Immunológia – II GY 1. Bevezetés
2016. febr. 9. Bajtay Zsuzsa
• Oktatók: Bajtay Zsuzsa, Sándor Noémi • Tankönyv: Immunológiai módszerek szerkesztette: Erdei Anna (Medicina, 2006) • Immunológia – II Gy tárgyra épül: Laboratóriumi gyakorlatok: - Immunológia Gyakorlatok I. (bb2n4m02) - Immunológiai Gyakorlatok II. (bb2n4m05)
• Letölthető tananyag: http:/immunológia.elte.hu
Immunológia II. Módszerek tematika 1.
2016. 02. 09.
Bevezető előadás. Az immunrendszer elemeinek áttekintése. Kísérleti állatok tartása, kezelése. Beltenyésztett törzsek. Állatmodellek. KO, Tg állatok.
2.
2016. 02. 16.
Antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló módszerek II. A kapcsolódást követő másodlagos reakciókon alapuló módszerek (precipitáció, agglutináció, komplement mediált lízis). A komplement rendszer vizsgálata.
3.
2016. 02. 23.
Ellenanyag-reagensek előállítása I. Immunizálás, poliklonális és monoklonális ellenanyag-reagensek előállítása, az ellenanyagok tisztítása, fragmentálása és jelölése.
4.
2016. 03. 01.
Ellenanyag-reagensek előállítása II. Molekuláris biológiai módszerekkel módosított ellenanyagok.
5.
2016. 03. 08.
Antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló módszerek I. A kapcsolódás kimutatásán alapuló (jelöléses) módszerek (ELISA, Western blot, immunprecipitáció).
2015. 03. 15. 6.
2016. 03. 22.
Sejtanalitikai módszerek (FACS, FM, CLSM). Membránfehérjék kölcsönhatásainak vizsgálata.
2016. 03. 29.
Tavaszi szünet
7.
2016. 04. 05.
Sterilitás, in vitro sejttenyésztés, sejtvonalak. Az immunrendszer sejtjeinek izolálása, azonosítása és funkcionális vizsgálata I. T limfociták
8.
2016. 04. 12.
Az immunrendszer sejtjeinek izolálása, azonosítása és funkcionális vizsgálata II. B limfociták
9.
2016. 04. 19.
Az immunrendszer sejtjeinek izolálása, azonosítása és funkcionális vizsgálata III. Monociták, makrofágok, dendritikus sejtek
11.
2016. 04. 26.
Beszámoló ZH
12.
2016. 05. 03.
Javító ZH
Bev. 1. ábra Immunhomeosztázis
3.25. ábra Elsődleges és másodlagos nyirokszervek
3.3. ábra Hemopoézis
Bev. 2. ábra Az immunválasz kialakulása
1.3. ábra A veleszületett és az adaptív immunrendszer receptorainak jellemzői
3.5. ábra Mintázat-felismerő és fagocitótikus receptorok kifejeződése fagocitákon
2.1. ábra Az antigének felépítése
2.2. ábra Antigén-determinánsok
10.1. Az immunglobulin-szupercsalád
10.17. A monovalens TCR és a bivalens BCR antigén-felismerő tulajdonságai
A nagy mértékű variabilitás az antigének sokféleségének felismerésére, a TCR-gének, Ig-gének szomatikus rekombinációja, szomatikus mutációja etc. kizárólag a magasabbrendű gerincesek limfocitáiban
12.1. ábra Az endogén és az exogén fehérjék bemutatása eltérő funkciójú T-limfocitáknak
11.15. Az immunglobulin nehéz- és könnyűláncát kódoló gének rekombinációja és expressziója
1.9. ábra Klónszelekció
A sejtaktiváció folyamatainak időbeni megjelenése
3.22. B limfociták membránfehérjéi és funkcióik
10.4. Az Ig molekula általános szerkezeti felépítése
- kb.160 Kd-os glikoprotein - 2 könnyű lánc (L light chain) - 2 nehéz lánc (H heavy chain) diszulfid hidakkal és nem-kovalens kötésekkel összekötve - domén szerkezet: Ig domén
10.3. Humán immunglobulinok
Antitest, ellenanyag, immunglobulin (Ig)
14.15. Az ellenanyag közvetített effektor funkciók
IMMUNKOMPETENS SEJTEK IZOLÁLÁSA
Primer sejtek (állati, emberi): - lép - tímusz - csontvelő - nyirokcsomó - hasüreg - vér Vér - vérplazma ( alakos elemek ) - eritrociták - trombociták - leukociták - granulociták - neutrofil - bazofil - eozinofil - limfociták - monociták Sejtvonalak: Korlátlanul osztódó állati és humán eredetű sejtek
1. Primer sejttenyészet közvetlenül élőlényből származó
2. Sejtvonal tumoros transzformáció eredménye (in vitro v. in vivo)
3. Klón in vitro aktivációt követően többszöri klónozással létrehozott, újra és újra aktivációt ill. növekedési faktorokat igényelhet
4. Hibridóma immortalizált sejtvonallal történő in vitro hibridizáció eredménye (nem diploid)
Sejtek izolálása egérből
tímusz lép
- vvs mentesítés
csontvelő
- szervek dezintegrálása
a sejtek festése, számolása: tripán kék – életképesség Elpusztult sejt
kristályibolya - magfestés élő sejtek
limfocita
monocita
granulocita
Kísérleti állatok tartása és kezelése
- Az állatkísérletek indoklása Állatvédelmi törvény XXVIII. tv (1998) / munkavédelmi előírások / etikai szempontok -Emberi-, állati sejtek használata kutatási pályázathoz: Egészségügyi Tudományos Tanács, Tudományos és Kutatásetikai Bizottság engedélyével
Kísérleti állatok tartása
• alom • táplálék / ivóvíz • állatorvosi kontrol • eredet / karantén • a tartás körülményei / az állatház besorolása (konvencionális, spf, steril (mikroizolátor) • a tenyésztés feltételei (egér- és patkánytörzsek / speciális genetikai háttér • állatszám / ketrec állatfaj
helyigény
hőmérséklet / oC
páratartalom /%
alapterület / cm2
magasság / cm
egér
50 – 70
12
18 - 26
40 - 70
patkány
150 – 300
18
18 - 26
40 - 70
hörcsög
80 – 100
15
18 - 26
40 - 70
nyúl
0,3 – 0,4 (m2)
35
16 - 21
40 - 60
1.3. táblázat Laboratóriumi kisállatok immunizálási módjai a beadás módja
tengerimalac
egér
patkány
hörcsög
nyúl
hátsó-comb v. hátizom 0,05
hátsó-comb v. hátizom 0,3
hátsó-comb v. hátizom 0,1
hátsó-comb v. hátizom 0,3
hátsó-comb v. hátizom 0,5-1,0
farokvéna
farokvéna
nyakivéna
nyakivéna
fülvéna
0,1-0,2
0,5
0,3
0,5
1,0-5,0
hasüreg
hasüreg
hasüreg
hasüreg
hasüreg
0,5-2,5
5,0-10,0
2,0-4,0
5,0-10,0
5,0-20,0
hátsótalppárnák 0,05
hátsótalppárnák 0,05
hátsótalppárnák 0,05
hátsótalppárnák 0,05
hátsótalppárnák 0,1
háton
háton
háton
háton
háton
0,05
0,05
0,05
0,05
0,1
háton
háton
háton
háton
háton
i.m.
helye
i.v.
mennyisége /ml helye
i.p.
mennyisége /ml helye
f.p.
mennyisége /ml helye
i.d.
mennyisége /ml helye
s.c.
mennyisége /ml helye
0,5-2,5
5,0-10,0
3,0-4,0
5,0-10,0
5,0-10,0
p.o.
mennyisége /ml helye
szájba
-
-
-
-
0,05-0,2
-
-
-
-
i.n.
mennyisége /ml helye
orrüreg
-
-
-
-
0,05
-
-
-
-
c.s.
mennyisége /ml helye
talp, fűl, has bőre 0,05-0,2
-
-
-
-
-
-
-
-
mennyisége /ml
1.4. táblázat Szérumminták vétele kisállatokból
a vérminta vételének helye
a vérminta mennyisége/ml
egér
szemzug vénás plexus, farokvéna vagy szívpunkció
0,3
patkány
szemzug vénás plexus, farokvéna vagy szívpunkció
2,5
hörcsög tengerimalac
nyúl
szemzug vénás plexus vagy szívpunkció
0,5
szívpunkció
2,0
fülvéna vagy szívpunkció
50
Néhány egértörzs genetikai jellemzői
alaptörzsek
kongenikus törzsek
rekombináns törzsek
egértörzs
szőrszín
H-2 haplotípus
Igh-C haplotípus
CD90 / Thy-1
CD5 / Ly-1
CD8 / Ly-2
CD45 / Ly-5
CD44 / Ly-24
AKR/J
albino
k
d
1
2
1
2
2 lo
BALB/c
albino
d
a
2
2
2
2
1 hi
CBA/J
agouti
k
j
2
1
2
2
1 hi
C57BL/10
fekete
b
b
2
2
2
2
2 lo
C3H/HeJ
agouti
k
j
2
1
1
2
2 lo
DBA/2
világos barna
d
c
2
1
1
2
1 hi
SJL
albino
s
b
2
2
2
1
2 lo
BALB.B
albino
b
a
2
2
2
BALB.K
albino
k
a
2
2
2
B10.BR
fekete
k
b
2
2
2
B10.D2
fekete
d
b
2
2
2
C3H.SW
agouti
b
j
2
1
1
B10.A
fekete
a
b
B10.A (1R)
fekete
h1
b
B10.A (2R)
fekete
h2
b
Állatmodellek
Immunhiányos egerek
név
genetikai háttér
defektus
beige
C57BL/6
NK-sejt hiány
Motheaten
C57BL/6J
B2-sejt hiány
Nude
outbred
tímusz hiány
scid
CB.17
T-és B-sejt hiány
xid
CBA/N
a humorális immunválasz zavara
KO (knock out ) / génkiütött állat és Tg / transzgenikus állat
Autoimmun törzsek és modellek
név
betegség modell
NOD (Non-obese diabetic)
IDDM (insulin dependent diabetes mellitus)
lpr (lymphoproliferative) - Fas gld (generalized lymphadenopathy) - FasL
SLE (systemic lupus erythematosus)
NZB (New Zeland Black)
SLE (systemic lupus erythematosus)
BXSB (C57BL/10, satin beige)
SLE (systemic lupus erythematosus)
EAE (experimental autoimmun encephalitis)
indukált
CIA (collagen induced arthritis)
indukált
Egér modellek különböző fertőzések és különböző tumorok tanulmányozásához
Mennyi sejt várható egy egérből? Frissen szeparált sejtek CBA, BALB/C T B DBA/2 T B B6, B10 T B
2-3 napig in vitro aktivált/antigén specifikus (poliklonális x5-10)
Lép
50-100 x 106
1-5 x 106
Lép B
20-50 x 106
1 x 106
Lép T
10-20 x 106
1 x 106
Nyirokcsomó
20-50 x 106
0,5–2 x 106
Nyirokcsomó B
1-5 x 106
0,3–0,5 x 106
Nyirokcsomó T
2-5 x 106
0,1-1 x 106
Peritóneum
1-2 x 106
Timusz
20-50 x 106
Csontvelő
5-20 x 106
Sejtfunkciók vizsgálata
sejtek
funkciók
B-limfociták
proliferáció ellenanyag termelés
T-limfociták
proliferáció citokin termelés citotoxicitás
makrofágok
citokin termelés fagocita képesség kemotaxis
dendritikus sejtek
citokin termelés fagocita képesség antigén prezentáló képesség
