Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav botaniky a zoologie
Imunokompetence a parazitismus u lína obecného (Tinca tinca L.) s různou úrovní ploidie Diplomová práce
2011 Vedoucí DP: RNDr. Martina Dávidová, Ph.D.
Bc. Radek Visner
„Souhlasím s uloţením této diplomové práce v knihovně Ústavu botaniky a zoologie PřF MU v Brně, případně v jiné knihovně MU, s jejím veřejným půjčováním a vyuţitím pro vědecké, vzdělávací nebo jiné veřejně prospěšné účely, a to za předpokladu, ţe převzaté informace budou řádně citovány a nebudou vyuţívány komerčně.„ V brně 16. 5. 2011 Radek Visner
Děkuji vedoucí mé diplomové práce RNDr. Martině Dávidové, Ph.D. za odborné vedení, trpělivost a čas mě věnovaný při zpracovávání této problematiky. Dále bych chtěl poděkovat všem svým kolegům a přátelům za pomoc při vypracovávání této diplomové práce. Tato práce byla podpořena Grantovou Agenturou České republiky, projekt číslo 524/07/0188.
Imunokompetence a parazitismus u lína obecného (Tinca tinca L.) s různou úrovní ploidie Polyploidie multiplikace úplných chromozómových sad má rozsáhlý a frekventovaný výskyt u mnoha skupin ryb. Polyploidizace je obecná metoda aplikovaná u ryb komerční akvakultuře. V této studii srovnáváme vybrané somatické, fyziologické a imunitní parametry u diploidních a triploidních línů a byl testován vztah mezi výskytem mnohobuněčných parazitů a úrovní ploidie ryb. Lín obecný (Tinca tinca) je kaprovitá ryba obecně uţívaná k indukování triploidie v akvakultuře, kterou jsme vyšetřovali v naší studii. Náš vzorek ryb byl odloven z chovné nádrţe ve Vodňanech během 4 sezón (září 2008, prosinec 2008, březen 2009 a červen 2009) ve sloţení 86 diploidů a 74 triploidů v poměru pohlaví 1: 1. Celkem bylo determinováno 12230 mnohobuněčných parazitů jako 13 druhů nebo rodů (Gyrodactylus tincae, Asymphylodora tincae, Tylodelphys clavata, Diplostomum spathaceum, Archigetes sieboldi,
Valipora
campylancristrota,
Caryophyllaeus
sp.,
Neogryporhynchus
cheilancristrotus, Nematoda sp., Anodonta sp., Ergasilus sieboldi., Argulus foliaceus and Hydrozetes sp.). Pouze 3 druhy byly zaznamenány v kaţdé sezóně (A. tincae, G. tincae and V. campylancristrota). Srovnání celkové abundance parazitů mezi diploidními a triploidními líny ukázalo vyšší výskyt u diploidů. Efekt ploidní úrovně na anundanci G. tincae nebyl zaznamenán. Diploidi byly více parazitování A. tincae (Trematoda) neţ triploidi. Na druhé straně byli triploidi více parazitování V. campylancristrota (Cestoda) neţ diploidi. Oba výsledky byli statisticky významné. Efekt pohlaví a velikosti těla na abundanci parazitů nebyl zaznamenán.
Immunocompetence and parasitism in tench (Tinca tinca L.) with different ploidy level
Polyploidy, the multiplication of entire sets of chromosomes, has occurred extensively and is frequent in many groups of fish. Polyploidization is a common method applied in fish commercial aquaculture. In the present study, we compared selected somatic, physiological and immune parameters in diploid and triploid specimens of tench and we tested whether there is the relationship between metazoan parasite load and fish ploidy level. Tench (Tinca tinca), cyprinid fish species commonly used for induction of triploidy in aquaculture, was investigated in this study. Fish samples were collected from breeding pond in Vodňany during four periods (September 2008, December 2008, March 2009, June 2009), and 86 diploid and 74 triploid specimens (sex ratio 1:1) were investigated. A total of 12230 metazoan parasites determined as 13 species or genera (Gyrodactylus tincae, Asymphylodora tincae, Tylodelphys clavata, Diplostomum spathaceum, Archigetes sieboldi, Valipora campylancristrota, Caryophyllaeus sp., Neogryporhynchus cheilancristrotus, Nematoda sp., Anodonta sp., Ergasilus sieboldi., Argulus foliaceus and Hydrozetes sp.) were found. Only 3 parasite species were recorded in each period (A. tincae, G. tincae and V. campylancristrota). The comparison of the total parasite abundance between diploid and triploid tench showed higher parasitic load in diploids. The effect of ploidy level on the abundance of G. tincae was not found. Furthermore, diploids were more parasitized by A. tincae (Trematoda) than triploids. On the other hand, triploids were more parasitized by V. campylancristrota (Cestoda) than diploids. The effect of sex and host body size on parasite abundance was not recorded.
OBSAH 1. ÚVOD .................................................................................................................................... 7 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED ..................................................................................................... 9 2. 1. Polyploidie ..................................................................................................................... 9 2. 2. Polyploidie u ryb......................................................................................................... 11 2. 2. 1. Indukce polyploidie .............................................................................................. 11 2. 2. 2. Detekce polyploidie.............................................................................................. 14 2. 2. 3. Výskyt polyploidie u konkrétních skupin ryb ...................................................... 18 2. 2. 4. Srovnání somatických a fyziologických parametrů mezi 2n a 3n rybami ........... 21 2. 3. Polyploidie a parazitismus ......................................................................................... 25 3. MATERIÁL A METODIKA ............................................................................................ 28 3. 1. Charakteristika hostitele ........................................................................................... 28 3. 2. Přehled parazitofauny lína obecného ....................................................................... 30 3. 3. Získání a zpracování materiálu ................................................................................ 31 3. 4. Základní epidemiologické charakteristiky............................................................... 36 3. 5. Statistické hodnocení dat ........................................................................................... 37 4. VÝSLEDKY ........................................................................................................................ 38 4. 1. Vliv pohlaví a ploidie na měřené parametry lína .................................................... 38 4. 2. Výskyt parazitů a jejich epidemiologické charakteristiky ..................................... 42 4. 3. Vliv pohlaví a ploidie na výskyt parazitofauny ....................................................... 48 4. 5. Vliv somatických, fyziologických a imunologických parametrů na parazitofaunu .............................................................................................................................................. 59 5. DISKUZE ............................................................................................................................ 60 5. 1. Vliv ploidie, pohlaví a sezónnosti na zaznamenané parametry u lína ................... 60 5. 2. Vliv ploidie, pohlaví a sezónnosti na parazitofaunu lína ........................................ 62 6. ZÁVĚR ................................................................................................................................ 65 7. LITERATURA ................................................................................................................... 66
1. ÚVOD V moderní akvakultuře jiţ našly své místo a pevně se uchytily různé způsoby zvyšování kvality chovaných ryb jako například zvyšování přírůstku a výnosu jedince, nebo jeho odolnosti vůči parazitárním infekcím a jiným nemocem. Velmi častým nástrojem je mezidruhová hybridizace a také uţívání genomových manipulací v komerčním chovu ekonomicky zajímavých ryb, jako jsou jeseteři (Acipenseriformes), kaprovité ryby (Cypriniformes), ostnoploutví (Perciformes), lososovití (Salmoniformes) a také sumečkovití (Ictaluridae) k produkci hybridních či polyploidních ryb, zvláště pak triploidů DONALDSON (1996). Studiem indukce polyploidizace ryb, metodikám její detekce, fyziologickými a imunologickými vlastnostmi polyploidních ryb, či přeţíváním juvenilních jedinců se zabývala celá řada autorů. Nicméně vlivu polyploidizace na odolnost vůči krátkodobému nebo chronickému stresu, náchylnost k onemocněním nebo výskytu různých morfologickoanatomických malformací tělesných struktur, jiţ tolik pozornosti věnováno nebylo. Podrobné studium
předešlých
faktorů
můţe
výrazně
napomoci
k optimalizaci
chovů
ryb
v akvakulturách BENFEY (1999). Interakce hostitele s parazitem je v centru hlavního zájmu parazitologie a parazitologů a určitou roli zde má hostitelská specifika, adaptace parazita, fylogeneze, distribuce parazita, obranné imunní reakce hostitele a proti reakce parazita a také koncept evolučního závodu ve zbrojení TINSLEY & JACKSON (1998). Zajímavé je analyzovat tyto vztahy mezi polyploidním hostitelem a parazity. Studií zabývajícími se vztahem polyploidie a parazitismu však není v dostupné literatuře mnoho, a tato velmi zajímavá oblast je zatím jen velmi málo probádána. Publikované studie se nejvíce zabývaly především interakcemi mezi polyploidními rostlinami a jejich parazity či herbivory. U ţivočichů je ovšem tento fenomén velmi málo prozkoumán. Jistě ale prací zpracovávající toto téma v brzké budoucnosti přibude. Jednou z nich je i naše studie na línu obecném.
7
Cíle práce: 1) Analyzovat vybrané somatické, fyziologické a imunologické parametry u jedinců lína obecného lišícího se úrovní ploidie (diploidní versus indukovaní triploidní jedinci). 2) Studovat parazitofaunu lína a vyhodnotit vliv sezónních změn a pohlaví na výskyt mnohobuněčných cizopasníků. 3) Porovnat stupeń parazitce mezi populacemi lína obecného s různou úrovní ploidie. 4) Analyzovat vliv vybraných fyziologických a imunologických parametrů na parazitofaunu lína s různou úrovní ploidie.
8
2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Polyploidie Velká většina ţivočišných organismů na naší planetě je diploidních (2n) s přibliţným počtem 48 chromozómů, tedy mají v somatických buňkách pouze dvě sady chromozómů. Vyskytují se však i ţivočišné druhy, jejichţ genomy obsahují více neţ klasické dvě chromozómové sady. Mezi takovéto ţivočichy s abnormálně velkým genomem patří zejména chrupavčité ryby z řádu Acipenseriformes, kde například genom jesetera krátkorypého (Acipenser brevirostrum Lesueur, 1818) čítá 350 – 500 chromozómů a obsahuje 16 úplných chromozómových sad LEGGAT & IWAMA (2003). Tento jev se obecně nazývá polyploidie. Pokud tedy hovoříme o polyploidii, tak tím máme na mysli zmnoţení sad chromozómů v somatických buňkách organismu nad normální tedy diploidní úroveň, coţ znamená, ţe počet chromozómových sad je tři a více. Ovšem ne všechna eukaryota jsou převáţně diploidního původu. U rostlin se polyploidie vyskytuje mnohem častěji neţ u ţivočichů. Z fylogenetického pohledu se s rostoucím stupněm vývoje sniţuje výskyt polyploidie TIWARY et al. (2004). U ţivočichů se polyploidie dělí na dva základní typy podle způsobu, jak vznikla: autopolyploidie
a
allopolyploidie.
Autopolyploidie
nastává,
pokud
ke
zmnoţení
chromozómových sad dochází při reprodukci jedinců stejného druhu. K jejímu vzniku vedou poruchy při procesu vývoje gamet FLAJŠHANS et al. (2005), LEGGAT & IWAMA (2003) nebo poruchy v procesu oplození způsobené fyzikálními vlivy vnějšího prostředí THORGAARD (1986). V prvním případě to mohou být například potlačení jedné fáze meiotického dělení, selhání při rozchodu mitotických chromozómů, stárnutí ovulovaných oocytů při němţ se nemusí uskutečnit oddělení druhého pólového tělíska v druhé fázi meiotického dělení CHERFAS et al. (1995). Pokud se bavíme o poruchách procesu fertilizace gamet THORGAARD (1986), tak můţeme uvést polyspermické oplození zmíněné UEDA (1996). Naopak k allopolyploidii můţe dojít při mezidruhové nebo mezirodové hybridizaci a to gynogenetickými či hybridogenetickými mechanismy FLAJŠHANS (2008). Při allopolyploidii nejčastěji vznikají 3n a 4n hybridi, tedy allotriploidi a allotetraploidi. Pokud tedy k poruchám, které vyvolávají zmnoţení chromozómových sad došlo spontánní cestou, tak se mohou v genomu fixovat a vést aţ ke vzniku či vývoji taxonů, které jsou evolučně polyploidního původu. V podmínkách Evropské akvakultury jsou mechanismy 9
vedoucí ke vzniku polyploidie podrobně studovány jiţ 50 let. Výsledky tohoto studia jsou obecně vyuţívány k produkci sterilních, ale i fertilních ryb s rychlým růstem, vyššími velikostními i hmotnostními přírůstky pro potřeby sladkovodní a mořské akvakultury FLAJŠHANS et al. (2005). Polyploidizace se ale nevyuţívá pouze v akvakulturách k produkci ryb a ústřic PIFERRER et al. (2009), ale je také hojně vyuţívána v moderním zemědělství. Je ceněna pro rostoucí produktivitu polyploidů, asociovanou s velikostí buněk nebo s rezistencí vůči nemocem. U rostlin s různými sadami chromozómů se polyploidie osvědčila k produkci bezsemenných plodů. Mezi takovéto genomové změny se řadí například: aneuploidie (cukrová třtina - Saccharum officinarum), triploidie (cukrová řepa - Beta vulgaris var. Altissima, pomerančovník pravý – Citrus sinensis), tetraploidie (tabák – rod Nicotiana, bavlna – Gossypium sp., lilek brambor - Solanum tuberosum), hexaploidie (aktinídie ovocná - Actinidia deliciosa a česnek kuchyňský - Allium sativum) a oktaploidie (jahoda – Fragaria) PIFERRER et al. (2009). Právě u polyploidních rostlin zjistili SOLTIS & SOLTIS (2000), ţe rostlinné druhy s polyploidním genomem mají širší ekologickou valenci. Další výhodou můţe být zvýšená heterozygotnost polyploidních organismů.
10
2. 2. Polyploidie u ryb 2. 2. 1. Indukce polyploidie U některých druhů volně ţijících ryb můţe k polyploidii docházet samovolně (spontánně) jako například u karase Carassius auratus (Linnaeus, 1758) LUSKOVÁ et al. (2004). Pokud ale nedochází k polyploidii spontánně, můţe být vyvolána uměle (indukovaně) procesem zvaným polyploidizace FLAJŠHANS (2008). Pro potřeby rybí akvakultury se nejčastěji indukují triploidní ryby s velmi dobrou ţivotaschopností, výjimku ovšem tvoří některé druhy z řádu Salmoniformes, kde byly prokázány malformace, nemoci a také častější výskyt deformací spodní čelisti TIWARY et al. (2004). K indukci polyploidie se vyuţívá tří základních principů: teplotní šoky, šok vyvolaný působením hydrostatického tlaku a působení chemických látek TIWARY et al. (2004) (Tab.1). Všechny tyto metody pro indukci triploidních jedinců fungují na stejném principu za vzniku triploidie ze dvou sad mateřských a jedné sady otcovských chromozómů. Mateřské sady pocházejí z mateřského pronukleu a z druhého pólového tělíska, které bylo zadrţeno (viz. níţe). Otcovská sada pochází ze spermie. Funkčnost tohoto principu je na základě vystavení oplozené jikry šoku, který způsobí depolymerizaci tubulinových vláken dělícího vřeténka pro oddělení druhého pólového tělíska, čímţ toto tělísko zůstane zadrţeno v důsledku inhibice tvorby dělícího vřeténka. Celý tento proces se děje během dokončování 2. fáze meiotického dělení FLAJŠHANS (2008). Teplotní šoky se provádí buď sníţením či zvýšením teploty a jsou co se týče nákladů levnou záleţitostí, a proto jsou hromadně aplikovány k produkci triploidů v akvakulturách. Chladné šoky se uplatňují u teplomilných druhů vyhledávající habitat s vyšší teplotou vody TIWARY et al. (2004). V České republice je tomu například právě při produkci lína obecného ve Vodňanech FLAJŠHANS et al. (1993). VARADARAJ & PANDIAN (1988) uvádějí 100% efektivitu při pouţití teplých šoků na okounovce mosambického (Oreochromis mossambicus Peters, 1852). K blokování dělícího vřeténka se uţívají i šoky vzniklé působením hydrostatického tlaku TIWARY et al. (2004). Tato metoda se úspěšně pouţívala k indukci triploidie u kapra obecného (Cyprinus carpio) LINHART et al. (1991) či pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss) TIWARY et al. (2004).
11
Poslední metodou k blokaci vřeténka je uţívání chemických látek TIWARY et al. (2004). REFSTIE et al. (1977) vystavoval jiţ oplozená vajíčka lososa obecného (Salmo salar) cytochalasinu B. Podobných výsledků dosáhli SMITH & LEMOINE (1979) u sivena amerického (Salvelinus fontinalis) po vystavení oplozených vajíček látce zvané kolchicin. K vysoké incidenci triploidie mohou slouţit i některé druhy anestetik jako freon či oxid dusnatý. Obě látky byly pouţity u lososa obecného. Oxid dusnatý měl účinnost 79,7%, freon jen o něco niţší JOHNSTONE et al. (1989). K vysoké incidenci triploidie dospěl i UEDA et al. (1988) po vystavení spermií nebo čerstvě oplozených vajíček vysokým hodnotám pH a vápenatých kationtů. Fyzikálního šoku je pouţito také u indukce tetraploidů, konkrétně u zygoty v prvním mitotickém dělení (obr. 1). Dochází k tomu ve fázi, kdy zygota prochází replikací genomu, zde šok opět depolymerizuje tubulinová vlákna dělícího aparátu a nedojde tak k samotné cytokinezi. Výsledný efekt je takový, ţe vzniklý organismus má dvě sady chromozómů ze samčího pronukleu a dvě sady ze samičího pronukleu. Tento způsob není příliš efektivní, neboť touto metodou byli indukováni ţivý tetraploidní jedinci jen u 10 druhů ryb PANDIAN & KOTEESWARAN (1998). U lína obecného byla tetraploidie úspěšně vyvolána pouze jednou, ale bez úspěšného dochování ryb do reprodukční dospělosti FLAJŠHANS et al. (1993). Jako důvody neúspěchu při indukci ţivých tetraploidů jsou uváděny mosaicismus (kdyţ je část buněk odlišná od dalších buněk v jednom organismu, mají tedy odlišnou chromozomální charakteristiku), aneuploidie (coţ je genomová mutace, kdy chybí nebo naopak přebývají chromozomy ve všech buňkách organismu oproti standardnímu počtu), vysoká homozygotnost a citlivost vůči vnějším podmínkám CASSANI et al. (1990), FLAJŠHANS (2008). Další moţností k získání triploidů je například kříţení tetraploidních samců s diploidními samicemi. Ovšem tato metoda je málo uţívaná vzhledem k špatnému odchovu a nestabilitě tetraploidních ryb (viz výše), a to i napříč nesporným výhodám takto vzniklých potomků FLAJŠHANS (2008). CHORROUT & NAKAYAMA (1987) tímto způsobem dosáhli u pstruha duhového triploidních potomků s vyšším procentem přeţítí a lepší rychlosti růstu neţ u triploidů, kteří vznikli za pouţití fyzikálních šoků. UEDA (1996) uvedl jako další moţnost dispermické oplození haploidní jikry. Zde budou mít výslední triploidi 2 otcovské chromozomální sady a 1 mateřskou FLAJŠHANS (2008).
12
Tab.1 Přehled metod vyuţívaných k indukci triploidie (upraveno dle TIWARY et al. (2004)) Metoda indukce triploidie
Druh, u kterého byla provedena
teplotní
Chladný šok
Oncorhynchus mykiss - pstruh duhový
Teplý šok
Oreochromis mossambicus - okounovec mosambický
tlakové
Šok hydrostatickým tlakem
Danio rerio - danio pruhované
chemické
Freon
Salmo salar – losos obecný
Oxid dusnatý
Salmo salar – losos obecný
Kolchicin
salvelinus fontinalis - siven americký
Cytochalasin B
Salmo salar – losos obecný
Vysoké pH a vápenaté kationy
Oncorhynchus mykiss - pstruh duhový
.
Obr. 1 Zjednodušené schéma triploidizace a tetraploidizace u ryb (přejato z FLAJŠHANS (2008).
13
2. 2. 2. Detekce polyploidie Dnes se vyuţívá k určení ploidní úrovně mnoho rozličných metod, které se od sebe liší ve finanční náročnosti, pouţitelnosti u různých úrovní polyploidie, invazivitě a narušení studovaného organismu, časové náročnosti a v neposlední řadě také svojí pouţitelností při terénním bádání FLAJŠHANS (2008). Tyto metody můţeme rozdělit na přímé a nepřímé THORGAARD (1983), LINHART et al. (2001) a TIWARY et al. (2004). Mezi přímé metody vycházející zejména z obsahu či mnoţství DNA a počtu chromozómů řadíme: stanovení karyotypu, kvantifikaci obarvených oblastí organizátoru jadérka v buňkách a uţití spektrofluorometrie, průtokové cytometrie a mikrodenzitometrie ke kvantifikaci obsahu DNA v buněčných jádrech, která jsou specificky barvena FLAJŠHANS (2008), TIWARY et al. (2004). FLAJŠHANS et al. (2005) uvádí uţití průtokové cytometrie jako nejvíce frekventovanou metodu díky své rychlosti a přesnosti. Jako metody nepřímé jsou povaţovány: Coulterova metoda zaloţená na principu měření objemu jádra, měření velikosti jádra a buněk erytrocytů (tzv. geometrické charakteristiky jader a buněk), elektroforéza enzymů a nakonec málo uţívané a dosti nepřesné rozlišování na bázi morfologických rozdílů. Kompletní přehled metod i s druhy ryb, na kterých byly aplikovány (tab. 2) FLAJŠHANS (2008), TIWARY et al. (2004). Tab. 2 . Přehled metod vyuţívaných ke stanoveí polyploidie u ryb Detekční metody polyploidie
Druh, kde byla metoda pouţita
Nepřímé Rozměry jader a buněk
Pleuronectes platessa Linnaeus, 1758 – Platýs velký
Coulterova metoda
Ctenopharyngodon idella – amur bílý
Proteinová elektroforéza
Carassius auratus langsdorfi
Morfologické rozdíly mezi
Salvelinus fontinalis – siven americký
jedinci Přímé
Kvantifikace obarvených
Hybrid Carassius carassius – karas obecný x
oblastí organizátoru
Cyprinus carpio – kapr obecný
jadérka Počet chromozómů
Danio rerio – danio pruhované
Stanovení karyotypu
Silurus glanis – sumec velký
Průtoková cytometrie
Tinca tinca – lín obecný
14
Materiál pro stanovení karyotypu se získává z ţivých nebo mrtvých ryb. Z kadaveru se preparují chromozómy z vnitřních orgánů (slezina, ledviny, gonády) či z buněk epitelu ţaber. U ţivých ryb se odebírají vzorky z krve a ploutevních lemů ALVAREZ et al. (1991). Tato metoda je podle LINHART et al. (2001) pracná a do provozních podmínek nepouţitelná, nicméně jako jediná můţe poukázat na abnormality v genomu jako aneuploidie či heteromorfismy (strukturní varianty bez fenotypového projevu). Průtoková cytometrie, spektrofluorometrie a mikrodenzitometrie jsou označovány jako instrumentální metody FLAJŠHANS (2008). První dvě jmenované fungují na principu schopnosti buněčné membrány být permeabilní, schopnosti jádra být obarveno DNA – specifickým barvivem (DAPI coţ je 4'-6-Diamidino-2-phenylindol) a na měřeni fluorescence, která je emitovaná obarvenou DNA. Výsledkem je histogram zobrazující intenzitu fluorescence. Na (obr. 2) je na histogramu vidět srovnání diploidního (vyšší vrchol) a triploidního jedince (niţší vrchol). Vrchol u triploida se nachází přibliţně 1,5krát dále na ose x od nuly neţ je tomu u diploida. Tento výsledek je dán obsahem 1,5krát více DNA právě u triploida
FLAJŠHANS
&
LINHART
(2000).
Poslední
instrumentální
metoda
–
mikrodenzitometrie – funguje na principu nátěru buněk Feulgenovou reakcí a následné měření absorbance barviva v těchto buňkách FLAJŠHANS (2008).
Obr. 2 Histogram relativního obsahu DNA u diploidních a triploidních jedinců lína obecného FLAJŠHANS & LINHART (2000)
15
FLAJŠHANS (1997) uvádí měření geometrických charakteristik buněk a jader (zejména erytrocytů) jako rychlou alternativu průtokové cytometrie. U erytrocytů a jejich jader je důleţité měřit podélnou osu, která má vypovídající charakter pro 2n a 3n ryby. Na rozdíl od podélné vykazuje příčná osa s rostoucí úrovní ploidie jen nevýznamné změny BENFEY et al. (1984). Kromě měření délky erytrocytu a jeho jádra pro zjištění ploidie se vyuţívají i další parametry (plocha erytrocytu a jeho jádra, střední objem erytrocytu) RÁB et al. (2006), SVOBODOVÁ et al. (1998). Hodnoty pro jednotlivé parametry a jejich změny vzhledem k stoupající úrovni ploidie pro sladkovodní ryby jsou shrnuty v tabulce (tab. 3) FLAJŠHANS et al. (2005). Tab. 3 Diagnostické ukazatele pro geometrickou charakteristiku erytrocytů a jejich jader Druh ryby
Ploidie
Plocha jádra
Počet erytrocytů
Střední objem
erytrocytů (µm²)
(10¹².lˉ¹)
erytrocytů
Tinca tinca
2n
10,58 ±1,21
1,34 ± 0,05
254 ± 7,38
Tinca tinca
3n
16,5 ± 1,71
0,92 ± 0,04
355 ± 17,6
Acipenser ruthenus
4n
19,69 ± 1,61
1,23 ± 0,16
200,69 ± 38,82
Hybrid jeseterů
5n
25,03 ± 2,49
0,79 ± 0,19
405,8 ± 84,86
Hybrid jeseterů
6n
30,61 ± 2,21
0,55 ± 0,1
440 ± 89,99
Hybrid jeseterů
7n
35,41 ± 4,93
0,27 ± 0,02
712,3 ± 117,56
Acipenser gueldenstaedtii
8n
35,99 ± 3,44
0,39 ± 0,21
623,43 ± 166,42
Hybrid jeseterů
9n
34,03
-
-
Acipenser gueldenstaedtii
12n
49,61 ± 4,17
0,2
1075 ± 25
Poslední nepřímou metodou zmiňovanou v této práci je rozlišování morfologických rozdílů ve tvaru a velikosti břišních ploutví. Zatímco ostatní metody se mohly pouţívat pro různé stupně polyploidie, uţití této metody je pouze pro srovnání rozdílů mezi 2n a 3n rybami FLAJŠHANS (2008). U lína obecného jsou tyto rozdíly popsány v kapitole Materiál a metodika dle FLAJŠHANS et al. (1993). Stejný autor popsal také fenotypové projevy ve tvaru a délce břišních ploutví u línů obecných. Srovnával triploidního jedince bez určení pohlaví s diploidním samcem a samicí (obr. 3) a uvádí vysokou přesnost detekce triploidie právě podle těchto znaků.
16
Obr. 3 Fenotypový rozdíl mezi diploidním a triploidním línem
17
2. 2. 3. Výskyt polyploidie u konkrétních skupin ryb Důvody pro uţití triploidů v akvakultuře shrnul HAFFRAY et al. (2007). A) Zvýšená rychlost somatického růstu a nárůst hmotnosti u reprodukčně dospělých jedinců. B) Sníţení stresových faktorů a ztrát energie u triploidních ryb díky sníţenému teritoriálnímu a reprodukčnímu chování. C) Pokud jsou ryby distribuovány po dosaţení pohlavní zralosti, tak i zlepšení kvality masa a větší obsah tuku ve svalovině. D) Sterilita při vysazování triploidních jedinců či populací do volné přírody, nebo při úniku šlechtěných ryb z chovných zařízení a zabránění tak introdukce genů do původních populací. Jak popisuje BENFEY (1989) a PANDIAN & KOTEESWARAN (1998), tak spontánní polyploidie je u ryb velmi častá a v posledních letech také velmi dobře dokumentována. Ovšem drtivá většina dokumentovaných nálezů spontánní polyploidie se týká spontánní autotriploidie. Tyto nálezy byly zaznamenány například u pstruha duhového FLAJŠHANS & RÁB (1987). Mezi další spontánně autotriploidní druhy, které jsou vyuţívány v akvakulturách patří také kapr obecný a sumec velký (Silurus glanis). Kompletní přehled druhů byl zveřejněn BENFEY (1989). Co se týče spontánní tetraploidie u ryb, tak ta byla popsána pouze v několika studiích u piskořů rodu Misgurnus a sekavců rodu Cobitis. Seznam nálezů shrnul FLAJŠHANS (2008). U lína není spontánní autotriploidie příliš častá FLAJŠHANS et al. (1993), FLAJŠHANS (1997) a FLAJŠHANS et al. (2007). V tabulce (tab. 4) je zobrazen přehled úrovní ploidie u ryb od diploidních aţ po ryby s 12 chromozomálními sadami. Počet chromozómů na jednu sadu se pohybuje v rozmezí n = 24 aţ n = 30. U ploidních úrovní 5n, 6n, 7n a 9n je uveden jako druh ryby, u které se tato ploidie vyskytuje hybrid jeseterů, avšak hybridizací kterých druhů vznikla, není známo FLAJŠHANS et al. (2005).
18
Tab. 4 Přehled úrovní ploidie u vybraných druhů ryb.Upravena dle FLAJŠHANS et al. (2005) Druh ryby
Úroveň
Celkový počet
n
ploidie
chromozómů
Tinca tinca (Linnaeus, 1758) – lín obecný
2n
48
24
Tinca tinca (Linnaeus, 1758) – lín obecný
3n
72
24
Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758 - jeseter malý
4n
~120
~30
Hybrid jeseterů
5n
~150
~30
Hybrid jeseterů
6n
~180
~30
Hybrid jeseterů
7n
~210
~30
Acipenser gueldenstaedtii Brandt & Ratzeburg, 1833
8n
~250
~31,25
Hybrid jeseterů
9n
~270
~30
Acipenser gueldenstaedtii Brandt & Ratzeburg, 1833
12n
~366-368
~30,5
- jeseter ruský
Podle LEGGAT & IWAMA (2003) mohou být některé poruchy během reprodukce a následného meiotického dělení vedoucí k polyploidii u stejného druhu nebo při hybridizaci druhů příbuzných evolučně fixovány. Touto fixací pak vznikaly nové taxonomické jednotky, coţ dokládá fakt, ţe spousta recentních druhů ryb se vyvinulo z polyploidního předka (obr. 4), a to i čeledi ryb velmi významných pro akvakulturu jako Salmonidae, Catostomidae či řád Acipenseriformes.
Všichni
předci
výše
jmenovaných
taxonomických
skupin
jsou
tetraploidního původu. Z tohoto vyplývá, ţe polyploidie hrála důleţitou roli v průběhu vývoje a diversifikace ryb od ţraloků (Chondroichthyes) aţ po vyšší kostnaté ryby. Polyploidie je velmi rozšířená u evolučně primitivních skupin jako Elasmobranchi, Chondrostei a niţší kostnaté ryby. Zatímco u vyšších kostnatých ryb je výskyt polyploidie jevem spíše sporadickým. Například u nejpočetnějšího řádu obratlovců – Perciformes se vyskytuje pouze jeden polyploidní druh a existuje pouze jeden záznam vzniku polyploidie spontánním způsobem LINCOLN (1987). Také BENFEY (1989) potvrzuje, ţe tato hypotéza zaloţená na vzniku a ustálení polyploidie při hybridizaci je pravděpodobná na základě vysoké přirozené mezidruhové hybridizace, která je u ryb dobře zdokumentována. SCHULTZ (1989) vyslovil hypotézu, ţe neţ se ryba stala a ustálila jako bisexuální tetraploid, musela se prvně stát gynogenetickým či hybridním allodiploidem a následně gynogenetickým allotriploidem. Dalším důvodem výskytu polyploidie můţe být stabilizace hybridního genomu. Toto podporuje i studie, u které se uměle produkované ryby z řádu Salmoniformes hybridně kříţily
19
a u potomků bylo následně zjištěno značně vyšší procento přeţívání SCHREERER & THORGAARD (1983).
Obr. 4 Incidence polyploidie u ryb dle TIWARY et al. (2004).
20
2. 2. 4. Srovnání somatických a fyziologických parametrů mezi 2n a 3n rybami Pokud se zaměříme na rozdíly v metrických parametrech mezi 2n a 3n rybami, tak se všeobecně předpokládá větší růstový potenciál ve prospěch triploidních ryb. BENFEY (1999) prokázal nevýznamnost velikosti buněk (v důsledku většího obsahu DNA) na rychlost růstu či velikost, protoţe tento jev je kompenzován úbytkem buněk. Další předpoklad je zaloţen na redukci vývoje pohlavních orgánů a sterilitě (viz níţe). BUCHTOVÁ et al. (2003a), BUCHTOVÁ et al. (2003b) na základě svých studií předpokládá v období pohlavního zrání rychlejší somatický růst triploidů oproti diploidům kvůli niţší investici energie do vývoje a zrání gonád. PANDIAN & KOTEESWARAN (1998) srovnali somatický růst 2n a 3n jedinců u mnoha druhů ryb z řádů Salmoniformes, Cyprinoformes a Siluriformes v období před a po dosaţení reprodukční dospělosti. V juvenilním stádiu trpí triploidi růstovými depresemi a vysokou mortalitou, naopak u adultních jedinců dochází ke zvýšené rychlosti somatického růstu v řádech desítek procent. Výsledky u stejných druhů ryb však mohou tento předpoklad potvrdit nebo i vyvrátit, jak popisuje HUSSAIN et al. (1995) ve dvou studiích na tlamounech Oreochromis niloticus a O. aureus. V prvním případě mu vyšel pozitivní výsledek pro tempo růstu u 3n jedinců pro oba druhy, u druhé negativní pro 3n opět pro oba druhy. V tabulce (tab. 5) jsou popsány druhy triploidních ryb s pozitivními i negativními růstovými a hmotnostními přírůstky TIWARY et al. (1997), TIWARY et al. (2004). Také u lína obecného byl pozitivní růstový potenciál pro triploidní populace prokázán a názorně porovnán u 2n samice s trţní hmotností 287 g s 3n samicí stejného věku s trţní hmotností 677 g (obr. 5). Důleţité je také zmínit, ţe obě samice pocházely ze společného chovu FLAJŠHANS et al. (2004).
21
Tab. 5 Pozitivní či negativní hmotnostní a velikostní přírůstky triploidních ryb oproti diploidům Druh
Hmotnostní a velikostní přírůstky
Ictalurus punctatus – sumeček tečkovaný
+
Silurus glanis – sumec velký
+
Heteropneustes fossilis – keříčkovec dvoupásý
+
Oreochromis niloticus – tlamoun nilský
+
Oreochromis aureus – tlamoun zlatý
+
Oreochromis niloticus – tlamoun nilský
-
Oreochromis aureus – tlamoun zlatý
-
Lepomis gibbosus – slunečnice pestrá
-
Oncorhynchus mykiss – pstruh duhový
-
Oncorhynchus kisutch – losos kisuč
-
Salmo salar – losos obecný
-
Stupeň polyploidie můţe ovlivnit také chemické sloţení masa. U pstruha duhového mají polyploidní jedinci niţší obsah vody a naopak vyšší obsah tuku ve svalovině, coţ je nejspíše způsobeno právě většími rozměry buněk LINCOLN (1987). Tento aspekt studovala také BUCHTOVÁ et al. (2005) na línovi. Potvrdil se výše zmíněný vyšší obsah tuku u triploidů, dále uvádí jako příznivější kvalitu masa a chemické sloţení svaloviny pro 3n liny ve věku L3+. Obecné rozdíly v různých parametrech mezi diploidy a triploidy shrnuje tabulka (tab. 6) dle TIWARY et al. (2004).
22
Tab. 6 Porovnání somatických a fyziologických parametrů mezi 2n a 3n rybami Úroveň ploidie
2n
3n
Velikost jádra erytrocytů
–
+
Velikost buněk
–
+
Počet buněk
+
–
Celková délka
–
+
Délka těla
–
+
Rychlost růstu
–
+
Hmotnost
–
+
Hmotnost bez orgánů
–
+
GSI
+
–
Hladina hormonů v plazmě
+
–
Objem spermatu
+
–
Hybnost spermií
+
–
Obsah tuku
–
+
Obr. 5 Srovnání 2n a 3n samic lína stejného věku
23
Triploidní ryby všeobecně hůře snášejí a špatně se vyrovnávají s dlouhodobým či chronickým stresem. Jako stresové faktory mohou slouţit špatná kvalita vody nebo kompetiční prostředí BENFEY (1999). V souvislosti se sekundární odezvou na stres se udávají nárůsty hodnot hematokritu a hladiny glukózy v plazmě, související s mobilizací energetických rezerv organismu. Jako ukazatele krevního obrazu udávají FLAJŠHANS & VAJCOVÁ (2002) parametry: počet erytrocytů, hemoglobin a počet leukocytů. FLAJŠHANS et al. (2005), FLAJŠHANS & VAJCOVÁ (2002) uvádí trend poklesu počtu erytrocytů a jejich středního objemu v důsledku zvětšování jádra erytrocytů a tím tedy i jejich velikosti v návaznosti na zvyšující se ploidní úroveň. S větší velikostí erytrocytů souvisí také vyšší obsah hemoglobinu, přičemţ celkový hemoglobin závisí i na konkrétním druhu ryby TIWARY et al. (2004). FLAJŠHANS (2008) uvádí obsah hemoglobinu niţší u triploidů v porovnání s diploidními rybami. SVOBODOVÁ et al. (1998) ve své studii prokázala významně niţší obsah hemoglobinu pro 3n líny. Dalším ukazatelem krevního obrazu jsou leukocyty. Jsou to důleţité obranné buňky nespecifické imunitní aktivity ţivočišného organismu. Dle SVOBODOVÁ et al. (2001), FLAJŠHANS et al. (2004) závisí počet leukocytů také na stáří ryby. U lína obecného byl celkový počet leukocytů podobný pro 2n i 3n, jen u triploidů byl nesignifikantně niţší. Princip sterility byl pozorován například u lososovitých ryb, kde 3n samice měly méně vyvinuté gonády s velmi malým počtem vyvíjejících se oocytů. U 3n samců lososovitých ovšem ke spermatogenezi dochází zcela normálně, ale důvod sterility je v náhodné segregaci trivalentů během meiotického dělení za vzniku aneuploidní spermie HUSSAIN et al. (1996). Sterilitu triploidních samců potvrzuje LINHART et al. (2006) u lína obecného. Relativní obsah DNA v jádře spermie, kde u diploidů nabýval klasické haploidní hodnoty (1n). Kdeţto u triploida hodnoty (1,47n). Jako další parametry zvolil hybnost spermií a objem spermatu, obě tyto veličiny hovoří výrazně ve prospěch 2n línů. Ovšem ne všechny triploidní ryby jsou sterilní, její úroveň se liší mezi jednotlivými druhy či hybridy. U karase zlatého Carassius auratus gibelio jsou triploidní samci i samice fertilní, u triploidních hybridů výše zmiňovaného C. auratus gibelio s kaprem obecným byly samice fertilní a samci naopak sterilní WU et al. (1993). Dalším příkladem fertilní triploidní ryby je mřenka mramorovaná (Noemacheilus barbatula). Důvod, proč je různá míra sterility u triploidních ryb v rámci druhů a pohlaví zatím není znám LINHART et al. (2006), ale platí zde obecné pravidlo, ţe vývoj samčích gonád (varlat) u triploidů nebývá tak redukován a postiţen jako vývoj samičích gonád (ovárií) PANDIAN & KOTEESWARAN (1998).
24
2. 3. Polyploidie a parazitismus O vyšším počtu parazitických druhů u polyploidních hostitelů neţ u jejich diploidních příbuzných informovali GUÉGAN & MORAND (1996). V této souvislosti také dodávají, ţe studium polyploidních organismů a s nimi souvisejících parazitů by mohlo napomoci evolučním ekologům a parazitologům k pochopení interakcí v komplexu hostitel – parazit. Jejich studie byla zaměřena na druhové sloţení Monogeneí u 29 druhů Afrických sladkovodních ryb z čeledi Cyprinidae. Testovali vliv úrovně ploidie hostitele na výskyt uvedených parazitů. Zjistili, ţe počet i druhová bohatost parazitů pozitivně koreluje s úrovní ploidie. Na základě získaných výsledků pak vyslovili pět hypotéz: 1) Polyploidní organismy jsou evolučně mladší a jejich obranyschopnost není ještě dostatečně vyvinutá proti parazitům, z toho vyplývá, ţe mohou být infikováni (napadáni) vyšším počtem druhů a jedinců parazitů. Tato hypotéza je tedy zaloţená na předpokladu, ţe výskyt polyploidie je relativně současným problémem, nicméně polyploidie se vyskytovala pravděpodobně jiţ před 50 milióny let. 2) Polyploidizace můţe vyvolat fyziologické problémy u ryb, tím narušit fyziologicko-imunologickou rovnováhu hostitele a tím umoţní více příleţitostí pro invazi parazitů. 3) Polyploidní druhy ryb jsou více citlivé a náchylné na parazitární infekce v důsledku toho, ţe to jsou hybridi (allopolyploidi). Tato hypotéza se opírá o fakt, ţe u hybridních ryb bylo nalezeno více druhů i vyšší abundance parazitů. 4) S rostoucími biochemickými rozdíly pozorovanými mezi diploidními a polyploidními rybami, rostou také moţnosti pro interakci hostitele a parazita. 5) Polyploidní taxony mají signifikantně vyšší počet lokusů enzymatického systému neţ jejich diploidní příbuzní a také více specifických lokusů pověřených rezistencí vůči parazitům. Studií zabývajících se vztahem polyploidních organismů a parazitismu nebylo publikováno mnoho. Nejvíce prací se zabývalo vztahem polyploidních rostlin a jejich škůdců, parazitů či herbivorů. U ţivočišných organismů jsou tyto studie spíše ojedinělé. Velmi rozsáhlá práce na téma polyploidie a parazitismus byla publikována TINSLEY & JACKSON (1998) a zaměřila se na druhy Afrických ţab rodu Xenopus (Pipidae). Na základě počtů chromosomů v rámci tohoto rodu u jednotlivých druhů bylo moţné identifikovat
25
diploidy, tetraploidy, oktoploidy a dodekaploidy. Ţáby se dle počtu chromozómů dělí na dvě základní linie diploidů: první linie diploidů a tetraploidů (2n = 20, 4n = 40) u podrodu Silurana a druhou linii kde 2n = 36 byli prezentováni jako tetraploidi (ještě byli v této linii pozorovány druhy s n = 72 a 108) u podrodu Xenopus. Autoři zaznamenali celkem 29 druhů jednobuněčných a mnohobuněčných parazitů. V tabulce (tab. 7) jsou vypsány paraziti společní pro oba poddruhy v prvním sloupci a ve druhém jiţ specifická parazitofauna pro podrod Xenopus. U podrodu Silurana nebyli zaznamenáni ţádní specifičtí parazité. Z výsledků této práce je tedy patrné, ţe 3 druhy nebo rody parazitů (Dollfuschella, Protopolystoma a Batrachocamallanus) se vyskytovaly a preferovaly vyšší úroveň ploidie u hostitele. Tab. 7 Sloţení a výskyt mnohobuněčných parazitů u rodu Xenopus. Silurana a Xenopus
Xenopus
Cestoda
Cephalochlamys
Dollfuschella
Trematoda
Oligolecithus Progonimodiscus
Monogenea Nematoda
Protopolystoma Camallanus
Batrachocamallanus
V práci KOŠAŘ (2007), který se zabýval vztahem MHC genů a polyploidie, byli porovnáváni diploidní a triploidní jedinci karase stříbřitého. Autor zde nebral v úvahu vliv pohlaví a zaměřil se na následující dva parametry: celkový počet zjištěných mnohobuněčných parazitů a celkový počet zaznamenaných druhů mnohobuněčných parazitů. Porovnávány byly dva vzorky, přičemţ oba odlovy byly provedeny ve stejném období v letních měsících na přelomu července a srpna. V prvním odběru byl prokázán signifikantní rozdíl ve výši celkového počtu parazitů ve prospěch 3n oproti 2n karasům, kdeţto v následujícím odběru, tedy v roce 2006, jiţ nebyl ţádný významný rozdíl potvrzen. Kdyţ tento negativní výsledek mohl být podle autora výrazně ovlivněn záplavami v roce 2006. Kompletní sloţení parazitofauny lína obecného sestavily SVOBODOVÁ & KOLÁŘOVÁ (2004). Autorky v této práci ovšem neberou ohledy na ploidní úroveň línů. Na našem modelovém hostiteli línu obecném v souvislosti s chromozomálními manipulacemi byly provedeny pouze 2 práce českých autorů.
Obě studie FLAJŠHANS et al. (2004) a
PIAČKOVÁ & FLAJŠHANS (2006) jsou provedeny na shodných populacích lína, rozdíl je
26
pouze ve stáří ryb a sumarizaci výsledků. Předmětem výzkumu byl zdravotní stav amfimiktických diploidních (amfimixie – normální způsob pohlavního rozmnoţování, při kterém splývají dvě gamety jedinců s rozdílným pohlavím), indukovaných triploidních a meiotických gynogenetických línů (coţ je druh partenogeneze, kde se vyvíjí jedinec pouze z neoplozeného vajíčka, ale k aktivaci je potřeba spermie samce, coţ například u výše zmíněného karase stříbřitého můţe byt spermie kterékoli u nás ţijící ryby z čeledi Cyprinidae (LUSKOVÁ et al. 2004). Vyšetření spočívalo v makroskopickém i mikroskopickém vyšetření kaţdého jedince, zaznamenávali, jak mnohobuněčné tak i jednobuněčné parazity. Celkem bylo nalezeno 11 druhů parazitů. Na kůţi a ţábrách nalezli jednobuněčné parazity (Trichodina spp., Chilodonella hexasticha, Trichodinella spp., Ichthyophtirius multifiliis, Trichophrya piscium a Apiosoma spp.) i mnohobuněčné (Gyrodactylus spp., Argulus foliaceus a Piscicola geometra). Z endoparazitů byli nalezeni jen Khawia sinensis a Diplostomum spp. Při parazitologickém vyšetření se zaměřili na kvantifikaci infekce, tedy intenzitu infekce a prevalenci parazitů populace 2n, 3n, MeiG (meiotičtí gynogenetičtí líni). Podle výsledků je vidět, ţe výskyt parazitů byl vţdy větší v jarních obdobích po komorování. Z výsledků plyne, ţe nejvyšší extenzitu invaze (tedy počet jedinců infikovaných jednotlivými parazity) měli vţdy MeiG líni aţ do věku L4, kdeţto rozdíl mezi 2n a 3n nebyl statisticky významný. Nicméně celkově byla intenzita infekce nízká a proto nevyvolala ţádnou imunitní odezvu projevující se výrazněji v krevním obraze studovaných ryb.
27
3. MATERIÁL A METODIKA 3. 1. Charakteristika hostitele Jako modelový hostitel byl vybrán lín obecný (Tinca tinca Linnaeus, 1758) (Obr. 6) z čeledi Cyprinidae, tedy kaprovití. Je to ryba s relativně krátkým, ale vysokým tělem dorůstající délky 30 – 63,5 cm při hmotnosti od 1,2 do 6 kilogramů. Povrch těla je chráněn silnou vrstvou mukózního hlenu pod nímţ se nacházejí drobné zelenavé elipsovité šupiny, které jsou zanořeny hluboko do škáry. Velkého kontrastu dosahuje zbarvení mezi dorzální a ventrální částí trupu, kde dorzální dosahuje výrazně tmavě zeleného odstínu a směrem k břichu přechází aţ ve ţlutavou barvu. Rozdílné zbarvení se vyskytuje také u ryb v různém věku, juvenilové jsou spíše světlejší, zatímco adulti postupně tmavnou. Ocasní ploutev má zakulacené okraje a mírný výkroj. Od stáří přibliţně 15 měsíců lze dle ploutví rozlišit pohlaví (viz. níţe). Dalším ukazatelem pohlavního dimorfismu je u dospělých pohlavně zralých jedinců tzv. třecí bradavky (třecí vyráţka), coţ jsou rohovité epidermální útvary lokalizované na hlavě a dorzální straně těla. Tento znak je ovšem pouţitelný pouze v době tření (viz. níţe) BARUŠ & OLIVA (1995). Výskyt lína je velmi široký a zasahuje téměř celou Evropu. Areál rozšíření sahá přes Kavkaz a Zakavkazsko aţ na Sibiř ve středních tocích řek Ob a Jenisej. V horách jako Alpy je limitním faktorem výskytu nadmořská výška nad 1600 m n. m. BARUŠ & OLIVA (1995). Lín je níţinná ryba s původním biotopem pomalu tekoucích vod, systémem různých tůní a ramen v záplavových územích řek. Jeho výskyt však zasahuje i do údolních nádrţí a rybničních soustav akvakultury. Jeho vyhledávané lokality jsou s bahnitým či jílovitým dnem zarostlé vodní vegetací LUSK et al. (1992). Juvenilní jedinci se specializují zejména na zooplankton, s přibývajícím věkem pak na larvy pakomárů (Chironomidae), klanonoţce (Copepoda) a perloočky (Cladocera). Adultní jedinci jsou pak částečně i fytofágní a v jejich potravě zaujímá více významu rostlinná potrava a fytoplankton BARUŠ & OLIVA (1995), LUSK et al. (1992). Samotný proces reprodukce začíná nejdříve ve třetím, častěji ale aţ ve čtvrtém roce ţivota ryby. Doba tření probíhá v období od května do srpna a je závislá především na teplotě vody, která musí dosahovat minimálně 18 ºC. Lín se vytírá na odumřelé části suchozemského porostu nebo na vodní rostliny, je tedy fytofilní rybou BARUŠ & OLIVA (1995).
28
Lín je významným doplňkovým druhem v rybničním hospodářství a to nejen pro svou odolnost vůči nedostatku kyslíku, kyselosti a vysoké teplotě vody, ale především pro své bílé tučné a velmi chutné maso. To je ceněno hlavně zahraničními konzumenty, a proto se z lína stal ekonomicky zajímavý druh pro export BARUŠ & OLIVA (1995).
Obr. 6 Lín obecný (Tinca tinca)
29
3. 2. Přehled parazitofauny lína obecného Celkový počet mnohobuněčných parazitů zjištěných na línovi obecném na území České a Slovenské republiky byl 43 druhů a zahrnuje ektoparazity a endoparazity. Počet jednotlivých druhů ke kaţdé skupině je následovný: Monogenea (5 druhů), Cestoda (8 druhů), Trematoda (12 druhů), Nematoda (7 druhů), Acanthocephala (4 druhy), Annelida (1 druh), Bivalvia (kvůli obtíţné determinaci larválních stádií je bráno jako skupina) a Arthropoda (6 druhů) MORAVEC (2001). U lína byly popsány pouze čtyři specifické druhy parazitů: Asymphylodora tincae (Trematoda), Skrjabillanus tincae (Nematoda), Dactylogyrus tincae (Monogenea) a Gyrodactylus
tincae
(Monogenea).
Výskyt
druhů
Philometra
ovata
(Nematoda),
Proteocephalus percae (Cestoda), Caryophyllaeus laticeps (Cestoda) a Gyrodactylus elegans (Monogenea) označuje MORAVEC (2001) jako náhodný respektive sporný. SVOBODOVÁ &
KOLÁŘOVÁ
(2004)
hodnotí
lína
jako
relativně
„zdravou“
rybu
s nízkými
epidemiologickými charakteristikami parazitů (prevalence, abundance a intenzita infekce), coţ potvrzují i PIAČKOVÁ & FLAJŠHANS (2006) s upřesněním, ţe prevalence parazitů u diploidních i triploidních línů byla vyšší v jarních měsících po tzv. komorování, coţ bylo patrně způsobeno oslabením organismu v důsledku dlouhého pobytu v nízkých teplotách.
30
3. 3. Získání a zpracování materiálu Líni pouţiti pro naše potřeby pocházeli z chovných nádrţí VÚRH (Výzkumný ústav rybářství a hydrobiologie) ve Vodňanech (Obr. 7). Ryby byly chovány společně v chovné nádrţi, bez dalších jedinců jiných druhů (obr. 8). Produkce diploidních a triploidních línů byla detailně popsána FLAJŠHANSEM et. al (1993). Triploidie byla indukována pomocí teplotního šoku, a to chladným šokem FLAJŠHANS & LINHART (2000). Všechny ryby byly označeny pomocí tekutého dusíku pro snadné makroskopické rozlišení ploidní úrovně při výlovu a výběru vhodných jedinců (viz. níţe).
Obr. 7 Lokalizace Vodňan
31
Obr. 8 Lokalizace chovných nádrţí náleţících k areálu rybářské školy. Pro uvedenou studii bylo odloveno 160 línů ve 4 sezónách (září 2008, prosinec 2008, březen 2009 a červen 2009). Celkem bylo vyšetřeno 81 diploidních (2n) a 79 triploidních (3n) jedinců. Poměr pohlaví byl u vzorku v mírný prospěch samců (83 samců a 77 samic). Přehled počtů odlovených jedinců v jednotlivých sezónách je popsán v tabulce (tab. 8). Co se týče věkového sloţení této populace lína obecného, v sezónách září, prosinec byli staří T3, ve zbývajících dvou sezónách tedy potom ve věku T3+ (T3 je označení tříleté ryby a T3+ pro tříleté ryby, které překonaly zimování). Tab. 8 Přehled počtu vyšetřených jedinců lína obecného dle pohlaví a ploidie v kaţdé vzorkované sezóně Sezóna
Teplota vody (°C)
2n
3n
Samci
Samice
Samci
Samice
Září 2008
14,3
9
9
10
12
Prosinec 2008
2,5
10
10
13
7
Březen 2009
5,6
11
11
9
9
Červen 2009
16,1
10
11
11
8
40
41
43
36
Součet
32
Samotný výlov se uskutečnil vţdy v ranních hodinách a to tak, ţe byla část chovné nádrţe vypuštěna a poţadovaný počet ryb byl sloven podběráky do kádí. Při výlovu se zjišťovalo pohlaví ryb na základě pohlavního dimorfismu (u samců podle zvětšených prvních paprsků na břišních ploutvích (pinna ventralis), která se dotýkala nebo překrývala anální otvor BARUŠ & OLIVA et al. (1995) a následně při pitvě makroskopické pozorování morfologie a anatomie gonád). Dále se zjišťovala úroveň ploidie dle značek vytvořených tekutým dusíkem na laterální straně těla poblíţ postranní čáry (pro 2n tečkou, pro 3n čárkou), která byla později ověřena v laboratorních podmínkách průtokovou cytometrií FLAJŠHANS et al. (2004), VINDELOV & CHRISTENSEN (1990). Poţadovaný vzorek z kaţdé sezóny obsahoval 40 ryb, v rovnoměrném rozloţení přibliţně 20 triploidních (10 samců a 10 samic) a 20 diploidních (10 samců a 10 samic). Hned na místě a bezprostředně po odlovu byla u kaţdého jedince odebrána krev (z důvodu výskytu co nejmenších změn v krevním obraze v důsledku stresu) punkcí ocasní ţíly (vena caudalis). Krev byla odebrána do heparinizovaných zkumavek a uchována při nízkých teplotách pro další zpracování (stanovení hemoglobinu, glukózy, počtu erytrocytů atd.) SVOBODOVÁ et al. (1986). Dále byl také odebrán povrchový sliz (mukus) kvůli stanovení lysozymu
pro pozdější imunologické studie.
Lysozym je enzym mající působení proti virům, parazitům a hlavně proti bakteriím a to díky svým bakteriolytickým vlastnostem TOMAN et al. (2000). Zpracování lysozymu a další imunologické parametry se analyzovaly na Ústavu experimentální biologie PřF Masarykovi Univerzity v Brně. Kaţdá ryba byla opatřena čipem (125 kHz TX1400L; Destron, USA) do svaloviny poblíţ prvního paprsku hřbetní ploutve (pinna dorsalis) kvůli snadnější identifikaci jednotlivých jedinců při pitvě. Líni byly přepravováni do laboratoře v barelech s původní vodou a poté vypuštěni do kádi s provzdušňovanou vodou a zpracováni do 24 hodin tak, aby došlo k co nejmenším kvantitativním a kvalitativním změnám ve sloţení jejich mnohobuněčné parazitofauny. V laboratorních podmínkách byly ryby usmrceny omráčením a následným přerušením páteře v dorzální oblasti za hlavou. Po usmrcení byly zaznamenány veškeré údaje do pitevního protokolu a to metrické parametry: TL (total lenght), SL (standart lenght) coţ je total lenght bez ocasní ploutve (pinna caudalis), hmotnost jedince, hmotnost bez vnitřních orgánů, dále hmotnosti sleziny, jater a gonád. Hmotnosti jater, sleziny a gonád byly poté pouţity pro výpočty biologických indexů: slouţících k určení relativního zastoupení těchto orgánů v hmotnosti jedince a tím jeho somatické kondice:
33
Hepato-somatický index: HSI = hmotnost jater (g) / celkové hmotnosti těla (g) x 100 Spleno-somatický index: SSI = hmotnost sleziny (g) / celkové hmotnosti těla (g) x 100 Gonado-somatický index: GSI = hmotnost gonád (g) / celkové hmotnosti těla (g) x 100 Velikost sleziny je důleţitá, a to z toho důvodu, ţe je brána jako imunologický parametr, který pravděpodobně hraje roli v imunitní odpovědi na působení parazitů MORAND & POULIN (2000). Spleno-somatický index je také vyuţíván jako imunokompetenční parametr v imunologických studiích TASKINEN & KORTET (2002), OTTOVÁ et al. (2005). Dále byl z metrických parametrů vypočten Fultonův kondiční faktor, který nám udává výţivný stav ryby na základě hmotnosti a délky jedince BOLGER & CONNOLLY (1989). Pro výpočet kondičního faktoru je vyuţívána rovnice: FK = hmotnost těla (g) x 100/ (délka těla (cm))³ Do protokolu bylo také zaznamenáno pohlaví, úroveň ploidie, číslo čipu, které slouţilo pro ověření identity. Následně byla provedena parazitologická pitva podle metodiky pospané v publikaci ERGENS & LOM (1970). Pro lokalizaci ektoparazitů byly odpreparovány skřele, ploutve a jednotlivé ţaberní oblouky, u kterých byla zaznamenána i jejich přesná lokalizace – pro pravou stranu těla P1 aţ P4, pro levou L1 – L4 a dány do Petriho misek s vodou. Vyjmuté vnitřní orgány byly dány do Petriho misky s fyziologickým roztokem (0,65 % NaCl). Vnitřní orgány byly prohlédnuty kvůli endoparazitům pomocí kompresorické (tlakové) metody. Nalezení mnohobuněční parazité byli fixováni ihned po izolaci dle své příslušnosti k taxonomickým skupinám: Monogenea – fixace tlakem směsí glycerinamoniumpikrátu (GAP) v poměru 1:1 ERGENS & LOM (1970) Cestoda – fixace za mírného tlaku ve 4% formaldehydu nebo pro případ pozdějšího zpracování pro molekulární analýzy v 90% ethylalkoholu, jako následné barvící činidlo byl pouţit IAC (ţelezitý acetokarmín) ERGENS & LOM (1970) 34
Trematoda – shodný postup jako u Cestoda Nematoda – fixace horkou směsí 70% ethylalkoholu a glycerínu (poměr 9: 1), prosvětlování v glycerínu cca 15 minut před samotnou determinací MORAVEC (1994) Crustacea – fixace a uchovávání ve 4 % formaldehydu Mollusca – shodný postup jako u Crustacea V našem vzorku byli pozorování také jednobuněční parazité, ale v důsledku zaměření naší studie na mnohobuněčné parazity a také obtíţné kvantifikaci jednotlivých druhů nebyli fixování a dále determinováni. K vlastní determinaci nafixovaných mnohobuněčných parazitů byl pouţit světelný mikroskop Olympus BX 50 s fázovým kontrastem, diferenciačním interferenčním kontrastem dle Nomarského a počítačová analýza obrazu (Micro Image 4.0 for Windows). K determinaci nalezených druhů byla pouţita literatura: ERGENS & LOM (1970), SCHOLZ (1989), GUSEV (1985), MORAVEC (1994), BAUER (1987).
35
3. 4. Základní epidemiologické charakteristiky BUSH et al. (1997) a MARGOLIS et al. (1982) charakterizovali základní epidemiologické charakteristiky u parazitů. Dle těchto autorů tedy byly hodnoceny a počítány i 4 epidemiologické charakteristiky pro účely našeho výzkumu, a to prevalence, abundance, intenzita infekce a průměrná intenzita infekce. Prevalence: počet hostitelů infikovaných 1 nebo více jedinci konkrétního druhu parazita dělená počtem zkoumaných hostitelů. K vyjádření procentuálního zastoupení parazita je výsledná hodnota násobena stem Je to jedna s nejrozšířenějších popisných metod BUSH et al. 1997. ESCH & FERNANDÉZ (1993) rozdělili parazity do tří skupin dle nabývajících hodnot prevalence: 1) Dominantní druhy – pokud je prevalence vyšší neţ 40% 2) Střední skupina – prevalence je v rozmezí 10 – 40% 3) Satelitní druhy – procentuální hodnota prevalence je niţší neţ 10% Intenzita infekce: počet jedinců určitého parazitického druhu na jednom infikovaném hostiteli, tedy počet jedinců v infrapopulaci BUSH et al. 1997. Průměrná intenzita infekce: vyjadřuje průměrný počet parazitů jednoho druhu přepočítaný na počet napadených hostitelů tímto druhem MARGOLIS et al. (1982). Abundance je ekologický koncept odkazující na relativní zastoupení určitého druhu v určitém ekosystému. Obvykle se tedy vyjadřuje jak velký počet jednotlivců lze nalézt na studovaný ekosystém. Pokud se to týká parasitismu, tak vyjadřuje kolik jedinců parazitů lze najít na zkoumaných hostitelích BUSH et al. (1997).
36
3. 5. Statistické hodnocení dat Data byla zadána do tabulek v Microsoft Office Excel 2003 (zde byly také provedeny jednoduché početní úkony - prevalence). Data analyzovány v programu Statistika 9.1 CZ. Vzhledem k vysokým odlehlým hodnotám a nerovnoměrnému rozloţení byla data pro hodnocení jednotlivých druhů parazitů či jejich celkového počtu upravena zlogaritmováním log (x+1) GUÉGAN & MORAND (1996). I po zlogaritmování ovšem zůstalo rozloţení nerovnoměrné v důsledku častého výskytu nul v datovém souboru. Pro námi získaná data bylo pouţito negativní binomiální rozloţení (data jsou agregovaná neboli shluková), protoţe data mají větší rozptyl neţ průměr, coţ se označuje jako overdispersion. Pro hodnocení metrických, fyziologických a imunologických parametrů byl pouţit parametrický T-test pro nezávislé vzorky, z důvodů normálního rozloţení těchto dat. Pro sloţení parazitofauny byly pouţity neparametrické testy. U kontinuálních proměnných byla pouţita Spearmanova korelace (Spearman rank correlation coefficient). Pro ostatní data byly pouţity v důsledku negativního binomiálního rozloţení neparametrický test: Mann-Whitney U test (téţ Wilcoxon rank sum test).
37
4. VÝSLEDKY 4. 1. Vliv pohlaví a ploidie na měřené parametry lína Všechny měřené somatické, fyziologické a imunologické parametry. Průměrné hodnoty jednotlivých parametrů pro sledované skupiny (2n a 3n populace, samci a samice) jsou uvedeny v tabulce (tab. 9). Celková délka těla (TL) a hmotnost jedince (W) byly jak u samců, tak i u samic vyšší ve prospěch triploidních populací. Pohlaví i ploidie signifikantně ovlivnili velikost i hmotnost ryb (tab. a ). U hepato-somatického indexu (HSI) jsou hodnoty vyšší opět ve prospěch 3n línů, gonado-somatický index (GSI) nabývá naopak vyšší hodnoty pro 2n líny. U spleno-somatického indexu (SSI) jsou hodnoty pro obě ploidní úrovně téměř shodné. Celkový počet leukocytů (LEU suma), hemoglobinu (HB g l-1) a erytrocytů (Ery v T l-1) je výrazně vyšší u diploidů. U glukózy (Glc (mmol/l)) bylo moţné zaznamenat vyšší hodnoty u triploidních jedinců oproti diploidním. U lysozymu (LSM) jsou výsledky rozporuplné, zatímco u samců jsou hodnoty vyšší pro 2n populaci, u samic naopak pro 3n populaci. Tab. 9. Průměrné hodnoty (včetně směrodatné odchylky) měřených metrických, fyziologických a imunologických parametrů u diploidních samců, diploidních samic, triploidních samců a triploidních samic Samec Parametr TL (mm) W (g) Fulton KF HSI GSI SSI LEU suma LSM Ery v T l-1 HB g l-1 Glc (mmol/l)
2n 222,23 ± 19,78 151,13 ± 47,87 1336,42 ± 94,12 2,05 ± 0,54 0,53 ± 0,3 0,326 ± 0,11 72,46 ± 47,14 0,225 ± 0,4 1,79 ± 0,34 96,47 ± 12,03 7,59 ± 2,76
Samice
3n 231,58 ± 22,57 164,19 ± 56,6 1282,27 ± 90,84 2,23 ± 0,64 0,44 ± 0,34 0,34 ± 0,1 54,85 ± 27,45 0,07 ± 0,15 1,1 ± 0,18 76,54 ± 15,58 8,15 ± 3,22
38
2n 245 ± 19,93 203,41 ± 56,72 1355 ± 124,89 2,38 ± 0,7 5,62 ± 5,07 0,37 ± 0,15 100,65 ± 68,83 0,11 ± 0,18 1,72 ± 0,28 90 ± 15,39 7,55 ± 2,63
3n 266,69 ± 22,47 248,17 ± 63,96 1280,36 ± 71,02 2,49 ± 0,78 2,48 ± 2,46 0,38 ± 0,11 75,17 ± 47,16 0,22 ± 0,48 1,11 ± 0,25 76,69 ± 14,54 7,97 ± 3,69
Výsledný vliv pohlaví a ploidie byl zjištěn na všechny měřené parametry (TL i W) a byl statisticky významný (tab. 10 a 11). Tab. 10. Vliv ploidie na parametry TL a W u línů, pouţit T-test pro nezávislé vzorky Proměnná
t-value
df
P
TL
3,366
158
< 0,001
W
2,359
158
< 0,05
Tab. 11. Vliv pohlaví na parametry TL a W u línů, pouţit T-test pro nezávislé vzorky Proměnná
t-value
df
P
TL
7,747
158
< 0,001
W
7,114
158
< 0,001
Vliv ploidie na hodnotu GSI jsme ještě rozdělili jen pro samce a samice (graf. 1 a 2). Podle výsledků byl u ploidie prokázán statisticky významný vliv na GSI u samic (U=256, Z=492, p < 0,001), avšak u samců jiţ tento vliv nebyl potvrzen (U=689, Z=-1,55, p = 0,12).
Graf. 1. Vliv plodní úrovně na GSI u samic. 39
Graf. 2. Vliv plodní úrovně na GSI u samců. Dále byl testován vliv pohlaví a ploidie na vybrané fyziologické a imunologické parametry (Fulton KF, SSI, HSI, LSM, Ery, HB, LEU a Glc). Vliv ploidie byl statisticky významný pro Fulton KF, Ery, HB a LEU, kdy byly vyšší hodnotynaměřené vţdy u diploidních jedinců (tab.). Vliv pohlaví byl pozorován pouze na parametry SSI, HSI a LEU (tab. 12 a 13). Tab. 12. Vliv ploidie na vybrané koeficienty, indexy a krevní parametry u lína Proměnná
t-value
df
p
Fulton KF
-4,131
158
< 0,001
SSI
1,222
158
0,525
HSI
1,222
157
0,224
Ery v T l-1
-14,754
152
< 0,001
HB g l-1
-7,087
156
< 0,001
LEU suma
-2,14
158
< 0,01
Glc (mmol/l)
0,73
158
0,46
40
Tab. 13. Vliv pohlaví na vybrané koeficienty, indexy a krevní parametry u lína Proměnná
t-value
df
p
Fulton KF
0,715
158
0,475
SSI
2,727
158
< 0,05
HSI
2,727
157
< 0,01
Ery v T l-1
-0,067
152
0,946
HB g l-1
-0,951
156
0,343
LEU suma
2,121
158
< 0,05
Glc (mmol/l)
-0,42
158
0,67
Srovnání parametrů (Fulton KF, W jater, HSI, SSI, GLC a leukocyty) mezi odlovem prosinec 2008 a březen 2009 (tedy po zimování) vyšlo statisticky významně pro všechny parametry (T-test). Vyšší hodnoty byly tedy naměřeny vţdy v zimě, výjimku tvoří pouze leukocyty, kdy byly vyšší hodnoty zjištěny na jaře (tab. 14). Rozdíl mezi těmito sezónami se testoval i na lysozym (M-U test U=131, Z= -6,43264, p < 0,001), kdy vyšly signifikantně vyšší hodnoty pro březen 2009.
Tab. 14. Porovnání vybraných parametrů mezi sezónami prosinec 2008 a březen 2009 Parametr
t-value
df
p
Fulton KF
2,33
78
< 0,05
W játra
2,83
78
< 0,01
HSI
7,46
78
< 0,001
SSI
2,48
78
< 0,05
GLC
6,9
78
< 0,001
-8,44
78
< 0,001
Leukocyty
41
4. 2. Výskyt parazitů a jejich epidemiologické charakteristiky Celkově bylo ze 4 odlovů (září 2008, prosinec 2008, březen 2009 a červen 2009) nasbíráno a determinováno 12230 mnohobuněčných parazitů patřících do 8 taxonomických skupin: Trematoda (Asymphylodora tincae, Tylodelphys clavata larv., Diplostomum spathaceum larv.), Cestoda (Valipora campylancristrota larv., Archigetes sieboldi, Neogryporhynchus cheilancristrotus larv., Caryophyllaeus sp.), Monogenea (Gyrodactylus tincae), Bivalvia (Anodonta sp. larv.), Nematoda (Nematoda sp.), Branchiura (Argulus foliaceus), Copepoda (Ergasilus sieboldi) a Acariformes (Hydrozetes sp.). Parazity, kteří nejsou zařazení do druhu, nebylo moţno přesně determinovat, nicméně dále je s nimi počítáno jako se samostatnými druhy. V tabulce (tab. 15) jsou uvedeny prevalence pro všechny vyskytující se druhy cizopasníků ve všech sezónách bez ohledu na pohlaví a plodní úroveň hostitele. Červeně jsou zvýrazněny pouze 3 druhy vyskytující se ve všech odlovech (A. tincae, V. campylancristrota a G. tincae). Druhy jako (D. spathaceum, N. cheilancristrotus, E. sieboldi, Hydrozetes sp., A. foliaceus, Anodonta sp. a Nematoda sp.) se vyskytovali sporadicky pouze na jednom či několika málo hostitelích. U druhů T. clavata, Caryophyllaeus sp., A. sieboldi byl výskyt zaznamenán ve dvou sezónách ze čtyř, ale jejich celková abundance byla opět velmi nízká a prevalence rovněţ, a proto nebyly zahrnuty do dalších statistických analýz. Naše pozornost byla tedy zaměřena na významné sledované druhy. U G. tincae dosahovala prevalence nejvyšších hodnoty v zimním období (95%), pak pozvolna klesala (graf. 3). A. tincae měla výrazně nejvyšší prevalenci v červnu (72,5%) (graf. 4). U druhu V. campylancristrota byly prevalence podobné pro všechny sezóny a pohybovaly se od 12 do 35% (graf. 5).
42
Tab. 15. Sezónní prevalence (%) všech druhů parazitů nalezených na línu obecném taxon A. tincae D. spathaceum T. clavata V. campylancristrota A. sieboldi Caryophyllaeus sp. N. cheilancristrotus G. tincae Anodonta sp. Nematoda A. foliaceus E. sieboldi Hydrozetes sp. Endoparaziti Ektoparaziti
září 17,5 0 2,5 20 0 5 0 5 0 0 0 0 0 37,5 5
prosinec 30 0 0 15 0 0 0 95 0 0 0 0 0 40 95
březen 20 0 0 12,5 7,5 2,5 2,5 87,5 2,5 0 0 7,5 7,5 37,5 87,5
87,5
100 90
95
80 70
45
60 50 40 30 20
5
10 0 Září
Prosinec
Březen
Červen
Graf. 3. Sezónní prevalence (%) Gyrodactylus tincae
43
červen 72,5 5 5 35 2,5 0 0 45 0 2,5 30 0 0 87,5 60
100 90
72,5
80 70 60 50 40 30
30 20
17,5
20 10 0 Září
Prosinec
Březen
Červen
Graf. 4. Sezónní prevalence (%) Asymphylodora tincae
100 90 80 70 60
35
50 40 30
20
15
12,5
20 10 0 Září
Prosinec
Březen
Červen
Graf. 5. Sezónní prevalence (%) Valipora campylancristrota V grafech je znázorněna abundance (absolutní) nalezených cizopasníků ve všech odlovech pro tři jiţ zmíněné druhy. Jako ostatní byly zahrnuty všechny zbývající nalezené druhy. V sezóně září 2008 bylo zaznamenán celkem 370 parazitů, jednalo se o tyto druhy: A. tincae, G. tincae, V. campylancristrota, T. clavata a Caryophyllaeus sp. (graf. 6). Výskyt posledně dvou jmenovaných byl sporadický a v počtu 4 jedinců u T. clavata a 2 jedinců Caryophyllaeus sp. V prosinci 2008 bylo zaznamenáno 568 mnohobuněčných parazitů patřících pouze do tří druhů: A. tincae, G. tincae, V. campylancristrota. U G. tincae oproti září výrazně vzrostl počet jedinců (graf. 7). V jarní sezóně, tedy v březnu 2009 bylo nalezeno celkem 752 parazitů patřící do 9 druhů: A. tincae, V. campylancristrota, G. tincae a ostatní 44
druhy (A. sieboldi, Caryophyllaeus sp., N. cheilancristrotus, Anodonta sp., E. sieboldi a Hydrozetes sp.) (graf. 8). Nejvíce parazitů bylo nalezeno v poslední sezóně, červnu 2009, a to celkem 10540 jedinců. Opět zde byly zastoupeny A. tincae, V. campylancristrota, G. tincae. Jako ostatní druhy byly nalezeny: T. clavata, D. spathaceum, A. sieboldi, Nematoda sp. a A. foliaceus (graf. 9). Z výsledků vyplívá, ţe největší diverzita parazitofauny byla zjištěna v březnu 2009 o počtu 9 druhů. A. tincae byla zastoupena nejvíce v posledním odlovu v počtu 10454 jedinců. Nejvyšší abundance u G. tincae byly pozorovány v zimní, respektive jarní sezóně (prosinec 2008, březen 2009) v téměř shodném zastoupení 358, respektive 353 jedinců. Celkové abundance a výskyt u posledního námi sledovaného druhu - V. campylancristrota – byly pozorovány celkově niţší, bez výrazných preferencí pro jakoukoli sezónu.
A. tincae n=346 V. campylancristrota n=16 G. tincae n=2 Ostatní n=6
Graf. 6. Celková abundance nalezených parazitů: pro sezónu září 2008.
45
A. tincae n=192 V. campylancristrota n=18 G. tincae n=358 Ostatní n=0
Graf. 7. Celková abundance nalezených parazitů pro sezónu prosinec 2008
A. tincae n=337 V. campylancristrota n=5 G. tincae n=353 Ostatní n=57
Graf. 8. Celková abundance nalezených parazitů pro sezónu březen 2009
46
A. tincae n=10454 V. campylancristrota n=34 G. tincae n=25 Ostatní n=27
Graf. 9. Celková abundance nalezených parazitů pro sezónu červen 2009
47
4. 3. Vliv pohlaví a ploidie na výskyt parazitofauny Zastoupení parazitů dle výskytu u samců nebo samic a dle výskytu u 2n a 3n populací lína je znázorněno v tabulce (tab. 16). Červenou barvou zde byly znázorněny druhy vyskytující se pouze u diploidních, triploidních línů a samců nebo samic. U samců bylo nalezeno celkem 9 druhů cizopasníků, ale pouze jeden parazit (Diplostomum spathaceum larv.) byl zjištěn jen pro samce. U samic byla diverzita celkově vyšší a bylo nalezeno 12 druhů, ze kterých byly 4 druhy (Archigetes sieboldi, Neogryporhynchus cheilancristrotus larv., Anodonta sp. larv. a Nematoda) nalezeny pouze u této skupiny. U diploidních línů bylo nalezeno a zařazeno celkem 11 druhů oproti 8 druhům u triploidů. Druhy vyskytující se výhradně u diploidních populací jsou larvální stádia endoparazitů Diplostomum spathaceum, Tylodelphis clavata a Neogryporhynchus cheilancristrotus. Dále zde byl ještě pozorován jeden zástupce Anodonta sp. a jeden zástupce Nematoda sp. Výhradně u triploidních populací byli pozorováni tito ektoparazité: Ergasilus sieboldi a Hydrozetes sp. Výše uvedené výsledky naznačují preference endoparazitů pro diploidní populace a naopak preference ektoparazitů pro populace triploidní.
48
Tab. 16 Přehled nalezených druhů parazitů vyskytující se u samců nebo samic, diploidních nebo triploidních populacích. Výskyt je značen +, absence Taxon
Druh
2n
3n
Samec
Samice
Trematoda
Asymphylodora tincae
+
+
+
+
Tylodelphys clavata larv.
+
-
+
+
Diplostomum
spathaceum
+
-
+
-
Valipora campylancristrota
+
+
+
+
Archigetes sieboldi
+
+
-
+
Neogryporhynchus
+
-
-
+
Caryophyllaeus sp.
+
+
+
+
Monogenea
Gyrodactylus tincae
+
+
+
+
Bivalvia
Anodonta sp. larv.
+
-
-
+
Nematoda
Nematoda sp.
+
-
-
+
Branchiura
Argulus foliaceus
+
+
+
+
Copepoda
Ergasilus sieboldi
-
+
+
+
Acariformes
Hydrozetes sp.
-
+
+
+
larv. Cestoda
larv.
cheilancristrotus larv.
Pro další hodnocení byly pouţiti jen výše zmíněné druhy (A. tincae, V. campylancristrota a G. tincae). Ostatní druhy byly vynechány z důvodu nepravidelného výskytu a nízkého počtu zaznamenaných jedinců. V září 2008 (graf. 10) je moţné pozorovat preferenci Asymphylodora tincae pro diploidní populaci bez vlivu pohlaví. Tento poměr je modelován z počtu n = 346 jedinců. Naopak u V. campylancristrota je tato preference pro triploidní populaci, opět bez vlivu pohlaví (n = 16). Gyrodactylus tincae se vyskytoval pouze u samic triploidních línů, nicméně tento údaj je značně zkreslen v důsledku nalezení pouze 2 jedinců. V prosinci 2008 (graf. 11) byly nalezeny pouze tři výše zmíněné druhy. U V. campylancristrota je opět vidět jasná preference pro 3n populace lína bez rozdílu pohlaví, A. tincae preferuje diploidní populace. Pokud tedy shrneme poznatky, které potvrzují i grafy (graf. 12 a 13), tak celkově A. tincae bez výrazného vlivu pohlaví preferuje 2n, naopak V. campylancristrota preferuje 3n. U G. tincae nejsou ţádné výraznější preference zaznamenány. 49
100% 80% 60%
3n 2n
40% 20% 0% Samec
Samice
A. tincae
Samec
Samice
G. Tincae
Samec
Samice
V. campylancristrota
Graf. 10. Poměrové zastoupení vybraných druhů cizopasníků u samců a samic mezi diploidními a triploidními populacemi v sezóně září 2008
100% 80% 60%
3n 2n
40% 20% 0% Samec
Samice
A. tincae
Samec
Samice
G. Tincae
Samec
Samice
V. campylancristrota
Graf. 11. Poměrové zastoupení vybraných druhů cizopasníků u samců a samic mezi diploidními a triploidními populacemi v sezóně prosinec 2008
50
100% 90% 80% 70% 60%
3n 2n
50% 40% 30% 20% 10% 0% Samec
Samice
A. tincae
Samec
Samice
G. Tincae
Samec
Samice
V. campylancristrota
Graf. 12. Poměrové zastoupení vybraných druhů cizopasníků u samců a samic mezi diploidními a triploidními populacemi v sezóně březen 2009
100% 80% 60%
3n 2n
40% 20% 0% Samec
Samice
A. tincae
Samec
Samice
G. Tincae
Samec
Samice
V. campylancristrota
Graf. 13. Poměrové zastoupení vybraných druhů cizopasníků u samců a samic mezi diploidními a triploidními populacemi v sezóně červen 2009
51
Následující tabulky jiţ zohledňují pohlaví a ploidii na výskyt parazitů. Kaţdá tabulka obsahuje pro konkrétní sezónu vţdy počet parazitů, prevalenci a minimální a maximální infekci daného druhu parazita. V tabulkách (tab. 17) a (tab. 18) jsou popsány výše uvedené hodnoty pro triploidní a diploidní populaci lína. Prevalence u G. tincae ve všech sezónách se od sebe nijak výrazně nelišili a nejvyšších hodnot dosahovaly v druhém a třetím odlovu. A. tincae má výrazně vyšší hodnotu prevalence ve všech sezónách u diploidů, kdeţto V. campylancristrota má tyto hodnoty vyšší pro všechny sezóny u 3n populací.
Tab. 17 Hodnoty prevalence (P%), počtu jedinců parazitů (N) a intenzita infekce (minimální – maximální) u triploidů pro jednotlivé sezóny 3n Taxon A. tincae
Září (n=22) N P% II 16 4,54 16
Prosinec (n=20) Březen (n=18) N P II N P II 67 25 52 5,55 2 28 0 0 0 0 0 0 0 0 4,54 4 0 0 0 0 0 0 31,8 1-5 18 30 1-8 4 22,2 1
D. spathaceum T. clavata V. campylancristrota A. sieboldi
0 4 15 0
0
0
0
0
0
17
11,1
Caryophyllaeus sp. N. cheilancristrotus G. tincae
1
4,54
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
9,1
1
156
100
Anodonta sp. Nematoda A. foliaceus E. sieboldi Hydrozetes sp.
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
135 0 0 0 0 0
52
Červen (n=19) N P II 2275 68,4 2440 0 0 0 0 0 0 29 57,9 1-5 3
5,26
3
0
710 0
0
0
0
0
0
0
0
0
172 88,9
155 0 0 0 0 0 0 16,6 1-2 16,6 1-5
13
47,4 1-3
0 0 0 4 11
0 0 12 0 0
0 0 0 0 42,1 1-3 0 0 0 0
Tab. 18 Hodnoty prevalence (P%), počtu jedinců parazitů (N) a intenzita infekce (minimální – maximální) u diploidů pro jednotlivé sezóny 2n Taxon A. tincae D. spathaceum T. clavata V. campylancristrota A. sieboldi Caryophyllaeus sp. N. cheilancristrotus G. tincae Anodonta sp. Nematoda A. foliaceus E. sieboldi Hydrozetes sp.
Září (n=18) N P% II 330 33,3 1120 0 0 0 0 0 0 1 5,55 1
Prosinec(n=20) N P II 125 35 161 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Březen (n=22) N P II 335 40,9 1151 0 0 0 0 0 0 1 4,54 1
Červen (n=21) N P II 8179 90,5 71744 4 9,5 1-3 3 9,5 1-2 5 19 1-2
0 1
0 0 5,55 1
0 0
0 0
0 0
22 1
4,54 22 4,54 1
0 0
0 0
0 0
0
0
0
0
0
0
1
4,54 1
0
0
0
0
0
0
202
95
42,9 1-2
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
181 86,4 143 1 4,54 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12
0 0 0 0 0
146 0 0 0 0 0
0 1 4 0 0
0 4,8 19 0 0
0 1 1 0 0
Preference mezi pohlavími (Tab. 19 a 20) u zmiňovaných druhů je následovná: G. tincae nejeví ţádne preference, V. campylancristrota také ne. Jedině A. tincae preferuje v září, prosinci a březnu samice, ovšem v období s největší prevalencí a absolutní abundancí jiţ není ţádná preference patrná.
53
Tab. 19 Hodnoty prevalence (P%), počtu jedinců parazitů (N) a intenzita infekce (minimální – maximální) u samců pro jednotlivé sezóny Samci Taxon A. tincae D. spathaceum T. clavata V. campylancristrota A. sieboldi Caryophyllaeus sp. N. cheilancristrotus G. tincae Anodonta sp. Nematoda A. foliaceus E. sieboldi Hydrozetes sp.
Září (n = 19) N P% II 182 10,5 9092 0 0 0 4 5,3 4 5 15,8 1-3 0 1
0 5,3
0 1
Prosinec (n=23 ) N P II 95 21,7 461 0 0 0 0 0 0 8 17,4 14 0 0 0 0 0 0
0
0
0
0
0
0
0
0
183
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
91,3 135 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0
Březen (n=20) N P II 231 15 6151 0 0 0 0 0 0 2 10 1
Červen (n=21 ) N P II 3851 81 7645 4 9,5 1-3 2 4,76 2 20 38,1 1-5
0 1
0 5
0 1
0 0
0 0
0 0
0
0
0
0
0
0
67
85
11
47,6 1-2
0 0 0 2 10
0 0 0 10 10
117 0 0 0 1 5
0 0 10 0 0
0 0 33,3 0 0
0 0 1-3 0 0
Tab. 20 Hodnoty prevalence (P%), počtu jedinců parazitů (N) a intenzita infekce (minimální – maximální) u samic pro jednotlivé sezóny Samice Taxon A. tincae
Září (n=21) N P% II 164 23,8 1120 0 0 0 0 0 0 11 23,8 1-5
D. spathaceum T. clavata V. campylancristrota 0 A. sieboldi
0
Prosinec (n=17) N P II 97 41,2 128 0 0 0 0 0 0 10 11,8 2-8
Březen (n=20) N P II 106 35 161 0 0 0 0 0 0 3 15 1
Červen (n=19) N P II 6603 78,9 21744 0 0 0 1 5,26 1 14 36,8 1-5
0
0
0
0
39
15
3
5,26 3
0
0
0 0
Caryophyllaeus sp. N. cheilancristrotus G. tincae
1
4,76 1
0
0
0
0
0
722 0
0
0
0
0
0
1
5
1
0
0
2
9,52 1
175
100
286 90
42,1 1-3
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
155 1 0 2 0 1
14
Anodonta sp. Nematoda A. foliaceus E. sieboldi Hydrozetes sp.
146 0 0 0 0 0
0 1 6 0 0
0 5,26 26,3 0 0
0
0 0 0 0 0
54
1 0 2 0 1
5 0 5 0 5
0 1 1-2 0 0
Vliv ploidie a pohlaví byl testován na počet parazitů, druhů, endoparazitů, ektoparazitů, Asymphylodora tincae, Gyrodactylus tincae a Valipora campylancristrota. Dále nás zajímal tento vliv na celkový počet parazitů, druhovou početnost a rozlišení parazitů dle lokalizace působení, tedy na endo a ektoparazity. Stupeň ploidie (2n vs. 3n) neměl vliv na počet endoparazitů, počet ektoparazitů a počet druhů . U počtu parazitů nebyl vliv ploidie statisticky významně potvrzen, nicméně úroveň testu p = 0,068 se velmi blíţí hladině významnosti p < 0,05 (tab. 21 a graf. 14). Úroveň ploidie neměla také ţádný vliv na výskyt G. tincae (tab. 21 a graf. 15). Naopak vliv byl prokázán na početnost A. tincae (Tab. 21 a graf. 16) preferující diploidní populace a V. campylancristrota preferující naopak populace triploidní. U obou parazitů byl test statisticky významný na úrovni p < 0,01 (Tab. 21 a graf. 17). Tab. 21. Vliv ploidie na výskyt jednotlivých skupin parazitů. Pouţit Mann-Whitney test Proměnná
U
Z
P
N parazitů
2663,5
-1,828
0,068
N druhů
3179,5
0,067
0,947
N endoparazitů
2729,5
-1,602
0,109
N ektoparazitů
3037,5
0,551
0,582
2351
-2,894
< 0,01
2269,5
3,17
< 0,01
3175
0,082
0,935
N A. tincae N V. campylancristrota N G. tincae
55
Graf. 14. Vliv ploidie na počet parazitů
Graf. 17. Vliv ploidie na počet V. campylancristrota
56
Graf. 16. Vliv ploidie na počet A. tincae
Graf. 15. Vliv ploidie na počet G. tincae
57
Dále nás zajímal vliv pohlaví na výše zmíněné parametry. Vliv pohlaví na počtu parazitů nebyl prokázán (Tab. 22).
Tab. 22. Vliv pohlaví na výskyt jednotlivých skupin parazitů. Pouţit Mann-Whitney test Proměnná
U
Z
p
N parazitů
2919,5
0,941
0,347
N druhů
2888,5
1,047
0,295
N endoparazitů
2859,5
1,146
0,252
N ektoparazitů
3022
0,591
0,555
N A. tincae
2901,5
1,002
0,316
N G. tincae
2991
0,697
0,486
N V. campylancristrota
3148
0,161
0,872
58
4. 5. Vliv somatických, fyziologických a imunologických parametrů na parazitofaunu Dále byl testován vliv somatických, fyziologických a imunologických parametrů na parazitofaunu lína obecného. Ovšem korelační koeficient nebyl signifikantní při p < 0,05, tedy nepřekročil úroveň 0,5 pro ţádný z uvedených parametrů (tab. 23). Tab. 23. Korelační koeficienty vlivu somatických, fyziologických a imunologických parametrů na výskyt parazitů Parametr
N para
N druh
N endo
N ekto
N Asym
N Gyro
N Valipo
TL
0,208
0,276
0,19
0,154
0,122
0,136
0,301
W
0,21
0,272
0,217
0,125
0,149
0,105
0,273
Fulton
0,056
0,023
0,192
-0,143
0,184
-0,152
-0,067
SSI
0,026
0,054
-0,009
0,094
0,048
0,078
0,002
GSI
0,354
0,303
0,335
0,133
0,35
0,127
0,074
HSI
-0,255
-0,093
-0,369
0,311
-0,381
0,363
-0,06
GLC
-0,257
-0,231
-0,315
0,114
-0,333
0,159
-0,012
LSM
-0,268
-0,153
-0,125
-0,254
-0,145
-0,24
0,004
ERY
0,085
0,002
0,128
-0,098
0,254
-0,073
-0,233
LEU
0,074
-0,004
0,206
-0,336
0,246
-0,364
-0,003
HB
-0,116
-0,119
0,016
-0,213
0,048
-0,173
-0,042
59
5. DISKUZE 5. 1. Vliv ploidie, pohlaví a sezónnosti na zaznamenané parametry u lína Hlavními cíly této práce bylo porovnat metrické, fyziologické a imunologické parametry u lína s různou úrovní ploidie. Dále zjistit vliv pohlaví na výskyt mnohobuněčné parazitofauny, její sezónní dynamiku a preference této parazitofauny pro 2n nebo 3n populace lína. Nejvýznamnějším faktorem na tyto parametry byl vliv plodní úrovně. BENFEY (1999) všeobecně předpokládá vyšší růstové přírůstky pro 3n ryby. V naší studii jsou pro triploidní populace významně vyšší hodnoty parametrů TL a W. Tento výsledek je ovlivněn redukcí vývoje gonád a sterilitou u triploidních populací v období pohlavního dospívání a tudíţ menší investicí energie do reprodukce a s tím související vyšší investice do somatického růstu BUCHTOVÁ et al. (2003a), BUCHTOVÁ et al. (2003b). Námi studovaní líni byli ve věku T 3 a T 3+, coţ je dle BARUŠ & OLIVA (1995) věk dosahování pohlavní dospělosti u línů. Naopak Fultonův kondiční faktor vyšel výrazně lepé pro diploidní populace. Jelikoţ vychází ze závislosti hmotnosti ryby na délce jejího těla, tak nabývá niţších hodnot u triploidních jedinců, protoţe mají vyšší obsah tuku ve tkáních HAFFRAY et al. (2007) a niţší obsah vody a naopak vyšší obsah tuku ve svalovině LINCOLN (1987). I fyziologické parametry jako erytrocyty a hemoglobin vyšly významně ve prospěch diploidních populací oproti triploidním. Tento jev je dán zvýšením obsahu DNA v erytrocytech během polyploidizace. Objem erytrocytů sice vzroste, ale tím se sníţí jejich počet TIWARY et al. (2004), PIAČKOVÁ & FLAJŠHANS (2006). Posledním parametrem vykazujícím významný rozdíl mezi 2n a 3n populacemi je imunologický parametr (leukocyty). I v tomto případě je vyšší hodnota u diploidních línů, coţ můţe souviset s vysokou prevalencí a abundancí endoparazitů (viz níţe). Na tyto měřené metrické, fyziologické a imunologické parametry nebyl testován vliv kaţdé sezóny (září 2008, prosinec 2008, březen 2009 a červen 2009) v důsledku zvyšujících se hodnot s přibývajícím věkem línů v kaţdém následujícím odlovu. Nicméně nás zajímaly rozdíly v hodnotách těchto parametrů: Fultonův kondiční faktor, hmotnost jater, hepatosomaticklý a spleno-somatický index, glukóza, lysozym a leukocyty mezi sezónami prosinec 2008 a březen 2009. Tento rozdíl nás zajímal především po zimování, tedy v sezóně březen 2009, kdy by tento rozdíl neměl být výrazný oproti prosinci 2008, v důsledku komorování
60
línů, kdy mají sníţenou aktivitu kvůli poklesu teploty vody a s tím spojeného sníţení příjmu potravy FLAJŠHANS (2008). U parametrů (Fulton KF, W játra, HSI, SSI a GLC) nám vyšly statisticky významně vyšší průměrné hodnoty v prosinci oproti březnu. Játra jsou zásobním orgánem rybího organismu a tedy se zde akumulují zásobní látky BENFEY (1999), z tohoto důvodu jsou hodnoty pro parametry w játra a HSI niţší v sezóně březen 2009 v důsledku odbourávání těchto látek při zimním nedostatku potravy. Tento aspekt se také výrazně projevil i ve Fultonově kondičním faktoru, kdy u ryb po komorování byla zjištěna statisticky významně niţší kondice. Autoři KORTET et al. (2003) se zabývali vlivem sezónnosti na hmotnost sleziny u plotice obecné (Rutilus rutilus). Pro jarní období (duben) zjistili vyšší hodnoty, kdeţto LAMKOVÁ (2006) v tomto měsíci zjistila nejniţší hodnoty u jelce tlouště (Leuciscus cephalus). V naší studii jsme se zaměřili jiţ na SSI a výsledek byl statisticky významně niţší právě v jarní sezóně (březen) oproti sezóně zimní. Příčin můţe být několik, opět jiţ zmiňované zimování, nebo také pouze měření v 1 roce. U počtu leukocytů nebyly LUSKOVÁ (1997) potvrzeny sezónní změny v tomto parametru, nicméně v naší studii vyšel významně vyšší počet v jarní sezóně (březen 2009) oproti zimě (prosinec 2008). Tento výsledek byl nejspíše ovlivněn vyšším počtem druhů parazitů v březnu (9) neţ v prosinci (3) a tudíţ bylo napadeno parazity více ryb. Dalším vliv, který nás zajímal na výše zmiňované parametry, byl vliv pohlaví. U TL a W jedince byl pozorován významný rozdíl ve velikosti ve prospěch samic. BARUŠ & OLIVA (1995) uvádí, ţe samice jsou větší a rostou rychleji neţ samci. Také indexy HSI a SSI vycházely ve prospěch samic, coţ opět souvisí nejspíše s jejich růstem a velikostí. U HSI také nejspíše s ukládáním zásobních látek pro pozdější potřebu energie pří dozrávání ovocytů. Pokud se týče počtu leukocytů, tak u samic byl vyšší neţ u samců, coţ potvrzuje i SVOBODOVÁ et al. (1986), s upřesněním, ţe je dále tento parametr ovlivněn ještě druhem ryby, jejím věkem, sezónností (viz. výše) a zdravotním stavem.
61
5. 2. Vliv ploidie, pohlaví a sezónnosti na parazitofaunu lína Jak jiţ bylo zmíněno ve výsledcích, celkově bylo nalezeno 12230 mnohobuněčných parazitů. Zajímal nás hlavně vliv ploidní úrovně, vliv pohlaví a také sezónnost na sloţení parazitofauny. Konkrétně na analýzu těchto parametrů (N parazitů, N druhů, N endoparazitů, N ektoparazitů, N Asymphylodora tincae, N Valipora campylancristrota a N Gyrodactylus tincae). Pokud jsme se zaměřili na vliv pohlaví na výše zmíněné parametry, tak jsme nepozorovali a nezaznamenali ţádný významný rozdíl mezi samicemi a samci v ţádném z výše uvedených parametrů. Pokud se ale zaměříme na výskyt všech druhů parazitů ve všech odlovech u lína obecného a zajímá nás buď prezence nebo absence, tak jsou vidět určité preference jak mezi pohlavím tak i mezi ploidií. Výskyt pouze u samic byl zaznamenán u Anodonta sp. (1-1), Neogryporhynchus cheilancristrotus (1-1), Nematoda (1-1) a Archigetes sieboldi (42-4). V závorce je vţdy uveden na prvním místě celkový počet jedinců, na druhém pak počet hostitelů. U posledně zmiňovaného druhu (Archigetes sieboldi) můţeme brát určitou preferenci mezi pohlavím, a to z důvodu výskytu ve dvou sběrných sezónách, počtu nalezených jedinců a výskytu pouze u samic. Nicméně jeho celková prevalence pro všechny samice ve všech sezónách je velmi nízká (5,2 %) a prevalence jen pro samice na kaţdou sezónu jeho výskytu rovněţ (březen 2009 P = 15% a červen 2009 P = 5,26 %). Výhradně u samců se vyskytoval pouze jeden druh Diplostomum spathaceum larv. (4-1), a to pouze na jednom línovi. Z důvodu velmi nízkého počtu zaznamenaných jedinců, výskytu často pouze v jednom odlovu a u velmi nízkého počtu hostitelů tedy nelze z těchto preferencí vyvozovat ţádné signifikantní závěry, pouze nám to můţe naznačit moţnosti. U námi sledovaného nejdůleţitějšího vlivu, tedy úroveň ploidie, byly opět pozorovány preference na úrovni prezence nebo absence druhu. Ovšem na parametry: počet parazitů, počet druhů, počet endoparazitů a počet ektoparazitů neměla ploidie statisticky signifikantní vliv, nicméně u počtu parazitů byl koeficient velmi blízko hladině významnosti ve prospěch diploidní populace. To souvisí s vysokou absolutní abundancí Asymphylodory tincae /viz níţe). Preference parazitů na ploidní úroveň vychází ve prospěch diploidní populace, kde byly nalezeny
tyto
druhy:
Diplostomum
spathaceum
larv.
(4-1),
Neogryporhynchus
cheilancristrotus (1-1) a Anodonta sp. (1-1). Naopak výhradně u triploidních populací byli nalezeni tito ektoparazité: Hydrozetes sp. (11-3) a Ergasilus sieboldi (4-3). Opět i zde platí, ţe tyto výsledky nemohou být hodnoceny jako významné kvůli malé velikosti vzorku. Nicméně
62
je moţné s ohledem na nenalezené rozdíly v hodnotách lysozymu souvisící s ektoparazity, ţe triploidní jedinci mohou mít jíné sloţení mukusu. Absence či pouze ojedinělí výskyt výše zmíněných druhů parazitů jak u vlivu pohlaví,tak i u vlivu ploidie u námi studovaných línů můţe souviset s relativní izolovaností naší populace lína v chovné nádrţi, tudíţ niţším výskyt jednotlivých druhů parazitů či jejich mezihostitelů. Ovšem nebyly zmíněny ještě tři velmi důleţité druhy: Gyrodactylus tincae (Monogenea), Asymphylodora tincae (Trematoda) a Valipora campylancristrota (Cestoda), na které se naše studie výhradně zaměřila z důvodu jejich relativně hojného výskytu, absolutní abundance i prevalence v kaţdém odlovu. Tyto druhy byly také testovány jak na výše zmíněné vlivy, tak i na vlivy metrických, fyziologických a imunologických parametrů. Zaměříme-li se na první druh Gyrodactylus tincae, tak z našich výsledků jednoznačně vyplývá jeho sezónní dynamika. V měsících či sezónách s niţší teplotou vody (prosinec 2008 s teplotou vody 2,5 ºC a v březnu 2009 s teplotou vody 5,6 ºC) byl jeho výskyt velmi vysoký. V prosinci 2008 dosahovala jeho absolutní abundance 358 jedinců při prevalenci 95%. V březnu 2009 byla abundance tohoto druhu 353 jedinců při prevalenci 87,5 %. V měsících září 2008 a červen 2009 byla abundance i prevalence oproti výše zmiňovaným sezónám nízká. Výskyt tohoto druhu je tedy výrazně ovlivněn teplotou vody. Podle CHUBB (1977) je nejvýznamnějším faktorem na výskyt Monogeneí právě teplota vody. KOSKIVAARA et al. (1991) uvádí pokles zástupců rodu Gyrodactylus v jarních aţ letních měsících v souvislosti se vzrůstající teplotou vody. Výrazný rozdíl ve výskytu mezi 2n a 3n populacemi, ani mezi pohlavími ovšem nebyl zaznamenán, tedy výskyt druhu Gyrodactylus tincae je ovlivněn pouze sezónností, přesněji tedy teplotou vody. Zajímavé také je, ţe nebyl zaznamenán ţádny vliv imunologických parametrů na výskyt Gyrodactyla, zvláště pak lysozymu obsaţeného v mukusu na povrchu těla. Dalším důleţitým druhem byla Asymphylodora tincae, kde stejně jako u předchozího druhu můţeme pozorovat sezónní dynamiku. Nejvyšší výskyt a prevalence byla v poslední sezóně (červen 2009), kdy absolutní abundance dosahovala hodnot 10454 jedinců a prevalence byla 72,5%. Tato sezónní dynamika souvisí opět s vlivem teplotya teplotními nároky Asymphylodory CHUBB (1979). A také s výskytem jediného mezihostitele Asymphylodory, kterým je vodní sladkovodní plţ mající nejvyšší výskyt právě v období nejvyššího v letních měsících s vyšší teplotou vody NAŠINCOVÁ & SCHOLZ (1994). Výskyt Asymphylodory negativně koreluje s HSI, coţ je nejspíše dáno odebíráním ţivin hostitele a tudíţ znesnadnění vytvořit si dostatečné rezervy zásobních látek. Nicméně tento korelační koeficient je relativně nízký, proto si myslíme ţe jde spíše o trend neţ o jasně daný 63
významný vztah. Na krevní a imunologické parametry ovšem výskyt této motolice neměl ţádný zásadní vliv. Dále nás zajímal vliv plodní úrovně na tohoto endoparazita. Vyšel nám statisticky významný rozdíl mezi 2n a 3n populacemi s jasnou preferencí diploidů. Důvod této výrazné preference pro 2n nebyl publikován, nicméně se domníváme, ţe to můţe být způsobeno několika faktory. Určitou roli by zde mohla sehrát rozdílná preference potravy mezi diploidy a triploidy, tedy 2n ryby by měli být více malakofágní a tudíţ pojídat plţe s cerkáriemi Asymphylodory. Nicméně potvrdit tento vliv nebylo v naší studii moţné, protoţe obě populace byly chovány pohromadě a krmeny průmyslově vyráběnou směsí pro komerční chov. Další moţností by byla jiná morfologická struktura střeva, tedy lokalizace kde se dospělci této motolice u lína vyskytují. Tato odlišnost by mohla být způsobena niţším počtem počtem buněk a větší velikostí těchto buněk u triploidů, čímţ mohlo právě dojít k různým malformacím. Posledním námi studovaným druhem byla Valipora campylancristrota, kde sezónní dynamika není jiţ tak výrazná jako u předchozích dvou druhů. I zde je ovšem vidět jakýsi trend, kdy bylo nejvyšších prevalencí (35 %) a absolutních abundancí (n = 34) dosaţeno v odlovech s vyšší teplotou vody. To opět souvisí s ţivotním cyklem této tasemnice a výskytem jejího prvního mezihostitele, coţ jsou klanonoţci (Copepoda). Druhým mezihostitelem je kaprovitá ryba, v tomto případě lín a lokalizace parazita je ve ţlučovém měchýři SCHOLZ et al. (2004). Výskyt této tasemnice významně nekoreloval s ţádným námi sledovaným imunologicko-fyziologickým parametrem. Ovšem opět zde byl významný rozdíl v preferenci plodní úrovně hostitele. Valipora výrazně preferovala triploidní populaci. Tento jev můţe být způsoben například hustotou či rozdílným sloţením ţluči, a také opět můţe souviset s rozdílnou velikostí a počtem buněk mezi diploidy a triploidy a tím vzniklýmo malformacemi. Pokud srovnáme naše výsledky s hypotézami (přehled v kapitole polyploidie a parazitismus) definovanými GUÉGAN & MORAND (1996), tak nepotvrzují ani jednu autory vyslovenou hypotézu. Celkově je udáváno ţe polyploidní jedinci jsou náchylnější na parazitární infekci, nicméně to vyvrací preference a mnohem vyšší výskyt Asymphylodory tincae u diploidní populace.
64
6. ZÁVĚR Naše studie se zabývala výskytem mnohobuněčných parazitů lína obecného (Tinca tinca L.) v závislosti na vlivu pohlaví, sezónnosti, imunologicko-fyziologických parametrech a hlavně úrovní ploidie. Celkem bylo vyšetřeno 160 jedinců lína obecného ve čtyřech odlovech (září 2008, prosinec 2008, březen 2009 a červen 2009) pocházející z experimentálních nádrţí VÚRH ve Vodňanech. Poměr mezi diploidními a triploidními jedinci byl 81: 79. Celkem bylo nalezeno 12230 jedinců patřících do 12 rodů/druhů. Ovšem pouze tři druhy: Gyrodactylus tincae (Monogenea), Asymphylodora tincae (Trematoda) a Valipora campylancristrota (Cestoda) byly zastoupeny ve všech odlovech a v dostatečném počtu a prevalenci pro další analýzy. Zjistili jsme tyto trendy a výsledky: -
Velmi malý vliv měřených metrických, imunologických a fyziologických parametrů na výskyt parazitofauny.
-
Vliv komorování či zimování línů na metrické, imunologické a fyziologické parametry.
-
Vliv pohlaví u některých z výše jmenovaných parametrů ve prospěch samic.
-
Velmi výraznou sezónní dynamiku u G. tincae a A. tincea, niţší u V. campylancristrota.
-
Rozdílnou kondici mezi diploidní a triploidní populací určenou Fultonovým kondičním faktorem ve prospěch diploidní populace.
-
Preference pro různou plodní úroveň: u V. campylancristrota pro triploidní populaci a u A. tincae pro populaci diploidní.
65
7. LITERATURA ALVAREZ M. C., OTIS J., AMORES A. & GUISE K. 1991: Short-term culture technique for obtaining chromosomes in marine and freshwater fish. Journal of Fish Biology 39, 817824. BARUŠ V. & OLIVA O. 1995: Fauna ČR a SR: Mihulovci (Petromyzontes) a ryby (Osteichthyes) 2. Academia, Praha, 698 pp. BAUER O. N. 1987: Key to the parasites of freshwater fish of the fauna USSR. Vol. III. Parasiti metazoans. Part 2., Nauka Leningrad, 584 pp. BENFEY T. J., SUTTERLIN A. M. & THOMPSON R. J., 1984: Use of erythrocyte measurements to identify triploid salmonids. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 41: 980-984. BENFEY T. J. 1989: A bibliography of triploid fish, 1943 to 1988. Canadian Tech. Rep. Fish. Aquatic Sciences. 1682, 33 p. BENFEY T. J. 1999: The physiology and behavior of triploid fishes. Reviews in Fisheries Science 7, 1: 39–67. BOLGER T. & CONNOLLY P. L. 1989: The selection of suitable indices for the measurement and analysis of fish condition. Journal of Fish Biology 34: 171-182. BUCHTOVÁ H., SVOBODOVÁ Z., FLAJŠHANS M. & VORLOVÁ L. 2003a: Analysis of growth, weight and relevant indices of diploid and triploid population of tench Tinca tinca (Linnaeus, 1758). Aquaculture research 34: 719–726. BUCHTOVÁ H., SVOBODOVÁ Z., FLAJŠHANS M. & VORLOVÁ L. 2003b: Analysis of slaughtering value of diploid and triploid population of tench (Tinca tinca Linnaeus, 1758). Czech Journal of Animal Science 48, 7: 285–294. BUCHTOVÁ H., SVOBODOVÁ Z., FLAJŠHANS M. & VORLOVÁ L. 2005: Chemical composition of flesh of diploid and triploid population of tench (Tinca tinca, Linnaeus 1758). Czech Journal of Animal Science 50, 2005 (5): 213–219. BUSH A. O., LAFFERTY K. D., LOTZ J. M. & SHOSTAK A. W. 1997: Parasitology meets ecology on its own terms: Margolis et al. Revisited. Journal of parasitology vol. 83, No. 4: 575-583. CASSANI J. R., MALONEY D. R., ALLAIRE H. P. & KERBY J. H. 1990: Problems associated with tetraploid induction and survival in grass carp, Ctenopharyngodon idella. Aquaculture 88, 273-284.
66
ERGENS R. & LOM J. 1970: Původci parasitárních nemocí ryb. Academia, Praha, 384 pp. ESCH G. W. & FERNANDÉZ J. C. 1993: A functional biology of parasitism. London: Chapman & Hall: 337. FLAJŠHANS M. & RÁB P. 1987: Nález triploidního pstruha duhového, formy kamloops, Salmo gairdneri kamloops (A finding of triploid rainbow trout of kamloops form, Salmo gairdneri kamloops). Zivocisná vyroba 32 (3), 279-282 (in Czech with English summary). FLAJŠHANS M., LINHART O. & KVASNIČKA P. 1993: Genetic studies of tench (Tinca tinca L.): induced triploidy and tetraploidy and first performance data. Aquaculture 113: 301–312. FLAJŠHANS M. 1997: Reproduction sterility caused by spontaneous triploidy in tench (Tinca tinca). Pol. Arch. Hydrobiol. 44 (1-2), 39-45. FLAJŠHANS M. & LINHART O. 2000: Produkce triploidních línů. Metodiky VÚRH JU Vodňany, č. 62, 14 s. FLAJŠHANS M. & VAJCOVÁ V. 2002: Rozdíly v hematologických ukazatelích u jeseterů, lišících se úrovní ploidie. In: Biodiverzita ichtyofauny ČR (IV): 59–64. FLAJŠHANS M., KOCOUR M., GELA D. & PIAČKOVÁ V. 2004: The first results on relationships among amphimictic diploid, diploid gynogenic and triploid tench, Tinca tinca L. under communal testing. Aquaculture international 12: 103–118. FLAJŠHANS M., PIÁČKOVÁ V. & RÁB P. 2005: Higher ploidy levels in fish and some problems of their analysis. Analytická cytometrie III. 3: 50–51. FLAJŠHANS M., KOHLMANN K. & RÁB P. 2007: Autotriploid tench Tinca tinca (L.) larvae obtained by fertilization of eggs previously subjected to post - ovulatory ageing in vitro and/or in vivo. Journal of Fish Biology 71: 868 – 876. FLAJŠHANS M. 2008: Studie vyuţití polyploidie v akvakultuře na modelovém druhu lína obecného, Tinca tinca L. Habilitační práce, Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický ve Vodňanech, Jihočeská univerzita, České Budějovice. GUÉGAN J. F., LAMBERT A., LÉVÉQUE C., COMBES C. & EUZET L. 1992: Can host body size explain the parasite species richness in tropical freshwater fishes. Oecologia 90: 197 – 204. GUÉGAN J. F. & MORAND S. 1996: Polyploid hosts: strange attractors for parasites? OIKOS 77, 2: 366-369. GUSEV A. V. 1985: Opredelitel´ parazitov presnovodnych ryb SSSR. Tom 2. Parazitičeskije mnogokljetočnyje. Nauka Leningrad, 424 pp. 67
HAFFARAY P., AUBIN J., HOUIS V., LABBE L. & JALABERT B. 2007: Comparison of pressure or thermal treatments on triploid yields and malformations up to swim up stage in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture 272: S265. HUSSAIN M. G., RAO G. P. S., HUMAYUN N. M., RANDALL C. F., PENMAN D. J., KIME D., BROMAGE N. R., MYERS J. M. & MCANDREW B. J. 1995: Coémparative performance of growth, biochemical composition and endocrine profiles in diploid and triploid tilapia, Oreochromis niloticus L. Aquaculture 138: 87 – 95. HUSSAIN M. G., PENMAN D. J. & MCANDREW B. J. 1996: Effects of triploidy on sexual maturation and reproduction in Nile tilapia, Oreochromis niloticus L. ICLARM Konference Proceedings, Makati City, Philippines. 320-325 pp. CHERFAS N. B., GOMELSKY B., BEN – DOM N. & HULATA G. 1995: Evidence for the heritable nature of spontaneous diploidization in common carp Cyprinus carpio L. eggs. Aquacult. Res. 26, 289-292. CHOURROUT D. & NAKAYAMA I. 1987: Chromosome studies of progenies issued from tetraploid females of rainbow trout. Theoretical and Applied Genetics 74, 687-692. CHUBB J. C. 1977: Seasonal occurence of helmints in freshwater fishes. Part I. Monogenea. Advances in parasitology 15: 133-199. CHUBB J. C. 1979: Seasonal occurence of helmints in freshwater fishes. Part II. Trematoda. Advances in parasitology 17: 141-313. JOHNSTONE R., KNOTT R. M., MCDONALD A. G. & WALSINGHAM M. V. 1989: Triploidy induction in recently fertilized Atlantic salmon ova using anaesthetics. Aquaculture 78: 229–236. KORTET R., TASKINEN J., SINISALO T. & JOKINEN I. 2003: Breeding-related seasonal changes in immunocompetence, health state and condition of the cyprinid fish, Rutilus rutilus, L. Biol. J. Linn. Soc. 78: 117-127. KOSKIVAARA M., VALTONEN E. T. & PROST M. 1991: Seasonal occurence of gyrodactylid monogeneans on the roach (Rutilus rutilus) and variations between four lakes of differing water duality in Finland. Aqua Fenn. 21: 47-55. KOŠAŘ M. 2007: Analýza vztahu variability vybraných MHC genů a infekce mnohobuněčnými parazity u Carassius auratus gibelio, hostitele s netypickou reprodukční strategií. Diplomová práce, Masarykova univerzita, Brno. LAMKOVÁ K. 2006: Vztah imunokompetence jelce tlouště (Leuciscus cephalus) a parazitce mnohobuněčnými cizopasníky. Diplomová práce, Masarykova univerzita, Brno.
68
LEGGATT A. R. & IWAMA K. G. 2003: Occurence of polyploidy in the fishes. Reviews in Fish Biology and Fisheries 13: 237-246. LINCOLN R. F. 1987: Triploid rainbow trout. Trout News (MAFF Lowestoft), 1: 13 – 16. LINHART O., SLECHTA V. & SLAVIK T. 1991: Fish sperm composition and biochemistry. Bull. Inst. Zool. Acad. Sin. Monogr.:16:285-311. LINHART O., RODINA M., FLAJŠHANS M., MAVRODIEV N., NEBESAROVÁ J., GELA D. & KOCOUR M. 2006: Studies on sperm of diploid and triploid tench, Tinca tinca (L.). Aquaculture International 14: 9–25. LINHART O., HAFFRAY P., OZOUF-COSTAZ C., FLAJŠHANS M. & VANDEPUTTE M. 2001: Triploidization of European catfish (Silurus glanis L.) with heat-, cold-, hydrostatic pressure shocks and growth experiment. Journal of Applied Ichtyology. 17, 247-255. LUSK S., BARUŠ V. & VOSTARDOVSKÝ J. 1992: Ryby v našich vodách. 2. vydání Praha: AVČR: 239 pp. LUSKOVÁ V. 1997: Annual cycles and normal values of hematological parameters in fishes. Acta Sc. Nat. Brno 31: 70. LUSKOVÁ V, HALAČKA K, VETEŠNÍK L. & LUSK S. 2004: Changes of ploidy and sexuality status of “ Carassius auratus“ populations in the drainage area of the River Dyje (Czech Republic). Ecohydrology & hydrobiology Vol. 4 No. 2: 165-171. MARGOLIS L., ESCH G. W., HOLME J. C., KURIS A. M. & SCHOD G. A. 1982: The use of ecological terms in parasitology (report of an ad hoc committee of the American Society of Parasitologists.). Journal of Parasitology 68: 131-133. MORAND S. & POULIN R. 2000: Nematode parasite species richness and the evolution of spleen size in Birds. Canadian Journal of Zoology. 78: 1356-1360. MORAVEC F. 1994: Parasitic nematodes of freshwater fishes of Europe. Praha: Academia: 473 pp. MORAVEC F. 2001: Checklist of the metazoan parasites of fishes of the Czech Republic and the Slovak Republic. Academia, Praha, 168 pp. NAŠINCOVÁ V. & SCHOLZ T. 1994: The life cycle of Asymphylodora tincae (Moder 1790) (Trematoda: Monorchiidae): A unique development in monorchiid trematodes. Parasitol. Research 80: 192-197. OTTOVÁ E., ŠIMKOVÁ A., JURAJDA P., DÁVIDOVÁ M., ONDRÁČKOVÁ M., PEČÍNKOVÁ M. & GELNAR M. 2005: Sexual ornamentation and parasite infection in
69
males of common bream (Abramis brama): a reflection of immunocompetence status or simple cost of reproduction? Evolutionary Ecology Research 7: 581–593. PANDIAN T. J. & KOTEESWARAN R. 1998: Ploidy induction and sex control in fish. Hydrobiologia 384, 167-243. PIAČKOVÁ V. & FLAJŠHANS M. 2006: Long-term examination of health conditions in monoculture of communally tested amphimictic diploid, diploid gynogenic and triploid tench, Tinca tinca L. Aquaculture international 14 (1 – 2): 43-59. PIFERRER F., BEAUMONT A., FALGUIÉRE J. C., FLAJŠHANS M., HAFFRAY P. & COLOMBO L. 2009: Polyploid fish and shellfish: Production, biology and applications to aquaculture for performance improvement and genetic containment. Aquaculture 293: 125 – 156. RÁB P., BOHLEN J., RÁBOVÁ M., FLAJŠHANS M. & KALOUS L. 2006: Cytogenetics as a tool box in fish conservation: the prezent situation in Europe. In: Pisano E., OzoufCostaz C., Foresti F. & Kapoor B. G. (Eds.), Fish Cytogenetics. Science Publishers, Enfield, 215 – 241 pp. REFSTIE T., VAASVIC V. & GJEDREM T. 1977: Induction of polyploidy in salmonids by Cytochalasin B. Aquaculture 10: 65–74. SCHEERER P. D. & THORGAARD G. H. 1983: Increased survival in salmonid hybrids by induced triploidy. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 40: 2040–2044. SCHOLZ T. 1989: Amphilinida and Cestoda, parasites of fish in Czechoslovakia. Academia, Praha, 56 pp. SCHOLZ T., BRAY R. A., KUCHTA R. & ŘEPOVÁ R. 2004: Larva of gryporhynchid cestodes (Cyclophyllidea) from fish: A review. Folia parasitologova 51: 131-152. SCHULTZ R. J. 1989: Origins and relationships of unisexual Poeciliids. In: Meffe G. K. & Snelson F. F., Jr. (eds.), Ecology and evolution of livebearing fishes (Poeciliidae). Prentice hall, Englewood Cliffs, NJ, pp. 69–87. SMITH L. T. & LEMOINE H. L. 1979: Colchicine-induced polyploidy in brook trout. The Progressive Fish-Culturist 41: 86–88. SOLTIS P. S. & SOLTIS D. E. 2000: The role of genetic and genomic attributes in the success of polyploids. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97: 7051– 7057. SVOBODOVÁ Z., PRAVDA D. & PALÁČKOVÁ J. 1986: Jednotné hematologické metody hematologického vyšetření ryb. Vodňany: Edice metodik: 36.
70
SVOBODOVÁ Z., KOLÁŘOVÁ J. & FLAJŠHANS M. 1998: The first findings of the differences in complete blood count between diploid and triploid tench, Tinca tinca L. Acta veterinaria. Brno 67, 243-248. SVOBODOVÁ Z., FLAJŠHANS M., KOLÁŘOVÁ J., MODRÁ H., SVOBODA M. & VAJCOVÁ V. 2001: Leukocyte profiles of diploid and triploid tench, Tinca tinca L. Aquaculture 198: 159-168. SVOBODOVÁ Z. & KOLÁŘOVÁ J. 2004: A review of the diseases and contaminant related mortalities of tench (Tinca tinca L.). Veterinary Medicine – Czech, 49 (1): 19-34. TASKINEN J. & KORTET R. 2002: Dead and alive parasites: Sexual ornaments signal resistence in the Male Fish, Rutilus rutilus. Evolutionary Ecology Research. 4: 919-929. THORGAARD G. H. 1983: Chromosome set manipulation and sex control in fish. In: Hoar, W. S., Randall, D. J, Donaldson, E. M., (Eds.). Fish Physiology, vol. 9B. Academic Press, New York, pp. 405-434. THORGAARD G. H. 1986: Ploidy manipulation and performance. Aquaculture 57: 5764. TINSLEY R. C. & JACKSON J. A. 1998: Correlation of parasite speciation and specifiky with host evolutionary relationships. International Journal for Parasitology vol. 28: 1573 – 1582. TIWARY B. K., KIRUBAGARAN R. & RAY A. K. 1997: Induction of Triploidy by Cold Shock in Indian catfish, Heteropneustes fossilis (Bloch). Asian Fisheries Science 10: 123– 129. TIWARY B. K., KIRUBAGARAN R. & RAY A. K. 2004: Reviews in Fish Biology and Fisheries. 14: 391–402. TOMAN M. a kol. 2000: Veterinární imunologie. Praha: Grada Publishing: 413 pp. UEDA T., SATO R. & KOBAYASHI J. 1988: Triploid rainbow trout induced by high pH multiplied by high calcium. Nippon Suisan Gakkaishi 54: 2045. UEDA T. 1996: Chromosome aberrations in salmonid fish embryos using prolonged-stored eggs in coelomic fluid. Chromosome Information Service 61:13-15. VARADARAJ K. & PANDIAN T. J. 1988: Induction of triploids in Oreochromis mossambicus by thermal, hydrostatic pressure and chemical shocks. Proc. Aquacult. Inter. Congress Expo, pp. 531–535.
71
VINDELOV L. L. & CHRISTENSEN I. J. 1990: Review of techniques and results obtained in one laboratory by an integrated system of methods designed for routine clinical flowcytometric DNA analysis. Cytometry 11:753-770. WU C., YE Y., CHEN R. & LIU X. 1993: An artifical multiple triploid carp and its biological characteristic. Genet. Aquacult. IV aquaculture 111: 255–262.
72
