SKRIPSI
IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI (Bossondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI DAN Polymerase Chain Reaction
Disusun oleh : HAYYU MAHARANI 061211131064
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2016 i
IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI ( Bossondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI DAN Polymerase Chain Reaction ( PCR )
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan Pada Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga
oleh HAYYU MAHARANI 061211131064
Menyetujui Komisi Pembimbing,
(Dr. Mufasirin, drh., M.Si.)
(RetnoBijanti, drh., M.S.)
Pembimbing Utama
Pembimbing Serta
ii
PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi yang berjudul : IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI (Bos sondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI DAN Polymerase Chain Reaction Tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Surabaya, Februari 2016 Hayyu Maharani NIM. 061211131064
iii
Telah diuji pada Seminar Hasil Penelitian Tanggal : 22 Januari 2016 KOMISI PENILAI SEMINAR HASIL PENELITIAN Ketua
: Dr. Poedji Hastutiek, drh., M.Si
Sekretaris
: M. Yunus, drh., M. Kes., Ph.D
Anggota
: Dr. Jola Rahmahani, drh., M.Kes
Pembimbing I
: Dr. Mufasirin, drh., M.Si
Pembimbing II
: Retno Bijanti, drh., M.S
iv
Telah diuji pada Tanggal: 09 Februari 2016 KOMISI PENGUJI SKRIPSI Ketua
: Dr. Poedji Hastutiek, drh., M.Si
Anggota : M. Yunus, drh., M. Kes., Ph.D Dr. Jola Rahmahani, drh., M.Kes Dr. Mufasirin, drh., M.Si Retno Bijanti, drh., M.S
Surabaya, 11 Februari 2016 Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Dekan,
Prof. Dr. Pudji Srianto,drh., M.Kes. NIP. 195601051986011001
v
UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur Kehadirat Allah SWT atas karunia yang telah dilimpahkan sehingga penulis dapat melaksanakan penelitian dan menyelesaikan penulisan skipsi dengan judul“Identifikasi Trypanosoma evansipada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction”.Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada: Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Prof. Dr. Pudji Srianto, drh., M.Kes.dan staf pimpinan serta Prof. Hj. Romziah Sidik, PhD., drh. atas kesempatan mengikuti pendidikan di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya. Dr. Mufasirin, drh., M.Si. selaku dosen pembimbing pertama yang bersedia memberikan bimbingan, sarandan nasehat yang berguna selama penelitian serta dalam penyusunan naskah skripsi ini. Retno Bijanti, drh., M.S.selaku pembimbing serta sekaligus sebagai dosen pembimbing penelitian yang tiada henti membimbing penulis dengan ikhlas dalam pelaksanaan penelitian dari awal hingga akhir dan memberi saya dorongan untuk segera menyelesaikan penulisan skripsi. Dr. Poedji Hastutiek, drh., M.Si. selaku ketua penguji, Muchammad Yunus, drh., M.Kes., Ph.D. selaku sekretaris penguji, dan Dr. Jola Rahmahani, drh, M.Kes.selaku anggota, atas saran yang membangun dalam penyusunan skripsi. Dr. I Komang Wiarsa Sardjana, drh., DEA.selaku dosen wali, atas segala nasehat, kritik, saran dan bimbingan yang diberikan selama mengikuti pendidikan di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Ketua Departemen Parasitologi Veteriner dan staf Laboratorium Biologi Molekuler Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga yang telah memberikan ijin dan bantuan pada penelitian ini. Seluruh staf pengajar Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga atas wawasan keilmuan selama mengikuti pendidikan di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. vi
Terima kasih kepada drh. Dilasdita Kartika Pradana selaku staf di Balai Besar Veteriner Bali yang telah berkenan memberikan banyak bantuan selama penelitian ini berlangsung. Ayahanda Slamet Adi Wibowo dan Ibunda Siti Solekah serta kakak Taju Mahadhikara yang telah memberikan dukungan, semangat, terutama doa yang sangat memotivasi penulis dalam menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi. Radiaprima Kartika Wijaya, terima kasih atas bantuan, dukungan, semangat dan doanya. Terima kasih kepada teman seperjuangan yang telah banyak membantu dan mendukung penelitian ini Lusiana Fitriyanti, Amira Nadia dan Anggun Rahmawati, serta teman-teman yang namanya tidak mungkin disebutkan satu persatu yang telah membantu terselesaikanya skripsi ini. Semua pihak yang tidak bisa saya sebutkan satupersatu yang telah mendukung
baik
secara
langsung
maupun
tidak
langsung
demi
terselesaikannyapenelitian ini. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan,oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Semoga penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaatbagi pembaca dan bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Surabaya, 22 Januari 2016
Penulis
vii
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL......................................................................................... i HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... ii HALAMAN IDENTITAS .............................................................................. iii ABSTRACT .................................................................................................... vi UCAPAN TERIMAKASIH ........................................................................... vii DAFTAR ISI ................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ........................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xiii SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG ...................................................... xiv BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................1 1.1 Latar Belakang Penelitian ...............................................................1 1.2 Rumusan Masalah ...........................................................................5 1.3 Landasan Teori ................................................................................5 1.4 Tujuan Penelitian .............................................................................7 1.5 Manfaat Penelitian ...........................................................................7 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................8 2.1 Surra ................................................................................................8 2.1.1 Penyebab ...............................................................................8 2.1.2 Morfologi Trypanosoma evansi ............................................8 2.1.3 Hewan yang rentan ..............................................................10 2.1.4 Penularan .............................................................................10 2.1.5 Gejala klinis.........................................................................11 2.1.6 Patogenesis ..........................................................................12 2.1.7 Diagnosis .............................................................................13 2.2 Sapi Bali ........................................................................................14 2.3 Morfometri ....................................................................................17 viii
2.4 Polymerase Chain Reaction ..........................................................17 BAB 3 METODE PENELITIAN....................................................................19 3.1 Jenis Penelitian ..............................................................................19 3.2 Tempat dan Waktu Penelitian .......................................................19 3.3 Materi Penelitian ...........................................................................19 3.3.1.1 Sampel ..............................................................................19 3.3.1.2 Bahan ulas darah ..............................................................19 3.3.1.3 Bahan isolasi DNA ...........................................................20 3.3.1.4 Alat penelitian ..................................................................20 3.4 Metode Penelitian .........................................................................21 3.4.1 Pembuatan ulas darah ..........................................................21 3.4.2 Pemeriksaan morfometri .....................................................21 3.4.3 Isolasi DNA .........................................................................22 3.4.3.1 Persiapan reagen isolasi ...............................................22 3.4.3.2 Ekstraksi DNA.............................................................22 3.4.4 Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) .........................23 3.4.5 Analisis hasil PCR...............................................................24 3.5 Analisis Data .................................................................................24 3.6 Bagan Kerangka Operasional ........................................................25 BAB 4 HASIL PENELITIAN ........................................................................26 4.1 Hasil Pemeriksaan Ulas Darah dan Morfometri ...........................26 4.2 Hasil Pemeriksaan Menggunakan Metode PCR ...........................27 BAB 5 PEMBAHASAN .................................................................................29 BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN ..........................................................34 RINGKASAN .................................................................................................35 DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................38 LAMPIRAN ....................................................................................................44
ix
DAFTAR TABEL Tabel
Halaman
3.3
Susunan dan Posisi Nucleotida untuk Primer ITS1 CF/BR ...............20
4.1
Hasil Pemeriksaan Morfometri Trypanosoma sp. ..............................27
x
DAFTAR GAMBAR Gambar
Halaman
2.1
Morfologi Trypanosoma evansi ............................................................9
2.2
Sapi Bali betina ...................................................................................14
2.3
Sapi Bali jantan ...................................................................................15
3.1
Bagan kerangka operasional penelitian ...............................................25
4.1
Hasil pemeriksaan ulas darah Sapi Bali ..............................................26
4.2
Hasil elektroforesis PCR pada darah Sapi Bali ...................................28
xi
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran
Halaman
1. Gen Trypanosoma evansi ................................................................... 44 2. Letak penempelan primer foward ITS1 CF/BR pada sequence gen Trypanosoma evansi ...........................................................................46 3. Letak penempelan primer reverse ITS1 CF/BR pada sequence gen Trypanosoma evansi .....................................................................46
xii
SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG %
= Persen
ºC
= Derajat Celcius
µl
= microliter
bp
= base pairs
dATP
= Deoxyadenine Triphospate
dCTP
= Deoxycitosine Triphospate
ddH2O
=Double Distilled Water
dGTP
= Deoxyguanine Triphospate
DNA
= Deoxyribonucleic Acid
dNTP
= Deoxynucleatide Triphospate
dTTP
= Deoxytimine Triphospate
EDTA
= Ethylen Diamine Tetra Acid
ELISA
= Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EtBr
= Ethidium Bromida
GPI
= Glikosilphosphatidilinositol
mA
= mili Ampere
mg
= miligram
mm
= milimeter
ng
= nanogram
nm
= nanometer
nt
= nukleotida
PCR
= Polymerase Chain Reaction
pH
= power of Hydrogen
Primer F
= Primer Forward
Primer R
= Primer Reverse
Rpm
= Revolutions per minute
rpm
= Rotation per minute
TBE
= Tris Borat EDTA
UV
= Ultra Violet
V
= Volt xiii
1
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Penyakit surra merupakan salah satu penyakit strategis yang menyerang hewan ternak yang disebabkan oleh Trypanosoma evansi (Luckins et al., 1992; Dargantes
et
al.,
2005).
Trypanosomaevansi
banyak
ditemukan
dalam
darahdanataujaringan hewan vertebrata(FAO, 1994).Parasitini ditularkan secara mekanis oleh vektor lalat penghisap darah seperti Tabanus sp dan Stomoxys sp(Payne et al., 1991, Luckins et al., 1992). Trypanosoma evansi mempunyai induk semang yang beragam dari hewan liar sampai hewan domestik termasuk ternak.Hewan domestik yang rentan adalah kuda, sapi, kerbau, kambing, domba, babi, anjing dan kucing, sedangkan hewan liar yang rentan diantaranya adalah badak (Vellayan et al., 2004), rusa (Adrian et al., 2010), wallaby (Reid et al., 2001) dan bisa berpotensi sebagai sumber infeksi untuk hewan domestik (Dargantes et al., 2005). Khusus pada sapi dan kerbau di Indonesia, infeksi T. evansi dapat menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat besar dikarenakan ternak tersebut merupakan sumber produksi daging dan susu (Manuel, 1998). Trypanosoma evansi pada beberapa ternak mempunyai ukuran yang bermacam-macam tergantung dari induk semang dan daerah geografisnya. Secara umum T. evansi mempunyai panjang berkisar antara 15-34 µm dengan rata–rata 24 µm. Bentuk tubuh silinder tetapi kadang–kadang terjadi bentuk stumpy/gemuk. Ukuran T. evansihampir sama dengan genus Trypanosoma lain, seperti T.
1
2
bruceiyang memiliki panjang berkisar antara 12-26 µm, T. gambiense dengan panjang berkisar antara 15-30 µm dan T. cruzi dengan panjang berkisar antara 1520 µm (Levine, 1985). Kasus penyakit surra pertama kali dilaporkan di Indonesia pada tahun 1897 pada populasi kuda di Pulau Jawa.Semenjak itu, secara sporadik menyebar ke seluruh wilayah Indonesia (Partoutomo, 1996). Menurut Sukanto (1994),paling tidak ada 11 provinsi di Indonesia (Aceh, Sumatra Utara, Lampung, Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur, Kalimantan Selatan, Sulawesi Utara, Nusa Tenggara Barat, Bali dan Nusa Tenggara Timur) merupakan daerah endemik penyakit surra. Penyakit surra pada sapi dan kerbau umumnya berlangsung lebih lambat, bersifat
kronis
dan
bahkan
tanpa
menunjukkan
gejala
klinis
atau
subklinis.Respons imun terhadap infeksi T. evansi pada kerbau dan sapi relatif lebih baik dari pada kuda sehingga ternak ruminansia besar tersebut lebih tahan
terhadap
mewabah pada
serangan ternak
penyakit surra. Penyakit dapat bersifat akut dan
ruminansia
ketika hewan mengalami stres,
karena
dipekerjakan atau difungsikan terlampau berat, akibat kekurangan pakan atau air dan faktor kondisi lingkungan kritis dan cuaca yang ekstrim (Soulsby,1982). Di antara berbagai bangsa sapi yang terdapat di Indonesia, Sapi Bali merupakan salah satu jenis sapi yang terdapat dalam jumlah yang cukup banyak dan tersebar hampir ke seluruh Indonesia. Menurut Guntoro (2002),
pada tahun
1990 jumlah populasi Sapi Bali di seluruh Indonesia mencapai sekitar 3 juta ekor yang tersebar di berbagai provinsi, mulai dari Aceh hingga Irian Jaya. Dari populasi tersebut sekitar 82% terdapat di 4 provinsi utama, dengan urutan
3
populasi yaitu Sulawesi Selatan sekitar 1.200.000 ekor, Nusa Tenggara Timur 600.000
ekor,
Bali
450.000
ekordan
Nusa
Tenggara
Barat
350.000
ekor.Sementara pada tahun 2002 seluruh populasi Sapi Bali di Indonesia diperkirakan mencapai hampir 3,5 juta ekor (Guntoro 2002). Sapi Bali (Bos sondaicus) merupakan jenis sapi yang unggul.Sapi Bali didomestikasi pertama kali di Pulau Bali.Perkembangan Sapi Bali sangat cepat dibandingkan dengan breed sapi potong lain di Indonesia, sehingga apabila Sapi Bali terkena suatu penyakit seperti penyakit surra akan mudah menular (Handiwirawan dan Subandriyo 2004). Penyakit surra pada Sapi Bali pernah terjadi di Flores, Provinsi Nusa Tenggara Timur pada tahun 1971.Sebanyak 516 ekor Sapi Bali terserang penyakit surra (Mastra, 2011).Pada tahun 2009, kasus penyakit surra pada Sapi Bali juga terjadi di Kecamatan Batu Engau, Kabupaten Paser, Provinsi Kalimantan Timur.Dari 19 sampel yang diuji di laboratorium BPPV Regional V Banjarbaru terdapat 8 sampel yang positif penyakit surra (BPPV Regional V Banjarbaru, 2009). Diagnosispenyakit surra di Indonesia umumnya masih berdasarkan laporan kasus diagnosa klinis, pemeriksaan laboratoris secara mikroskopis terhadap sampel preparat ulas darah dan atau teknik sentrifugasi mikrohematokrit. Akurasi data diagnosis klinis dan sensitivitas metoda uji laboratoris tersebut relatif belum optimal terutama pada manifestasi penyakit sub klinis sehingga cenderung tidak mencerminkan kejadian penyakit yang sesungguhnya (Mastra, 2011). Pada faseakut,
tanda
demamintermitendisertai
klinisyang
biasa
denganakumulasiparasitdalam
terlihat
dilapanganadalah
darah(parasitemia),
gejala
4
ini biasa terjadi pada kuda (Luckins, 1998; Thumbi, 2008).Sebagian penyakit berlangsungkronis yang biasa terjadi pada sapi dan kerbau dan hasil pemeriksaan ulas darah jumlahparasitdalam darah sedikit sekali bahkan tidak terdeteksi. Tingkatparasitemia terhadap
yang
rendah
akan
negatif.
Trypanosomafalse
berhasilketikajumlahparasitterlalu
menyebabkan
rendah,
diagnosis
DeteksiT.
seperti
pada
parasitologi evansitidak
infeksikronis(Nantulya,
1994; Masakeetal., 2002; Desquesnes, 2002).Perlu ada alternatif teknik diagnosis yang lebih sensitif terhadap infeksi Trypanosoma pada sapi yaitu penanda molekuler dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Pengembangan dan penerapan teknik PCR telah banyak digunakan untuk diagnosis
infeksi
hewan.Untuk
Trypanosomapada
mengoptimalkandiagnosis
dengan PCR perlu mempertimbangkan beberapa faktor yang mempengaruhi sensitivitas PCR, seperti kuantitas dan kualitas DNA yang ada di dalam sampel (González et al., 2006).Pemeriksaan morfometri dan teknik PCR penting untuk memperkuat
diagnosis
karenaketerbatasandiagnosis menggunakan
penyakit
surra
T.evansiyang
ada
kombinasidaridua
akurasidiagnosis(Monzonet al., 1990).
atau
secara dan
lebihteknik
parasitologis
disarankan
untuk
untukmeningkatkan
5
1.2. Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan di atas, maka dapat dirumuskan masalah yaitu : Bagaimana identifikasi dan morfologi Trypanosoma evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction?
1.3. Landasan Teori Pada tahun 1968-1969 wabah surra pada Sapi Bali terjadi di beberapa daerah di Indonesia, termasuk terjadi di Flores, Provinsi Nusa Tenggara Timur pada tahun 1971 terserang sebanyak 516 ekor Sapi Bali. Sementara dalam tahun 1974-1976 terjadi peningkatan kasus penyakit Surra di Provinsi Nusa Tenggara Barat (Sukanto et al., 1994). Prevalensi Trypanosomiasis pada Kabupaten/Kota Bima dan Sumbawa Besarrata-rata sebesar mengindikasikan bahwa
kejadian
infeksi
secara alami
Sapi Bali di
15,3%. Hasil ini
oleh
parasit darah
patogen T. evansi pada Sapi Bali di Kabupaten/Kota Bima dan Sumbawa Besar tersebar
luas dan
cendrung
bersifat
endemis (Mastra, 2011).Menurut data
pengujian dan diagnosa laboratorium BPPV Regional V Banjarbaru, pada tahun 2009 terjadi kasus penyakit surra di Kecamatan Batu Engau, Kabupaten Paser Provinsi Kalimantan Timur pada Sapi Bali.Dari 19 sampel yang diuji terdapat 8 sampel positif penyakit surra (BPPV Regional V Banjarbaru, 2009). Periode antara inokulasi pada hewan sehat dan waktu Trypanosoma dapat dideteksi dalam plasma darah dengan observasi langsung disebut masa/periode prepaten. Dengan mengetahui periode prepaten, penyakit ini kemudian dibedakan
6
menjadi dua kategori yaitu : kategori akut apabila jumlah parasit dalam darah sangat tinggi dan terlihat gejala klinis. Dikategorikan kronis apabila jumlah parasit dalam darah sedikit dan tidak tampak gejala klinis.Trypanosomiasis adalah penyakit yang serius di banyak negara, seperti Afrika, Asia dan Amerika Latin (Duvallet et al., 1999) Trypanosoma evansi memiliki morfologi yang mirip dengan Trypanosoma lain seperti T. equiperdum, T. brucei, T. gambiense dan T. rhodesiense. Permukaan
tubuhT.evansi diselubungi oleh lapisan protein tunggal yaitu
glikoprotein yang dapat berubah-ubah bentuk (variable surface glycoprotein). Kemampuan glikoprotein yangdapat berubah bentuk, maka T. evansi dapat memperdaya
sistem
kekebalan
tubuh induk semang. Konsekuensinya akan
terjadi variasi antigenik (antigenic variation) tubuh membentuk
akan
selalu
berusaha
antibodi yang berbeda-beda sesuai denganprotein permukaan yang
ditampilkan oleh T. evansi (Davilaet al., 2003). Banyak cara yang dapat dilakukan untuk mengidentifikasi Trypanosoma, baik dengan cara yang sederhana seperti pemeriksaan ulas darah dengan pewarnaan, sampai dengan pemeriksaan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode PCR dapat mendeteksi asam nukleat parasit.Polymerase Chain Reaction merupakan metode yang sangat sensitif yang dapat mendeteksi satu Trypanosoma/ml darah (Davila etal.,2003) atau bahkan satu pikogram dari DNA Trypanosoma yang ada pada DNA inang (Clausen etal.,1998). Polymerase Chain Reaction adalah suatu metode memperbanyak fragmen DNA spesifik secara in vitro.Prinsip metode PCR adalah perbanyakan rantai
7
DNA.Polymerase Chain Reaction juga dapat digunakan untuk mendeteksi fragmen DNA tertentu dalam sampel.Proses PCR melibatkan serangkaian siklus temperatur
yang
berulang
masing–masing
siklus
terdiri
atas
tiga
tahapan.Polymerase Chain Reaction memanfaatkan enzim DNA polymerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Siklus PCR terdiri dari tiga tahap yaitu denaturasi, annealing dan polimerasi (Gumilar et al., 2008).
1.4. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi Trypanosoma evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction.
1.5. Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini dapat memberikan informasi tentang identifikasi dan morfologi Trypanosoma evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction, sehingga dapat menambah pengetahuan dan sebagai referensi untuk penelitian selanjutnya.
8
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Penyakit Surra 2.1.1. Penyebab Penyakit surra adalah nama penyakit yang diberikan pada hewan yang terserang protozoa darah Trypanosoma evansi. Taksonomi Trypanosoma menurut Levine (1985) adalah : Kingdom
: Animal
Filum
: Sarcomastigophora
Sub Filum
: Mastigophora
Kelas
: Zoomastighoporasida
Ordo
: Kinetoplastorida
Sub Ordo
: Trypanosomarina
Family
: Trypanosomatidae
Genus
: Trypanosoma
Spesies
: Trypanosoma evansi
2.1.2. Mofologi Trypanosoma evansi Trypanosoma evansi berbentuk seperti daun, aktif membelah dengan binary fission.Di bagian tengah tubuh terdapat inti yang mengandung kariosoma (trofonukleus) yangbesar dan terletak hampir sentral (Ausvetplan, 2006).Gambar morfologi T. evansi dapat dilihat pada Gambar 2.1.
8
9
Gambar 2.1 Morfologi Trypanosoma evansi Sumber : Levine (1985). Trypanosoma
evansimempunyai karakteristik
ramping,
ukuran
kecil,
dibandingkan dengan Trypanosoma theileri, tetapi lebih besar dibandingkan dengan T. congolense, mempunyai flagela bebas dan bergerak aktif (Desquesnes et al., 2002).Pada Gambar 2.1 terlihat bahwa flagela timbul pada ujung posterior dari bagian parabasal dan membentang sampai bagian anterior.Flagela di luar ujung anterior tubuh sebagai flagela bebas berbentuk seperti cambuk.Flagela di sepanjang tubuh membentuk membran bergelombang yang disebut undulating membran.Trypanosoma evansi mempunyai panjang 15-34 µm dengan rata – rata 24 µm. Tubuh berbentuk silinder, tetapi kadangberbentuk stumpy/gemuk (Levine, 1985).
10
2.1.3. Hewan yang rentan Hampir semua hewan berdarah panas rentan terhadap penyakit surra, kecuali bangsa burung.Kuda paling tinggi kerentanannya diikuti unta, anjing, sapi dan kerbau.Hewan percobaan seperti tikus, marmut dan kelinci juga termasuk hewan yang rentan. Pada sapi dan kerbau, penyakit ini bersifat kronis, tetapi dalam kondisi tertentu seperti kurang makan dan kerja terlalu keras, keganasan penyakit akan meningkat dengan mortalitas sampai 80 % (Levine, 1985). Trypanosoma evansi mempunyai inang yang beragam dari hewan liar sampai hewan domestik. Diantara hewan domestik yang rentan adalah kuda, sapi, kerbau, kambing, domba, babi, anjing dan kucing, sedangkan hewan liar yang rentan diantaranya adalah badak (Vellayan et al., 2004), rusa (Adrianet al., 2010), wallaby (Reid et al., 2001), dan bisa berpotensi sebagai sumber infeksi untuk hewan domestik (Dargantes et al., 2005). Hewan coba seperti tikus dan mencit juga sangat peka terhadap infeksi T. evansi (OIE, 2009).
2.1.4. Penularan Penyakit surra di Indonesia ditularkan oleh lalat penghisap darah Tabanus sp, Haematopota sp, Chrysop sp, Stomoxys spdan Haematobiasp. (Jones et al., 1996). Insekta merupakan vektor mekanik, karena tidak terjadi perkembangan siklus di dalam vektor dan Trypanosoma tertinggal di dalam probosis (Levine, 1985). Penularan infeksi Trypanosoma evansi sangat cepat pada beberapa hewan karena sifat lalat, khususnya Tabanus sp yang menghisap darah terputus–putus (dari satu hewan berpindah ke hewan lain) (Soulsby, 1982). Lalat Tabanus
11
yangpaling menonjol populasinya sebagai penyebar infeksi Trypanosoma evansi di Indonesia adalah Tabanus rubidus dan Tabanus megalops (Sasmita dkk., 2013). Sebaran penyakit yang luas sangat dipengaruhi oleh topografi daerah dan manajemen atau cara pemeliharaan ternak terutama yang dipelihara
secara
tradisional dengan cara menggembalakan ternak secara bersama-sama
di areal
padang pengembalaan. Batas tanah pertanian tidak jelas, ladang terbuka yang hanya dibatasi oleh semak, sungai dan hutan masih banyak dijumpai didaerah ini sebagai tempat berkumpul hewan ternak untuk merumput dan mencariair minum. Kondisi lingkungan seperti ini juga sangat digemari oleh lalat pengisap darah seperti Tabanus sp.,Stomoxyssp. Lalat Tabanus sp., merupakan salah satu vektor penularan secara mekanik Trypanosomiasis yang sangat potensial pada hewan ternak (Soulsby, 1982).
2.1.5. Gejala klinis Gejala klinis yang khas penyakit surra adalah adanya oedema atau pembengkakan pada daerah ventral atau bagian bawah tubuh seperti leher, legok lapar dan kaki.Gejala klinis lain adalah terjadi perdarahan di bawah kulit, hidung, mata dan anus. Gejala lain adalah anemia, demam selang seling (intermittent fever) dan pada akhirnya terjadi kematian.Gejala klinis rambut rontok dapat terjadi karena kondisi tubuh hewan yang menurun dan nafsu makan berkurang (Ismudiono dkk., 2006). Gejala klinis khas yang lain apabila parasit menuju cairan cerebrospinal akan menimbulkan gejala inkoordinasi gerak (Levine, 1985).
12
Bentuk akut penyakit dapat berlangsung sampai tiga bulan dan ditandai dengan
demam
tidak
teratur,
penurunan
berat
badan
yang
progresif,
keratokonjungtivitis berulang dan plak urtikaria pada leher.Tanda klinis pada kasus kronis kurang terlihat jelas.Pada hewan yang terinfeksi T. evansi, produksiakan turun, hewan tampak lesu,rambut kasar, anemia dan demam berulang (Hoare, 1972).
2.1.6. Patogenesis Patogenesis penyaki surra bermula dari kelenjar saliva vektor lalat dan ditularkan pada inang melalui gigitan (Wiser, 1999).Infeksi ditularkan dengan penetrasi T. evansi ke dalam jaringan subkutan atau submukosa (Losos, 1986). Parasit tersebut kemudian memasuki sistem peredaran darah, berkembang dan akan bertambah secara logaritmik di dalam darah dalam waktu satu sampai tiga hari setelah parasit ditemukan di dalam aliran darah (Noble and Noble., 1982; Jefrey et al., 1983). Kerusakan endotel pembuluh darah menyebabkan oedema dan perdarahan (Ressang, 1984). Trypanosoma evansi menyebabkan reaksi inflamasi pada jaringan darah dengan diikuti multifikasi parasit (Losos, 1986).Trypanosoma evansi bertambah dalam darah secara berkala dan hal ini disertai demam pada hewan.Serangan demam yang berulang disebabkan oleh invasi masal T. evansi ke dalam darah atau perkembangbiakan yang cepat dalam darah (Ressang, 1984). Trypanosoma evansi mengeluarkan toksin yang dikenal dengan nama trypanotoksin yang dapat mempengaruhi sistem kerja tubuh hewan yang terinfeksi
13
(Levine, 1985). Trypanotoksin dapat merusak membran eritrosit yang dimulai dengan ikatan antara kompleks antigen–antibodi atau komplemen, proses tersebut menyebabkan
anemia
hemolitik
(Morrison
et
al.,
1981).Gangguan
imunopatologik yang paling penting pada trypanosomiasis adalah imunosupresi yang ditandai anemia. Ikatan kompleks antigen – antibodi atau komplemen yang beredar dalam darah pada permukaan eritrosit, bertanggung jawab terhadap destruksi eritrosit dan proses ini menyebabkan terjadi hemolisis (Noble and Noble., 1982). Anemia hemolitik menyebabkan peningkatan destruksi eritrosit dengan cara fagositosis pada limpa, hati, sumsum tulang dan di sirkulasi darah (Morrison et al., 1981). Peningkatan destruksi eritrosit ditandai dengan adanya splenomegali (Losos, 1986).
2.1.7. Diagnosis Diagnosis penyakit surra berdasarkan gejala klinis yang muncul dan dilakukan uji parasit, uji serologis dan uji molekuler untuk diagnosis konfirmatif di
laboratorium.Uji
parasit
diantaranya
dilakukan
dengan
pemeriksaan
haematologi (mikroskopik), Microhematocrite Centrifugation Technique (MHCT) dan Mouse Inoculation Test (MIT). Uji serologi dapat dilakukan dengan metode Card Agglutination Test For Trypanosomes (CATT) dan Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay
(ELISA),
sedangkan
Polymerase Chain Reaction (PCR) (Solihat, 2002).
uji
molekuler
menggunakan
14
2.2.
Sapi Bali Sapi Bali merupakan sapi potong asli Indonesia dan merupakan hasil
domestikasi dari Banteng (Bos bibos) (Hardjosubroto, 1994), dan merupakan sapi asli Pulau Bali (Sutan, 1988).Sapi Bali menjadi primadona sapi potong di Indonesia
karena
mempunyai
kemampuan
reproduksi
tinggi,
serta
dapat
digunakan sebagai ternak kerja di sawah dan ladang (Moran, 1990; Putu et al., 1998), persentase karkas tinggi, daging tanpa lemak (Pane, 1990), daya adaptasi yang tinggi terhadap lingkungan dan persentase kelahiran dapat mencapai 80 persen (Tanari, 2001).Beberapa kekurangan Sapi Bali yaitu pertumbuhan lambat, peka terhadap penyakit jembrana, penyakit Malignant Catarrhal Fever (MCF) dan penyakit surra (Hardjosubroto, 1994).Gambar Sapi Bali dapat dilihat pada Gambar 2.2 dan 2.3.
Gambar 2.2 Sapi Bali Betina Sumber :Wibisono (2009).
15
Gambar 2.3 Sapi Bali Jantan Sumber :Wibisono (2009). Menurut
Hardjosubroto
(1994),
Sapi
Bali
mempunyai
taksonomi sebagai berikut : Phylum
: Chordata
Subphylum
: Vertebrata
Class
: Mamalia
Sub class
: Theria
Infra class
: Eutheria
Ordo
: Artiodactyla
Sub ordo
: Ruminantia
Infra ordo
: Pecora
Famili
: Bovidae
Genus
: Bos (cattle)
Sub-Genus
: Bovine
Group
: Taurinae
Spesies
: Bos sondaicus (Banteng/Sapi Bali)
klasifikasi
16
Sapi Bali (Bos sondaicus) berasal dari domestikasi Banteng dan dapat beradaptasi dengan baik pada lingkungan setempat, dan sekarang sudah menyebar di luar wilayah Indonesia (tropis dan sub tropis) (McCool, 1992; Sivarajasingham, 1992; Talib et al., 1998).Sapi Bali juga dapat ditemukan di kebun binatang dan Taman Safari di luar negeri, secara liar dan terpelihara juga dapat dilihat pada hutan-hutan tropis dan negara Asia Tenggara dan Australia Utara (Talib et al., 1998). Sapi Bali mempunyai ciri khusus antara lain, warna bulu merah bata, tetapi yang jantan dewasa berubah menjadi hitam. Satu karakter lain yakni perubahan warna sapi jantan kebirian dari warna hitam kembali pada warna semula yakni coklat muda keemasan yang diduga karena hormon testosteron sebagai hasil produk testes. Karakteristik lain yang harus dipenuhi dari ternak Sapi Bali murni yaitu warna putih pada bagian belakang paha, pinggiran bibir atas, dan pada paha kaki bawah mulai tarsus dan carpus sampai batas pinggir atas kuku, bulu pada ujung ekor hitam, bulu pada bagian dalam telinga putih dan terdapat garis hitam yang jelas pada bagian atas punggung. Bentuk tanduk pada jantan yang paling ideal disebut bentuk tanduk silak congklok, yaitu jalannya pertumbuhan tanduk dimulai dari dasar sedikit keluar lalu membengkok ke atas, kemudian pada ujung membengkok sedikit keluar.Pada sapibetina bentuk tanduk yang ideal yang disebut manggul gangsa yaitu pertumbuhan tanduk satu garis dengan dahi arah ke belakang sedikit melengkung ke bawah dan pada ujung sedikit mengarah ke bawah dan ke dalam.Tanduk ini berwarna hitam (Hardjosubroto, 1994).
17
2.3.
Morfometri Morfometri adalah suatu metode yang digunakan untuk menganalisis
organisme secara kuantitatif yang mencakup ukuran dan bentuk.Morfometri digunakan sebagai alat untuk identifikasi parasit sejak zaman dahulu.Morfometri dapat digunakan untuk mengukur dan mendeteksi perubahan bentuk.Tujuan utama dari morfometri adalah mempengaruhi
untuk
statistik
bentuk.Ukuran
membuatkesalahan
uji hipotesis tentang faktor yang dan
bentukdariparasitdapat
tentangidentifikasi spesies parasit karena pada beberapa
spesies parasit ditemukan memiliki ukuran dan bentuk yang hampir sama,oleh karena itupengukuran morfometridapat membantu untuk mengidentifikasiparasit (Javidet al., 2013).
2.4.
Polymerase Chain Reaction Polymerase Chain Reaction adalah metode amplifikasi suatu sekuen DNA
tertentu.Polymerase Chain Reaction merupakan cara yang sensitif, selektif dan sangat cepat untuk memperbanyak sekuen DNA yang diinginkan (Murray et al., 2006). Empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandagakan, (2) oligonukleotida (primer), yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sinstesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua, yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’ – fosfat dan oligonukleotida dengan sekuen
pada
ujung
3’
–OH
rantai
DNA
cetakan
yang
lain,
(3)
18
deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), yang terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP dan (4) enzim DNA polimerase yaitu enzim yang berfungsi sebagai katalis dalam reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga berperan penting adalah buffer PCR (Yuwono, 2006). Reaksi
pelipatgandaan
fragmen
DNA
dimulai
dengan
melakukan
denaturasi DNA tamplate (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denaturasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas (95ºC) selama 1-2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55ºC sehingga primer akan menempel (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Proses annealing bisa dilakukan selama 1-2 menit. Setelah dilakukan annealing, oligonukleotida (primer) menempel pada DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72ºC selama 1,5 menit. Pada suhu ini, DNA polimerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk, dengan ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA baru hasil polimerasi, selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95ºC. Rantai DNA yang baru tersebut, selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerase selanjutnya (Yuwono, 2006).
19
BAB 3 MATERI DAN METODE
3.1. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif laboratoris yang hasilnya disajikan secara deskriptif.
3.2. Tempat dan Waktu penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Departemen Parasitologi Veteriner dan Laboratorium Biologi Molekuler Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya.
Waktu pelaksanaan penelitian pada bulan
Agustus 2015 – September 2015. 3.3. Materi penelitian 3.3.1. Bahan penelitian 3.3.1.1. Sampel Sebanyak dua sampel diperoleh dari darah Sapi Baliyang diduga terinfeksi Trypanosoma evansi berasal dari Kabupaten Jembrana yang didapatkan dari Balai Besar Veteriner Bali. Sampel darah sebanyak 3 ml diambil melalui
vena
jugularis, menggunakan 5 ml tabung venoject yang berisi larutan Ethylen Diamine Tetra Acid (EDTA).
3.3.1.2. Bahanulas darah Bahan untuk pemeriksaan ulas darah adalah darah, larutan pewarna Giemsa 10%, minyak emersi dan methanol absolut.
19
20
3.3.1.3. Bahanisolasi DNA Bahan untuk isolasi DNA adalah gSYNCT M DNA Extraction Kit (Geneaid), yang meliputi (larutan GSTBuffer, GSB Buffer, W1 Buffer, Wash Buffer,Proteinase K, Elution Buffer), Ethanol Absolut dan ddH2 O.Bahan untuk PCR adalah 2x KAPA Taq Extra Hotstart Ready Mix PCR Kit (KAPA Biosystems).Sepasang primer ITS1 CF/BR dan distilled water. Bahan untuk elektroforesis gel adalah agarosa, Tris Borat EDTA(TBE), Ethidium Bromida (EtBr), Marker DNA dan loading dye.Susunan untuk primerITS1 CF/BR dapat dilihat pada Tabel 3.3, dan posisi primer pada genom Trypanosoma evansi untuk primer forward pada nomor 2117-2097 dan primer reverse pada nomor 25972578 dapat dilihat pada Lampiran 1. Tabel 3.3. Susunan untuk Primer ITS1 CF/BR Primer
Sekuens
Posisi
Forward
5’-CCGGAAGTTCACCGATATTG-3’
2117-2097
Reverse
5’-TGCTGCGTTCTTCAACGAA- 3’
2597-2578
Panjang Pita 480 bp
Sumber : Njiruet al.(2005)
3.3.2
Alat penelitian Alat
penelitian
yang
digunakan
adalah
glove
disposable,
masker,
Erlemeyer 1000 ml, disposablespuit 1 cc, disposable spuit 3 cc, sentrifus, tabung Eppendorf, mikro pipet, jarum sonde, aluminium foil, gabus, gelas obyek, gelas penutup, mikroskop, tissue, spidol marker dan frezer.
21
Alat untuk isolasi DNA dan PCR yang digunakan dalam penelitian yaitu mesin PCR (Mastercycler Personal), Microcentrifuge (Hermle Z 400 K), water bath (Gemmyco Water Bath YCW-010), vortex, mikropipet, tip, tabung Eppendorf, microtube, timbangan digital, alat elektrophoresis, lampu UV, botol reagen, cool box, optilab®, mikroskop dan laptop
3.4.Metode Penelitian 3.4.1. Pembuatan ulas darah Darah diteteskan pada object glass,dibuat ulasan darah dan dikeringkan. Kemudian
difiksasi
dengan
methanol
absolut
selama
3
menit
dan
dikeringkan.Proses selanjutnya adalah preparat diwarnai dengan Giemsa 10% selama 45 menit. Setelah itu, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan, diperiksa dengan mikroskop dengan perbesaran 1000x dengan bantuan minyak emersi.
3.4.2. Pemeriksaan morfometri Pemeriksaan morfometri dilakukan dengan cara hasil ulas darah yang positif terdapat T. evansi diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x dan difoto dengan menggunakan OptiLab ®. Kemudian hasil foto Trypanosoma tersebut diukur yang meliputi panjang dan lebar tubuh, panjang dan lebar inti, panjang dan lebar kinetoplas, panjang undulating membran dan jarak inti ke kinetoplas. Morfologi yang terlihat sesuai dengan deskripsi Soulsby (1982) untuk spesies T. evansi.
22
3.4.3.Isolasi DNA 3.4.3.1. Persiapan reagen isolasi DNA Larutan Wash buffer ditambahkan ethanol absolut sebanyak 100 ml dan kemudian dicampur.
Proteinase K
dilarutkan dengan pelarut dengan cara
ditambahkan ddH2 O sebanyak 1,10 ml dan disimpan dalam suhu 4o C (Geneaid, 2014).
3.4.3.2. Ekstraksi DNA menggunakan prosedur menurut Geneaid (2014) Sampel darah ditambahkan PBS sampai volume akhir 200 µl dan dicampur, kemudian dipindahkan pada 1,5 ml microsentrifus tube. 20 µl proteinase K ditambahkan pada larutan dan divortex, kemudian diinkubasi pada suhu 60o C selama 5 menit.Selama inkubasi tube dibalik setiap 2 menit. Larutan yang sudah diberi PBS dan proteinase K
kemudian ditambahkan
200 µl GSB bufferdandivortex selama 5 detik. Larutan diinkubasi pada suhu 60o C selama 5 menit untuk memastikan lisat hancur.Selama inkubasi, tube dibolak balik setiap 2 menit. Larutan ditambahkan 200 µl alkohol absolut kemudian divortex selama 10 detik.GD column diletakkan pada tabung koleksi ukuran 2 ml, kemudian semua campuran pada GD columndipindahkan dan disentrifugasi pada 14-16.000 x g selama 1 menit. Selama dilakukan sentrifugasi, jika campuran tidak mengalir ke GD columnmembrane waktu sentrifugasi diperlama sampai campuran mengalir ke
23
GD columnmembrane.2 ml tabung koleksi yang terisi dibuka kemudian GD column dipindahkan pada 2 ml tabung koleksi yang baru. Sebanyak 400 µl W1 buffer ditambahkan pada GD column, disentrifugasi pada 14-16.000 x g selama 30 detik kemudian dibuang.GD columndiletakkan kembali pada tabung koleksi ukuran 2 ml. Pada GD culumnditambahkan 600 µl Wash buffer kemudian disentifugasi pada 14-16.000 x g selama 3 menit dan dibuang. GD columndiletakkan kembali pada tabung koleksi ukuran 2 ml. Standar volume elusi adalah 100 µl. Jika sampel yang digunakan sedikit, volume elusi dikurangi menjadi 30-50 DNA.Konsentrasi
DNA
diukur
dengan
µl untuk meningkatkan konsentrasi spektrofotometer
dengan
panjang
gelombang 260 nm.
3.4.4.Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Campuran reaksi PCR dimasukkan dalam tabung Eppendorf, yang terdiri atas 25 µl 2x KAPA Taq Extra HotStart Ready Mix with dye, 4-7 µl templateDNA, primer (F: 1µl), primer (R: 1 µl) dan distilled water16-19 µl sehingga total volume 50 µl.Campuran reaksi PCR dicampur sampai homogen menggunakan vortex. Tabung Eppendorf selanjutnya dimasukkan kedalam mesin PCR dengan menggunakan program persiapan dengan suhu 94º C selama 5 menit, denaturasi 94º C selama 40 detik, anneling dengan suhu 58º C selama 40 detik, extension rantai
72º C selama 90 detik, dan terminasi 72º C selama 5 menit.
Proses PCR menggunakan reaksi 35 kali (Njiru et al., 2005).
24
3.4.5. Analisis hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa Hasil amplifikasi dari proses PCR yang telah dilakukan sebelumnya kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) menggunakan alat elektroforesis. Komposisi gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,3 gram agarosa dalam 30 ml buffer TBE 1x dan ditambahkan larutan Ethidium Bromida (EtBr) 0,3 µl. Larutan tersebut kemudian dipanaskan hingga semua agarosa larut sempurna, kemudian didinginkan hingga suhu larutan mencapai 60 o C. Setelah larutan dingin dituangkan ke dalam cetakan gel yang memiliki sisir sebagai pembentuk sumur gel. Pada tiap sumuran gel dimasukkan 5 µl marker DNA yang telah dicampurkan dengan 1 µl loading dye dan 7 µl sampel hasil PCR yang telah dicampurkan dengan 1 µlloading dye. Proses elektroforesis dilakukan dalam buffer TBE 1x sebagai media penghantar arus pada tegangan 100 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis kemudian
divisualisasi
dengan
lampu
UV
dan
difoto
dengan
kamera
digital.Sampel dinyatakan positif apabila didapatkan pita DNA 480 base
pair
(bp).
3.5.Analisis data Data penelitian berupa hasil pengukuran Trypanosoma evansi dan amplifikasi DNA sampel. Pada metode PCR, sampel dinyatakan positif apabila didapatkan pita DNA 480 base pair (bp). Data disajikan secara deskriptif (Njiru et al,. 2005).
25
3.6.BaganKerangkaOperasionalPenelitian
Sampel darah Sapi Bali
Pemeriksaan Ulas Darah
Ekstraksi DNA
Pemeriksaan Morfometri
PCR
Identifikasi hasil pemeriksaan terhadap Trypanosama evansi
Gambar 3.1. Bagan kerangka operasional penelitian
26
BAB 4 HASIL PENELITIAN
4.1 Hasil Pemeriksaan Ulas Darah dan Morfometri Hasil pemeriksaan ulas darah dari dua sampel darah Sapi Bali (Bos sondaicus) yang berasal dari Kabupaten Jembrana Provinsi Bali menunjukkan satu sampel positif (sampel B), Trypanosoma sp. berbentuk ramping, mempunyai inti, kinetoplas, flagela bebas dan undulating membran.Hasil pemeriksaan ulas darah pada Sapi Bali (Bos sondaicus) dapat dilihat pada Gambar 4.1.
Gambar 4.1 Hasil pemeriksaan ulas darah Sapi Bali (Bos sondaicus) pada perbesaran 1000x terlihat adanya Trypanosoma sp.pada plasma darah. 26
27
Setelah diketahui adanya Trypanosoma sp.pada plasma darah Sapi Bali (Bos sondaicus), maka dilakukan pemeriksaan morfometri dengan cara hasil foto pemeriksaan ulas darah yang positif Trypanosoma sp. dengan menggunakan mikroskop
dengan
perbesaran
1000x
dan
optilab ®,
kemudian
dilakukan
pengukuran dengan menggunakan aplikasi yang berasal dari optilab ® pada PC. Hasil pemeriksaan morfometri dapat dilihat dari Tabel 4.1. Tabel 4.1 Hasil pemeriksaan morfometri Trypanosoma sp. pada darah Sapi Bali (Bos sondaicus) yang berasal dari Kabupaten Jembrana Provinsi Bali. Parameter
Kisaran
Rata-rata
Panjang
23,09 – 39,94 µm
32,47 µm
Lebar
1,82 – 4,34 µm
3,15 µm
Panjang Inti
5,21 – 11,41 µm
8,21 µm
Lebar Inti
1,56 – 4,19 µm
3,10 µm
Panjang Kinetoplas
2,34 – 9,05 µm
5,16 µm
Lebar Kinetoplas
1,78 – 4,58 µm
2,69 µm
Panjang Undulating
8,95 – 17,45 µm
12,77 µm
10,57 – 19,36 µm
14,80 µm
Membran Jarak Inti ke Kinetoplas
4.2 Hasil Pemeriksaan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) Untuk memperkuat diagnosis dari hasil pemeriksaan ulas darah yang positif merupakan Trypanosoma evansi, maka dilakukan pemeriksaan dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil amplifikasi DNA dari darah Sapi Bali (Bos sondaicus) yang berasal dari Kabupaten Jembrana Provinsi Bali menggunakan Primer ITS1 CF/BR menghasilkan pita dengan
28
panjang 480 bp (positif). Hasil elektroforesis pada proses PCR sampel darah Sapi Bali (Bos sondaicus) dapat dilihat pada Gambar 4.2.
Gambar 4.2 Hasil Elektroforesis PCR pada darahSapi Bali (Bos sondaicus). A. Darah Sapi Bali (Bos sondaicus) negatif; B.Darah Sapi Bali (Bos sondaicus) positif Trypanosoma evansi M. Marker DNA.
29
BAB 5 PEMBAHASAN
Hasil pemeriksaan ulas darah dari dua sampel darah Sapi Bali (Bos sondaicus) yang berasal dari Kabupaten Jembrana Provinsi Bali, diketahui satu sampel positif.Pemeriksaan mikroskopik hapusan darah menunjukkan adanya spesies Trypanosoma sp. dengan karakteristik morfologi yang khas seperti T. evansi. Bentuk terlihat seperti daun dengan panjang sekitar 23,09 – 39,94 µm dan rata-rata panjang adalah 32,47 µm. Lebar tubuh sekitar 1,82 – 4,34 µm dengan rata-rata 3,15 µm. Inti yang terlihat berukuran panjang 5,21 – 11,41 µm rata-rata 8,21 µm dan lebar inti sekitar 1,56 – 4,19 µm, rata-ratanya 3,10 µm. Dalam gambar juga terlihat adanya kinetoplas yang memiliki panjang sekitar 2,34 – 9,05 µm dan rata-ratanya 5,16 µm, lebar kinetoplas berkisar antara 1,78 – 4,58 µm dengan rata-rata 2,69 µm, serta undulating membran dengan panjang sekitar 8,95 – 17,45 µm, rata-rata 12,77 µm. Jarak antara inti ke kinetoplas sekitar 10,57 – 19,36 µm, rata-rata 14,80 µm. Morfologi yang terlihat sama dengan deskripsi Soulsby (1982)untuk spesies T. evansi. Ketika diamati dalam sampel darah segar, T. evansi berbentuk ramping, berukuran lebih kecil dibandingkan dengan T. theileri, tetapi lebih besar dibandingkan dengan T. congolens. T. evansi memiliki extremitas posterior yang tipis dan juga flagela bebas, aktif bergerak tetapi memiliki perpindahan yang terbatas jika dilihat dari mikroskop.Apabila diamati pada preparat ulas darah tipis dengan pewarnaan Giemsa, terlihat bentuk monomorfik tipis Trypanomastigot (Hoare, 1972). 29
30
Trypanosoma evansi dapat ditemukan di dalam sirkulasi darah pada fase infeksi akut. Trypanosoma evansi memiliki ukuran panjang 15 sampai 34 μm dengan
rata-rata
24
µm
dan
dapat
membelah
(binary
fission)
untuk
memperbanyak diri. Bentuk yang khas seperti daun atau kumparan adalah ciri khusus dan ditemukan flagella yang panjang sebagai alat gerak. Di bagian tengah tubuh terdapat inti. Salah satu ujung tubuh berbentuk lancip, sedangkan ujung tubuh yang lain agak tumpul dan terdapat bentukan yang disebut kinetoplas (Naiposposet al., 2014). Dalam penelitian ini, ukuran T. evansi pada Sapi Bali terlihat lebih panjang dengan rata-rata 32,47 µm. Hal ini berbeda dengan ukuran T. evansi yang ada pada kuda yaitu rata-rata 27,94 µm (Elshafie et al., 2013). Peningkatan panjang rata-rata T. evansi berhubungan dengan virulensi (Gill, 1977). Ukuran dan bentuk T.evansi dalam darah tidak berkaitan dengan karakteristik genetik, tetapi pertumbuhan parasit berhubungan dengan respons imun inang (Tejeroet al., 2008). Salah satu aspek penting dari T. evansi adalah kemampuannya secara periodik untuk mengubah varian glikoprotein permukaan (VSG) (Herrera et al., 2001). Trypanosoma ditutupi oleh varian glikoprotein permukaan (VSG) yang merupakan penentu antigenik utama sistem kekebalan tubuh inang (Maudlin and Miles.,
2004).
melepaskan
Variabilitas terletak
lapisan
pada kemampuan parasit yang dapat
dan membuat lapisan yang baru dengan glikoprotein
permukaan lain (Bacchi, 2009). Variasi antigen dalam T. evansi menjadi mekanisme primer penolakan respon imun induk semang (Maudlin and Miles., 2004).
31
Sebuah studi di India melaporkan besar variasi yang signifikan dalam total panjang isolat T. evansi antara kerbau dan anjing (John et al., 1992). Variasi yang berbeda dapat diamati dalam morfologi T. evansi ditemukan pada spesies hewan yang sama, oleh karena itu pengamatan biometrikal dapat memberikan hanya perkiraan diagnosis (Stephen, 1986; Tamarit et al., 2011). Dengan demikian, konfirmasi
infeksi
dengan
teknik
molekuler
diperlukan
untuk
mengatasi
keragaman yang terlihat pada diagnosis berdasarkan morfologi. Pada penelitian ini, terdapat satu sampel darah Sapi Bali yang diperiksa dengan ulas darah maupun dikuatkan dengan pemeriksaan PCR menunjukkan hasil yang negatif. Hali ini disebabkanrespons imun terhadap
infeksi T. evansi
pada kerbau dan sapi relatif lebih baik dari pada kuda sehingga ternak ruminansia besar tersebut lebih tahan terhadap serang penyakit surra. Menurut Soulsby (1982), penyakit surra dapat bersifat akut dan mewabah pada ternak ruminansia ketika hewan mengalami stres, karena dipekerjakan atau difungsikan terlampau berat, akibat kekurangan pakan atau air dan faktor kondisi lingkungan kritis dan cuaca yang ekstrim. Dalam penelitian terdahulu juga tidak didapatkan penyakit surra akut atau kematian pada sapi dan kerbau yang diamati selama lebih dari 2 tahun di lapangan (Partoutomo et al., 1996). Faktor lain yang ikut berperan sebagai penentu terjadinya sakit atau kematian hewan dengan penyakit surra di lapangan adalah pemeliharaan, makanan dan ada atau tidaknya infeksi campuran. Infeksi yang kronis juga ditandai dengan kenaikan suhu badan antara hari ke-1-5 pascainfeksi yang selanjutnya suhu badan berfluktuasi pada nilai normal. Walaupun jumlah
32
parasit di dalam darah meningkat sampai jumlah yang sangat tinggi, tetapi suhu badan tidak menunjukkan kenaikan, atau dapat dikatakan bahwa tidak ada korelasi antara jumlah parasit di dalam darah dan kenaikan suhu badan (Partoutomo, 1996). Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah Polymerease Chains Reaction(PCR),
yang merupakan metode deteksi antigen yang mempunyai
spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi. Hasil deteksi Trypanosoma evansi dengan menggunakan metode PCR menunjukkan hasil positif dengan panjang pita 480 bp. Untuk indentifikasi T.evansi dengan metode PCR, persentase deteksi dan sensitivitas PCR tergantung dari primer yang digunakan yang ditentukan oleh jumlah salinan dan homologi primer urutan target. Ketika parasitemia kurang dari 103 parasit/ml darah, pada periode prepaten, perlu untuk menggunakan setidaknya 100 ng DNA dalam sampel (Gonzálezet al., 2006). Pada penelitian ini menggunakan primer ITS1 CF/BR yang dapat mendeteksi sampai 0,01 pg DNA T.evansi (Njiru et al., 2005). Meskipun memiliki sensivitas rendah, teknik ulas darah untuk mendeteksi adanya T.evansi banyak digunakan di lapangan karena cepat untuk mendiagnosis dan lebih murah. Sampel harus diperiksa maksimal dalam waktu 3 jam setelah pengambilan sampel karena kelangsungan hidup T. evansi yang terbatas (Holland et al., 2001). Berbeda dengan pemeriksaan ulas darah, salah satu keuntungan dari PCR adalah bahwa sampel DNA dapat di proses dalam waktu lebih dari 3 jam setelah pengambilan sampel (Gonzáles et al., 2003;Singh et al.,2004).
33
Polymerase Chain Reaction (PCR) diketahui memiliki sensitivitas yang tinggi dalam hal deteksi parasit (Masake et al., 2002).Pada awal infeksi, teknik PCR menunjukkan sensitivitas 80%, sedangkan pada fase infeksi kronis, teknik PCR 2-3 kali lebih sensitif (Desquesnes and Davila, 2002).Dalam penelitian ini, ada kemungkinan bahwa Sapi Bali (Bos sondaicus) yang terdeteksi positif T.evansi berada pada fase aktif infeksi yang dibuktikan dengan ditemukan parasit yang beredar di dalam darah cukup banyak dan dapat dideteksi dengan pemeriksaan ulas darah dan PCR. Metode PCR sudah banyak dilakukan untuk mendeteksi antigen termasuk T.evansi. Polymerase Chain Reaction dapat mendeteksi infeksi T.evansi baik infeksi awal atau kronis dibandingkan dengan teknik parasitologi tradisional dan teknik serologi (Wuytset al., 1995). Salah satu faktor keberhasilan uji PCR adalah kemurnian sampel dan kadar DNA yang digunakan sebagai template. Metode PCR memiliki ambang sensitivitas yang biasanya berkisar 1 sampai 20 parasit/ml darah. Jika parasitemia lebih rendah dari tingkat ini, PCR tidak dapat mendeteksi adanya infeksi (negatif)(Desquesnes and Davila, 2002).
34
BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan Hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa morfologi Trypanosoma evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri berukuran panjang berkisar antara 23,09 – 39,94 µm dengan rata-rata 32,47 µm dan lebar 1,82 – 4,34 µm dengan rata-rata 3,15 µm, yang dikuatkan dengan hasil PCR dengan ditemukan pita dengan panjang 480 bp.
6.2. Saran Berdasarkan hasil penelitian, maka saran yang dapat diajukan adalah diperlukan penelitian lebih lanjut pada daerah lain di wilayah Indonesia terutama pada daerah sekitar Provinsi Bali untuk mengetahui tingkat kejadian penyakit surra pada Sapi Bali (Bos sondaicus) dan variasi morfologi dengan berdasarkan pengukuran morfometri yang dikuatkan dengan pemeriksaan PCR.
34
35
RINGKASAN
Hayyu Maharani.Identifikasi Trypanosoma evansipada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction. Penelitian ini di bawah bimbingan Dr. Mufasirin,drh., M.Si selaku pembimbing utama dan Retno Bijanti, drh., M.S. selaku pembimbing serta. Penyakit surra merupakan salah satu penyakit strategis yang menyerang hewan ternak yang disebabkan oleh Trypanosoma evansi.Penyakit surra pada Sapi Bali pernah terjadi di Flores, Provinsi Nusa Tenggara Timur pada tahun 1971.Sebanyak 516 ekor Sapi Bali terserang penyakit surra.Pada tahun 2009, kasus penyakit surra pada Sapi Bali juga terjadi di Kecamatan Batu Engau, Kabupaten Paser, Provinsi Kalimantan Timur.Dari 19 sampel yang diuji di laboratorium BPPV Regional V Banjarbaru terdapat 8 sampel yang positif penyakit surra. Pemeriksaan morfometri dan teknik PCR adalah metode yang penting untuk
memperkuat
diagnosis
penyakit
surra
karenaketerbatasandiagnosis
T.evansiyang ada pada teknikparasitologidan disarankan untuk menggunakan kombinasidaridua atau lebihteknik untukmeningkatkan akurasidiagnosis. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi Trypanosoma evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction.Penelitian ini dilakukan pada bulan Agustus 2015 sampai September 2015.
35
36
Penelitian ini menggunakan dua sampel darah Sapi Bali yang berasal dari Kabupaten Jembrana yang didapatkan dari Balai Besar Veteriner Bali.Darah Sapi Bali kemudian diperiksa dengan metode ulas darah. Pemeriksaan morfometri dilakukan dengan cara hasil ulas darah yang positif terdapat Trypanosoma sp. diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x dan difoto dengan menggunakan
OptiLab®.
Kemudian
hasil foto
tersebut
diukur
morfometri
Trypanosoma sp. yang meliputi panjang dan lebar tubuh, panjang dan lebar inti, panjang dan lebar kinetoplas, panjang undulating membran dan jarak inti ke kinetoplas. Selanjutnya darah Sapi Bali diekstraksi untuk memperoleh DNA. Deoxyribonucleic Acid (DNA) hasil ekstraksi kemudian diamplifikasi melalui proses PCR dengan menggunakan primer ITS1 CF/BR. Proses PCR menggunakan program persiapan dengan suhu 94º C selama 5 menit, denaturasi 94ºC selama 40 detik, anneling dengan suhu 58º C selama 40 detik, extension rantai 72º C selama 90 detik dan terminasi 72º C selama 5 menit. Proses PCR menggunakan reaksi 35 siklus. Hasil pemeriksaan morfometri Trypanosoma sp. pada Sapi Bali adalah panjang sekitar 23,09 – 39,94 µm dan rata-rata panjang adalah 32,47 µm. Lebar tubuh sekitar 1,82 – 4,34 µm dengan rata-rata 3,15 µm. Inti yang terlihat berukuran panjang 5,21 – 11,41 µm rata-rata 8,21 µm dan lebar inti sekitar 1,56 – 4,19 µm dengan rata-rata 3,10 µm. Kinetoplas yang memiliki panjang sekitar 2,34 – 9,05 µm dan rata-rata 5,16 µm, lebar antara 1,78 – 4,58 µm dengan rata-rata 2,69 µm, serta undulating membran dengan panjang sekitar 8,95 – 17,45 µm, ratarata 12,77 µm. Jarak antara inti ke kinetoplas sekitar 10,57 – 19,36 µm, rata-rata
37
14,80 µm.Hasil deteksi Trypanosoma sp.dengan menggunakan metode PCR menunjukkan hasil positif T. evansi dengan panjang pita 480 bp. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa morfologi T. evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri berukuran panjang berkisar antara 23,09 – 39,94 µm dengan rata-rata 32,47 µm dan lebar 1,82 – 4,34 µm dengan rata-rata 3,15 µm, yang dikuatkan dengan hasil PCR dengan ditemukanpita dengan panjang 480 bpdan disarankan perlu penelitian lebih lanjut di daerah lain terutama daerah yang berada di sekitar Kabupaten Jembrana dan Kabupaten di Provinsi Bali serta daerah lain di Indonesia.
38
DAFTAR PUSTAKA Adrian, S.M., A.S. Rehana, L. Hassan and M.T. Wong, 2010. Outbreaks of trypanosomiasis and the seroprevalence of Trypanosoma evansi in a deer breeding centre in Perak, Malaysia. Trop. Anim. Health. Product.42 (2):145-150. Ausvetplan. 2006. Disease Strategy Surra. Australia: Primary Industries Ministerial Council OIE. 2008. Trypanosoma Evansi Infection (including surra). Belgium. Bacchi, C.J., 2009. Chemotherapy of human African Trypanosomiasis.Interdisciplinary Perspective Infectious Disease.1–5. Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner Regional V Banjarbaru.2009. Peta Hasil Pengujian Hewan Kalimantan. Clausen, P.H., A. Wiemann, R. Patzelt, D. Kakaire, C. Poetzsch, A. Peregrine and D. Mehlitz, 1998. Use of a PCR assay for the specific and sensitive detection of Trypanosoma sp. in naturally infected dairy cattle in peri-urban Kampala, Uganda. Ann. N.Y. Acad. Sci. 849:21–31. Dargantes, A.P., R.S.F. Campbell, D.B. Copeman and S.A. Reid. 2005. Experimental Trypanosoma evansi infection in the goat. II. Pathology. J. Comp. Pathol. 133(2):267-276. Dávila, A.M., H.M. Herrera, T. Schlebinger, S.S. Souza andY.M. Traub-Cseko, 2003.Using PCR for unraveling the cryptic epizootiology of livestock Trypanosomosis in the Pantanal, Brazil. Vet. Parasitol. 117:1–13. Desquesnes, M., and A.M.R. Dávila. 2002. Applications of PCR-based tools for detection and identification of animal Trypanosomes: a review and perspectives. Vet.Parasitol. 109:213–231. Duvallet, G., S. de La Rocque, J.M. Reifenberg, P. Solano, T. Lefrançois, J.F. Michel, Z. Bengaly, I. Sidibe, D. Cuisance and G. Cuny. 1999. Review on the molecular tools for the understanding of the epidemiology of animal Trypanosomosis in West Africa. Mem.Inst. Oswaldo Cruz. 94: 245–248. Elshafie, E.I., R.A. Sani, L. Hassan,R. Sharma, A. Bashir,and I.A. Abubakar. 2013. Seroprevalence and risk factors of Trypanosoma evansiinfection in horses in Peninsular Malaysia. Res.Vet. Sci. 94: 285-289. FAO. 1994. In "A systematic approach to tsetseand Trypanosomiasis Control, Proceedingsof the FAO Panels of Experts, Rome Dec.
38
39
Geneaid. 2014. gSYNC T M DNA Extraction Kit. 1-10. Gill, B.S., 1977.Trypanosomes and Trypanosomiasis of Indian Livestock. ICAR, New Delhi. González, E., B. González-Baradat, R. González, N. Linares, A. Mijares, T. Perrone and M. Mendoza. 2006. Development oftechniquepolymerasechain reactionfor diagnosisof animalTrypanosomosiscaused byTrypanosoma evansi.Agro. Trop. 56:496–500. Gumilar, G., F. M. T. Supriyanti dan H.H. Siti., 2008.Bioteknologi. Jurusan Pendidikan Kimia FMIPA UPI. Bandung. Guntoro S., 2002. Membudidayakan Sapi Bali.Kanisius.Yogyakarta. Handiwirawan, E. dan Subandriyo. 2004. Potensi dan keragaman sumberdaya genetik sapi bali. Lokakarya Nasional Sapi Potong. Pusat Penelitiandan Pengembangan Peternakan. Hlm. 50-60. Hardjosubroto, W., 1994. Aplikasi Pemuliabiakan Ternak di Lapangan. PT. Gramedia Widiasarana Indonesia. Jakarta. Herrera, H.M., L.P.C.T. Aquino, R.F. Menezes, L.C. Marques, M.A.V. Moraes, K. Werther and R.Z. Machado.2001.Trypanosoma evansiexperimental infection in South American coati (Nasua nasua): clinical, parasitological and humoral immune response. Vet. Parasitol. 102: 209–216. Herrera, H.M., A.M.R. Davila, A. Norek, U.G. Abreu, S.S. Souza, P.S. D’Andrea andA.M. Jansen. 2004. Enzootiology of Trypanosoma evansi in Pantanal, Brazil.Vet.Parasitol. 125:263–275. Hoare CA., 1972. The Trypanosomes of Mammals: a zoological monograph. Blackwell Scientific Publications, Oxford, U.K, 749. Holland, W.G., F. Claes, N.G. Thanh, P.T. Tam and D. Verloo et al., 2001.A comparative evaluation of parasitological tests and a PCR for Trypanosoma evansi diagnosis in experimentally infected water buffaloes. Vet. Parasitol.97: 23-33. Ismudiono, N. D. Retno, H. Anwar, R. Sidik, K. Soepranianondo, Y. Dhamayanti, R.S. Wahyuni, P. Srianto, D.S. Nazar, B. Sektiari, M. Yunus, F.A. Ratam, T. Nurhayati, dan S. Prawestirini. 2006. Laporan studi Kelayakan Pendirian Pusat pembibitan dan Pengembangan Ternak Kerbau Rawa di Kabupaten Kutai Kartanegara Kalimantan Timur. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya.
40
Javid, A.K., A. Fayaz, Z.C. Mohammad, A.D. Javid, and T. Hidayatullah. 2013. On Morphology and Morphometry of Trichuris ovis Abildgaard, 1795 Recovered from Ruminants of Ladakh, India. J. Buffalo Sci. Res. 2:49-52. Jefrey, H.C and Leach., 1983. Atlas Helminthologi dan Protozoologi Kedokteran. Edisi II. Penerbit E.G.C. Jakarta.Hlm : 61 – 63. John, M.C., S. Nedunchelliyan, and K.S. Venkataraman. 1992. Biometrical observations on different strains of Trypanosoma evansi. Vet. Parasitol. 43: 143-145. Jones T. W., R.C. Payne,I.P. Sukanto, dan S. Partoutomo. 1996. Trypanosoma evansi in the republic of Indonesia. Proceedings of the first Internet Conference on Salivarian Trypanosomes. FAO anim. prod. 136. Levine, N. D. 1985. Veterinary Protozoology.1 st Edition.Iowa Statet University Press. Ames. Losos, G.J. 1986. Infectious Tropical Disease of Domestic Animal.IDRC. Canada. Hlm : 183 – 263. Luckins, A. G., 1998. Epidemiology of Surra: unanswered questions. J. Protozool. Res. 8:106-119. Luckins, A.G., N. Mclntyre, and P. Rae. 1992. Multiplication of Trypanosoma evansi at the site of infection in skin of rabbits and cattle. Acta Tropica. 50:19-27. Manuel, M. F., 1998. Sporadic outbreaks of Surra in the Philippines and its economic impact.J. Protozool. Res. 8:131-138. Masake, R.A., J.T. Njuguna, C.C. Brown, and P.A.O.Majiwa. 2002. The application of PCR ELISA to the detection of Trypanosoma brucei and T. vivax infections in livestock. Vet.Parasitol. 105:179-189. Mastra, I.K., 2011. Seroprevalensi Trypanosomiasis Di Pulau Sumbawa, Propinsi Nusa Tenggara Barat. Buletin Veteriner, BBVet Denpasar.23:79 Maudlin, I., P.H. Holmes, and M.A. Miles. 2004. The Trypanosomiasis. CABI PublishingCAB International, Oxfordshire, U.K. 25–30, 283–331. McCool, C. 1992. Buffalo and Bali cattle: Exploiting their reproductive behaviour and physiology. Trop. An. Health and Product.24: 165. Monzon C.M., O.A. Mancebo,and J.P. Roux. 1990. Comparison between 6 parasitological methods for diagnosis of Trypanosoma evansi in the subtropical area of Argentina. Vet. Parasitol. 36:141–146.
41
Moran.J.B., 1990.Performans dari sapi-sapi Pedaging di Indonesia dalam Kondisi Pengelolaan Tradisional dan Diperbaiki. Laporan Seminar Ruminansia II. Pusat Penelitian dan Pengembangan Ternak. Bogor. Morrison. W.I., M. Murray and W.I. McIntrye. 1981. Bovine Trypanosomiasis. Desease of Cattle In The Tropic. Martinus Nijhoff Publisher. London. Hlm: 469 – 496. Murray, R.K., D.K. Granner dan V.W. Rodwell.2006. Biokimia Harper. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Naipospos, T. S. P., P.P. Suseno, C. Basri, M.Z. Hasan, D. Sudiana., dan H. Latif. 2014. CIVAS. Trypanosomiasis (Surra). Nantulya, V. M., 1994. Suratex: a simple latexagglutination antigen test for diagnosis ofTrypansoma evansi suratex infections(surra). Trop. Med. Parasitol. 45(1):9-1. Njiru, Z.K., C.C. Constantine, S. Guya, J. Crowther, J.M. Kiragu, R.C. Thompson, and A.M. Davila. 2005. The use of ITS1 rDNA PCR in detecting pathogenic African Trypanosomes. Parasitol. Res. 95:186–192. Noble, E.R and G.A. Noble., 1982. Parasitologi ( Biologi Parasit Hewan ). Gadjah Mada University Press. Hlm:67 – 69. Office International des Epizootics (OIE). 2009. Manual ofDiagnostic Tests and Vaccine for Terrestrial Animals. New York, USA. Pane, I., 1990.Upaya peningkatan mutu genetik sapi Bali di P3 Bali.Prosiding Seminar Nasional Sapi Bali.Bali. Partoutomo, S., 1996.Trypanosomiasis Caused by Trypanosoma evansi (Surra) in Indonesia. Proceeding of A Seminar on Diagnostic Techniques for Trypanosoma evansi in Indonesia. Balitvet, Bogor: 1-9. Payne, R. C., I. P. Sukanto, D. Djauhari, D. Partoutomo, S. Wilson, A. J. Jones,R. Boid, and A. G. Luckins., 1991.Trypanosoma evansi infection in cattle, buffaloes andhorses in Indonesia. Vet. Parasitol. 38:109-119. Pereira, D. E., P. J. L. Almeda, M. Ndao, B. Goosens, and S. Osaer.1998. PCR primer evaluation for the detection of Trypanosome DNA in naturally infected goats. Vet. Parasitol.80:111-116.
42
Putu, I.G., P. Situmorang, A. Lubis, T.D. Chaniago, E. Triwulaningsih, T. Sugiarti, I.W. Mathius dan B. Sudaryanto. 1998. Pengaruh pemberian pakan konsentrat tambahan selama dua bulan sebelum dan sesudah kelahiran terhadap performan produksi dan reproduksi sapi potong. Prosiding Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner. Bogor. Reid S.A., A.Husein,andD.B. Copeman. 2001. Evaluation and improvement of parasitological tests for Trypanosoma evansi infection. Vet. Parasitol. 102: 291–297. Ressang, A.A., 1984. Trypanosomiasis. Patologi Khusus Veteriner. Edisi II. Airlangga University Press.Hlm : 347 – 359. Sasmita, R., P. Hastutiek, A. Sunarso, dan M. Yunus. 2013. Buku Ajar Arthropoda Veteriner. Airlangga University Press. Surabaya. Singh, N., K.M.L. Pathak, and R. Kumar. 2004. A comparative evaluation of parasitological, serological and DNA amplification methods for diagnosis of natural Trypanosoma evansi infection in camels. Vet. Parasitol.126:365-373. Sivarajasingham, S., 1992. Improvement of indigenous cattle and buffalo breeds in South East Asia. Proceeding of the 6th AAAP Animal Science Congress. Bangkok. 151. Solihat, L. 2002. Proses Pemeriksaan Sampel Penyakit-Penyakit Parasit Darah di Laboratorium Parasitologi Balivet. Temu Teknis Fungsional Non Peneliti. Soulsby, E. J. L., 1982.Helminths, Arthropods, and Protozoa of Domesticated Animals.7th ed.Lea and Febriger. London. 514:532-536. Stephen, L.E.,1986. Trypanosomiasis: a veterinary perspective. Pergamon Press, Oxford. Sukanto, I.P., 1994. Petunjuk diagnosa parasit darah Trypanosoma, Babesia dan Anaplasma dan Prosiding Seminar Penelitian Parasit Besar di Indonesia. Bogor. Hlm: 23-28. Sutan, S.M., 1988. Perbandingan Performans Reproduksi dan Produksi antara Sapi Brahman, Peranakan Ongole dan Bali di Daerah Transmigrasi Batumarta, Sumatra Selatan.Institut Pertanian Bogor. Bogor. Talib, C., A. Bamualim, dan A.Pohan., 1998. Problematika pengembangan sapi bali dalam pemeliharaan di padang penggembalaan. Prosiding Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner. Bogor.
43
Tamarit, A., M.T. Tejedor-Junco, M. González, J. Alberola And C. Gutierrez. 2011. Morphological and biometrical features of Trypanosoma evansi isolates from an outbreak in mainland Spain. Vet. Parasitol. 177: 152-156. Tanari, M., 2001. Usaha Pengembangan Sapi bali sebagai Ternak Lokal dalam Menunjang Pemenuhan Kebutuhan Protein asal Hewani di Indonesia. Tejero F., A. Roschman-González, T.M. Perrone-Carmona, and P.M. Aso. 2008. Trypanosoma evansi: A quantitative approach to the understanding of the morphometry-hematology relationship throughout experimental murine infections. J. Protozool. Res. 18: 34-47. Thumbi, S. M., F. A. McOdimba, R. O. Mosi, and J. O. Jung’a., 2008.Comparative evaluationof three PCR base diagnostic assays for the detection of pathogenic Trypanosomes in cattleblood.Parasitol.Vec. 1:1-7. Vellayan, S., M. Aidi,R.W. Radcliffe,L.J. Lowenstine,J. Epstein,S.A. Reid,D.E. Paglia, R.M. Radcliffe, T.L. Roth, T.J. Foose, M. Khan, V. Jayam, S. Reza, and M. Abraham.2004. Trypanosomiasis (Surra) in The Captive Sumatran Rhinoceros (Dicerorhinus Sumatrensis Sumatrensis) in Peninsular Malaysia. Int Congr Entomol Proc Trop Vet. Med. 11:187-189. Wibisono A., 2009. Silsilah sapi Bali. Wiser, M.F., 1999.Kinetoplastids.www.fao.org. Wuyts N., N. Chokesajjawatee, N. SarataphanAnd S. Panyim. 1995. PCR amplification of crude blood on microscope slides in the diagnosis of Trypanosoma evansiin dairy cattle. Ann. Soc. Belge Med. Trop. 75:229– 237. Yuwono, T., 2006.Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Penerbit Andi. Yogyakarta.
44
LAMPIRAN 1.Gen Trypanosoma evansi
ORIGIN 1. ttagccatgc tcattacatc 61. gacgtaatc tggcgaaacg 121. ccaagctaat ttgtgtttac 181. gcacttgtcg acgcctccac 241. ccgggggcag gccgagcctt 301. gttgctcggc gtgtagtgga 361. ctgccatggc gagcctgaga 421. aatagctacc cgaaaaaata 481. cgatgaggca gttttcaatg 541. ggggatactc ggtgccagca 601. cccgcggtaa agggttcgta 661. gttgaactgt ggacgtgttt 721. tgacccacgc gagcggttcc 781. tcctcacttt ctgtgaccaa 841. aaaagtgcga acgaagcatc 901. agccctgggg gattatgggg 961. ccgcgtgcct tcggctcttc 1021. gtgatgtttt gggtagttcg 1081. ggggagaacg acgaactaca 1141. gcgaaggcat ggatcaaaga 1201. tgattagaga ggggaacatc 1261. attgggtgcc tttatcaatt 1321. tacgtgccta gttttttacg 1381. ggaatatcct acagtctcag 1441. gggggagtac ccacaagacg 1501. tggagcgtgc gacagggtga
atgcctcaga tgccgccaaa
atcactgcat attttgcggt
tgcaggaatc
tgcgcatggc
ctccgcatta
ctggataact
acatgaacca
atcggacgct
ctctttttct
atgtcgcggc
tggcgatggg
acgtccagcg
aatgaatgaa
attagaacca
taacactcag
acgtgttgac
tcaattcatt
ccgtgcgaaa
gtctactgac
gaacaactgc
cctatcagcc
agtgatggcc
gttgacggga
gcgggggatt
agggttcgat
tccggagagg
acttctacgg
agggcagcag
gcgcgcaaat
tgcccaatgt
gcgaaaagaa
atagagccga
ccgtgcccta
gtgcatggtt
aaacccatcc
aatatcgagt
aacaattgga
ggacaagtct
ttccagctcc
aaaagcgtat
attaatgctg
ttgctgttaa
gggccacgta
gttttgtgcc
gtgccagtcc
cgtccacctc
cctcgtggcc
cgtgaacaca
ctcagataca
agaaacacgg
cacgcatgtc
atgcatgcga
gggggcgtcc
gtgaatttta
ccaaagcagt
ctgccgactt
gaattacaaa
gcatgggata
ccaccgtttc
ggcttttgtt
ggttttagaa
gtccttggga
tgggtcggtg
tttcgtgtct
catttttgtg
gcgcgcacat
tttacattca
ttgcgacgcg
cggcttccag
gaatgaagga
tactggtgcg
tcagaggtga
aattcttaga
ccgcaccaag
tcttcaagga
taccttcctc
aatcaagaac
caaagtgtgg
ccattgtagt
ccacactgca
aaccatgaca
cccatgaatt
cgtgtggcgg
ccttttgtgc
cgaccctcgg
ccccaattta
ttctatcacc
cccggttccc
tcttttgagg
ttcttccggg
cagcacgttt
cttacttctt
cacgcgaaag
cttggaggtt
gttcgcaaga
gtgaaactta
aagaaattga
cggaatggca
ggtttaattt
gactcaacac
ggggaacttt
accagatccg
45
1561. ggattgacag atggagtgtt ctttctcgat cccctgaatg gtggtgcatg gccgcttttg 1621. gtcggtggag tgatttgttt ggttgattcc gtcaacggac gagatccaag ctgcccagta 1681. ggtgccggga ttgtccacac aggacagcag tccctccggc ggggattttt tccccaacgg 1741. tggtcgtcat ccttcttttt acaggcccct tctctgcggg attccttgct tttcgcgcaa 1801. ggtgagattt tgggcaacag caggtctgtg atgctcctca atgttctggg cgacacgcgc 1861. actacaatgt cagtgagaac aagagtccga gcggcacttc acaatgtcgc tcccgcttga 1921. tcaaaagagc ggggaaacca cggaatcacg tagacccact tgggaccgag tattgcaatt 1981. attggtcgcg caacgaggaa tgtctcgtag gcgcagctca tcaaactgtg ccgattacgt 2041. ccctgccatt tgtacacacc gcccgtcgtt gtttccgatg atggtgcaat acaggtccgg 2101. aagttcaccgatattggatc ggaccgtcgctccgggcgaccgacttcaat agaggaagca 2161. aaagtcgtaa caaggtagct gtaggtgaac ctgcagctgg atcattttct gatatccatt 2221. atacaaaaaa gagcatattt atgtgcatgt ataaattgca cagtatgcaa ccaaaaatat 2281. acatatatgt tttacatgta tgtgtttcta tatgccgttt gacatgggag atgagggatg 2341. ctatacatag ttctgttatt ttctatcatg tatgtgtgtt agagtgtctg tgttaatata 2401. ctttttaatg catgctctac ataatataca gtagtaataa cacagagaat acgtatggaa 2461. tgcgtatctc tctatatata tttatgtata tatgctatgt gtatatcaac ctcgcatatt 2521. ttctccctgt tgaccacggc tcccacaacg tgtcgcgatg gatgacttttcttcctagtt 2581. cgttgaagaacgcagcacgc gcaagatgcgatcaattgta gcagaatcat ttcattgccc 2641. aatctttgaa cgcaaacggc gcatgggaga agctctctcg agccatcccc gtgcatgcca 2701. catttctcag tgtcgaatat aaaaacaaaa cacacaccta ttttgtgttg ttcaacgcac 2761. gcaaaaaatc ccgccacctc tttctcctcg tgtggtgcat attcatgttt gtgagtgtgc 2821. acatatacga tatctttcaa ctctttctac tcgcacgatg gtgtatgtca cgcatatacg 2881. tgtgtgtagt gagtgatatg gaagagaaat gggaaaggca tatatatata tgtatataca 2941. taatatatat gtgtgtggat ttgtgtgttg agcacatata aggaaaaagg ttgtgtgtat 3001. atacagagag tctgtggcgg ttgggacatg tgtataaata tatatatgta tatgtgtgtg 3061. ttccgctgtg gagattttat atcttacgga gagtgttcat atatatatgt ttgtacgcat 3121. gtattttggc gccccgtata gagattaaaa aagaagagaa aaagtatgca aaagaggcgg 3181. cggatagtgt gtatgtgtgt attcacagca agcaactata ttttgctgct tgtgagtata
46
3241. tgcatatatg tacattatgt ttttatattg 3301. catttttcag acctgagtgt tactcagcgg 3361. aggaaaagaa aacaa
2.
gcttgtgctt
ctttcgtgta
cgcttcactt
ggcaggacca
cccgctaaac
ttaagcatat
Letak penempelan primer foward ITS1 CF/BR pada sequenze gen Trypanosoma evansi A lignment s tatis tic s for matc h #1
Score
Expect
Identities
Gaps
Strand
3 2 .2 bits(1 6)
9 e- 0 6
1 6 /1 6(100%)
0 /1 6 (0%)
P lus /Plus
Query
5
AAGTTCACCGATATTG
20
|||||||||||||||| Sbjct 3.
2117
AAGTTCACCGATATTG
2097
Letak penempelan primer reverse ITS1 CF/BR pada sequenze gen Trypanosoma evansi Al i gnment st at i st i cs f or mat ch # 1
Score
Expect
Identities
Gaps
Strand
38.2 bits(19)
1e-07
19/19(100%)
0/19(0%)
Plus/Minus
Query
1
TGCTGCGTTCTTCAACGAA
19
||||||||||||||||||| Sbjct
2597
TGCTGCGTTCTTCAACGAA
2578
Sumber : National Center of Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov)
