IMUNOGLOBULIN A, Tn ANTIGEN A IgA NEFROPATIE
IMMUNE GLOBULIN A, Tn ANTIGEN AND IgA NEPHROPATHY
K. Matoušovic,1 Ľ. Podracká, 2 , K. Konečný3 1 Interní klinika UK 2. lékařské fakulty a FN Motol, Praha 2 Klinika dětí a dorostu FN PJ Šafaříka, Košice 3 3. interní klinika FN Olomouc
ABSTRAKT IgA nefropatie je glomerulonefritida, k jejíž diagnóze je nutný bioptický průkaz převažujících uloženin IgA1 v mezangiu glomerulů. Klinicky jde obvykle o výraznou erytrocyturii s mírnou proteinurií. Vzniká v důsledku zvýšené tvorby a následného ukládání cirkulujících imunitních komplexů do glomerulů, kdy antigenem jsou neúplné cukerné řetězce otočné oblasti (”hinge region”) imunoglobulinu A1 (IgA1) a protilátkou IgG nebo IgA1, které se specificky váží k těmto cukerným řetězcům. Cukerné řetězce ”hinge region” se skládají z N-acetylgalaktozaminu (GalNAc), který je připojen k serinu nebo treoninu O-glykozidickou vazbou. U zdravých lidí je na GalNAc připojena galaktóza (Gal). Dalším monosacharidem tohoto cukerného řetězce je sialová kyselina (NeuAc, neuraminic acid), která je připojena na Gal nebo na GalNAc nebo na oba tyto monosacharidy. U pacientů s IgA nefropatií chybí v některých cukerných řetězcích IgA Gal a koncový GalNAc je antigenním epitopem pro přirozené a obecně se vyskytující cirkulující anti-GalNAc protilátky. Vzniklé cirkulující imunitní komplexy se ukládají v mezangiu glomerulů. O-glykozidický řetězec končící GalNAc se nazývá Tn-antigen nebo také jen T-antigen, jestliže se řetězec skládá z disacharidu GalNAc-Gal, říká se mu TF (Thomsen-Friedenreich) antigen. Zvýšená exprese Tn a TF byla nalezena na řadě nádorových buněk, především u nádorů zažívacího traktu. Terminální GalNAc na glykoproteinech membrány erytrocytů, lymfocytů, monocytů a trombocytů je příčinou vzácného Tn syndromu. Klíčová slova: IgA nefropatie, IgA, glykoproteiny, Tn antigen
ABSTRACT IgA nephropathy is a glomerulonephritis whose diagnosis requires biopsy-based evidence of predominant IgA1 deposits in the glomerular mesangium. In clinical terms, the condition involves marked erythrocyturia associated
with mild proteinuria. It develops as a result of increased production and subsequent deposition of circulating immune complexes into glomeruli, with the antigen being incomplete carbohydrate chains of the immune globulin A1 (IgA1) hinge regions and the antibody being IgG or IgA1 binding specifically to these carbohydrate chains. The hinge region carbohydrate chains are composed of N-acetyl galactosamine (GalNAc), linked to serine or threonine by a glycoside bond. In healthy individuals, galactose (Gal) is linked to GalNAc (Gal). Another monocarbohydrates of the carbohydrate chain is neuraminic acid (NeuAc), linked to Gal or GalNAc, or to both of these monocarbohydrates. Patients with IgA nephropathy lack, in some carbohydrate chains, IgA Gal, and terminal GalNAc is the antigen epitope for natural and generally occurring, circulating anti-GalNAc antibody. The formed circulating immune complexes are deposited in the glomerular mesangium. The O-glycoside chain terminating with GalNAc is referred to as the Tn-antigen or only the T-antigen; if the chain is composed of the dissacharide GalNAc-Gal, it is referred to as the TF (Thomsen-Friedenreich) antigen. Increased Tn and TF expression has been found in a variety of tumor cells, primarily in gastrointestinal tract tumors. Terminal GalNAc on erythrocyte, monocyte, and thrombocyte membrane glycoproteins is the cause for the rare Tn syndrome. Key words: IgA nephropathy, IgA, glycoproteins, Tn antigen
IgA nefropatie IgA nefropatie je známa 34 roků. Klinickým projevem časného stadia je nejčastěji mikroskopická erytrocyturie, která u 40 % pacientů přejde při běžné respirační infekci za několik hodin nebo dní v makroskopickou. U více než poloviny pacientů onemocnění pomalu progreduje a při 20letém sledování se chronické selhání ledvin vyvine asi u 40% pacientů. Úbytek funkce nastává současně se zvýšením proteinurie a hypertenze a je obvykle pomalý (Matoušovic a Rossmann 1994). Podíl pacientů se selháním ledvin narůstá s dobou sledování. IgA nefropatie rekuruje v polovině transplantovaných ledvin, ale je jen zřídka příčinou selhání štěpu: funkce ubývá většinou v důsledku rejekční nefropatie. Imunoglobulin A (IgA) Patogeneze IgA nefropatie je nyní téměř jednomyslně připisována odchylkám ve struktuře IgA (obr. 1). Ze všech imunoglobulinů se v organimu tvoří nejvíce právě IgA, ale protože se rychle katabolizuje v játrech (Mestecky et al., 1995), je jeho plazmatická hladina nižší než IgG. Vyskytuje se ve dvou izotypech: IgA1 a IgA2, a to jako momér nebo dimér. Nacházíme ho jednak v séru (téměř výlučně jako monomér IgA1), jednak na sliznicích (převážně jako di- až polymér IgA2 se spojovacím J-řetězcem), kam je secernován po vazbě na tzv. sekreční komponentu. Je zde součástí obrany proti infekci (např. v močových cestách). Úplná deficience IgA je poměrně častá (asi 1:500 v populaci), ale není spojena s vyšším výskytem infekcí (van Marjolein et al., 2001). Oba izotypy mají vysoký stupeň homologie. Jako „hinge region“ (otočná, pantová, sklopná oblast) se označuje část těžkého řetězce mezi C1 a C2 doménou (viz dále). Oba izotypy IgA jsou glykoproteiny, liší se však typem glykozylace. Oba mají běžně se vyskytující N-glykozidický řetězec, ale IgA1 patří mezi vzácně se vyskytující cirkulující glykoproteiny s O-glykozidicky vázanými cukry. Protože se při IgA nefropatii ukládá v glomerulech výhradně IgA1, je výzkum její patogeneze zaměřen na odchylky v jeho struktuře, především ve struktuře O-glykozidicky vázaných cukrů. Dokladů o oprávněnosti této hypotézy kvapem přibývá.
Obr. 1: „Hinge region“ (pantová, otočná, sklopná oblast) těžkého řetězce IgA s 10 O-glykozidicky vázanými cukernými řetězci (prázdné kroužky). Plnými kroužky jsou znázorněny N-glykozidicky vázané cukerné řetězce. Pořadí aminokyselin v „hinge region“ IgA1 a IgA2 je zobrazeno v dolní části schematu. Na 3 až 5 molekul serinu nebo treoninu (225, 228, 230, 232, 236) jsou navázány O-glykozicky vázané cukerné řetězce. V „hinge region“ IgA2 není zastoupen serin ani treonin a proto tam nemohou být O-glykozidicky vázané cukerné řetězce.. O-glykozidicky vázané cukry a jejich heterogenita O-cukerný řetězec může být vázán pouze dvěma aminokyselinami proteinové kostry bílkovin: serinem nebo treoninem. „Hinge region“ každého těžkého řetězce IgA1 se skládá z 21 aminolkyselin, z nichž 9 je serin nebo treonin, tedy aminokyseliny schopné vázat O-cukerné řetězce (Novak et al., 2000, 2001, 2002). Glykozylace je značně heterogenní a bylo zjistěno, že na jednu „hinge region“ těžkého řetězce připadá 3 až 5 glykanů, připojených Oglykozidickou vazbou. Jedna molekula IgA1 má tedy ve své „hinge region“ 6 až10 O-vázaných cukerných řetězců (obr. 1). Syntéza cukerného řetězce je postupný proces, zprostředkovaný enzymy, které se nazývají glykozyltransferázy.
Začíná připojením N-acetylgalaktozaminu (GalNAc) na hydroxylovou skupinu serinu nebo treoninu enzymem GalNAc-transferázou. Dalším krokem je vazba galaktózy (Gal), katalyzovaná b1,3-galaktozyltransferázou. Syntéza je ukončena připojením sialové kyseliny (NeuAc – „neuraminic acid“) na Gal enzymem a2,3-sialyltransferázou nebo na GalNAc enzymem a-2,6 sialyltransferázou. Možné varianty skladby O-glykozidicky vázaného cukerného řetězce jsou na obr. 2.
Obr. 2: Varianty struktury O-glykozidicky vázaných cukerných řetězců IgA. Na serin nebo treonin peptidické kostry IgA mohou být navázány N-acetylgalaktozamin (GalNAc), galaktóza (Gal) a sialová kyselina (NeuAc – „neuraminic acid“) v různé konfiguraci. Odchylky glykozylace u IgA nefropatie K připojení Gal na GalNAc, důležitému z hlediska rozvoje IgA nefropatie, nemusí dojít z několika důvodů: buď jde o útlum aktivity b1,3-galaktozyltransferázy, anebo je zvýšena aktivita a2,6-sialyltransferázy. V druhém případě se NeuAc a2,6 vazbou naváže přímo na GalNAc a tím se další syntéza cukerného řetězce zastaví a GalNAc tedy už nemůže být jako obvykle galaktozylován. GalNAc, který není substituován Gal, se stává vazebným místem pro přirozeně se vyskytující protilátky za vzniku patologických imunitních komplexů. (Czerkinski et al., 1986, Jackson et al., 1988).
Metody analýzy cukerných řetězcu u IgA nefropatie Při studiu významu glykozylace IgA1 v patogenezi IgA nefropatie se studovala role cukrů po odštěpení jednotlivých cukerných komponent. Odstranění NeuAc z cukerného řetězce se provádělo neuraminidázou (z Vibrio cholerae), Gal byla odštěpována b1,3-galaktozydázou z býčích testes a GalNAc nebo celý cukerný řetězec odštěpí endo-Oglykanáza.
Studium skladby O-glykozidického řetězce se také provádělo plynovou chromatografií. Tyto analýzy prokázaly snížený obsah Gal v cirkulujím IgA u pacientů s IgAN. Jiným přístupem bylo studium vazby lektinů, tedy látek, které se specificky váží na určitý monosacharid nebo disacharid cukerného řetězce glykoproteinu. Je známa celá řada lektinů, ale čistota i specificita vazby jednotlivých preparátů téhož lektinu může silně kolísat. Z hlediska IgA1 je důležitý lektin jacalin, který se specificky váže na sialovaný i desialovaný disacharid GalNAc-Gal (můžeme jím proto izolovat IgA1 např. ze séra). Jacalin se však současně váže i na další sérové glykoproteiny, mající disacharid GalNAc-Gal, např. plasminogen, plasmatický faktor 5, inhibitor C1, IgD aj. Proto preparáty IgA, připravené afinitní chromatografií na imobilizovaném jakalinu nejsou příliš čisté. Z hlediska IgA nefropatie je také významný lektin Helix aspersa, který se váže na cukerný řetězec končící GalNAc (který tedy není substituován Gal), vyskytující se ve zvýšeném množství na cirkulujícím i v mesangiu uloženém IgA pacientů s IgAN. Třetí možností studia je použití monoklonálních protilátek, namířených proti specifické struktuře cukerných řetězců. Jejich reaktivita je vysoce specifická (na rozdíl od lektinů) a záleží často nejen na struktuře cukerného řetězce, ale i na sekvenci aminokyselin bílkovinné kostry, na níž jsou cukerné řetězce navázány. Mnohá upřesnění o struktuře glykoproteinů přinesla hmotová spektrometrie. Tn a TF antigen, Tn syndrom, IgA nefropatie Nejen bílkoviny, jak se často předpokládá, ale také neúplně dostavěný O-glykozidicky vázaný cukerný řetězec může být antigenní determinantou (Varki 1993; Galili 1989; Tomana et al., 1997, 1999). Jestliže končí Gal (na jeho konci chybí NeuAc), nazývá se TF antigen (Thomsen-Friedenreich), jestliže končí GalNAc (tedy chybí NeuAc i Gal), jde o Tn antigen. Pod pojmem sialylovaný Tn antigen se rozumí GalNAc, na nějž je přímo navázána a2,6-glykozidickou vazbou NeuAc. Neúplně syntetizovaný O-glykozidicky vázaný cukerný řetězec hraje roli v patogeneze řady chorob. Nejlépe prozkoumán je tzv. Tn syndrom (Berger 1999), vzácné hematologické, často latentně probíhající onemocnění, projevující se trombocytopenií, leukopenií a ev. hemolytickou anémií. Je při něm utlumena aktivita beta-1,3galaktozyltransferázy (katalyzuje vazbu Gal na GalNAc) a v důsledku toho je GalNAc koncovým monosacharidem O-glykozidického řetězce buněčné membrány erytrocytů, lymfocytů, monocytů a trombocytů. Tento terminální GalNAc je epitopem, na který se váží přirozeně a obecně se vyskytující anti-GalNAc protilátky. V sérech pacientů s Tn syndromem jsou tyto protilátky IgM izotypu. Epitopem jsou v tomto případě tři sousedící molekuly GalNAc, navázané na tři sousedící molekuly serinu a/nebo treoninu a nejsou doplněny Gal. Příčinou poruchy je defekt exprese genu pro b1,3-galaktozyltransferázu, enzymu, který katalyzuje vazbu Gal na GalNAc. Podobná patogeneze se předpokládá u IgA nefropatie (Mestecky et al., 2002). Rovněž zde nejsou všechny GalNAc v „hinge region“ IgA1 substituovány Gal a také zde se na GalNAc váží přirozeně se vyskytující protilátky za tvorby cirkulujících imunitních komplexů (Lai a Leung JC, 2002), které se ukládají v mesangiu glomerulů. Důsledkem této depozice je aktivace mezangiálních buněk, zvýšená tvorba cytokinů, proliferace a zvýšená tvorba mezangiální matrix. Tedy morfologický obraz IgA nefropatie. Typ a specifita anti-GalNAc protilátek je ovšem jiná než u Tn syndromu. V tomto případě se jedná o protilátky IgG nebo IgA1 izotypu, které se také vyskytují u každého člověka. Na rozdíl od Tn syndromu nevyžaduje jejich specificita tři sousedící molekuly GalNAc. V „hinge region“ IgA1 se tato struktura ani nevyskytuje, molekuly serinu či treoninu spolu nesousedí, ale jsou odděleny jinými aminokyselinami (obr. 1). Naopak, monoklonální anti-Tn protilátky, které jsou namířeny proti sousedící trojici GalNAc s degalaktozylovaným myelomovým IgA1, nereagují. Specificita těchto proticukerných protilátek může ale také záviset na sekvenci aminokyselin bílkovinné kostry, na níž jsou postranní cukerné řetězce navázány. Kromě glykoproteinů mohou být cukerné epitopy přítomny též na glykolipidech či polysacharidech, ale patogenetický význam těchto nálezů není ještě zcela objasněn.
Cukerné řetězce tedy jsou antigenními epitopy (Rudd et al., 2001) a hrají roli v patogenezi řady chorob, jejichž výčet ještě jistě není ukončen. Kromě Tn syndromu a IgA nefropatie se tento mechanizmus uplatňuje také u chladové hemolytické anémie. Defektní glykozylace glykoproteinů byla nalezena také u řady chronických zánětlivých chorob, patogenetický význam tohoto jevu není ovšem znám. Degalaktozylovaný N-glykozidicky vázaný cukerný řetězec IgG (tedy končící N-acetylglukozaminem) byl zjištěn např. u revmatoidní artritidy (Tomana et al., 1992), lupus erytematodes, tuberkulózy, Crohnovy nemoci a ulcerativní kolitidy (Tomana 1996). Závěr Příčinou IgA nefropatie je tedy nadměrná tvorba cirkulujících imunitních komplexů, obsahujících IgA1 a IgG a jejich perzistence v cirkulaci. Jestliže totiž O-cukerný řetězec IgA1 není dostavěn, nemůže se IgA1 katabolizovat běžným způsobem (Stockert et al., 1992), tj. vázat se na asialoglykoproteinový recepor hepatocytů, internalizovat a degradovat. Perzistuje tudíž v cirkulující krvi a vzhledem k vysokému ultrafiltračnímu tlaku a svérazné struktuře glomerulární kapiláry a mesangia se komplexy ukládají právě zde. Výsledkem jsou odchylky ve funkci a struktuře mezangia a posléze bioptický nález mezangiálně proliferativní glomerulonefritidy v optické a mohutné uloženiny IgA1 v mezangiu při imunofluorescenční mikroskopii. IgA nefropatie se tedy v posledních letech přiřadila k několika málo glomerulonefritidám, u nichž je známa antigenní determinanta, vedoucí ke zvýšené tvorbě imunitních komplexů, stojících na počátku rozvoje procesu (Floege a Feehally, 2000). Použité zkratky: IgA: immunoglobulin A, IgG: immunoglobulin G, IgM: imunoglobulin M, GalNAc: N-acetylgalaktozamin, Gal: galaktóza, NeuAc: sialová kyselina (neuraminic acid) Literatura
1. Berger EG: Tn syndrome. Biochim Biophys Acta 1455: 255-268, 1999. 2. Czerkinsky C, Koopman W, Jackson S, Collins JE, Crago SS, Schrohenloher RE, Julian B, Galla JH, Mestecky J: Circulating immune complexes and immunoglobulin A rheumatoid factor in patients with mesangial immunoglobulin A nephropathies. J clin Invest 77: 1931-1938, 1986. 3. van Egmond M, Damen CA, van Spriel AB, Vidarsson G, van Garderen E, van de Winkel JGJ: IgA and the IgA Fc receptor. Trends in Immunol 22: 205-211, 2001. 4. Floege J, Feehally J: IgA nephropathy. Recent development. J Am Soc Nephrol 11: 2395-2403, 2000. 5. Galili U: Abnormal expression of a-galactosyl epitopes in man. A trigger for autoimmmune diseases? Lancet 2: 358-361, 1989. 6. Jackson S: Immunoglobulin-antiimmunoglobulin interactions and immune complexes in IgA nephropathy. Am J Kidney Dis 12: 425-420, 1988. 7. Lai KN, Leung JC: Pathogenic role of the IgA molecule in IgA nephropathy. Nephrology 7, Suppl: S86-S91, 2002. 8. Matoušovic K, Rossmann P.: Primary glomerulonephritis. Morphological and clinical aspects of diagnosis and prognosis. Academia Praha, 1995.
9. Mestecky J, Hashim OH, Tomana M: Alterations in the IgA carbohydrate chains influence the cellular distribution of IgA1. Contrib Nephrol 111: 66-72, 1995. 10. Mestecky J, Novak J, Julian BA, Tomana M: Pathogenic potencial of galactose-deficient IgA1 in IgA nephropathy. Nephrology 7, Suppl: S92-S99, 2002. 11. Novak J, Julian BA, Tomana M, Mestecky J: Progress in molecular and genetic studies of IgA nephropathy. J Clin Immunol 21: 310-327, 2001. 12. Novak J, Tomana M, Kilian M, Coward L, Kulhavy R, Barnes S, Mestecky J: Heterogeneity of O-glycosylation in the hinge region of human IgA1, Mol Immunol 37: 1047-1056, 2000. 13. Novak J, Vu HL, Novak L, Julian B, Mestecky J, Tomana M: Interactions of human mesangial cells with IgA and IgA-containing immune complexes. Kidney int. 62: 465-475, 2002. 14. Odani H, Hiki Y, Takahashi M, Nishimoto A, Yasuda Y, Iwase H, Shinzato T, Maeda K: Direct evidence for decreased sialylation and galactosylation of human serum IgA1 Fc O-glycosylated hinge peptides in IgA nephropathy by mass spectrometry. Bioch Biophys Res Comm 271: 268-274, 2000. 15. Rudd PM, Elliott T, Cresswoll P, Wilson IA, Dwek RA: Glycosylation and the immune system. Science 291: 23702376, 2001. 16. Stockert RJ, Kressner MS, Collins JC, Sternlieb I, Morrel AG: IgA interaction with the asialoglycoprotein receptor. Proc Natl Acad Sci USA 79: 6229-6231, 1982. 17. Tomana M, Schrohenloher RE, Reveille JD, Arnett FC, Koopman WJ: Abnormal galactosylation of serum IgG in patients with systemic lupus erythematosus and members of families with high frequency of autoimmune diseases. Reumatol Int 12: 191-194, 1992. 18. Tomana M: Glycoproteins in inflammatory bowel disease. In: Glycoproteins and disease (red. Montreuil J, Vliegenthart JFG, Schachter H), Elsevier Amsterdam, 1996, s. 291-298. 19. Tomana M, Matoušovic K, Julian BA, Radl J, Konečný K, Mestecky J: Galactose-deficient IgA1 in sera of IgA nephropathy is present in complexes with IgG. Kidney international 52: 509-516, 1997. 20. Tomana M, Novak J, Julian BA, Matoušovic K, Konečný K, Mestecky J: Circulating immmune complexes in IgA nehropathy consist of IgA1 with galactose deficient hinge region and antiglycan antibodies. J clin Invest 104: 73-81, 1999. 21. Varki A: Biological role of oligosaccharides: All of the theories are correct. Glycobiology 3: 97-130, 1993.
Prof. MUDr. Karel Matoušovic, DrSc. Interní klinika UK 2. LF a FN Motol V Úvalu 84 150 00 Praha 5
