Interakce mezi rostlinami a patogenními mikroorganizmy

Výzkumný ústav rostlinné výroby,v.v.i. Praha 6 - Ruzyně

Interakce mezi rostlinami a patogenními mikroorganizmy

5. odborný seminář 15.11.2007.

Obsah 2-7 8-11 12-15 16-18 19-21 22-24 25-27 28-32 33-39 40-47 48-53 54

L. Věchet: Význam interakcí hostitel patogen a poznávací systémy v interakci hostitel-patogen. B. Kokošková: Zkušenosti s biologickou ochranou proti spále růžokvětých rostlin ve světě a v České republice A. Hanzalová: Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechs. v České republice. L. Věchet: Interakce pšenice ozimá (Triticum aestivum) a padlí travní (Blumera graminis f.sp. tritici) v infekčním procesu. V. Dumalasová, M. Fajferová, P. Bartoš: Biologické interakce mezi ozimou pšenicí a mazlavými snětmi Tilletia tritici, T. laevis a T. controversa. J. Krejčová, B. Šerá, N. Vrchotová, K. Cvrčková: Příspěvek ke studiu alelopatických vlastností netýkavek. J. Hýsek, M. Vach: Biologická interakce mezi patogeny a antagonistickými organismy u jarního ječmene. L. Věchet, L. Burketová: Indukovaná rezistence rostlin. Indukovaná rezistence pšenice k padlí travnímu Blumeria graminis f.sp. tritici. V. Šašek, B. Korbelová, L. Burketová: Antioxidační mechanismy a signální dráhy řepky aktivované při napadení Leptosphaeria maculans. M. Švec: Papilárny mechanizmus nešpecifickej rezistencie pri pšenici. D. Novotný: příspěvek k poznání endofytické mykobioty větví a listů jabloní a jejich vztahu k fytopatogenním houbám. Závěr.

1

Význam interakcí hostitel patogen a poznávací systémy v interakci hostitelpatogen. Lubomír Věchet Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně e-mail: [email protected] Když rostlina a patogen přicházejí do vzájemného kontaktu, vytvářejí se mezi těmito dvěma organizmy těsné komunikace (Hammound-Kosack & Jones, 2000). Téměř každá interakce hostitel-patogen je jedinečná v jednotlivostech vzájemného kontaktu, to je v aktivaci, lokalizaci, časovém rozvržení a velikosti obranných reakcí. Aktivity patogena směřují na kolonizaci hostitele a k využití jeho zdrojů, zatímco rostliny jsou adaptovány ke zjištění přítomnosti patogenů a k reakci na antimikrobiální obranu a ostatní stresy. S jakými překážkami se může patogen na své cestě k infekci hostitele setkat ukazuje schéma (Obr. 3), které bylo vytvořeno pro interakcí Uromyces vignae a náchylného hostitele. Obr. 3. Průběh infekce patogena na rostlině. Heath (2004); (úprava Schwarzbach, 2004).

Některé z uvedených obranných reakcí, ač diferencovaně účinné vůči patotypům, mohou být součástí výbavy tzv. nehostitelské rezistence k jiným patogenům téhož hostitele, např. jiné formae specialis. Po infekci rostliny patogenem jsou aktivovány časné lokální obranné reakce a zpožděné systémové reakce proto, aby působily proti napadení patogenem (Bülow et al, 2004). Mezi časné lokální reakce patří hypersenzitivní reakce (HR), která vede k místnímu programovanému odumření buňky rostliny, aby zbavila patogena jeho výživového základu (Greenberg, 1997; Pontier et al., 1998). Tato strategie ochrany (zejména úspěšná k biotrofním bakteriím a fotopatogenním houbám stejně jako k virům) je založena na poznání patogena a na komunikaci buňky patogena s buňkou hostitele v tkáni přilehlé k místu infekce (Thomma

2

et al., 2001). Později mohou rostliny vyvinout systémově získanou rezistenci (SAR), vedoucí k rezistenci v celé rostlině a to v nespecifickém způsobu směrem k širokému spektru patogenů. V případě SAR je signál přenášen z infikované tkáně do celé rostliny k indukci souhrnného projevu obranného genu (Ryals et al., 1994). To ukazuje, že pro rostliny jsou nezbytné signální vnímání v počátečním poznání patogena a signální transdukce ke spuštění dalších obranných reakcí, aby působily proti fytopatogenům (Nűmberger and Scheel, 2001). Zda je rostlina náchylná nebo rezistentní k infekci záleží na mnoha nepatrných interakcích mezi molekulami tvořenými rostlinou a molekulami tvořenými patogenem. Lyon (2002) uvádí, že znalost příslušných molekulárních interakcí může být rozdělena do dvou skupin založených na informaci o „patogenem odvozených molekulách“ a informaci o „rostlinou odvozených molekulách“. Patogenem odvozené molekuly. Patogeni vlastní avirulentní geny, jejichž produkty souvisí s určující specifitou hostitele. Patogeni mohou vlastnit hrp geny (gen odpovědný za hypersenzitivní reakci a patogenitu), jejichž produkty jsou spojeny s indukcí hypersenzitivních reakcí u rostlin. Nekrotorfní patogeni produkují široký řadu extracelulární enzymů, umožňující jim vstoupit do rostlinných buněk prostřednictvím odbourávání polymerů buněčné stěny. Mnoho těchto extracelulárních enzymů existuje jako izoenzymy (enzymy s geneticky odlišnou primární strukturou, produkované jedním organizmem a vykazující stejnou substrátovou a účinkovou speicifitu. Mezi sebou se liší fyzikálně-chemickými parametry, funkčními vlastnostmi, buněčnou lokalizací nebo distribucí mezi tkáněmi). Mikrobiální proteázy mohou degradovat proteiny buněčné stěny spojené s rezistencí. Bitrofní patogeni tvoří velmi málo extracelulárních enzymů, ve srovnání s nekrotrofy. Patogenní houby vlastní kutinázy, které jim umožňují penetrovat kutin na povrchu rostlin. Fytopatogenní bakterie nevlastní kutinázy a mohou vstoupit pouze skrz přirozené otvory, jako např. stomata nebo poranění. Někteří patogeni tvoří fytotoxiny zamezující koordinovaným způsobem rezistenci k infekci. Fytotoxiny mohou být specifické (působící na řadu hostitelů patogena) nebo mohou být nespecifické (působí na rostliny mimo řadu hostitelů patogena). Houboví patogeni jsou obecně schopni rychle degradovat fytoalexiny tvořené hostitelskou rostlinou, zatímco degradeace fytoalexinů z nehostitelských rostlin je velmi pomalá. Je málo důkazů o degradaci fytoalexinů bakteriemi. Rostlinou odvozené molekuly Rostliny vlastní geny rezistence, které jsou specifické k patogenu a jsou obecně neefektivní proti ostatním patogenům. To naznačuje velmi specifickou signální reakci mezi produktem genu avirulence tvořeným patogenem a produktem genu rezistence (receptorem – příjemce. Bílkovina, nejčastěji v membráně, která specificky váže určitou látku z prostředí. Tato vazba v nich vyvolá změnu, jež má za následek biologickou odpověď buňky) v rostlině. Na povrchu každé buňky rostliny bude mnoho kopií receptoru. Projev genů rezistence může být modifikován ostatními geny rostliny. Zdá se, že produkty genu rezistence mají několik společných charakteristik, které zahrnují oblasti membrány a leucinem bohatých opakování (ty jsou často spojeny s proteiny zahrnutými ve spojení protein/protein). Rostliny obsahují proteiny, jež mají schopnost inhibovat enzymy, jež odbourávají buněčnou stěnu. Umění rostliny poznat patogena je tedy klíčovým problémem, který určuje, zda rostlina bude napadena, či nikoliv. Rezistence k chorobě tedy závisí na schopnosti rostliny poznat patogena brzy v infekčním procesu a na dostupnosti účinných intercelulárních signálních systémů, které spouští rezistentní reakce. V procesu poznání jsou klíčové geny rezistence

3

rostliny. Ty kódují receptory, které jsou schopny vzájemně reagovat se specifickými, to je odpovídajícími proteiny získanými z patogena. Interakce mezi rostlinou a patogenem se mohou vyvinout dvěma způsoby: 1. Rostlina je opatřena receptorem, který vzájemně reaguje s proteinem patogena. Výsledkem je vytvoření rychlé obranné reakce. V takové situaci je bakterie nazývána avirulentní pro daný patotyp rostliny (Piffanelli et al., 1999; Martin, 1999). 2. Proteiny patogenního organizmu jsou pro daný genotyp virulentní. Rostlina je napadena patogenem, zatímco obranné mechanizmy jsou aktivovány pomaleji (Maleck a Lawton, 1998). Rostlina není vždy opatřena receptory k proteinům napadajících bakterií nebo hub. V této situaci je patogen nazývaný virulentní k danému genotypu rostliny a pár rostlina-patogen je kompatibilní. V tomto případu molekuly patogena jsou nespecifickými elicitory, což jsou nespecifické látky způsobující patogenezi. Způsoby získání signálu z nespecifických elicitorů jsou ještě málo známé. Molekuly, které v hostiteli indukují přítomnost patogena (receptory) se aktivují elicitory (metabolit patogena, který stimuluje v hostitelské rostlině produkci fytoalexinů) patogena a rychle vytvářejí vnitřní signál, jež spouští časné obranné reakce. Blumwald et al. (1998) uvádějí, že poznání mikroorganizmu buňkou rostliny záleží právě na tvorbě elicitorů patogenem. Mohou to být buď nespecifické elicitory, například fragmenty buňky houby uvolňované během infekčního procesu, které vyvolávají obrannou reakci. Ta pomáhá minimalizovat chorobu. Nebo to naopak mohou být rasově specifické elicitory, molekuly, kterými jsou zakódovány geny avirulence (Avr) v patogenu. V obou případech s počátkem přepisu (transkripcí) genu patogeneze jsou zesíleny buněčné stěny. Potom jsou v místě penetrace patogena vytvářeny aktivní formy kyslíku, způsobující odumření infikovaných buněk. Rezistence tedy zahrnuje specifické poznání napadajícího patogena dominantním nebo semi-dominantním produktem genu rezistence (R). Tento typ interakce vychází z teorie gen proti genu, kde pro každý gen, který uděluje rezistenci hostitele, existuje odpovídající gen v patogenu, jenž odpovídá jeho virulenci. Interakce mezi (R) geny rezistence k chorobě u rostlin a jejich odpovídajících genů avirulence (Avr) jsou klíčem k určení, zda je rostlina náchylná nebo rezistentní k napadení patogenem. V rezistentních reakcích rostlin k patogenům hrají hlavní roli signály a signální transdukční kaskády. Poznání patogenem odvozených signálů indukujících rezistenci (elicitorů) se může vyskytnout na povrchu rostlinné buňky skrz nachystané receptory. Jinak řečeno, patogen exportuje elicitor do buněčné cytoplazmy, kde jeho poznání vyžaduje určité místo. Vazba elicitoru aktivuje receptor nebo komplex receptorů a výsledek je nazýván efektor (látka ovlivňující tvorbu proteinu), který může být defosforylován (slučovat se s kyselinou fosforečnou). Následně je pak vnímaný signál transdukován prostřednictvím signální kaskády, která končí ve fyziologických reakcích jež kulminují do rezistentní reakce. Lokalizace infekce je pak jedním z výsledků těchto obranných reakcí rostliny. Poznání patogenů rostlinou je tedy zprostředkováno velkou řadou vysoce polymorfních (mnohotvárných) R genů (Dangl & Jones, 2001; Jones, 2001). Produkty těchto genů fungují při poznání přímých nebo nepřímých produktů patogenem kódovaných Avr genů (Nimchuk et al., 2001). Většina identifikovaných R genů rostliny kóduje intracelulární proteiny, které obsahují předpověděné vazební místo nukleotidu, následované řadou leucinem bohatých opakováních (LRR-leucine rich repetition), na jejich konečných místech určení (Xiao et al., 2001). Studie proteinů rezistence naznačily, že vysoce proměnlivé LRR domény určují poznání Avr produktů patogena (Dodds et al., 2001; Ellis et al., 1999; Jia et al., 2000). Patogenní mikroorganizmy se přizpůsobí svojí infekční strategií změnám získaným z místa jejich hostitele. Rostliny na druhé straně mají, aby přežily, vyvinuty mechanizmy rezistence ve svém vývojovém procesu. Předpokládá se, že u patogena geny patogenity kódují proteiny

4

sounáležitě do dvou funkčních skupin, regulační proteiny a efektory ovlivňující tvorbu proteinů. Ty prvně jmenované, regulační proteiny, mohou být zahrnuty v regulování aktivity genů hub a proteinů, zatímco efektory ovládají rostlinné procesy ve prospěch patogena. Rostliny jsou neustále konfrontovány se širokou rozmanitostí potencionálních patogenů v jejich prostředí. Nicméně vývoj choroby je spíše výjimka, než pravidlo a to následkem vysoce účinných, přírozeně koordinovaných systémů pasivní a aktivní obrany, které se v rostlinách vyvinuly. Podle Franka (1994) každý hostitel může poznat a odolávat pouze podskupině parazitů a každý parazit může růst pouze na konkrétních hostitelích. Biochemické poznávací systémy určují, které odpovídající genotypy hostitele a parazita končí v rezistenci nebo v chorobě. Poznávací systémy jsou často spojeny se všeobecným genetickým polymorfizmem v populaci hostitele a parazita (Obr. 4). Výsledkem vzájemného vztahu hostitel-patogen jsou také změny Obr. 4. Funkce poznávacích systémů patogena a hostitele. Michelmore & Meyers (1998); (úprava Věchet, 2006).

ve vývoji patogena. Některé obranné reakce hostitelské rostliny mohou patogena přinutit zastavit vývoj. Tak například u obligátních patogenů obilnin, jako jsou rzi a padlí travní je takovým klíčovým vývojovým stádiem tvorba haustoria. Niks (1986) a Niks & Rubiales (2002) definovali tzv. pre-haustoriální rezistenci u částečné rezistence - nespecifická rezistence (Obr. 7), která je založena na vysoké rychlosti neúspěšné tvorby haustoria. Naopak post-haustoriální rezistence - specifická rezistence (tzv. hypersensitivní), je vyvolána až potom, co patogen vytvořil haustorium v buňce rostliny. Rostliny používají rozsáhlou řadu signálů, které pocházejí z mikroorganizmů a z prostředí, aby poznaly patogeny a vyvolaly obranné reakce. Nespecifické elicitory (molekula tvořená hostitelem, která indukuje reakci na patogena. Opačně, elicitory (může být tvořen patogenem, 5

vyvolávající reakci v hostiteli) biotického nebo abiotického původu indukují obrany hostitele v širokém sortimentu druhů. Abiotické elicitory (náleží k fyziologickým a anorganickým komponentům, tak jako těžké kovy nebo UV záření) mohou indukovat stresové reakce ve vystavených tkáních, které obstarají další bariéry k napadajícím patogenům nebo jinak zvýší náchylnost rostliny k infekci. Biotické elicitory indukují fragmenty buněčné stěny uvolněné z hub a bakterií, hydrolytické enzymy rostlinného nebo patogenního původu, nějaké peptidy, glykoproteiny a plynenasycené mastné kyseliny. Tyto elicitory indukují obranné reakce v řadě hostitelských druhů. Často nespecifické elicitory aktivují obecný náznak toho, že buňka byla nějakým způsobem poškozena (např. uvolnění fragmentů buněčné stěny hostitele může elicitovat obranné reakce). Literatura Bülow L., Schindler M., Choi C., Hehl R. (2004): PathoPlant®: A Database on Plant-Pathogen Interactions. In Silico Biology 4, 0044; ©2004, Bioinformation Systems e.V. Dangl J. L., Jones J. D. G. (2001): Plant pathogens and integrated defense response to infection. Nature 411, 826-833. Dodds P. N., Lawrence G. J., Ellis J. G. (2001): Six amino acid changes confined to the leucine-rich repeat β-strand/β-turn motif determine the diference between the P and P2 rust resistence specificities in flax. Plant Cell 13, 495-506. Ellis J. G., Lawrence G. J., Luck J. E., Dodus P. N. (1999): Identification of regions in allels of the flay rust resistence gene L that determine differences in gene-for-gene specifity. Plant Cell 11, 495-506. Jia Y., McAdams S. A., Bryan G. T., Hershey H. P., Valent B. (2000): Direkt inteaction of resistence gene and avirulence gene products confers rice blast resistence. EMBO J. 19, 4004-4014. Frank, S. A. (1994): Recognition and polymorphism in host-parasite genetics. Philosophical Transaction of the Royal Society of London B 346:283-293. Greenberg J. T. (1997): Programmed cell death in plant-pathogen interactions. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 525-545. Hammond-Kosack K., Jones J. D. G. (2000): Responses to plant pathogens. In: Buchanan BB, Gruissem W, Jones RL (eds) Biochemistry and molecular biology of plants. American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md. Heath M. C. (2004): In search of durable resistance. 11th International Cereal Rusts & Powdery Mildew Conference, John Innes Centre, Norwich, UK, 22-27 August 2004. Jones J. D. G. (2001): Putting knowledge of plant disease resistence genes to work. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 281-287. Lyon G. D.: (2002): Plant/pathogen interactions at cellular level.. Programme, Scottish Crop Research Institute, Invergowrie, Dundee DD2 3DA, Scotland, UK. Maleck K., Lawton K. (1998): Plant strategies for resistance to pathogens. Curr.Opin.Plant.Biol., 9, 208-213. Martin G. B. (1999): Functional analysis of plant disease resistance genes and their downstream effectors. Curr.Opin.Plant.Biol., 2, 273-279. Michelmore R.W., Meyers B.C. (1998): Cluster sof resistence genes in plants evolve by divergent selection and a birth-and-death process. Geonome Res. 8, 1113-1130. Niks R. E.(1986): Failure of haustoria development as a factor in slow growing and development of Puccinia hordei in partial resistant barely seedlings. Physiol. Mol. Plant Pathol. 28, 309-322. Niks R. E., Rubiales D. (2002): Potentially durale resistence mechanisms in plants to specialised fungl pathogens. Euphytica 124, 201-216.

6

Nimchuk Z., Rohmer L., Chang J. H., Dangl J. L. (2001): Knowing the dancer from the dance: R-gene products and their interactions with other proteins from host and pathogen. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 288-194. Nűmberger T.; Scheel D. (2001): Signal transmission in the plant immune response. Trends Plant Sci. 6, 372-379. Piffanelli P., Devoto A., Schulze-Lefert P. (1999): Defence signalling in cereals. Curr.Opin.Plant.Biol., 2, 295-300. Pontier D.; Balague C.; Roby D. (1998): The hypersensitive response. C. R. Acad. Sci. III, Sci. Vie 321, 721-734. Ryals J., Uknes S., Ward E. (1994): Systemic acquired resistence. Plant Physiology 104, 1109-1112. Thomma B. P.; Penninckx I. A.; Broekaert W. F.; Cannue B. P. (2001): The complexity fo disease signaling in Arabidopsis. Curr. Opin. Immunil. 13, 63-68. Xiao S., Ellwood S., Calis O., Patrick E., Li T., Coleman M., Turmer J. G. (2001): Broad spektrum powdery mildew resistence in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science 291, 118-120. Toto řešení bylo podporováno Výzkumným záměrem VÚRV č. 0002700602.

7

Zkušenosti s biologickou ochranou proti spále růžokvětých rostlin ve světě a v České republice. Blanka Kokošková Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně e-mail: [email protected]

Bakteriální spála růžovitých rostlin, jejíž původce je bakterie Erwinia amylovora, patří k nejvýznamnějším chorobám kulturních rostlin. V mnoha státech je patogen uveden na seznamu karanténních škodlivých organismů, Českou republiku nevyjímaje. První výskyt původce spály na našem území byl potvrzen v roce 1986. V současné době je choroba rozšířena již na celém území státu. Spála představuje závažnou hrozbu pro některé dřeviny čeledi růžovitých, zejména náchylné odrůdy jádrovin jako je jabloň (Malus sp.), hrušeň (Pyrus sp.), kdouloň (Cydonia sp.) a některé okrasné nebo divoce rostoucí dřeviny, především hloh (Crataegus sp.), skalník (Cotoneaster sp.), jeřáb (Sorbus sp.), aj. Po proniknutí spálové bakterie na naše území byly vypracovány a systematicky uplatňovány metody integrované ochrany tak, aby zabránily jejímu šíření a omezily její škodlivost. Snahou bylo předejít poklesu produkce jádrovin v hodnotě mnoha milionů Kč ročně a zamezit odumírání náchylných hostitelských rostlin v letech případných epifytocií. Systém ochranných opatření proti původci spály zahrnuje také chemickou a biologickou ochranu. Chemická ochrana V chemické ochraně proti spále se uplatňují především měďnaté přípravky a antibiotika. K chemickým přípravkům na bázi mědi patří amoniakální měďnaté sulfáty, hydroxidy, oxychloridy (Copac E, Kocide 101, Champion 50 WP, Kuprikol 50, Cupravit 50) nebo sírany mědi a jejich směsi (bordóská jícha). Mezi směsné preparáty, které se ověřovaly v ochraně proti spále v ČR patřily např. Sandofan C (oxadixyl, oxychlorid mědi), Curzate K (cymoxanil, oxychlorid mědi) nebo Trimiltox forte (mancozeb, Cu). Nevýhodou měďnatých přípravků je zpravidla nižší účinnost ve srovnání s antibiotiky, případně fytotoxicita, která se projevuje zvláště u jádrovin při aplikaci na květy velmi citlivých odrůd. Průběžně se ověřují nové vývojové preparáty, avšak mnoho z nich bylo zamítnuto pro nedostatečnou účinnost nebo byly nepřijatelné z ekologického hlediska. Ve Francii byl dlouhodobě ověřován a posléze povolen přípravek Firestop (flumequin) i preparát Aliette 80 WP (fosetyl Al), používaný zvláště proti květní spále. V našich testech prokázal přípravek Aliette 80 WP variabilní výsledky, nelze ho jednoznačně doporučit. Po dlouhodobém a častém používání chemických přípravků v ovocných sadech se v populaci bakteriální mikroflóry může zvýšit počet bakteriálních kmenů rezistentních k jejich účinným látkám. Kmeny E. amylovora rezistentní k streptomycinu představují potenciální nebezpečí pro lidské zdraví. Plazmidy, zodpovědné za rezistenci k tomuto antibiotiku, se mohou snadno šířit v populacích klinicky významných bakterií. V USA byly v mnoha komerčních sadech izolovány kmeny E. amylovora rezistentní k streptomycinu i oxytetracyklinu. První kmen v USA s rezistencí k streptomycinu byl zjištěn už na počátku 70. let minulého století v těch sadech jádrovin, kde byl streptomycin běžně aplikován od 60. let. V zemích EU je použití antibiotik proti spále růžovitých rostlin zakázáno.

8

Počátky biologické ochrany ve světě Biologická ochrana eliminuje zmíněné nevýhody. Nejvíce zkušeností s biologickou ochranou proti původci spály mají Američané. Již v polovině minulého století se zjistilo, že jisté saprofytické bakterie izolované spolu s E. amylovora z rostlinných pletiv hostitelských rostlin spály mají určité inhibiční vlastnosti vůči patogenu. Předmětem zájmu výzkumu byly od té doby antagonisticky působící žluté saprofytické bakterie, které byly později identifikovány jako bakterie druhu Erwinia herbicola, dnes zařazené do druhů Pantoea agglomerans a Pantoea dispersa. Biologická ochrana založená na antagonistických vlastnostech některých kmenů těchto druhů bakterií vykazuje proměnlivou účinnost, nicméně se považuje za slibnou alternativu chemické ochrany. Mechanismy účinku působení antagonistů Vzájemné interakce mezi původcem spály a antagonistickými bakteriemi jsou ovlivněny mnoha faktory. Základními mechanismy účinku antagonistů proti patogenu je produkce antibiotik působících inhibičně na spálovou bakterii a kompetice o živiny. Dále k nim patří schopnost antagonistických bakterií osídlovat a pomnožovat se na povrchu hostitelských rostlin i okyselovat živné prostředí a tím omezovat růst bakterie E. amylovora. Inhibičně působící látky produkované antagonistickými bakteriemi, tzv. bakteriociny, se někdy z antagonistů extrahují a používají se v ochraně proti spále místo živých bioagens. Nejúčinnější antagonistické kmeny původce spály V USA se dlouhodobě ověřuje účinnost několika bioagens na bázi Pantoea agglomerans, P. dispersa a Pseudomonas fluorescens. K nejperspektivnějším antagonistům patří kmen Pf A506, který se vyznačuje mimořádnou vitalitou a výraznými inhibičními vlastnostmi proti bakterii E. amylovora. Preparát na bázi antagonistického kmenu Pf A506 byl v USA registrován pod názvem BlightBan A506 již v roce 1966 a od té doby je komerčně využíván v sadech jabloní a hrušní v mnoha zemích, především však v USA. Nejlepších účinků se dosáhne, je-li preparát aplikován v období raného kvetení jádrovin. Kmen PfA 506 potlačuje nejen původce spály růžovitých rostlin, ale také původce mrazových škod, nukleačně aktivní kmeny bakterie Pseudomonas syringae a různé saprofytické bakterie. Kmen PfA506 neprodukuje antibiotika, ale potlačuje růst patogena na základě kompetice o místo a živiny. Nevýhodou kmenu Pf A506 je rezistence k streptomycinu i oxytetracyklinu a proto jeho používání pravděpodobně umožňuje vznik a šíření dalších bakteriálních kmenů rezistentních k těmto antibiotikům v mikroflóře rostlin. Druhý nejznámější antagonistický kmen je kmen EhC9-1, srovnatelný v účinnosti proti spále s kmenem PfA506 i streptomycinem. Uvádí se, že obě bioagens redukují infekci spály přibližně o 40-60 %. Další známé antagonistické kmeny patří k druhu Pantoea agglomerans nebo P. dispersa. Jejich inhibiční účinek je založen kromě kompetice o živiny také na produkci bakteriocinů, působících toxicky vůči bakterii E. amylovora. V posledních letech se začaly používat směsi antagonistů s různými mechanismy účinku, což se ukázalo jako výhodnější než jednotlivé antagonistické kmeny. Účinnost směsí antagonistů bývá o 20-30 % vyšší než samotných kmenů. Rostlinné extrakty Ověřuje se také možnost využití rostlinných extraktů, které kromě přímého účinku proti patogenu mohou vyvolat u ošetřených rostlin i projevy tzv. indukované rezistence. V testech in vitro jsme v posledních letech ověřovali potenciální účinnost rostlinných esenciálních olejů 9

z 34 různých aromatických rostlin. Rostlinné extrakty z Origanum compactum, O. majorana a Thymus vulgaris prokázaly velmi silný účinek proti spálové bakterii. Avirulentní kmeny E. amylovora V ochraně proti spálové bakterii se využívaly také avirulentní kmeny E. amylovora, které se ukázaly perspektivní zvláště při preventivní aplikaci, neboť se pomnožovaly zpravidla pomaleji než virulentní kmeny. Formy aplikace biopreparátů Běžná forma aplikace bioagens se uskutečňuje postřikem v době na počátku kvetení. Používají se minimálně dvě aplikace v týdenních intervalech, první v době, kdy rozkvetlo cca 25 % květů. Úspěšnost ošetření ovlivňují vlhkostní a teplotní podmínky v době aplikace bioagens a krátce poté. Suché a chladné počasí je nevhodné pro rozvoj antagonistických kmenů a úspěch za těchto podmínek prostředí nebývá zaručen. V USA se dlouhodobě využívají včely jako vektory bioagens, které roznášejí antagonistické kmeny formou lyofilizovaného prášku přímo do nakvétajících květů jabloní či hrušní v ovocných sadech. Tento způsob ošetření má řadu výhod, zvláště ekonomický efekt, neboť nedochází k ztrátám bioagens jako při aplikaci postřikem. V květech ošetřených směsí účinných bioagens prostřednictvím včel byla prokazatelně zjištěna nižší populace bakterie E. amylovora než v květech neošetřených. Výzkum chemické a biologické ochrany proti spále v ČR Výzkumné cíle zaměřené na chemickou a biologickou ochranu v ČR zahrnovaly selekci antagonistických bakterií proti původci spály v podmínkách in vitro, ověření účinnosti vybraných chemických přípravků a perspektivních antagonistických bakteriálních kmenů na hostitelských rostlinách spály ve skleníku a technickém izolátoru a porovnání jejich účinků s perspektivou využití v ovocnářství. Ve všech našich pokusech byl streptomycin použit jako standard, ačkoliv se nepředpokládá, že by byl registrován v ČR. Testování potenciálních antagonistů Pro selekci antagonistických kmenů produkujících bakteriociny se osvědčila metoda agarových ploten kontaminovaných bakterií E. amylovora. Touto metodou byla z celkového počtu více než 1000 ověřovaných bakteriálních izolátů zjištěna antibióza vůči bakterii E. amylovora přibližně u 50 % kmenů. Z celkového počtu testovaných izolátů 15 % dosahovalo nebo převyšovalo účinnost streptomycinu, až dosud nejúčinnějšího preparátu proti spálové bakterii, který byl používán. Celkem bylo vybráno kolem 200 antagonistických kmenů, které byly dále detailně testovány. Antagonistické kmeny bakterií byly izolovány z různých hostitelských rostlin, převážně z hlohu. Četnost výskytu těchto kmenů neměla spojitost s hostitelským původem. Determinačními biochemickými a sérologickými testy byly kmeny identifikovány jako Erwinia herbicola (nyní Pantoea agglomerans a Pantoea dispersa). Pro selekci potenciálních antagonistů, jejichž mechanismus účinku vycházel z jiného principu než je tvorba bakteriocinů, se osvědčil test na nezralých hruškách. Do hruškového testu byly kromě kmenů produkujících bakteriociny zařazeny také vitální kmeny, jimž tato schopnost chyběla. Lze předpokládat, že takové kmeny se mohou vyznačovat výraznými kompetitivními účinky a projevit se jako účinní antagonisté v ovocných sadech. Výhodou testu byla poměrně vysoká spolehlivost umožňující rozlišení mezi různě účinnými antagonisty, což bylo v korelaci s výsledky polních testů. Nevýhodou byla nedostupnost nezralých plodů po delší časové období než je několik měsíců po sklizni při uchování

10

v běžných ledničkách. Touto metodou bylo vybráno 34 velmi účinných antagonistických kmenů (16 %), z nichž většina pocházela z hlohu. Účinnost chemikálií a antagonistů v podmínkách in vitro Byla porovnávána inhibiční aktivita proti původci spály u 10 chemických přípravků včetně streptomycinu a 10 vybraných antagonistických kmenů Pantoea agglomerans a P. dispersa produkujících v podmínkách in vitro bakteriociny. Směsné preparáty jako Sandofan C, Curzate K a Ridomil Plus 48 WP vyjma Trimiltox forte neprokázaly proti spálové bakterii dostatečnou účinnost a proto byly z dalších testů vyřazeny. Přípravek S-0208 byl přibližně o 30 % účinnější než streptomycin, zatímco přípravky Trimiltox forte, Kuprikol 50, Champion 50 WP a Kocide 101 dosáhly asi 80% účinnosti streptomycinu. Všechny antagonistické kmeny prokázaly v testech in vitro asi o 30-50 % vyšší inhibiční účinek než streptomycin, použitý jako kontrola. Účinnost chemikálií a antagonistů na hostitelských rostlinách spály V podmínkách umělé infekce ve skleníku bylo na odříznutých kvetoucích výhonech hostitelských rostlin spály ověřováno 6 různých chemických přípravků a čtyři antagonistické kmeny. Nejúčinnějším preparátem s účinností 82 % byl streptomycin následován přípravkem Aliette 80 WP. Preparáty S-0208 a Trimiltox forte prokázaly vyšší než 60% účinnost. Čtyři antagonistické kmeny měly v průměru asi 58 % účinnost proti spále. Přípravek Champion 50 WP prokázal nepatrně nižší účinnost než antagonisté, zatímco Kuprikol 50 měl nejnižší účinnost, pouze 47 %. Z výsledků vyplynulo, že účinnost antagonistických kmenů byla vyšší nebo srovnatelná s měďnatými látkami. Mezi jednotlivými hostitelskými druhy (hloh, jabloň, hrušeň, jeřáb, skalník) nebyly zjištěny průkazné rozdíly v napadení původcem spály. Spolehlivější výsledky než v klimaboxu byly získány po umělých infekcích stromů jabloní a hrušní spálovou bakterií v technickém izolátoru ve Výzkumné stanici Slaný. Nejvyšší účinnost, a to 80% prokázal streptomycin. Aliette 80 WP měl ve srovnání se streptomycinem sotva poloviční účinnost. Antagonistické kmeny byly účinnější než Aliette 80 WP, i když nedosahovaly účinnosti streptomycinu. Na jabloních prokázali antagonisté průměrnou účinnost asi 60 % a na hrušních asi 50 %. Mezi 6 testovanými antagonisty bylo možné považovat tři kmeny za perspektivní v biologické ochraně proti květní spále. Závěr Lze shrnout, že účinnost vybraných bakteriálních antagonistických kmenů byla srovnatelná s účinností většiny testovaných chemických preparátů. Antagonisté se sice nevyrovnali streptomycinu, který redukoval spálové infekce až o 80 %, ale byli účinnější než v zahraničí preferovaný preparát Aliette 80 WP. Dá se předpokládat, že biopreparáty připravené na bázi antagonistických kmenů mohou předčit měďnaté preparáty, jako např. Kuprikol 50, který je u nás jedním z nejpoužívanějších. Dedikace: projekt MZe ČR 0002700603 + 320/5305.

11

Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechs. v České republice Alena Hanzalová Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, Praha-Ruzyně 6 161 06 e-mail: [email protected] Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechs. (anam. Drechslera tritici-repentis (Died.) Shoem.), původce hnědé listové skvrnitosti na pšenici zvané ”tan spot”, je v současné době poměrně hojným patogenem v našich podmínkách. V letech 2000 - 2004 byla PTR nejhojněji izolovaným patogenem ze vzorků listových skvrnitostí pšenice pocházejících z různých lokalit v ČR (Graf 1). Její celosvětové rozšíření je přičítáno především nedostatkům v dodržování agrotechnických opatření jako je např. zaorávání posklizňových zbytků, střídání plodin, ale také zavádění bezorebných technologií a v neposlední řadě i široký hostitelský okruh patogena. Této chorobě je věnována velká pozornost především v USA a Kanadě (De Wolf et al. 1998), kde je již řadu let vážným problémem. V Evropě nabývá P. tritici-repentis (PTR) na významu teprve v posledních cca 10 letech. Symptomy Symptomy na listech pšenice způsobené P. tritici-repentis jsou v polních podmínkách na první pohled velice podobné jako u původců Stagonospora nodorum a Septoria tritici . PTR však nevytváří pyknidy na listech, čímž se liší od zbývajících dvou patogenů. Na rezistentních nebo částečně rezistentních odrůdách pšenice tvoří PTR podstatně menší léze; chlorózy a nekrózy mohou chybět. Kromě ohraničených nekrotických skvrn s tmavým centrem a chlorotickým okrajem může PTR vytvářet pouze chlorotické skvrny. Rasy a toxiny Za tvorbu nekróz či chloróz jsou odpovědné hostitelsky specifické toxiny, které patogen produkuje. V současné době jsou popsány 4 Ptr toxiny (Ptr ToxA, Ptr ToxB, Ptr ToxC, Ptr ToxD), které hrají důležitou roli v patogenezi. Geny zodpovědné za syntézu těchto toxinů jsou vzájemně nezávislé. Pro toxiny Ptr ToxA a Ptr ToxB, které jsou proteiny, byly již charakterizovány geny ToxA a ToxB. Jednotlivé PTR izoláty jsou v současné době členěny do 8 různých ras, které jsou determinovány na základě virulence/avirulence (indukce chloróz či nekróz) k testovacímu sortimentu odrůd (Strelkov et Lamari 2003). Jednotlivé rasy, až na virulentní rasu 4, produkují vždy nejméně jeden typ toxinu. Populace patogena byla studována především v Severní Americe, kde převažovala rasa 1 a 2. V ČR se jeví rasa 1 též jako dominantní, sporadicky se vyskytují rasy 2 a 4. Šlechtění na rezistenci Ochrana vůči hnědé skvrnitosti pšenice spočívá především v osevním postupu, zaorání rostlinných zbytků, na kterých může patogen přežívat, a v aplikaci fungicidních přípravků. Nejvhodnější metodou ochrany je však šlechtění rezistentních odrůd. Zdroje rezistence jsou přítomné v různých částech světa. Rezistence vůči PTR má kvalitativní nebo kvantitativní charakter. Citlivost hostitele k Ptr ToxA a Ptr ToxB je řízena dvěma nezávislými dominantními geny. Většina v současné době pěstovaných odrůd pšenice je nositelem střední rezistence vůči PTR, pouze několik odrůd vykazuje vysokou úroveň rezistence k tomuto listovému patogenu.

12

Odolnost odrůd Ve skleníkových podmínkách byla sledována náchylnost vybraných odrůd ozimé pšenice registrovaných v České republice vůči P. tritici-repentis (Graf 2). Žádná z 29 testovaných odrůd nebyla vůči PTR rezistentní. Odrůdy Clarus, Šárka a Rapsodia vykazovaly mírně rezistentní reakci. Nejvíce odrůd mělo k PTR mírně rezistentní až mírně náchylnou reakci, z hojně pěstovaných odrůd to byly např. Sulamit, Ebi, Bill, Batis, Clever. Další, pěstiteli oblíbené odrůdy, Nela, Alana, Versailles, Drifter, byly mírně náchylné k PTR a odrůda Biscay byla jako jediná náchylná. V polních podmínkách jsou odolnější pozdnější odrůdy ozimé pšenice vůči PTR než ranější odrůdy. V polních testech prováděných ve VÚRV Praha byly Vlasta a Alana rezistentní k umělé infekci PTR, odrůdy Ebi, Estica a Versailles mírně rezistentní, Šárka a Saskia mírně náchylné a odrůda Samanta byla náchylná (Graf 3). Graf 1: Procentuální výskyt původců listových skvrnitostí pšenice v letech 2000-2004 na různých lokalitách v ČR. 100%

2000

2001

2002

2003

2004

90%

výskyt ve vzorcích (%)

80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

Pyrenophora tritici-repentis (Drechslera tritici-repentis)

Phaeosphaeria nodorum (Stagonospora nodorum)

Mycosphaerella graminicola (Septoria tritici)

patogen

Graf 2: Reakce vybraných odrůd ozimé pšenice k umělé infekci P. tritici-repentis ve skleníkových podmínkách. (Stupnice hodnocení 1-5, 1=rezistentní, 5=náchylný.)

13

5

stupeň napaden

4

3

2

1

Biscay

Corsaire

Drifter

Complet

Svitava

Ilias

Caphorn

Alana

Versailles

Nela

Batis

Banquet

Karolinum

Mladka

Samanta

Darwin

Rialto

Clever

Bill

Apache

Ebi

Vlasta

Globus

Sulamit

Saskia

Rheia

Rapsodia

Clarus

Šárka

0

odrůda

Graf 3. Průměrné hodnoty AUDPC (plocha pod křivkou vývoje choroby) vybraných odrůd ozimé pšenice uměle infikovaných PTR v polních podmínkách v letech 1999-2001. AUDPC - průměr za 3 roky

700 650 600 550 500 450 400 350 300

Sa m an ta

a Sa sk i

Šá rk a

Ve rs ai lle s

Es tic a

Eb i

Al an a

Vl as ta

250

odrůda

Literatura De Wolf E. D., Effertz R. J., Ali S., Francl L. J. (1998): Vistas of tan spot research. Canadian Journal of Plant Pathology 20(4), 349-370. Strelkov S. E., Lamari L. (2003): Host-parasite interactions in tan spot [Pyrenophora triticirepentis] of wheat. Canadian Journal of Plant Pathology 25, 339-349.

14

Toto řešení bylo podporováno z prostředků NAZV 1G58083 a Výzkumného záměru MZE 0002700602.

15

Interakce pšenice ozimá (Triticum aestivum) a padlí travní (Blumeria graminis f.sp. tritici) v infekčním procesu Lubomír Věchet Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně e-mail: [email protected]

Vzájemné interakce hostitel patogen se odehrávají na buněčné úrovni. Reakce rostliny, ale i patogena ovlivňují proces infekce. Invaze hostitele biotrofním patogenem, jako je padlí travní, vyžaduje vývoj specializovaných infekčních struktur. Řada pozorování naznačila, že myšlenka spojená s počátečními stádii kontaktu houby hraje kritickou úlohu v poznání hostitele, diferenciaci patogena a úspěch infekce. V našich pokusech jsme zjišťovali tvorbu infekčních struktur padlí travního na odrůdách pšenice ozimé s odlišnou rezistencí: Kanzler – náchylný standard; Asta – geny rezistence (Pm2, Pm6); Mikon – standard s částečnou rezistencí. Pokusy byly prováděny na listových segmentech umístěných na benzimidazolovém agaru. Každá odrůdy byla infikována rasou patogena virulentní ke genům Pm2, Pm6. Infekční struktury byly sledovány ve 4. hod. po infekci (tvorba klíčků), v 17. hod. po infekci (tvorba apresoria), ve 24. hod. po infekci (pravděpodobná tvorba haustoria – nebylo sledováno), ve 47. hod. a v 71 hod. po infekci (SH - sekundární hyfa). Tab. 1. Tvorba infekčních struktur padlí travního (Blumeria graminis f.sp. tritici) na odrůdách pšenice ozimé s odlišnou rezistencí k chorobě. KANZLER ASTA MIKON 4. hod. Klíčí 18,36 8,48 14,29 17. hod. Klíčí 1,67 2,65 2,98 Apresoria 8,94 9,74 4,48 Inf. struktury 10,61 12,39 7,46 24. hod. Klíčí 1,2 1,9 0,00 Apresoria 12,05 10,96 4,32 Inf. struktury 13,25 12,86 4,32 47. hod. Klíčí 0,76 1,27 0,00 Apresoria 9,09 7,20 7,00 SH 6,82 2,97 4,00 Inf. struktury 16,67 11,44 11,00 71. hod. Klíčí 0,72 2,24 1,06 Apresoria 9,43 8,21 2,14 SH 15,22 11,20 13,86 Inf. struktury 25,37 21,65 17,03 Ve čtvrté hodině po infekci byly velké rozdíly mezi odrůdami. Nejvíce konidií klíčilo u odrůdy Kanzler, méně u Mikon a nejméně u Asta. Později, to je v 17. hod. počty vytvořených 16

infekčních struktur na jednotlivých odrůdách se velice sblížily. Tvorba apresorií byla nejnižší u odrůdy Mikon. Ve 24. hod. po infekci byly minimální rozdíly mezi tvorbou apresorií u Kanzleru a Asty, zatímco u Mikon byla tvorba apresorií podstatně nižší (méně jak poloviční) oproti jejich tvorbě na odrůdě Kanzler a Asta. Ve 47. hod. po infekci byla tvorba všech infekčních struktur nejvyšší u odrůdy Kanzler a u odrůd Asta a Mikon byla výrazně nižší. U těchto dvou odrůd došlo k poklesu tvorby apresorií a sekundární hyfy. Výrazný pokles v tvorbě sekundární hyfy byl u odrůdy Asta. U odrůdy Mikon se tvořilo více sekundárních hyf, než u Asty, ale méně než u Kanzlera. Rozdíly i když nepatrné byly mezi těmito dvěma odrůdami v tvorbě apresoria. V této hodně se u sekundárních hyf začaly vytvářet prodloužené sekundární hyfy. Tvorba infekčních struktur probíhala dále. Větší podíl měla tvorba sekundárních hyf a prodloužených sekundárních hyf, menší podíl měla tvorba apresoria a klíčení konidií. V 71. hod. byla tvorba infekční struktur opět nejvyšší u odrůdy Kanzler, nižší u odrůdy Asta a Mikon. Výrazně malý podíl tvorby apresorií byl u odrůdy Mikon, oproti odrůdám Asta a Kanzler. Podíl prodloužených sekundárních hyf byl o něco vyšší u odrůdy Mikon, než u odrůdy Asta. Nejvyšší byl u odrůdy Kanzler. U odrůdy Kanzler se v této době začaly tvořit počátky konidioforů. Výsledky pokusů ukázaly, že u odrůdy s částečnou rezistencí (Mikon) byly nižší tvorba apresorií ještě před tvorbou haustoria, jehož tvorba však nebyla sledována. Z nižší tvorby apresorií se dá odvodit i nižší tvorba haustorií. Podle Niks & Skinnes (1998) jde u částečné rezistence o prehaustoriální rezistenci, to je rezistence, která se vytváří těsně před tvorbou haustoria. Nižší tvorba apresorií u částečně rezistentní odrůdy, zde reprezentované odrůdou Mikon, byla trvalého rázu, to znamená, že byla pozorována ještě ve 47. a 71. hod. po infekci.Tvorba sekundárních hyf u této odrůdy v 71. hod. po infekci byla naopak vyšší, než u odrůdy Asta. U specifické rezistence, zde reprezentované odrůdou Asta, jde o rezistenci posthaustoriální, která funguje až po vytvoření haustoria (kolem 24. hod.), v našem případě byla detekována ve 47. hod. po infekci. Závěrem je možné říci, že napadení rostliny chorobou je určeno tvorbou infekčních struktur patogena a ta je podmíněna geneticky. Na konečné napadení mají vliv i podmínky vnějšího prostředí. Klíčení konidie padlí travního (Blumeria graminis f.sp. tritici), 4 hod. po infekci.

17

Tvorba apresoria a infekčního klíčku padlí travního Blumeria graminis f.sp. tritici), 18. hod.

Počátek tvorby prodloužené sekundární hyfy, 46 hod., na titulní straně Tvorba sekundární prodloužené hyfy padlí travního (Blumeria graminis f.sp. tritici), 50. hod.

Literatura Niks E.R., Skinnes H. (1998): Partial resistance. In: Airborne pathogens on cereals. Annual report, COST Action 817, 138-141. Toto řešení bylo podporováno Výzkumným záměrem VÚRV č. 0002700602.

18

Biologické interakce mezi ozimou pšenicí a mazlavými snětmi Tilletia tritici, T. laevis a T.controversa Veronika Dumalasová, Martina Fajferová, Pavel Bartoš

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, Praha-Ruzyně 6 161 06 e-mail: [email protected] Že žádný organismus není autonomní jednotkou a organismy se ve svém prostředí navzájem ovlivňují, je obzvláště zjevné u vztahů patogenních organismů a jejich hostitelů, jako jsou sněti rodu Tilletia na pšenici. Pokud se u biologických interakcí zaměříme na hledisko efektu, tedy prospěšnosti nebo škodlivosti, patří mazlavé sněti mezi biotrofní parazity. Složitá problematika mechanismu biologických interakcí je zatím zejména u mazlavých snětí na pšenici málo prozkoumaná. Vstup do interakce s jedním organismem ovlivňuje průběh interakcí dalších. V přítomnosti určitého patogena může dojít k oslabení, nebo naopak nastartování obranných mechanismů hostitele vůči jiným patogenům. Rostlinu dále může učinit přístupnější dalším patogenům už jen celkové oslabení napadené rostliny. U mazlavých snětí je známa také souvislost mezi napadením pšenice a sklonem k vyzimování. Interakci mazlavých snětí a pšenice předchází kontakt rostliny a patogena. Teliospory se uvolní během sklizně, při mlácení nebo pokud klasy velmi provlhnou. U mazlavé sněti hladké a mazlavé sněti pšeničné je kontakt usnadněn tím, že zdrojem inokula jsou zpravidla spory ulpívající přímo na obilkách. U sněti zakrslé jsou zdrojem infekce spory pocházející z půdy z předchozí sklizně nebo zanesené větrem. Teliospory sněti zakrslé jsou proto dlouhodobě schopné přežívat v půdě a také její produkty klíčení teliospor jsou odolnější k nepříznivým vlivům a mají větší schopnost regenerace oproti mazlavé sněti hladké a mazlavé sněti pšeničné. Napadení pšenice mazlavými snětmi je podmíněna vyklíčením teliospor v dobu vhodnou pro infekci hostitele. Spory mazlavých snětí klíčí až po uvolnění se ze soru. Klíčení inhibuje trimethylamin, možná i další endogenní složky. K infekci mazlavou snětí hladkou a mazlavou snětí pšeničnou dochází pod zemí, krátce po vyklíčení obilky, dříve než se koleoptile objeví na povrchu. Na klíčení má vliv vlhkost půdy a její teplota, optimální teplota je 5-10°C. U sněti zakrslé infekce začíná penetrací mladých rostlin infekční hyfou po vyklíčení teliospor nacházejících se na povrchu nebo blízko povrchu půdy. Infekce osivem je vzácná. Pro klíčení teliospor je důležitá stabilní dlouhodobě nízká teplota, vlhkost, a světlo; proto sněti zakrslé více vyhovují oblasti s aspoň dvouměsíční sněhovou pokrývkou. Tyto podmínky nachází sněť zakrslá pouze u ozimů, na jařinách se nevyskytuje. K absenci sněti zakrslé na jařinách přispívá také jarní dormance teliospor. Spory, které nejsou uchovávány v laboratoři, jsou od března do června dormantní. Dormanci působí dlouhé chladno a vlhko během zimy, za tepla a sucha pomíjí. Úspěšná infekce je podmíněna včasným obsazením apikálního meristému houbou před počátkem prodlužování internodií. Hyfy rostou intercelulárně a během prodlužování internodií se pohybují vzhůru spolu s apikálním meristémem. Na zasažení apikálního meristému má vliv hloubka setí a termín výsevu. U mazlavé sněti hladké a mazlavé sněti pšeničné podporuje infekci hlubší setí a nižší teploty po výsevu, prodlužující dobu potřebnou k obsazení apikálního meristému hyfami. U sněti zakrslé jsou rostliny náchylnější k infekci při mělkém setí (asi 1cm) než při hlubokém setí (6cm). Záleží zde i na stádiu vývoje rostliny, nejnáchylnější jsou rostliny na počátku odnožování, nebo dokud je odnoží jen několik málo. Po proniknutí infekční hyfy do pletiva pšenice začíná hrát roli v interakci hostitele a patogena i aktivní obrana rostliny. Mazlavé sněti a pšenice představují dobrý příklad 19

klasického systému gen proti genu (Flor 1947). Vysoká úroveň napadení se rozvine pouze tehdy, pokud existují u určitého izolátu sněti komplementární geny virulence ke všem genům rezistence, které má určitá hostitelská rostlina. Fyziologické rasy mazlavých snětí jsou dobře definovatelné na základě jejich virulence či avirulence ke genům rezistence hostitele. Tři zmiňované druhy mazlavých snětí jsou si blízce příbuzné, virulence sněti zakrslé, mazlavé sněti pšeničné a mazlavé sněti hladké je pšenicí regulovaná shodným souborem genů rezistence pšenice. Exprese některých genů rezistence je závislá na teplotě, agresivitu konkrétních fyziologických ras ovlivňuje datum výsevu pšenice. Odolnost některých odrůd klesá pokud teploty v raných fázích vývoje rostliny dosahují přibližně 10°C. Přesívky bývají náchylné při podzimním výsevu a rezistentní při setí na jaře. U nekompatibilní reakce nedochází k typickému vývoji symptomů choroby, mycelium houby je rostlinou potlačeno. Hyfy mohou být přítomny v pletivu rezistentních odrůd, neproniknou však do apikálního meristému z důvodů, které nejsou dosud dostatečně známy. Na nekompatibilní interakcí hostitel-patogen se mohou podílet obranné reakce spouštěné po aktivaci signálních drah zahrnujících kyselinu salicylovou a/nebo jasmonát. U některých odolných odrůd dochází při obranné reakci ke zvýšené expresi antifungálních proteinů. Dále byl pozorován rozdíl v up-regulaci transkriptů pro pšeničnou lipázu, chitinázu a proteinu PR1a, tedy rostoucí citlivost buňky k příslušným molekulám zvýšením počtu odpovídajících receptorů. Ns-LPTs, nespecifické lipidy přenášející proteiny mohou projevovat i antimikrobiální aktivitu. Toxicita pšeničných ns-LPTs je spojena se změnou v propustnosti houbové membrány a následném odlivu intracelulárních iontů. Také hromadění kalusu kolem pronikající hyfy během raných fází penetrace se jeví být součástí reakce hostitele na invazi, nejde však o rozhodující faktor. U kompatibilní reakce dochází k vývoji typických projevů choroby. Sporulace mazlavé sněti pšeničné a mazlavé sněti hladké začíná ve velmi mladém semeníku. Dokud se neobjeví klasy nemusí být symptomy choroby zjevné. Napadené klasy jsou tmavěji zelené a zůstávají zelené déle. Zralé napadené klasy jsou šedonamodralé. Stébla snětivých klasů mohou být zkrácená. Sory mají zhruba tvar obilky, nejsou tak kulaté jako u sněti zakrslé. Klasy mohou být deformované, ale často vypadají téměř normálně. Napadené klasy neuvolňují prašníky, pyl není životaschopný, stěny mladých semeníků jsou zelené, počet základů květů je zvýšený, vřeteno klasu prodloužené. Vyskytují se i částečně snětivé klasy a obilky. Pro sněť zakrslou je typický abnormálně vysoký počet odnoží (plus 50%) a nápadné zkrácení stébla. Teliosporogeneze začíná blízko středu mladých semeníků v době, kdy jsou asi 1,5 mm dlouhé, s růstem semeníků se hyfy šíří a tvoří se spory, je spotřebováno téměř všechno pletivo uvnitř semeníku. Modifikovaná stěna semeníku tvoří stěnu soru. Tvar soru je kulatější než obilka a může být i větší, dává tak napadenému klasu typický tvar. Prašníky se nevytvoří, pyl není životaschopný, k fertilizaci proto nedochází. Napadeny jsou běžně jen některé odnože téže rostliny. Obvykle jsou snětivé všechny, nebo téměř všechny kvítky v klase. Ale především u odolných odrůd může být napadena jen část semeníku, část klasu nebo je napadeno jen několik semeníků v klase. Napadené klasy mají obvykle zvýšený počet květních primordií. Vřetena klasů se u napadených klasů prodlužují, dobře patrné je to u kompaktního typu klasů. V důsledku napadení mazlavými snětmi se mohou tvořit také chlorotické skvrny na listech, nevznikají však vždy a u všech odrůd. Zvýšené odnožování, zakrslost a další morfologické změny napadených rostlin jsou řízeny hormony rostliny. Škodlivost mazlavých snětí z ekonomického hlediska spočívá ve ztrátách na výnosu. Napadeno může být přes 70% klasů. Sněť zakrslá redukuje výnos o 0,8% s každým 1% napadených klasů. Mazlavá sněť pšeničná a mazlavá sněť hladká o 1%, protože nezvyšují

20

tvorbu odnoží tak jako sněť zakrslá. Dále dochází k postižení kvality působící neprodejnost a potíže s využitím napadené sklizně, u sněti zakrslé se navíc zvyšují náklady na moření vzhledem k nutnosti ošetření speciálními chemickými přípravky účinnými právě k sněti zakrslé. Na nekompatibilní interakci hostitele a patogena může být založena i ochrana. Odolnost k mazlavým snětem je řízena týmiž geny pšenice, zatím bylo popsáno nejméně 15 major genů (Bt1 až Bt15), vyskytují se jednotlivě nebo v kombinacích. K určení fyziologických ras se používá soubor linií pšenice monogenních pro jednotlivé Bt geny. Kromě zmíněných 15 genů je znám gen BtZ pocházející z translokace z Agropyron intermedium užitý k ochraně před mazlavou snětí hladkou a mazlavou snětí pšeničnou v bývalém Sovětském Svazu. Kromě Bt genů jsou známy geny se slabým nebo modifikujícím účinkem, nemají zatím význam ve šlechtění. Příkladem kvalitního zdroje rezistence k mazlavým snětím je linie PI178383 pocházející z Turecka, hlavní zdroj rezistence k DB v USA, má Bt8, Bt9, Bt10 a další zatím neidentifikovaný faktor rezistence. Tato odolnost zůstala stálá 20 let, hlavně proto, že severoamerické izoláty sněti postrádají virulenci k Bt8. Z Evropy je známa rasa vysoce virulentní ke genům PI178383. Potenciál zdrojů rezistence je vždy závislý na virulenci ras sněti v určité oblasti. Odolnost může být překonána selektivním zvýšením výskytu virulentní rasy nebo vznikem nových kombinací genů virulence v populaci sněti. Proto je potřeba neustále hledat nové zdroje rezistence a inkorporovat je do kultivarů. Chemická ochrana nemusí chránit před chorobou tak účinně jako odolné kultivary. Odolnost pšenice byla využita s úspěchem v USA, kde by v některých oblastech nebyla bez odolných odrůd produkce ozimé pšenice vůbec možná, sněť zakrslou se zde podařilo redukovat na stopová množství, nevýznamná pro produkci a kvalitu. Řešení bylo podporováno z prostředků NAZV 1G58083 a Výzkumného záměru MZE 0002700602.

21

Příspěvek ke studiu alelopatických vlastností netýkavek J. Krejčová1, B. Šerá2, N. Vrchotová2, K.Cvrčková1 Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Zemědělská fakulta, Studentská 13, České Budějovice, CZ-370 05 2 Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR, v.v.i., Branišovská 31, České Budějovice, CZ370 05 e-mail: [email protected]

1

Rod Impatiens patří do čeledi Balsaminaceae a pokrývá severní polokouli a pásmo tropů. V centrální Evropě rostou tři druhy: Impatiens noli-tangere L., I. parviflora DC. a I. glandulifera Royle (Kubát et al.2002). Jsou to jednoleté byliny rostoucí na vlhčí humózní půdě. I noli-tangere (netýkavka nedůtklivá) je původním druhem osídlujícím listnaté lesy a křoviny. I. parviflora (netýkavka malokvětá) je velmi podobná předcházejícímu druhu, ale pochází z Asie a má stejné nároky jako předešlý druh. I. glandulifera (netýkavka žláznatá) pochází z Himalájí a od předcházejících druhů se liší především značnou výškou (1 – 3 m) a červenofialovými květy. Roste na březích řek, podél kterých se šíří (např. Pyšek, Prach 1994). Zatímco I. balsamina je chemicky velmi podrobně studovaná, fenolické látky v I. glandulifera, I. noli-tangere, I. parviflora jsou popsány jen velmi málo, stejně tak jako biologické vlastnosti extraktů. V nadzemních částech I. glandulifera, I. noli-tangere, I. parviflora byly identifikovány naftochinony (Lobstein et al. 2001, Šerá et al. 2005), deriváty kvercetinu (glykosidy flavonolů) a deriváty kávové kyseliny (Šerá et al. 2005). U naftochinonů (např. 2-methoxy1,4-naftochinon) jsou uváděny allelochemické a pesticidní vlastnosti (www.ars-rin.gov/duke). V současné době se řada různých rostlinných naftochinonů testuje ve farmakologii, v testech in vitro vykazují cytotoxické účinky na nádorové buňky (Babula et al. 2006a, Babula et al. 2006b). Také flavonoly a deriváty kávové kyseliny jsou biologicky aktivní látky (www.ars-rin.gov/duke). Naším cílem bylo otestovat extrakty z netýkavek na klíčivost semen a prokázat tak jejich alleopatické vlastnosti (toxicitu). Extrakty Z listů dvou druhů netýkavek (I. noli-tangere, I. glandulifera) byly připraveny tři typy extraktů: vodný, methanolový a dichlormethanový. I. parviflora byla extrahována jen vodou. 3,5 g sušených, jemně rozemletých listů bylo extrahováno 2 hod 80 ml destilované vody, methanolu nebo dichlormethanu. Extrakty byly následně filtrovány přes skleněné filtry, sediment promyt 2 x 15 ml extrakčního činidla, následovala opět filtrace. Filtráty byly spojeny a výsledný objem byl upraven na 100 ml. Testy klíčivosti Testy byly prováděny na pěti skleněných Petriho miskách pro každý typ extraktu (vodný, methanolový a dichlormethanový) a pro kontroly . Použity byly misky o průměru 9 cm a jako podklad pro klíčení tři filtrační papíry (KA4). Do každé misky bylo naneseno 6 ml extraktu nebo v případě kontrolních pokusů 6 ml extrakčního činidla (voda, methanol nebo dichlormethan). Petriho misky obsahující methanol nebo dichlormethan (jak extrakty, tak kontroly) byly ponechány při pokojové teplotě do té doby, než se z nich odpařil methanol nebo dichlormethan. Pak bylo teprve na povrch filtračních papírů naneseno 6 ml destilované vody.

22

Do každé připravené misky bylo vloženo 30 semen hořčice bílé (Leucosinapis alba L.). Pro testování každého typu extraktu (nebo kontroly) bylo použito celkem 150 semen. Misky byly uzavřeny a inkubovány 48 hod ve tmě při teplotě cca 22°C. Po ukončení inkubace byla počítána vyklíčená semena a měřeny délky jejich kořínků a hypokotylů. Získané výsledky ukazují na silnou toxicitu extraktů netýkavek na klíčivost semen hořčice bílé. V testech, kde byly použity vodné a methanolové extrakty netýkavek, většina semen vůbec nevyklíčila (Obr. 1). Délky kořínků byly také ve srovnání s kontrolními vzorky nepatrná, hypokotyl byl měřitelný jen v pokuse s vodným extraktem I.parviflora. Obrázek 1: Počet vyklíčených semen hořčice bílé po působení vodného, methanolového a dichlormethanového extraktu z netýkavek. Kontrola (K), netýkavka nedůtklivá (INT), n. žlaznatá (IG), n. malokvětá (IP). 120

100

97

96

94 83

Počet (%)

80

72

60

40 19

20 3

1

INT

IG

16 2

0 K

Voda

IP

K

INT Methanol

IG

K

INT

IG

Dichlormethan

V pokusech s použitím dichlormethanových extraktů vyklíčilo více jak 70% semen, ale délka kořínků a hypokotylů byla několika násobně menší než v kontrole (Tab.1, Tab.2). Dichlormethanové extrakty obsahují nepolární látky, které jsou ve vodě nerozpustné nebo jen málo rozpustné. Domníváme se tudíž, že tyto látky málo pronikají do semen. Tab. 2. Délky kořínků a hypokotylů u klíčících semen hořčice bílé po působení vodného a methanolového a dichlormethanolového extraktu z netýkevek. Netýkavka malokvětá (IP, netýkavka nedůtklivá (INT) a netýkavka žlaznatá (IC). Rostlinný extrakt Kořínek Hypokotyl Průměr SD Průměr SD Vodný IP 0,49 1,13 0,17 0,75 INT 0,04 0,23 0,00 0,00 IG 0,03 0,26 0,00 0,00 Methanolový INT 0,16 0,37 0,00 0,00 IG 0,02 0,14 0,00 0,00 Dichlormethanový INT 5,25 4,79 1,37 1,60 IG 4,77 5,08 1,17 1,97

23

Následující plánované pokusy na semenech jiných rostlin (např. plevelů) by mohly dát odpověď na otázku využitelnosti těchto extraktů v ochraně rostlin. Literatura Babula P., Mikelová R., Adam V., Kizek R., Havel L., Sladký Z. (2006a): Naftochinony – biosyntéza, výskyt a metabolismus v rostlinách. Česká a slovenská farmacie 55, 151159. Babula P., Mikelová R., Adam V., Potěšil D., Zehnálek J., Kizek R., Havel L., Sladký Z.: (2006b): Chromatografické stanovení naftochinonů v rostlinách. Chem. Listy 100, 271276. Lobstein A., Brenne X., Feist E., Metz N., Weniger B., Anton R. (2001): Quantitative determination of Naphthoquinones of Impatiens species. Phytochemical analysis 12, 202-205. Kubát K., Hrouda L., Chrtek J. jun., Kaplan Z., Kirschner J., Štěpánek J. [eds] (2002): Klíč ke květeně České republiky. Academia, Praha, Pyšek P., Prach K. (1994): How important are rivers for supporting plant invasions? 19-26 p., In: de Waal L. C. et al. [eds], Ecology and management of invasive plants, John Wiley & Sons Ltd, Šerá B., Vrchotová N., Tříska J. (2005.: Phenolic compounds in the leaves of alien and native Impatiens plants. 281-282 p., In: Introduction and Spread of Invasive Species, Berlin, Germany. Tato práce byla finančně podpořena grantem Ministerstva zemědělství ČR č. QH72117 a výzkumným záměrem ÚSBE AV ČR, v.v.i. č. AV0Z60870520.

24

Biologická interakce mezi patogeny a antagonistickými organismy u jarního ječmene. Josef Hýsek, Milan Vach Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně E-mail: [email protected] Biologické způsoby ošetření patří k technologiím budoucnosti, neboť po jejich aplikaci nedochází k zatížení a v některých případech až k zamoření životního prostředí. Pokud se v době aplikace biopreparátů vyskytují mikroorganismy ve zvýšeném množství v půdě, v krátkém čase pak snižují svůj počet a dostávají se do přirozené rovnováhy s dalšími mikroorganismy. Převládá-li v půdním prostředí např. houba Trichoderma harzianum (Neethling and Nevalainen, 1996), potlačující některé parazitické houby např. rodu Fusarium a není-li dodána znovu do půdy, její počet se snižuje, neboť v půdním prostředí dochází k antagonismu mikroorganismů. Další mikroby biopreparátů, např. Pythium oligandrum a Bacillus subtilis působí též antagonisticky na fytopatogenní a další mikroorganismy v půdě (Veselý, 2001). Většina fytopatogenních hub je přenášena půdou (Gaeumannomyces graminis, Pseudocercosporella herpotrichoides, Fusarium spp., Drechslera spp., Septoria spp., sněti a další) a přicházejí tak do kontaktu s antagonistickými houbami z biopreparátů, které je negativně ovlivňují a způsobují jejich redukci v půdě. Tím se snižuje infekční tlak fytopatogenních hub na růst a vývoj kulturních rostlin. Materiál a metodika Diagnostika fytopatogenních mikroskopických hub probíhá na základě stanovení morfologických znaků a to na živných médiích (Czapek-Doxův agar, sladinkový agar, Komadův agar a další specifická média), kde jsou typická zbarvení kolonií ve svrchní i spodní straně a může být měřen jejich průměr. Fytopatogenní mikroskopické houby na obilninách lze rozdělit do několika skupin: a/ houby napadající kořeny a paty stébel (Gaeumannomyces graminis, Pseudocercosporella herpotrichoides, Typhula incarnata, Rhizoctonia solani aj.), b/ houby napadající stéblo a list (rzi, sněti, padlí travní, Septoria spp., Drechslera spp., Ascochyta spp., Fusarium spp. a další), c/ houby napadající klasy (Septoria spp., Fusarium spp., padlí travní a další). Mikroskopické preparáty je třeba připravit z nepříliš starých kultur, neboť ve starších kulturách dochází k morfologickým změnám (odumírání konidioforů). Změřili jsme přesně velikost konidií, konidioforů, ev. sporangioforů a podle tvaru a velikosti jsme zařadili houbu ke známým rodům a druhům. Všechny houby lze vypěstovat též v růstových sklíčkových komůrkách na sterilních podložních sklech s jamkou jako jednosporové izoláty. Lze pozorovat vývoj houby a její růst. Houby lze určovat přímo ve vodních preparátech nebo v laktofenolu s methylenovou modří a dále zobrazit pomocí mikrofotografie, které je nutné přesně změřit v µm. Bylo sledováno nejen spektrum mikroskopických hub v půdě v průběhu vegetačního období, ale i parazitické houby na povrchu ječmene. V našich polních pokusech s jarním ječmenem, které probíhaly v letech 2005 a 2006 ve VÚRV v Praze-Ruzyni jsou zahrnuty biofungicidy české provenience. Z uvedených přípravků používáme Supresivit, založený na bázi houby Trichoderma harzianum. Obsahuje konidie antagonistické houby, které rychle klíčí, vytváří mycelium, jež osidluje prostor a zabraňuje tak v růstu patogenních hub. Dalším přípravkem je Polyversum, jehož základem je antagonistická houba Pythium oligandrum, vytvářející jak oospory, tak i zoosporangia. Třetím biofungicidem je tekutý přípravek Ibefungin, založený na sporách antagonistické sporulující bakterie Bacillus subtilis, která svými metabolity působí proti růstu fytopatogenních hub. 25

Uvedené biopreparáty byly aplikovány jednak jako suché mořidlo osiva, jednak jako hnojivo s fungicidním účinkem. Bylo tedy použito dvou způsobů jejich aplikace, tzn., že bylo sledováno působení vybraných biofungicidů homogenizovaných přímo s osivem (mořidlo) a ve druhém případě ve směsi se síranem amonným. Byla použita nemořená odrůda Akcent, dávka dusíkatého hnojení (SA) 30 kg N.ha-1 před setím a 30 kg N.ha-1 při přihnojení. Varianty polního pokusu s jarním ječmenem byly následující: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Kontrolní varianta + síran amonný Vitavax + síran amonný Vitavax + (síran amonný + Polyversum 3 g na 1 kg hnojiva) Vitavax + (síran amonný + Ibefungin 10 ml na 1 kg hnojiva) Vitavax + (síran amonný + Supresivit 1 g na 1 hnojiva) (Vitavax + Polyversum 3 g na 1 kg osiva) + síran amonný (Vitavax + Ibefungin 10 ml na 1 kg osiva) + síran amonný (Vitavax + Supresivit 1 g na 1 kg osiva) + síran amonný

Výsledky a diskuse Ze sledování a vyhodnocení polních pokusů jsme získali následující výsledky, uvedené v tabulce: Variant půda 2005 půda 2005 rostliny - povrch 2006 rostliny a 2006 1. Drechslera sp. Trichoderma sp. + hnědá skvrnitost 25% rzi 15% ++ Acremonium sp. + helminthosporiová sněti hniloba 15% mazlavé Fusarium poae + 20% 2. hnědá skvrnitost 20% rzi 15% Drechslera Fusarium sp.++ graminearum + sněti helminthosporiová mazlavé Fusarium poae + hniloba 10 % 10% Fusarium Fusarium solani oxysporum + + 3. Drechslera sp. + Fusarium hnědá skvrnitost 10 % rzi 10% helminthosporiová sněti Fusarium poae graminearum + + hniloba 10 % mazlavé Fusarium 10% oxysporum ++ 4. Drechslera sp. + Fusarium hnědá skvrnitost 10 % rzi 10% helminthosporiová sněti Fusarium poae oxysporum + hniloba 10 % mazlavé + 10% Fusarium tricinctum + 5. Drechslera sp. + Fusarium hnědá skvrnitost 10% rzi 10% oxysporum + helminthosporiová sněti Fusarium oxysporum + hniloba 10% mazlavé Fusarium tricinctum + 10% 6. Drechslera sp. + Fusarium poae + hnědá skvrnitost 10% rzi 10% helminthosporiová sněti Fusarium poae Fusarium + tricinctum + hniloba 10% mazlavé 10% 26

7.

Drechslera sp. + Fusarium oxysporum +

hnědá skvrnitost 10% helminthosporiová hniloba 10%

8.

Fusarium oxysporum + Fusarium Drechslera sp. + oxysporum +

hnědá skvrnitost 10% helminthosporiová hniloba 10%

rzi 10% sněti mazlavé 10% rzi 10% sněti mazlavé 10%

Vysvětlivky: + slabé napadení (do 10%) ++ vyšší napadení (do 20%) Z tabulky je jasně patrné, že ošetřené varianty byly podstatně méně napadeny patogenními houbami. Fytopatogenní houby byly sledovány v půdě a přímo na povrchu rostlin. Bylo však poměrně obtížné rozlišit napadení jednotlivých rostlin parazitickými houbami do 10 %, avšak jejich zjištění v půdě bylo průkaznější. Skvrnitosti ječmene jsou vyvolány houbami rodu Drechslera (Helminthosporium), při nichž dochází k nekrózám povrchových pletiv a hnědnutí listů. Z těchto nekróz je možné vyizolovat přímo patogenní houby. Uvedené houby lze hodnotit i uvnitř rostlin (Houterman et al., 2006), což však již nebylo předmětem našeho sledování v polních pokusech. V literatuře byl zjištěn kladný účinek biopreparátů na potlačení výskytu parazitických hub a na optimální růst i vývoj hostitelských rostlin (Veselý, 2001 a Neethling, Nevalainen, 1996), které byly vyhodnocením našich pokusů potvrzeny. Závěr Ošetření jarního ječmene biopreparáty Supresivit, Ibefungin a Polyversum ve formě mořidla a ve formě směsi se síranem amonným mělo jednoznačně pozitivní vliv na potlačení parazitických hub přenosných půdou a vyskytujících se i na povrchu rostlin. Na kontrolní neošetřené variantě byl zjištěn nejvyšší stupeň napadení, zatímco na variantách ošetřených biofungicidy byl vliv houbové infekce nižší. Literatura Houterman P.M., Speier D., Dekker H.L., Van der Does, Meiijer M., Cornelissen, B.J.C., Rep M. (2006): A proteomic approach to identify proteins secreted by Fusarium oxysporum in xylem sap of tomato. Book of Abstracts, European Fusarium Seminar, 19-22 September, Wageningen, the Netherlands, p.65. Neethling D., Nevalainen H. ( 1996): Mycoparasite species of Trichoderma produce Lectins. Can. J. Microbiol. 42, 141 - 146. Veselý D. (2001): Pythium oligandrum as the Biological Control Agent in the Preparation of Polyversum. Bulletin of the Polish Academy of Sciences, Biological Sciences, vol. 49, No. 3, 209-218. Tento příspěvek byl připraven za finanční podpory výzkumného záměru MZe ČR 0002700603 a MZe 0002700601.

27

Indukovaná rezistence rostlin. Indukovaná rezistence pšenice k padlí travnímu Blumeria graminis f.sp. tritici. Lubomír Věchet1, Lenka Burketová2 Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně 2 Ústav experimentální botaniky AV ČR, v.v.i., Na Karlovce 1a, 160 00 Praha 6 E-mail: [email protected]

1

Jedním z hlavních problémů týkající se produkce potravinářských plodin je obtížnost kontrolování chorob rostlin k udržení vysoké kvality a výnosu, která je pěstiteli a konzumenty očekávána. V poslední době je vyvíjeno několik přístupů prostřednictvím aplikace biotechnologií k redukci výskytu chorob na zemědělských plodinách. Jedním takovým přístupem ke kontrole chorob je indukce a posílení vlastních obranných mechanizmů rostlin, které by nevyžadovaly aplikaci toxických sloučenin na rostliny. K tomu je nezbytné pochopit mnoho biochemických interakcí vyskytujících se mezi rostlinami a patogeny. Rostliny mají společného se živočichy to, že vlastní jedinečné induktivní mechanizmy pro ochranu proti infekci patogenů. Rostliny mají jak konstitutivní (tvořící jejich součást) nebo induktivní (uměle vyvolané) základní mechanizmy rezistence proti patogenům a škodlivému hmyzu (van Loon et al. 2006). Indukovaná rezistence je reakce k vnějším stimulům bez změny genómu hostitele (Shetty & Vasanthi 2000). Indukovaná rezistence je fyziologický „stav zvýšené obranné schopnosti“ vyvolaný specifickými vnějšími stimuly, pomocí jichž je vrozená obrana rostlin zesílena následnými biotickými změnami (van Loon et al., 1998). Tento zvýšený stav rezistence je efektivní proti široké řadě patogenů a parazitů, včetně hub, bakterií, virů, nematod, parazitických rostlin a dokonce býložravému hmyzu (Benhamou & Nicole, 1999; Hammershmidt & Kuc, 1995; Kesler & Baldwin, 2002; McDowell & Dangl, 2000; Sticher et al., 1997; van Loon et al., 1998; Walling, 2000). Nejjasněji definované formy indukované rezistence jsou SAR (systémově získaná rezistence) a ISR (indukovaná systémová rezistence). SAR může být spuštěna vystavením rostliny virulentním, avirulentním a nepatogenním mikrobům nebo uměle chemikáliemi (Vallad & Goodma. 2004). Indukovaná systémová rezistence (ISR) rostlin proti patogenům je široce rozšířený jev, který byl intenzivně zkoumán s ohledem k základním signalizačním drahám, stejně jako k jeho možnému použití v ochraně rostlin (Heil & Bostock 2002). Je vyvolaná lokální infekcí. Rostliny reagují signální kaskádou závislou na kyselině salicylové, která vede k systematickému projevu širokého spektra a dlouhodobé rezistence k chorobě. Ta je účinná proti houbám, bakteriím a virům. Změny ve složení buněčné stěny, nová produkce proteinů vztažených k patogenezi, jako jsou chitinázy a glukanázy a syntéza fytoalexinů, které jsou spojeny s rezistencí. Existuje pravděpodobně možnost dalších obranných sloučenin, které zatím nebyly identifikovány. Mnoho rostlin reaguje k lokálnímu napadení býložravci nebo patogeny nově produkcí sloučenin, které redukují nebo inhibují další napadení nebo chování jejich nepřátel. Reakce se vyskytují jak na rostlinném orgánu původně napadeném (lokální reakce), tak na vzdálených, ještě neinfikovaných částech (systémová reakce). Jedna z těchto reakcí je indukovaná systémová rezistence (ISR) nebo systémově získaná rezistence (SAR) rostlin proti patogenům. Walters et al. (2005) uvádějí, že biotické induktory zahrnují induktory biologického původu a rhizobakterie růst podporující rostlin, ošetření nepatogeny nebo fragmenty buněčné stěny. Abiotické induktory zahrnují chemikálie, které působí v různých okamžicích v signálních drahách zahrnutých v rezistenci k chorobě stejně tak jako vodní stres, tepelný šok a stres pH. Indukovaná rezistence těmito zprostředkovateli (elicitory rezistence) je širokého spektra a dlouhého trvání, ale málokdy poskytuje úplnou kontrolu infekce. Většinou poskytuje 28

mezi 20 a 80% kontroly choroby (Walters et al. 2005).. Je také mnoho zpráv, že elicitory rezistence neposkytují žádnou významnou kontrolu choroby. Na poli je projev indukované rezistence pravděpodobně ovlivněn vnějším prostředím, genotypem a výživou plodiny. Bohužel je málo dostupných informací o těchto faktorech na projev indukované rezistence. Za účelem maximalizovat účinnost elicitorů rezistence, je vyžadováno větší pochopení těchto interakcí. Bude také důležité určit jak může indukovaná rezistence nejlépe zapadnout do strategií kontroly, protože ještě není a neměla by jednoduše zaujmout postavení „bezpečných fungicidů“. Indukovaná rezistence je známa již více jak sto let. Prvně tento typ rezistence zjistili byli Ray (1901) a Beauverie (1901). Ve třicátých letech minulého století byla Chesterem (1933) popsána patogenem vzbuzená rezistence k následnému napadení. Později v šedesátých letech ukázal Ross (1961), že TMV, ale i jiné viry na tabáku by mohli indukovat lokální a systémovou rezistenci proti těmto virům a ostatním patogenům. K tomuto popisu poprvé použil termíny „LAR“ pro lokální rezistenci a „SAR“ pro systémově získanou rezistenci. Jsou známy čtyři typy indukované rezistence (van Loon et al.,2006): A) Lokálně získaná rezistence (LAR - local acquired resistance) B) Systémově získaná rezistence (SAR - systemic acquired resistance) C) Indukovaná systémová rezistence (ISR –induced systemic resistance) D) Indukovaná rezistence proti poranění býložravého hmyzu (WIR - wound-induced resistance) Lokálně získaná rezistence – LAR zahrnuje strukturální změny, jako utváření papily, tylós a abscise (oddělení) zón. Nekrotické změny začínají uvolněním protonů a draslíkových iontů z buňky a vrcholí v oxidační destrukci obsahů buňky lipidovými hydroperoxydázami a reaktivními druhy kyslíku. Dále zahrnuje toxické změny, to znamená akumulaci fytoalexinů, syntézu fenolových sloučenin a jejich následnou oxidaci do chinonových sloučenin polyfenolovou oxidázou a peroxidázou. Samotné transdukční dráhy ještě nebyly vysvětleny, ale možná vyžadují tvorbu Ca2+ (Mehdy, 1994) nebo proteinkinázy (Jones & Jenes, 1997) a nebo je iniciována tvorba peroxidu vodíku (Mehdy, 1994). Peroxid vodíku zabíjí buňky a bylo zjištěno, že indukuje syntézu kyseliny salicylové (Leon et al., 1998). Systémově získaná rezistence - SAR Je vyjádřená v rostlině jako úplná, v reakci k napadení patogenem (Ryals et al., 1994). SAR je rezistence tkání rostliny vzdálených od místa pokusu penetrace patogena. SAR vyžaduje signální molekulu kyseliny salicylové a je spojena s akumulací k patogenezi vztaženým proteinům (Durrant & Dong, 2004). Může být spuštěna vystavením rostliny virulentním, avirulentním a nepatogenním mikrobům nebo uměle chemikáliemi. Tato rezistence je cílená k širokému spektru potenciálních patogenů a ne pouze k jednomu, který tuto reakci inicioval (Sticher et al., 1997). SAR má tyto hlavní složky: akumulaci PR proteinů (pojmenované SAR proteiny, protože se PR proteiny také akumulují při HR) a vyžaduje signální molekuly kyseliny salicylové ve všech částech rostliny (Cameron et al., 1994). Indukovaná systémová rezistence - ISR Růst rostliny podporují rhizobakterie (Pseudomonas fluorescens), které vyvolávají reakci nezpůsobující nekrózy (Sticher et al., 1997) tak, že signální dráha peroxidu vodíku, který indukuje syntézu kyseliny salicylové, může fungovat v LAR ale nemůže se vyskytnout v ISR. Kromě toho ne vždy rezistence koreluje s produkcí PR-proteinů (Pieterse et al., 2000) a také indukuje rezistenci k hmyzu. Funkce je obvykle spojena s dráhou kyseliny jasmonové vedoucí k defenzinům a inhibitorům proteáz. Zdá se, že ISR je odlišná od SAR.

29

Indukovaná rezistence proti poranění býložravého hmyzu - WIR Napadení rostlin hmyzem vede k systémovému projevu inhibitorů proteázy, které redukují aktivitu enzymů býložravého hmyzu (Sticher et a., 1997). Jsou známy tři signály, které v tomto systému působí. Je to opět kyselina jasmonová, dále pak systemin a oligogalakturonidy odvozené od degradovaného pektinu (Ryan, 1992). Indukovaná rezistence pšenice k padlí travnímu Ve čtyřletých maloparcelkových pokusech jsme zkoušeli vyvolat indukovanou rezistenci pšenice ozimé odrůdy Kanzler náchylný standard k padlí travnímu pomocí induktorů. Induktory syntetického původu byly benzothiadiazol (BTH), komerčně vyráběný jako Bion® a kyselina salicylová (SA). Induktory biologického původu.byly glycin betain (GB), extrakty z dubové kůry (Quercus robur L – OB), křídlatka sachalinská (Reynoutria sacchaliensis L. RS) registrovaný preparát Milsana®), kurkuma (Curcuma longa L – CU) a zázvor (Zingiber officinale Roscoe – GI). Induktory byly připraveny jako vodní extrakty BTH, SA a GB nebo jako následující rostlinné extrakty: BTH- 1,2 mM, SA - 1 mM, GB - 0,3 M; extrakty z CU, GI, RS, přípravek z OB. Byla hodnocena závažnost napadení na všech živých listech deseti rostlin, ve dvou opakováních. Z údajů o závažnosti choroby bylo vypočteno kumulativní procento napadení celé rostliny ((Věchet & Kocourek 1987; Brière et al., 1994). Tab.1. Závažnost padlí travního, vyjádřena jako kumulativní procento napadení, na odrůdě pšenice ozimé Kanzler : CO – neošetřená kontrola, OB dubová kůra, SA – kyselina salicylová, RS – křídlatka sachalinská, BTH – benzothiadiazol, GI – zázvor, CU – kurkuma, GB – glycin betain. 12.7.2004 07.7.2005 23.6.2006 20.6.2007 CO 144,4 15,5 24,1 3,2 OB 55,7 2,7 10,1 3,2 SA 71,8 7,3 7,4 2,0 RS 41,8 1,7 9,0 0,0 BTH 16,5 0,3 9,9 0,8 GI 32,0 0,7 12,4 1,7 CU 36,6 1,9 11,4 1,2 GB 42,0 3,9 12,7 0,2 Average of 42,34 2,6 10,4 1,3 inducers Výsledky ukazují proměnlivost závažnosti choroby v jednotlivých letech pokusu. Nejvyšší výskyt choroby byl v roce 2004, slabý v roce 2005 a nejnižší výskyt padlí travního byl v roce 2007. Z tabulky je zřejmé, že induktory snížily napadení odrůdy Kanzler chorobou ve všech letech pokusů. Avšak čím nižší závažnost choroby (2007), tím menší byly rozdíly mezi efektivitou induktorů a neošetřenou kontrolou. Efektivita jednotlivých induktorů také kolísala s podmínkami počasí, od nichž se odvíjela závažnost choroby. Zejména v letech vyšší a střední závažnosti choroby byla efektivita induktorů vysoká. Jejich použití dokázalo snížit závažnost choroby na méně než 50% neošetřené kontroly. Z induktorů syntetického původu mělo velice dobré výsledky ošetření BTH. Z induktorů biologického původy to bylo zejména ošetření křídlatkou sachalinskou, zázvorem, glycin betainem a kurkumou. Ošetření dubovou kůrou bylo méně efektivní, ale i tak velice účinné. Závěrem je možné říci že vyvolání indukované rezistence pomocí indukturů biologického nebo syntetického původu ukazuje nový směr v kontrole padlí travního.

30

Indukovaná rezistence pšenice ozimé (náchylná odrůda Kanzler) k padlí travnímu (Blumeria graminis f.sp. tritici) na listových segmentech umístěných na benzimidazolovém agaru. KO – neošetřená kontrola, DK – extrakt z dubové kůry, SA – kyselina salicylová, KS – extrakt z křídlatky sachalinské, BTH – benzothiadiazol (Bion®), ZA – extrakt ze zázvoru, KU – extrakt z kurkumy, GB – glycin betain. VÚRV 2004.

Literatura Benhamou N., Nicole M. (1999): Cell biology of plant immunization against microbial infection: The potential of induced resistance in controlling plant diseases. Plant Physiol. Biochem. 37, 703–719. Cameron R. K., Dixon R. A., Lamb C. J. (1994): Biologically induced systemic acquired resistance in Arabidopsis thaliana. Plant J. 5, 715–725. Chester K. (1933): The problem of acquired physiological immunity in plants. Quart. Rev. Biol. 8, 129-151. Durrant W. E., Dong X. (2004): Systemic acquired resistance. Annual Review of Phytopathology 42, 185-209. Hammerschmidt, R., and Kuc J. (1995): Induced resistance to disease in plants. Klumer, Dordrecht, the Netherlands. Heil M., Bostock R.M. (2002): Induced resistance (ISR) against pathogens in the context of induced defences. Annals of botany 89 (5), 503-512. Jones D A., Jones J. D. (1997): The role of leucine-rich repeat proteins in plant defences. Adv Bot Res 24, 89-167.

31

Kessler, A., I.T. Baldwin (2002): Plant responses to insect herbivory: The emerging molecular analysis. Annu. Rev. Plant Biol. 53, 299–328. Leon J., Rojo E., Titarenko E., Sánchez-Serrano J.J. (1998): JA-dependent and -independent wound signal transduction pathways are differentially regulated by Ca2+/calmodulin in Arabidopsis thaliana. Molecular and General Genetics 258, 412–419. McDowell J. M., Dangl J. L. (2000): Signal transduction in the plant immune response. Trends Biochem. Sci. 25, 79-82. Mehdy M. C. (1994): Active oxygen species in plant defense against pathogens. Plant Physiol. 105, 467-472. Pieterse C. M. J., van Pelt J. A., Ton J., Parchmann S., Müller M. J., Buchala A. J., Métraux J. P., van Loon L. C. (2000): Rhizobacteria-mediated induced systemic resistance (ISR) in Arabidopsis requires sensitivity to jasmonate and ethylene but is not accompanied by an increase in their production. Physiological and Molecular Plant Pathology 57, 123-134. Ryals J., Uknes S., Ward E. (1994): Systemic acquired resistence. Plant Physiology 104, 1109-1112. Ryan C. A. (1992). Search for the proteinase inhibitor inducing factor, PIIF. Plant Molecular Biology 19 123-133. Sticher L., Mauch-Mani B., Metraux J. P. (1997): Systemic acquired resistence. Annu. Rev. Phytopathol. 35, 235-270. van Loon, L. C., Bakker P.A. H. M, Pieterse C. M. J. (1998): Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 36, 453–483. Walling L. L. (2000): The myriad plant responses to herbivores. J. Plant Growth Regul. 19, 195–216. Walters D., Walsh D., Newton A., Lyon G. (2005): Induced resistance for plant disease control: Maximizing the efficacy of resistance elicitors. Phytopathology: 85, 12, 13681373. Toto řešení bylo podporováno Výzkumným záměrem VÚRV č. 0002700602.

32

Antioxidační mechanismy a signální dráhy řepky aktivované při napadení Leptosphaeria maculans Vladimír Šašek1,2, Barbora Korbelová1,3 Lenka Burketová1 1 Ústav experimentální botaniky AV ČR, v.v.i., Na Karlovce 1a, 160 00 Praha 6 2 Katedra ochrany rostlin, FAPPZ ČZU, Kamýcká 129, 160 00 Praha 6 3 Ústav mikrobiologie a biotechnologie, FPBT VŠCHT, Technická 5, 166 28 Praha 6 e-mail: [email protected] Brukev řepka olejka (Brassica napus L.) společně s dalšími druhy rodu Brassica tvoří jednu z nejvýznamnějších skupin olejnin na světě a je i dominantní olejninou pěstovanou v České republice [1]. Fomová suchá hniloba, jejímž původcem je askomyceta Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. & De Not., je vážnou chorobou řepky způsobující padání klíčních rostlin, poléhání a předčasné dozrávání [2]. Leptosphaeria maculans je hemibiotrofní patogen s obrovským evolučním potenciálem, díky němuž velmi rychle překonává monogenně založenou rezistenci řepky získanou především introdukcí genů rezistence z druhu Brassica rapa [3]. Fungicidní ošetření tedy zůstává hlavním opatřením v ochraně rostlin před fomovou hnilobou. V souladu se zajištěním potravinové bezpečnosti je snahou omezit používání pesticidů a částečně je nahradit např. přírodními látkami, které u rostlin indukují rezistenci, aniž by vykazovaly přímý antimikrobiální účinek, nebo rezistentními odrůdami vyšlechtěnými pomocí moderních biotechnologických metod [4]. Mezi ně patří transgenoze nebo šlechtění na polygenně založenou rezistenci metodou analýzy lokusů kvantitativní znaků (QTL) [5]. Pro využití uvedených metod pro ochranu řepky před L. maculans je však třeba znát molekulární mechanismy interakcí mezi tímto patogenem a jeho hostitelem. V této práci jsme se zaměřili na aktivaci signálních drah v klíčních rostlinách řepky po infekci L. maculans a na enzymy účastnící se tvorby a regulace reaktivních forem kyslíku (ROS), které mají kromě své signální funkce i přímý toxický účinek na patogena. Zdá se, že základní obranné mechanismy jsou v celé rostlinné říši poměrně konzervované [6]. Rostliny odpovídají na napadení patogenem aktivací mnoha indukovaných obranných reakcí. Ty zahrnují tvorbu antimikrobiálních sloučenin a enzymů degradujících buněčnou stěnu patogena, zpevnění buněčné stěny a zvýšenou expresi mnoha genů známé i neznámé funkce. Rychlost, jakou jsou tyto mechanizmy aktivovány, rozhoduje o jejich úspěchu, protože rezistence koreluje s rychlými odezvami, zatímco náchylnost s odezvami pomalými [7]. Tyto obranné reakce jsou regulovány sítí vzájemně propojených signálních drah, v nichž klíčovou roli hrají tři hormony: kyselina salicylová, jasmonová a etylén. Přestože se signální dráhy těchto hormonů protínají, kyselina jasmonová se podílí především na rezistenci rostlin k nekrotrofním patogenům, zatímco kyselina salicylová je dávána do souvislosti s patogeny biotrofními [8]. Tento model je však značně zjednodušený. Signalizace rostlin při biotickém stresu je podstatně složitější proces. V poslední době se naoř. objevily práce, které ukázaly na význam kyseliny abscisové, hormonu spojeného spíše s abiotickým stresem, v interakci rostlina-patogen [9]. Další nedávno popsanou složkou signalizace je dráha MAP kinas (mitogen-activated protein kinases), která spouští obranné reakce po rozpoznání konzervovaných molekul, jakými jsou chitin, nebo flagelin. [10]. Podíl jednotlivých signálních drah účastnících se obranných reakcí řepky při infekci Leptosphaeria maculans není detailně znám. Zvýšená odolnost k infekci byla pozorována např. při ošetření rostlin benzothiadiazolem, funkčním analogem kyseliny salicylové [11]. Nicméně vzhledem k tomu, že patogen je hemibiotrof a v infekčním cyklu se uplatňuje jak biotrofní, tak nekrotrofní stádium, je velmi pravděpodobné, že na rezistenci se podílejí i další signální dráhy.

33

Oxidační vzplanutí, tvorba reaktivních forem kyslíku (ROS) během napadení rostlin patogenem, je všudypřítomná ranná fáze mechanismu resistence rostlinné buňky [12]. Během napadení rostlin patogenem dochází k nárůstu aktivity NADPHoxidasy, která produkuje superoxidový radikál. V buňce dochází k nárůstu ROS, které je nutno dále regulovat. Nejdůležitější regulační antioxidační mechanismy jsou enzymatická regulace ROS a neenzymatická regulace ROS [13]. Mezi důležité antioxidační enzymy patří guajakol dependentní peroxidasa (GPX), askorbátperoxidasa (APX), katalasa a superoxiddismutasa (SOD). Další neenzymatickým antioxidačním mechanismem je poměr oxidované a redukované formy kyseliny askorbové a glutathionu. Rostliny řepky olejky (odrůda Columbus) byly pěstovány hydroponicky za řízených podmínek v kultivační místnosti (fotoperioda 16/8h; 22/18°C). Rostliny byly ošetřeny po 14 dnech od výsevu postřikem 3 mM salicylátem sodným, 0,2 mM metyljasmonátem, 1 mM ethephonem, 1mM kyselinou abscisovou, chitosanem (0,05 mg/ml), nebo kultivačním médiem obsahujícím elicitory z L. maculans připraveným filtrací a následnou dialýzou kultivačního média, ve kterém byl po dobu 14 dnů kultivován izolát L. maculans. Do všech roztoků bylo přidáno smáčedlo Silwet L77 v konečné koncentraci 0,015%. Inokulace byla provedena nanesením 10 μl suspenze spor (107/ml) L. maculans na propíchnutý děložní list. Pro měření enzymových aktivit byly děložní listy infiltrovány kultivačním médiem s elicitory z L. maculans pomocí injekční stříkačky s jehlou. Médium bylo použito namísto inokulace, aby výsledky nebyly ovlivněny vlastními antioxidačními mechanismy L. maculans. Z rostlin byla 24 hod. po ošetření a 4 nebo 6 dní po inokulaci izolována celková RNA pomocí TRI Reagent a ošetřena DNázou I. Následně byla provedena reverzní transkripce s M-MLV reverzní transkriptasou a oligo dT primerem. Exprese následujících genů byla kvantifikována Real-time PCR: PR-1 (U21849; gen indukovaný signální dráhou kyseliny salicylové), AOS (EV124323; gen indukovaný signální dráhou kyseliny jasmonové), HEL a ERF5 (ES906553, resp. EV126309; geny indukované dráhou etylénu), LEA1 (EE538232; gen indukovaný dráhou kyseliny abscisové) a WRKY22 (EV193324; gen indukovaný dráhou MAP kinas) Pro inokulační test byly rostliny tři dny po ošetření inokulovány L. maculans a ponechány 72 hodin při vysoké relativní vzdušné vlhkosti. Dva týdny po inokulaci byly listy odstřiženy a skenovány. Plocha nekrotických skvrn byla změřena analýzou obrazu aplikací DPlan4Lab. Aktivita NADPHoxidasy byla stanovena spektrofotometricky v rostlinném homogenátu s použitím substrátu NADPH a detekční barvičky nitrotetrazolové modři. Jako slepý vzorek byla měřena aktivita za stejných podmínek s přídavkem enzymu superoxiddismutasy. Aktivita antioxidačních enzymů byla stanovena spektrofotometrickou metodou. Aktivita katalasy byla stanovena spektrofotometricky v rostlinném homogenátu s použitím substrátu H2O2. Aktivita GPX byla stanovena spektrofotometricky v rostlinném homogenátu s použitím substrátu guajakol a H2O2. Aktivita APX byla stanovena spektrofotometricky v rostlinném homogenátu s použitím substrátu kyselina askorbová a H2O2. Aktivita GR byla stanovena spektrofotometricky v rostlinném homogenátu s použitím substrátu oxidovaný glutathion a NADPH. Isoformy peroxidasy byly detekovány po nativní PAGE v gelu s použitím substrátů dianisidin a H2O2. Ošetření rostlin salicylátem sodným výrazně zpomalilo rozvoj nekrotických skvrn na inokulovaných děložních listech. V menším rozsahu byl tento efekt pozorován i po ošetření metyljasmonátem (Graf 1). Avšak největší účinek byl zaznamenán u kultivačního média, ve kterém byla pěstována L. maculans. Vzhledem k tomu, že médium neobsahovalo díky filtraci a dialýze mycelium ani toxiny, lze jeho účinky přisuzovat látkám uvolňovaným houbou do media. Další účinnou složkou by mohly být složky buněčné stěny.

34

20 Prům. plocha léze [mm2]

18 16 14 12 10 8 6 4 2 ac ul an s L. m

m éd iu m

ko nt ro la

m éd iu m

on át m et yl ja sm

od ný sa li c yl át s

vo da

ko nt ro la

0

Graf 1 Biologický test rezistence. Účinek různých ošetření na rozvoj choroby byl sledován pomocí měření velikost lézí, které se utvářely na děložních listech po inokulaci suspenzí spor L. maculans.

Pro ověření specifity vybraných genových markerů byly stanovena exprese těchto genů po ošetření rostlin induktory jednotlivých signálních drah. Pouze markerové geny signální dráhy etylénu HEL a ERF5 byly kromě ethephonu (induktoru dráhy etylénu) výrazně indukovány i induktory dalších drah salicylátem sodným a metyljasmonátem. To je zřejmě způsobeno úzkou vazbou etylénu na dráhu kyseliny jasmonové. Tento jev je známý i u rostlin Arabidopsis, přesto se gen HEL používá jako marker signální dráhy etylénu [8]. Ostatní geny byly specifické pro jednotlivé signální dráhy. Z další analýzy genové exprese vyplynulo, že rostliny Brassica napus odpovídají intenzivně na infekci patogenem Leptosphaeria maculans. Po ošetření kultivačním médiem i po infekci došlo k indukci exprese genu PR-1, který je považován za genový marker dráhy kyseliny salicylové (Graf 2). Naproti tomu marker dráhy kyseliny jasmonové AOS (allen oxid syntasa) nebyl žádným z ošetření indukován ani reprimován. Gen HEL, marker signální dráhy etylénu, nebyl indukován ošetřením kultivačním médiem, ale byl velmi silně indukován infekcí L. maculans a v podobné míře i samotným propíchnutím listu, které je nezbytné pro inokulaci patogenem (Graf 2). Účast etylénu v interakci řepky s tímto patogenem nebyla, pokud je nám známo, dříve popsána. Podobný expresní profil měl i druhý marker dráhy etylénu gen ERF5. Rozdílný účinek kultivačního média a inokulace si vysvětlujeme působením hyf patogena, které mohou mechanicky poškozovat buňky hostitele při jejich penetraci. Markerový gen dráhy kyseliny abscisové LEA1 nebyl indukován ani kultivačním médiem ani inokulací patogenem. Zajímavé je, že mutanti Arabidopsis náchylní k L. maculans měli nefunkční právě geny zapojené do signální dráhy kyseliny abscisové [14]. Avšak abychom mohli tvrdit, že mechanismus rezistence k L. maculans se u rostlin Brassica napus liší od A. thaliana, museli bychom sledovat současně expresi několika genů zapojených do různých úrovní signální dráhy kyseliny abscisové. Gen WRKY22, který je transkripčním faktorem indukovaným dráhou MAP kinas a jeho exprese se dle očekávání zvýšila po ošetření chitosanem. Nicméně tento gen nebyl indukovaný inokulací ani ošetřením kultivačním médiem L. maculans. Vzhledem k tomu, že salicylát sodný indukoval u rostlin rezistenci v podstatně vyšší míře něž metyljasmonát a nejúčinnější ošetření, kultivační médium s metabolity L. maculans, indukovalo marker dráhy kyseliny salicylové PR-1, hraje tato dráha v počáteční fázi infekce zřejmě hlavní roli. To je v souladu i se symptomy pozorovanými na listech, kde nejsou patrné žádné nekrotické skvrny a patogen se tedy chová jako biotrof, který v rostlinách zpravidla aktivuje dráhu kyseliny salicylové. K obdobnému závěru došli i Potlakayala a kol. [15]. 35

Avšak zcela jiné závěry vyplývají z práce jiné skupiny [16], které nepotvrzují dominantní význam kyseliny salicylové v obranných reakcí řepky při infekci L. maculans. Tento rozpor by mohl mít několik příčin. V druhém případě byly inokulační testy provedeny na pravých listech, zatímco pro experimenty první skupiny byly použity listy děložní, stejně jako v našich měřeních. Také variabilita mezi izoláty L. maculans a odrůdami řepky by mohla výsledky ovlivnit, ale spíše jen načasování obranných reakcí. Po ošetření rostlin elicitorem (kultivační médium L. maculans) je rychlý nárůst aktivity NADPHoxidasy, protože zde dochází k produkci ROS buňkami jako obranná reakce na první kontakt s elicitorem. Během 1. hod po ošetření je aktivita NADPHoxidasy v ošetřených rostlinách o 150% vyšší než v kontrolních rostlinách. Aktivita NADPHoxidasy v ošetřených rostlinách je nadále zvyšována. Kolem 6. hod od ošetření elicitorem dochází ke snižování aktivity NADPHoxidasy (Graf 3). Enzymy katalasa a APX svojí aktivitou regulují obsah toxického H2O2 v buňce. K nárůstu aktivity katalasy (Graf 4) v děložních listech dochází ve 3. hod po ošetření elicitorem. Tento nárůst aktivity v začátku odpovídá nárůstu obsahu peroxidu vodíku. V pozdějších časech je funkce tohoto enzymu pravděpodobně nahrazena jinými enzymy. Nárůst aktivity APX (Graf 4) během 3. hod po ošetření odpovídá nárůstu peroxidu vodíku. Nárůst aktivity APX ve 12. hod po ošetření pravděpodobně nahrazuje funkci katalasy. GPX je enzym hrající roli nejen v antioxidačním mechanismu, podílí se také na růstu, vývoji rostliny a lignifakaci. Nárůst aktivity GPX (Graf 4) v děložních listech kolem 3. a 20. hod odpovídá nárůstu obsahu peroxidu vodíku. GPX se podílí na konečné detoxikaci peroxidu vodíku v děložních listech. Dále bylo detekováno několik isoforem PX (obr. 1). Jsou zde detekovány isoformy, které jsou v buňce přítomny konstitutivně. Po 18. hod po ošetření je viditelná další isoforma PX, která není přítomna v kontrolních rostlinách.GR, poslední enzym askorbát-glutathionového cyklu, katalyzuje NADPH-dependentní redukci oxidovaného glutathionu. Po 3. hod po ošetření dochází k nárůstu aktivity GR (Graf 4) v ošetřených rostlinách. Kultivační médium obsahující elicitory z L. maculans indukuje akumulaci ROS a aktivaci antioxidačních mechanismů v děložních listech B. napus. Mezi důležité antioxidační enzymy patří GPX, APX a GR podílejících se na regulaci ROS po ošetření elicitorem, Byly detekovány isoformy PX indukované po ošetření elicitorem. NADPHoxidasa a CAT hraje důležitou roli během prvního kontaktu s elicitorem. 3.hod t 18.hod t 24.hod t k E k E k E

Obr. 1 Isoenzymy PX (A,B,C) jsou přítomny v buňce konstitutivně, liší se pouze aktivitou. Isoenzymy PX (D) jsou indukovány po ošetření elicitorem, po ošetření elicitorem je viditelný nárůst aktivity. Znační vzorků: k - neošetřená kontrola, E - rostliny ošetřené elicitorem.

36

vo da éd ko n m éd ium tro la iu k o m L. ntro m ac la u L. vpi lan ch s m ac ul 4.d en an s 4 L. vpi .den ch m ac ul 6.d en an s 6. de n

10

Brassica napus LEA1 exprese

Brassica napus WRKY22 exprese

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

m

15

vo da éd ko n m éd ium tro la iu k o m L. ntro m ac la u v pi lan L. ch s m ac 4. ul d en an s 4. v de pi L. n c m ac h 6 .d ul en an s 6. de n

20

vo da m éd ko n m éd ium trol a iu k o m nt L. ro m l ac a ul v a pi L. ns c m ac h 4 . ul an den s 4. L. vpic den m ac h 6 . ul an den s 6. de n

Relativní exprese

Relativní exprese

1

30 140

25 120

Relativní exprese

vo da m éd ko n m éd ium tro la iu k o m L. ntro m ac la u L. vpic lan s m h ac 4. ul an den s 4 L. vpic .den m h ac 6. ul an den s 6. de n 10

Relativní exprese

vo da éd ko n m éd ium tro la iu k o m L. ntro m ac la u L. vpi lan ch s m ac ul 4.d en an s 4 L. vpi .den ch m ac ul 6.d en an s 6. de n m

Relativní exprese

100

m

vo da éd ko n m éd ium tro la iu k o m L. ntro m ac la u v pi lan L. ch s m ac 4. ul d e an n s 4. v d pi L. en c m ac h 6 . ul an den s 6. de n

m

Relativní exprese

Brassica napus PR-1 exprese

Brassica napus AOS exprese

1000

0

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Brassica napus ERF5 exprese Brassica napus HEL exprese

100

80

60

5 40

20

0 0

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Graf 2 Exprese markerových genů signálních drah měřená kvantitativní RT-PCR 1 den po ošetření elicitory z kultury L. maculans (médium L.maculans), resp. 4 a 6 dní po inokulaci sporami L:maculans (L.maculans 4.den a L.maculans 6.den).

37

Aktivita NADPHoxidasy

% aktivity enzymu

600 500 400 300 200 100 0 1

3

6

8

18

24

Doba po ošetření elicitorem (hodin)

Graf 3 Aktivita NADPHoxidasy v děložních listech po ošetření elicitorem z L. maculans. Aktivita katalasy

180

180

160

160

140

140

% aktivity enzymu

% aktivity enzymu

Aktivita katalasy

120 100 80 60 40 20

120 100 80 60 40 20

0

0 3

5

8

12

18

20

3

Doba po ošetření elicitorem (hodin)

% aktivity enzymu

% aktivity enzymu

200 150 100 50 0 8

12

12

18

20

Aktivita GR

250

5

8

Doba po ošetření elicitorem (hodin)

Aktivita GPX

3

5

18

20

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 3

Doba po ošetření elicitorem (hodin)

5

8

12

18

20

Doba po ošetření elicitorem (hodin)

Graf 4 Aktivity antioxidačních enzymů v děložních listech po ošetření elicitorem z L. maculans.

38

Literatura 1. Potměšilová J., Adamec J. (2004): Situační a výhledová zpráva olejniny. MZe ČR. 38 s. 2. West J.S. et al. (2001): Epidemiology and management of Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) on oilseed rape in Australia, Canada and Europe. Plant Pathology 50, 1027. 3. Rouxel T., Balesdent M. H. (2005): The stem canker (blackleg) fungus, Leptosphaeria maculans, enters the genomic era. Molecular Plant Pathology 6, 225-241. 4. Anonym 2002. Communication from the commission to the council, the european parllament and the economic and social committee - Towards a Thematic Strategy on the Sustainable Use of Pesticides [on-line]. Publikováno 1.7.2002 [cit. 2007-05-03]. Dostupné z http://europa.eu/scadplus/leg/en/lvb/l21288.htm. 5. Kelly J. D., Vallejo V. (2006): QTL Analysis of Multigenic Disease Resistance in Plant Breedingin Multigenic and Induced Systemic resistance in Plants. Tuzun, S., Bent, E. New York: Springer. 521 s. 6. Baker B. et al. (1997): Signaling in Plant-Microbe Interactions. Science 276, 726-733. 7. Glazebrook J. (2005): Use of Expression Profiling to Explore Disease Resistance Signaling in Plants. in Genomic and Genetic Analysis of plant Parasitism and Defence. Tsuyumu, Shinnji et al. Minnesota: APS Press. 8. De Vos M. et al. (2005): Signal Signature and Transcriptome Changes of Arabidopsis During Pathogen and Insect Attack. Molecular plant-microbe interactions 18, 923-937. 9. Ton J. et al. (2005): Dissecting the b-Aminobutyric Acid–Induced Priming Phenomenon in Arabidopsis. The Plant Cell 17, 987–999. 10. Tsunekai A., et al. (2002): MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature 415, 977-983. 11. Liu S. Y. et al. (2006): Resistance to Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) in Brassica napus (oilseed rape) induced by L. biglobosa and chemical defence activators in field and controlled environments. Plant pathology 55, 401-412. 12. Bowell G.P., et al. (2002): The apoplastic oxidative burst in response to biotic stress in plants: a three-component system, Journal Experim. Botany 53, 1368-1376. 13. Apel K., Hirt H. (2004): Reactive Oxygen Species: Metabolism, Oxidative Stress and Signal Transduction. Annual Review of Plant. Biology 55, 373-399. 14. Kaliff M. et al. (2007): ABA Is Required for Leptosphaeria maculans Resistance via ABI1- and ABI4-Dependent Signaling. Molecular Plant-Microbe Interactions 20, 335345. 15. Potlakayla S.D. et al. (2007(: Systemic Acquired Resistance in Canola Is Linked with Pathogenesis-Related Gene Expression and Requires Salicylic Acid. Phytopathology 97, 794-802. 16. Liu S. et al. (2007): Comparison of Leptosphaeria biglobosa-induced and chemically induced systemic resistance to L. maculans in Brassica napus. Chinese Science Bulletin 52.

Tato práce byla finančně podpořena granty č. 21180/1312/3124 FAPPZ ČZU, a QH72117 (MZE). Izolát L. maculans JN2 poskytl laskavě Dr. T. Rouxel, INRA, Francie.

39

Papilárny mechamizmus nešpecifickej rezistencie pri pšenici Miroslav Švec Univerzita Komenského, Prírodovedeká fakulta, Katedra genetiky, Mlynská dolina B1 842 15 Bratislava e-mail: [email protected] Typy obranných mechanizmov Rastliny sa vo všeobecnosti môžu proti napadnutiu patogénom brániť rôznymi spôsobmi. Všetky známe typy obranných rekcií sa dajú začleniť do dvoch základných kategórií: konštitutívne a inducibilné obranné mechanizmy. Úlohou konštitutívnych obranných mechanizmov je spomalenie nástupu patogéna do pletív hostiteľa, čím rastlina získava viac času na vybudovanie indukovaných obranných reakcií (Hartleb a kol.,1997). Najčastejšie sa takéto mechanizmy prejavujú tvorbou kutikuly na vonkajšej strane epidermálnych buniek listov. Patogény na prekonanie tejto prekážky produkujú množstvo enzýmov degradujúcich kutín – ako napr. kutinázy, celulázy a xylanázy. Inducibilné obranné mechanizmy vznikajú v bunke až po jej napadnutí patogénnom. Pri tomto type obranných mechanizmov sa najčastejšie vytvárajú rôzne mechanické bariéry, alebo patogén môže byť eliminovaný prostredníctvom viacerých biochemických reakcií. Inducibilné obranné mechanizmy Tento typ obranných mechanizmov sa na základe ontogenetického štádia patogéna rozdeľuje na prehaustoriálne a posthaustoriálne. Prehaustoriálne obranné mechanizmy sú asociované predovšetkým s prestavbou bunkovej steny epidermálnych buniek. Lokálne modifikované oblasti bunkovej steny hostiteľa v mieste infekcie bez charakteristických štruktúr sa označujú ako halo efekty. Sú to lokálne depozity rôznych chemických látok: silíc a fenolov Heath a Stumpf, 1986), peroxidáz a hydrolytických enzýmov . Pri pšenici bol na rozdiel od jačmeňa identifikovaný aj lignín (Smart a kol., 1986). Fytoalexíny sú látky patriace k látkam s antifungálnym účinkom. Ich syntéza v bunke je naštartovaná prítomnosťou patogéna. Sú to nízkomolekulové a z hľadiska štruktúry veľmi rozmanité zlúčeniny. Väčšinu z nich môžeme zaradiť k izoflavonoidom, diterpénom, stilbénom, kumarínom a pod. Dosiaľ je známa štruktúra asi 400 fytoalexínov (Hartleb a kol.1997). Ich účinok spočíva predovšetkým v ovplyvňovaní permeability membrán a narušení ich integrity (Smith, 1996). K inducibilným obranným mechanizmom zaraďujeme aj tvorbu PR-proteínov (pathogenesis related proteins). Ich syntéza je indukovaná špecifickými procesmi patogenézy (Van Loon a Van Strien, 1999). Sú to monoméry s nízkou molekulovou hmotnosťou, stabilné pri nízkych hodnotách pH a odolné voči proteolytickým enzýmom, takže môžu fungovať aj v kyslom prostredí vakuol, v bunkovej stene a intercelulárnych priestoroch (Hartleb a kol. 1997). Tvorba reaktívnych kyslíkových radikálov a H2O2 (ROS – reactive oxygen species) je ďalším významným obranným mechanizmom. Cytochemické štúdie (Mellersh a kol., 2002) ukázali, že extracelulárna produkcia H2O2 súčasne s akumuláciou fenolických látok sa vyskytuje v miestach poškodenia bunkovej steny. Výraznejšie poškodenie bunkovej steny podmieňovalo deponovanie kalózy v miestach medzi plazmatickou membránou a bunkovou stenou. Podobná odpoveď rastlín sa prejavuje pri hostiteľskej aj nehostiteľskej rezistencii rastlín (Heath, 2002). Ďalšie údaje potvrdzujú, že primárnou úlohou H2O2 je pôsobiť ako signál pre dosiaľ neznáme obranné mechanizmy asociované s prestavbou bunkovej steny. Iné údaje však potvrdili hypotézu, že prítomnosť samotného H2O2 je dostačujúca na zabránenie 40

penetrácie (Mellersh a kol., 2002). Výraznejšie nahromadenie ROS môže vyústiť v programovanú bunkovú smrť, tzv. hypersenzitívnu reakciu. Hypersenzitívna reakcia je komplexný proces, je to prudká lokálna reakcia hostiteľa na atak patogéna, ktorej výsledkom je náhla smrť poškodenej bunky. Zvyčajne sa začína lokálnou agregáciou cytoplazmy v mieste penetrácie, rozsiahlou dezorganizáciou membrán, kolapsom bunky a formovaním hnedej autofluoreskujúcej hmoty. V susedných bunkách sa akumukujú fytoalexíny, aktivované sú aj PR-proteíny. U jačmeňa sa hypersenzitívna reakcia prejavuje v prítomnosti dominantných alel Mla12 a Mlg. Hückelhoven a kol. (1999) zistili, že hypersenzitívna bunková smrť u genotypov s uvedenými lokusmi bola asociovaná s akumuláciou H2O2 . Podobne komplexným procesom ako hypersenzitívna reakcia je aj typ obranných mechanizmov založených na tvorbe papíl. Papilárna rezistencia rastlín Morfologická štruktúra rastlinných buniek, ktorá má zabrániť prieniku patogénna do bunky sa označuje ako papila. Formuje sa v priestore medzi plazmatickou membránou a bunkovou stenou, v blízkosti cytoplazmatických agregátov, pod apresoriálnym hrotom patogéna. Je to všeobecná obranná reakcia na mechanické poškodenie ako aj na penetráciu patogéna, je to v podstate mechanická prekážka. Po kontakte s patogénom sa u rezistentných foriem začína v bunke syntetizovať kalóza (polysacharid β – 1,3 glukán), ktorá je transportovaná k bunkovej stene (Aist a Bushnell,1991) . Okrem kalózy, ktorá je hlavným komponentom papily, sa v jej štruktúre predpokladá prítomnosť antimikrobiálnych toxínov, fenolických látok (Heath, 2002), pektínu, celulózy, suberínu, lipidov, kremíka, ako aj proteínov typických pre bunkové steny, sú to tzv. hydroxyprolín bohaté glykoproteíny – HRGPs (Aist, 1976). Hückelhoven a kol. (1999) zistili, že u genotypov s Mlg a mlo5 rezistenciou bola tvorba H2O2 spojená iba s výskytom efektívnych papíl. Superoxidový radikál O2- sa v epidermálnych bunkách rezistentných genotypov vytvára oveľa dlhšiu dobu (36 hod.) ako pri senzitívnych (18 hod.) po inokulácii patogénom (Hückelhoven a Kogel, 1998). Papily sa formujú veľmi rýchlo, do 24 hodín po inokulácií až 85% infekčných miest sa vyznačuje výskytom papíl (Koga a kol., 1990). Papily sa prednostne tvoria v dlhých bunkách v porovnaní s krátkymi bunkami, ktoré sa nachádzajú v blízkosti prieduchov. V experimentoch, v ktorých bola pomocou elektrónovej mikroskopie sledovaná ultraštruktúra papíl sa zistilo, že genotypy s adultívnou rezistenciou mali v porovnaní so senzitívnymi genotypmi väčšie papily, a tieto papily sa vyznačovali kompaktnejšou, amorfnou, alebo globulárnou štruktúrou (Heitefuss a Ebrahim-Nesbat, 1986). Naopak papily senzitívnych genotypov boli charakteristické viac-menej uniformnou distribúciou menších a menej hustých štruktúr viditeľných v elektrónovom mikroskope. Papilárna rezistencia jačmeňa siateho Odolnosť rastlín jačmeňa siateho voči múčnatke trávovej (Blumeria graminis f.sp.hordei) sprostredkovaná tvorbou efektívnych papíl bola zaznamená tak pri nešpecifickej (adultívnej) ako aj pri špecifickej (Mlg) rezistencii. Typickým príkladom papilárnej rezistencie je mlo rezistencia, ktorá vzhľadom k tomu, že je trvanlivá a podieľa sa na nej viacero faktorov, je považovaná za rasovo nešpecifickú. Aj keď je nešpecifická, je podmienená pôsobením recesívneho génu (mlo) lokalizovaného na 4.chromozóm (Jørgensen, 1975). Spolu s týmto génom spolupôsobia aj ďalšie gény, ktoré sú súčasťou signálnych dráh vedúcich k obranným reakciam. Efekt tohto génu spočíva v tom, že vnútrobunkové výrastky, vznikajúce v miestach poškodenia bunkovej steny a všeobecne označované ako papily rastú rýchlejšie, ich frekvencia býva výššia, čo často podmieňuje bunkovú smrť. Tvorba nekrotických škvŕn sa najviac prejavuje v čase klasenia rastlín (Schwarzbach, 1976).

41

Dôsledkom zvýšeného výskytu nekróz je nižšia úroda, približne o 4 % (Kjær a kol., 1990). Charakteristickým rysom mlo rezistencie je občasný výskyt kolónií patogéna. Ich frekvencia závisí aj na type bunky na ktorej spóra vyklíčila. Infekčná účinnosť patogéna meraná počtom vyrastených kolónií z celkového množstva infekčných jednotiek je najvyššia na stomatálnych bunkách (0.8 %), najmenšia na dlhých bunkách – 0.003 % (Jørgensen, 1992). Aj množstvo vytváraných papíl sa paralelne zväčšuje s vyšším ontogenetickým štádiom hostiteľa. Papily senzitívnych rastlín sú asi o 50 % menšie ako papily rezistentných mlo rastlín. Viaceré štúdie potvrdili, že rozhodujúcu úlohu v zložení papíl zohráva kalóza (Bayles a kol., 1990; Yokohama a kol, 1991). Ďalšie údaje poukazujú na to, že tvorba efektívnych papíl je u rezistentných Mlg a mlo5 genotypov doprevádzaná výskytom H2O2 až do vzdialenosti 2 μm od papily (Hückelhoven a kol.,1999). Tieto výsledky podporujú hypotézu, že H2O2 hrá základnú úlohu v obrannej reakcii voči múčnatke trávovej. Zvýšená produkcia H2O2 sa vyskytuje aj pri nehostiteľskej rezistencii, napr. po inokulácii mlo rastlín spórami pšeničnej múčnatky (Blumeria graminis f.sp.tritici). Zvláštnosťou je, pšeničná múčnatka indukuje u genotypu mlo5 hypersenzitívnu reakciu, zatiaľčo jačmenná múčnatka takúto zmenu neindukuje (Hückelhoven a kol.,2001). Významnou zložkou papíl mlo rastlín sú aj fenolické látky. Štrukturálna analýza potvrdila, že jednou z takýchto látok je fenolický konjugát pkumaroyl-hydroxyagmatín, p-CHA (Röpenack a kol., 1998). Takýto účinok však nemal nehydroxylovaný derivát p-kumaroyl-agmatín. Predpokladá sa, že p-CHA a rýchlosť tvorby papíl hrá významnú úlohu v rasovo nešpecifickej rezistencii. Rezistencia podmienená recesívnymi alelami Mlo lokusu je vlastne dôsledkom mutácie a znefunkčnenia pôvodnej alely. Dosiaľ je známych 30 recesívnych alel, ktoré sa od seba vzájomne odlišujú rôznymi deléciami a substitúciami (Pifanelli a kol.,2002), z nich napríklad mlo-16 a mlo-30 sú defektné v intrónovom splicingu. Rezistencia podmienená alelami mlo-12 a mlo-28 je parciálna. Freialdenhoven a kol.(1996) zistili, že pre úplnú expresiu mlo rezistencie je nevyhnutná prítomnosť ďalších dvoch génov – Ror 1 a Ror 2 (required for mlo- specified resistance). U mutantných mlo/ror rastlín dochádza k supresii tvorby papíl v bunkových stenách. Mutanti v Ror génoch sa vyznačujú menšou akumuláciou H2O2 v miestach pod apresóriom, avšak vyššou frekvenciou hypersenzitívnej reakcie ako rezistentný genotyp s mlo5 alelou (Hückelhoven a kol.2000). Papilárna rezistencia pšenice Papilárne podmienenej rezistencii pšenice voči múčnatke trávovej bola v porovnaní s jačmeňom venovaná oveľa menšia pozornosť. Kmecl a kol.(1995) zistili, že u odrôd pšenice bez génov špecifickej rezistencie tvorba papíl a agregátov v bunkovej stene bola vhodným indikátorom vyššej kvantitatívnej rezistencie v poľných podmienkach. U odrôd vykazujúcich vyšší stupeň poľnej kvantitatívnej rezistencie až 80 % buniek reagovalo formou prestavby bunkových stien, kým u senzitívnych to bolo iba 20 %. Hodnota korelačného koeficientu medzi percentom buniek reagujúcich tvorbou papíl a kvantitatívnou poľnou rezistenciou bola 0.766. V pokusoch, v ktorých bola sledovaná úloha kremíka v rezistencii voči múčnatke trávovej bolo zistené, že rastliny ovplyvnené kremíkom reagovali na atak patogéna zvýšenou tvorbou papíl, produkciou kalózy a glykolyzovaných fenolov (Bélanger a kol., 2002,2005). Preukazateľne vyššia frekvencia tvorby efektívnych papíl bola zistená u genotypov nesúcich gény špecifickej rezistencie Pm2 (Ulka/8xCc) a Pm2+6 Mardler (Li a kol. 2005). Akumulácia H2O2 v blízkosti papíl bola podobná u rezistentných aj náchylných pšeničných línií. Identifikovať mlo rezistenciu sa u pšenice dosiaľ nepodarilo. Elliottovi a kol. (2002) sa podarilo nájsť homológa jačmenného Mlo, ktorý je lokalizovaný na syntenických miestach všetkých troch genómov hexaploidnej pšenice. Kandidátny ortologický gén bol označený ako TaMlo-A1, TaMlo-B1 a TaMlo-D1 kóduje tri odlišné, avšak veľmi príbuzné proteíny, a je na 88 % identický s jačmenným MLO proteínom. Podobne ako u jačmenného Mlo, aj u pšenice

42

vedie superexpresia týchto génov k nadmierne senzitívnemu fenotypu. MLO proteín pšenice pozostávajúci z 534 aminokyselín, s vysokou homológiou s ostatnými rastlinnými MLO proteínmi identifikovali Yu a kol. (2005). Homeologické Ta Mlogény boli týmito autormi lokalizované na 2AL, 2BL a 2DL chromozómy pšenice. V našich experimentoch sme sa snažili určiť papilárny mechanizmus rezistencie u tetraploidných genotypov pšenice, ktoré vykazovali vysoký stupeň rezistencie voči múčnatke trávovej (Blumeria graminis f.sp.tritici) v poľných podmienkach. Spomedzi 180 vzoriek pšenice dvojzrnovej (Triticum turgidum ssp. dicoccum) sme vybrali 10 vzoriek s najvyšším stupňnom rezistencie (bodové hodnotenie 9) v poľných podmienkach a 2 vzorky s priemernou rezistenciou (CGN 7967 a TRI 17 204 s bodovým hodnotením 5) (Tab.1). Ako pozitívnu kontrolu sme vybrali hexaploidnú pšenicu Amigo a ako negatívna kontrola slúžila čínska odroda Ai-bian 1. Kontrolné odrody sa nám osvedčili v prechádzajúcich experimentoch, tak v poľných ako aj laboratórnych podmienkach. V laboratórnych podmienkach sme overovali rezistenciu uvedených genotypov pomocou parametra infekčnej účinnosti patogéna (IÚ1) na primárnom liste 10 dňových klíčencov. U tých istých vzoriek sme minimálne na 150 infekčných miestach vyhodnocovali výskyt papíl (Tab.2). Tab.1: Hodnotenie nešpecifickej rezistencie tetraploidných genotypov pšenice v poľných podmienkach (9 – rezistentný genotyp, 1 – náchylný genotyp). Genotyp FAR 23 FAR 32 FAR 41 FAR 59 FAR 50 CGN 7967 Amigo

Hodnotenie 9 9 9 9 9 5 9

Genotyp CGN 7975 UAO 300001 UAO 300002 TRI 5329 TRI 11 293 TRI 17 204 Ai-bian 1

Hodnotenie 9 9 9 9 9 5 1

Vysokým stupňom rezistencie v poľných podmienkach sa vyznačovalo 5 vzoriek z Talianska (FAR vzorky), dva genotypy z Ukrajiny (UAO 300001 a UAO 300002) a vzorky CGN 7975 (Kuvajt), TRI 5329 (Švajčiarsko) a TRI 11 293 (Slovensko). U všetkých týchto vzoriek s výnimkou FAR 41 korelovala poľná rezistencie s rezistenciou identifikovanou v laboratórnych podmienkach. Infekčná účinnosť patogéna (t.j. počet infekčných jednotiek v štádiu sekundárnej hýfy na 100 infekčných jednotiek v štádiu apresória) bola pri všetkých týchto vzorkách nižšia ako na rezistentnej odrode Amigo. Keďže aj vzorka FAR 41 sa vyznačuje vysokým stupňom poľnej rezistencie, predpokladáme, že u nej sa mechanizmy rezistencie uplatňujú v neskorších ontogenetických štádiach. Na základe kritérií použitých pri sledovaní rezistencie v laboratórnych podmienkach, môžeme za najodolnejšie považovať genotypy FAR 32, UAO 300001 a TRI 11 293. Vysoký výskyt papíl sme zaznamenali u talianskej dvojzrnky FAR 60, u ktorej bolo približne 3-krát viac infekčných miest s výskytom papíl ako infekčných miest bez výskytu papíl. U tejto vzorky je vysoko pravdepodobné, že rezistencia voči múčnatke je zabezpečená práve tvorbou efektívnych papíl. S určitosťou by sa to však dalo tvrdiť až po identifikácii tvorby H2O2 v blízkosti papíl. Papilárny mechanizmus rezistencie môžeme predpokladať aj u vzorky CGN 7975 a u oboch ukrajinských vzoriek. Zaujímavé je zistenie, že aj vzorky FAR 41 a TRI 17204, ktoré sa vyznačujú iba miernou rezistenciou v skorých ontogenetických štádiach majú relatívne vysoký počet infekčných miest s výskytom papíl. Túto skutočnosť je možné vysvetliť na základe nižšej efektívnosti týchto papíl, ktoré pravdepodobne neobsahujú komponenty zabráňujúce prieniku patogéna do epidermálnych buniek. 43

Tab. 2: Hodnotenie nešpecifickej rezistencie tetraploidných pšeníc na základe parametrov infekčnej účinnosti patogéna na primárnom liste (IÚ1) a papilárneho indexu Genotyp IÚ1 Papilárny index FAR 23 27 122 FAR 32 2 106 FAR 41 135 150 FAR 59 8 100 FAR 60 38 286 UAO 300001 1 130 UAO 300002 8 141 CGN 7967 69 53 CGN 7975 1 180 TRI 5329 5 46 TRI 11293 0 63 TRI 17204 90 163 Amigo 38 33 Ai-bian 1 126 9 Súhrn Papilárny mechanizmus rezistencie je jedným z viacerých spôsobov, ktorými sa rastliny bránia voči prieniku patogéna do ich pletív a buniek. Tvorba efektívnych papíl býva doprevádzaná produkciou látok spomaľujúcich prerastanie apresória cez papilu, ako sú napr. kalóza, fenoly, kyslíkové radikály a najmä produkcia H2O2. Tento typ rezistencie sa dosiaľ najviac uplatnil u jačmeňa siateho. Táto rezistencia označovaná u jačmeňa ako mlo rezistencia je podmienená mutantnou recesívnou alelou a viacerými signálnymi génmi, z ktorých najdôležitejšiu úlohu hrajú gény Ror1 a Ror2. Výsledným efektom je u takéhoto genotypu tvorba papíl s akumuláciou H2O2 v miestach pod apresóriom. Aj u pšenice letnej bola zaznamenaná tvorba papíl najmä v súvislosti s prejavom nešpecifickej rezistencie. Nie je to ale rezistencia typu mlo ako u jačmeňa. Hoci homológy dominantnej alely tohto génu boli identifikované aj u pšenice, recesívna alela objavená ešte nebola. Perspektívnym sa javí umlčanie takejto dominantnej alely (gene silencing), čím by sa zabezpečil podobný efekt ako u mlo rezistencie jačmeňa. Tvorba papíl u pšenice môže však byť ukazovateľom nešpecifickej rezistencie. Skríning nešpecifickej rezistencie v skorých ontogenetických štádiach, podmienenej papilárnym mechanizmom je možné realizovať aj v laboratórnych podmienkach . Takýmto postupom je možné identifikovať aspoň časť genotypov s vysokým stupňom rezistencie. Medzi perspektívne zdroje nešpecifickej rezistencie môžeme zaradiť aj viaceré genotypy pšenice dvojzrnovej. Obr.1: Spóra múčnatky trávovej a papila u genotypu pšenice CGN 7975. s = spóra, j = jadro, ap = apresórium, p = papila

44

45

Obr.2: Spóra múčnatky trávovej a papila u genotypu pšenice FAR 60. s = spóra, ap = apresórium, p = papila

46

Literatúra Aist J.R. (1976): Annu.Rev.Phytopathol. 14, 145-163. Aist J.R., Bushnell, W.R.(1991): In:Cole,G.T.-Hoch,H.C.(eds):The spore and disease initiation in plants and animals. New York, Plenum Press,321-345. Bayles, C.J. a kol. (1990): Physiol. Mol. Plant Pathol. 36, 63-72 Bélanger, R.R. a kol. (2002): Phytopathology 93,402-412. Elliott, C. a kol. (2002):MPMI 15,1069-1077. Freialdenhoven, A. a kol.(1996).The Plant Cell 8: 5-14. Hartleb, H. a kol. (1997).Resistance of Crop Plants against Fungi . GFV, Jena, Stuttgart, Lubeck, Ulm, 570s. Heath M.C.(2002):Can.J.Plant Pathol. 24,359-364. Heath M.C., Stumpf M.A. (1986): Physiol. Mol. Plant Pathol. 29, 27-39. Heitefuss R., Ebrahim-Nesbat F. (1986): J.Phytopathology 116, 358-373. Hückelhoven, R. a kol. (1999). Plant Physiol. 119: 1251-1260. Hückelhoven, R. a kol.(2000).Molecular Plant Pathology 1:287-292. Hückelhoven R., Kogel K.H. (1998): MPMI 11,292-300. Jørgensen J.H.(1975): In: Proc.Symp.Barley genetics III, Garching:446-455. Jørgensen J.H.(1992):Euphytica 63,141-152. Kjær, B. a kol. (1990). Euphytica 46: 185-193. Kmecl, A. a kol.(1995). Physiol. Mol. Plant Pathol. 47: 185-199. Koga, H. a kol. (1990). Can. J. Bot.:68: 2344-2352. Li, A. a kol. (2005). Plant Pathology 54:308-316. Mellersh D.G. a kol.(2002). Plant J. 29:257-268. Pifanelli, P. a kol.(2002). Plant Physiology 129: 1076-1085. Rémus-Borel, W. a kol. (2005). Physiol. Mol. Plant Pathol. 49:108-115. Röpenack, E.a kol. (1998). Journal of Biological Chemistry 273, 9013-9022. Schwarzbach E. (1976): In: Barley Genetics III, Karl Thiemig, München, 440-445. Smart, M.G. a kol. (1986). Can. J.Bot. 64: 793-801. Van Loon L.C., Van Strien E.A. (1999: Physiol. Mol. Plant Pathol. 55, 85-97.

47

Příspěvek k poznání endofytické mykobioty větví a listů jabloní a jejich vztahu k fytopatogenním houbám David Novotný Výzkumný ústav rostlinné výroby v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně, e-mail. [email protected] V roce 2005 byla na 2 lokalitách v České republice zkoumána endofytická mykobiota větví a listů jabloní (Malus domestica). Ve větvích a listech bylo zjištěno okolo 65 a 60, respektive morfotypů hub. Nejčastěji se vyskytujícími endofytickými houbami ve větvích byly druhy Pleurophoma cava, Alternaria alternata, Aureobasidium pullulans, Seimatosporium cf. lichenicola¸ Phomopsis cf. mali a Microsphaeropsis sp. V listech dominantní taxony byly Alternaria alternata, Aureobasidium pullulans, Cladosporium herbarum a Venturia inequalis. Mnohé z těchto dominantních druhů jsou známy jako patogeny jabloní nebo jako saprofyty znehodnocující plody. Při studiu interakcí rostliny a fytopatogenních mikroorganismů se v posledních letech ukazuje, že se nejedná pouze o přímé vztahy mezi těmito dvěmi organismy (hostitel x patogen), ale o interakci s dalšími organismy, které žijí přirozeně v rostlině (endofytické houby a bakterie) a které výrazně ovlivňují fytopatogenní působení mikroorganismů (Kehr 1998). Většina zdravých rostlin hostí společenstvo endofytických hub, které většinou nezpůsobují rostlinám žádné onemocnění, ale některé z nich se za určitých podmínek mohou stát slabými fytopatogennní organismy. Každý druh rostliny hostí specifické společenstvo endofytů. Rozdíly ve složení endofytické mykobioty je i mezi jednotlivými orgány (listy, větve, kořeny) určitého druhu hostitele (Fisher & Petrini 1990, 1992; Fisher et al. 1995; Halmschlager et al. 1993; aj.). Co se týče kvantitativního a kvalitativního složení endofytické mykobioty rostlin, tak dosud nejvíce zkoumanými skupinami rostlin jsou jehličnaté i listnaté dřeviny (např. Carroll & Carroll 1978, Danti et al. 2002, Kowalski & Kehr 1992, aj.), trávy (např. Latch et al. 1984, Riesen & Sieber 1985, White & Baldwin 1992) a druhy z čeledi Ericaceae (např. Hambleton & Currah 1997, Okane et al. 1998, Petrini 1985). Zpočátku byly studovány hlavně druhy z mírného pásma, ale v posledních letech jsou zkoumány i rostliny z tropů (např. Beena et al. 2000, Cannon & Simmons 2002, aj.). Studiu endofytů hospodářsky významných rostlin je celosvětově věnována menší pozornost. Dosud byla zkoumána endofytická mykobiota rýže Oryza sativa - Fisher & Petrini 1992), pšenice (Triticum aestivum - Riesen & Sieber 1985, Crous et al. 1995), révy vinné (Vitis vinifera - Mostert et al. 2000), kukuřice (Zea mays Fisher et al. 1992) a jabloně (Malus domestica - Serdani et al. 1998, Camatti-Sartori et al. 2005). V České republice byly dosud zkoumány endofyty travin (Cagaš & Marvanová), dubů (Quercus robur a Q. petraea – Novotný 2003). V současné době probíhá studium endofytů révy vinné (Šilhánová & Novotný) a jabloní, protože bez znalosti endofytické (přirozené) mykobioty zemědělsky významných rostlin není možné poznat ekologii závažných houbých patogenů těchto rostlin. Endofytickým houbám jabloní a zhodnocení jejich potenciálního fytopatogenního působení je věnován tento příspěvek. Mykobiota větví a listů jabloní byla studována na 2 lokalitách (Bítouchov u Semil a lokalitě Praha-Ruzyně) v České republice. Vzorky větví a listů byly odebírány v roce 2005 ve

48

třech obdobích (květen, červenec a říjen), přičemž při každém odběru bylo z každé lokality odebráno 5 tenkých větví (do síly 5 mm) a 10 listů. Listy i větve byly v této práci zkoumány metodou založenou na silné povrchové sterilizaci. Vzorky byly očištěny pod tekoucí vodovodní vodou a po té povrchově sterilizovány. V případě větví byla povrchová sterilizace následující: 1) 1 minutu v 96% ethanolu, 2) 3 minuty v 10% roztoku chlornanu sodného (NaClO), 3) 30 sekund v 96% ethanolu a 4) opláchnutí ve sterilní vodě. Listy byly povrchově sterilizovány následně: 1) 30 sekund v 70% ethanolu, 2) 1 minutu v 1% roztoku chlornanu sodného (NaClO), 3) 15 sekund v 70% ethanol a 4) opláchnutí ve sterilní vodě. Listy byly rozděleny na řapíky a čepele a větvě byly pouze rozříznuty podélně. Tato pletiva byla rozřezána na segmenty o velikosti 3-7 x 1-7 x 0,5-1 mm, které byly přeneseny na Petriho misky s 2 % malt extrakt agarem, přičemž na jednu misku bylo pokládáno pět segmentů. Inkubace hub probíhala vždy při teplotě 20-25 °C a po 3-4 týdnech byly vyrostlé kolonie hub prohlíženy, určovány nebo přeočkovávány na izolační a determinační agarové půdy. Endofytická mykobiota listů Dosud byly ve zkoumaných větvích identifikováno 65 druhů a morfotypů hub. Houby kolonizovaly větve se zhruba stejnou frekvencí v květnu, červenci i říjnu. Byly zjištěny v 96100% studovaných větví a v tomto směru nebyl pozorován žádný rozdíl mezi oběmi lokalitami. Dominantními druhy byly Pleurophoma cava, Alternaria alternata, Aureobasidium pullulans, Seimatosporium cf. lichenicola¸ Phomopsis cf. mali a Microsphaeropsis sp. Byla zjištěna podobnost ve složení spektra dominantních druhů hub na obou studijních plochách, ale přesto jisté odlišnosti byly pozorovány. Vyšší druhová diversita byla pozorována na lokalitě Bítouchov u Semil. Druhy Cryptosporiopsis sp. (anamorfní stadiium k rodu Pezicula) a Seimatosporium cf. lichenicola se vyskytovaly relativně často ve větvích z této lokality, zatímco na lokalitě ve středních Čechách byly jejich výskyt nižší. Z větví z lokality Bítouchov bylo dosud izolováno a určeno okolo 57 morfotypů hub. Nejčastěji se vyskytovaly druhy Aureobasidium pullulans, Pleurophoma cava, Phomopsis cf. mali a Seimatosporium cf. pestalotioides. Tab.: Seznam druhů zjištěných a dosud určených na rodovou nebo druhovou úroveň ve větvích jabloní z lokality Bítouchov u Semil Penicillium sp. Alternaria alternata Pezicula sp. Aureobasidium pullulans Basidiomycet sp. 1 Phoma sp. 1 Phoma sp. 2 Cladosporium cladosporioides Phoma sp. 3 Cladosporium herbarum Coryneum sp. 1 Phomopsis cf. mali Epicoccum nigrum Pleurophoma cava Fusarium sp. Prosthemium sp.1 Geniculosporium serpens Sarcinomyces crustaceus Seimatosporium cf. lichenicola Microsphaeropsis sp. Nodulisporium sp. 1 Spiniger sp. Z větví z lokality Praha - Ruzyně bylo dosud izolováno a určeno okolo 52 morfotypů hub. Nejčastěji se vyskytujícími druhy byly Aureobasidium pullulans, Alternaria alternata a Pleurophoma cava. 49

Tab. Seznam druhů zjištěných a dosud určených na rodovou nebo druhovou úroveň ve větvích jabloní z lokality Praha-Ruzyně Penicillium sp. Alternaria alternata Arthrinium phaeosphaerum Pezicula sp. Phoma sp. 1 Aureobasidium pullulans Phoma sp. 2 Botrytis cinerea Phoma sp. 3 Cladosporium cladosporioides Phoma sp. 4 Cladosporium herbarum Phomopsis cf. mali Cladosporium sp. Epicoccum nigrum Pleurophoma cava Geniculosporium serpens Sarcinomyces crustaceus Microsphaeropsis sp. Seimatosporium cf. lichenicola Nodulisporium sp. 1 Sordaria fimicola Endofytická mykobiota listů Dosud bylo v průběhu práce zaznamenáno okolo 60 morfotypů hub. Nejčastěji pozorovanými byly druhy Alternaria alternata, Aureobasidium pullulans, Cladosporium herbarum a Venturia inequalis. Bylo zjištěno, že četnost výskytu hub stoupá se stářím listu a byly pozorovány rozdíly ve složení mykobioty mezi lokalitami. Z listů z lokality Bítouchov u Semil bylo dosud izolováno a identifikováno okolo 55 morfotypů hub. Nejčastěji se vyskytujícími druhy byly Alternaria alternata, Aureobasidium pullulans, Cladosporium herbarum, Venturia inequalis a Phoma spp. Tab.: Seznam druhů hub zjištěných a dosud určených na rodovou nebo druhovou úroveň v listech z lokality Bítouchov u Semil Acremonium sp. Nodulisporium sp. 1 Nodulisporium sp. 2 Alternaria alternata Periconia sp. Apiospora montagnei Pezicula sp. Aureobasidium pullulans Basidiomycet sp. 1 Phoma sp. 1 Phoma sp. 2 Botrytis cinerea Chaetomium sp. Phoma sp. 3 Phoma sp. 4 Cladosporium cladosporioides Phomopsis cf. mali Cladosporium herbarum Cladosporium herbarum var. Pleurophoma cava macrocarpum Seimatosporium cf. lichenicola Cladosporium sphaerospermum Sordaria sp. Epicoccum nigrum Fusarium sp. Ulocladium sp. Geniculosporium serpens Venturia inaequalis Microsphaeropsis sp. V listech z lokality Praha - Ruzyně bylo dosud zjištěno okolo 48 morfotypů hub. Nejčastěji se vyskytujícími druhy byly Alternaria alternata, Aureobasidium pullulans a Cladosporium herbarum a Phoma spp.

50

Tab.: Seznam druhů hub zjištěných a dosud určených na rodovou nebo druhovou úroveň v listech z lokality Praha – Ruzyně Alternaria alternata Geniculosporium serpens Microsphaeropsis sp. Apiospora montagnei Nodulisporium sp. Aureobasidium pullulans Basidiomycet sp. 1 Phoma sp. 1 Phoma sp. 2 Botrytis cinerea Phomopsis cf. mali Cladosporium cladosporioides Cladosporium herbarum Pleurophoma cava Cladosporium herbarum var. Seimatosporium cf. lichenicola macrocarpum Epicoccum nigrum Sordaria fimicola Fusarium sp. Venturia inaequalis Z výše prezentovaných výsledků je na první pohled vidět, že některé ze jmenovaných druhů jsou známými patogeny jabloní. Prvním z nich je druh Venturia inaequalis s anamorfním stadiem Spilocaea, který byl v průběhu studia často zaznamenávána ve zdravých listech, ale nikoliv na větvích. V. inaequalis je známý fytopatogenní druh způsobující strupovitost jabloní projevující se na listech a plodech (Riggs 1990). Z uvedeného je vidět, že tento druh má přirozený rezervoár výskytu ve zdravých listech na nichž v průběhu stárnutí listu dochází ke změně jeho chování a houby vytváří mycelium a rozmnožovací útvary (konidiofory a konidie) na povrchu listu a chová se jako nektrotrofní parazit. Druh Phomopsis mali je znám jako původce phomopsisové rakoviny a hniloby ovoce (Rosenberger 1990), přitom tento druh byl v průběhu prezentované práce často zjištěn ve zdravých větvích což ukazuje na typické chovaní endofytů, které žijí asymptomaticky v rostlině a navenek se projevují při oslabení hostitele. V případě druhu Alternaria alternata, který byl nejčastěji zaznamenán v listech, se jedná o organismus, který se může změnit z endofyta na patogena a způsobovat alternariovou skvrnitost listů (Sawamura 1990). Podobně listové skvrnitosti (phomová skvrnitost listů a plodů) mohou způsobovat zástupci rodu Phoma (Pennycook 1990), kteří byli poměrně často zjištěni jako endofyty jak v listech, tak ve větvích jabloní. Druhy Alternaria alternata Cladosporium cladosporioides, C. herbarum, Epicoccum nigrum, Fusarium sp., Penicillium sp., Botrytis cinerea jsou, jak se ukázalo, běžnou součást endofytické mykobioty a přitom jsou známy jako původci hnilob ovoce a to jak ve fázi před sklizní (Rosenberger 1990b, Spotts 1990) tak během uskladňování (Rosenberger 1990c). Jako endofyty, které se mohou přeměnit v patogeny ovocných dřevin, jsou zástupci rodu Pezicula sp. (Ooki et al 2003), jež byli s nemalou četností zaznamenáni ve větví v průběhu této práce. Z uvedeného je vidět, že mnoho druhů dominujících endofytické mykobiotě se při oslabení obranných mechanismů rostliny chová jako parazity nebo jako saprofyty. Naskýtá se zde mnoho otázek týkající se vzájemných vztahů jabloně jakožto hostitele, známých patogenů a nepatogenních druhů hub, na které by bylo vhodné nalézt odpověď nejen akademických, ale i praktických důvodů.

51

Literatura Beeenaeena K. R., Ananda K. and Sridhar K. R. (2000): Fungal endophytes of three sand dune plant species of west coast of India. - Sydowia 52, 1-9. Camatti-Sartori V., da Silva-Ribeiro R.T., Valdebenito-Sanhueza R.M., Pagnocca F.C., Echeverrigaray S. et Azevedo J.L. (2005): Endophytic yeasts and filamentous fungi associated with southern Brazilian apple (Malus domestica) orchards subjected to conventional, integrated or organic cultivation - , J. Basic Microbiol. 45, 397-402. Cannon P. F. and Simmons C. M. (2002): Diversity and host preference of leaf endophytic fungi in the Iwokrama Forest Reserve, Guyana. - Mycologia 94, 210-220. Carroll G. C. and Carroll F. E. (1978): Studies on the incidence of coniferous needle endophytes in the Pacific Northwest. - Can. J. Bot. 56, 3034-3043. Crous P. W., Petrini O. Marais G. F., Pretorius Z. A. et Rehder F. (1995): Occurence of fungal endophytes in cultivars of Triticum aestivum in South Africa - , Mycoscience 36, 105111. Danti R., Sieber T. N. and Sanguineti G. (2002): Endophytic mycobiota of European beech (Fagus sylvatica) in the Apennines. - Mycol. Res. 106, 1343-1348. Fisher P. J. and Petrini O. (1992): Fungal saprobes and pathogens as endophytes of rice (Oryza sativa L.). - New Phytol. 120, 137-143. Fisher P. J., Petrini O. et Scott H. M. L. (1992): The distruibution of some fungal and bacterial endophytes in maize (Zea mays L.) - Cambridge, New Phytol. 122, 299-305. Kehr R. D. (1991): Pezicula canker of Quercus rubra L., caused by Pezicula cinnamomea (DC.) Sacc. I. Symptoms and pathogenesis - Eur. J. For. Path. 21, 218-233. Kehr R. (1998): Zur Bedeutung pilzlicher Endophyten bei Waldbäumen. - Mitt. Biol. Bundesanst. Land - Forstwirtsch. Berlin-Dahlem 349, 8-30. Kowalski T. and Kehr R. D. (1992): Endophytic fungal colonization of branch bases in several forest tree species. - Sydowia 44, 137-168. Mostert L., Crous P. W. et Petrini O. (2000): Endophytic fungi associated with shoots and leaves of Vitis vinifera, with specific reference to the Phomopsis viticola complex Horn, Sydowia 52, 46-58. Latch G. C. M., Christensen M. J. and Samuels G. J. (1984): Five endophytes of Lolium and Festuca in New Zealand - Ithaca, Mycotaxon 20 (2), 535-550. Novotný D. (2003): A comparison of two methods for the study of microscopic fungi associated with oak roots. - Czech Mycol. 55 (1-2), 73-82. Ooki Y. , Fujita T. and Harada Y. (2003): Pezicula cinnamomea from cherry tree: pathogenicity tests and photomorphogenesis in culture - Mycoscience 44, 319-326. Pennycook S. R. (1990): Phoma leaf and fruit spot. - In: Jones A. L. and Aldwinckle H. S. (eds.) Compendium of apple and pear diseases, p. 26, St. Paul. Riesen T. and Sieber T. (1985): Endophytic fungi in winter wheat (Triticum aestivum L.). 190 p. Zürich. Riggs A. R. (1990): Apple scab. - In: Jones A. L. and Aldwinckle H. S. (eds.) Compendium of apple and pear diseases, p. 6-8, St. Paul. Rosenberger D. A. (1990): Phomopsis cancor, rough bark, and fruit decay. - In. Jones A. L. and Aldwinckle H. S. (eds.) Compendium of apple and pear diseases, p. 38-39, St. Paul. Rosenberger D. A. (1990b): Dry eye rot. - In. Jones A. L. and Aldwinckle H. S. (eds.) Compendium of apple and pear diseases, p. 28-29, St. Paul. Rosenberger D.A. (1990c): Miscellaneous postharvest decay fungi - In. Jones A. L. and Aldwinckle H. S. (eds.) Compendium of apple and pear diseases, p. 60-61, St. Paul. Sawamura K. (1990): Alternaria blotch. - In. Jones A .L. and Aldwinckle H. S. (eds.) Compendium of apple and pear diseases, p. 24-25, St. Paul.

52

Serdani M., Crous P. W., Holz G. and Petrini O. (1998): Endophytic fungi associated with core rot of apples in South Africa, with specific reference to Alternaria species - Horn, Sydowia 50, 257-271. Spotts R. A. (1990): Moldy core and core rot. - - In. Jones A. L. and Aldwinckle H. S. (eds.) Compendium of apple and pear diseases, p. 29-30, St. Paul. White J. F. and Baldwin N. A. (1992): A preliminary enumeration of grass endophytes in west central England. - Sydowia 44, 78-84. Práce podpořena projekty MZe NAZV č. QF 4074 a MZe 000270603.

53

Nové poznatky v interakci hostitel patogen napomohou ke zlepšení našeho biologického chápání. To přispěje k vytvoření lepších základů pro udržitelné použití zdrojů.

54

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 161 06 Praha 6 – Ruzyně, Drnovská 507 Odborný garant: Ing. Lubomír Věchet, CSc. ISBN: