Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Investice do rozvoje vzdělávání

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.


Genomika (KBB/GENOM)



SNPs Odvozování a genotyping Ing. Hana Šimková, CSc.



Cíl přednášky - seznámení s problematikou hledání SNP, odvozování SNP markerů a charakterizací genotypu (genotyping)

Klíčová slova - SNP markery, SNP genotyping, resekvenování, sekvenování pomocí hybridizace, y , heteroduplexy, p y, minisekvenační metody, y, metodyy založené na fluorogenních systémech, Illumina GoldenGate Assay


SNP A GENOTYPING Objevování SNP A) resekvenováním - SNP se nacházejí na základě porovnávání sekvencí

získaných z různých jedinců, genotypů, linií 1. Identifikace SNP  srovnáním celogenomové sekvence s cDNA sekvencemi v G B k GenBank  srovnáním ESTů v databázích s využitím statistických programů (např. PolyBayes – odhaluje „nepravé“ SNP)  srovnáním genomových sekvencí z různých jedinců 2. Ověření SNP  resekvenováním úseku DNA kolem SNP z 10-100 jedinců  metodami používanými pro genotyping

Resekvenování cílových oblastí

NimbleGen Sequence capture - zachycení cílových sekvencí ze vzorků fragmentované genomické DNA hybridizací na mikročip - na mikročipu naneseny sondy pro cílové oblasti - např. exony nebo oblasti vykazující asociaci s chorobami - odmytí nenavázaných fragmentů - vymytí a amplifikace zachycených fragmentů - osekvenování pomocí technologie 454 Mikročipy py vyráběny y y na zakázku - sestava sekvencí dle přání zákazníka - až 5 Mb sekvencí

B) nalezením polymorfismů bez sekvenování a) metody vycházející ze specifických vlastností heteroduplexní DNA (= dvouřetězcová DNA, kde každý řetězec nese jinou alelu, vytváříme ji in vitro) – je méně stabilní než homoduplex, dříve denaturuje - vzniká niká po PCR amplifikaci st studovaného do aného lok lokusu, s následo následované ané denat denaturací rací a renaturací tvorba homoduplexů a heteroduplexů 

DHPLC (denaturující HPLC) – produkty PCR po renaturaci se nanesou na chromatografickou kolonu, eluce fragmentů za pomoci organického rozpouštědla. Heteroduplexy jsou pomalejší.



DGGE (denaturující gradientová gelová elektroforéza) – na polyakrylamidovém gelu s denaturačním gradientem (močovina). Heteroduplexy denaturují dříve – zpomalí se.



TILLING (cíleně indukovaná lokální léze v genomech)

TILLING ((targeting g g induced local lesions in genomes) g ) - k detekci SNP (EcoTILLING) a indukovaných mutací ((TILLING)) Založena na schopnosti nukleáz specifických pro jednořetězce štěpit heteroduplexy. heteroduplexy Hledání polymorfismu (SNP) mezi jedinci s normálním (N) a mutantním (M) fenotypem: - z obou se naizoluje DNA DNA, pomocí PCR se naamplifikuje určitý úsek (gen), smíchá se, zdenaturuje. Při renaturaci se tvoří jednak homoduplexy (pro N i M genotyp) genotyp), jednak heteroduplexy. Ty jsou v místě nesouladu (mismatch) roštěpeny nukleázou na sekvenátoru – u heteroduplexu p místo 1 fragmentu 2. Pro hlavní modelové organismy se připravují p p j kolekce p primerů p pro všechny y lokusy v genomu umožní proskrínovat polymorfismy v celém genomu.

EcoTILLING

Denaturace, zchlazení Normální nebo

Mutant nebo

Heteroduplex

Analýza na PA gelu nebo sekvenátoru

Gibson a Muse, 2004

b) metoda založená na detekci heterozygotů

SSCP ((single-stranded g conformation p polymorphism) y p ) analýza ý = polymorfismus konformace jednořetězců DNA zdenaturována a nanesena na nedenaturační p polyakrylamidový y y ýg gel. Elektroforéza při 4°C – DNA nerenaturuje, ale tvoří intramolekulární sekundární struktury. Každé vlákno – jiná sekundární struktura (konformace). Řetězec W AA

Aa

aa

Řetězec etě ec C Denaturace formamidem a teplem

Homozygot – 2 konformace  2 proužky na elektroforéze Heterozygot – 4 konformace  4 proužky na elektroforéze  Nižší kapacita, fragmenty jen do 400 bp

Gibson a Muse, 2004

SNP genotyping -

charakterizace genotypů pomocí SNP

A) Low-tech metody 

ASO (alelově specifická oligohybridizace) - cílová sekvence amplifikována z jednotlivců v 96-jamkových miskách – přenos ř na membránu, bá h hybridizace b idi s kkrátkými á ký i oligonukleotidy li kl id (1 (15-bp) b ) za velmi přísných podmínek signál jen při 100% komplementaritě



PCR-RFLP - amplifikace specifického fragmentu pomocí PCR + štěpení produktu restriktázou (zachytí SNP v rekogničním místě) = CAPS

Gibson a Muse, 2004

 dCAPS (vytvořené štěpitelné amplifikované polymorfní sekvence) Amplifikace A lifik + štěpení. ště í PCR primer i navržen ž tak, t k žže pro jjednu d z alel l l (A) se za použití speciálního primeru vytvoří rekogniční místo pro restriktázu  po štěpení restriktázou vzniká pro alelu A fragment o něco kratší

Alela T

Dlouhýý p produkt

Alela A

Štěpený produkt Gibson a Muse, 2004

B) Minisekvenační metody - sekvenuje se pouze 1 nebo několik nukleotidů SBE (prodloužení jedné báze) prodloužení 3‘ konce primeru o jediný nukleotid – ddNTP ((ukončí reakci)) – jje fluorescenčně značený. Primer se váže svým 3‘ koncem 1 bázi před SNP místo. Multiplexing - jako templát slouží produkty multiplexní PCR (naamplifikované fragmenty DNA pro několik různých SNP). Reakce může probíhat - na čipu (primery fixovány) - v roztoku t k – k rozlišení liš í jjednotlivých d tli ý h SNP: a) primery různých délek b) vychytání produktů SBE na mikrokuličky – na základě „zip kódu“ pro jednotlivé primery  -

(amplifikace analyzovaných lokusů)

Izolace cílové ssDNA zachycením na kuličky se streptavidinem

SBE v roztoku t k

SBE na čipu

Gibson a Muse, 2004

ad b) vychytání produktů SBE na mikrokuličky - kuličky separovány průtokovým cytometrem na základě barevného kódu (viz přednáška Analýza exprese) - kuličky fixovány na arrayi (viz Illumina genotyping) c) K separaci jednotlivých produktů SBE lze místo fluorescence použít hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF – do reakce přidán jen jeden typ ddNTP (+ ostatní dNTPs) – pokud odpovídá variantě v SNP, reakce se ukončí hned, jinak až po několika nukleotidech. MALDI-TOF MALDI TOF rozliší oba typy produktů podle velikosti, případně náboje. Lze provádět paralelně analýzu 384 vzorků.

 Pyrosekvenování - může se provádět v 96-jamkových 96 jamkových mističkách mističkách. Detekce v reálném čase. Může určit také frekvenci výskytu alely ve studované populaci – semikvantitativní metoda. metoda

A

A

A

Gibson a Muse, 2004

C) Homogenní metody založené na fluorogenních barvičkách Homogenní testy – v 1 reakci v roztoku (spojení amplifikace s genotypingem). Založeny na a) ASO a použití 2 fluorescenčních barviček s překrývajícími se spektry – reportér (R) a zhášeč (Q) – detekovány v průběhu PCR (v misce, kapiláře). Pokud jsou v těsné blízkosti ((např. p 2 konce krátkého oligonukleotidu), g ), není detekována fluorescence reportéru  TaqMan 5‘ exonukleázový test – využívá exonukleázové aktivity Taq polymerázy (při extenzi nového řetězce postupně odbourává sondu fluorescence)  Molekulární majáky (Molecular beacons - MB) - „majáky“ jsou alelově specifické oligonukleotidy obklopené krátkými inverzními repeticemi – vzniká vlásenka se smyčkou – R a Q blízko sebe – nevzniká fluorescence. Po 100% hybridizaci na templát se R a Q dostanou od sebe – vzniká fluorescence (může být alelově specifická) Do reakce sondy pro obě alely SNP ((s 2 různými ý barvičkami) + primery pro amplifikaci lokusu

SNP

Gibson a Muse, 2004

b) alelově specifické ligaci a přenosu energie fluorescenční rezonancí (FRET) DOL (dye-labeled (dye labeled oligonucleotide ligation assay) assay). Donor v dostatečné blízkosti stimuluje fluorescenci reportéru.

SNP SN

Gibson a Muse, 2004

Do reakce - polymeráza - primery i + 3 oliga li (2 různě značené sondy pro 2 alely SNP) - termostabilní t t bil í liligáza á PCR nejprve při vyšší, pak nižší Ta (k nasednutí sond)

 Invazní test (invader assay) – bez amplifikace. Využívá enzym cleavasu – štěpí vlásenkovité invazní struktury A) Invazní strukturu tvoří jednobázový přesah mezi i invazním í oligem li a primární i á í sondou 1, je-li hybridizována k cílové DNA obsahující alelu1

B) Nesoulad (mismatch) mezi primární sondou 2 a cílovou DNA obsah jící alel obsahující alelu 1 brání jednobázovému přesahu a netvoří se invazní struktura

Do reakce 3 typy oligonukleotidů: 1. Invader oligo (invazní oligo) 2 2. Primary probe 1 a 2 (primární sondy) - 100% komplementární k 1 z alel + „flap“ 3. Signal oligo (nese reportér a zhášeč)

Illumina vysokokapacitní metoda k určení genotypu na velkém souboru SNP (v krátkém čase a za rozumnou cenu).

Co to vlastně Illumina je? Je to systém kombinující několik komponentů: - miniaturizovanou array jednotlivých arrayí (Sentrix Array Matrix)

- konfokální skenr s vysokým rozlišením (BeadArray Reader)

- vysoce multiplexní analýza genotypu (GoldenGate Assay)

http://www.illumina.com

Jak vypadá Sentrix Array Matrix? Tvoří ji : 96 miniaturních arrayí (každá o průměru 1,2 mm) uspořádaných do matrice 8x12.

každá array je tvořena cca 50 000 optickými vlákny spojenými do svazku každé má na konci jamku a v ní kuličku o průměru 3 µm

na každé kuličce je kovalentně navázáno několik stejných oligonukleotidů (=illumiCode=adresa) illumiCode #1024 /\/\/\/

/\/\/\/

illumiCode #217

/\/\/\/

illumiCode #561


Jednomu analyzovanému SNP lokusu odpovídá 1 typ kuličky určený specifickým illumi kódem (adresou).

Analyzuje se až 1536 lokusů, v každé miniarrayi máme tedy 1536 typů k lič k k kuliček, každý ždý typ cca 30x. 30 Na 96 miniarrayích N i i í h jedné j d é Sentrix S t i Array A Matrix M t i analyzujeme l j ssoučasně č s ě 96 vzorků DNA.


Jak probíhá vlastní analýza genotypu? GoldenGate® Assay 1) Upevnění genomické DNA na paramagnetické kuličky a její denaturace Biotin


2) Allelově specifická extenze a ligace - pro každý lokus navrženy 3 oligonukleotidy: 2 z 5‘ konce, liší se polymorfním nukleotidem na konci 1 z 3‘ konce – charakterizuje lokus a obsahuje illumiCode adresu

Genomic DNA Allele Specific Extension & Li ti Ligation

[T/C] Universal PCR Sequence 1 Universal PCR Sequence 2

A G

[[T/A]] illumiCode’ Address Universal PCR Sequence 3’


ad 2) Allelově specifická extenze a ligace

Genomic DNA Allele Specific p Extension & Ligation

[T/C] Polymerase Universal PCR Sequence 1 Universal PCR Sequence 2

A G

Ligase

[T/A] illumiCode’ Address Universal PCR Sequence 3’


3) Amplifikace+inkorporace fluorescenční barvičky

A

Amplification Template

PCR with Common Primers

Cy3 y Universal Primer 1

illumiCode #561

Universal Primer P3

Cy5 Universal Primer 2


4) Hybridizace na univerzální IllumiCodeTM Array

A/A

illumiCode #1024 /\/\/\/

/\/\/\/

illumiCode #217

T/T

/\/\/\/

illumiCode #561

A/T http://www.illumina.com

4) Odečtení Od č í výsledků ý l dků (BeadArray (B d R Reader) d ) a interpretace získaných dat

LIMS & GenCall Software


Získaná data zobrazená jako GeneCall Display

Akcent 2H-7H 1H


Jak se získaná data využívají?  Pro rozsáhlé asociační mapování, které může odhalit genetický základ komplexních dědičných chorob  Pro konstrukci genetických map Konsensuální genetická mapa ječmene získaná z 3 DH mapovacích populací na základě Pilot Oligo Pool Assay (OPA1) Mapovací populace - celkem 480 jedinců 1536 SNP genotypováno současně $68,000 $6 000 za 480 4 0 vzorků ků (5 x 96) 6) 737,280 genotype calls za 3-4 dny 9.2 cents za data-point Při větším počtu vzorků – nižší náklady

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Recommend Documents