Imunologie, molekulární biologie a intenzivní medicína –současnost a perspektivy Miroslav Průcha Oddělení klinické biochemie, hematologie, imunologie a molekulární diagnostiky IPVZ 18.12.2007
2001 ACCP/SCCM/ESICM/ATS/SIS INTERNATIONAL SEPSIS DEFINITIONS CONFERENCE
The PIRO system for Definition and Staging Sepsis November 2001, Washington, USA
Present
Future
Predisposition
Premorbid illness
Genetic polymorphisms
Infection
Cultures
Microbial products: toxins, bacterial DNA
Response
SIRS, CRP
Markers of activated inflammation: PCT, IL-6, ...
Organ dysfunctions
Scores:
Apoptosis, cell stress,
SOFA, MODS, ...
hypoxia
Levy MM et al. Intensive Care Med (2003) 29:530.538
Patogeneze sepse
Sepse jako porucha regulace imunologických mechanismů Sepse jako sekundární imunodeficience Přesmyk Th1 do Th2 odpovědi Zvýšená apoptóza imunokompetentních buněk a jejich imunosupresivní efekt Snížená exprese MHC II.třídy a kostimulačních molekul Beutler (Trauma,Sepsis,Inflammation 2004, „By definition, sepsis reflects failure of immune response“)
Patogeneze sepse = zánět
Zánět – propojení vrozené(innate) a získané (adaptivní) imunity Koncepce hyperzánětlivé odpovědi Koncepce imunoparalýzy Nature Immunology: December 2005,(Dampening inflammation…..)
SEPSE=IMUNODEFICIENCE
Snížení produkce Ag specifických Ab Snížená funkčnost Ag presentujících buněk (HLA-DR/CD14) Snížení produkce Gama interferonu Kompartmentalizace zánětlivé odpovědi Koncentrační gradienty pro a protizánětlivých cytokinů (lokalizace, systémovost infekce)
Infekce a genetika
Rozdíly u hostitele- Whitney et al: Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 1896901(věk, pohlaví, čas odběru a proporce buněk v KO x leukémie a sepse) Huang et al: prvotní exprese (18 hodin) u dendritických buněk (166 genů) byla stejná u různých původců – E.coli, Influenza, C.albicans x časově pozdější genová exprese rozdílná u těchto infekcí – jedinečné
Infekce a genetika
Chřipková pandemie Smrtící pro dospělé mezi 18-30, 30-60 – lepší přežití a také děti 4-12 let!!! Imunologická pamětˇ a influenza virus H3 Cirkulující protilátky jsou v oběhu desetiletí Long-lived plasma cell – jsou také v kostní dřeni
LPS
Bakteriální lipopeptidy
LBP + CD14 TLR4
CpG motiv
Bakteriální peptidoglykany
TLR6 MYD88
TLR2
TLR2
IRAK TRAF6 TLR9
Glykoproteiny parazitů
NIK
DNA IKK 1kB NFkB Jádro
MHC II B7, CD40
Receptory pro komplement
IL-1, IL-12, TNF IL-6
Historie
1953 – F.Crick, M.Wilkins a J.Watson – struktura DNA 1956 – DNA poprvé vytvořena uměle 1961 – rozluštěn princip mechanizmu, jak DNA se „přeměňuje“ v bílkoviny 1966 – DNA objevena jak v chromozomech tak mitochondriích 1969 – poprvé oddělen jednotlivý gen
Historie
1953 – F.Crick, M.Wilkins a J.Watson – struktura DNA 1956 – DNA poprvé vytvořena uměle 1961 – rozluštěn princip mechanizmu, jak DNA se „přeměňuje“ v bílkoviny 1966 – DNA objevena jak v chromozomech tak mitochondriích 1969 – poprvé oddělen jednotlivý gen
Historie
1970 – první syntéza umělého genu 1973 – USA – objeven postup výroby rekombinantních molekul DNA - lidský gen připojen do bakteriální DNA. 1976 -První funkční syntéza umělého genu v bakterii. 1977 - První izolace lidského genu
Historie
1981 - Objevena lidská mitochondriální DNA. - Poprvé přenesen gen z jednoho lidského druhu na druhý. 1982 - V USA přišel poprvé na trh medikament vyrobený genovou technikou (inzulin); následoval interferon. 1983 - Poprvé syntetizován umělý chromosom. 1984 - Poprvé uplatněna molekulární biologie v kriminalistice. Založen genetický otisk prstu (DNA fingerprint).
Historie
1988 - Organizace na výzkum lidského genomu (Human Genome Organisation) oznámila úkol zmapovat kompletní skladbu DNA. 1991 - Začátek projektu zkoumání lidského genomu mezinárodním veřejným konsorciem Human Genome Project (HGP). 1995 - Rozluštění prvního genomu (bakterie Haemophilus influenzae).
Historie a současnost
1996 - Po šestiletých výzkumech rozluštěn první eukaryotní genom pivovarských kvasinek (Saccharomyces cerevisiae). 1998 - Poprvé rozluštěn genom mnohobuněčného organismu - parazita hlístice (Caenorhabditis elegans). 1999 - popsán genetický kód lidského chromozómu 22, jednoho z 23 párů lidských chromozómů.
Historie a současnost
Březen 2000 - V Berkeley rozšifrovali genetickou výbavu mušky octomilky. 11. února 2001 - HGP a jeho hlavní konkurent Celera Genomics oznámily rozluštění 95 procent lidského genomu. 2002 - Genetická mapa myši. Lidé a myši mají asi z 99 procent totožný genom. 14. dubna 2003 - dokončení plné identifikace lidského genomu.
Lidský genom
Pouze 1,1% tvoří geny kódující proteiny – 23 390, retroelementy – 1/3 lidského genomu, jedná se o parazitické sekvence – kódování proteinů , význam v evoluci 1/10 virové DNA ( endogenní retroviry), sekvence SINE (Short Interspersed Elements)- nekódují žádný enzym, sekvence LINE(Long..( produkce reverzní transkriptázy) virové geny s novou funkcí - syncytin
Dnešní stav
Sekvence bohaté na geny přečteny z 99% Sekvence chudé na geny přečteny z 80% Spolehlivost přečtených písmen 0,001% Mnoho „genů“ se ukázalo jako pseudogeny = „rozložené“ geny Doplněny dlouhé opakující se úseky
SNP single nucleotide polymorphism ¨když se lišíme jedním písmenem“
AAACGTCCC AACCGTCCC 10 milionů „běžných“ SNP „běžný“ = má jej aspoň 1% lidstva
Haplotyp kombinace SNP „když se lišíme jedním písmenem vícekrát“
AAACGTCCCATACCT AACCGTCCCATAGCT AAGCGTCCCATACCT
Genomika a diagnostika
Testování genů „Single gen disease“ Testování genů – více než 1000 genů – asociace – Alzheimerova choroba, Gaucherova choroba, cystická fibróza… Prenatální diagnostika Diagnostika pro predikci chorob – Huntingtonova choroba Stanovení rizika pro vznik nádorového onemocnění a Alzheimerovy choroby
Genomika a terapie - limity
Krátká životnost …opakování Imunitní odpovědˇ - problematické je opakování Virové vektory – toxicita, imunitní a zánětlivá odpovědˇ, kontrola terapie Multigenová onemocnění
Genomika a terapie
Genová terapie – experimentální 1999 – Jesse Gelsinger – OTCD(ornithine transcarboxylase deficiency) – zemřel po 4 dnech na MOF (reakce imunitního systému na vektor – adenovirus) 2003 – zastavení studií s retrovirovým vektorem v kmenových krevních buňkách – Francie- 2 děti s prim. ID – X-SCID
Genomika a terapie
Monoklonální protilátky – biologic response modifiers, nyní biologická léčba 20 v rutinním klinickém použití, dalších 130 ve studiích Onkologie – Ab proti růstovým faktorům, receptorům a tumorspecifickým nebo tumor selektivním antigenům Infekční choroby – pavilimuzab (RSV), dalších 27 v klinickém zkoušení (HCV,
Genomika a terapie
Farmakogenomika 100.000 lidí zemře za rok v důsledku vedlejších účinků léků CYP 450 (warfarin, statiny…) Individualizovaná medicína
Genomika a intenzivní medicína sepse
Glue Grant (USA), GenoSept (Evropa) Diagnostika – rozlišení infekčního a neinfekčního zánětu, predikce intenzity zánětlivé odpovědi Rozdílná exprese genová na úrovni orgánů – „výjímečné“ - mozek Epidemiologické konsekvence!!(počty pacientů) Recentně – geny asociované s proteinem C a vasopresinem (Sirius Genomics) luminexová technologie
Genomika a intenzivní medicína
Terapie – interní , autoimunitní, neurologická onemocnění RA, SLE, Mb.Crohn, ulcerozní kolitida
Budoucnost
Genomika,proteomika, metabolomika… Genotyp x fenotyp Nové technologie – hmotnostní spektrometrie, MALDI-TOF, iontové pasti… Nanotechnologie
Budoucnost
Hledání nových diagnostických biomarkerů Poznání patogeneze chorob Hledání nových diagnostických cílů – geny, proteiny Lepší diagnostika znamená lepší terapii
Aplikace do intenzivní medicíny
Sepse – porucha na úrovni receptorů – TLR Regulace intenzity zánětlivé odpovědi Perspektivnější než výroba nových ATB Zásahy na několika úrovních současně
Pathogen associated molecular patterns
PAMPs Bakteriální motivy Rozpoznány vrozenou imunitou mohou představovat potencionální terapeutický cíl Není jasné zda host rozliší mezi patogenem a komensálem
Rozpoznávací mechanismy
Receptory pro motivy a komponenty = pattern recognition proteins (PRPs) Toll- like receptory (1-10) Peptidoglykan rozeznávající molekuly nucleotide –vázající oligomerizační doména– NOD1, NOD2 TREM-1 (triggering receptor expressed on myeloid cells) DAP-12
Další ligandy
Mannosu vázající lektin (MBL) Calcium vázající lektin Váže se na mikrobiální struktury a iniciuje komplementovou aktivaci Varianty kodonu 54 a 57 exonu 1 v MBL genu (5% populace ale zvyšuje 6x riziko meningokokového onemocnění Hibberd et al: Lancet 1999, 353: 10491053 Roy et al: Lancet 2002, 359: 1569-1573
Toll-like receptory
TLR2TLR6 – peptidoglykany TLR4 – LPS TLR 5 – flagelin TLR 9 – bakteriální DNA TLR4 a sepse – neutralizace anti-TLR protilátek chrání před letální endotoxémií ale ne před septickým šokem ! Rogres et al: B-1506, IACC 20003
NODs
Rodina cytosolických proteinů Homologie s rostlinnými geny které jsou odpovědné za resistenci vůči patogenům 24 NOD genů bylo identifikováno v lidském genomu NOD2 varianty – deficientní v kappaB aktivaci NOD2 exprese je zvyšována prozánětlivými cytokiny
Hypotéza I (diagnostická)
Existuje „specifická“ exprese genů spojených se zánětem pro septické pacienty Její diagnostika nám pomůže tyto pacienty najít a rozlišit od pacientů se zánětlivou odpovědí neinfekční etiologie
Hypotéza II (terapeutická)
Dokážeme rozlišit typ pacienta – high a low respondera v zánětlivé odpovědi Dokážeme rozlišit fázi imunitní odpovědi imunosupresivní nebo imunomodulační Tato diferenciace nám umožní cílenou imunomodulační léčbu na několika úrovních Prucha et al: Shock 2004, 22:29-34
Genetické polymorfismy cytokinů a jejich receptorů
Prucha M, Matoška V: Anesteziologie a intenzivní medicína 2005; 4-203-210
Akt/protein kináza B
Phosphoinositide 3 kinázy Modulace základních buněčných funkcí Přežití, pohyb a aktivace s produkcí prozánětlivých mediátorů U kriticky nemocných chemotaxe, zánět, modulace apoptózy Jejich blokace = blokace funkce NF-κ B
Apoptóza
Programovaná buněčná smrt Aktivní, na energii závislý proces „sebevraždy“ buňky Koncept v r. 1972 80.léta – „ced“- rodina genů u nematodů Ced-3 = homolog IL-1 konvertujícího enzymu Bcl-2 – antiapoptotický savčí proto-onkogen Fas receptor – „death receptor
Apoptóza lymfocytů u kriticky nemocných
Rozdílná regulace apoptózy u ly a neutrofilů Nejvíce apoptotických buněk ve slezině a střevním epitelu Apoptóza dendritických buněk a B a CD4T ly ve slezině Přímý efekt GCS, nedostatek antiapoptotických proteinů, Bcl-2, C5a, produkce NO
Apoptóza neutrofilů u kriticky nemocných
In vivo konstituční apoptóza za 1-2 dny U sepse snížení apoptózy – závislost na snížení caspase 3 a 9 U hemoragického šoku v experimentu oddálení apoptózy a zvýšení oxidativní aktivity Při přenesení těchto neutrofilů do plic dojde k ALI
Proteomika
Až 10x více proteinů než je počet genů 20 proteinů tvoří 90 % váhového množství všech proteinů 1mg = 109 polypeptidových molekul 1 ng = 400 AK (PCT 0,5 ng/ml) Loading pro analýzu – 1 ul
Nová koncepce SIRS, sepse
Tang et al : J.Leucocyte Biology 2007, doi: 10.1189/jlb.1206752 Pivotel Advance: Endogenous pathway to SIRS,sepsis, and related conditions Heparan sulfát – fyziologická role – zachovává integritu endoteliálních bariér Za patologických podmínek – C, neutrofily, ischemie …heparan sulfát je „odmýván“ proteásami
Nová koncepce SIRS
Heparan sulfát je agonistou TLR4 (Johnson GB et al: Crit.Rev. Immunol. 2003) Indukce SIRS heparan sulfátem – produkce TNF-α (Johnson et al J.Immunol. 2004) V experimentu zvířata bez TLR4 anebo CD14 nereagovala na LPS TLR4 je konstitučně suprimován a při sepsi je tato suprese uvolněna proteázami (event.jinými substancemi)
Terapeutické konsekvence – ovlivnění intenzity zánětu
Anti-endotoxinová terapie selhává Nový způsob – nové terapeutické cíle – endogenní agonisté a Toll-like receptorové regulátory TLR4 antagonista TAK-242 (Takedas) CytoFab anti-TNF-α (Protherics) TLR4 antagonista eritoran (Eisais) Anti-endotoxinová molekula GR-270773 (GSK) Neutralizace NO –NOX100 (Medinoxs) Transgenní antitrombin III (GTC Biotherapeutics)
Metody molekulární diagnostiky při diagnostice sepse
Diferenciální diagnostika infekčního a neinfekčního zánětu pomocí DNA microarray
Průcha et al: Shock 2004, 22:29-33
Hematoonkologie a onkologie
Genomika - CLL – vztah hypermutačního stavu genů pro Ig a prognóza pacienta Proteomika – gliom – vysoká exprese EGFR(epidermal growth factor receptor + mutace EGFR genu – horší prognóza Vzniká kvalitativně odlišný protein (úroveň fosforylace s důsledkem pro onkogenní potenciál nádoru Detekce nádorových buněk v periferní krvi – metody PCR nebo jiné s využitím nových biomarkerů (Ca prsu, ca tlustého střeva)
Metodologie - array
Proteinové array DNA array Inflammation Kit – multiplexová analýza cytokinů Minimální spotřeba materiálu a biologického vzorku Reproducibilita srovnatelná s klasickými metodami
Intenzivní medicína – genomika
DNA arrays Funkce genů – jejich kvantitativní a kvalitativní exprese Laudanski C et al: PNAS:2006 Genes and Development 2006, 15 – AUF-1 limituje a zeslabuje expresi TNF-α a IL-1b Aplikace terapeutické
Intenzivní medicína aplikace
Stavba DNA – rekombinantní DNA technologie ( Xigris) Glue Grant, GenoSept Terapie – CYTOFab anti-TNF-α polyclonal Výhody – polyvalentnost, významnější neutralizace proti monovalentní, Fab fragmenty jsou menší než celý Ig - větší distribuční objem
Metodologie – PCR real time
Diagnostika extra-humánního genomu Detekce virové a bakteriální DNA(herpetické viry –CMV, HSV, VZV, MRSA, SEPTIFast) Časová dostupnost – 4 hodiny
SeptiFast - Kit Concept Sample
Sample preparation
Blood (3 ml)
Pathogen Lysis & DNA Extraction
PCR Analysis
Gram (-)
Gram (+)
• Detection und Identification of most important gram negative bacteria
• Detection und Identification of most important gram positive bacteria
Fungi • Candida & Aspergillus fumigatus
Less than 6 hrs time to result (start sample prep report)
SeptiFast Test
Detection of the 25 most important pathogens known to cause sepsis Identification in 20 groups relevant for decision making
Proteomika - metodologie
MS, Linear Ion Trap (lineární past), rozlišovací schopnost 10-16 (atomoly) Stále dokonalejší schopnost simulace podmínek in vivo – interakce mezi bb.imunitního systému a antigenem
Aplikace v intenzivní medicíně
Caspase 12 Nature 2006, 440, 7087 Caspase 12 deficientní myši jsou resistentní k septickému šoku Caspase 12 je inhibitor caspase 2
Molekulární exprese na leukocytech (flow cytometry)
CD14/HLA-DR CD64/CD45 TREM/CD45 Monneret G et al: Clinical Chemistry 2002, 1589-1592 Sedlackova et al: Epidemiologie,mikrobiologie, imunologie 2005 Gibot et al: Annals Internal med 2004, 141: 9-15
Závěry
Sepse – selhání imunologických mechanismů zajištující homeostázu Toto selhání je patogeneticky multifaktoriální – role makro a mikroorganismu Imunoterapie je součástí komplexní terapie sepse (antimikrobiální, fluid, vasoaktivní)
Závěry
Detekce nových parametrů genetických – genové polymorfismy (Glue Grant..) Detekce nových parametrů diagnostických – na úrovni proteinů Vyhledávání nových potencionálních terapeutických cílů na základě kompletního poznání patogeneze infekčního zánětu
Závěry
Přesná a přísná regulace zánětlivé odpovědi Imunoterapie se musí zakládat na zhodnocení stavu imunity v daném okamžiku ( pacient s vysokou produkcí prozánětlivých mediátorů x pacient s imunoparalýzou Zásah na různých úrovních - mediátory, transkripční proces Zásah s různým efektem – imunostimulačním nebo imunosupresivním
ZÁVĚRY
Nové biomarkery s možností stratifikace pacientů podle rizika Úloha genomiky a proteomiky DNA čipy, proteinové čipy Zkrácení „času odezvy“ (bed side monitoring) Dokonalejší diagnostika = účinnější léčba
