Infravörös és Raman spektroszkópia a fehérjeszerkezet vizsgálatában Smeller László
Abszorpciós és emissziós spektroszkópia • Az átjutott vagy kibocsátott fény analizálása a hullámhossz függvényében. • Információ: – atomok, molekulák azonosítása, – molekuláris szintű szerkezetváltozások (konformációváltozások) detektálása, – koncentráció meghatározás
Mi történhet, ha egy mintát fénnyel világítunk meg? (elnyelt fény) megvilágító fény
átjutott fény minta
kibocsátott fény Lumineszcencia (Fluoreszcencia és Foszforeszcencia)
Abszorpció UV-VIS, IR, CD spektr.
szórt fény Raman és Rayleigh szórás
Miért nyel el ill. bocsát ki fényt egy atom v. molekula? • Energiaátmenet: ld. Jablonski diagram E
Gerjesztett elektron- és vibrációs állapot* Gerjesztett elektronállapot
S1
Vibrációsan gerjesztett áll.* Alapállapot
S0
*csak molekuláknál!
Miért nyel el ill. bocsát ki fényt egy atom v. molekula?
Abszorpciós spektroszkópia Abszorpciós törvény x
dJ ∝ J
E
J0
J J+dJ J
S1 T1
dx ∆E=hf=hc/λ
S0 UV-VIS IR Raman Fluoreszcencia abszorpció
Foszforeszcencia
Abszorpciós spektroszkópia Lambert-Beer törvény Elvi alapja: abszorpciós törvény: J=J0·e-µx ahol µ(anyag,c,λ) • Lambert-Beer törvény: • • • •
A = lg
spektrum: A(λ) mérés: spektrofotométer referencia oldat (J0) információ: azonosítás koncentráció.
J0 = ε (λ )cx J
x J0
J
dJ ∝ dx
dJ = − µJdx
dJ = − µdx J dJ ∫ J = ∫ − µdx ln J = − µx + const
J = J 0 e − µx
Infravörös spektroszkópia • Infravörös fény: λ=800 nm - 1 mm közép infra tartomány: 2,5-50 µm • abszorpciós spektroszkópia • az elnyelt infravörös sugárzás molekularezgéseket kelt • érzékeny a molekulaszerkezetre • speciális detektálás: FT spektrométer (FTIR spektroszkópia)
Az infravörös spektrum mérése: Fourier transzformációs spektrométer
fényforrás
tk 6.17 ábra
tk 6.18 ábra
Fourier transzformáció
Az FT spektroszkópia elve részletesen
Egy f(x) függvény Fourier transzformáltja a g(ν) fügvény: E = A sin(ωt)
∞
F ( f ( x)) = E=
x/2 x=retardáció
n
i =1
J = const (1-cos(2πx/λ)) = JDC+const cos(2πx/λ) n
J AC = J 0 ∑ cos(2πx/λi ) ∞
i =1
dJ (λ ) J AC = ∫ 0 cos(2πx/λ )dλ d λ 0
dA sin(ω t)dω d ω 0
− 2πiνx
dx = g (ν )
−∞
∞
∑ Ai sin( ωi t) E = ∫
∫ f ( x )e
A Fourier transzformáció inverze:
F ( g (ν )) = −1
∞
∫ g (ν )e
2πixν
dν = f ( x )
−∞
eiϕ = cos ϕ + i sin φ
Tipikus Fourier transzformáltak
Tipikus Fourier transzformáltak
Konvolúció
FT tulajdonságai
∞
F(x)
G(ν)
valós
hermitikus (valós=páros, imag=páratlan)
imaginárius
anti-hermitikus (valós=páratlan, imag=páros)
páros
páros
páratlan
páratlan
valós és páros
valós és páros(cosinus transformáció)
valós és páratlan
imaginárius és páratlan (sinus transzformáció)
imaginárius és páros
imaginárius és páros
imaginárius és páratlan
valós és páratlan
Def:
( f ⊗ g )(t ) =
∫ f (τ ) g (t − τ )dτ
−∞
forrás:Wikipédia
Konvolúciós tétel:
F ( f ⊗ g ) = F ( f )F (g )
Diszkrét FT
Diszkrét FT
gk
fj f(x)
f(x)
diszkretizálás
x
xj
j
j
j
FT előre
k
N −1
g k = ∑ f j e − 2πijk / N j =0
Kettős diszkretizálás: véges lépések (∆x) véges számú adat (L)
N −1
f j = ∑ g k e 2πijk / N
vissza
k =0
A spektrum számolása a Fourier transzformációs spektrométerben E = A sin(ωt)
Az interferométeren keresztüljutott sugárzás: ∞
n
x/2 x=retardáció
∞
dA E = ∑ A i sin( ωi t) E = ∫ sin(ω t)dω dω i =1 0
J = const (1-cos(2πx/λ)) = JDC+const cos(2πx/λ) n
J AC = J 0 ∑ cos(2πx/λi ) ∞
i =1
dJ (λ ) J AC = ∫ 0 cos(2πx/λ )dλ dλ 0
dJ 0 (λ ) cos(2πx/λ )dλ dλ 0
J AC = ∫
éppen a dJ 0 (λ ) dλ
A spektrum a
mennyiség cosinus transzformáltja dJ 0 (λ ) -nek a mintán való dλ
áthaladása után megmaradt részének és a dJ 0 (λ ) -nak a hányadosa (transzmissziós spektrum) dλ
Molekularezgések
fényforrás
FT
Az elektronok könnyűek, gyorsan követik az atommag mozgását, ezért az atommagok rezgéseit az elektronok nem befolyásolják. A klasszikus fizikai leírásban az atommagok közti kötést, egy rugóval vesszük figyelembe.
Molekularezgések: kétatomos molekula
a középiskolából ismert: f = m2
ℓ1
ℓ2
1 2π
D2 m2
m2 l 1 ∆l 1 = = m1 l 2 ∆l 2 ∆l m1 + m2 l 1 + l 2 l = = = = m1 l2 l 2 ∆l 2
F = D∆l
=
F / D D2 = F / D2 D
tehát:
1 m1 + m2 D2 , amit az f = = 2π m1 D
D2 m2
egyenletbe helyettesítve a rezgési frekvencia: f =
az mredukált
mm = 1 2 m1 + m2
1 2π
D(m1 + m2 ) m1m2
mennyiséget redukált
tömegnek is nevezik, ezzel a frekvencia: f =
1 2π
D mredukált
Kvantummechanikai leírás
A hullámhossz:
λ=
mredukált c = 2πc f D
Az infravörös spektroszkópiában a λ reciprokát, a hullámszámot (ν) használják: ν: hány hullám fér 1 1 D el egységnyi ν= = hosszúságon? [cm-1] λ 2πc mredukált
Példa: CO A mért rezgési hullámszám: ν= 2143 cm-1 Ö λ=4,67µm Ö f =6,43 1013 Hz mC=2·10-26 kg, mO=2,7·10-26 kg Ö D=1875 N/m Ha ν ismert, D számolható ha D ismert, ν számolható
Klasszikus fizikai rezgések és energianívók kapcsolata • Klasszikus kép
E
Energianívók
E
ψ
ψ
n=3
n=3
n=2
n=2
n=1 n=0
1 f = 2π
x
En = hf ( n + 12 )
D
n=1
∆E
n=0
mredukált
n = 0, 1, 2….
∆E=hf
rezonancia az f frekvenciájú fénnyel u.a.!!!
x
A rezgési frekvencia függése a tömegtől és a kötéserősségtől Tömeg
kötéserősség
N atomos molekula: • 3N szabadsági fok, 3-3 a teljes molekula transzlációja ill. rotációja • 3N-6 rezgési szabadsági fok (lineáris molekuláknál csak 3N-5) • normálrezgések • normálkoordináták
Kötéserősség:
Infravörös rezgési frekvenciák (cm-1) B-H 2400
C-H 3000
N-H 3400
O-H 3600
F-H 4000
Al-H 1750
Si-H 2150
P-H 2350
S-H 2570
Cl-H 2890
Ge-H 2070
As-H 2150
Se-H 2300
Br-H 2650
Sokatomos molekulák rezgései
C-N: 1100 cm-1, C=N: 1660 cm-1, C≡N: 2220 cm-1.
Víz (O-H): 3600 => nehézvíz: 2600 cm-1
Normálkoordináták
Normálrezgések
A kétatomos molekula példáján bemutatva: xc
xO
xν
xT
KP
xO mC
• Minden atom ugyanazzal a frekvenciával, fázissal, de különböző amplitúdóval és irányban rezeg. • Pl. víz:
mO xC
Általános esetben 3N dimenziós koordinátarendszer forgatása Lineáris transzformáció (mátrixművelet)
A normál módusok nem hatnak kölcsön egymással.
A víz normálrezgései
Néhány tipikus rezgési frekvencia
Ezek nem rezgések, hanem gátolt forgások (libráció)
Példa: Formaldehid
Analitikai alkalmazások • • • •
szintézis: közti és végtermék azonosítás szerkezet bizonyítás metabolit kimutatás gyógyszerellenőrzés (tisztaság vizsgálat)
• Megj.: Lambert-Beer tv. itt is igaz, koncentráció meghatározás is lehetséges. forrás: www.Spectroscopynow.com
molekula azonosítás
Molekula azonosítás C4H8O
Fingerprint (ujjlenyomat) tartomány
Makromolekulák rezgései Globális rezgések (bonyolultak) Lokalizált rezgések, pl: • CH2 rezgések a lipidekben • amid rezgések a fehérjékben (acetamid rezgések)
forrás: www.Spectroscopynow.com
Az N-metilacetamid mint a fehérjelánc gerincének modellje
Fehérjék rezgési spektroszkópiája
A víz abszorpciós spektruma
• Gerinc: amid rezgések – konformáció (másodlagos szerkezet) – H/D csere, (harmadlagos szerkezet)
• Oldalláncok – kölcsönhatások más molekulákkal – pl Ca2+ kötés
• Fontos technikai megj.: nehézvíz (D2O)
Víz és nehézvíz spektrumok
A fehérjék amid rezgései
Bandekar BBA 1120 (1992) 123
A fehérjék amid rezgései
Az amid I vibráció és a másodlagos szerkezet β lemez
amid II N-H nyújtási rezgés H-D cserére érzékeny Szerkezet kompaktsága (harmadlagos szerk.)
amid I C=O rezgés H-híd miatt konformációérzékeny
A másodlagos szerkezeti elemekhez tartozó jellegzetes amid I jel Intramolekuláris szerkezet β-lemez
rendezetlen
1600
ν cm-1
α-hélix
1700
Intermolekuláris külcsönhatás Intermolekuáris antiparallel β-lemez
1600
ν cm-1
1700
α helix
Fourier öndekonvolúció elve
Spektrum
Az amid I sáv átlapoló komponensek összege: dekovolúció A
A
A
mért spektrum
A
ν
vonalalak
A
ν
ν
Inverz FT
FT
Fourier öndekonvolúció Vonalak szétválasztása vonalkeskenyítéssel
Spektrum FT-ja
ν
ν
„elvi spektrum”
A
A
A
x
x
osztás a vonalalak FT-jával
Alkalmazások
fehérjedenaturáció
lipid fázisátalakulás
Meersman és mtsai. Biophys J.
BPTI bovine pancreatic trypsin inhibitor
x
aggregáció
Mioglobin (Nyomásciklus) aggregáció
Ca2+ kötés Parvalbumin
Raman szórás Raman spektroszkópia
Absorbance
28 °C 43.8 °C 67.5 °C 80.7 °C 90 °C 30 °C 1600
1580 1560 1540 Wavenumber (cm-1)
1520
Sir Chandrasekhara Venkata Raman Nobel Nobel-díj díj 1930
Mi történhet, ha egy mintát fénnyel világítunk meg?
Energiaátmenetek a vibrációs spektroszkópiában
(elnyelt fény) megvilágító fény
átjutott fény minta
Abszorpció UV-VIS, IR, CD spektr.
szórt fény Raman és Rayleigh szórás
kibocsátott fény Lumineszcencia (Fluoreszcencia és Foszforeszcencia)
E
Gerjesztett elektron- és vibrációs állapot* Gerjesztett elektronállapot
S1
Vibrációsan gerjesztett áll.* Alapállapot
S0 IR
*csak molekuláknál!
Raman Stokes anti-Stokes
Raman szórás: a klasszikus leírás a beeső fény frekvenciája
Szórt intenzitás Rayleigh
A beeső fény elektromos térerőssége: E = E0 sin 2πν 0t A szóró molekula polarizálhatósága: α ′ = α + A sin 2πν i t A rezgés frekvenciája
Stokes anti-Stokes
A polarizálhatóság változik a rezgés során! A polarizáció során előálló dipól:
µ I = α ′E = E0 (α + A sin 2πν i t ) sin 2πν 0t = = αE0 sin 2πν 0t +
λ
1 1 AE0 cos 2π (ν 0 + ν i )t + AE0 cos 2π (ν 0 −ν i )t 2 2
λlézer νlézer+vrezgés
νlézer
νlézer-vrezgés
Raman és infravörös Raman
infravörös
Fényszórás
abszorpció
Raman és infravörös
A molekula rezgése során változik a molekula polarizálhatósága dipólusmomentuma
forrás: http://www.sigmaaldrich.com
Zavaró tényező: fluoreszcencia E
gerjesztés: zöld piros infravörös lézerrel
Mérési összeállítás minta
monokromátor
Resonance Raman Surface Enhanced Raman Tip-Enhanced Raman Raman Microscopy Confocal Raman Microscopy
lézer
PM cső v. CCD kamera
Speciális technikák
Resonance Raman Ha a virtuális nívó megközelít egy valódi elektrongerjesztési nívót az intenzitás megsokszorozódik.
E
S1
Surface Enhanced Raman Fém (Ag, Au) kolloidokban fellépő felületi plazmonok erősítik a beeső fény elektromos terét polythiophene SERS, normal Raman
103-105 S0 Raman
Resonance Raman Vibrational Spectroscopy Volume 31, 2003, Pages 265–269
Raman mikroszkóp
A konfokális elv Előny: nagyobb térbeli felbontás, fluoreszcencia elnyomás
Tip-Enhanced Raman
Irodalom: források, ill. további olvasnivaló • • • • • • • • • • • • • •
felbontás ~ néhány x 10 nm
• •
http://en.wikipedia.org/wiki/Discrete-time_Fourier_transform http://www.cv.nrao.edu/course/astr534/FourierTransforms.html https://ccrma.stanford.edu/~jos/mdft/mdft.html Raman Spectroscopy: Introductory Tutorial by: Daniel T. Schwartz Department of Chemical Engineering University of Washington Nanoscale structural analysis using tip-enhanced Raman spectroscopy by: Tanja Deckert-Gaudig and Volker Deckert, Current Opinion in Chemical Biology 2011, 15:719–724 www.horiba.com/scientific/products/raman-spectroscopy/tutorial-faqs/raman-tutorial/ www.spectroscopynow.com Bandekar BBA 1120 (1992) 123 http://www.lsbu.ac.uk/water/vibrat.html D. Eisenberg and W. Kauzmann, The structure and properties of water ( Oxford University Press, London, 1969) Byler & Susi (Biopolymers 1986 Mar;25(3):469-87) F. Meersmann, L. Smeller, K. Heremans (2002) A comparative study of cold-, pressure- and heatinduced unfolding and aggregation of myoglobin Biophys. J. 82 2635-2644. L. Smeller, P. Rubens, K. Heremans (1999) Pressure effect on the temperature induced unfolding and tendency to aggregate of myoglobin Biochemistry 38 3816-3820. L. Smeller (2002) Pressure-temperature phase diagram of biomolecules Biophys. Biochim. Acta 1595 11-29. http://www.sigmaaldrich.com (sok anyafról található IR vagy Raman spektrum itt) Szőllősi, Fidy: Orvosi Biofizika
