Imunologické metody fagocytóza, stanovení oxidačního metabolismu, chemiluminiscence, baktericidní test

Imunologické metody – fagocytóza, stanovení oxidačního metabolismu, chemiluminiscence, baktericidní test

Fagocytóza „ „ „

„ „

Jeden z evolučně nejstarších obranných mechanismů Součást přirozené imunity Schopnost buněk imunitního systému pohlcovat, usmrcovat a rozkládat mikroorganismy (u živých) Schopnost rozpoznat cizorodou částici, navázat se a pohltit ji Fagocytující buňky - neutrofily, eosinofily, monocyty, makrofágy

Fagocytóza jako mnohastupňový proces „ „ „ „ „ „

Interakce mezi fagocytujícími buňkami a endotelem Adhezní molekuly Chemotaxe s účastí chemoatraktantů Ingesce – pohlcování částic , > 0,5um Nitrobuněčné zabíjení Mechanismy zabíjení nezávislé na kyslíku a závislé na kyslíku (NADPh oxidázový komplex)

Vrozené poruchy fagocytózy „ „

„ „ „

Imunitní nedostatečnost Primární poruchy – geneticky podmíněné – nízká incidence 1:100000-1:1000000 Sekundární poruchy Poruchy v počtu granulocytů (retikulární dysgeneze) Poruchy funkce granulocytů – LAD syndrom (Leukocyte Adhesion Deficency, mutace genu pro podjednotku beta CD18)

Poruchy fagocytózy „ „ „

Poruchy chemotaxe Poruchy ingesce Poruchy tvorby granulí neutrofilních granulocytů ( Chediak-Higashiho sy, poruchy myeloperoxidázy)

Fagocytóza – princip metody (testy postihující pohlcení) „ „ „ „

„

„

Substráty MSHP – hydroxyetylmetakrylátové partikule Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans MSHP – hydrofilní charakter částic (omezení nespecifické adherence), standardní velikost 1um (nízká spontánní agregace) Inkubace s plnou krví 1 hodinu při 37C, po inkubaci nátěr na podložní sklo , fixace , obarvení a počítání ve světelném mikroskopu Hodnocení určitého počtu buněk, pozitivní obsahují 3 a více partikulí.

Fagocytóza – technické podmínky a hodnocení „

„ „

„ „

„

Čerstvá krev s heparinem (zpracování do 2 hodin po odběru) EDTa – vyvázání kalciových iontů Třepání, nátěry Omezená výpovědní hodnoty v rutinní klinické praxi Toxikologie, farmakologie Termostat, třepačka, světelný mikroskop, event. průtokový cytometr

Baktericidní test „ „

„ „ „ „

„

Screeningová metoda Rozdílné mikrobicidní systémy s druhovou specificitou mikroba Substrát – živý mikroorganismus!!! Candida albicans, Staph.aureus, pseudomonády Vyšetření z plné krve nebo na izolovaných granulocytech Vitální barvení kandid trypanovou modří, živé kandidy mají schopnost trypanovou modř eliminovat Staphylokok – očkování na plotny a počítání kolonií nebo průtoková cytometrie s barvením přežívajících mikroorganismů

Baktericidní test – technická úskalí „ „

„

„

„

Obtížná standardizace Heparinová krev, teplota zpracování, časový limit pro zpracování Substrát – mikrobiologická laboratoř , různá citlivost kmenů, pasážování kmenů Uplatnění – v rutinní diagnostice omezené, více ve výzkumu Technické vybavení – třepačka, termostat, sterilizátor, mikroskop, průtokový cytometr

Testy oxidačního metabolismu „

„ „ „

„ „

„ „ „

Testujeme schopnost granulocytů tvořit kyslíkové radikály aktivací NADPH oxidázy NBT - nitroblue-tetrazolium chlorid INT – iod-nitroblue tetrazolium Schopnost granulocytů redukovat bezbarvé tetrazoliové soli na barevné formazány Kyslíkový metabolismus, zabíjení stafylokoků, enterokoků, kandid Sklíčkový test – optický mikroskop , pozitivní buňky jsou s modrými skvrnami ( redukovaný formazán) Mikrotitrační destičky s fotometrickým odečtem Klinické koreláty – chronická granulomatozní choroba Zpracování do 2 hodin po odběru

Chemiluminiscence „ „ „

„

„

„ „ „ „

Měření chemiluminiscenční aktivity fagocytů Kvantitativní sledování oxidačního vzplanutí Redukce molekulárního kyslíku na superoxid a následně peroxid vodíku Peroxid vodíku je substrátem pro myeloperoxidázovou reakci s emisí fotonů a chemiluminiscencí fagocytů Pro chemiluminiscenci je stimulem phorbol-myristát-acetát, který aktivuje proteinkinázu C a následně NADPH oxidázu Chemické světlo se zesiluje akceptací fotonů luminolem Spontánní aktivita a aktivita stimulovaných fagocytů Chemiluminiscenční analyzátor Hodnotí se vrchol odpovědi a čas nezbytný k jeho dosažení

Chemiluminiscence – technické podmínky, uplatnění testu „

„ „

„ „ „

Čas zpracování , teplota při zpracování 37C, koncentrace granulocytů, diferenciál krevního obrazu Širší uplatnění ve srovnání s NBT testem Poruchy NADPH v oxidázovém a myeloperoxidázovém systému Klinický korelát – chronická granulomatóza Farmakologie Chemiluminometr, průtokový cytometr