Inhibitory ATR kinasy v terapii nádorů J.Vávrová, M Řezáčová Katedra radiobiologie FVZ Hradec Králové UO Brno Ústav lékařské chemie LF Hradec Králové UK Praha
Cíl léčby: zničení nádorových buněk – zachování normálních buněk Nádorové buňky
p53 – mutace Ras – mutace ATM – mutace 75% nádorů
Normální buňky
p53 +/+ Ras +/+ ATM +/+
Hledají se látky ovlivňující na základě molekulárních mechanismů především nádorové buňky
Strategie buňky v odpovědi na poškození DNA Protinádorová terapie Ionizující záření Cytostatika
Poškození DNA
Rozpoznání poškození
Aktivace molekulárních mechanismů
Zástava cyklu, reparace DNA Obrana opravou
Smrt buňky, apoptóza,
senescence
Obrana eradikací
Přežití buněk
Odpověď buněk na IR rodinou phosphoinositol 3 –kinase like serine/threonine protein kinases (PIKK)
ATM a ATR jsou zásadní (vrcholové kinasy) aktivované po gama záření (ATM/ATR) - vznik DSB, SSB a UV záření (ATR) a některých chemoterapeutik (cis platina) - vznik SSB Dochází k autofosforylaci kinas fosforylují řadu cílů důležitých pro zástavu buněk v buněčném cyklu Zásadní rozdíl : ATR kinasa je nezbytná pro přežití buňky
knock-out ATR u myší je letální pro vývoj embrya
ATM kinasa není nezbytná pro přežití buňky ATM-/- buňky jsou hypersenzitivní k IZ
DSB
aktivace ATM
P
S 1981
Kolokalizace γH2AX a 53BP1 lymfocyty 2 Gy 1 h
u lidí s mutovaným ATM genem - onemocnění ataxia-telangiectasia extremně zvýšená radiosenzitivita • chybí blok v G2 fázi, • neschopnost reparace radiačního poškození • vstup do mitózy s nereparovanou DNA • vysoce zvýšené riziko nádorových onemocnění
Model myší s nedostatkem ATR kinasy – tzv. ATR-Seckel myši A,b/ myši ve stáří 3 měsíce
C,D novorozené myši
Přežití myší se Seckel syndromem – urychlené stárnutí Umírají 30. týden po narození Neschopnost reparace DNA poškození – akumulace gamaH2AX foci Mají ATM - akumuluje se p53, apoptóza – nemoci stáří Murga M., et al. Nat.Genet. 2009, 41, 891-898
ATR myši s nízkou hladinou ATR Seckel mice Při vzniku DSB vznikají i SSB Endogenní zdroj SSB je replikační stres (RS)
Při každé replikaci vznikají SSB a musí být reparovány a odpověď ATR/ChK1 předchází akumulaci SSB, které by mohly být pro buňku letální V odpovědi na SSB – pouze ATR DSB – ATM, ATR, DNA-PK odlišná úloha aktivace ATM-Chk2 a ATR-Chk1
Buněčná odpověď na aktivaci ATM a ATR kinasy Poškození DNA SSB
Poškození DNA DSB
ATRIP
RPA
ATR Modifikace chromatinu
DNA-PK
53BP1 Mre11/Rad50/Nbs1 γH2AX
ATM
P
P
Chk1
Blok v S fázi
reparace DNA P
G2 blok
reparace
Chk2 P
DSB - aktivují jak ATM, tak ATR SSB - aktivují pouze ATR
p53 apoptóza
p21
G1 blok
Selektivní zabití nádorových buněk – cíl radioterapie, cytostatické léčby
Základní problém je pořád stejný: jak zabít nádorové buňky a nezabít nenádorové Idea je nalézt látky toxické pro mutované (pozměněné) nádorové buňky Senzibilizace nádorových buněk k účinku radioterapie nebo cytostatické léčby Inhibitory ATM/ATR kinasy
Buňky HL-60 (promyelocytární leukémie) –bez p53 •ztráta G1 bloku a indukce
apoptózy brzy po ozáření • prodloužení G2 bloku, zvyšující jejich schopnost reparace poškození po ionizujícím záření • zvýšená radiorezistence
DSB
aktivace ATM/ATR P Kofein – nespecifický inhibitor
Funkční Cdc25 - cyklus
Chk1
Cdc25A Cdk2/ Cyclin E G1 blok
Chk2
Cdc25C Cdk2/ Cyclin B1 G2 blok
P
Nádorové supresory
protoonkogen
Cdc25 A fosfatasa – protoonkogen regulující buněčný cyklus ruší G2 blok po ozáření radiosenzibilizující efekt ruší pokles cdc25A fosfatasy po ozáření radiorezistentní syntéza DNA – genomová nestabilita kofein
- + -
+
75 % o f cells in G 2 p h ase
Kofein inhibitor ATM/ATR kinas
6 Gy
50 LDR LDR+C 25
0 0
24
48
72
time after beginning of irradiation (h)
2
16
23
33
16
7
3
4
apoptóza
Cdc25A
6 Gy + kofein
33 3
9
36
39
37
36
26
Význam selektivní inhibice ATM a ATR kinasy • Selektivní inhibitor ATM - KU55933 2-(morpholin-4-yl-6-thianthren-1-yl-pyran-4-one)
relativně malý radiosenzibilizující efekt • Selektivní inhibitor ATR - VE-821 3-amino-6-(4-(methylsulfonyl)phenyl-N-phenylpyrazine-2-carboxamide)
má podobný efekt jako kofein ??Normální buňky není známo, zda budou schopny reparovat replikační chyby s malým množstvím ATR kinasy
Srovnání účinku inhibitoru ATM kinasy (KU55933) a inhibitoru ATR kinasy (VE-821) na buňky HL-60 (p53 0) ozářené dávkou 3 Gy
G2 blok
Apoptóza (sub G1)
VE-821 144 h inkubace s VE-821 (3-10 uM)
Zabití nádorových buněk Synergický efekt s carboxy-platinou 96 h – MTS assay Podobně s cis-platinou
Nádorové buňky
Normální buňky
Reaper PM. Et al. Nature chemical biology 7, 2011, 428-430.
IDEÁL
Reaper PM. Et al. Nature chemical biology 7, 2011, 428-430.
Inhibice ATR a Chk1 kinas
Zruší blok v S a G2 fázi Povede k senzibilizace především buněk P53-/- a ATM -/Selektivní senzibilizace nádorových buněk Reparace u nádorových buněk přes Chk1 je nutná, nemají mnoho dalších cest k reparaci U normálních buněk se aktivují ještě další reparační mechanismy přes MAPK a především kinasu p38
Děkuji za pozornost
