III. MATERI DAN METODE PENELITIAN 1. Bagan Alir Penelitian
Isolat Azospirillum spp. penambat N2 bebas Asal Rizosfer Pasir Besi
Pembuatan inokulum isolat
Karakterisasi Isolat Sebagai Kandidat PGPR
Uji Pelarutan Fosfat
Uji Kemampuan Hormon Tumbuh IAA
Penghasil Siderofor
Uji Antagonisme
Uji ACC Deaminase
Uji viabilitas biji Jagung (Zea mays L.)
Persentase viabilitas biji
Seedling Bioassay Benih Jagung (Zea mays L.)
Parameter : Tinggi tanaman Panjang akar terpanjang Berat basah tanaman Berat kering tanaman Kandungan Klorofil Daun
bio.unsoed.ac.id
6
2. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 2.1 Materi Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain isolat Azospirillum spp. KR33 (asal rizosfer tumbuhan Calotropis gigantean (L.) R.Br.), HR92 (asal rizosfer tumbuhan Tilia cordifolia), HR124 (asal rizosfer tumbuhan Richardia scabra L.), HR141 (asal rizosfer tumbuhan Alysicarpus monilifer (L.) DC.), HR152, dan HR154 (asal rizosfer tumbuhan Ipomoea pres-caprae (L.) R.Br.). Pasir besi dari pantai Jetis, biji jagung, medium selektif Caceres, medium Pikovskaya, medium Chrome Azurol Sulfate (CAS), medium Nutrient Agar (OXOID, Difco), medium Nutrient Broth (OXOID, Difco), medium PDA (Difco), medium Dworkin-Foster Salt, medium Iron Free Succinate, larutan fisiologis Hoagland,
reagen
Salkowski,
reagen
Choloromolybdic
acid,
reagen
Chlorostannous, substrat ACC, substrat L-triptofan, Indole-3-Acetic Acid, NaOCl 5,5%, alkohol 96%, alkohol 70%, methanol, etil asetat, ethanol absolut, HCl 1 N, NaOH 2 N, akuades, dan spiritus Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain laminar air flow, autoklaf, HPLC (High Pressure Liquid Chromatography), inkubator, shaker incubator, orbital shaker, pH meter, microcentrifuge, spektrofotometer UV-Vis, digital light meter, mikropipet dan tip, cawan Petri, labu Erlenmeyer, botol Schott Duran, tabung gelas ukuran 3x20 cm, tabung reaksi, inkubator, jarum inokulum, milipore 0,22 µm, syringe, timbangan analitik, cuvette, vortex, tabung Eppendorf, pinset, gelas ukur, Beaker Glass, kertas saring, pembakar spiritus, plastik wrapper, aluminium foil, pipet tetes, kapas, tissue, kertas label, alat tulis, penggaris, dan camera digital
2.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
bio.unsoed.ac.id
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman dan Laboratorium Ekologi-Fisiologi, Pusat Penelitian Biologi bidang Mikrobiologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor selama 5 bulan (September - Januari 2014).
7
3. Metode Penelitian 3.1 Metode Percobaan Penelitian dilakukan secara deskriptif untuk mengetahui karakter fisiologis Azospirillum
spp. asal rizosfer tumbuhan pasir besi yang memiliki potensi
sebagai isolat PGPR. Karakter fisiologis yang diamati yaitu pengamatan kemampuan pelarutan fosfat, kemampuan penghasilan hormon tumbuh IAA, produksi siderofor, produksi ACC Deaminase, dan uji antagonis terhadap beberapa jamur patogen. Penelitian secara eksperimental dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dilakukan untuk mengetahui potensi isolat Azospirillum spp. dalam meningkatkan perkecambahan dan pertumbuhan vegetatif tanaman jagung (Zea mays L.). Perlakuan untuk percobaan tersebut terdiri dari 7 perlakuan yaitu, kontrol tanpa penggunaan isolat Azospirillum spp., dan enam perlakuan penambahan isolat Azospirillum spp. dan masing-masing perlakuan akan diulang sebanyak 3 kali sehingga terdapat 21 unit percobaan, yaitu : K
: perlakuan kontrol (tanpa inokulasi isolat Azospirillum spp.)
A
: perlakuan menggunakan isolat Azospirillum sp. HR154
B
: perlakuan menggunakan isolat Azospirillum sp. KR33
C
: perlakuan menggunakan isolat Azospirillum sp. HR92
D
: perlakuan menggunakan isolat Azospirillum sp. HR141
E
: perlakuan menggunakan isolat Azospirillum sp. HR124
F
: perlakuan menggunakan isolat Azospirillum sp. HR152
Setiap unit percobaan ini digunakan dalam uji viabilitas perkecambahan dan seedling bioassay tanaman jagung. Percobaan menggunakan metode Axenic Sand Culture Assay (Oedjijono et al., 1996; Hussain et al., 2013) dengan modifikasi pada medium pasir besi steril.
3.2 Variabel Penelitian
bio.unsoed.ac.id
Variabel yang diamati pada penelitian ini terdiri atas variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas yang diamati adalah jenis isolat Azospirillum spp. asal lahan pasir besi sedangkan variabel tergantung yang diamati adalah viabilitas kecambah untuk percobaan pengaruh isolat Azospirillum spp. terhadap perkecambahan biji dan pertumbuhan bibit tanaman jagung untuk percobaan pengaruh isolat Azospirillum spp. terhadap pertumbuhan vegetatif tanaman jagung.
Untuk
percobaan
pengaruh 8
isolat
Azospirillum
spp.
terhadap
perkecambahan biji, parameter yang akan diamati adalah jumlah biji yang berkecambah sedangkan untuk
percobaan pengaruh isolat Azospirillum spp.
terhadap pertumbuhan vegetatif tanaman jagung adalah tinggi tanaman, panjang akar tanaman, bobot basah dan kering tanaman, kandungan klorofil daun, dan populasi bakteri pada akar tanaman.
3.3 Cara Kerja 3.3.1 Sterilisasi Alat dan Bahan (Volk dan Wheeler, 1988) Alat-alat yang terbuat dari bahan gelas dan medium yang tahan panas dimasukkan ke dalam autoklaf. Alat dan bahan disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15-20 menit. Tahap I : Subkultur dan Pengukuran Kurva Pertumbuhan Isolat Azospirillum spp. asal pasir besi 3.3.2 Subkultur isolat Azospirillum spp. asal pasir besi Sebanyak enam isolat (KR33, HR92, HR124, HR141, HR152, dan HR154) koleksi kultur Azospirillum spp. dipilih yang berkemampuan penambatan nitrogen tinggi berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Oedjijono et al., (2014). Koleksi kultur induk isolat Azospirillum spp. yang disimpan dalam Eppendorf diambil sebanyak satu ose dan diinokulasikan secara aseptis ke dalam 5 ml medium Nutrient Broth. Kultur diinkubasi pada suhu 33oC selama 24 jam. Kultur yang tumbuh kemudian digoreskan pada medium Caceres (Lampiran 2.B) untuk mengamati koloni Azospirillum spp. lalu diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama.
3.3.3 Pembuatan Inokulum Isolat Pembuatan inokulum isolat ditujukan untuk mengetahui jumlah populasi sel hingga mencapai jumlah kepadatan sel hingga 108. Kultur Azospirillum spp. ditumbuhkan
bio.unsoed.ac.id
pada medium Nutrient Agar selama 24 jam. Kultur tersebut kemudian dilarutkan dalam 5 ml larutan NaCl fisiologis 0,9% dengan cara scrapping menggunakan jarum ose lalu dihomogenkan
dengan menggunakan vortex. Setelah homogen,
larutan NaCl berisi kultur bakteri tersebut dipindahkan dalam 25 ml larutan NaCl fisiologis 0,9% dalam labu Erlenmeyer 100 ml, diukur kepadatan sel menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Untuk mengetahui total populasi bakteri dilakukan penanaman pada medium Nutrient Agar. Sebanyak 1 ml 9
larutan NaCl fisiologis 0,9% berisi kultur bakteri dilarutkan dalam 9 ml akuades steril dan dilakukan seri pengenceran bertingkat hingga mencapai pengenceran 10-8 kemudian dua pengenceran terakhir ditanam pada medium Nutrient Agar dengan metode agar tuang (PP) lalu diinkubasi pada suhu ruang. Koloni yang tumbuh kemudian dihitung untuk mendapatkan jumlah total bakteri. Angka absorbansi kultur yang jumlah koloni bakteri mencapai 108 dijadikan patokan dalam membuat inokulum selanjutnya.
Tahap II : Karakterisasi Kemampuan Fisiologis PGPR Isolat Azospirillum spp. asal lahan pasir besi 3.3.4 Uji Kemampuan Pelarutan Fosfat Isolat Azospirillum spp. asal lahan pasir besi pada medium Pikovskaya Agar Sebanyak satu ose kultur padat isolat Azospirillum spp. diinokulasikan secara aseptis dengan metode spot inoculation pada cawan Petri berisi medium Pikovskaya Agar (Lampiran 2.C). Inokulasi dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan pada tiap cawan. Cawan yang telah diinokulasi kultur, diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Zona jernih yang muncul di sekitar koloni yang tumbuh diamati. Kemampuan pelarutan fosfat (IP) diukur berdasarkan rumus (Oedjijono et al., 2014) :
3.3.5 Estimasi Fosfat Anorganik Terlarut Isolat Azospirillum spp. asal rizosfer lahan pasir besi (Modifikasi Ahmad et al., 2008) Sebanyak 4% inokulum dengan kepadatan seragam (OD600=0,600-0,650) isolat Azospirillum spp. diinokulasikan pada 50 ml medium Pikovskaya Broth dalam Erlenmeyer 100 ml. Inkubasi pada shaker orbital pada kecepatan 150 rpm selama 7 hari. Untuk perlakuan kontrol diinokulasikan dengan NaCl fisiologis 0,9% steril.
bio.unsoed.ac.id
Setelah 7 hari inkubasi, kultur diambil, untuk pengukuran fosfat anorganik terlarut, sebanyak 10 ml kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman no.41 untuk memisahkan sisa Ca3(PO4)2 yang masih terbawa. Hasil saringan kemudian disentrifus pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit. Sebanyak 1 ml supernatan dimasukkan dalam labu takar 50 ml kemudian ditambahkan dengan 10 ml reagen Chloromolybdic acid (Lampiran 3.B) dikocok hingga homogen kemudian ditambahkan dengan 100 µl reagen Chlorostannous (Lampiran 3.C) lalu dikocok 10
hingga homogen kemudian ditambahkan dengan akuades hingga volume mencapai 50 ml. Tunggu selama 10 menit kemudian diukur absorbansi sampel pada panjang gelombang 600 nm. Absorbansi kemudian dimasukkan dalam persamaan regresi linier kurva standar fosfat (Lampiran 5) sehingga akan didapatkan jumlah fosfat anorganik terlarut, pH medium diukur pada awal dan akhir masa inkubasi. Untuk mengetahui populasi total bakteri pelarut fosfat dilakukan TPC pada medium Pikovskaya Agar dan diinkubasi selama 3-7 hari. Hitung jumlah koloni yang menghasilkan zona jernih di sekitar koloni. 3.3.6 Uji Kemampuan Produksi Hormon Tumbuh IAA Isolat Azospirillum spp. asal rizosfer lahan pasir besi (Modifikasi Patten dan Glick, 2002) Sebanyak 0,5 ml inokulum cair kultur Azospirillum spp. dengan kepadatan sel 108 CFU’s/ml diinokulasikan pada 25 ml medium Nutrient Broth Half-Strength yang telah ditambahkan substrat L-Triptofan dengan konsentrasi 100 mg/L dalam labu Erlenmeyer 50 ml yang telah ditutupi plastik hitam. Kultur diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang. Pengukuran IAA dilakukan pada jam ke-0, 24, 48, dan 72. Sebanyak 4 ml kultur diambil secara aseptis dan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf kemudian dipisahkan filtrat dengan supernatannya menggunakan microcentrifuge pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambahkan dengan 1 ml reagen Salkowski (Lampiran 3.A) kemudian diinkubasi pada ruang gelap selama 30 menit, dilakukan sebanyak dua kali pengulangan. Setelah diinkubasi, supernatan diukur nilai absorbansinya menggunakan UV-Vis Spektofotometer dengan panjang gelombang 530 nm. Hasil absorbansi dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar IAA (Lampiran 4.A)
3.3.7. Analisa Kandungan IAA menggunakan HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
bio.unsoed.ac.id
Sebanyak 3 ml supernatan kultur dari percobaan 3.3.6 diatur derajat keasamannya hingga menjadi 2,8. Supernatan kemudian diekstrak sebanyak 3 kali menggunakan etil asetat dengan volume yang sama dengan jumlah sampel (v/v). Pelarut kemudian diuapkan menggunakan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kering. Ekstrak dibilas dengan ethanol absolute hingga didapatkan volume sebanyak 1 ml. Sampel kemudian disaring menggunakan milipore PTFE 0,2 µm lalu ditempatkan 11
pda vial HPLC. Sampel diinjeksikan pada HPLC (Shimadzu) dengan kolom C18 (Supelco). Fase gerak menggunakan 70% (akuabides : asam asetat; 99:1) dan 30% (methanol : asam asetat; 99:1) (v/v) dengan flow rate 1ml/min pada panjang gelombang 280 nm. Tunggu hingga terbentuk peak chromatogram pada layar. Luas area peak chromatogram dibandingkan dengan persamaan regresi linier kurva standar IAA sintetik (Lampiran 4.B). 3.3.8 Uji Kualitatif Kemampuan Produksi Siderofor Isolat Azospirillum spp. asal rizosfer lahan pasir besi (Schwyn dan Neilands, 1987; Louden et al., 2011) Sebanyak satu ose kultur padat isolat Azospirillum spp. diinokulasikan secara aseptis dengan cara digoreskan pada cawan Petri berisi medium Chrome Azurol Sulfate (Lampiran 2.F). Kultur diinkubasi pada suhu ruang dan diamati tiap hari. Isolat yang mampu menghasilkan siderofor ditandai dengan terbentuknya warna orange di sekitar koloni yang tumbuh.
3.3.9 Pengukuran Estimasi Siderofor Unit Isolat Azospirillum spp. asal rizosfer lahan pasir besi (Modifikasi Schwyn dan Neilands, 1987) Sebanyak satu ose kultur diinokulasikan pada 5 ml medium Succinate Iron Free (Lampiran 2.G) kemudian diinkubasi pada shaker waterbath incubator selama 48 jam pada kecepatan 125 rpm. Setelah inkubasi inokulasikan sebanyak 1% volume kultur ke dalam 30 ml medium Succinate Iron Free dan inkubasi pada shaker orbital dengan kecepatan 125 rpm dan diinkubasi selama 48 jam. Sebanyak 2 ml kultur disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit kemudian 0,5 ml supernatan ditambahkan dengan 0,5 ml Blue Dye CAS (Lampiran 2.F) divortex kemudian ukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang 630 nm. Untuk blanko digunakan medium Sucinnate Iron Free tanpa penambahan isolat. Jumlah siderofor unit dihitung dengan rumus sebagai berikut :
bio.unsoed.ac.id
( )
(
)
12
3.3.10 Uji Kualitatif Kemampuan Produksi ACC Deaminase Isolat Azospirillum spp. asal rizosfer lahan pasir besi (Modifikasi Penrose dan Glick, 2003; Husen at al., 2009) Sebanyak satu ose kultur padat isolat Azospirillum spp. digoreskan pada medium DF Salt (Dworkin-Foster Salt) yang telah ditambahkan dengan 3 mM ACC (1aminocylopropane-1-carboxylic acid) sebagai sumber nitrogen. Sebelumnya dibuat larutan induk ACC sebanyak 0,5 M dengan cara melarutkan 0,1 g ACC ke dalam 1,987 ml akuades steril kemudian disterilisasi dengan menggunakan milipore berukuran 0,22 µm dan disimpan pada kulkas bersuhu -20oC. Medium yang telah diinokulasi oleh isolat diamati tiap hari dan dibandingkan dengan perlakuan kontrol negatif (medium DF Salt tanpa N) dan perlakuan kontrol positif (medium DF dengan Ammonium Sulfate). Suatu isolat mampu menghasilkan enzim ACC Deaminase apabila isolat tersebut mampu tumbuh pada medium dengan ACC dan Ammonium Sulfate namun tidak mampu tumbuh pada medium DF tanpa N.
3.3.11 Uji Kemampuan Antagonisme Isolat Azospirillum lahan pasir besi
spp. asal rizosfer
Uji kemampuan antagonisme isolat Azospirillum spp terhadap fungi patogen menggunakan metode dual culture test. Kultur padat isolat Azospirillum spp. diinokulasikan dengan cara digoreskan sepanjang 3 cm pada satu bagian medium PDA dan
di seberangnya diinokulasi dengan satu plug isolat fungi patogen
Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Cercospora sp., dan Aspergillus sp. Inkubasi pada suhu ruang hingga miselium jamur menutupi seluruh permukaan cawan. Batas yang terbentuk antara pertumbuhan isolat Azospirillum spp. dan fungi patogen uji diindikasikan sebagai aktivitas antagonisme oleh Azospirillum spp. aktivitas antagonisme diamati dan diukur. Persentase nilai penghambatan diukur menggunakan rumus yang dipaparkan oleh Kumar et al. (2002) yaitu:
bio.unsoed.ac.id (
)
13
Tahap III : Uji perkecambahan dan Seedling Bioassay tanaman Jagung (Zea mays L.) 3.3.12 Uji Perkecambahan Biji Jagung (Modifikasi Dey et.al., 2004) Biji yang memiliki ukuran seragam dipisahkan kemudian dicuci bersih dengan air mengalir. Biji yang telah bersih kemudian disterilisasi permukaannya dengan cara dicelupkan pada NaOCl 5,25% sebanyak satu kali selama 3 menit lalu dicelupkan pada alkohol 70% sebanyak 2 kali pengulangan selama 2 menit. Biji kemudian dibilas menggunakan akuades steril sebanyak 3 kali pengulangan selama 30 detik. Biji ditiriskan pada cawan Petri steril yang berisi kapas yang telah dilembabkan dengan akuades steril. Tiap cawan diisi dengan masing-masing 10 biji jagung dengan tiga pengulangan yang telah direndam selama 10 menit pada inokulum isolat dengan kepadatan sel 108 CFU’s/ml sedangkan untuk kontrol digunakan NaCl fisiologis steril. Biji diinkubasi dalam cawan Petri berisi tissue steril pada suhu ruang selama 7 hari. Persentase biji yang berkecambah kemudian dihitung berdasarkan rumus (Copeland and Donald, 1995) :
3.3.13 Seedling Bioassay dengan metode Axenic Sand Culture Assay (Modifikasi Oedjijono et al., 1996; Hussain et.al., 2013) Biji tanaman jagung yang memiliki ukuran seragam terlebih dulu dibersihkan permukaannya pada air mengalir hingga hilang sisa pestisida atau fungisidanya lalu dilakukan sterilisasi permukaan dengan mencelupkan biji pada NaOCl 5,25% selama 3 menit sebanyak satu kali pengulangan selanjutnya dicelupkan pada alkohol 70% selama 2 menit sebanyak dua kali pengulangan, terakhir biji tersebut dicelupkan pada akuades steril selama 30 detik sebanyak tiga kali pengulangan. Biji kemudian direndam pada inokulum isolat perlakuan selama 10 menit. Biji tersebut
bio.unsoed.ac.id
dikecambahkan dalam cawan Petri steril yang telah diisi dengan kapas steril lembab. Pasir besi untuk medium tanam sebelumnya dicuci bersih lalu dikeringkan di bawah sinar matahari. Pasir disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 30 menit sebanyak dua kali selama dua hari berturut-turut. Pasir yang telah steril kemudian ditambahkan dengan larutan Hoagland 50% sebanyak 5 ml. Dua biji yang berkecambah kemudian dimasukkan ke dalam tiap tabung reaksi besar berisi 30 g pasir steril dan ditambahkan kultur cair Azospirillum spp. (108 cfu 14
ml-1) sebanyak 2 ml kemudian ditutup dengan 10 g pasir steril. Inkubasi pada keadaan gelap selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada keadaan terkendali dengan diberi penyinaran selama 8 jam tiap harinya dengan intensitas cahaya ±1300-1400 lux selama 15 hari. Setelah 15 hari, tanaman dicabut secara hati-hati dan bagian akar dibersihkan dari pasir yang menempel. Pengukuran parameter pertumbuhan meliputi tinggi tanaman, panjang akar, berat basah tanaman, dan berat kering tanaman. Dilakukan pula pengamatan kesegaran tanaman dengan mengukur kandungan klorofil pada daun menggunakan chlorophyll meter Tanaman bagian atas kemudian dimasukkan ke dalam oven bersuhu ±80 oC selama 24 jam hingga beratnya konstan. Tanaman kemudian ditimbang pada timbangan analitik untuk mengetahui berat kering tanaman.
3.3.14 Pengamatan Jumlah Total Koloni Azospirillum spp. pada Akar Tanaman dengan Metode Total Plate Count Akar tanaman jagung dibersihkan dari pasir-pasir yang menempel dengan cara dikibas-kibaskan. Akar yang sudah bersih ditimbang sebanyak 1 g kemudian dimasukkan ke dalam 90 ml akuades steril kemudian digojog pada orbital shaker selama semalam. Setelah digojog, sebanyak 1 ml sampel diambil untuk dilakukan pengenceran hingga 10-8, sebanyak 1 ml suspensi dari dua pengenceran terkahir ditanam pada medium Caceres dengan metode agar tuang (pour plate). Inkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Jumlah koloni dihitung per gram sampel (Cfu’s/g) dengan menggunakan rumus : (
)
Keterangan : Fp = Faktor Pengenceran, PP = Pour Plate (1 ml)
4. Metode Analisis
bio.unsoed.ac.id
Karakter fisiologi dari isolat Azospirillum spp. potensial PGPR dianalisis menggunakan metode deskriptif komparatif. Data perkecambahan dan parameter pertumbuhan tanaman jagung dianalisis menggunakan Analisis Sidik Ragam (ANOVA) dengan tingkat kepercayaan 95%. Hasil analisis sidik ragam yang menunjukkan perbedaan pengaruh nyata dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT).
15
