concentratie (mg NH4+-N/L)

1

Figuur 18: De Berthelotmethode werd vergeleken met de standaard Nesslermethode met een stockoplossing van 5 mg NH4+-N/L. Per standaard werden drie herhalingen gemeten. De corresponderende standaardafwijking wordt weergegeven als foutenvlaggen op de grafiek. De Berthelotmethode werd gemeten bij een golflengte van 700 nm. Nessler werd gemeten bij een golflengte van 450 nm.

46

1.4. IJZER In figuur 19 wordt de standaardcurve voor Fe2+, Fe3+ en voor mengsel Fe2+/Fe3+ met v % 1:1 weergegeven. De drie standaardcurves worden hier getoond omdat bij deze methode Fe3+ wordt gereduceerd tot Fe2+ na toevoegen van het eerste reagens. De drie curves liggen bijna op elkaar wat aantoont dat de ijzerreductie optimaal verloopt. De curve is lineair van 0.1 tot 100 mg Fe +/L kan daardoor concentraties meten lager dan de drinkwaternorm. De drinkwaternorm is in figuur 19 aangeduid als de verticale stippellijn. Hogere ijzerconcentraties werden niet getest wegens irrelevant in verband met de drinkwaternorm. De R² van de Fe2+ , Fe3+ en Fe2+ / Fe3+ (v % 1:1) standaardcurves zijn respectievelijk 0.999, 0.998 en 1. De standaardafwijkingen variëren tussen de 0.2 en 10 % van de gemeten concentraties en zijn daardoor niet goed zichtbaar op de grafiek.

Absorbantie gemeten bij 490 nm

3,5 3 2,5 2

Fe 2+

1,5

Fe 3+

1

Fe 2+/3+

0,5 0 0

25

50 75 Concentratie (mg Fe+ /L)

100

Figuur 19: De standaardcurve met een Fe2+, Fe3+ en een mengsel van Fe2+/Fe3+ (v % 1:1) verdunningsreeks, volgens de phenanthroline methode. De drinkwaternorm voor ijzer wordt weergegeven door middel van de verticale stippellijn en bedraagt 0.2 mg Fe +/L. Per standaard werden drie herhalingen uitgevoerd, de bijhorende standaardafwijkingen worden weergegeven op de grafiek.

1.5. MANGAAN De high-throughput spectrofotometrische methode om lage concentraties mangaan te bepalen is gebaseerd op de formaldoxime methode. De curve is lineair van 0.05 – 0.8 mg Mn2+/L en kan dus net gebruikt worden om concentraties rond de drinkwaternorm te bepalen. De drinkwaternorm is in figuur 20 aangeduid als de stippellijn. De standaardcurve heeft een R² van 0.9875.

47

Absorbantie gemeten bij 450 nm

0,3 y = 0,3546x + 0,0012 R² = 0,9875

0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0

0,2 0,4 Concentratie (mg Mn2+/L)

0,6

0,8

Figuur 20: De standaardcurve voor mangaanbepaling. De drinkwaternorm voor mangaan wordt weergegeven door middel van de verticale stippellijn en bedraagt 0.05 mg Mn 2+/L. Per standaard werden drie herhalingen gemeten. De bijhorende standaardafwijking wordt weergegeven als foutenvlaggen op de grafiek.

1.6. CHEMISCHE ZUURSTOFVRAAG Bij de optimalisatie van een high-throughput methode om lage COD-concentraties te bepalen werden zowel een chemiluminescentie methode en een spectrofotometrische methode uitgetest. Figuur 21 illustreert de standaardcurve verkregen via chemiluminescentie. Er werd 100 µl injectievloeistof, 1 % glutaraldehyde, geïnjecteerd met een snelheid van 300 µl/seconde. De curve is slechts lineair tussen 0.1 en 2 mg COD/L. Daarnaast zijn er grote standaardafwijkingen aanwezig waardoor de methode niet betrouwbaar is.

Chemiluminescentie

4000 y = 677,86ln(x) + 2013,9 R² = 0,8243

3000 2000 1000 0 0

2

4

6

8

10

12

Concentratie (mg COD/L) Figuur 21: Bepaling van de chemische zuurstofvraag aan de hand van chemiluminescentie in plaats van

een

colorimetrische

methode.

Er

werden

vier

herhalingen

uitgevoerd

per

verdunningsconcentratie. De bijhorende standaardafwijkingen zijn weergegeven in de figuur.

48

De standaardcurve verkregen volgens de spectrofotometrische methode is weergegeven in figuur 22. De curve is lineair tussen 1 en 10 mg COD/L en heeft een R² van 0.9773. Bijkomend zijn de standaardafwijkingen kleiner in vergelijking met de chemiluminescentie methode.

Absorbantie gemeten bij 525 nm

0,05

y = 0,0047x - 0,0018 R² = 0,9773

0,04 0,03 0,02 0,01 0 0

2

4 6 Concentratie (mg COD/L)

8

10

Figuur 22: De standaardcurve voor bepaling van de chemische zuurstofvraag, volgens de kaliumpermanganaatmethode. Voor COD bedraagt geen specifieke drinkwaternorm die kan worden weergegeven op deze grafiek. Per verdunningsconcentratie werden drie herhalingen uitgevoerd en per triplicaat werd de standaardafwijking bepaald.

2. ARTIFICIËLE ZANDFILTERGEMEENSCHAPPEN Om de invasie-effecten en de functionaliteit van zandfiltergemeenschappen te onderzoeken, werden 26 artificiële zandfiltergemeenschappen gecreëerd. Hierbij werd de rijkheid constant gehouden, en was de gelijkheid de variabele parameter. De gelijkheid varieerde tussen 0 en 1 met Giniwaarden van 0, 20.8, 40, 60, 76.4 en 84. Voor elke Gini werden vijf verschillende gemeenschappen gecreëerd, elk uitgevoerd in triplicaat, waardoor 15 datapunten aanwezig zijn per Gini coëfficiënt. De zandfiltergemeenschappen werden geïnoculeerd in minimaal medium waarbij na 1 en 3 dagen incubatie staal werd genomen. In totaal werden drie 96-well platen opgesteld: een plaat zonder invasie, een plaat met 1 % invasie door Pseudomonas putida en een plaat met 1 % invasie door Enterobacter aerogenes.

2.1.INVASIE VERSUS GELIJKHEID Figuur 23 illustreert het percentage GFP cellen in de zandfiltergemeenschap in functie van de Gini coëfficiënt. Initieel werden 1 % invaders aan de artificiële gemeenschap toegediend. Deze grafiek toont aan dat een gemeenschap met een hogere Gini, gevoeliger is voor invasie. Bij een Gini van 80 behoort de invader reeds tot de helft van de totale gemeenschap. Naarmate de zandfiltergemeenschap met de invader langer wordt geïncubeerd, daalt het percentage invaders. Het aantal GFP cellen verandert niet na invasie met Enterobacter aerogenes en is zelfs lager dan 1 %.

49

50 %

GFP cellen (% cellen/ml)

45 % 40 % 35 %

Pseudomonas putida

30 % 25 %

Enterobacter aerogenes

20 % 15 % 10 % 5% 0% 0

20

40

60

80

100

Gini coëfficiënt Figuur 23: Het aantal GFP cellen als percentage van de totale zandfiltergemeenschap wordt weergegeven in functie van de Gini coëfficiënt. Elke zandfiltergemeenschap werd in triplicaat geïnoculeerd. De bijhorende standaardafwijking wordt weergegeven als foutevlaggen op de grafiek.

Figuur 24 bevat dezelfde informatie als figuur 23, maar toont duidelijker de dalende trend. Naarmate de zandfiltergemeenschap meer ongelijk verdeeld is, daalt het aantal niet-gelabelde GFP cellen per ml. Deze datapunten werden verkregen nadat de zandfiltergemeenschappen werden geïnvadeerd met 1 % Pseudomonas putida. Hierbij werd het aantal GFP cellen gemeten na 1 dag incubatie. De totale zandfiltergemeenschap bevatte

cellen per ml.

Aantal niet-GFP cellen per ml

4000 3500 3000 R² = 0,1306

2500 2000 1500 1000 500 0 0

20

40 Gini coëfficiënt

60

80

100

Figuur 24: Het aantal niet-GFP gelabelde cellen per ml in functie van de Gini coëfficiënt van de zandfiltergemeenschap. De stippellijn toont deze dalende trend aan. Elke zandfiltergemeenschap werd in triplicaat geïnoculeerd. De bijhorende standaardafwijkingen worden weergegeven op de grafiek. Elke Gini werd vijf keer herhaald.

50

Figuur 25 toont het effect van de dominante soort van een residentiële gemeenschap op de invasiegevoeligheid van deze gemeenschap. Enkel de resultaten na invasie door Pseudomonas putida

worden

weergegeven

doordat

Enterobacter

aerogenes

geen

invasie-effecten

veroorzaakte. Tabel 4 geeft een weergave van de mogelijke identiteit van de gebruikte zandfilterbacteriën bij dit experiment. Nog niet alle bacteriën zijn geïdentificeerd. Tabel 4: De initialen van de mogelijke bacteriële soort of familie waartoe de bacterie behoort.

Initiaal S33 S19 K128 S74 K130 K27 S63 S53

Bacteriële soort of familie Albidiferax sp. Comamonadaceae Onbekend Hydrogenophaga sp. Onbekend Rhodococcus sp. Onbekend Comamonadaceae

Bij een Gini van 84 is de gemeenschap het gevoeligst voor invasie indien S19 de dominante soort is (Figuur 25). Wanneer S33, K128, S75 of K130 hierbij de dominante soort is, daalt het percentage invaders van 1 % naar gemiddeld 0.55 % na 1 dag incuberen. 43,97

44 Percentage invasie (% GFP cellen per ml)

40 36 32 28 24

Gini 84

20

Gini 76,4

16

Gini 60 10,61

12 8

3,34

4 0

0,560,59

0,5 0,51

S33

S19

K128

0,54

S75

0,59 0,52

0,58

K130

K27

1,14 0,67

S63

S53

Dominante soort aanwezig in de zandfiltergemeenschap Figuur 25: Het percentage aanwezige invaders in functie van de dominante soort aanwezig in de residentiële zandfiltergemeenschap. Het percentage GFP wordt weergegeven na 1 dag incubatie Elke zandfiltergemeenschap werd in triplicaat geïnoculeerd. De bijhorende standaardafwijkingen worden weergegeven als foutevlaggen op de grafiek.

51

Wanneer de zandfiltergemeenschap een Gini heeft van 76.4, dan daalt het aantal invaders opnieuw na 1 dag incubatie tot gemiddeld 0.55 % indien S33, K128, K130 en K27 de dominante soorten zijn (Figuur 25). Bij een Gini van 60 zijn er duidelijke invasie-effecten waar te nemen indien K128 en S53 de dominante soort zijn in een gemeenschap. Deze figuur verklaart ook waarom bij figuur 23 bij een Gini van bijvoorbeeld 84, sommige gemeenschappen geen invasie-effecten vertonen (lage datapunten Pseudomonas putida). Terwijl andere gemeenschappen bij dezelfde Gini ongeveer 50 % invasie kennen (hoge datapunten Pseudomonas putida ).

2.2. FUNCTIONALITEIT De functionaliteit werd bepaald door de resterende ammoniumconcentratie, en de eventueel geproduceerde nitriet- en nitraatconcentraties te bepalen. De ammonium- en nitrietgehaltes werden bepaald volgens de eerder beschreven high-throughput methodes. Het nitraatgehalte werd bepaald door middel van IC (761 Compact IC, Metrohm). Het medium bevatte initieel 1.5 mg NH4+-N/L. Figuur 26 toont de functionaliteit van de zandfiltergemeenschappen met een verschillende gelijkheid, zonder invasie. De functionaliteit werd na 2 dagen incubatie gemeten. De ‘blanco’ is het medium met 1.5 mg NH4+-N/L zonder inoculum. Dit betekent dat bij een volledige nitrificatie, de stikstofbalans moet kloppen en in totaal 1.5 mg NH4+-N/L dient te bedragen. Bij figuur 26 is dit echter niet het geval. Ammonium is geoxideerd tot nitriet en nitriet is deels

Concentratie (mg/l)

geoxideerd tot nitraat. Maar niet al het mogelijke nitraat is dus gevormd.

2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

NO3-N NO2-N NH4-N

0

20,8

40

60

76,4

84

Blanco

Gini coëfficiënt Figuur 26: Functionaliteit van de zandfiltergemeenschap in functie van de Gini coëfficiënt. Bij deze zandfiltergemeenschappen was geen invasie aanwezig. Elke zandfiltergemeenschap werd in triplicaat

geïnoculeerd.

De

bijhorende

standaardafwijkingen

worden

weergegeven

als

foutevlaggen op de grafiek. De foutevlaggen zijn afwezig bij de nitraatconcentraties doordat deze werden gemeten met de IC. De stippellijn toont de stikstofbalans (1.5 mg NH4+-N/L).

52

Figuur 27 toont de functionaliteit van de zandfiltergemeenschappen met een verschillende gelijkheid, na invasie door (1 %) Pseudomonas putida. De ‘blanco’ is het medium met 1.5 mg

Concentratie (mg/l)

NH4+-N/L zonder inoculum. De functionaliteit werd 2 dagen na incubatie gemeten. 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

NO2-N NH4-N

0

20,8

40

60

76,4

84

Blanco

Gini coëfficiënt Figuur 27: Functionaliteit van de zandfiltergemeenschap in functie van de Gini coëfficiënt. Bij deze zandfiltergemeenschappen was geen invasie aanwezig. Elke zandfiltergemeenschap werd in triplicaat

geïnoculeerd.

De

bijhorende

standaardafwijkingen

worden

weergegeven

als

foutevlaggen op de grafiek. De nitraatconcentraties worden niet weergegeven doordat de ion chromatograaf een foutmelding gaf tijdens de metingen. De stippellijn toont de stikstofbalans (1.5 mg NH4+-N/L).

Figuur 28 illustreert de invloed van dominantie op de functionaliteit van de totale gemeenschap beter. Hierbij tonen de gemeenschappen zonder invasie en met invasie dezelfde trend. Naarmate de Gini stijgt en de dominantie dus toeneemt, daalt de resterende ammoniumconcentratie in het medium. Een dalende ammoniumconcentratie betekent een toename in ammoniumoxidatie. Dit werd bevestigd door de stijgende trend van de nitrietconcentraties, dit zowel in de gemeenschappen met als zonder invasie Deze figuur illustreert daarnaast ook de invloed van invasie op de functionaliteit van de gehele gemeenschap. Hierbij dient de trend van de gemeenschappen zonder invasie vergeleken te worden met de trend bij de geïnvadeerde gemeenschappen. De ammoniumconcentraties zijn bij elke Gini lager bij de gemeenschappen met invasie in vergelijking met deze zonder. Dit vertaalt zich in een hogere ammoniumoxidatie, waarbij dus meer nitriet dient aanwezig te zijn bij invasie. Dit wordt dan ook geïllustreerd in figuur 28 doordat de nitriettrendlijn van de invasieplaat bij elke Gini hoger ligt dan de nitriettrendlijn van de plaat zonder invasie.

53

Figuur 28: Ammoniumoxidatie in functie van de Gini van de zandfiltergemeenschap en de aanwezigheid van een invasieve soort. Elke zandfiltergemeenschap werd in triplicaat geïnoculeerd. De bijhorende standaardafwijkingen worden weergegeven op de grafiek. Voor de NH4+-N concentraties van gemeenschappen zonder invasie en de gemeenschappen met 1 % invasie door Pseudomonas putida (PP) wordt een trendlijn weergegeven met respectievelijke R² van 0.0971 en 0.0774. Ook de trendlijn voor de NO2--N concentraties van de gemeenschappen zonder invasie en de gemeenschappen met 1 % invasie door Pseudomonas putida (PP) wordt weergegeven met respectievelijke R² van 0.1855 en 0.0271.

54

3. INVASIE-EXPERIMENT VAN DE ZANDKOLOMMEN 3.1.HYDRAULISCHE RETENTIETIJD De hydraulische retentietijd van het totale systeem (zandkolommen, buisjes, mixvat,..) werd bepaald door middel van een tracertest. Hierbij werd 2 g/L NaCl gebruikt als traceroplossing. De resultaten worden weergegeven met behulp van doorbreekcurves. Doorbreekcurves geven weer hoelang het duurt vooraleer de eerste toegevoegde NaCl moleculen het systeem opnieuw verlaten. Na gemiddeld 200 minuten verlaten de eerste NaCl moleculen het systeem (Figuur 29). Tussen de kolommen blijkt zoals verwacht enige variatie aanwezig te zijn. 1 Zandkolom 1 Zandkolom 2

0,8 C/C0 (g/l)

Zandkolom 3 0,6

Zandkolom 4 Zandkolom 5

0,4

Zandkolom 6 Zandkolom 7

0,2

Zandkolom 8 Zandkolom 9

0 ,0

50,0

100,0

150,0

200,0

Tijd (minuten) Figuur 29: Doorbreekcurves van het tracerexperiment op 9 zandkolommen met een initiële tracerconcentratie C0 van 2 g NaCl/L. De tracerconcentratie op een bepaald punt in de tijd wordt weergegeven door C (g/L). De doorbreekcurve van zandkolom 10 ontbreekt echter door een foutmelding van Consort tijdens de tracermetingen.

Tabel 5 geeft een vergelijking weer van de experimentele HRT bekomen met de tracertesten. De theoretische HRT werd berekend met de formules beschreven in Materiaal & Methode. De tracertesten zijn betrouwbaar. De experimentele en theoretische HRT benaderen elkaar goed. Deze HRT geeft de retentietijd weer van het totale systeem. Tabel 5: Vergelijkende tabel tussen de experimentele en theoretische HRT. Hierbij wordt zandkolom 1 als voorbeeld genomen.

Experimentele HRT systeem 1 HRT = 1.11 uur Influent debiet = 0.7 ml/min = 42 ml/uur Systeemvolume = = 46.75 ml

Theoretische HRT systeem 1

= 8 ml Volumebuisjes 13,01 ml Volumeijzeren verbindingsstukken 0.11 ml Systeem volume = 52.98 ml HRT = Systeemvolume / influent debiet HRT = 1.26 uur 55

3.2.NITRIFICATIE De tien zandkolommen werden geïnoculeerd met een commercieel AOB/NOB mengsel opdat de gewenste functionaliteit, namelijk nitrificatie werd verkregen. Om nitrificatie op te volgen werden zowel de ammonium -, nitriet – als nitraatconcentraties bepaald. De ammonium – en nitrietconcentraties werden bepaald volgens de eerder beschreven high-throughput methodes. Het nitraatgehalte is echter kleiner dan de detectielimiet van de nitraat-salicylzuurmethode bij het gebruikte medium. Hierdoor werd de nitraatconcentratie bepaald met behulp van ionenchromatografie

(IC).

De

zandkolommen

werden

continu

gevoed

met

een

voedingsoplossing die onder andere 1.5 mg NH4+-N/L bevatte

3.2.1. TEST 1: EEN HOGE RECIRCULATIESNELHEID Bij de eerste test werd een hoge recirculatiesnelheid van 1.920 l/uur gebruikt om zo een snelle zandfilter op laboratorium schaal te kunnen nabootsen. De influentsnelheid bedroeg 42 ml/uur. Figuur 30 geeft de ammoniumconcentratie weer in het effluent van het systeem. Bij de eerste inoculatie werd na ongeveer 1 dag slechts 33 % ammonium geoxideerd. Daarnaast steeg het ammoniumgehalte opnieuw tot ongeveer 1.2 mg NH4+-N/L en werd verder geen ammoniumoxidatie waargenomen. Er werd daarom een DNA extractie uitgevoerd op enkele zandstalen. Hieruit bleek dat geen DNA, dus ook geen inoculum meer aanwezig was in de zandkolommen. Vandaar dat na 10 dagen de kolommen opnieuw werden geïnoculeerd met hetzelfde inoculum. Hierna werd nog steeds geen ammoniumoxidatie waargenomen. Het inoculum kende namelijk geen activiteit meer.

Concentratie voeding (mg NH4+-N/L)

3,5

Zandkolom 1

3

Zandkolom 2

2,5

Zandkolom 3 Zandkolom 4

2

Zandkolom 5

1,5

Zandkolom 6 Zandkolom 7

1

Zandkolom 8 0,5

Zandkolom 9 Zandkolom 10

0 0

2

4

6 8 Tijd (Dagen)

10

12

Figuur 30: Ammoniumoxidatie in de 10 zandkolommen werd gemeten op verschillende tijdspunten, bij een influentsnelheid van 0.7 ml/minuut en een recirculatiesnelheid van 32 ml/minuut. Het influent bevatte steeds 1.5 NH4+-N/L. Na 2 uur werd een stijging van het ammoniumgehalte in het effluent waargenomen. Het inoculum werd 1 uur na de start van de metingen toegediend. De stippellijn geeft het tijdstip weer waarop de zandkolommen een 2e keer werden geïnoculeerd.

56

Figuur 31 geeft de nitrietconcentraties van het effluent weer. Na de eerste inoculatie werd een

Concentratie effluent mg NO2--N/L

hogere nitrietconcentratie waargenomen. Daarna bleef de nitrietconcentratie 0 mg NO2--N/L. 2,5

Zandkolom 1 Zandkolom 2

2

Zandkolom 3 Zandkolom 4

1,5

Zandkolom 5 Zandkolom 6

1

Zandkolom 7 0,5

Zandkolom 8 Zandkolom 9

0 0

20

40 Tijd (Dagen)

60

80

Zandkolom 10

Figuur 31: Nitrietconcentratie in het effluent van de zandkolommen. De stippellijn geeft het tijdstip weer waarop de zandkolommen een 2e keer werden geïnoculeerd. De eerste inoculatie gebeurde 1 uur na de start van de metingen.

Ook figuur 32 toont dezelfde trend als bij figuur 31. De nitraatconcentraties zijn hoog na de

Concentratie effluent (mg NO3--N/L)

eerste inoculatie. Maar daarna blijft de nitraatconcentratie 0 mg NO3--N/L. 3

Zandkolom 1

2,5

Zandkolom 2 Zandkolom 3

2

Zandkolom 4

1,5

Zandkolom 5 Zandkolom 6

1

Zandkolom 7

0,5

Zandkolom 8 Zandkolom 9

0 0

20

40 60 Tijd (Dagen)

80

100

Zandkolom 10

Figuur 32: Nitraatconcentratie in het effluent van de zandkolommen. De stippellijn geeft het tijdstip weer waarop de zandkolommen een 2e keer werden geïnoculeerd. De eerste inoculatie gebeurde 1 uur na de start van de metingen.

Zowel de NH4+-N, NO2--N en NO3--N concentraties stijgen een uur na het inoculeren (Figuur 30, Figuur 31 en Figuur 32). De gemeten concentraties NO2--N en NO3--N zijn niet het resultaat van ammoniumoxidatie. Indien ammoniumoxidatie had plaatsgevonden was de NH4+-N concentratie

57

in het effluent gedaald en zou de stikstofbalans kloppen. Dit betekent dat de NO2--N en NO3--N concentraties de 1.5 mg N/L niet zouden overschrijden, wat hier niet het geval is.

3.2.2. TEST 2: EEN LAGE RECIRCULATIESNELHEID Uit voorgaande resultaten werd geconcludeerd om een tragere recirculatiesnelheid van 0.564 l/uur te gebruiken. De influentsnelheid bleef 42 ml/uur. Door de tragere recirculatiesnelheid kregen de bacteriën een betere kans een biofilm rond de zandkorrels te vormen. Na inoculatie werden zowel de recirculatiepomp en de voedingspomp een halve dag uitgeschakeld, waarna de pompwerking gelijkmatig werd opgebouwd.

3.2.2.1.

FUNCTIONALITEIT

Opdat nitrificatie optimaal kon verlopen, werd de zuurstofconcentraties van twee zandkolommen opgevolgd (Figuur 33). De zuurstofconcentraties werden gemeten in het effluent net na het verlaten van de zandkolommen en dus niet in het systeemeffluent. Het influent bevatte steeds een zuurstofconcentratie van gemiddeld 8 mg O2-/L.

Concentratie zuurstof effluent zandkolom (mg O2/L)

18 16 14 12 Zandkolom 4

10 8

Zandkolom 7

6 4 2 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Tijd (Dagen) Figuur 33: Verloop van de zuurstofconcentratie in het effluent van twee zandkolommen.

De ammonium-, nitriet-, en nitraatconcentraties van de tien zandkolommen zijn weergegeven in figuur 35 en 36. De eerste vijf zandkolommen (kolom 1 tot en met 5; figuur 35) werden na inoculatie blootgesteld aan een variabele voedingsstroom. Er werd afwisselend een voeding met 1.5 mg NH4+-N/L als stikstofbron en een voeding zonder stikstofbron gebruikt. Bij de laatste vijf zandkolommen (kolom 6 tot en met 10; figuur 36) werd daarentegen steeds een oplossing met 1.5 mg NH4+-N/L als stikstofbron in het influent gebruikt. Het experiment met de variabele voedingsstroom werd 10 dagen na inoculatie gestart en wordt weergegeven door de eerste verticale stippellijn. Deze stippellijn wordt ook weergegeven in figuur 36 om de datapunten beter te kunnen vergelijken. In een tweede fase van het experiment werden de zandkolommen geïnvadeerd door GFPgelabelde pathogenen. Het aantal GFP-gelabelde cellen in het inoculum werd eerst geanalyseerd 58

aan de hand van flow cytometrie. Initieel werden 1 % invaders toegediend aan de zandkolommen. Een overzicht van het experiment wordt weergegeven in figuur 34.

Figuur 34: Overzicht van het invasie-experiment met de tien zandkolommen. C= Controle, P= Invasie van de zandkolom met Pseudomonas putida en EA= Invasie van de zandkolom met Enterobacter aerogenes.

59

Figuur 35: De ammonium-, nitriet- en nitraatconcentraties van zandkolom 1 tot en met zandkolom 5. De eerste stippellijn toont het tijdstip waarop de variabele voedingsstroom startte. De tweede stippellijn toont het moment van invasie. Hierbij is zandkolom 1 de controle. Zandkolommen 2 en 3 werden geïnvadeerd met Pseudomonas putida, zandkolommen 4 en 5 met Enterobacter aerogenes. De ammonium- en nitrietconcentraties werden bepaald met de high-throughput methode en in triplicaat uitgevoerd. Nitraat werd bepaald met IC.

Figuur 36: De ammonium-, nitriet- en nitraatconcentraties van zandkolom 6 tot en met zandkolom 10. De eerste stippellijn toont het tijdstip waarop de variabele voedingsstroom startte bij de eerste 5 zandkolommen. De tweede stippellijn toont het moment van invasie. Hierbij is zandkolom 6 de controle. Zandkolommen 7 en 8 werden geïnvadeerd met Pseudomonas putida, zandkolommen 9 en 10 met Enterobacter aerogenes. De ammonium- en nitrietconcentraties werden bepaald met de high-throughput methode en in triplicaat uitgevoerd. Nitraat werd bepaald met IC.

3.2.2.2.

MOLECULAIRE ANALYSE

Moleculaire analyses werden uitgevoerd op zandstalen afkomstig van de tien zandkolommen. Deze stalen werden in triplicaat genomen per zandkolom, waarvan elk staal ongeveer 0.5 g zandkorrels bevatte. Er werden stalen genomen na de inoculatie, voor de start van de variabele voeding en voor en na invasie. Het DNA werd geëxtraheerd door middel van de FastPrep methode om zo een qPCR te kunnen uitvoeren. Een quantitatieve PCR kan zo meer inzicht geven over de effecten van een variabele voeding en invasie op de diversiteit van de zandkolommen. Een qPCR om het percentage AOB’s en NOB’s te bepalen werd dus uitgevoerd.

3.2.2.2.1.

RESULTATEN

Na het uitvoeren van de qPCR’s werden verschillende dissociatiecurves bekomen. Bij 16s was een goede amplificatie aanwezig bij de verdunde stalen. Ook op de agarosegel nadien werd slechts 1 bandje waargenomen per staal, met andere woorden het geamplificeerde DNA. De dissociatiecurve van de NOB’s vertoonde twee pieken. De eerste piek is waarschijnlijk het resultaat van dimeren. Ook op de agarosegel na de qPCR werden twee bandjes waargenomen. Bij de onverdunde stalen werden daarnaast sterke inhibitie effecten waargenomen. Dit betekent dat de resultaten van deze qPCR niet betrouwbaar zijn en er nog enige opzuivering en optimalisatie dient plaats te vinden.

62

Discussie

1. OPTIMALISATIE HIGH-THROUGHPUT METHODES High-throughput methodes zijn een efficiënte manier om op korte tijd een groot aantal stalen te analyseren. Bijkomend zijn slechts kleine staalvolumes nodig en zijn deze methodes kost efficiënt. In deze thesis werden high-throughput methodes geoptimaliseerd voor NO2-, NO3-, NH4+, Fe2+, Mn2+ en COD als organisch component. De nadruk ligt hierbij op het meten van lage NO2-, NO3- en NH4+-concentraties. Reeds verscheidene analytische methodes zijn ontwikkeld voor de bepaling van deze componenten waaronder chemiluminescentie, fluorescentie, flowinjectie analyse, atoom emissie en atoom absorptie spectrometrie (Stoyanova, 2008). Hier wordt echter enkel gebruik gemaakt van spectrofotometrische bepalingen. Een high-throughput methode voor nitriet was reeds ter beschikking en is gebaseerd op de Montgomery reactie. Andere colorimetrische protocols zijn echter gebaseerd op de nitrosatiereactie. Hierbij worden onder andere xylenol, resorcinol of indol gebruikt als reagens. Deze eerste twee reagentia vormen echter problemen door respectievelijk interferentie met nitraten en Fe3+ (Rahim et al., 1983). Indol is een selectief reagens maar met de Montgomery reactie wordt een lagere detectielimiet bereikt (Rahim et al., 1983). Andere colorimetrische methodes zijn gebaseerd op de Griess reactie (Fox, 1979). Hierbij reageert nitriet met een amine tot een diazoniumzout. Dit zout wordt gekoppeld aan een aromaat waardoor een gekleurde oplossing wordt gevormd waarvan de concentratie spectrofotometrisch wordt bepaald (Gürkan, 2010). De Griess reactie kent een hoge gevoeligheid maar is pH- en temperatuurafhankelijk (Fox, 1979). Bijkomend zijn de reagentia carcinogeen en kunnen verschillende ongewenste nevenreacties plaats vinden (Gürkan, 2010). Deze nadelen komen niet voor bij de Montgomery reactie. Het Montgomery protocol blijkt dus één van de betere protocols te zijn om lage NO2-concentraties te bepalen. In watermedium wordt namelijk een standaardcurve bekomen met een R² van 0.9986 (Figuur 10; Resultaten). De accuraatheid van de nitriet-high-throughput methode werd vergeleken met een commerciële nitrietkit (Macherey-Nagel Nanocolor, Test 0-68 en Test 0-69). Figuur 11 (Resulaten) toont aan dat de high-throughput methode even accuraat is als een nitrietkit. Beide vergelijkingen benaderen de diagonaal met vergelijking

. De gemeten concentraties zijn met andere

woorden sterk vergelijkbaar met de verwachtte concentraties. Men kan dus besluiten dat de high-throughput methode een betrouwbaar protocol is in minimaal medium. Het voordeel echter van de high-throughput methode is dat deze goedkoper is en een lager staalvolume nodig heeft. Hierdoor is het efficiënter de high-throughput methode te gebruiken, bijzonder bij hoog aantal stalen (Tabel 6). De standaardmethode die in de meeste laboratoria reeds jaren wordt gebruikt om lage ammoniumconcentraties te bepalen is het Nesslerprotocol (Fleck & Munro, 1965; Cabral, 1994). Hierbij reageert ammonium met mercury in een basische oplossing tot een bruin- oranje complex (Leonard, 1963). De standaardcurve vertoont een goede R² in minimaal medium. De curve begint echter af te vlakken rond de drinkwaternorm (Figuur 13; Resultaten). Nesslerisatie is ook gevoelig voor verschillende factoren zoals pH, temperatuur, zouten en partikellading, en 64

daardoor niet exact voor het meten van lage ammoniumconcentraties. Bijkomend wordt er vaak een oranje neerslag gevormd die de metingen kan verstoren en is de methode gevoelig voor interferenties (Cabral, 1994). Deze factoren zorgen voor een lage gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de Nesslerreactie (Harwood & Huyser, 1970). Een

recente

colorimetrische

ammoniumdetectiemethode

is

de

OPA-sulfietmethode

(Amornthammarong & Zang, 2008). Hierbij zorgt het toegevoegde sulfiet voor reducerende omstandigheden, waardoor ammonium reageert met phtaldialdehyde tot een geel complex. Dit protocol werd getest tijdens de optimalisatie van de high-throughput bepaling van ammonium. Het is een accurate methode en er zijn geen gekende interferenties met andere ionen. Maar deze methode is niet significant bij lage concentraties. De standaardafwijkingen zijn groot en bij lage concentraties zijn de absorbanties negatief (Figuur 14; Resultaten). Dit wordt veroorzaakt doordat het blancostaal een hogere absorbantie kent dan de lagere concentraties van de standaardreeks, de detectielimiet is bereikt. Deze methode is met andere woorden lineair in de range van 2.8 tot 28 mg NH4+-N/L en omvat de drinkwaternorm (0.38 mg NH4+-N/L) voor ammonium dus niet. Uiteindelijk werd de Berthelotmethode of Indol-fenol-blauwmethode uitgetest. Hierbij wordt ammonium onder basische omstandigheden omgezet tot ammoniak. Deze laatste reageert met hypochloriet

tot

chlooramine.

En

de

kleurreactie

wordt

gekatalyseerd

door

natriumnitroprusside (Bucur et al., 2006). Het is een selectieve methode met een goede reproduceerbaarheid, korte reactietijd en is minder gevoelig voor interferenties in vergelijking met de Nesslerreactie (Weatherburn, 1967; Harwood & Kühn, 1970). Het toevoegen van nitroprusside als catalyst versterkt bijkomend de kleurvorming (Harwood & Huyser, 1970; Kempers & Kok, 1989). De stalen dienen volgens Harwood & Huyser (1970) en Kempers (1974) echter een pH te bevatten tussen 9.9 en 12.1. De colorimetrische methode gebruikt voor deze thesis is de aangepaste Berthelotreactie of de salicylzuurmethode. Deze methode heeft slechts twee reagentia nodig, terwijl de originele Berthelotreactie er vier nodig heeft. Daarnaast is het giftige fenol vervangen door salicylzuur (Jüttner, 1999). Deze twee factoren zorgen ervoor dat de ammoniumbepaling volgens de salicylzuurmethode efficiënter in gebruik is, ook wanneer dit met een pipeteerrobot wordt uitgevoerd. Zoals werd beschreven door Cerdà et al. (1995) was de volgorde van de reagentia ook hier van belang. Een optimale kleurontwikkeling werd enkel bekomen indien salicylzuur als tweede reagens werd toegediend (Figuur 16; Resultaten). Omwille van de instabiliteit van hypochloriet, een component van beide reagentia, wordt in sommige protocols aangeraden om hypochloriet

te

vervangen

door

dichloroisocyanuraat.

Maar

de

salicylzuur-

dichloroisocyanuraatmethode interfereert sterk met aminozuren en eiwitten die van nature aanwezig zijn in zoet- en zeewater (Jüttner, 1999). Hierdoor blijft de salicylzuurmethode met hypochloriet de beste optie. De ammoniumbepalingen werden uitgevoerd in minimale en complexe media. De minimale media waren gedestilleerd water en drinkwater (Evian) met een neutrale pH. Een pH van 7 in plaats van de voorgestelde pH 9 tot 12, had geen negatief effect op de resultaten: Een R ² van 0.999 toont een sterke correlatie in figuur 15 (Resulaten). Daarnaast werd de methode ook 65

vergeleken met een commerciële ammoniumkit (HACH Lange, LCK 304). Deze kit is ook gebaseerd op de Berthelotreactie doordat zelfde reagentia aanwezig zijn. Figuur 17 (Resultaten) toont aan dat de gemeten concentraties van de standaardreeks vergelijkbaar zijn met de verwachtte concentraties. Het aangepaste Berthelotprotocol is dus een betrouwbare highthroughput methode om lage ammoniumconcentraties te bepalen. De ammoniumbepaling met behulp van de ammoniumkit is echter duur en vraagt 5 ml staal. Terwijl de salicylzuurmethode goedkoper is en slechts 160 µl staal nodig heeft (Tabel 6). Dit bewijst de efficiëntie van highthroughput methodes. De salicylzuurmethode vormt echter wel problemen indien men het ammoniumgehalte wenst te bepalen in complexe media zoals LB medium en R2A medium. Dit wordt veroorzaakt door de complexe samenstelling van proteose peptone en gistextract in deze media. Volgens Rhine et al. (1998) zou men aminozuur - en organische stikstofinterferentie kunnen vermijden door andere reagentia te gebruiken. De pH lijkt hier eerder een belangrijkere factor. Indien men het ammoniumgehalte wenst te bepalen in complexe media is het beter de pH te verhogen van de stalen en een buffer toe te dienen zoals Harwood en Huyser (1970) beschreven. Een pH hoger dan 7 zorgt ervoor dat enkel ammonium deel neemt aan de kleurreactie. Dit verklaart waarom de pH geen negatief effect had op de ammoniumbepaling van de

waterstalen.

Het

gebruikte

water

heeft

namelijk

een

lage

concentratie

aan

stikstofcomponenten (EU,1998). De ammonium-salicylzuurmethode werd vergeleken met het Nesslerprotocol (Figuur 18; Resultaten). Deze grafiek toont aan dat de salicylzuurmethode een betere correlatie vertoont dan het Nesslerprotocol. Bijkomend kent de standaardcurve van de salicylzuurmethode een steiler verloop.

Dit

betekent

dat

wanneer

stalen

slechts

kleine

verschillen

kennen

in

ammoniumconcentratie, de absorbanties meer verschillen bij de salicylzuurmethode in vergelijking met de Nesslermethode. Hierdoor zal de gemeten fout kleiner zijn bij de salicylzuurmethode en kan dit protocol beschouwd worden als de meest gevoelige methode. In het algemeen kan de spectrofotometrische bepaling van nitraat ook problemen met zich mee brengen. Zo vormen niet alle nitraationen zomaar complexen met andere ionen. Bijkomend zijn nitraatzouten sterk oplosbaar waardoor de colorimetrische bepaling moeilijk kan verlopen (West & Lyles, 1960). Verschillende spectrofotometrische methodes werden reeds ontwikkeld waaronder de fenoldisulfonische zuurmethode en de chromotrofische zuurmethode. Deze protocols zijn echter tijdrovend, gevoelig voor interferenties en vragen grote staalvolumes, waardoor deze weinig mogelijkheid bieden ze high-throughput uit te voeren (West & Lyles, 1960). Een high-throughput methode voor nitraatbepaling met een goede accuraatheid en precisie werd reeds opgesteld door Tu et al. (2010). Dit protocol is gebaseerd op de cadmium reductiemethode (Raikos et al. 1988). Hierbij wordt gebruik gemaakt van het zeer giftige cadmium om nitraat te reduceren tot nitriet, waarbij het gevormde nitrietgehalte spectrofotometrisch wordt bepaald (Cataldo, 1975). Deze methode is slechts lineair van 0.02 tot 1.50 mg NO3--N/L en omvat de drinkwaternorm (11.3 mg NO3--N/L) niet. Hierdoor is dit protocol niet geschikt voor drinkwateranalyses. De methode die bij dit onderzoek werd gebruikt 66

is de nitraat-salicylzuurmethode (Cataldo, 1975). Hierbij reageert salicylzuur onder zure omstandigheden met nitraat tot de vorming van nitrosalicylzuur. Een chromofoor wordt gevormd bij pH 12. Om nitrietinterferentie te vermijden, wordt een verzadigde sulfonische zuuroplossing toegediend (Cataldo et al., 1975). Deze methode vertoont een goede correlatie in figuur 12 (Resultaten). Deze gevoelige methode kent echter net zoals de ammoniumsalicylzuurmethode interferentiemoeilijkheden in complexe media. Een overzicht van de drie belangrijkste high-throughput methodes wordt weergegeven in tabel 6. Deze tabel vat de verschillende voordelen van high-throughput methodes samen. Tabel 6: Vergelijken van de efficiëntie tussen een high-throughput methode en een bestaande kit. De kosten per 100 stalen voor de high-throughput methodes werd berekend waarbij een stock van 1 liter per reagens wordt gemaakt.

Methode

R²

Vergelijking

Kosten per 100 stalen

Staalvolume

Nitrietkit

0,9788

y = 1,0488x - 0,0052

€ 300

200 µl of 4 ml

Montgomery methode

0,9957

y = 1,1203x - 0,0072

€ 0,1

200 µl

Ammoniumkit

0,999

y = 0,9366x - 0,0049

€ 360

5 ml

Berthelot methode

0,9985

y = 1,0786x - 0,0766

€ 0,2

160 µl

Salicylzuur methode

0.992

y = 0,0091x – 0,007

€ 0.12

4 µl

Natuurlijke waterbronnen bevatten meestal spoorconcentraties van ijzer en mangaan (Stoyanova, 2008). De meest accurate methode om lage ijzerconcentraties te bepalen is de phenanthroline methode (Hoshino et al., 2011). Hierbij wordt het aanwezige Fe3+ initieel gereduceerd tot Fe2+ aan de hand van hydroxylaminehydrochloride. Eén mol Fe2+ reageert vervolgens in basisch milieu met drie mol phenanthroline tot een oranje-rood complex (Viollier et al., 2000; Braunschweig et al., 2012). Deze methode is weinig gevoelig voor interferenties. Andere voordelen zijn de intensere kleurvorming bij een ijzerconcentratie in vergelijking met andere spectrofotometrische methodes, de kleur blijft stabiel en de reactie is niet sterk pHafhankelijk

(Pyenson

&

Tracy,

1944).

Een

overzicht

van

de

overige

bestaande

spectrofotometrische ijzerbepalingen wordt weergegeven in tabel 7.

67

Tabel 7: Andere spectrofotometrische bepalingen van ijzer dan de phenanthroline methode en waarom niet werd geopteerd deze methodes te gebruiken.

Referentie

Methode

Opmerkingen Lineair van 1 tot 10 mg Fe+/L en omvat

Demirhan & Tuncel (2003)

Thiocyanaatmethode de drinkwaternorm (0.2 mg Fe+/L) dus niet.

Pyenson & Tracy (1944)

2,2’-Bipyridyl

Minder intense kleurontwikkeling dan de

methode

phenanthroline methode. Gevoelig voor pH en interferenties van

Hey (1982)

Salicylzuurmethode

organische zuren en mangaan indien geen extra salicylzuur wordt toegevoegd. Gebruik van vier reagentia en zelfs giftig

Hoshino et al. (2011)

o- hydroxyhydro-

cyanide indien men enkel Fe3+ bepaalt,

quinonephtalein

waardoor dit niet high-throughput kan worden uitgevoerd.

De spectrofotometrische mangaandeterminatie is gebaseerd op de formaldoxime methode. Een snellere en meer gevoelige methode voor lage mangaanconcentraties in vergelijking met de standaard permanganaatmethode (Goto et al., 1962) en de standaard periodaatmethode (Bradfield, 1957). Bij de formaldoxime methode vormt formaldoxime een complex met mangaan onder basische omstandigheden (Chiswell & O’Halloran, 1991). Een nadeel echter is dat ook ijzer complexeert met de reagentia en dus dient ontkoppeld worden door middel van EDTA (Ethyleendiaminetetra-azijnzuur). Het verwijderen van deze ijzerinterferenties gebeurde op deze manier echter niet efficiënt. Bijkomend is de mate van ijzerinterferentie pH afhankelijk (Hydes, 1987). Andere mogelijkheden om ijzerinterferentie te vermijden zijn door de stalen na toevoegen van de reagentia 2 uur te incuberen bij 65 °C. Hierdoor zou zowel ijzer als koper ontkoppeld worden van het formaldoximecomplex (Bradfield, 1957). Dit is echter niet highthroughput uit te voeren. Een andere mogelijkheid is om CDTA (Cyclohexaan-1,2-diaminetetraazijnzuur) te gebruiken in plaats van EDTA (Bradfield, 1957). In de literatuur werden reeds uiteenlopende methodes ontwikkeld voor de bepaling van COD. Hierbij wordt meestal het organisch materiaal afgebroken in de aanwezigheid van een oxiderend reagens zoals permanganaat of dichromaat (Su et al., 2007). De overmaat van het oxiderend reagens wordt door middel van titratie bepaald (Jardim & Rohwedder, 1989). De titratiemethode is echter tijdrovend en duur. Vandaar dat reeds andere oxidatiemethodes in de literatuur worden vermeld, zoals ultrasound oxidatie, electrocatalytische oxidatie, UV-ozon oxidatie, fotocatalytische TiO2 oxidatie en oxidatie met behulp van een microgolfoven (Jardim & Rohwedder, 1989; Lee et al., 1999; Kim et al., 2000; Jin et al., 2004; Domini et al., 2006). Recente COD-analyses baseren zich echter op chemiluminescentie (Fujimori et al., 2001; Li et al., 2003; Hu & Yang, 2004). Hierbij wordt glutaraldehyde in de oplossing geïnjecteerd, waarna een 68

lichtsignaal ontstaat. De signaalsterkte wordt gemeten en is evenredig met de resterende kaliumpermanganaatoplossing. Deze methode kent volgens Su et al. (2007) een hoge gevoeligheid en brede lineaire range. Daarnaast biedt deze methode ook meer mogelijkheden om stalen high-throughput te verwerken (Yao et al., 2009). De chemiluminescentiemethode volgens Yao et al. (2009) werd ook getest in het laboratorium. De bijhorende standaardcurve bleek slechts lineair te zijn tussen 1 en 4 mg COD/L (Figuur 21; Resultaten) terwijl de auteurs een lineaire standaardcurve illustreerden van 0.16 tot 19.24 mg COD/L. Het protocol werd uitgevoerd zoals beschreven in het artikel. Enkel werden de reactietubes opgewarmd in een thermoblock in plaats van een warm waterbad en werden deze niet opnieuw bijgevuld na incubatie. Het lijkt weinig waarschijnlijk dat deze factoren een invloed zouden hebben op de metingen. Daarnaast was er amper water verdampt uit de reactietube waardoor niet opnieuw kon worden bijgevuld. Het opnieuw bijvullen van de reactietubes zoals werd beschreven door Yao et al. (2009) kunnen daarnaast een verdunningseffect veroorzaken, waardoor de resultaten minder nauwkeurig kunnen zijn. Door de beperkte lineariteit van de chemiluminescentiemethode werd geopteerd gebruik te maken van een spectrofotometrische methode. Hierbij is de standaardcurve echter wel lineair over een grote range, namelijk van 1 tot 10 mg COD/L (Figuur 22; Resultaten). De curve heeft een R² van 0.977 wat een aanvaardbare correlatie toont. Doordat deze spectrofotometrische methode zich echter baseert op de uitvoering beschreven in het chemiluminescentieprotocol, is deze methode moeilijker te omschrijven als een high-throughput methode. De incubatie in reactietubes, het overbrengen op ijs en overpipetteren in een 96-well plaat vragen echter veel handelingen en dus ook veel tijd. Hierdoor kan dit protocol ook niet worden uitgevoerd door een pipetteerrobot. Deze high-throughput methodes zijn ontwikkeld in gedestilleerd water, Evian en andere minimale media waardoor ze toegepast kunnen worden op drinkwaterstalen. Deze methodes dienen echter met enige voorzichtigheid behandeld te worden in complexe media. De nitriet – en ammoniummethodes zijn echter zeer betrouwbare methodes waarbij de ammoniumsalicylzuurmethode in vergelijking met de standaard Nesslermethode, een meer gevoelige methode is.

2. ZANDFILTERGEMEENSCHAPPEN De eerder beschreven high-throughput methodes werden ontwikkeld opdat een groot aantal stalen op een snelle manier verwerkt konden worden. Enkele methodes, waaronder het ammonium – en nitrietpotocol werden gebruikt om de functionaliteit van de zandfilterbacteriën te bepalen. Uiteindelijk werden verscheidene synthetische zandfiltergemeenschappen gecreëerd met een constante rijkdom en variabele gelijkheid. Deze gemeenschappen werden geïnvadeerd door een GFP-gelabelde pathogeen. Hierdoor kon het verband tussen de gelijkheid van een gemeenschap en de invasieresistentie van deze gemeenschap bepaald worden. Daarnaast werd ook het effect van invasie op de gemeenschapsfunctionaliteit bepaald. Hier werd opnieuw gebruik gemaakt van de relevante high-throughput methodes. 69

Zandfiltergemeenschappen worden gekenmerkt door complexe interacties tussen verschillende bacteriële soorten. Drinkwaterbacteriën kunnen bijkomend een biofilm vormen waarvan coaggregatie een voorbeeld is (Simões et al., 2008). Hierbij interageren onder andere genetisch verschillende bacteriën met elkaar door het syntheseren van specifieke eiwitten (Buswell et al., 1997; Rickard et al., 2000). De synthetische zandfiltergemeenschappen werden opgegroeid in een vloeibaar cultuur in 96well platen waarbij geen mogelijkheid was een biofilm te vormen. Niet alleen de aanwezigheid van een biofilm, maar ook de gelijkheid van een gemeenschap kan echter een belangrijke factor zijn om invasie te verhinderen (Hillebrand et al., 2008). Figuur 23 en 24 (Resultaten) tonen namelijk aan dat een zandfiltergemeenschap met een gelijke verdeling minder gevoelig is voor invasie van de modelpathogeen Pseudomonas putida. Deze trend werd ook waargenomen bij andere ecosystemen (Wilsey & Polley, 2002; Tracy & Sanderson, 2004; Smith et al., 2004; De Roy et al., 2013). Dit fenomeen kan worden verklaard doordat gemeenschappen met een gelijke soortenverdeling, meer consumeren van de aanwezige koolstofbronnen waardoor minder koolstofbronnen overblijven voor de invasieve soort (Wilsey & Polley, 2002; De Roy et al., 2013). In dit opzicht kan een gemeenschap met een gelijke verdeling biologisch vergeleken worden met een gemeenschap met een hoge diversiteit. Wanneer een gemeenschap namelijk gedomineerd wordt door één soort, zullen de minder abundante soorten maar weinig bijdragen tot de consumptie van de koolstofbronnen (Wilsey & Polley, 2002; Mulder et al, 2004). Het is zelfs mogelijk dat de dominante soort de minder frequente soorten onderdrukt (Wardle, 2001). Of dit ook het geval is bij deze synthetische zandfiltergemeenschappen is niet geweten. Dit zou men echter wel kunnen nagaan in een volgende fase van het onderzoek door een DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) of next generation sequencing uit te voeren op de gemeenschap voor en na invasie. In praktijkstudies werden echter tegenstrijdige relaties gevonden tussen de gelijkheid van een gemeenschap en de mate van invasie. Zo toonden sommige experimenten aan dat een gemeenschap met een dominante soort zelfs minder invasie kent (Robinson et al., 1995; Smith & Knapp, 1999; Mattingly et al., 2007). Deze experimenten werden echter in de buitenwereld uitgevoerd, blootgesteld aan verscheidene extrinsieke factoren die de relatie tussen de gelijkheid en invasie sterk kunnen beïnvloeden (Smith et al., 2004). Hierdoor kunnen deze experimenten niet altijd met elkaar vergeleken worden (Lonsdale, 1999). De creatie van synthetische gemeenschappen onder gecontroleerde omstandigheden levert dus meer betrouwbare resultaten op die in een latere fase eventueel kunnen geëxtrapoleerd worden naar meer variërende, werkelijke omstandigheden. Ook De Roy et al. (2013) experimenteerde met synthetische gemeenschappen en bekwam hetzelfde verband tussen gelijkheid en invasiegevoeligheid. Figuur 23 (Resultaten) illustreert een voorbeeld waarbij Enterobacter aerogenes niet in staat is de zandfiltergemeenschap te invaderen.

Deze

pathogeen

kan

waarschijnlijk

moeilijker

competiteren

met

de

zandfilterbacteriën voor de aanwezige bronnen. Een mogelijke verklaring voor de zwakke competiviteit is dat deze bacterie gevoeliger is voor stressvolle omstandigheden en hierdoor

70

geen invasiefunctie kan uitoefenen in complexe gemeenschappen. Er is hier dan ook geen effect waar te nemen van de gelijkheid van de gemeenschap op invasie door Enterobacter aerogenes. Wanneer het verband tussen gelijkheid en invasie van een gemeenschap wordt onderzocht, dient men ook rekening te houden met de identiteit van de dominante soort (Crawley et al., 1999; Dangles & Malmqvist, 2004; Emery & Gross, 2006; Crutsinger et al., 2007). Er werd echter nog maar weinig onderzoek verricht naar de invloed van de identiteit van de dominante soort op invasie (Emery & Gross, 2007). Dit kan eventueel een bijkomende verklaring zijn voor de tegenstrijdige resultaten van invasie-experimenten in praktijkstudies. Figuur 25 (Resultaten) toont dat wanneer de Gini constant is voor een bepaalde oneven gemeenschap, de identiteit van de dominante soort een belangrijke invloed heeft op de invasiegevoeligheid van deze gemeenschap. Bij een zandfiltergemeenschap met een sterke ongelijkheid (Gini 84), zal de invasie het grootst zijn indien S19 de dominante soort is. Eerdere studies toonden gelijkaardige resultaten aan dat gemeenschappen met aan verschillende dominante soort een andere invasiegevoeligheid kenden (Robinson & Dickerson, 1984; Crawley et al., 1999). Een mogelijke verklaring voor dit fenomeen is dat wanneer de dominante en invasieve soort gelijkaardige eigenschappen bezitten, de ene soort de andere kan weg competiteren (Case, 1990; Pacala & Tilman, 1994). De overlap van koolstofbronnen is hierbij opnieuw een belangrijke parameter. Daarnaast overwint de residentiële soort het vaker tegenover de invasieve soort (Case, 1990). Volgens Emery & Gross (2007) bepaalt zelfs de dominante soort en niet de gelijkheid van een gemeenschap de mate van invasie. Dominante soorten kunnen namelijk een sterke invloed hebben op de functionaliteit van de gehele gemeenschap (Crawley et al., 1999; Dangles & Malmqvist, 2004). Ook dit wordt geïllustreerd in figuur 28 (Resultaten). Naarmate de dominantie

stijgt

van

de

zandfiltergemeenschap,

stijgt

de

functionaliteit,

namelijk

ammoniumoxidatie. Ook in het onderzoek van Lamb et al. (2011) werd bij een hogere dominantie een hogere ammoniumoxidatie waargenomen in de grond. Doch werd bij andere synthetische

gemeenschappen

een

lagere

functionaliteit

waargenomen

indien

de

gemeenschappen een ongelijke verdeling kenden (Wittebolle et al., 2009). Dit verschillend resultaat kan verklaard worden doordat een andere vorm van interactie aanwezig kan zijn tussen de verschillende soorten in een gemeenschap. Na invasie verhoogde de ammoniumoxidatie van de zandfiltergemeenschap waarbij een gelijkaardige trend werd waargenomen zoals de zandfiltergemeenschappen zonder invasie. Ook hier steeg dus de ammoniumoxidatie naarmate de gemeenschap meer oneven verdeeld was (Figuur 28; Resultaten). Of de nitrietoxidatie ook toeneemt, kan niet geconcludeerd worden uit figuur 26 en figuur 27. Figuur 26 toont de zandfiltergemeenschappen zonder invasie. Hier is geen volledige nitrietoxidatie te zien, volgens de stikstofbalans werd namelijk te weinig nitraat gevormd. Mogelijk ontstaan er anaerobe omstandigheden in de 96-well plaat waardoor denitrificatie kan plaatsvinden. Aangezien de nitraatmetingen werden uitgevoerd met de IC waarmee eerder problemen werden vastgesteld, kunnen deze nitraatmetingen echter niet als betrouwbaar beschouwd worden.

71

Synthetische zandfiltergemeenschappen zijn een handige en betrouwbare methode om onder meer de invloed van invasie na te gaan. Hierbij zijn zowel de gelijkheid als de identiteit van de dominante soort twee belangrijke parameters die het resultaat van invasie bepalen. Kleinschalige zandfilters, onder gecontroleerde omstandigheden, zouden echter een meer realistisch beeld tonen van de aanwezige processen.

3. ZANDFILTERS OP LABOSCHAAL De invasie van kleinschalige zandfilters werd in parallel uitgevoerd met de synthetische zandfiltergemeenschappen in 96-well platen. Ook hier werden de geoptimaliseerde ammoniumen nitrietprotocols gebruikt om de stalen te analyseren. Nitraatconcentraties werden bepaald door middel van ion chromatografie doordat deze concentraties zich onder de detectielimiet van de high-throughput methode bevonden. Na het inoculeren en bekomen van een functionaliteit, werd de helft van de zandkolommen blootgesteld aan een variabele voedingsstroom. Hierbij kregen ze afwisselend een voeding zonder ammonium en een voeding met 1.5 mg NH4+-N/L. De hypothese bij deze variabele voeding stelt dat micro-organismen met een hoge affiniteit bij een variabele voeding de kans krijgen meer bij te dragen tot de functionaliteit van de gemeenschap. Bij een voeding met een lagere ammoniumconcentratie zullen soorten met een hoge affiniteit belangrijker worden in de gemeenschap en kan zo de diversiteit van de zandkolommen toenemen (Webster et al., 2005). In een volgende fase werden de kolommen geïnvadeerd door GFP-gelabelde pathogenen. Een overzicht van dit experiment wordt weergegeven in figuur 34 (Resultaten). Zandfilters geven een realistischer beeld weer van de effecten die invasie en een variabel influent kunnen hebben op de functionaliteit en diversiteit van een biofiltergemeenschap. Zandfiltratie is een veel gebruikte technologie bij de productie van drinkwater (Aslan & Cakici, 2007). Een belangrijk mechanisme bij biofiltratie is de verwijdering van opgeloste polluenten door middel van sorptie en biologische afbraakmechanismen (Henrichs et al., 2009). Daarnaast dient het aantal bacteriële cellen gereduceerd te worden om eventuele pathogenen in drinkwater te vermijden (Elliott et al., 2008; Langenbach et al., 2008). Enkele parameters die de functionaliteit, in dit geval nitrificatie, bepalen zijn onder meer het filtermateriaal, de filtratiesnelheid en de aanwezige biofilms (Stevik et al., 2004). Aangezien het influent bij dit experiment 1.5 mg NH4+-N/L bevatte, dient volgens vergelijking (a) en (b) (Literatuurstudie), voor een optimale ammoniumoxidatie 4.8 mg O2-/L aanwezig te zijn en voor een optimale nitrietoxidatie 1.6 mg O2-/L. In figuur 33 (Resultaten) voldoet zandkolom 4 steeds aan deze zuurstofeisen. De zuurstofconcentraties van zandkolom 7 daarentegen zijn bijna steeds lager dan 4.8 mg O2-/L en bereiken af en toe de 1.6 mg O2-/L. Desondanks de lagere zuurstofconcentraties bij deze zandkolom verloopt de ammoniumoxidatie niet trager dan bij kolom 4 . In de literatuur heerst ook enige onduidelijkheid over de nodige zuurstofconcentratie om een optimale nitrificatie te verkrijgen. Zo stelt Abeliovich (1987) dat nitrificatie kan plaats vinden tot een DO van 0.05 mg O2-/L en zelfs bij anaerobe condities doorgaat. Stenstrom & Poduska (1980) daarentegen geven aan dat de minimale zuurstofconcentratie 0.3 mg O2-/L 72

bedraagt. Beide auteurs houden echter geen rekening met de hoeveelheid stikstof die geoxideerd dient te worden. Als duimregel geldt dat het effluent van een biofilter ongeveer 2 mg O2-/L dient te bevatten zodat zeker voldoende zuurstof in de filter aanwezig was om een goede nitrificatie te garanderen (Malone et al., 1998). Figuur 33 (Resultaten) toont inderdaad de zuurstofconcentratie van het zandkolomeffluent. Dit betekent dat de zuurstofconcentratie in de schmutzdecke, de bovenste laag van de kolom met de meeste biomassa, zeker hoger was dan het effluent en waarschijnlijk voldoende was om nitrificatie te kunnen garanderen. Het influent dat terecht komt in de zandkolommen werd tijdens de recirculatie ook gemengd met nieuwe voeding, belucht met beluchtingsstenen. Nitrificerende micro-organismen worden gekenmerkt door de excretie van extracellulaire polymeren. Deze lipopolysacchariden ondersteunen de bacteriën namelijk bij het vormen van een biofilm. Zo kan na gemiddeld 30 minuten een biofilm worden gevormd rond de zandkorrels (Hagopian & Riley, 1998). Hierbij dient onder meer de rusttijd op het zandbed langer te zijn dan de regeneratietijd van de bacteriën om uitspoeling te voorkomen (Hagopian & Riley, 1998). De zandkolommen werden in de eerste test met hoge recirculatiesnelheid echter onmiddellijk na het inoculeren opgestart, waardoor de rusttijd bijna nihil is en de bacteriën geen kans hadden een biofilm te vormen. Maar vooral de retentietijd is een belangrijke parameter. Henrichs et al. (2009) merkte op dat indien een biofiltratiesysteem een korte hydraulische retentietijd kent, de nitrificatiesnelheid en bacteriële adsorptie sterk achteruit gaan. In figuur 30 (Resultaten) is een duidelijke toename van de NH4+-N concentratie waar te nemen in het effluent. Ook de NO2--N en NO3--N concentraties zijn uitermate hoog na inoculatie (Figuur 31 en 32; Resultaten). De stikstofconcentraties in het effluent zijn hoger dan de stikstofconcentratie in het influent, namelijk 1.5 mg NH4+-N/L, waardoor de stikstofbalans niet meer in evenwicht is. Dit betekent dat in het effluent niet alleen de stikstofconcentratie maar ook het celaantal onbewust werd gemeten. Of het inoculum had zelf al een hoge nitriet- en nitraatconcentratie. Een DNA-extractie op de zandkorrels gaf aan dat geen DNA meer aanwezig was in de zandkolommen en dat de bacteriën waren uitgewassen. Dit wordt verklaard door de combinatie van een korte rusttijd en een hoge recirculatiesnelheid. Lagere recirculatiesnelheden zouden de bacteriën inderdaad een betere kans geven een biofilm te vormen. Doch is biofiltratie met hoge recirculatiesnelheden met deze experimentele opstelling, nog steeds mogelijk indien men een lange rusttijd gebruikt en de recirculatiesnelheid stapsgewijs opbouwt (Wand et al., 2007). Eens de biofilm gevormd is, zorgen hoge hydraulische snelheden zelfs voor een stabielere en sterkere biofilm (van Loosdrecht et al., 1995). De stapsgewijze opbouw vraagt echter meer tijd dan beschikbaar was, waardoor uiteindelijk werd geopteerd om de volgende experimenten uit te voeren met een recirculatiesnelheid zoals bij trage zandfilters wordt toegepast. Hierbij werd echter een beperkte functionaliteit bekomen. Ammonium werd geoxideerd tot nitriet, en soms werd deze laatste geoxideerd tot nitraat (Figuur 35 en 36; Resultaten). De stikstofbalans klopte echter niet altijd. Bij de eerste vijf zandkolommen werd na het induceren van een variabele voeding geen of amper nitraat gemeten in het effluent (Figuur 35; Resultaten). De stalen werden nochtans steeds genomen tijdens de 73

perioden waarbij deze kolommen aan een voedingsstroom mét 1.5 mg NH4+-N/L waren aangesloten.

De

lage

ammoniumconcentraties

in

het

effluent

tonen

aan

dat

de

ammoniumoxidatie bleef doorgaan tijdens de fase met variabele voeding. AOB’s worden namelijk gekenmerkt door hun snelle recuperatie na een uithongeringsfase (Wilhelm et al., 1998; Tappe et al., 1999). De snelheid waarmee een bacteriële soort zich herstelt is echter wel soortafhankelijk (Bollmann et al., 2002). Maar in het algemeen kan gesteld worden dat na een korte uithongering, hier tussen de 4 en 24 uur, een snelle recuperatie plaatsvindt (Geets et al., 2006). Bij de kolommen 2, 3 en 5 is nog nitriet aanwezig in het effluent. Dit kan wijzen op een onvoldoende nitrietoxidatie wat ook meteen de lage nitraatconcentraties in het effluent verklaart. De lage nitraatconcentraties kunnen ook ontstaan door denitrificatie. In de zandkolommen kunnen namelijk anaerobe plaatsen aanwezig zijn. Naast dode cellen, is er echter geen echte koolstofbron aanwezig in de voeding waarop denitrificerende bacteriën kunnen overleven. Het is dus onduidelijk of denitrificatie plaats vond in de zandkolommen. De laatste vijf zandkolommen kregen steeds dezelfde voeding met 1.5 mg NH4+-N/L. Hier is gemiddeld een hogere ammoniumconcentratie waar te nemen in het effluent, tussen dag 10 en 30 in vergelijking met de eerste vijf zandkolommen (Figuur 36; Resultaten). Een variabele voeding kan de ammoniumoxidatie dus stimuleren. De functionaliteit van de eerste zandkolommen is dus mogelijk gestegen doordat soorten met een hoge affiniteit werden bevoordeeld door de variabele voeding (Webster et al., 2005). Of de nitrietoxidatie ook werd gestimuleerd door een wisselende voeding kan men niet met zekerheid concluderen uit deze resultaten. Er dient ook opgemerkt te worden dat de hogere ammoniumconcentraties in de kolomeffluenten van de laatste vijf zandkolommen het resultaat kunnen zijn van ammoniumabsorptie aan de zandkorrels. De resultaten van de functionaliteit van alle kolommen dienen in het algemeen echter wel met enige voorzichtigheid bekeken te worden. De variatie is namelijk groot tussen de kolommen waardoor moeilijk eenduidig besluit kan gemaakt worden. Ook vanaf dag 30, de dag waarop invasie startte, zijn de verschillen groot waardoor geen algemeen besluit genomen kan worden na invasie. Ook een GFP-analyse aan de hand van flow cytometrie na invasie gaf geen duidelijk resultaat of de invasieve soort nog aanwezig was. Er werd verwacht dat bij de eerste vijf zandkolommen een grotere diversiteit zou ontstaan door de variabele voeding, waardoor deze kolommen meer resistent zouden zijn tegen over invasie (Stachowicz & Tilman, 2005). Een verdere optimalisatie van de opstelling van deze zandfilters is dus nodig. Eén van de factoren die deze opstelling kan verbeteren, is de blootstelling aan licht. De activiteit van de AOB’s is namelijk gevoelig voor licht (Alleman et al., 1986; Wotton, 2002). Daarnaast zorgt het licht ook voor de groei van algen in de buisjes, zandkolommen en mengvaten. Deze algen produceren exopolymeren die de flocculatie kunnen versterken waardoor vaker verstoppingen optreden in het systeem. Bijkomend doen algen aan fotosynthese waardoor vooral gedurende de nacht zuurstoftekorten kunnen optreden in de zandkolommen (Wotton, 2002). De algengroei was sterk aanwezig in het gehele systeem. Een combinatie van deze groei en trage

74

recirculatiesnelheid zorgde ervoor dat vaak verstoppingen optraden. Een mogelijkheid om dit probleem op te lossen is door het hele systeem dus af te schermen van licht. Bijkomend zouden batchexperimenten, opgesteld bij dezelfde condities zoals de zandkolommen, een beter idee kunnen geven over de verwachtte resultaten. Daarnaast werden nog geen duidelijke resultaten bekomen over de diversiteit van de zandfiltergemeenschappen zelf. De gebruikte qPCR’s hebben een goede standaardreeks van de E. coli dat het plasmide bevat met het specifiek gen. Maar bij de zandstalen werden bij hoge DNAconcentraties inhibitie-effecten waargenomen en bij verdunde stalen was het aantal dimeren te hoog waardoor de resultaten niet betrouwbaar zijn. Verdere optimalisatie bij deze qPCR’s is dus ook vereist.

75

4. CONCLUSIES High-throughput methodes werden ontwikkeld om NO2-, NO3-, NH4+, Mn2+, Fe2+ en COD concentraties lager dan de drinkwaternorm te bepalen. Deze methodes zijn accurate, efficiënte en goedkope methodes om op korte tijd een groot aantal stalen te verwerken. Zowel het ammoniumprotocol als het nitrietprocol benaderen de commerciële standaardkits. Daarnaast is de ammonium-salicylzuur methode een meer gevoelige methode in vergelijking met de standaard Nessler methode. De geoptimaliseerde high-throughput methodes zijn echter wel gevoelig voor matrixeffecten en kunnen daardoor enkel worden toegepast in minimale media. Een zandfiltergemeenschap met een gelijke verdeling is meer resistent tegenover invasie van Pseudomonas putida. Bij een ongelijke verdeling dient men echter ook rekening te houden met de identiteit van de dominante soort. De dominante soort in de residentiële gemeenschap bepaalt namelijk ook de invasiegevoeligheid. Naast Pseudomonas putida werden de gemeenschappen ook geïnvadeerd door Enterobacter aerogenes. Deze pathogeen vertoonde echter geen invasie-effecten op de zandfiltergemeenschap. Een zandfiltergemeenschap met een ongelijke verdeling kent een hogere ammoniumoxidatie. Deze oxidatie neemt zelfs toe na invasie door Pseudomonas putida. Bij kleinschalige zandfilters is een rusttijd noodzakelijk na het inoculeren opdat de bacteriën een biofilm rond de zandkorrels kunnen vormen. Een beperkte functionaliteit werd bekomen bij deze zandfilters. Verdere optimalisatie van het experiment is noodzakelijk om de variatie tussen de kolommen te verkleinen en een volledige nitrificatie te bekomen.

76

5. TOEKOMSTIG ONDERZOEK Het invasie-experiment van de zandfiltergemeenschappen in 96-well platen gaf al een goede indicatie door welke parameters invasie onder meer wordt beïnvloed. Maar deze synthetische zandfiltergemeenschappen werden geïncubeerd bij 28 °C wat geen realistische temperatuur is voor zandfilters in de praktijk. Daarom kan in de toekomst gekeken worden naar stressfactoren die de invasie en functionaliteit van een zandfiltergemeenschap kunnen beïnvloeden. Zo heeft het water dat terecht komt in een zandfilter vaak een temperatuur van 10 °C en kunnen er componenten aanwezig zijn in het water die invasie eventueel kunnen beïnvloeden. Daarnaast kan er ook onderzocht worden wat het effect is door invasie van bacteriën die een positief effect hebben op de zandfilterfunctionaliteit. Waarna eventueel kan gekeken worden of deze toegediende positieve bacteriën in staat zijn om zo de gemeenschap beter te beschermen tegenover invasie van pathogenen. Deze

onderzoekspunten

kunnen

zowel

onderzocht

worden

bij

synthetische

zandfiltergemeenschappen in 96-well platen, met batch experimenten en uiteindelijk bij kleinschalige zandfilters.

77

Referenties

Aakra, A., et al. (1999). "An evaluated improvement of the extinction dilution method for isolation of ammonia-oxidizing bacteria." Journal of Microbiological Methods39(1): 23-31. Abeliovich, A. (1987). "Nitrifying bacteria in wastewater reservoirs." Appl Environ Microbiol 53(4): 754-760. Achak, M., et al. (2009). "Removal of organic pollutants and nutrients from olive mill wastewater by a sand filter." Journal of Environmental Management90(8): 2771-2779. Alleman, J. E., et al. (1987). "Light-Induced Nitrosomonas Inhibition." Water research21(4): 499-501. Alleman, J. E., et al. (1987). "Light-Induced Nitrosomonas Inhibition." Water research 21(4): 499-501. Amornthammarong, N. and Zhang, J. Z. (2008). "Shipboard fluorometric flow analyzer for highresolution underway measurement of ammonium in Seawater." Analytical Chemistry 80(4): 10191026. Arndt, R. E. and Wagner, E. J. (2003). "Filtering Myxobolus cerebralis Triactinomyxons from contaminated water using rapid sand filtration." Aquacultural Engineering29(3-4): 77-91. Ashbolt, N. J. (2004). "Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions." Toxicology198(1-3): 229-238. Aslan, S. and Cakici, H. (2007). "Biological denitrification of drinking water in a slow sand filter." Journal of Hazardous Materials148(1-2): 253-258. Asner, G. P. and Vitousek, P. M. (2005). "Remote analysis of biological invasion and biogeochemical change." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America102(12): 4383-4386. Belgaqua (2012). "Wat U moet weten over drinkwater." http://www.belgaqua.be/document/filternl.pdf (2012). Bell, T., et al. (2005). "The contribution of species richness and composition to bacterial services." Nature436(7054): 1157-1160. Betancourt, W. Q. and Rose, J. B. (2004). "Drinking water treatment processes for removal of Cryptosporidium and Giardia." Veterinary Parasitology126(1-2): 219-234. Blackburne, R., et al. (2007). "Kinetic characterisation of an enriched Nitrospira culture with comparison to Nitrobacter." Water research41(14): 3033-3042. Bollmann, A. and Laanbroek, H. J. (2001). "Continuous culture enrichments of ammonia-oxidizing bacteria at low ammonium concentrations." Fems Microbiology Ecology 37(3): 211-221. Boorman, G. A., et al. (1999). "Drinking water disinfection byproducts: Review and approach to toxicity evaluation." Environmental Health Perspectives107: 207-217. Bouchez, T., et al. (2000). "Ecological study of a bioaugmentation failure." Environ Microbiol 2(2): 179-190. Bradfield, E. G. (1957). "An Improved Formaldoxime Method for the Determination of Manganese in Plant Material." Analyst 82(973): 254-257.

79

Braunschweig, J., et al. (2012). "Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology." Journal of Microbiological Methods89(1): 41-48. Brewer, P. G. and Spencer, D. W. (1971). "Colorimetric Determination of Manganese in Anoxic Waters." Limnology and Oceanography16(1): 107-&. Bruno, J. F., et al. (2003). "Inclusion of facilitation into ecological theory." Trends in Ecology & Evolution18(3): 119-125. Bucur, B., et al. (2006). "Spectrophotometric determination of ammonium by an rFIA assembly." Revue Roumaine De Chimie51(2): 101-108. Buswell, C. M., et al. (1997). "Coaggregation amongst aquatic biofilm bacteria." Journal of Applied Microbiology 83(4): 477-484. Byers, J. E. and Noonburg, E. G. (2003). "Scale dependent effects of biotic resistance to biological invasion." Ecology84(6): 1428-1433. Cabral, J. P. S. (1994). "Comparison of Methods to Assay Ammonia in Bacterial Suspensions." Journal of Microbiological Methods 19(3): 207-213. Camel, V. and Bermond, A. (1998). "The use of ozone and associated oxidation processes in drinking water treatment." Water research32(11): 3208-3222. Case, T. J. (1990). "Invasion Resistance Arises in Strongly Interacting Species-Rich Model Competition Communities." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87(24): 9610-9614. Cataldo, D. A., et al. (1975). "Rapid Colorimetric Determination of Nitrate in Plant-Tissue by Nitration of Salicylic-Acid." Communications in Soil Science and Plant Analysis6(1): 71-80. Cerda, A., et al. (1995). "Evaluation of Flow-Injection Methods for Ammonium Determination in Waste-Water Samples." Analytica Chimica Acta 311(2): 165-173. Chen, C., et al. (2007). "Comparison of seven kinds of drinking water treatment processes to enhance organic material removal: A pilot test." Science of the Total Environment382(1): 93-102. Chiswell, B. and O'Halloran, K. R. (1991). "Comparison of three colorimetric methods for the determination of manganese in freshwaters." Talanta38(6): 641-647. Crawley, M. J., et al. (1999). "Invasion-resistance in experimental grassland communities: species richness or species identity?" Ecology Letters 2(3): 140-148. Crutsinger, G. M., et al. (2008). "Intraspecific diversity and dominant genotypes resist plant invasions." Ecology Letters 11(1): 16-23. Dan, D. Z., et al. (2005). "Determination of chemical oxygen demand in fresh waters using flow injection with on-line UV-photocatalytic oxidation and spectrophotometric detection." Analyst130(2): 227-232. Dangles, O. and Malmqvist, B. (2004). "Species richness-decomposition relationships depend on species dominance." Ecology Letters 7(5): 395-402.

80

Davis, M. A., et al. (2005). "Invasibility: the local mechanism driving community assembly and species diversity." Ecography28(5): 696-704. De Roy, K., et al. (2012). "Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting." Water research 46(3): 907-919. De Roy, K., et al. (2013). "Environmental conditions and community evenness determine the outcome of biological invasion." Nat Commun4: 1383. de Vet, W. W. J. M., et al. (2011). "Biological iron oxidation by Gallionella spp. in drinking water production under fully aerated conditions." Water research45(17): 5389-5398. de Vet, W. W. J. M., et al. (2012). "Phosphorus limitation in nitrifying groundwater filters." Water research46(4): 1061-1069. Demirhan, N. and Elmali, F. T. (2003). "Spectrophotometric determination of iron(II) with 5-nitro-6amino-1,10-phenanthroline." Turkish Journal of Chemistry 27(3): 315-321. DenverWater (2012). "The treatment process." http://www.denverwater.org/WaterQuality/TreatmentProcess (2012). Domini, C. E., et al. (2006). "Comparison of three optimized digestion methods for rapid determination of chemical oxygen demand: Closed microwaves, open microwaves and ultrasound irradiation (vol 561, pg 210, 2006)." Analytica Chimica Acta 569(1-2): 275-276. Dvorak, B. I., et al. (2007). "Drinking water: Iron manganese."http://www.ianrpubs.unl.edu/epublic/live/g1714/build/g1714.pdf (2012).

and

EEA. (2004). "Indicator fact sheet: Drinking water quality."http://www.eea.europa.eu/data-andmaps/indicators/drinking-water-quality-2 (2012). Eighmy, T. T., et al. (1992). "Microbial-Populations, Activities and Carbon Metabolism in Slow Sand Filters." Water research26(10): 1319-1328. Eisenhauer, N., et al. (2012). "Bacterial diversity stabilizes community productivity." PLoS One7(3): e34517. Elliott, M. A., et al. (2008). "Reductions of E-coli, echovirus type 12 and bacteriophages in an intermittently operated household-scale slow sand filter." Water research 42(10-11): 2662-2670. EL-Taweel, G. and Ali, G. H. (2000). "Evaluation of roughing and slow sand filters for water treatment." Water, Air andSoil Pollution120: 21-28. Emery, S. M. and Gross, K. L. (2006). "Dominant species identity regulates invasibility of old-field plant communities." Oikos 115(3): 549-558. Erickson, A. J., et al. (2007). "Enhanced sand filtration for storm water phosphorus removal." Journal of Environmental Engineering-Asce133(5): 485-497. EU. (1998). "Richtlijn 98/83/EG betreffende de kwaliteit van voor menselijke consumptie bestemd water."http://eur-lex.europa.eu (2012).

81

Fargione, J., et al. (2003). "Community assembly and invasion: An experimental test of neutral versus niche processes." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America100(15): 8916-8920. Fleck, A. and Munro, H. N. (1965). "The Determination of Organic Nitrogen in Biological Materials. A Review." Clin Chim Acta 11: 2-12. Flemming, H. C. (2002). "Biofouling in water systems - cases, causes and countermeasures." Applied Microbiology and Biotechnology59(6): 629-640. Fox, J. B. (1979). "Kinetics and Mechanisms of the Griess Reaction." Analytical Chemistry 51(9): 14931502. Fujimori, K., et al. (2001). "Chemiluminescence method with potassium permanganate for the determination of organic pollutants in seawater." Analytical Sciences 17(8): 975-978. Gasol, J. M. and Del Giorgio, P. A. (2000). "Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities." Scientia Marina 64(2): 197-224. Geets, J., et al. (2006). "Strategies of aerobic ammonia-oxidizing bacteria for coping with nutrient and oxygen fluctuations. " Fems Microbiology Ecology 58: 1-13. Gleick, P. H. (1996). "Basic water requirements for human activities: Meeting basic needs." Water International21(2): 83-92. Goh, C. P. and Lim, P. E. (2008). "Potassium permanganate as oxidant in the cod test for saline water samples." AJSTD25(2): 383-393. Goldstein, R. M., et al. (1985). "Reasons for Possible Failure of Inoculation to Enhance Biodegradation." Applied and Environmental Microbiology50(4): 977-983. Goto, K., et al. (1962). "Rapid Colorimetric Determination of Manganese in Waters Containing Iron - a Modification of Formaldoxime Method." Analytica Chimica Acta 27(4): 331-&. Grosholz, E. (2002). "Ecological and evolutionary consequences of coastal invasions." Trends in Ecology & Evolution17(1): 22-27. Grosholz, E., et al. (2000). "The impacts of a non-indigenous marine predator in a California bay." Ecology Letters81: 1206-1224. Gürkan, R., et al. (2010). "A new analytical method for the kinetic spectrophotometric determination of trace amounts of nitrite in some environmental water samples." Analytical Chemistry 5(1): 16-31. Hammes, F. A. and Egli, T. (2005). "New method for assimilable organic carbon determination using flow-cytometric enumeration and a natural microbial consortium as inoculum." Environmental Science & Technology 39(9): 3289-3294. Harwood, J. E. and Huyser, D. J. (1970). "Automated Analysis of Ammonia in Water." Water research 4(10): 695-&. Harwood, J. E., and Kühn, A. L. (1970). "A colorimetric method for ammonia in natural waters." Water Research 4(12): 805-811.

82

Hassen, A., et al. (2000). "UV disinfection of treated wastewater in a large-scale pilot plant and inactivation of selected bacteria in a laboratory UV device." Bioresource Technology74(2): 141-150. Hawkes, C. V., et al. (2005). "Plant invasion alters nitrogen cycling by modifying the soil nitrifying community." Ecology Letters8(9): 976-985. Head, M. A. and Oleszkiewicz, J. A. (2004). "Bioaugmentation for nitrification at cold temperatures." Water research38(3): 523-530. Healy, M. G., et al. (2007). "Performance of a stratified sand filter in removal of chemical oxygen demand, total suspended solids and ammonia nitrogen from high-strength wastewaters." Journal of Environmental Management83(4): 409-415. Hendel, B., et al. (2001). "Extracellular enzyme activities during slow sand filtration in a water recharge plant." Water research35(10): 2484-2488. Henrichs, M., et al. (2009). "Modelling of biofilters for ammonium reduction in combined sewer overflow." Water Science and Technology 60(3): 825-831. Hey, M. H. (1982). "The Determination of Ferrous and Ferric Iron in Rocks and Minerals - and a Note on Sulfosalicylic Acid as a Reagent for Fe and Ti." Mineralogical Magazine 46(338): 111-118. Hillebrand, H., et al. (2008). "Consequences of dominance: A review of evenness effects on local and regional ecosystem processes." Ecology89(6): 1510-1520. Hodgson, D. J., et al. (2002). "Mechanisms linking diversity, productivity and invasibility in experimental bacterial communities." Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences269(1506): 2277-2283. Hoefel, D., et al. (2003). "Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques." Journal of Microbiological Methods 55(3): 585-597. Hope, C. K. and Bott, T. R. (2004). "Laboratory modelling of manganese biofiltration using biofilms of Leptothrixdiscophora." Water research38(7): 1853-1861. Hoshino, M., et al. (2011). "Improved Spectrophotometric Determination of Total Iron and Iron (III) with o-Hydroxyhydroquinonephthalein and Their Characterization." Yakugaku Zasshi-Journal of the Pharmaceutical Society of Japan 131(7): 1095-1101. Hu, Y. G. and Yang, Z. Y. (2004). "A simple chemiluminescence method for determination of chemical oxygen demand values in water." Talanta63(3): 521-526. Huisman, L., et al. (1974). "Slow sand filtration." World Health Organization Geneva: 1-120. Huston, M. A. (1997). "Hidden treatments in ecological experiments: Re-evaluating the ecosystem function of biodiversity." Oecologia110(4): 449-460. Hydes, D. J. (1987). "Continuous-Flow Determination of Manganese in Natural-Waters Containing Iron." Analytica Chimica Acta 199: 221-226. Jacobsen, O.S., et al. (2012). "Sand-filter bio-augmentation of the pesticide metabolite, BAM, as a tool to clean-up drinking water contaminated by low concentrations."Geus: Poster.

83

Jardim, W. F. and Rohwedder, J. J. R. (1989). "Chemical Oxygen-Demand (Cod) Using Microwave Digestion." Water research 23(8): 1069-1071. Jellison, K. L., et al. (2000). "Enhanced ripening of slow sand filters." Journal of Environmental Engineering-Asce126(12): 1153-1157. Jin, B. H., et al. (2004). "Measurement of chemical oxygen demand (COD) in natural water samples by flow injection ozonation chemiluminescence (FI-CL) technique." Journal of Environmental Monitoring 6(8): 673-678. Jordan, N. R., et al. (2008). "Soil modification by invasive plants: effects on native and invasive species of mixed-grass prairies." Biological Invasions10(2): 177-190. Jousset, A., et al. (2011). "Intraspecific genotypic richness and relatedness predict the invasibility of microbial communities." Isme Journal5(7): 1108-1114. Juttner, F. (1999). "Interference with ammonium determination by the indophenol-type reaction of salicylate and dichloroisocyanurate." Fresenius Journal of Analytical Chemistry 363(1): 128-129. Kempers, A. J. (1974). "Determination of Sub-Microquantities of Ammonium and Nitrates in Soils with Phenol, Sodium Nitroprusside and Hypochlorite." Geoderma 12(3): 201-206. Kempers, A. J. and Kok, C. J. (1989). "Re-Examination of the Determination of Ammonium as the Indophenol Blue Complex Using Salicylate." Analytica Chimica Acta 221(1): 147-155. Kennedy, T. A., et al. (2002). "Biodiversity as a barrier to ecological invasion." Nature 417(6889): 636638. Kim, Y. C., et al. (2000). "Photocatalytic sensor for chemical oxygen demand determination based on oxygen electrode." Analytical Chemistry 72(14): 3379-3382. Koivunen, J., et al. (2003). "Elimination of enteric bacteria in biological-chemical wastewater treatment and tertiary filtration units". Water research37: 690-698. Koivunen, J., et al. (2003). "Elimination of enteric bacteria in biological-chemical wastewater treatment and tertiary filtration units." Water research 37(3): 690-698. Koops, H. P., et al. (2006). "The lithoautotrophic ammonia-oxidizing bacteria." Prokaryotes5: 778811. Lamb, E. G., et al. (2011). "Effects of plant species richness and evenness on soil microbial community diversity and function." Plant and Soil 338(1-2): 483-495. Langenbach, K., et al. (2010). "Modeling of slow sand filtration for disinfection of secondary clarifier effluent." Water research 44(1): 159-166. Lebaron, P., et al. (1998). "Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems." Applied and Environmental Microbiology 64(5): 1725-1730. LeChevallier, M. W. and Au, K. K. (2004). Water treatment and pathogen control: Process efficiency in achieving safe drinking water. London. UK., IWA Publishing: 112. Lehtola, M. J., et al. (2001). "Microbially available organic carbon, phosphorus, and microbial growth in ozonated drinking water." Water research35(7): 1635-1640. 84

Lehtola, M. J., et al. (2002). "Changes in content of microbially available phosphorus, assimilable organic carbon and microbial growth potential during drinking water treatment processes." Water research36(15): 3681-3690. Leonard, R. H. (1963). "Quantitative range of Nessler’s reaction". Clinical Chemistry9(4): 417-422. Levenspiel, O. ( 1999). Chemical reaction engineering. 3e editie, John Wiley & Sons. Levin, L. A., et al. (2006). "Invasive cordgrass modifies wetland trophic function." Ecology87(2): 419432. Li, B. X., et al. (2003). "Chemiluminescence system for automatic determination of chemical oxygen demand using flow injection analysis." Talanta 61(5): 651-658. Litchman, E. (2010). "Invisible invaders: non-pathogenic invasive microbes in aquatic and terrestrial ecosystems." Ecology Letters13(12): 1560-1572. Logsdon, G. S., et al. (2002). "Slow sand filtration for small water systems." Journal of Environmental Engineering-Asce1: 339-348. Lonsdale, W. M. (1999). "Global patterns of plant invasions and the concept of invasibility." Ecology 80(5): 1522-1536. Lynch, N., et al. (1987). "Bioaugmentation of stressed anaerobic filters with methanogenic enrichment cultures." Waste Conf. Purdue Uni.: 285-296. Mack, R. N., et al. (2000). "Biotic invasions: Causes, epidemiology, global consequences, and control." Ecological Applications10(3): 689-710. Madigan, M. T., et al. (2009). Biology of microorganisms, Pearson education: 1-1061. Malone, R. F., et al. (1998). "Sizing and management of floating bead bioclarifiers." Proceedings of the Second International Conference on Recirculating Aquaculture. Massa, S., et al. (1998). "Comparison of plate count agar and R2A medium for enumeration of heterotrophic bacteria in natural mineral water." World Journal of Microbiology & Biotechnology 14(5): 727-730. Mattingly, W. B., et al. (2007). "Species evenness and invasion resistance of experimental grassland communities." Oikos 116(7): 1164-1170. McClure, N. C., et al. (1991). "Genetic engineering for wastewater treatment." J. Inst. Water Env. Manag.5: 608-616. Miller, T. E., et al. (2002). "Effect of community structure on invasion success and rate." Ecology83(4): 898-905. Montgomery, H. A. C. and Dymock, J. F. (1961). "The determination of nitrite in water." Analyst86: 414-416. Mooney, H.A. and Hobbs, R. (2000). "Invasive Species in a Changing World."Island Press: Washington. Mulder, C. P. H., et al. (2004). "Species evenness and productivity in experimental plant communities." Oikos 107(1): 50-63. 85

Naeem, S., et al. (2000). "Plant diversity increases resistance to invasion in the absence of covarying extrinsic factors." Oikos91(1): 97-108. Neef, A., et al. (1996). "Population analysis in a denitrifying sand filter: Conventional and in situ identification of Paracoccus spp. in methanol-fed biofilms." Applied and Environmental Microbiology62(12): 4329-4339 OECD (2006). "Keeping water safe to drink." http://www.oecd.org/env/biodiversitywaterandnaturalresourcemanagement/36216684.pdf (2012). Oerther, D.B., et al. (1998). "Bioaugmentation of sequencing batch reactors for biological phosphorous removal: comparative rRNA sequence analysis and hydribization with oligonucleotide probes."Water Science and Technology37: 469-473. Pacala, S. W. and Tilman, D. (1994). "Limiting Similarity in Mechanistic and Spatial Models of Plant Competition in Heterogeneous Environments." American Naturalist 143(2): 222-257. Pacini, V. A., et al. (2005). "Removal of iron and manganese using biological roughing up flow filtration technology." Water research39(18): 4463-4475. Parker, I. M., et al. (1999). "Impact: toward a framework for understanding the ecological effects of invaders." Biological Invasions1: 3-19. Peart, D. R. and Foin, T. C. (1985). "Analysis and prediction of community change: a grassland case study." J. White: 312-339. Rahim, S. A., et al. (1983). "Indole as a Reagent for Nitrite in Aqueous-Solution." Microchemical Journal 28(4): 479-484. Raikos, N., et al. (1988). "Comparative-Study of Different Techniques for Nitrate Determination in Environmental Water Samples." Fresenius Zeitschrift Fur Analytische Chemie 331(5): 495-498. Rhine, E. D., et al. (1998). "Improving the Berthelot reaction for determining ammonium in soil extracts and water." Soil Science Society of America Journal 62(2): 473-480. Richardson, S. D., et al. (2000). "Identification of new drinking water disinfection by-products from ozone, chlorine dioxide, chloramine, and chlorine." Water Air and Soil Pollution123(1-4): 95-102. Rickard, A. H., et al. (2000). "Coaggregation between aquatic bacteria is mediated by specific-growthphase-dependent lectin-saccharide interactions." Applied and Environmental Microbiology 66(1): 431-434. Rittmann, B.E. and Whiteman R. (1994). "Bioaugmentation: a coming of age."Water Quality Int1: 126. Robinson, G. R., et al. (1995). "Invasibility of Experimental Habitat Islands in a California Winter Annual Grassland." Ecology 76(3): 786-794. Robinson, G. R., et al. (1995). "Invasibility of Experimental Habitat Islands in a California Winter Annual Grassland." Ecology 76(3): 786-794. Robinson, J. V. and Dickerson, J. E. (1984). "Testing the Invulnerability of Laboratory Island Communities to Invasion." Oecologia61(2): 169-174.

86

Rodgers, M., et al. (2005). "Organic carbon removal and nitrification of high strength wastewaters using stratified sand filters." Water research39(14): 3279-3286. Rolland, L., et al. (2009). "Influence of the physical and mechanical characteristics of sand on the hydraulic and biological behaviors of sand filters." Desalination248: 998-1007. Rousseau, R., et al. (1999). "The relationship between diversity profiles, evenness and species richness based on partial ordering." Environmental and Ecological Statistics6(2): 211-223. Rubiyatno, et al. (2012). "The decrease of organic substance concentration and turbidity in well water using biosand filter reactor." Journal of Environmental Science and Technology 5(6): 430-440. Sala, O. E., et al. (2000). "Biodiversity - Global biodiversity scenarios for the year 2100." Science287(5459): 1770-1774. Satoh, H., et al. (2003). "Evaluation of the impact of bioaugmentation and biostimulation by in situ hybridization and microelectrode." Water research 37(9): 2206-2216. Scherrenberg, S. M., et al. (2008). "Innovative phosphorus distribution method to achieve advanced chemical phosphorus removal." Water Science and Technology58(9): 1727-1733. Schoenen, D. (2002). "Role of disinfection in suppressing the spread of pathogens with drinking water: possibilities and limitations." Water research36(15): 3874-3888. Sharma, S. K., et al. (2001). "Comparison of physicochemical iron removal mechanisms in filters." Journal of Water Supply Research and Technology-Aqua50(4): 187-198. Shea, K. and Chesson, P. (2002). "Community ecology theory as a framework for biological invasions." Trends in Ecology & Evolution17(4): 170-176. Simberloff, D. (2006). "Invasional meltdown 6 years later: important phenomenon, unfortunate metaphor, or both?" Ecology Letters9(8): 912-919. Simberloff, D. (2011). "How common are invasion-induced ecosystem impacts?" Biological Invasions13(5): 1255-1268. Simberloff, D. and Von Holle, B. (1999). "Positive interactions of nonindigenous species: invasional meltdown?" Biological Invasions1: 21-32. Simoes, L. C., et al. (2008). "Intergeneric coaggregation among drinking water bacteria: Evidence of a role for Acinetobacter calcoaceticus as a bridging bacterium." Applied and Environmental Microbiology 74(4): 1259-1263. Smith, M. D. and Knapp, A. K. (1999). "Exotic plant species in a C-4-dominated grassland: invasibility, disturbance, and community structure." Oecologia 120(4): 605-612. Stachowicz, J. J. and Byrnes, J. E. (2006). "Species diversity, invasion success, and ecosystem functioning: disentangling the influence of resource competition, facilitation, and extrinsic factors." Marine Ecology Progress Series311: 251-262. Stachowicz, J. J. and Tilman, D. (2005). "Species invasions and the relationships between species diversity, community saturation, and ecosystem functioning. Species invasions: insights into ecology, evolution, and biogeography". 41-64.

87

Stachowicz, J. J., et al. (1999). "Species diversity and invasion resistance in a marine ecosystem." Science286(5444): 1577-1579. Stachowicz, J. J., et al. (2002). "Biodiversity, invasion resistance, and marine ecosystem function: Reconciling pattern and process." Ecology 83(9): 2575-2590. Stembal, T., et al. (2005). "Removal of ammonia, iron and manganese from groundwaters of northern Croatia - pilot plant studies." Process Biochemistry40(1): 327-335. Stenstrom, M. K. and Poduska, R. A. (1980). "The Effect of Dissolved-Oxygen Concentration on Nitrification." Water research 14(6): 643-649. Stephenson, D. and Stephenson, T. (1992). "Bioaugmentation for enhancing biological wastewater treatment." Biotechnol Adv10(4): 549-559. Stevik, T. K., et al. (1999). "The influence of physical and chemical factors on the transport of E-coli through biological filters for wastewater purification." Water research 33(18): 3701-3706. Stoyanova, A. M. (2008). "Spectrophotometric determination of trace iron by using its catalytic effect on the N-phenylanthranilic acid-potassium periodate reaction." Analytical Sciences 24(5): 595-599. Su, Y. Y., et al. (2007). "Rapid, sensitive and on-line measurement of chemical oxygen demand by novel optical method based on UV photolysis and chemiluminescence." Microchemical Journal 87(1): 56-61. Symstad, A. J. (2000). "A test of the effects of functional group richness and composition on grassland invasibility." Ecology81(1): 99-109. Tao, W., et al. (2012). "Effects of pH and temperature on coupling nitritation and anammox in biofilters treating dairy wastewater." Ecological Engineering47: 76-82. Tappe, W., et al. (1999). "Maintenance energy demand and starvation recovery dynamics of Nitrosomonas europaea and Nitrobacter winogradskyi cultivated in a retentostat with complete biomass retention." Applied and Environmental Microbiology 65(6): 2471-2477. Tilman, D. (2004). "Niche tradeoffs, neutrality, and community structure: a stochastic theory of resource competition, invasion, and community assembly." Proc Natl Acad Sci U S A101(30): 1085410861. Tracy, B. F. and Sanderson, M. A. (2004). "Forage productivity, species evenness and weed invasion in pasture communities." Agriculture Ecosystems & Environment 102(2): 175-183. Tranckner, J., et al. (2008). "Estimating nitrifying biomass in drinking water filters for surface water treatment." Water research42(10-11): 2574-2584. Tu, X. H., et al. (2010). "A simple miniaturised photometrical method for rapid determination of nitrate and nitrite in freshwater." Talanta 82(3): 976-983. USEPA. (2012). "Drinking water treatment." http://water.epa.gov (2012). Vallejo-Pecharroman, B., et al. (1999). "Flow injection determination of chemical oxygen demand in leaching liquid." Analyst124(8): 1261-1264.

88

van der Putten, W. H., et al. (2007). "Microbial ecology of biological invasions." Isme Journal1(1): 2837. van der Wielen, P. W. J. J., et al. (2009). "Ammonia-Oxidizing Bacteria and Archaea in Groundwater Treatment and Drinking Water Distribution Systems." Applied and Environmental Microbiology75(14): 4687-4695. van Elsas, J. D., et al. (2012). "Microbial diversity determines the invasion of soil by a bacterial pathogen." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America109(4): 1159-1164. van Loosdrecht, M. C. M., et al. (2002). "Mathematical modelling of biofilm structures." Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 81(1-4): 245-256. Van Nevel, S., et al. (2013). "Pathogen invasion potential in water is determined by nutrient availability and the indigenous community." FEMS Microbiol Ecol. doi: 10.1111/1574-6941.12145.[in press] Van Pelt-Verkuil, E., et al. amplification."SpringerScience.

(2008).

"Principles

and

technical

aspects

of

PCR

Vandenabeele, J., et al. (1992). "Manganese Oxidation by Microbial Consortia from Sand Filters." Microbial Ecology24(1): 91-108. Vandenabeele, J., et al. (1995). "Influence of Nitrate on Manganese Removing Microbial Consortia from Sand Filters." Water research29(2): 579-587. Vandenabeele, J., et al. (1995). "Role of Autotrophic Nitrifiers in Biological Manganese Removal from Groundwater Containing Manganese and Ammonium." Microbial Ecology29(1): 83-98. Viollier, E., et al. (2000). "The ferrozine method revisited: Fe(II)/Fe(III) determination in natural waters." Applied Geochemistry15(6): 785-790. Vitousek, P. M. (1990). "Biological Invasions and Ecosystem Processes - Towards an Integration of Population Biology and Ecosystem Studies." Oikos57(1): 7-13. Vitousek, P. M., et al. (1996). "Biological invasions as global environmental change." American Scientist84(5): 468-478. VMM. (2010). "Drinkwaterkwaliteit in detail bekeken". www.vmm.be (2012). von Gunten, U. (2003). "Ozonation of drinking water: Part I. Oxidation kinetics and product formation." Water research37(7): 1443-1467. Wand, H., et al. (2007). "Removal of bacteria by filtration in planted and non-planted sand columns." Water Res 41(1): 159-167. Wardle, D. A. (2001). "Experimental demonstration that plant diversity reduces invasibility - evidence of a biological mechanism or a consequence of sampling effect?" Oikos 95(1): 161-170. Weatherburn, M. (1967). "Phenol-Hypochlorite Reaction for Determination of Ammonia." Analytical Chemistry 39(8): 971-&. Webster, G., et al. (2005). "Links between ammonia oxidizer species composition, functional diversity and nitrification kinetics in grassland soils." Environ Microbiol 7(5): 676-684. 89

West, P. W. and Lyles, G. L. (1960). "A New Method for the Determination of Nitrates." Analytica Chimica Acta 23(3): 227-232. WHO. (2012). "Slow sand filtration." http://www.who.int/water_sanitation_health/hygiene/emergencies/fs2_12.pdf(2012). Wilhelm, R., et al. (1998). "Effect of long-term ammonia starvation on the oxidation of ammonia and hydroxylamine by Nitrosomonas europaea." Journal of Biochemistry 124(4): 811-815. Wilsey, B. J. and Polley, H. W. (2002). "Reductions in grassland species evenness increase dicot seedling invasion and spittle bug infestation." Ecology Letters 5(5): 676-684. Wittebolle, L., et al. (2009). "Initial community evenness favours functionality under selective stress." Nature458(7238): 623-626. Wolthoorn, A., et al. (2004). "Effect of synthetic iron colloids on the microbiological NH4+ removal process during groundwater purification." Water research38(7): 1884-1892. Wotton, R. S. (2002). "Water purification using sand." Hydrobiologia 469(1-3): 193-201. Yao, H., et al. (2009). "A high throughput chemiluminescence method for determination of chemical oxygen demand in waters." AnalyticaChimicaActa633(1): 76-80.

90