INTRACELLULÁRISAN JELZETT IDEGSEJTEK 3-DIMENZIÓS MIKROSZKÓPOS REKONSTRUKCIÓJÁNAK KIVITELEZÉSE PATKÁNY ÉS MACSKA AGYKÉREGBŐL
Sólyom Zsanett
DEBRECENI EGYETEM OEC ANATÓMIAI, SZÖVET-ÉS FEJLŐDÉSTANI INTÉZET
Debrecen 2013.
1. Tartalomjegyzék 1. Tartalomjegyzék……………………………………………………..…………….…….......1 2. Mellékletek…………………………………………………………………………………..2 3. Bevezetés és szakirodalmi áttekintés……………..………………….………………….…..3 3.1. A „kezdet”…………………………………………………………………………3 3.2. Új módszerek az idegrendszer szerkezetének vizsgálatában….……......................4 3.3. A „váltás”………………………………………………………………………….5 3.4. Az idegsejtek általános morfológiai jellemzői és jelentőségük…………………...6 4. Célkitűzés…….………….………………...…..….………...……………………………….9 5. Anyagok és módszerek……………………...…………………………...………………...10 5.1. Műtéti eljárás és biocytin injektálás……………………………………………...10 5.2. Immunhisztokémia………………………………………………………………12 6. Vizsgálati eredmények és megbeszélésük……..…………………………………………..14 6.1. Műszeres háttér és a sejtrekonstrukció folyamata……………………………….15 6.1.1. Fénymikroszkóp és kameraválasztás…………………………………...15 6.1.2. Objektív választás………………………………………………….......16 6.1.3. Motorizált tárgyasztal, komputer interface, rekonstrukciós program….16 6.1.4. A sorozatrekonstrukció megtervezése………………………………….17 6.1.5. A rekonstrukció során fellépő hibák……………………………………19 6.2. A sorozatmetszetek rekonstruálásának kivitelezése……………………………..21 7. Megbeszélés………..………………………………………………………………………26 8. Összefoglalás………………………………………………………………………………30 9. Köszönetnyilvánítás………………...……………………………………………………...31 10. Függelék………………………………………………………………………………….32 11. Szakirodalomi jegyzék……………………………………………………………………33
1
2.Mellékletek Rövidítések jegyzék: ¾ ABC: avidin-biotinilált peroxidáz komplex ¾ DAB: 3,3’-diamino-benzidin ¾ DMSO: dimetil-szulfox (dimethyl-sulfoxide) ¾ EPSP: excitatorikus (depolarizáló) posztszinaptikus memdránpotenciál (excitatory postsynaptic potential) ¾ GABA: gamma-aminovajsav ¾ HEPES: N-2-hydroxyethylpiperazine-N9-2-ethanesulfonic acid ¾ i.p. : intraperitoneális ¾ IPSP: inhibitoros (hiperpolarizáló) posztszinaptikus membránpotrenciál (inhibitory postsynaptic potencial) ¾ PB: foszfát puffer (phosphate buffer) ¾ PBS: foszfát pufferolt sósoldat (phosphate buffered saline) ¾ PC: személyi számítógép (personal computer) ¾ TB: Tris puffer (Tris buffer) ¾ TBS: Tris pufferolt sóoldat (Tris buffered saline) Ábrajegyzék ¾ 1. ábra: Abdellatif Nemri (2010), Scholarpedia, 5 (12):8577 ¾ 2. ábra: Nature Reviews Neuroscience 4, 71-77 (2003. Január) ¾ 3. ábra: Abdellatif Nemri (2010), Scholarpedia, 5 (12):8577 ¾ 4.ábra:http://www.mozaweb.hu/Lecke-Biologia-Biologia_8Az_idegsejtek_felepitese_es_mukodese-104888 ¾ 5.; 9. ábra: http://www.mbfbioscience.com/neurolucida ¾ 6.; 7.; 8.a,b. ábra: http://www.olympus-global.com ¾ 13. ábra: Halavi, M., Hamilton K. A., Parekh R., Ascoli, G. A. (2012) Digital reconstructions of neuronal morphology: three decades of research trends. Frontiers in Neuroscience Vol.6, 49
2
3. Bevezetés és szakirodalmi áttekintés
1. ábra: Santiago Ramon’y Cajal a laboratóriumában (Cajal Intézet, Madrid) 3.1. A „kezdet”
Több mint 100 év telt el azóta, hogy Ramon’y Cajal (1. ábra), akit a neuromorfológia szülőatyjának is neveznek, sikeresen alkalmazta kortársa, Camillo Golgi ezüst-impregnációs eljárását, amit továbbfejlesztett és tökélyre vitt. A legteljesebb és mindmáig a legátfogóbb neuromorfológiai leírását adta szinte valamennyi idegrendszeri struktúrának számos emlős fajban köztük az emberi agy idegsejt típusai és pálya összeköttetések tekintetében (Cajal, 1899). A retinától a kisagyig, az agytörzstől a gerincvelőig először írta le részletekbe menően az idegsejtek alakját, nyúlványaik eloszlását és az axonális kapcsolatokat (2. ábra). Átfogó vizsgálatait mind a fejlődő mind kifejlett egyedekben végezte. Cajal preparátumai közül számos a mai napig használhatók és példányai kitüntetett helyen szerepelnek számos múzeum gyűjteményében, így a madridi Cajal Intézetben (Lopez et al., 2010). Ramon’y Cajal nem csak leíró kutatást végzett. Eredményei alapján számos előremutató következtetést is tett a neuronok és hálózataik működésére vonatkozólag, amelyek közül sokat a 20. és 21. századi technikákkal igazoltak. Cajal hatalmas tudása és a gigászi mű, amit létrehozott, olyan általános következtetésekre is lehetőséget nyújtott számára, ami az idegrendszer általános összefüggéseinek és törvényszerűségeinek megfogalmazását tette lehetővé, pl. igazolta a neuron doktrínát, mely szerint az idegrendszer különálló sejtekből, neuronokból áll, amelyek szinapszisokon keresztül kapcsolódnak egymással. De ide sorolandók a neuronhálózat szerveződésére vonatkozó megállapításai, az 3
idegsejtek huzalozásának optimalizációs kérdései, az idegrendszer energia felhasználásra vonatkozó meglátásai, az idegi kapcsolatok fejlődését irányító tényezők (molekuláris faktorok) is. Mindezekre korának technikája nem engedett egyértelmű választ adni, ehhez több mint fél évszázadot kellett várni, de a felismerések briliáns volta méltó az 1906-ban Nobel díjat kapott zsenihez.
2. ábra: Illusztráció Ramon’y Cajal első publikációjának, mely az idegi populáció 5 típusát ábrázolja: A. Purkinje sejt; D. Csillagsejt; F. Golgi sejt; H. Szemcsesejt; S. Kosársejt axonjai
3.2. Új módszerek az idegrendszer szerkezetének vizsgálatában
Az idegrendszer, így az agykéreg tanulmányozását egészen az 1960-as évekig a Cajal által is használt Golgi-féle ezüst-impregnációs módszer hatotta át (3. ábra). Talán egyetlen igazán előrevivő morfológiai módszer említhető, amely az 1950-es évektől kezdve forradalmian új adalékokkal szolgált az idegrendszer ultrastruktúrális morfológiai vizsgálatában, ez pedig az elektronmikroszkópos technika bevezetése volt. Az 1960-as és 704
es évektől robbanásszerű technikai fejlődésnek lehetünk szemtanúi az idegtudományban. Az immunhisztokémiai módszerek megjelenése fény- és elektronmikroszkópos szinten, új neuronális nyomkövető anyagok alkalmazása (pl. torma-peroxidáz), képalkotó eljárások bevezetése mikro-, meso- és makro-szinten (pl. optikai agytérképezés), neurobiokémiai vizsgálatok sokasága, genetikailag manipulált kísérleti állatok használata, kísérleti eredmények komputeres feldolgozása és ezek kombinációja lehetővé tették, hogy a neuronok szerkezetéről és idegi hálózatokban elfoglalt szerepéről egyre többet tudjunk meg, egyre jobban megértsük jelentőségüket.
3. ábra: Egér nagyagykérgéből származó impregnált piramissejt Golgi módszerrel
3.3. A „váltás”
A Golgi imregnációs eljárás alternatív módszerekkel történő felváltását számos tényezőnek tulajdonítható. A Golgi impregnáció egyik legfontosabb hiányossága, hogy a jelölés véletlenszerű, előre nem jósolható meg, melyik neuron és hol fog impregnálódni a szövetben annak ellenére, hogy a Golgi módszer számos változata terjedt el (Golgi-Kopsch módszer, ’rapid’ Golgi, stb.). Továbbá, bizonyos idegsejt típusok impregnációja gyakoribb előfordulást mutat, míg mások ritkábban fellelhetők. Ebből következik, hogy a Golgi módszer nem alkalmas az egyes sejttípusok gyakoriságának mérésére.
5
Azonban a Golgi módszer legfőbb korlátja mégsem ez. A legkritikusabb hiányosságnak az idegsejtek nyúlványrendszerének részleges impregnálhatósága tekinthető. A legszembetűnőbb e tekintetben az axon nyúlványok jelölésének részlegessége, amely szakavatott szemmel nézve Cajal munkáiban jól látszik. Kétségtelen tény, hogy az 1970-es évekre a kutatókat messze nem elégítette ki a Golgi módszer, az új kérdések új eljárások bevezetését tették szükségessé.
Elsődleges cél volt: -
az egyes idegsejtek összeköttetését teljes terjedelmében lehessen vizsgálni, azaz ne csak véletlenszerűen jelölt és részleteiben nem teljes nyúlványú idegsejteket lehessen tanulmányozni, hanem a dendrit- és axonfa teljes egészét.
-
az egyes idegsejtek összeköttetésére vonatkozó térbeli – 3-dimenziós – paraméterek meghatározása (pl. axon- és dendritfa kiterjedésének mérése, axon hosszmérés, térfogatmérés, bouton számolás, boutonok térbeli ’cluster’ analízise).
-
az egyes idegsejtek működésbeli tulajdonságai (pl. tüzelési ráta, membránpotenciál (EPSP,
IPSP),
receptív
mező
tulajdonság,
neurotranszmitter
tartalom)
is
meghatározhatók legyenek.
3.4. Az idegsejtek általános morfológiai jellemzői és jelentőségük
Az idegsejteknek tipikusan kétféle nyúlványa van: (i) a dendritek szolgálnak a rajtuk található szinaptikus kapcsolatok fogadására, ezért ezeket a helyeket bemeneti pontokként (input), (ii) az axonok szolgálnak a sejttest által feldolgozott szignál továbbításáért a célsejtek felé, ezért ezeket a nyúlványokat a kimeneti (output) nyúlványokként tartjuk számon. Ez utóbbi nyúlványok hozzák létre a szinapszisokat más sejtek sejttestén, dendrit törzsén, dendrit tüskéjén vagy axon kezdeti szakaszán (4. ábra).
6
4. ábra: Egy sematikus rajz az idegsejt felépítéséről
Mindkét nyúlványrendszer – dendrit és axon – bonyolult elágazódási mintázatot mutat, amely sejttípusra jellemző. Az agykérgi idegsejtek többsége (cc. 80-85%) piramis alakú sejttesttel bír, az agyfelszín felé van egy vastag dendrit ága, a sejttest alapi részén pedig számos rövidebb bazális dendrit ága található, valamennyi dendritikus tüskével borított. Ezek a sejtek serkentő neurotranszmittert, glutamátot vagy aszpartátot használnak és piramis vagy principális sejtekként tartják őket számon. A principális sejtek axonja részben az agykérgen belül ágazik el, részben más agykérgi területre vagy agykéreg alatti struktúrába vetít. A neuronok kisebbik társaságának elnyúlt vagy kerekded sejtteste van, dendritfája nagyon változatos képet mutat és gátló transzmittert, gamma-aminovajsavat (GABA) használ. Ezeknek a sejteknek kizárólag az agykérgen belül vannak axon kapcsolatai, ezért interneuronoknak nevezik őket. Mindkét sejttípus axonfája több mm kiterjedésű lehet. A principális sejtek axonjai akár 2-3 mm távolságig is eljuthatnak a sejttesttől az agyfelszínnel párhuzamos síkban, de a gátló típusú idegsejtek is elérhetnek 1-2 mm-re. Az idegsejtek morfológiai jegyei meghatározók az idegrendszer működére vonatkozóan. Az axonok morfológiája szoros kapcsolatban áll több olyan jelenséggel, mint pl. a szinaptikus jelátvitel, neuronhálózati kapcsolatok, neuronhálózat működési dinamika, amelyek mind esszenciális meghatározói az agy működésének. A bonyolult agyi neuronhálózatok megismerése megköveteli, hogy ne csak qualitatív ismereteink legyenek, hanem quantitatív információ álljon rendelkezésre, amelyeket olyan neuronhálózati modellekben lehet felhasználni, amelyek a szerkezeti és működésbeli összefüggéseket vizsgálják. Ennek kielégítésére az idegsejtek és kapcsolataik 3-dimenziós, digitális rekonstrukcióira van szükség. Nyilvánvaló, hogy a Cajal által használt Golgi-módszer ebben a felvetésben csak nagyon korlátozottan használható. 7
A 1970-es évektől megjelentek az intracelluláris jelölési módszerek, amelyek elsőként lehetővé tették a neuronok teljes összeköttetési rendszerének (dendrit és axonfa) hiánytalan, minden részletet feltáró megjelenítését. Ezek az intracelluláris technikák új típusú jelző anyagokat alkalmaztak, pl. torma-proxidáz. A jelzett idegsejtek fénymikroszkópos rajza először mutatta meg milyen kiterjedt axon-nyúlvány rendszerrel rendelkezhetnek az agykérgi idegsejtek (Gilbert and Wiesel, 1983). Az utóbbi 20 évben számos rendkívül előnyös tulajdonságú neuronális jelzőanyagot fejlesztettek ki (phaseolus-leucoagglutinin, biocytin, neurobiotin), amelyek valamennyien kiszállítódnak az idegsejt axonális és dendritikus nyúlványainak legtávolabbi végébe (gyors- és lassú transzport). Ezzel megnyílt az út a 3dimenziós sejtrekonstrukciók felé. Munkám során olyan módszereket alkalmazunk, amelyekkel az agykérgi idegsejtek nyúlványait 3-dimenzióban lehet rekonstruálni és a digitalizált adatot kvantitatív analízisnek alávetni, valamint az eredményeket tárolni.
8
4. Célkitűzés: Jelen munkámban a digitális 3-dimenziós idegsejt-rekonstruálás folyamatának technikai kivitelezésének problémakörével foglalkoztam, elsősorban azokkal a részletekkel, amelyekkel jobb megközelítés érhető el a fénymikroszkópos metszetek kvantitatív kiértékelésre. 1) Melyik szövettani lépés(ek) irányadó a metszetek készítése során annak érdekében, hogy a metszetek lehető legkisebb torzulása lépjen fel az eredeti, „in vivo” állapothoz képest? 2) Milyen szempontoknak kell eleget tenni a sorozatmetszetek egymáshoz illesztése során, hogy a lehető legkisebb hibát kövessük el, amely a 3-dimenziós rekonstrukció torzulását eredményezi az eredeti, „in vivo” állapothoz képest? 3) Milyen további lehetőségek vannak a 3-dimenziós neuron rekonstrukciós eljárások kiterjesztésében?
9
5. Anyagok és módszerek: A rekonstruált idegsejtek állatkísérletekből származnak, amelyeket a svájci EPFL, Brain Mind Institute kutatólaboratóriumában végeztek, illetve a Debreceni Egyetem, OEC, Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet, „Laboratory for Cortical Systems Neuroscience” egységben hajtottunk végre. Kísérleti állatként 13-16 napos Wistar patkányt használtunk az Európai Unió állatkísérleti chartájának megfelelően (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes (Strasbourg, 18.III, 1986) illetve a magyar állatvédelmi törvény előírásainak szellemében (Hungarian Enactment of the Protection of Animals [1998.XXVIII.] Section 4).
5.1. Műtéti eljárás és biocytin injektálás:
I. In vitro preparátumok készítése (EPFL, Brain Mind Institute): 1) Az éter gőzben elaltatott állatok dekapitálása után a koponyaüregből az agyat kivették, majd 300 μm vastag szeleteket készítettek sagittális síkban, amelyek tartalmazták a somatosensoros kérget. 2) További felhasználásig a szeleteket jégen tartották mesterséges agyfolyadékban, melynek összetétele (a mennyiségek mM-ban értendők): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1 MgCl2, és 25 D-glükóz 95% 02- 5% CO2 gázkeverék hozzáadásával. 3) Az intracelluláris oldattal töltött üveg pipetta tartalma (a mennyiségek mM-ben): 110 K- glükonát, 10 KCl, 4 ATP-Mg, 10 foszfokreatin, 0,3 GTP, 10 HEPES, és 13 biocytin. A pH értéket 7,3-7,4-re állították 5 M KOH hozzáadásával, valamint az ozmolaritást 290-300 mosm-ra 35 mM D-mannitol hozzáadásával. Az összes felhasznált anyag a Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) vagy a Merck (Darmstadt, Germany) gyártótól származik. 4) Az intracelluláris méréseket követően a szeleteket 4% paraformaldehidet tartalmazó foszfát pufferben (PB) fixálták egy éjszakán át +4ºC-on. Az in vitro intracelluláris jelölési technika különbözött az in vivo intracelluláris módszertől. Az előbbi esetben ”patch-clamp” elektróddal, míg az utóbbi esetben „sharp” pipettával történtek a jelölések. 10
II. In vivo kísérletek (Debreceni Egyetem, OEC): 1) A kísérleti állatok altatása intraperitoneálisan (i.p.) beadott Urethan (1,2-1,4 g Urethan / 1000 g testtömeg) injekcióval történt. 2) Az állatok fejbőrén anterior-posterior irányban a középvonal mentén szikével metszést ejtettünk a homlokcsonttól a lambda varratig. 3) A koponyalékelést két oldalon végeztük el bregmahoz viszonyítva (+1.8 mm posterior irányban) egyenként 2 mm átmérőjű nyílást ejtettünk, majd a dura matert injekciós tű hegyével megslicceltük. a)
Borosilikát üvegkapillárist (elektród impedancia: 80-100 M Ohm) húztunk kapillárishúzó készülékkel (Sutter P-97 típusú), amit 1%-os 2M KCl oldatban feloldott biocytinnel (Sigma-Aldrich) töltöttünk fel.
b)
Az üvegelektródot hidraulikus mikromanipulátor (Narishige WM-10) segítségével a somatosensoros kéregbe juttattuk a pia mater-re merőleges irányból un. ’current clamp’ módban. Az elektród bemeneti impedancia növekedése jelezte, hogy az elektród hegye sejtmembrán közelben van, majd nagyfrekvenciás triggert („buzz”) alkalmazva az elektród betörését a sejt belsejébe a membrán potenciál hirtelen esése jelezte (-40-70 mV).
c)
Pozitív 0.5-1 nA négyszög impulzussal vezérelt (200msec ON/200msec OFF) egyenáramot kapcsolva az üveg kapillárisba helyezett ezüst elektródra iontoforetikusan injektáltuk a biocytint a sejt belsejébe mialatt csúcspotenciálokat regisztráltunk.
4) Az injektálást követően az állatoknak 1 óra túlélést hagytunk, majd letális dózisú altatót injektáltunk i.p. (2-3 ml 10% Urethan). Közvetlenül ezután az állatokat transcardiálisan perfundáltuk Tyrode mosófolyadékkal 1-2 percig, majd 2% paraformaldehidet és 0.5% glutáraldehidet tartalmazó 0.1 M PB-oldattal. 5) Feltártuk az állat koponyáját és óvatosan kiemeltük az agyat. 6) Posztfixáció: a kiemelt agyat egy éjszakán át a fenti fixáló oldatban tartottuk +4 ºC-on. 7) Metszetkészítés: Az agykéreg injektált részéből vibratom segítségével (Leica S-1000) 80 μm vastag coronális metszeteket készítettünk.
11
5.2. Immunhisztokémia:
I. In vitro agyszeletek esetében: 1) A preparátumokat 0.1 M PB-oldatban (pH=7.4) mosták 3x10 percig. Az endogén peroxidázok blokkolását 3%-os H2O2-ot tartalmazó PB-oldatban végezték 30 percen keresztül. 2) Ismételt PB mosást követően a szeleteket 5, 10, 20 és 40%-os dimetil-szulfoxidot (DMSO) tartalmazó 100 mM-os PB-oldatba helyezték, koncentrációnként 30 percre. 3) Újabb 6x10 percig történő PB mosás után a szeleteket biotinilált torma peroxidázzal konjugált avaidin komplex- szel (1:200 hígítás) (ABC-Elite, Vector Labs, Peterborough, UK) inkubálták +4ºC -on éjszakán át a gyártó instrukciói szerint. 4) Másnap 2x10 perces 0.05 M TBS mosást követően 1x10 percig 0.05 M Tris puffer oldatban (TB) mostuk a metszeteinket, majd 0.05% 3,3’-diaminobenzidin-4HCl-ot (DAB) (Sigma-Aldrich) és 0.0025%-os CoCl2-ot tartalmazó 0.05 M TB-oldatban inkubáltuk a metszeteket 25 percen át sötétben, rázatás mellett. 5) A DAB reakciót 0.1% H2O2-ot tartalmazó desztillált vízzel vizualizáltuk a preparátumok barnulásáig 1 percen keresztül. Végül a metszeteket 3x10 percen át 0.05 M TBS-oldatban, majd 1x10 percig 0.1 M PB-oldatban mostuk. 6) Az inkubálást követően fénymikroszkóppal (Zeiss Axioskop) ellenőrizték a jelölt sejteket. A reakciót az agyszeletek hideg PB-oldatba történő áthelyezéssel állították le. 7) Végül a szeletek vizes bázisú fedőanyaggal (mounting medium, IMMCO) dehidrálás nélkül voltak lefedhetők.
12
II. In vivo metszetek esetében: 1) A preparátumokat 1x15 percen át 0.05 M Tris puffer sós oldatával (TBS), majd 2x15 percig
0.2%
Triton
X100-at
tartalmazó
0.05
M
TBS-oldatban
mostuk
szobahőmérsékleten. 2) Ezt követően a metszeteket ABC Kit-et (1:200, Peroxidase Standard PK-4000, Vector Labs.) és 0.2% Triton X 100-at tartalmazó 0.05 M TBS- oldatban inkubáltuk +4ºC-on egy éjszakán át. 3) Másnap 2x10 perces 0.05 M TBS mosást követően 1x10 percig 0.05 M Tris puffer oldatban (TB) mostuk a metszeteinket, majd 0.05% 3,3’-diaminobenzidin-4HCl-ot (DAB) (Sigma-Aldrich) és 0.0025%-os CoCl2-ot tartalmazó 0.05 M TB-oldatban inkubáltuk a metszeteket 25 percen át sötétben, rázatás mellett. 4) A DAB reakciót 0.1% H2O2-ot tartalmazó desztillált vízzel vizualizáltuk a preparátumok barnulásáig 1 percen keresztül. Végül a metszeteket 3x10 percen át 0.05 M TBS-oldatban, majd 1x10 percig 0.1 M PB-oldatban mostuk. 5) Az
enzimreakciót
követően
fénymikroszkópos
vizsgálattal
ellenőriztük
a
metszetekben található megfelelően jelölt sejteket. Amennyiben találtunk megfelelően jelölődött sejteket, a metszeteket gyantában való beágyazásra készítettük elő. 6) Ozmium-tetroxidos (OsO4) (Sigma-Aldrich) utófixálás: az eredeti 4%-os törzsoldatból 0.1 M PB-oldattal 0,1%-os OsO4-ot készítettünk és ebben inkubáltuk a metszeteket 20 percig, majd 0,1 M PB mosással állítottuk le a reakciót. 7) Dehidrálás: Felszálló etilalkoholos sort (50 70, 90, 96%-os) használtunk, minden egyes lépéseljárás során 1x10 percig, majd abszolút etanolt 2x10 percig és propilénoxidot 1x10 percig alkalmaztunk. A víztelenítés során a metszetekre szűrőpapírt helyeztünk, ami kisimítja és megakadályozza a metszetek repedését, összetörését (aminek jelentőségét lásd alább) 8) Beágyazás műgyantába: a gyanta (Durkupan ACM, Fluka) 4 komponensből (A,B,C,D komponens) áll, melyek keverési aránya A:B:C:D=10:10:0,3:0,3 g . A metszeteket ebbe a gyantakeverékbe helyeztük egy teljes napon át, majd másnap metszetek tárgylemezekre pakoltuk és fedőlemezzel buborékmentesen lefedtük. 9) Ezután a tárgylemezeket melegítőkamrába helyeztük és 56ºC-on 1-2 napig ott tartottuk. 13
6. Vizsgálati eredmények és megbeszélésük
Az agyfelszínnel párhuzamos szürkeállományi összeköttetéseket alkotó idegsejtek axonfája gyakran eléri a több milliméter átmérőt. Ez messze meghaladja a fénymikroszkópos metszetek vastagságát (tipikusan 1µ-100µ), következésképpen az axonfáról csak úgy alakítható ki egységes 3-dimenziós rekonstrukció, ha az egyes metszetekben található és ugyanahhoz a sejthez tartozó nyúlványokat és idegvégződéseket (axon terminális vagy bouton) metszetről-metszetre rekonstruáljuk, majd komputeres program segítségével összeillesztjük. Gyakorlatban az agyfelszínnel párhuzamos metszeteket használtunk és a Neurolucida (MicroBrightField) rajzolóprogram segítségével készítettük a 3-dimenziós rekonstrukciókat (5. ábra).
5. ábra: Kompletten felszerelt Neurolucida rendszer
14
6.1. Műszeres háttér és a sejtrekonstrukció folyamata: 6.1.1. Fénymikroszkóp és kamera választás A középkategóriás mikroszkópok többsége nem alkalmas 3-dimenziós rekonstrukcióra, mert a műszaki paramétereik miatt a nagyfokú precizitásuk nem biztosított. Például, a legtöbb mikroszkóp tárgyasztalának z-irányú mozgatása nem fogaskerék meghajtással, hanem dörzshajtással történik. Ezért csak azok a mikroszkópok jöhetnek számításba, amelyeknél a gyártó garantálja a z-irányú precíz, csúszásmentes működést. Mi a laboratóriumunkban a 6-os
ábrán
látható
speciálisan
felszerelt
fénymikroszkópot használjuk. 6. ábra: Olympus BX50 fénymikroszkóp
Ezen kívül a mikroszkóp megvilágító egysége alkalmas legyen a megfelelő erősségű és minőségű fény biztosítására. Általában 100W teljesítményű halogén izzóval ellátott mikroszkópban a sötét területek is megfelelően átvilágíthatók. A mikroszkóp alkalmas legyen motorizált tárgyasztal és z-motor befogadására. Továbbá
szükség
van
a
mikroszkópra
szerelhető
digitális
kamerára
is.
Laboratóriumunkban Microfire by Optronics típusú kamerát használunk (8.a. ábra), amelynek nagy
képfelbontása
és
fényérzékenysége
alkalmas
ozmifikált
metszeteink
és
szeletpreparátumaink megjelenítésére. A kamera kép megjelenítéséhez 22”-os LCD monitort használtunk, amelynek nagy fényereje és felbontása lehetővé tette a metszetről kapott finom képi részletek megkülönböztetését.
15
6.1.2. Objektív választás A rekonstruálást 100x olaj immerziós objektívvel végezzük, amely lehetővé teszi, hogy a legvékonyabb axonokat is biztonsággal felismerjük. További fontos szempont, hogy az objektív minél nagyobb numerikus apertúrával rendelkezzen, valamint a munkatávolsága összhangban legyen a preparátum vastagságával. Ebből a szempontból a szeletek rekonstruálás igen kényes, mert csak a legjobb minőségű objektívek képesek a felszíntől 200 μm-nél mélyebb fókuszálásra (7. ábra).
7. ábra: Az általunk használt Olympus UPlanFL N 100x/1.30 oil 0.17/FN26.5 objektív
6.1.3. Motorizált tárgyasztal, komputer interface, rekonstrukciós program
Az egyik legfontosabb technikai kellék a 3-dimenziós rekonstrukciós munkához a megfelelően megválasztott motorizált tárgyasztal. A tárgyasztal léptetése precíz mechanikát és megbízhatóságot igényel. Laboratóriumunkban a német Merzhauser (Wetzlar) és amerikai gyártmányú Ludl Electronics tárgyasztalokat használtuk, amelyek z-irányú léptetőmotorral is ki vannak egészítve (8.b. ábra). Ezen motorok precizitása 0.01 μm léptetést is lehetővé tesz, amely megfelelő térbeli feloldást biztosít a fénymikroszkópban látható vékony jelölt axonok és boutonok méretének (axon vastagság, tipikusan 0.1-1 μm) hű rekonstruálására. A léptetőmotorok összeköttetésben vannak egy digitális interface-el (LUDL, MC2000 XYZ), amelynek feladata a komputerrel történő adatkommunikáció (RS232 port) végrehajtása.
16
8. ábra: A laboratóriumunkban használt mikroszkóp speciális alkatrészei: a. digitális kamera, b. motorizált tárgyasztal A neuron rekonstrukciókhoz a Neurolucida 8.0 programot használtuk, amely mind PC mind McIntosch platformon fut. Ez a rajzolóprogram a MicroBrightField Bioscience, (Willinston, VT, USA) cég terméke és jelenleg világszerte a legelterjedtebb neuron rekonstrukciós program (9. ábra). A tárgyasztal és a z-motor mozgását az interface-hez csatlakozó joystick-kel vezéreltem, míg a képernyőn látható struktúrák követését és digitalizálását a PC-hez csatlakozó egér és billentyűzet segítségével. Az egér célkeresztjét a képernyőn látható struktúra éles képe fölé helyezve pontról pontra követtem a jelölt struktúrákat. Az egér gombjának minden egyes lenyomásával a célkereszt aktuális helyzetét rögzítette a program. Ez tartalmazta a pont térbeli koordinátáit (x, y, z), az adott ponthoz tartozó vastagságot, és a pont típusát (axon kezdete, axon vége, elágazási pont stb.). Ezen kívül a Neurolucida program szöveg elhelyezését is lehetővé teszi, amely segíti komplex rekonstrukción belüli tájékozódást.
9. ábra: A Neurolucida (MicroBrightField) oldala 17
6.1.4. A sorozatrekonstrukció megtervezése A 3-dimenziós rekonstrukció megkezdése előtt tervet készítettünk az alábbi lépések szerint: •
tájékozódtunk, hogy a kiválasztott és jelölt sejt nyúlványrendszere hány metszetben volt megtalálható, milyen volt a metszetek minősége, repedés, gyűrődés, légbuborék nem zavarja-e a sorozatrekonstrukció teljességét. A metszetek előszűrése biztosította, hogy feleslegesen ne végezzünk munkát (kiábrándító, amikor napok munkája vész el egy hiányzó metszet miatt vagy követhetetlenek az axon nyúlványok valamilyen hisztológiai hiba következtében).
•
a sorozatmetszetek számbavétele és a metszetek alakjának kisnagyítású rajza vagy digitális (scan) másolata (10. ábra) és elhelyezkedése a tárgylemezen segített a metszetek egymás utáni sorrendjének megközelítő megállapításában (lásd alább, a metszés során az egymás után következő metszetek alakban csak kis mértékben térnek el egymástól)
•
fel kellett mérni azt is, hogy megfelelő oldalukkal kerültek-e a metszetek a tárgylemezre. Amennyiben a metszetek egy része egymáshoz képest fordított felszínnel került a tárgylemeze (tükörkép), úgy a rekonstruálás során ezt szigorúan figyelembe kellett venni.
10. ábra: Macska agykérgéből származó ozmiumosan utófixált metszetek digitális másolata, mely segít a tájékozódásban és a metszetek egymás utáni sorrendjének megállapításába 18
6.1.5. A rekonstrukció során fellépő hibák A neuron rekonstrukciók során számos hiba követhető el, amelyek kiküszöbölése gondos tervezést, a Neurolucida program alapos ismeretét, az eszközök (mikroszkóp, motorizált tárgyasztal) működési tulajdonságaiban való jártasságot és nem utolsó sorban a metszetkészítés során fellépő változások számbavételét igénylik. a) Metszetekben fellépő változások, amelyek a rekonstrukciót befolyásolják
Az idegszövet mintát, amelyben a jelzett idegsejtek találhatók fixáló szerben tartósítani kell (lásd transcardiális perfúzió), hogy a membránok és egyéb sejtalkotó organellumok a lehető legjobban megőrizzék eredeti szerkezetüket. A fixáló szerek kivétel nélkül szöveti zsugorodást okoznak, amit figyelembe kell venni a rekonstrukciók végleges méretének meghatározásakor (skálázás). További szövetzsugorodás lép fel a dehidrálási lépések során is és ezek eredője nem szükségszerűen egyenlően hat a metszet különböző helyein és különböző irányban. Általában elfogadott, hogy az idegszövetben a myelinizált területek, így a fehérállomány nagyobb zsugorodási együtthatóval bír, mint a szürkeállomány. További zsugorodási egyenlőtlenség léphet fel a metszetek preparálása során használt vegyszerek révén, amelyek különböző mértékű zsugorodást okozhatnak. Például a DAB (3,3’-diaminobenzidin-4HCl, Sigma), mint kromogén is képes lokálisan zsugorodást okozni szemben azokkal a területekkel, ahol kevesebb a jelölt struktúra. Ezért a metszetzsugorodás ritkán homogén eloszlású. Továbbá a szomszédos metszetek zsugorodásában is lehet eltérés annak ellenére, hogy ugyanazon eljárást alkalmazzuk. Például, közismert, hogy a metszetek hajlamosak kitapadni sima felületekre. Ilyen felület lehet az immunhisztokémiai során használt üvegedény fala. Kitapadás esetén a reagens kevésbé hat a kitapadt felületen szemben a szabad felülettel, ami kihat a zsugorodásra. Ezért külön hangsúlyt fektettünk a metszetkitapadás megakadályozására (reagens agitáció) valamennyi immunhisztokémiai lépés során. További nehézséget okozhat a rekonstrukció során a metszetekben található mechanikai sérülések, törés vagy legrosszabb esetben metszet vesztés (sorozatrekonstrukció esetén ez utóbbi nem megengedett).
19
b) A metszetzsugorodás mértékének meghatározása
A metszetzsugorodás abszolút mértékének meghatározása összetett feladat. Ez esetben az in vivo szituációhoz képest kell megmérni a rekonstruálandó struktúrában végbement zsugorodást. Kísérleteinkben ezt igyekeztünk megvalósítani. Mivel a szelet preparátumokat (11.a,b ábra) dekapitálást követően nyerték, feltételezzük, hogy az életben tartott szeletek az in vivo helyzethez képest nem zsugorodtak. Ezért a szeletekben elhelyezett elektródok helyzete felhasználható a zsugorodás mérésére. A zsugorodási faktort az elektródok in vitro egymástól mért távolságának ismeretében és ugyanezen elektródok tárgylemezen mért távolságának ismeretében tudjuk kiszámítani. A kettő hányadosát (tárgylemezen mért/ in vitro mért érték) zsugorodási faktornak nevezzük, szeletekre 0.98 körüli érték adódott. Fontos megemlíteni, hogy az svájci laboratórium által használt fedőanyag (mounting medium, IMMCO) vizes bázisú, így a szeletek dehidrálás nélkül voltak lefedhetők. Ezért úgy kezeltük az agyszeleteinket, amelyek minden irányban (x, y, z) hasonló zsugorodást mutatnak szemben az olyan szeletekkel, amelyeket a tárgylemezre rászárítanak.
11.a. ábra: Patkány somatosensoros kérgéből származó, 300 µm vastag, sagittális síkban készült agyszelet. Betűk jelölik az intracelluláris jelölőanyaggal (Neurobiotin) jól feltöltődött és rekonstruálásra alkalmas piramissejteket.
20
11.b. ábra: A fenti piramissejtek Neurolucida rajzolóprogrammal rekonstruált, xy-síkban megjelenített képe
Ezzel szemben az ozmium-tetroxiddal kezelt és dehidrált metszeteink erőteljesebb zsugorodáson estek át. Ezeknek a metszeteknek az abszolút zsugorodását az in vivo állapotban elhelyezett agyi mikroelektródok egymástól mért távolsága és ugyanezen elektródok metszetben is azonosított nyomának mért távolsága alapján számítottuk ki, amely átlagosan 0.90 körüli értéknek adódott (Buzás et al., 1998).
6.2. Sorozatmetszetek rekonstruálásának kivitelezése
Az egyik legnagyobb kihívás a 3-dimenziós sejtrekonstrukciókban a sorozatmetszetből történő rekonstruálás. Számos szempontot kell figyelembe venni annak érdekében, hogy a végeredmény hitelesen mutassa meg az idegsejtek térbeli kiterjedését.
21
a) Metszeten belüli nyúlványok rekonstrukciója: Általában a jelölt idegsejt nyúlványai lényegesen nagyobb területen találhatók, mint ami a mikroszkóp objektívon keresztül egy látótérbe belefér. A nyúlványok követését a komputer program által vezérel motorizált tárgyasztal segítségével (léptetésével) követjük. Fontos azonban figyelembe venni, hogy a legjobb minőségű optikák is rendelkeznek hibával, amit a gyártó természetesen megpróbál csökkenteni, de 100%ban kiküszöbölni nem tud. Az egyik ilyen hibaforrás, amelyre nagyon ügyelni kell a szférikus aberráció, amely a lencse középső és perifériás része közötti és az áthaladó fény hullámhosszának függvényében változó fénytörési különbséget jelenti. A legkiválóbb optikáknál is van valamennyi eltérés az objektív lencse középső és széli tartománya között. Ezért a tárgyról kapott kép középső és széli részei között nagyításbeli különbség léphet fel, aminek „korrekciójára” egy egyszerű módszert használtunk. A rekonstruálást kizárólag az okulárban látszó terület középső egyharmadában végeztük, majd a széli részeket akár manuálisan akár a Neurolucida program automata funkcióját aktiválva középre léptettük és folytattuk a digitalizálást. Mivel ez egy empirikus módszer, rendszeres ellenőrzést végeztünk nem tolódtak-e el egymáshoz képest a távoli axonágak. Ez a fajta ellenőrzés kizárólag az xy-síkban lévő rekonstruálási eltéréseket tárja fel és ad lehetőséget a korrigálásra. A z-tengely (a metszet síkjára merőleges) mentén bekövetkező hibák felismerése sokkal nehezebb, mint az xy-síkban, mert a monitoron mindig a rekonstruált profil xy-síkú vetülete látható. A z-irányú eltérések azonosításához monitorozni kell a rekonstruált struktúrák oldalirányú vetületét, azaz akár az x- akár az y-tengelyre merőleges vetületét. Gyakorlatban egy második monitor beállítása történik, amelyen az xz vagy yz vetület van megjelenítve. Ezzel a kettős monitor megoldással egyszerre látjuk a rekonstruált 3dimenziós struktúra különböző irányú vetületeit és észre tudjuk venni azokat az eltéréseket, pl. extrém nagy ugrás a z-tengely mentén, amelyek valamilyen hibára utalnak. Hozzá kell tenni, hogy a hibák többsége a felhasználó figyelmetlenségéből szokott adódni, pl. a z-tengely kezdeti értékének megadása (referencia pont) nem történik meg és ezzel a rekonstruált axon szakasz eltolódik. A z-tengely értékének beállításával kapcsolatban érdemes megemlíteni, hogy a rekonstrukció során rendszeresen ellenőrizzük a helyes beállítási értéket. Például, a metszetünk referencia pontjához időről-időre ugrassuk a tárgyasztalt vissza és ellenőrizzük a
22
referencia pont z-értékének változatlanságát. Amennyiben kis eltérést tapasztalunk, használjuk a ”set stage Z” funkiót.
b) Rekonstrukció sorozatmetszetből Az egyik legnagyobb kihívás valamennyi neuron-rekonstrukciós munkában a sorozatmetszetből történő rekonstruálás. Ebben az esetben az idegsejt axonja és dendritnyúlványai a metszés következtében több metszetben vannak jelen (12.a,b ábra). Ezért a metszés során elvágott nyúlványokat össze kell illeszteni („match”) a szomszéd metszetben található megfelelő nyúlvánnyal. Az összetartozó nyúlványok azonosítása alapos jártasságot kíván a felhasználótól. Figyelembe kell venni, hogy a metszetek mind a metszés során mind az immunhisztokémiai lépések során fizikai változáson
mennek
keresztül,
amelyek
közül
a
legfontosabb a zsugorodás. 12.a. ábra: Macska primer látókérgéből származó 2. rétegi piramissejt fotója
12.b. ábra: Macska primer látókérgéből származó 2. rétegi piramissejt axon- fájának sorozatmetszetből rekonstruált felületi rajza. Lila vonal jelöli az axont, sárga vonal a dendriteket.
23
Azonban a nagyméretű metszetek, amint azt az előbb említettem, nem teljesen egyenletesen zsugorodnak. Ennek következtében az egyik metszetből a másik metszetben folytatódó nyúlványok illesztésekor az alábbi meggondolásokat kell szem előtt tartani. (i) Amennyiben a két szomszédos metszet között a relatív zsugorodási együttható különbsége jelentős (a metszethatáron található és áthaladó axon párok metszetenkénti távolságból kiszámítható, <0,1%), akkor érdemes ezzel az együtthatóval korrigálni. Ezzel a módszerrel a szomszédos metszetekre azonos zsugorodással tudunk számolni, így a metszetek illesztése folytatható. A korrigálás a Neurolucida programban elvégezhető, a rekonstruált metszet méretének kalibrációja az alkalmazott zsugorodási faktorral megváltoztatható. (ii) A valóságban minden metszetpárra, még az (i) pontban említett korrekció esetén is van egy reziduális hiba, amelynek mértéke néhány µm. Ez valószínűleg a metszetek egymás közötti inhomogenitásból adódik. A vágott axon és dendrit végek illesztésekor számításba kell venni, hogy a pontos illesztéshez minél több pontpárt használunk annál pontosabb lesz az illesztés a teljes axonfára vonatkoztatva. Egy illesztési pontpár megfelel ugyanannak az axon (dendrit) ágnak a vágott végének az egyik metszet felszínén és a hozzá kapcsolódó másik metszet felszínén. Két szomszédos metszet között a tekeredő axon akár 20-30 ilyen pontpárt is definiál ugyanazon a metszethatáron. Ezért a vágott axonok illesztését (ez egyben a szomszéd metszetek illesztése) egyszerre több pontpárral végezzük, mert a teljes axonra nézve az illesztések átlagos „jósága” így a legnagyobb. Gyakorlatban elegendő 2-3 pontpárral illeszteni, de ezeknek a pontpárok a kiválasztása az alábbi meggondolás szerint történik. Belátható, hogy a metszetek közötti reziduális zsugorodási eltérés következtében nem minden pontpár fog hibátlanul illeszkedik. Annak érdekében, hogy az illeszkedés az összes párra optimális maradjon a program a legkisebb négyzetes eltérés elve alapján végzi a pontkoordináták illesztését. Fontos megjegyezni, hogy a kiválasztott illesztési pontpárok ne legyenek túl közel egymáshoz. Lehetőleg azokat a pontpárokat válasszuk ki, amelyek az axon elágazási területének széle felé találhatók (ehhez az axon elágazási terület előzetes felmérése/becslése szükséges). Ellenkező esetben, túl közeli pontpárok illesztése során a kis illesztési eltérés is felnagyítva jelentkezik a tőlük távoli, az axonfa széli részein található pontpárokra. Korábbi mérések alapján 2-4 mm távolságban elhelyezkedő illesztési pontpárokra 5-10 μm pontosság elérhető (Buzás et al., 1998).
24
Általában a metszetillesztéshez legjobban az egyik metszetből a másik metszetbe áthaladó vékony struktúrák használhatók, amelyek a metszet felszínén pontszerűen jelennek meg. Minél nagy az illesztendő struktúra átmérője annál pontatlanabb az illesztés.
Adatmentés Általános érvényű, hogy a komputerbe betáplált adat először a virtuális memóriába kerül, ahonnan megfelelő utasításra a memórialemezre íródik. Amíg az adatmentés nem történik meg, addig a rekonstruált struktúra nincs biztonságban és könnyen áldozatául eshet nem várt eseménynek. Annak megelőzésére, hogy valamilyen program leállás vagy hálózati kimaradás miatt adataink elvesszenek érdemes gyakori mentést végezni. Gyakorlatban tanácsos minden 10-20 bevitt adatpont után menteni (Ctrl S).
25
7. Megbeszélés A 3-dimenziós neuron rekonstrukciók jelentősége az idegrendszer kutatásban
A digitalizált idegi struktúrák (elektronmikroszkópos sorozatmetszet profilok, fénymikroszkópban azonosított jelölt idegsejtek, traktográfok idegpályákról és teljes agyról) teljesen új dimenziót nyitottak az idegrendszer vizsgálatában. A Ramon’y Cajal által meghirdetett úton olyan mérföldkőhöz érkeztünk, amely a kor technológiai lehetőségeit felhasználva új perspektívát nyitott az idegi kapcsolatok megfejtésében. Ennek a felismerésnek az előfutárai már az 1960-as években jelentkeztek. Glaser és van der Loose (1965) voltak az elsők, akik neuron rekonstrukciós algoritmussal álltak elő és az első komputeres megoldást kínálták. Velük párhuzamosan több laboratóriumban is folytak a fejlesztések (Capowski, 1976, 1977; Levinthal et al., 1974), de csak az 1980-as évek elején születtek olyan tanulmányok, amelyek komplex neuronális rekonstrukciót közöltek a kor legmodernebb, akkor nagy kapacitású számítógépeinek segítségével (Johnson and Capowski, 1983). Az összehasonlítás kedvéért, az MTA tulajdonában álló és Budapesten a SOTE I. Anatómiai Intézetében felállított Quantimet PDP11/34 (Cambridge Instruments, UK) számítógép helyigénye még egy teljes terem volt, kapacitása és sebessége viszont egy ezrede egy mai átlagos laptopnak. Részben itt fejlesztették ki a későbbiekben piacra kerülő Neutrace rekonstrtukciós rendszer egyes funkcióit, amiben több magyar és amerikai informatikus és kutató is szerepet játszott (Capowski and Sedivec, 1981; Zsuppán, 1984). Az első publikációk még csak a dendritfák rekonstrukcióiról szóltak (Capowski and Réthelyi, 1982), az évtized közepétől már agykérgi idegsejtek bonyolult axon rekonstrukciói is napvilágot láttak (Kisvárday et al., 1985, 1987). Az azóta eltelt időszakban exponenciális emelkedés látható a digitális rekonstrukciók közlésében (13. ábra) (Halavi et al, 2012), s ez köszönhető annak is, hogy a kereskedelemben megjelenő rekonstrukciós rendszerek egyre inkább félautomata rekonstrukciós megoldásokat kínálnak (Neurolucida, MBF).
26
13. ábra: A digitális sejtrekonstrukciók közlésének exponenciális növekedése az elmúlt 15 évben (Halavi et al., 2012)
A digitalizált neuron rekonstrukciók szemben az analóg és részleges képet nyújtó kézi rajzokkal szemben szinte megszámlálhatatlan lehetőséget biztosítanak kvantitatív mérésre. Morfometriai paraméterek származtathatók, neuron modellekben ezek a paraméterek felhasználhatók, statisztikai mérések végezhetők (Buzás et al., 1998; Segev and Rall, 1998) és a vizsgálhatók a szerkezeti változások hatásai a normál és patológiás funkcióban akár kísérletesen akár modellekben. Továbbá, az adatok újra használása hallatlan előnyt jelent jövőbeli, előre nem megjósolható kutatási feladatokban. Nem utolsó sorban az adatok felhasználása a digitalizálás révén nyitottá vált, a világ bármely részéről hozzáférhető a világhálón keresztül. Ma már több publikusan elérhető digitális rekonstrukciókat gyűjtő központ létezik, ezek közül a legnagyobb a NeuroMorpho.org, (Ascoli et al., 2007) (http://neuromorpho.org/neuroMorpho/index.jsp) amelynek adattárába az utóbbi években 66 országból 7000-nél több rekonstrukció érkezett be 15 állatfajt képviselve és mintegy 50 agyterületet (Halavi et al., 2012). Erről az oldalról több mint 2 millió lehívás történt közel 100 országból. A diplomamunkámban szerepelő, és általam rekonstruált idegsejtek egy része megtalálható a fenti adattárban, nagyobbik része pedig a BlueBrainProjekt adattárában (EPFL, Brain Mind Institute, Lausanne* http://bluebrain.epfl.ch/)
27
1. táblázat: A általam rekonstruált, különböző agyterületekről származó sejttípusok adatai az elmúlt 5 évben Szövettípus
Sejttípus
Kísérleti állat
Darabszám
Somatosensoros kéreg piramissejt
patkány
kb. 160
Amygdala
patkány
15
patkány
10
Somatosensoros kéreg corticocorticalis
patkány
6
Bulbus olfactorius
mitrális sejt
patkány
6
Primer látókéreg
piramissejt
macska
3
principális sejt és interneuron
Hippocampus
interneuron
Összesen
kb. 200
Az utóbbi évek technikai fejlődése hatalmas lendületet adott a központi idegrendszer szerkezeti megismerésével foglalkozó kutatásoknak. Az agy, elsősorban az agykéreg huzalozásának megismerése egyszerre több dimenzióban is megkezdődött. Az agyi neuronális mikro
hálózatok,
amit
a
laboratóriumunkban
is
vizsgálunk
agykérgi
idegsejtek
rekonstrukcióján keresztül, ezek hálózatba rendeződése valamint az egész agyat átszelő hosszú távú pályák vizsgálata ma már elérhető a legmodernebb vizsgálódási módszerekkel. A teljes agy összeköttetéseinek ismerete (huzalozási térképe, „connectome”) a jövőbeli cél, ami remélhetőleg merőben új összefüggéseket tár fel az agy szerveződésére és működésére vonatkozólag (Svoboda, 2011). Ennek érdekében a technikai fejlesztések a régóta vágyott automatikus rekonstruálás irányában folytatódnak, amelynek vannak már hasznosítható részeredményei, de a végső céltól, a folyamat teljes automatikus tételétől még messze vagyunk (Chothani et al., 2011; 28
Türetken et al., 2011; Zhao et al., 2011). Több projekt is ennek szellemében jött létre, így pl. a Human Brain Project, a Human Connectome Project és a Mouse Brain Architectre Project valamennyien nagy reményeket fűzve az agy 21. századi felfedezéséhez.
29
8. Összefoglalás
Az idegrendszer, így az agykéreg tanulmányozását egészen az 1960-as évekig Cajal által is használt Golgi-féle ezüst-impregnációs módszer hatotta át. Azonban a Golgi módszernek adódtak hiányosságai, mégpedig, hogy a jelölés véletlenszerű, előre nem megjósolható
volt,
valamint
az
idegsejtek
nyúlványrendszerének
részleges
impregnálhatósága. Mindezek új kérdések és új eljárások bevezetését tették szükségessé. Elsődleges cél volt, olyan technikák kifejlesztése, mellyel az egyes idegsejtek összeköttetéseit teljes terjedelmében lehet vizsgálni, és ezzel párhuzamosan meghatározható az idegsejtek térbeli, 3-dimenziós paraméterei. Az 1960-as és 70-es évektől robbanásszerű fejlődést figyelhettünk meg az idegtudományban. Megjelentek az intracelluláris jelölési módszerek, amelyek során olyan jelzőanyagokat alkalmaztak, melyek az egész axon- és dendritfa megjelenítését tették lehetővé. Ezzel megnyílt az út a 3-dimenziós sejtrekonstrukciók felé. Kezdetben az analóg és részleges képet nyújtó kézi rajzokkal szemben megjelentek félautomata rekonstrukciós rendszerek (Neurolucida, MBF), melyekkel jelenleg is dolgozunk. Munkánk során megpróbálunk ezzel a rendszerrel pontos, 3-dimenziós képet adni az idegsejtek nyúlványairól, kiterjedéséről, szinaptikus kapcsolatairól. Mindehhez felállítottunk egy olyan rekonstrukciós kritérium rendszert, amelyet minden egyes idegsejt rekonstruálásnál szigorúan követünk annak érdekében, hogy a legkevesebb hibát tartalmazzák a rekonstrukciók.
30
11.Szakirodalmi jegyzék 1. Ascoli, G. A., Donohue, D. E., and Halavi, M. (2007). NeuroMorpho.Org – a central resource for neuronal morpholo-gies. J. Neurosci. 27, 9247–9251. 2. Buzás P., Eysel T. U., Kisvárday Z. F., (1998) Functional topography of single cortical cells: an intracellular approach combined with optical imaging. Brain Research Protocols 3, 199-208 3. Capowski, J. J. (1976). Characteristics of neuroscience computer graphics dis-plays and a proposed system to gen-erate those displays. Comput. Graph. 10, 257–261. 4. Capowski, J. J. (1977). Computer-aided reconstruction of neuron trees from several serial sections. Comput. Biomed. Res. 10, 617–629. 5. Capowski, J. J., and Sedivec, M. J. (1981). Accurate computer reconstruction and graphics display of complex neu-rons utilizing state-of-the-art interac-tive techniques. Comput. Biomed. Res. 14, 518–532. 6. Chothani, P., Mehta, V., and Stepanyants, A. (2011). Automated tracing of neurites from light microscopy stacks of images. Neuroinformatics 9, 263–278. 7. Gilbert, C. D., and Wiesel, T. N. (1983). Clustered intrinsic connections in cat visual cortex. J. Neurosci. 3, 1116–1133. 8. Halavi, M., Hamilton K. A., Parekh, R., Ascoli, G. A. (2012) Digital reconstructions of neuronal morphology: three decades of research trends. Frontiers in Neuroscience Vol.6, 49 9. Johnson, E. M., and Capowski, J. J. (1983). A system for the three-dimensional reconstruction of biological structures. Comput. Biomed. Res. 16, 79–87. 10. Kisvárday Z. F., Martin, K. A. C., Whitteridge, D., Somogyi P. (1985). Synaptic connections of intracellularly filled clutch cells: a type of small basket cell in the visual cortex of the cat. J.Comp.Neurol. 241, 11-137. 11. Kisvárday Z. F., Martin, K. A. C., Friedlander, M. J., Somogyi P. (1987). Evidence for interlaminar inhibitory circuits in striate cortex of the cat. J.Comp.Neurol. 260, 119. 31
12. Levinthal, C., Macagno, E., and Tountas, C. (1974). Computeraided reconstruction from serial sections. Fed. Proc. 33, 2336–2340. 13. Lopez, P. G., Marin, V. G., and Freire, M., (2010). The historical slides and drawings of Cajal. Front Neuroanat. 4:9. 14. Ramon’ y Cajal, S. (1899). Estudios sorbe la corteza cerebral humana. Corteza visual Rev. Trim. Microgr., 4: 1-63. 15. Segev, I., and Rall, W. (1998). Excitable dendrites and spines: earlier theoretical insights elucidate recent direct observations. Trends Neurosci. 21, 453–460. 16. Svoboda, K. (2011). The past, present, and future of single neuron reconstruction. Neuroinformatics 9, 97–98. 17. Türetken, E., González, G., Blum, C., and Fua, P. (2011). Automated reconstruction of dendritic and axonal trees by global optimization with geometric priors. Neuroinformatics 9, 279–302. 18. Zhao, T., Xie, J., Amat, F., Clack, N., Ahammad, P., Peng, H., Long, F., and Myers, E. (2011). Automated reconstruction of neuronal morphology based on local geometrical and global structural models. Neuroinformatics 9, 247–261. 19. Zsuppán, F. (1984). A new approach to merging neuronal tree segments traced from serial sections. J. Neurosci. Methods 10, 199-204
32
