Honden en Katten als Stille Getuigen Daniëlle Hoogmoed, MSc.
‘State of Washington’ versus ‘Kenneth Leuluaialii and George Tuilefano’, 1996 • Een echtpaar en hun hond dood aangetroffen in de woning. • De politie heeft twee verdachten op het oog. • Menselijk DNA-onderzoek leidt tot onbruikbare DNAprofielen. • Uit hondenbloed op de kleding van beide verdachten, wordt echter wel een duidelijk DNA-profiel verkregen. • Dit DNA-profiel van de kleding van de verdachten matcht met het DNA van de dode hond van de slachtoffers. • Dit dierlijke spoor is uiteindelijk het belangrijkste stukje bewijs voor de vervolging van de twee verdachten.
Introductie • Biologische sporen van dieren, planten en bacteriën worden steeds vaker voor forensisch DNA-onderzoek gebruikt. – Zoals bij inbraken, illegale handel, vermissing, mishandeling en moord.
• Dierlijke biologische sporen zijn o.a.: – – – – –
Bloed Speeksel Weefsel Haren Botten
• Bij bovenstaande sporen kan dierlijk DNA-onderzoek plaatsvinden.
Waarom worden dierlijke biologische sporen gebruikt bij forensisch onderzoek? • Dieren zijn zeer vaak aanwezig in de humane samenleving. – Honden en katten zijn de meest voorkomende huisdieren in Europa en Verenigde Staten.
• Dierlijke sporen kunnen dus van groot belang zijn bij misdrijven.
Waarom worden dierlijke biologische sporen gebruikt bij forensisch onderzoek? • Dieren kunnen het slachtoffer zijn. – Mishandeling en geweld door mensen of andere dieren.
• Dieren kunnen de dader zijn. – Aanvallen van mensen/ kinderen en andere dieren (bijtincidenten).
• Dierlijke sporen kunnen een link vormen: – Tussen een misdrijf/ plaats delict en een verdachte. – Tussen een verdachte en een slachtoffer.
Welke vragen kunnen beantwoord worden met dierlijke biologische sporen? • Bronniveau: – Wat is dit voor biologisch spoor? – Wie is de donor van dit biologische spoor?
• Activiteitenniveau: – Hoe komt dit biologische spoor hier? – Waar leidt dit biologische spoor naartoe?
• Dit is belangrijk voor het maken van reconstructies en het verifiëren van verklaringen van getuigen/ verdachten.
Welke vragen kunnen beantwoord worden met dierlijke biologische sporen? • Wat is dit voor biologisch spoor?
• Classificeren: – Het aangetroffen spoor is bloed. Dit bloed is afkomstig van een hond. • Wie is de donor van dit biologische spoor?
• Individualiseren: – Het DNA-profiel van het hondenbloedspoor matcht met het referentie DNA-profiel van Rex.
De onderzoeksketen • De politie is als eerste ter plaatste bij een misdrijf. • De forensische opsporing onderzoekt het plaats delict en neemt ‘samples’. • Deze ‘samples’ worden onderzocht bij een forensisch instituut, zoals het NFI. • Het gehele onderzoek wordt uitgevoerd in opdracht van de Officier van Justitie.
De onderzoeksketen • Bij het NFI wordt een onderzoeksplan opgesteld. • Vervolgens worden ‘stukken van overtuiging’ onderzocht op sporen. Indien sporen worden aangetroffen worden verdere laboratorium analyses uitgevoerd. • Als eindproduct wordt een rapport geschreven aan de Officier van Justitie, wat in de rechtbank wordt gebruikt. • Tijdens het hele proces is de kwaliteit gewaarborgd.
Zoeken naar sporen Blote oog
Microscopisch
Technieken welke worden gebruikt bij forensisch DNA-onderzoek DNA-isolatie
Specifiek DNA vermenigvuldigen met Polymerase kettingreactie (PCR)
DNA zichtbaar maken met capillaire gelelektroforese
DNA-isolatie op het forensische lab
Lyseren (= kapot maken) van cellen (4 - 16 uur) DNA bindt aan membraan Overige celonderdelen worden wegwassen DNA elueren(= losmaken van membraan) in een DNA vrij epje
PCR •
Verwarmen tot ± 94 °C DNA-strengen gaan uit elkaar
•
Afkoelen tot ± 55 °C Primers plakken aan enkele DNA strengen
•
Verwarmen tot 72 °C Enzym DNA polymerase maakt nieuwe DNA-strengen vanaf primer
•
Ongeveer 25-30 keer herhalen: DNA verdubbelt iedere cyclus
Capillaire gel-elektroforese • Kan op 1 base nauwkeurig scheiden • Er kunnen twee typen analyses worden uitgevoerd: – Fragment analyse: Verschil in grootte bij meerdere stukjes specifiek DNA
– Sequence analyse: Het achterhalen van de sequentie/basenvolgorde van een specifiek stukje DNA
Capillaire gel-elektroforese
1500
1000
500
Tijd (t)
Dierlijk forensisch DNA-onderzoek
Haplotype bepaling, D-loop regio Individualiseren, STR’s (Short Tandem Repeats)
DNA • Elke lichaamscel bevat hetzelfde DNA. – Geslachtscel bevat de helft van het DNA. Karyogram Hond (78 chromosomen)
Karyogram Kat (38 chromosomen)
DNA-onderzoek • Mitochondriaal DNA: – – – –
Is veelvuldig aanwezig in cellen. Wordt door moederlijke lijn doorgegeven. Classificeren van dieren. Kan goed uit haren worden gehaald.
• Nucleair DNA: – – – –
Bevat al het erfelijke materiaal van de vader en moeder. Individualiseren van dieren. Verwantschapsonderzoek. Maar is erg moeilijk uit haren te halen, hiervoor is de haarwortel nodig.
Coderend versus niet-coderend DNA • DNA is voor een deel coderend. – Dit is minder dan 2 % van het DNA. – Genen zijn de coderende delen (uiterlijke kenmerken).
• Het overgrote deel van DNA is niet coderend. – Meer dan 98 % van het DNA is niet coderend. – Dit zegt niets over de uiterlijke kenmerken. – o.a. short tandem repeats en D-loop regio
Primers • Primers zijn kleine stukjes enkelstrengs DNA welke gericht zijn tegen een specifiek stuk complementair DNA. • De forward en reverse primer dienen als startpunt voor de PCR.
• Diersoort specifieke primers worden gebruikt, om te analysen van welke diersoort een spoor afkomstig kan zijn. – Bijvoorbeeld: Het bloedspoor is afkomstig van een hond.
Haplotype bepaling, D-loop regio • Met een haplotype bepaling kan bijvoorbeeld een hond in een ‘groep’ worden ingedeeld (classificeren). – Vergelijkbaar met bijvoorbeeld bloedgroepen. – Bijvoorbeeld: Het hondenbloedspoor heeft haplotype A en de referentiehond heeft haplotype C. – Het hondenbloedspoor en het referentiemateriaal komen niet overeen op haplotype.
Individualiseren, Short tandem repeats (STR) • Met een STR-methode kan een karakteristiek DNAprofiel van bijvoorbeeld een hond worden verkregen (individualiseren). – Bijvoorbeeld: Het DNA-profiel van het hondenbloedspoor matcht (niet) met het DNA-profiel van de referentiehond. – De kans van voorkomen van het DNA-profiel (bewijswaarde) van de match wordt uitgerekend. • Voor Humaan DNA-onderzoek is de kans van voorkomen voor een volledig DNA-profiel minimaal 1 op de 1.000.000.
Individualiseren, Short tandem repeats • Basis van forensisch DNA-onderzoek. – 4 basen steeds herhaald (bv. GCAC-GCAC-GCAC).
• Het aantal herhalingen is het DNA-kenmerk. – Wordt weergeven met een cijfer.
• Het aantal herhalingen van Short Tandem Repeats (STR) kan voor iedere hond verschillend zijn. – De sequence van STRs voor alle honden is hetzelfde .
Short Tandem Repeat (STR)
CTAGTAACCT TCATTCATTC ATTCATTCAT TGACTGTTCA TGTT
CTAGTAACCT TCATTCATTC ATTCATTGAC TGTTCATGTT TCAT
Chromosoom 1
TCAT
TCAT
4
TCAT
TCAT
TCAT
TCAT
5
TCAT
TCAT
Homozygoot
Heterozygoot
STRs voor Humaan Forensisch DNAonderzoek
Bron: 'De Essenties van forensisch biologisch onderzoek; Humane biologische sporen en DNA' en/of A.J. Meulenbroek.
Puzzelen met Pieken
STRs voor dierlijk forensisch DNAonderzoek • Dit is een opkomend gebied, eerst lag de focus in de forensische wetenschappen op humane biologische sporen. • Voor humaan DNA-onderzoek zijn meerdere gevalideerde STRkits verkrijgbaar op de markt. • Dit is nog niet het geval voor alle diersoorten, forensische labs kunnen ‘in-huis’-methoden ontwikkelen, valideren en gebruiken. – In de literatuur wordt gezocht naar mogelijke kandidaat STRs voor dierlijk forensisch DNA-onderzoek. – Geschikte STRs voldoen aan meerdere criteria. – Geselecteerde STRs worden getest, geoptimaliseerd en gevalideerd.
Criteria selectie geschikte STRs vanuit literatuur • Duidelijke en ondubbelzinnige STRs. • Robuuste amplificatie met PCR. – Werkzaam onder suboptimale condities, zoals gedegradeerd DNA of een lage concentratie DNA.
• De STR moet een hoge discriminerende waarde hebben. • Meerdere geselecteerde STRs moeten in multiplex geamplificeerd kunnen worden. • STRs in multiplex moeten onafhankelijk overerven. • Er moeten geen tot weinig artefacten gevormd worden. • Idealiter zijn de specifieke forward en reverse primer sequenties bekend.
Geselecteerde STRs worden in het lab getest • Er wordt getest of de geselecteerde STRs en bijbehorende primers werkzaam zijn. • Als een multiplex STR-methode is opgezet wordt deze: – Geoptimaliseerd (condities van lab apparatuur aanpassen) – Gevalideerd (goedgekeurd voor gebruik bij forensische zaken).
Gevalideerde dierlijke STR-methode voor Forensisch DNA-onderzoek • Indien een gevalideerde STR-methode voor bijvoorbeeld katten is opgezet, kan men: – Individualiseren – Welke kat is de donor van dit spoor? • Kan van belang zijn bij zeer uiteenlopende misdrijven (zoals moord, mishandeling, inbraak en vermissing).
– Verwantschapsonderzoek uitvoeren – Wie zijn de ouders van deze kat? • Kan van belang zijn bij het fokken van (ras)dieren en vervalsing van documentatie.
Rapportage DNA-onderzoek • Classificeren: Het aangetroffen spoor is bloed. Dit bloed is afkomstig van een hond. Het haplotype van het hondenbloedspoor is A en komt (niet) overeen met één of meerdere van de referentiehonden. • Individualiseren: Het DNA-profiel van het bloedspoor matcht (niet) met het DNA-profiel van de referentiehond. – Indien een match wordt gevonden: De geobserveerde match is (zeer veel) waarschijnlijker indien deze hond de donor is van het bloedspoor dan dat een random niet-gerelateerde hond de donor is van het bloedspoor.
Andere toepassingsgebieden van dierlijk biologisch forensisch onderzoek • CITES, Beschermen van bedreigde diersoorten (ivoor, tijgervel, traditionele medicijnen). • Smokkel van illegale goederen. • Tegengaan van illegale jacht (konijnen, hazen). • Reconstructie laatste maaltijd van een menselijk slachtoffer (vis, varken, koe, kip). • Post mortem interval/ tijd van overlijden bepalen met insecten.
Andere toepassingsgebieden van niethumaan biologisch forensisch onderzoek • Bacteriën – Aantonen van fecaal materiaal.
• Schimmels – Verboden paddenstoelen, hallucinogeen en giftig.
• Planten – CITES en smokkel, verboden planten als hennep, maaginhoud, individualisatie, verdachte linken aan een plaats.
Conclusie • Er is meer dan enkel humane biologische sporen voor Forensisch onderzoek. • Dierlijke, plantaardige, schimmel en bacteriële biologische sporen kunnen zeer belangrijk zijn bij Forensisch onderzoek. • Bij uitlopende zaken als mishandeling, geweld, overval, moord, smokkel vervalsing documentatie, vergiftiging en illegale handel. • Geld is nu nog vaak een beperkende factor. In de verenigde Staten is nu een groot bewustzijn, van het belang van niethumane biologische sporen.
Afsluitende lessen Puzzelen met pieken • Verdieping in forensisch DNA-onderzoek – – – –
Short Tandem Repeats Wie van de drie? DNA-mengprofielen (binnenkort) Dieren en DNA (binnenkort)
Vragen?
[email protected] Melanie Rosenhart Coördinator “Forensisch DNA-onderzoek: Puzzelen met Pieken”
Nog dit voorjaar een bezoek van een DNA-lab aan uw school? Er zijn nog enkele plaatsen beschikbaar: •Taal van de tumor – 3 •Puzzelen met pieken – 10 (reizend) en 11 (locatie Amsterdam) •Prenataal onderzoek bij planten – 9 •Bioinformatica: leven in de computer (doe-het-zelf variant) - 17 Inschrijven via onze website www.dnalabs.nl
Inschrijving najaar 2013 start op donderdag 23 mei
It’s Academy Van alles met DNA doe je bij
• Science labs – DNA fingerprinting – Forensisch DNA-onderzoek puzzelen met pieken • Ook met Profielwerkstuk ondersteuning (6 november en 7 mei) – Googelen met genen • En meer… Masterclasses, science labs individueel en leskisten (zie flyer) Meer informatie: www.itsacademy.nl of mail Bart Groeneveld:
[email protected]
