PLATELIATM VZV IgG 48 TESTOV
72684
IMUNOENZYMATICKÁ METÓDA NA KVALITATÍVNE ZISTENIE PROTILÁTOK TRIEDY IgG PROTI VARICELLA ZOSTER V ĽUDSKOM SÉRE
Ref. 91078/BRD
Slovensky 1/8
OBSAH
1.
POUŽITIE
2.
SÚHRN A VYSVETLENIE TESTU
3.
PRINCÍP TESTU
4.
OBSAH SÚPRAVY A PRÍPRAVA REAGENCIÍ
5.
UCHOVÁVANIE A STABILITA REAGENCIÍ
6.
BEZPEČNOSTNÉ OPATRENIA
7.
TYP A UCHOVÁVANIE VZORKY
8.
PRACOVNÝ POSTUP
9.
SCHÉMA PRACOVNÉHO POSTUPU
10.
VALIDÁCIA TESTU
11.
INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV
12.
OBMEDZENIA TESTU
13.
ANALYTICKÁ ŠPECIFICITA
14.
CITLIVOSŤ A ŠPECIFICITA
15.
PRESNOSŤ
16.
POMÔCKA NA RIEŠENIE PROBLÉMOV
17.
LITERATÚRA
Ref. 91078/BRD
Slovensky 2/8
1. POUŽITIE IMUNOENZYMATICKÁ METÓDA NA KVALITATÍVNE ZISTENIE PROTILÁTOK TRIEDY IgG PROTI VARICELLA ZOSTER V ĽUDSKOM SÉRE 2. SÚHRN A VYSVETLENIE TESTU Varicella a Herpes Zoster sú dva klinické prejavy vyplývajúce z infekcie vírusom Varicella Zoster (VZV). Varicella alebo ovčie kiahne je veľmi nákazlivé ochorenie, ktoré je vo všeobecnosti dôsledkom primárnej infekcie vírusom VZV a obyčajne postihuje deti. Infekcia spôsobená VZV počas tehotenstva môže vyvolať ochorenie alebo vrodenú vývojovú vadu plodu; ak sa vyskytne pred koncom tehotenstva, môže spôsobiť smrť novorodenca. Herpes Zoster je ochorenie, ktoré postihuje najmä dospelých a zdá sa, že je spôsobené reaktiváciou vírusu, ktorý zostal v latentnom štádiu po dlhú dobu v miešnych senzorických gangliách následne po primárnej infekcii. Infekcia spôsobuje bolestivé kožné vyrážky pozdĺž dráh postihnutých nervov. Sérologické metódy sú obyčajne prispôsobené na určenie imunitného stavu ohrozených jedincov (najmä imunosuprimovaných pacientov) a na pre- a postnatálnu diagnostiku infikovaných osôb. 3. PRINCÍP TESTU Test je založený na technike ELISA (Imunosorpčná enzýmová imunoanalýza). Čiastočne purifikovaný a inaktivovaný VZV antigén je naviazaný na pevnú fázu (stripy po 8 jamkách). Špecifické imunoglobulíny sa viažu k antigénu počas inkubácie s nariedeným ľudským sérom. Po premytí, ktorým sa odstránia nereagujúce proteíny, sa robí inkubácia s konjugátom, v ktorom sa monoklonálne protilátky proti ľudskému IgG značia peroxidázou. Potom sa odstráni nenaviazaný konjugát a pridá sa peroxidázový substrát. Vznikajúce sfarbenie je úmerné koncentrácii špecifických protilátok prítomných vo vzorke séra. 4. OBSAH SÚPRAVY A PRÍPRAVA REAGENCIÍ - Reagencie postačujú na 48 stanovení. - Pred použitím nechajte ustáliť na izbovú teplotu. MT PLATE
MIKROTITRAČNÁ PLATNIČKA 3 x 2 stripy potiahnuté vírusom Varicella Zoster. Použitie: otvorte obal n a protiľahlej strane kódového označenia (po ZG nasleduje číslo šarže), ktoré slúži na identifikáciu, vyberte rámik a potrebné stripy z fóliového obalu, vložte nepoužité stripy do polyetylénového sáčka so silikagélom, vytlačte z neho vzduch a nepriedušne ho uzavrite pritlačením uzáveru.
CONJ
KONJUGÁT (1 x 10 ml) Obsah: anti-ľudské monoklonálne IgG protilátky značené peroxidázou, vo fosfátovom pufri obsahujúcom 0,05 % fenolu a 0,02 % Bronidoxu. Pripravený na použitie bez ďalšieho riedenia.
CONTROL +
POZITÍVNE KONTROLNÉ SÉRUM (1,6 ml) Obsah: nariedené ľudské sérum s obsahom anti-Varicella Zoster IgG v 0,01 mol/l fosfátovom pufri s 1% BSA a 0,09% azidom sodným, tekuté, pripravené na použitie bez ďalšieho riedenia. Farba: farba kontrolného séra je úmerná relatívnemu titru protilátok.
CONTROL CUT OFF CUT OFF KONTROLNÉ SAÉRUM ( 2,0 ml) Obsah: Nariedené ľudské sérum s obsahom anti-Varicella Zoster IgG v 0,01 mol/l fosfátovom pufri s obsahom 1 % BSA a 0,09 % azidu sodného, tekuté, pripravené na použitie bez ďalšieho riedenia. Farba: farba kontrolného séra je úmerná relatívnemu titru protilátok. CONTROL IgG- IgG NEGATÍVNA KONTROLA (PF93910) (1 x 1,6 ml) ZAMENITEĽNÉ MEDZI ŠARŽAMI Obsah: Ľudské sérum neobsahujúce anti-Varicella Zoster IgG v 0,01 mol/l fosfátovom pufri s 1 % BSA a 0,09 % azidu sodného, tekuté, pripravené na použitie bez ďalšieho riedenia.
Ref. 91078/BRD
Slovensky 3/8
WASH BUF
PREMÝVACÍ ROZTOK 10X (PF93603). (1 x 100 ml) ZAMENITEĽNÉ MEDZI ŠARŽAMI Obsah: 10 krát koncentrovaný fosfátový fyziologický roztok; obsahuje 0,5 % Brij. Príprava: Premývací roztok o pracovnej koncentrácii pripravte nariedením príslušného objemu v pomere 1:10 destilovanou vodou. Ak sú prítomné kryštály, rozpustite ich pri 37 °C pred riedením.
SAMP DIL
RIEDIACI ROZTOK 2 (PF93611). 1 x 100 ml. Na riedenie vzoriek séra. Pripravený na použitie. ZAMENITEĽNÉ MEDZI ŠARŽAMI Obsah: Proteínový roztok vo fosfátovom pufri s 0,09 %-ným azidom sodným s obsahom metyloranže ako farbiva.
SUBS TMB
SUBSTRÁT (PF93619). (15 ml). Pripravený na použitie. ZAMENITEĽNÉ MEDZI ŠARŽAMI Obsah: Tetramethylbenzidín 0,26 mg/ml a peroxid vodíka 0,01 % stabilizovaný v citrátovom pufri 0,05 mol/l (pH 3,8).
H2SO4 0.3 M
ZASTAVOVACÍ ROZTOK (PF93602). (1 x 16 ml). ZAMENITEĽNÉ MEDZI ŠARŽAMI 0,3 mol/l H2SO4 v roztoku pripravenom na použitie.
SAMOLEPIACA FÓLIA (2) POLYETYLÉNOVÝ SÁČOK (1) MATERIÁL NUTNÝ NA USKUTOČNENIE TESTU, KTORÝ NIE JE SÚČASŤOU DODÁVKY. - Inkubátor s reguláciou teploty na 37 °C - Spektrofotometer na mikrotitračné platničky, vlnová dĺžka 450 nm alebo 450/620 nm, s lineárnosťou OD do 2,000 (najmenej) - Premývačka mikrotitračných platničiek (prednostne) na premývanie o objemoch 225-375 µl - Destilovaná alebo deionizovaná voda - Obvyklé laboratórne sklo: valce, testovacie skúmavky atď. - Mikropipety na presné pipetovanie 10, 100 a 1000 µl roztoku - Jednorázové rukavice - Stopky - Roztok chlórnanu sodného (5%) - Nádoby na odkladanie potenciálne infekčných materiálov - Absorpčný papier 5. UCHOVÁVANIE A STABILITA REAGENCIÍ Reagencie musia byť uchovávané pri 2/8 °C. Termín exspirácie je uvedený na každej zložke a na štítku krabice. Po otvorení alebo po príprave majú reagencie obmedzenú stabilitu. REAGENCIE PODMIENKY Mikrotitračná platnička 5 týždňov pri 2/8 °C v polyetylénovom sáčku Kontrolné séra 5 týždňov pri 2/8 °C Konjugát 5 týždňov pri 2/8 °C Substrát až do termínu exspirácie pri 2/8 °C, 1 týždeň pri 15/30 °C; uchovávaný v tme. Riediaci roztok na vzorky až do dátumu exspirácie pri 2/8 °C. Premývací roztok 2 týždne pri 2/8 °C, 5 dní pri 15/30°C.. Zastavovací roztok až do dátumu exspirácie pri 2/8 °C. 6. BEZPEČNOSTNÉ OPATRENIA VÝHRADNE NA DIAGNOSTIKU IN VITRO. Upozornenie: Táto súprava obsahuje materiály ľudského pôvodu, ktoré boli testované a vykázali negatívnu reakciu pri testoch na prítomnosť HBsAg a pri testoch na protilátky proti HIV-1, HIV-2 a HCV pomocou metód schválených FDA. Vzhľadom na to, že žiadny diagnostický test nemôže poskytnúť úplnú istotu o neprítomnosti infekčných zložiek, je nutné zaobchádzať so všetkými materiálmi ľudského pôvodu ako s potenciálne infekčnými materiálmi. Pri práci s materiálmi ľudského pôvodu
Ref. 91078/BRD
Slovensky 4/8
musia byť dodržované všetky bezpečnostné opatrenia, ktoré sa bežne používajú v laboratórnej praxi. Bezpečnostné predpisy a ochrana zdravia 1. Nepipetujte ústami. Pri zaobchádzaní so vzorkami a uskutočňovaní testu používajte jednorázové rukavice a ochranné okuliare. Po skončení práce si dôkladne umyte ruky. 2. Nasledujúce reagencie obsahujú nízke koncentrácie škodlivých alebo dráždivých látok: a) Premývací roztok obsahuje detergenty b) Konjugát obsahuje fenol c) Substrát je kyselina d) Kalibrátory obsahujú ako konzervačné činidlo 0,09 % azidu sodného, ktorý môže reagovať s meďou a olovom v odpadovom potrubí za vzniku vysoko výbušných azidov kovov. V prípade ich vyliatia do výlevky vypláchnite laboratórne potrubie veľkým množstvom vody. V prípade kontaktu akejkoľvek reagencie s kožou alebo očami omyte postihnutú oblasť veľkým množstvom vody. 3. Zariadenia, ktoré po použití nie sú určené na likvidáciu, musia byť sterilizované. Metódou, ktorá je uprednostňovaná, je autoklávovanie po dobu jednej hodiny pri 121 °C; materiály určené na likvidáciu musia byť autoklávované alebo spálené. 4. Kyselina sírová obsiahnutá v zastavovacom roztoku a kyselina chlorovodíková používaná pri umývaní laboratórneho skla sú korozívne kyseliny, a je nutné s nimi zaobchádzať s náležitou opatrnosťou. V prípade kontaktu s kožou alebo očami dôkladne omyte zasiahnuté miesto vodou. 5. Neutralizované kyseliny a ostatný tekutý odpad musia byť dekontaminováné pridaním dostatočného množstva chlórnanu sodného tak, aby konečná koncentrácia chlórnanu sodného bola minimálne 1,0 %. Pre účinnú dekontamináciu je potrebné, aby 1% chlórnan sodný pôsobil 30 minút. 6. V prípade rozliatia je nutné potenciálne infekčný materiál ihneď odstrániť absorpčným papierom a zasiahnuté miesta sa musia pred ďalším pokračovaním v práci otrieť napríklad 1,0 % chlórnanom sodným. Pred použitím chlórnanu sodného na miestach postriekaných kyselinou je nutné zasiahnuté plochy najprv dôkladne vysušiť. Materiály použité na očistenie postriekaných miest, vrátane rukavíc, je nutné likvidovať ako potenciálne biologicky nebezpečný odpad. Materiály obsahujúce chlórnan sodný sa nesmú autoklávovať. Analytické upozornenia 1. Pred použitím nechajte všetky reagencie ustáliť na izbovú teplotu (18-30 °C). Ihneď po použití vráťte reagencie na miesto s teplotou stanovenou pre uchovávanie. Je dôležité, aby pracovný postup prebiehal pri správne teplote. Skontrolujte, či nie je v termostate teplota nižšia než 35 °C alebo vyššia než 39 °C. Sáčok so stripmi ponechajte pred otvorením najmenej ½ hodiny pri izbovej teplote. 2. Nepoužívajte preexspirované reagencie. Zabráňte mikrobiologickej kontaminácii reagencií, ktorá by mohla skrátiť životnosť výrobku a viesť ku chybným výsledkom. 3. Neupravujte pracovný postup a nepoužívajte reagencie od iných výrobcov alebo reagencie z inej šarže, pokiaľ nie je u danej reagencie uvedené, že je zameniteľná medzi rôznymi šaržami. Neskracujte žiadnu predpísanú dobu inkubácie. 4. Všetko laboratórne sklo, ktoré bude použité na reagencie, musí byť dôkladne umyté 2 M kyselinou chlorovodíkovou a potom vypláchnuté destilovanou vodou alebo vysoko kvalitnou deionizovanou vodou. 5. Počas uchovávania a v priebehu inkubačných krokov nevystavujte reagencie pôsobeniu silného svetla alebo výparom chlórnanu. 6. Jednotlivé jamky nesmú počas uskutočňovania testu vyschnúť. 7. Dbajte na to, aby nedošlo ku skríženej kontaminácii reagencií. Je dôležité, aby pre rôzne reagencie boli vyhradené pipety na výlučné použitie. 8. Dbajte na to, aby nedošlo ku kontaminácii alebo preliatiu okraja jamiek konjugátom. Neodstraňujte ho z platničky fúkaním. 9. Pri enzýmovej imunoanalýze môže príležitostne dochádzať k „okrajovému efektu“, ktorý je nutné minimalizovať zvýšením vlhkosti v priebehu inkubácie. Platničky musia byť zakryté viečkom a inkubované pri 37 °C buď vo vodnom kúpeli so stojanom alebo plavákom slúžiacim v prípade potreby na stabilizáciu platničky alebo v inkubátore. Alternatívne je možné platničky inkubovať v schválenom analyzátore. V prípade záujmu o podrobnejšie informácie si prečítajte príslušný návod na použitie. CO2 inkubátory sa používať nesmú. 10. Dbajte na to, aby bolo dno platničky čisté a suché a aby pred meraním platničky neboli na povrchu kvapaliny prítomné žiadne vzduchové bubliny. 11. Použitie silno hemolyzovaných vzoriek, neúplne zrazeného séra alebo vzoriek s mikrobiologickou kontamináciou môže viesť ku chybným výsledkom.
Ref. 91078/BRD
Slovensky 5/8
12. Ku každému používanému nástroju si dôkladne prečítajte návod na použitie daného výrobcu, ktorý vám poskytne doplňujúce informácie o nasledujúcich bodoch: - inštalácia a špecifické potreby - zásady, pokyny, upozornenia a riziká súvisiace s použitím - špecifikácia výrobcu a účinnosť prístrojov - servis a údržba. 7. TYP A UCHOVÁVANIE VZORKY Ako vzorka sa používa sérum odobraté bežným spôsobom zo žily a spracované za dodržania všetkých pravidiel, ktoré vyžaduje správna laboratórna prax. Čerstvé sérum môže byť uchovávaní po dobu až 4 dní pri 2/8 °C alebo zamrazené po dlhšiu dobu pri –20 °C, pričom môže byť zmrazené a rozmrazené maximálne 3 krát. Rozmrazené vzorky je nutné pred použitím dôkladne pretrepať. Kvalita vzoriek môže byť významne ovplyvnená mikrobiálnou kontamináciou, ktorá vedie ku chybným výsledkom. Nesmú sa používať silno hemolyzované, lipemické, ikterické alebo kontaminované vzorky. Test nie je možné robiť s ľudskou plazmou. 8. PRACOVNÝ POSTUP Pripravte si požadovaný počet stripov. Pripravte premývací roztok o pracovnej koncentrácii nariedením 10x koncentrovaného premývacieho roztoku (100 ml + 900 ml H2O). Narieďte vzorky v pomere 1:101 pridaním 10 µl séra do 1 ml riediaceho roztoku; do jednotlivých jamiek napipetujte po 100 µl každého riedenia vzorky (doporučuje sa testovať vzorky dvojmo). Do jedného stripu napipetujte NERIEDENÉ kontroly (100 µl do každej jamky). Minimálna požiadavka je 1 negatívna kontrola, 2 cut-off a 1 pozitívna kontrola. Ponechajte jednu jamku pre slepý pokus, tvorený 100 µl substrátového roztoku. Jamky prelepte ochrannou fóliou a inkubujte 45 minút pri 37 °C. Po premytí 4x po dobu 30 sekúnd (300 µl), napipetujte do každej jamky okrem blanku 100 µl konjugátu, prelepte jamky ochrannou fóliou a inkubujte znovu po dobu 45 minút pri 37 °C. Platničky znovu 4 krát premyte podľa vyššie uvedeného postupu. Nakoniec napipetujte do každej jamky 100 µl substrátu. Po 15 minútach pri izbovej teplote zastavte enzymatickú reakciu pridaním 100 µl zastavovacieho roztoku. Absorbancia (OD) sa odčíta do 30 minút pri 450 nm alebo pri 450/620 nm. ® 9. Schéma pracovného postupu pre súpravu Platelia VZV IgG
Manuálna technika KROK 1
Do jednotlivých jamiek stripov napipetujte po 100 µl nariedenej vzorky alebo kontroly Inkubujte 45 minút pri 37 °C Premyte 4krát (30“ soak time; 300 µl)
KROK 2
Do každej jamky okrem blanku napipetujte 100 µl konjugátu Inkubujte 45 minút pri 37 °C Premyte 4 x (30“ soak time; 300 µl)
KROK 3
Do každej jamky napipetujte 100 µl substrátu Inkubujte 15 minút pri izbovej teplote
KROK 4
Pridajte 100 µl zastavovacieho roztoku Do 30 minút zmerajte absorbanciu pri 450 nm.
10. VALIDÁCIA TESTU Odčítajte hodnotu slepej vzorky (≤ 0,150) od všetkých ostatných hodnôt. Ak sa vzorky testujú trojmo, musia sa hodnoty OD kontrolného cut-off séra pohybovať v rozmedzí do 25 % priemernej hodnoty. Vypustite
Ref. 91078/BRD
Slovensky 6/8
všetky abnormálne hodnoty a znovu vypočítajte priemer. OD pozitívnej kontroly musí byť minimálne 1,5 krát vyššia než u cut-off. Pomer medzi negatívnou kontrolou a cut-off musí byť menší než 0,6. Hodnota OD cut-off musí byť ≥ 0,2 pri 450 nm a ≥ 0,16 pri 450/620 nm. 11. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Kvalitatívne výsledky Ak je OD vzorky vyššia než cut-off, vzorka je pozitívna na prítomnosť špecifických IgG. Vypočítajte pomer medzi hodnotou OD vzorky a hodnotou cut-off. Vzorka sa bude hodnotiť ako: Pozitívna: pokiaľ je pomer > 1,2 Nejasná: ± 20 % hodnoty cut-off Negatívna: pokiaľ je pomer < 0,8 V prípade, že je výsledok nejasný, testujte znova. Pokiaľ pochybnosti pretrvávajú, odoberte novú vzorku krvi. 12. OBMEDZENIA TESTU Vzorka séra získaná v priebehu akútnej fázy infekcie, kedy sú prítomné len protilátky triedy IgM, môže byť v tomto teste negatívna. Hladina protilátok IgM proti Varicella Zoster musia byť stanovené pomocou súpravy Platelia® VZV IgM. Alternatívne je možné paralelne otestovať druhú vzorku séra, odobratú približne o 8-14 dní neskôr, na stanovenie nárastu hladín protilátok triedy IgG. Výsledok testu sa musí posudzovať v kombinácii s informáciami získanými vyhodnotením ostatných diagnostických postupov. 13. ANALYTICKÁ ŠPECIFICITA Prítomnosť IgG protilátok proti takým vírusom ako sú Epstein Barr, Herpes simplex, Mumps a osýpky nemá vplyv na výsledky testu. 14. CITLIVOSŤ A ŠPECIFICITA V klinickom štúdii uskutočnenej v nemocničnom laboratóriu bolo analyzovaných 47 vzoriek v porovnaní s inými komerčne dostupnými imunoenzymatickými metódami. Také vzorky, ktoré boli v nesúlade medzi dvoma metódami, boli otestované IFA metódou, považovanou za referenčnú. Výsledky sú zhrnuté nasledovne: Referenčná hodnota + 29 0 3 15
+ Platelia® VZV IgG -
Citlivosť metódy je 90,63 % a špecificita je 100 %. 15. PRESNOSŤ Opakovateľnosť na 3 rôznych šaržiach: Cut Off n=21
Šarža 029
Šarža 030
Šarža 031
O.D.
0,451
0,457
0,362
CV %
10
7
5
Ref. 91078/BRD
Slovensky 7/8
Reprodukovateľnosť: INDEX Vzorka
Šarža 029
Šarža 030
Šarža 031
Priemer
CV%
1
0,3
0,4
0,3
0,3
23
2
1,5
1,0
1,7
1,7
10
3
3,0
3,0
3,1
3,1
5
16. POMÔCKA NA RIEŠENIE PROBLÉMOV PROBLÉM Neplatný test (všetko negatívne)
Neplatný test (všetko pozitívne). Zlá presnosť
MOŽNÝ ZDROJ Vynechanie jednej reagencie či viacerých reagencií alebo pridanie jednej reagencie či viacerých reagencií v zlom poradí. Platnička nevykazuje reakciu.
Kontaminácia substrátu. Nedostatočné premytie. Neúplne premytie jamiek. Nedostatočné odsatie jamiek. Chyba pri pipetovaní. Príliš pomalé napipetovanie reagencie. Prítomnosť bublín. Znečistenie optickej dráhy.
Neadekvátne vyvíjanie farby
Nesprávna doba inkubácie alebo teplota. Pridanie nesprávneho objemu substrátu na platničku
KONTROLA ALEBO NÁPRAVNÁ AKCIA Skontrolujte pracovný postup Skontrolujte nepoužité roztoky. Zopakujte test. Skontrolujte kód na obale použitej platničky (informácie o správnom kódovom označení sú uvedené v bode 4 príbalového letáku). Skontrolujte vlhkosť nepoužitej platničky (silikagélový absorbent musí byť svetložltý). Zopakujte test. Použite novú alikvotnú časť substrátu. Skontrolujte, či správne funguje premývačka. Skontrolujte, či správne funguje premývačka. Skontrolujte, či správne funguje premývačka. Skontrolujte funkciu pipety. Zabráňte vyschnutiu platničky po premývacom kroku. Reagencie pridajte ihneď. Zabráňte vzniku vzduchových bublín pri pipetovaní. Skontrolujte, či nie je znečistený svetelný zdroj alebo detektor prístroja. Otrite spodnú časť platničky mäkkou tkaninou. Skontrolujte zariadenie na reguláciu teploty a meranie času. Presne dodržte doporučený návod na použitie. Skontrolujte funkciu pipety.
17. LITERATÚRA Viď anglickú verziu.
05/2012
Ref. 91078/BRD
Slovensky 8/8
