5.1.2.
Hoge druk vloeistofchromatografie
Analytische vloeistofchromatografie gebeurt meestal in stalen kolommen met kleine partikels onder hoge druk. Deze techniek, aangeduid als 'High Pressure Liquid Chromatography' (HPLC; later werd deze afkorting door sommigen ook gebruikt voor 'High Performance Liquid Chromatography'), ontstond eind van de jaren 50 en werd uitgebouwd tijdens de jaren 60. Een typisch HPLC systeem bestaat uit een pomp, een injectiesysteem, een kolomsysteem (een analytische kolom, een guard kolom, de leidingen met fittings), en de detector(en). Het geheel wordt in moderne systemen gestuurd door software en kan eventueel nog uitgebreid worden met een fractiecollector [Figuur 5.6].
Figuur 5.6. Schema van een isocratische hoge druk chromatograaf.
5.1.3.
Vergelijking van conventionele chromatografie en HPLC
Tussen conventionele lage druk chromatografie en HPLC zijn een aantal grote verschillen (zie ook Tabel 5.3). Bij conventionele chromatografie bestaat het vulmateriaal van de kolom uit relatief grote partikeldeeltjes (100 tot 150 µm) en heeft de kolom een diameter van 1 cm of groter. De lineaire loopsnelheid is laag, vaak in de grootorde van mm/min, nodig om samendrukken van de partikels te voorkomen. De druk is bijgevolg laag en de kolom kan dus bestaan uit glas of polycarbonaat. Dergelijke chromatografie duurt relatief lang, en wordt toegepast op grotere hoeveelheid staal, vaak tot grammen groot. Zij is meestal preparatief, bv. zuivering van eiwitten, en de fracties worden vaak opgevangen voor verder onderzoek. HPLC is een typische analytische techniek (maar kan ook preparatief aangewend worden). Om de scheiding te vergroten wordt de partikelgrootte sterk verkleind, meestal tot 3 - 10 µm. Dit leidt tot een snellere uitwisseling tussen mobiele en stationaire fase waardoor de loopsnelheid kan vergroten (5-10 cm/min). De diameter van de kolom wordt kleiner, meestal 2-5 mm. Een kleiner partikel heeft echter een hogere weerstand tegen de loopvloeistof die ertussendoor moet, zodat hoge druk noodzakelijk is om een hoge loopvloeistofsnelheid te bereiken. Meestal bereikt men drukken tussen 1000-3000 psi wat overeenkomt met meer dan 100 kg/cm². De kolomwand is in staal gemaakt om aan dergelijke 45
druk te weerstaan, en de pomp moet op een gelijkmatige wijze het solvent onder hoge druk met een gelijk debiet kunnen sturen. Essentieel voor de ontwikkeling van HPLC was de verkleining van de korrelgrootte van de stationaire fase. Hierdoor krijgt de stationaire fase een groter oppervlak voor een betere uitwisseling, waardoor HETP verkleint. Bij een hoge loopvloeistofsnelheid wordt hiermee een aanzienlijk kleinere theoretische plaathoogte bereikt waardoor de resolutie sterk vergroot. Dit laat toe om kleinere staalgroottes te analyseren met een veel grotere sensitiviteit (miniaturisatie). Deze ontwikkeling gaat nog steeds verder. Een voorbeeld is het Aquity systeem (Waters Corporation), met 2,1 x 100 mm kolommen en uniforme korrels van 1,7 µm, omschreven als UPLC (ultra performance liquid chromatography). Een ander voorbeeld is de ontwikkeling van partikel loze kolommen (Chromolith, Merck) of continue bed matrix kolommen (Uno, Biorad). HPLC is dus hoofdzakelijk analytisch, voor kleine staalgroottes van enkele microgram tot een nanogram toe, waarbij detectie meestal on-line gebeurt. De duur van deze chromatografie gaat van enkele minuten tot een uur [Tabel 5.3]. Moderne toestellen laten via automatische injectoren en online detectoren een volledige automatisatie toe waardoor de werkingstijd kan versneld en verlengd worden.
Tabel 5.3. Vergelijking conventionele en hoge druk vloeistof chromatografie. CONVENTIONELE LC
HPLC
kolommateriaal
glas - plastic
staal
diameter
>1 cm
0,2 – 0,8 cm
deeltjesgrootte (µm)
100 – 150
3 – 10
lineaire snelheid (cm/hr)
10 – 30
100 – 300
druk (kg/cm²)
0,05 – 0,1
> 100 (1000-4000 psi)
staalgrootte
100 mg – 5 g
1 - 10 µg
detectie
manueel of detector
detector
duur
lang (uren)
kort (minuten)
toepassing
preparatief
analytisch
Zowel de miniaturisatie als de hoge druk hebben enkele nadelen : -
het ontstaan van gasbellen tijdens de drukverschillen
-
de snelle vervuiling van de kolom bij dergelijke fijne korrelgrootte
-
een snelle bandverbreding bij incorrecte assemblage van de pijpleidingen.
In de volgende paragrafen beschrijven we eerst de onderdelen van de HPLC apparatuur. Daarna bekijken we de verschillende chromatografische technieken, met enerzijds de eigenschappen van de kolom en anderzijds de eigenschappen van de mobiele fase, en de voorbereiding van het staal. Soms 46
zullen enkele praktische elementen bij de uitvoering van de chromatografie aangehaald worden, alsook enkele toepassingen.
5.2. HPLC APPARATUUR Figuur 5.7 toont een schema van een HPLC toestel. De vloeistof wordt aangebracht vanuit, meestal meerdere, reservoirs die ter ontgassing 18 doorborreld worden met helium of stikstof gas 19. Het vloeistofmengsel (de gradiënt) wordt gevormd aan de hand van een proportionele klep die in functie van het percentage van deze mobiele fase gedurende een zekere tijd open staat. Meestal bevindt zich onmiddellijk hierna een mengsysteem en het pompsysteem dat de vloeistof aanzuigt, en verder pompt met een accuraat debiet (afhankelijk van de zuigers; 10 tot 5000 µl/min). Eerst gaat de vloeistof naar een drainageklep, die ook gebruikt wordt om de vloeistofleidingen te ontluchten en met vloeistof te vullen voor het opstarten van het HPLC experiment. Vandaar gaat het via filters en druksensoren naar de injectieplaats. Een staal, ingebracht via een injectieklep systeem, loopt met de vloeistof naar de kolom. Meestal wordt een beschermende voorkolom (guard kolom) aangebracht voor de kolom. Deze zeer kleine kolom heeft hetzelfde fijne granulaire particulaat materiaal als de analytische kolom, en vangt aldus microscopische vervuilingen op voor deze op de dure analytische kolom terechtkomen. Na
Figuur 5.7. Schema van een hoge druk chromatograaf (Perkin-Elmer) met lage druk mengkamer.
18
Een alternatief ontgassingsysteem bestaat uit een semi-permeabel membraan op de invoerlijn die onder vacuüm wordt geplaatst. 19 Helium geeft minder aanleiding tot gasbelvorming dan stikstof, maar is duurder.
47
de kolom gaat de vloeistoflijn naar een detector. Frequent zit hier een analoog naar digitaal convertor tussen. In de detector wordt een fysisch signaal opgemeten en gerapporteerd aan het computer informatie verwerkingssysteem. Vanuit de detector, kan de vloeistofstroom naar een afvalfles gaan, naar een fractiecollector, of een andere detector.
5.2.1.
Injector
De meest gebruikte injectieklep is van het type Rheodyne [Figuur 5.8]. Deze injector werkt via een lus (loop) waarin het op te brengen staal wordt vast gehouden voor het naar de kolom gaat. Tijdens de ladingspositie loopt de vloeistof van de pomp rechtstreeks naar de kolom zonder dat dit door de laadlus gaat. Het staal wordt rechtstreeks ingebracht in de laadlus, het overschot dat groter is dan het volume van de laadlus gaat naar de afvalfles. Zodra de klep op injecteren wordt gezet, wordt de lus in het circuit gebracht van het vloeistofverloop komende van de pomp en gaande naar de kolom. Het staal wordt dan ook in één beweging met minimale bandverbreding naar de kolom meegenomen.
Figuur 5.8. Opbouw van een injector. In de laadpositie (linkse panelen) gaat het staal via poort 3 in de lus, waarbij het lusvolume en het teveel staal via poort 5 naar de afval gaat; ondertussen vloeit het eluent via poort 1 en 2 naar de kolom. Bij injectie (rechtse panelen) loopt het eluent door de lus (poort 1 en 6) en zo naar de kolom via poort 3.
48
5.2.2.
Leidingen en fittings
De buizen waardoor de vloeistof loopt zijn meestal van inert staal, met een kleine inwendige diameter (meestal 0.01 inch=0.25 mm). Meer recent worden ook een inerte polymeren aangewend, meestal PEEK (polyetheretherketon). Beide materialen hebben voor- en nadelen : -
Inert staal reageert niet met organische solventen, is goedkoper en erg druk bestendig. Het is wel moeilijker te behandelen. Bepaalde eiwitten hebben een affiniteit voor metaalionen en hebben verlies bij gebruik van staal. Ook erg zure (bv. HCl) of vooral erg basische oplossingen kunnen corrosief zijn voor staal.
-
PEEK is inert ten opzichte van biologische materialen. Het is buigbaar, dus makkelijker te hanteren. Bij het maken van connecties is eenvoudig en kan 'finger tight' (dus zonder gebruik van sleutels). Bepaalde organische solventen zijn evenwel niet compatibel met een PEEK leiding (bv. tetrahydrofuran, dimethylsulfoxide, methyleendichloride) en PEEK is minder druk-bestendig
De aansluiting van een leiding aan een toestel of aan een kolom moet met enige aandacht en kennis uitgevoerd worden. Hierbij moet men rekening houden met de lengte van de tubing, de lengte van de fittings en ferrule (waarvan de afmetingen fabrikant afhankelijk zijn) [Figuur 5.9]. Indien de leiding onvoldoende diep gaat, ontstaat een dood volume waarin extra menging mogelijk is, wat tot
Figuur 5.9. Overzicht HPLC fittings en ferrules, en slecht uitgevoerde verbindingen.
49
bandverbreding en staartvorming aanleiding kan geven. Indien de leiding te ver uitsteekt in de ferrule krijgt men geen passend slot met als gevolg lekken bij hoge druk [Figuur 5.9].
5.2.3.
Pompen
Het pompsysteem is een kritisch onderdeel van een HPLC, en moet minstens voldoen aan volgende voorwaarden : - delen die in aanraking komen met solvent moeten resistent zijn tegen zuur, base, zout,… (titanium, glas, saffier, ceramiek) - pompsnelheid accuraat en reproduceerbaar (minder dan 1% variatie) - de nodige druk kunnen genereren (2000-3000 psi) - puls vrije werking (zoniet detector schommelingen) - voor analytische toepassingen een bereik van 0.1 tot 10 ml/min - efficiente menging bij alle debieten - reproduceerbare gradientvorming bij zowel lage als hoge debieten (lineair, concaaf, convex, stap gradient) Het overgrote deel van HPLC toestellen is uitgerust met een verplaatsingspomp die werkt volgens het reciproke cilinder/stamper principe. Het volume dat per cyclus verplaatst wordt zal dus afhangen van de cilinder afmetingen; bij analytische HPLC worden pompen met stampers van 50-200 µl gebruikt. Het combineren van twee pompkoppen, die alternerend werken, met een 'pulse damper' zorgt voor een quasi pulsvrij debiet.
5.2.4.
Detectoren
De meest gebruikte detectoren bij HPLC zijn: -
UV-VIS absorbantie detector
-
diode array detector
-
fluorescentie detector
-
infrarood detector (IR of FT-IR)
-
elektrochemische detector
-
refractie detector
-
evaporatieve laser scattering detector (ELSD)
-
massa spectrometer (met elektrospray ionisatie als koppeling)
-
radioactiviteit detector ( counter)
In een UV-VIS absorbantie detector wordt bij één enkele golflengte de absorbantie van het licht door het analyt gemeten. In een diode array detector staan er enkele tot honderden kleine dioden en lichtcellen naast elkaar waardoor tegelijkertijd bij verschillende golflengten kan gemeten worden. Indien genoeg dioden, kan zelfs een gans absorbantiespectrum opgenomen worden, wat uiteraard 50
een betere karakterisatie toelaat (verhoogde specificiteit) [Figuur 5.10]. Een infrarood detector is vergelijkbaar met een absorbantie detector, doch meet in het infrarood bereik. Bij een fluorescentie detector wordt het analyt beschenen bij zijn een excitatie golflengte en het signaal bij de excitatie golflengte gemeten. Fluorescentie is zowel specifieker als gevoeliger dan absorbantie (maar niet toepasbaar op alle analyten; zie derivatisatie). Bij een elektrochemische detector wordt de conductantie of de stroom gemeten. Bij sommige types is er een vooraf bestaande cel die eerst een oxiderende of een reducerende potentiaal aanbrengt, alvorens de conductantie of de potentiaal van het analyt te meten. Bij een evaporatieve laser scattering detector wordt het solvent (samen met het analyt) verneveld tot kleine partikels (aerosol) die naar een verwarmde buis worden gevoerd, waar het solvent verdampt. Niet-volatiele stoffen zullen afbuiging veroorzaken van een laserstraal (scatter), die wordt opgemeten. Ideaal voor analyten met weinig specifieke absorbtie of scheidingen waarbij solventen met hoge cut-off gebruikt worden [Figuur 5.11]. In een massa spectrometer wordt het profiel van de massa’s van de fragmenten van het analyt gemeten. Bij de ionisatie moet men rekening houden met de vloeistofstroom. Elektrospray ionisatie is hiervoor een typische ionisatiebron (zie Hoofdstuk 9). In een 'on-line counter' wordt de radioactiviteit van het analyt gedetecteerd. Voor de theoretische achtergrond bij deze detectietechnieken wordt verwezen naar andere cursussen.
Tabel 5.4. Vergelijking detectie gevoeligheid DETECTOR
SENSITITIVITEIT*
absorbantie
100 pg - 1 ng
fluorescentie
1 - 10 pg
electrochemisch
10 pg - 1 ng
refractieve index
100 ng - 1 µg
conductiviteit
500 pg - 1 ng
massaspectrometrie
10 pg - 1 ng
FT-IR
1 µg
licht scattering
10 µg
laser scattering
1 pg - 100 pg
* gebaseerd op een analyt met MW 200 waarbij signaal 5X noise.
De identificatie van een analyt bestaat enerzijds uit het fysisch kenmerk dat gemeten wordt in de detector en anderzijds wordt de specificiteit verhoogd door de chromatografische scheiding. Een correctie chromatografische identificatie vereist dat een zuivere standaardstof op exact dezelfde plaats in het chromatografisch systeem gedetecteerd wordt. Toevoegen van een standaard moet de piek doen verhogen (spiking). Anderzijds is ook de specificiteit van de detectie ten aanzien van de
51
Figuur 5.10. Vergelijking diode en UV-detectie. Scheiding van de calcium kanaal blokker lacidipine en zijn metabolieten via RP-HPLC (ODS-Hypersil; eluent methanol/acetonitril/water (66/5/29 - v/v) tot pH 3.5 met mierezuur; 1 ml/min; 40°C).
Figuur 5.11. ELSD detector en vergelijking ELSD - UV detectie.
52
interfererende stof belangrijk. In deze optiek zijn massaspectrometrie en methoden die een fysisch profiel geven (bv. diode array detector) specifieker en laten soms ook een hogere sensitiviteit toe. De meest sensitieve bepalingen zijn vaak gebaseerd op fluorescentie of op elektrochemische principes. Een aanpassing van een detectiemethode van absorbantie naar fluorescentie kan soms een tien- tot vijftigvoudige verbetering in sensitiviteit mogelijk maken [Tabel 5.4].
5.2.5.
HPLC kolommen
Voor de bespreking van de kwaliteit van een HPLC kolom brengen we de Van Deemter vergelijking in herinnering. H HETP A
B C.µ µ
A: de Eddy diffusieterm is een belangrijke parameter bij een HPLC kolom. De kolom is gevuld met een fijn korrelig materiaal, op basis van silica of een plastic polymeer, waarop soms een chemische coating. Als de vloeistof zich rond en in deze deeltjes moet bewegen, leidt dit tot kortere of langere afstandsweg wat bandverbreding geeft. Ideaal is dus een kleine doch gelijkmatige deeltjesgrootte, liefst rond, en bovenal homogeen verdeeld. De kwaliteit van het vullen van de kolom op gelijkmatige wijze en resistent aan de bestaande drukverschillen zorgt ook voor een beter vloeistofverloop over de kolom. Thans gebruikt men daarom meestal een kolom die door de firma gevuld wordt onder hoge druk. B/µ: de moleculaire diffusiefactor is bij HPLC meestal verwaarloosbaar klein, gezien de diffusie in vloeistoffen klein is. Cµ: is de weerstand tegen massaoverdracht. Factoren die tussenkomen in de massaoverdracht zijn de korreldiepte, de korreldiameter, de dikte van de aangebrachte chemische laag. Dit kan verbeterd worden door te werken bij hogere temperatuur (snellere diffusie). Deze factor heeft een beperkte invloed op vloeistofchromatografie (zie ook Figuur 4.10). Oefening : HPLC en de resolutievergelijking. Leid uit de resolutievergelijking af hoe men de resolutie kan verbeteren van een kolom Rs
N - 1 k' 16 k' 1
In Figuur 5.12 zijn een paar HPLC kolommen afgebeeld. Deze zijn gemaakt in inert staal met een verbreding aan de uiteinden waar het frit (een klein metalen gaas) het pakmateriaal van de kolom vasthoudt. Hierop sluit een connectieleiding aan. Analytische kolommen zijn lang en dun, en verkrijg-
53
baar in verschillende lengtes. Een typische lengte is 150 of 250 mm met 3 tot 5 mm inwendige diameter. Deze kolommen werken bij een loopsnelheid van een 0,5 tot 2 ml/min. Voor kleine staalhoeveelheden worden soms micro-bore kolommen gebruikt bijvoorbeeld 2 mm x 120 mm.
Figuur 5.12. Design van een HPLC kolom (boven; links) en guardkolommen (rechts).
Voor de kolom wordt vaak een beschermende kolom (guard) geplaatst. Een guardkolom bestaat meestal uit een kleine cartridge, met dezelfde pakking als de analytische kolom die in een eigen behuizing is ingebracht [Figuur 5.12]. Voor preparatief werk bestaan gelijkaardige kolommen met een grotere diameter. Bij HPLC worden volgende toepassingen veelvuldig gebruikt: -
-
normaal fase chromatografie
de stationaire fase bestaat hier meestal uit silica en is hydrofiel
de mobiele fase is apolair (bv. hexaan).
omgekeerde fase chromatografie (reversed phase; RP) chromatografie
de stationaire fase is apolair (bv. silica gealkyleerd met een apolaire groep zoals octadecyl (ODS))
-
de mobiele fase is polair (bv. een water:methanol of water:acetonitril gradiënt)
ionenwisselingschromatografie (afhankelijk van de lading op de kolom anion- of kationuitwisselingschromatografie)
-
gel-permeatie chromatografie
54
-
chirale chromatografie: hierbij bestaat het actief kolommateriaal uit een enantiomeer specifieke fase waarin ofwel normaal fase doch vooral reversed phase HPLC wordt uitgevoerd.
In Figuur 5.13 is een schema afgebeeld om de juiste fase/toepassing te selecteren voor een bepaald analyt. Dit schema toont aan dat, zoals in het eerste hoofdstuk reeds aangehaald, de specifieke eigenschappen van het analyt in grote mate de scheidingstechniek zullen bepalen.
grootte
oplosbaarheid
polariteit hexaan
solvent
MW < 2000
techniek
kolom/fase
normale fase - adsorptie
silica
normale fase - partitie
CN, NH2
methanol acetonitrile
RP
C8, C18
THF
gelpermeatie
niet-ionisch
RP
C8, C18
RP + ionenpairing
C8, C18
water ionisch
ionenwisseling
solvent
gelpermeatie gelfiltratie
MW > 2000 ionenwisseling water
RP
C8, C18 (wide pore)
HIC
C8, phenyl, C4
affiniteit
Figuur 5.13. Selectieschema voor chromatografische fasen in functie van de analyt eigenschappen.
55
5.6. ADSORPTIECHROMATOGRAFIE De eigenschappen van atomen, ionen, of moleculen aan het oppervlak van een partikel zijn verschillend van deze binnenin het partikel. De bindingen in het oppervlak zijn immers verstoord door de afwezigheid van een bovenliggende laag. Daardoor bezit de oppervlakte een hoger energieniveau, wat omschreven wordt als hebbende 'surface activity'. Bij contact met een vloeistof (of gas), zal het actieve oppervlak moleculen aantrekken en proberen te adsorberen. De krachten hierbij kunnen divers zijn, ionisch, dipool-dipool, London interacties, of een combinatie ervan. Een goed adsorbens moet een grote oppervlakte bezitten met vele chemisch aktieve groepen, zoals alumina of silica (zie Tabel 5.13). Sommige zijn neutraal (aktieve kool), andere zuur (silica) of basisch (alumina). Daarnaast zijn er ook synthetische niet-polaire absorbers, gebaseerd op polystyreen (bv. XAD resins). Zowel opgeloste stoffen als het solvent kunnen adsorberen, en meestal is er competitie tussen de verschillende moleculen in de mobiele fase voor binding. Het adsorptievermogen van polaire adsorbens is vaak te wijten aan hydroxyl groepen en vorming van waterstof bruggen met de soluut moleculen. De aanwezigheid van hydroxyl, aromatische of geladen groepen in de soluten zorgen voor een sterkere interactie met het adsorbens.
TABEL 5.13. ADSORBENS IN DALENDE ADSORPTIEVERMOGEN EN HUN TOEPASSINGEN.
voorbeeld
toepassingen
alumina (actieve) kool silica gel magnesia calcium carbonaat calcium fosfaat sucrose zetmeel cellulose
sterolen, alkaloiden peptiden, sterolen, vetzuren lipiden, sterolen, aminozuren porfyrin proteïnen, polynucleotiden proteïnen
De adsorbens in Tabel 5.13 worden weinig gebruikt bij analytische biochemie, met uitzondering van silica gel. Wel worden ze aangewend bij staalopzuivering/voorbereiding, dikwijls in de vorm van vaste fase extractie kolommen. Dit aspect wordt uitgebreider besproken in Hoofdstuk 8. Cellulose werd vroeger gebruikt bij de scheidingen van aminozuren en peptiden (papierchromatografie).
5.6.1.
Silica gel chromatografie
Silica wordt vooral aangewend bij de scheidingen en opzuiveringen van lipiden en lipofiele stoffen (vet-oplosbare vitaminen, drugs, …), zowel in lage druk als hoge druk toepassingen. Het adsorberend vermogen van silica is te wijten aan de silanol-groepen (Si-OH). Wegens het complementair karakter van de deze techniek met omgekeerde fase scheiding, wordt deze verder besproken in Hoofdstuk 5.7.
89
5.7. PARTITIECHROMATOGRAFIE In tegenstelling tot de vorige chromatografische technieken, wordt partitiechromatografie nauwelijks aangewend bij de scheidingen van proteïnen of peptiden, met uitzondering van omgekeerde fase (onder denaturerende omstandigheden). Deze techniek wordt wel veelvuldig toegepast in analytische bepalingen, bijgevolg zullen hier voornamelijk HPLC applicaties vermeld worden.
5.7.1.
Normaal fase en reversed phase HPLC
Een normaal fase matrix bestaat uit silica, een amorf, poreus materiaal afgeleid van silicaten (glas), en bevat een aantal adsorptie-actieve groepen waaronder silanol (-Si-OH) de belangrijkste is. Deze groep kan fysisch water absorberen en is een zwak zuur. In een apolair solvent (bv. hexaan) zullen de polaire
Si OH
groepen
O
van
hydroxylgroepen
het
analyt
van
de
interageren matrix.
Door
met
de
gradueel
H
+
Si O
H
+
O
O
Si OH
Si O
H
+
toevoegen van een meer polair solvent ontstaat er competitie tussen het solvent en het analyt met de hydroxylgroepen van het silica waardoor het analyt progressief los komt van de kolom. De mobiele fase zal dus variëren van een (volledig) apolair solvent naar een meer polair solvent. Het meest apolaire molecule (met het minst aantal polaire interagerende groepen) zal eerst elueren gevolgd door de meer polaire analyten (die meer interacties hebben met het silica) [Figuur 5.34]. Normale fase wordt vaak gebruikt voor apolaire analyten die weinig oplosbaar zijn in de hydrofiele loopvloeistof van reversed phase HPLC (scheiding van lipiden, bepaling van vetoplosbare vitaminen, drugs,..). Recent werd ook koolstof, in een poreuze korrelvorm (bv. Hypercarb, 3 µm, 250Å), als een normale fase voor HPLC kolommen gecommercialiseerd. Deze matrix is erg robuust (stabiel pH 1 - 14; compatibel met hoge concentraties water) en dus geschikt voor de scheiding van meer polaire stoffen. Bij reversed phase HPLC is het kolommateriaal eveneens silica maar ditmaal gederivatiseerd met een apolaire groep, bv. butyl, phenyl 54, octyl, of octadecyl. Meestal worden resterende reactieve hydroxylgroepen van het silica worden afgeschermd via een proces dat men end-capping noemt 55.
R Si
OH
O Si
Cl
Si
O
Si
Si
Si TM CS
O OH
R
R Si
OH
O
Si
O
Si
O Si
54
Kolommen met butyl en phenylgroepen zijn vergelijkbaar qua hydrofobe interacties; de phenyl ring kan echter ook via - bindingen interageren met analyten. 55 Zonder endcapping zullen polaire (storende) interacties optreden tussen de Si-OH groepen en het analyt.
99
De loopvloeistof is polair en het analyt zal via apolaire interacties binden 56 aan de apolaire kolomfase. Toevoeging van een meer apolair solvent geeft competitie tussen de apolaire interacties van het analyt met enerzijds de apolaire fase van de kolom en anderzijds het solvent met als gevolg elutie van het analyt van de kolom. Het solvent gaat dus van polair naar toenemend apolair. Met afnemende polariteit van het solvent krijgt men progressief elutie eerst van de meest polaire stoffen, die de minste apolaire interacties hebben met de kolom, naar de meer apolaire stoffen, die sterker gebonden waren aan de kolom [Figuur 5.34].
Figuur 5.34. Verband tussen polariteit en elutietijden bij normale en RP chromatografie.
Figuur 5.35. Effect van ketenlengte bij RP chromatografie. Condities : 5 µm alkyl-siloxaan korrels; 50 % methanol; 1 ml/min. Pieken : 1. uracil; 2. fenol; 3. acetofenon; 4. nitrobenzeen; 5. methylbenzoaat; 6. tolueen
56
Bij gebonden fasen is het moeilijker een onderscheid te maken tussen adsorptie en partitie en de scheidingsprincipes zijn dus ingewikkelder.
100
Naast de silica-gebaseerde RP kolommen, werden recent ook andere materialen gebruikt zoals bepaalde plasticpolymeren (bv. poly(styrene-divinyl)benzeen) voor RP kolommen. Door hydrofobiciteit van het kolommateriaal te verhogen, bv. octyl naar octadecyl fase, zal een sterkere retentie van de stoffen optreden (verhoging van k’). Dit leidt tot een betere scheiding (maar ook een langere scheidingsduur) [Figuur 5.35]. Het gamma aan RP kolommen is erg groot en ze worden verkocht door verschillende firma's (Waters, Macherey-Nagel, Phenomenex, Merck, Tosohaas, Alltech,…). Bovendien kunnen kolommen met dezelfde 'fase' toch verschillen vertonen, afhankelijk van de leverancier. Ter illustratie, Figuur 5.36, waar een aantal commerciële C8 en C18 kolommen, volgens hydrofobiciteit en residuele niet gecapte silanol activiteit, in kaart werden gebracht.
Figuur 5.36. Vergelijking van C18- en C8-RP HPLC kolommen.
Sommige scheidingen waarbij de gebonden fase van de silica korrels vrij polair is, zoals CN, diol of aminopropyl, worden ook als normale fase bestempeld. Het betreft hier dan een normale partitie chromatografie, terwijl de normale scheidingen op silica op adsorptie gebaseerd zijn. Deze verwarring heeft te maken met het feit dat de term 'normale fase' pas werd ingevoerd na de opmars van omgekeerde fase scheidingen. Een definitie kan hierbij enige houvast bieden. Indien de stationaire fase meer polair is dan de mobiele fase, spreekt men van normale fase chromatografie; een
101
elutie waarbij de mobiele fase significant polairder is dan de stationaire fase wordt als omgekeerde fase gedefinieerd.
5.7.1.1.
Solventkeuze bij partitiechromatografie
De solvent keuze wordt vooral bepaald door de fase (maar ook door de detectie methode !). Bij omgekeerde fase chromatografie wordt meestal een (polair) mengsel van water met een organisch solvent zoals methanol of acetonitril genomen. Door de concentratie van organisch solvent te verminderen, neemt de polariteit toe, verhoogt de interactie met de kolom, en elueert het analyt later (of niet !). De beste keuze wordt meestal empirisch bepaald, maar "kennis is..tijdswinst" [Figuur 5.37].
Figuur 5.37. Effect van solvent polariteit op RP-chromatogram. Elutie van 9,10-anthraquinoon-derivaten met alkylsubstituties bij RP-HPLC door solvent met stijgende polariteit (dalend % methanol). Pieken: geen substitutie (1), 2-methyl (2), 2-ethyl (3), 1,4-dimethyl (4) en 2-t-butyl (5).
Indien de capaciteitsfactor (de affiniteit van het analyt voor de kolom) van de verschillende analyten te verscheiden is, is isocratische elutie niet bruikbaar. In dit geval zal in een gradiënt van laag naar hoge concentratie van organisch solvent een scheiding toe laten van zowel de zwak als de sterk gebonden stoffen. Het effect van gradiëntelutie tov. van isocratische elutie wordt getoond in Figuur 5.38. Bij normale fase is het solvent apolair. Veel gebruikt zijn heptaan, diethylether, methanol, chloroform, ofwel puur ofwel als mengsels, met toevoeging van solvent-oplosbare zuren of basen (mierezuur, trifluoroazijnzuur, pyridine, triethylamine). Bij gebruik van een polairder solvent, zal het analyt vlugger
102
elueren. Ook hier kan men door gradient elutie (binair, tertiair) moleculen met een erg uiteenlopende polariteit scheiden [Figuur 5.39].
Figuur 5.38. Verbeterde scheiding door gradient elutie versus isocratische elutie bij RP-HPLC. Condities : 5 µl gechlorineerde benzeenderivaten in isopropanol; 1 % Permaphase ODS in stalen 10 mm x 2.1 mm kolom; detector 254 nm; 60°C; 1200 psi.
Volgende punten verdienen aandacht bij de solvent keuze : 1. compatibiliteit met stationaire fase (matrix + fase) (vermijd extreme pH; sterke oxidantia) 2. compatibiliteit met (onderdelen van) het systeem - staal (zoutconcentratie; HCl); PEEK (gechloreerde solventen) 3. compatibiliteit met detectie (zie Tabel 5.15; UV-cutoff) - doorlaatbaarheid of spectrale eigenschappen (UV; invloed op fluorescentie; gradient) 4. viscositeit (overdruk) (zie Tabel 5.15) 5. mengbaarheid van de solventen (zie Tabel 3.4 - 3.5) 103
6. volumeveranderingen of neiging tot gasbelvorming bij mengen 7. polariteit–apolariteit van het mengsel
Kolom: Spherisorb (100 x 4.6 mm). Solvent A: hexaan Solvent B: methyl tert-butyl ether Gradient : 2% B 3 min; 2 - 20% B over 12 min; 20 - 100% B over 5 min; 100 % B 10 min. ELSD
Kolom: YMC PVA-Sil (250 x 4.6 mm, 3 µm) Solvent A: isooctaan/methyl tert-butyl ether (98/2, v/v) Solvent B: isopropanol/acetonitril/chloroform/azijnzuur (84/8/8/0,025, v/v) Solvent C: isopropanol/water/triethylamine (50/50/0,2, v/v) Gradient : A/B/C van 100/0/0 (0 min),naar 80/20/0 (5 min), 44/52/2 (15 min), en 34/52/12 (40 min). ELSD
Figuur 5.39. Voorbeelden van normale fase scheidingen op silica. Links. Scheiding van neutrale lipiden (EC, cholesterol esters; TG; triglyceriden; CHOL, cholesterol; DAG, diacylglycerol; MAG, monoacylglycerol); gebaseerd op El-Hamdy A.H. et al. (1993) J. High Resol. Chromatogr. 16, 55. Rechts. Scheiding van lipiden extract van planten (SE, sterol esters; S, sterols; DAG, diacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiglyceriden; SG, sterol glycosiden; CERE, cerebrosiden; DGDG, digalactosyldiglyceriden; PE, fosfatidylethanolamine; PI, fosfatidylinositol; PC, fosfatidylcholine); gebaseerd op Christie W.W. et al. (1995) J. High Resol. Chromatogr. 18, 97.
5.7.1.2.
Solvent polariteit
Zowel bij normale als RP-HPLC speelt de polariteit van het solvent een grote rol bij de elutie. Deze solventeigenschap wordt uitgedrukt als solventsterkte of ε0. Dit is een waarde die aangeeft in welke mate een solvent de adsorptie kan verbreken en een analyt kan elueren 57 van een absorbent. Afhankelijk van het adsorbent, kan men dus verschillende solventsterkten definiëren. De meest gebruikte (wegens historische redenen) zijn deze gebaseerd op elutie van aluminiumoxide en silica, waarbij pentaan arbitrair als nul werd gedefinieerd (zie Tabel 5.15). Men kan de solventsterkte ook tov. C18-fase bepalen (hierbij werd methanol als 1 gedefinieerd). Hoe hoger ε0, hoe polairder het
57
Soms spreekt men ook van eluotrope sterkte.
104
solvent. Acetonitril heeft dus een lagere solventsterkte, is meer apolair dan methanol. Om intermediaire waarden in ε0 te bereiken, worden twee of meer solventen gemengd. De relatie tussen ε0 van het finale mengsel en deze van de solventen is echter niet lineair ! Een andere veel gebruikte maat voor de solventpolariteit is de polariteitsindex P' (zie Tabel 5.15)
Tabel 5.15. Solvent eigenschappen : solventsterkte, polariteit en UV-transparantie. SOLVENT
°(SiO2)
°(Al2O3)
°(C18)
P' (Snyder)
UV-cutoff (nm)
viscositeit (20°C; cP)
pentaan
0.00*
0.00*
0.0
0.0
210
0.22
carbontetrachoride
0.11
0.17-0.18
1.7
265
0.97
tolueen
0.22
0.20-0.30
2.4
285
0.38
benzeen
0.25
0.32
3.0
280
0.65
diethylether
0.38-0.43
0.38
2.9
220
0.24
chloroform
0.26-0.31
0.36-0.40
4.4
245
0.53
aceton
0.47-0.53
0.56-0.58
8.8
5.4
330
0.30
tetrahydrofuraan
0.53
0.45-0.62
3.7
4.2
220
0.46
pyridin
0.55
0.71
5.3
305
0.88
ethylacetaat
0.38-0.48
0.58-0.62
4.3
260
0.43
acetonitril
0.50-0.52
0.52-0.65
6.2
**200**
0.34
n-butanol isopropanol
0.70 0.60
ethanol methanol water azijnzuur
3.1
0.70-0.73
3.9
0.78-0.82
8.3
4.3
0.88
3.1
5.2
0.95
1.0*
6.6
*** >0.73
2.90
210
1.20 210
10.2 hoog
6.2
1.90 0.54 1.00
230
1.26
* gedefinieerde waarden; ** UV-cutoff afhankelijk van zuiverheid; *** silica lost op in water
5.7.1.3.
Ionisatie en buffers bij omgekeerde fase
De scheiding van een ioniseerbaar analyt via RP-HPLC vraagt enige voorkennis. In de buurt van de pKa is een deel van het analyt geioniseerd, een deel niet geïoniseerd. Het geioniseerde analyt is polairder en zal minder interacties vertonen met de fase. Het gevolg is een verschil in retentie en bandverbreding. Bij neutrale pH zullen zwakke zuren en basen dus meestal een slechte piekvorm bezitten. Een verbetering van het chromatogram kan dan bekomen worden door de pH van het solvent aan te passen (minstens twee eenheden weg van de pKa, maar rekening houdende met de stabiliteit van de matrix !) [Figuur 5.40]. Hiertoe kan men base of zuur toevoegen of een
105
buffersysteem gebruiken. Veel gebruikte buffers zijn kaliumfosfaat 58 of ammoniumacetaat. De eigenschappen van een goede buffer zijn : - chemisch stabiel - aangepaste buffercapaciteit - optisch transparant - goed oplosbaar in organische solvent(en) - silanolgroepen kunnen maskeren
Figuur 5.40. Effect van pH bij RP-scheidingen. Een licht zure stof wordt best gechromatografeerd in hetzij een meer uitgesproken zuur milieu hetzij in een licht basis milieu; een basische stof best in een licht zuur milieu of in een uitgesproken basis milieu. Bij intermediaire pH dicht bij de pKa treedt meestal bandverbreding op door partiële ionisatie van het analyt. Een neutraal analyt wordt niet beïnvloed door de pH.
Ionische onderdrukking kan effectief zijn bij zwakke basen/zuren, maar kan niet gebruikt worden bij sterke basen/zuren. In dit geval kan het noodzakelijk zijn de geladen groepen af te dekken, en hiertoe wordt ionenparingschromatografie gebruikt. Hierbij wordt bij een pH waar het analyt geioniseerd is, een ion met tegengestelde lading (counter-ion) toegevoegd aan de loopvloeistof. De twee ionen zullen een ionenpaar vormen, en indien het counterion een apolair deel heeft, zal het ionenpaar significant meer affiniteit voor de apolaire fase vertonen [Figuur 5.41].
N C8-fase
+
O
-
R O
Figuur 5.41. Ionpairing bij zure analyten.
58
Bij hoge concentraties organisch solvent moet men opletten voor het kristalliseren van fosfaatbuffers; ammoniumacetaat is dan een beter alternatief.
106
Frequent gebruikte ionenparingsreagentia (meestal sterke organische basen of zuren) voor de scheiding van (zwakke) zuren zijn alkylammonium-fosfaten (bv. tetrabutylammonium-fosfaat); voor (zwakke) basen alkylsulfonaten en alkylsulfaten (bv. hexaansulfaat of octylsulfonaat). Ze worden toegevoegd in een concentratie van ongeveer 5 mM. De mogelijkheid om zowel niet-polaire als ionische moleculen te scheiden, door gebruik van counterionen, verhoogt aanzienlijk de waarde van RP-HPLC. Ionenparing laat ook toe om zowel zwakke zuren als zwakke basen samen te scheiden. Bijvoorbeeld bij een lage pH is een zwak zuur niet geïoniseerd en met octylsulfonaat wordt de positief geladen zwakke base afgeschermd. Vraag : Welke fysicochemische eigenschappen moeten counter-ionen bezitten ?
transparant; oplosbaar in solvent; sterke base/zuur De polaire geïoniseerde groepen kunnen ook interageren met de residuele vrije silanolgroepen van het silica. Een kolom met goede end-capping van de silanolgroepen verhindert deze interferentie.
5.7.2.
Speciale fasen HPLC
5.7.2.1.
Chirale chomatografie
Verscheidene biochemische moleculen (bv. neurotransmitters, aminozuren, suikers) zijn optisch aktief. Enantiomeren hebben echter gelijkaardige fysico-chemische eigenschappen (behalve interactie met gepolariseerd
licht),
en
kunnen
dus
niet
gescheiden
worden
via
de
reeds
besproken
chromatografische scheidingen. Vermits enantiomeren verschillende biologische activiteit kunnen bezitten, is het toch belangrijk, zeker voor de farmaceutische industrie, deze te (kunnen) scheiden. Hiervoor werden volgende chirale 59 scheidingen ontwikkeld : -
derivatisatie van het enantiomeer met optische zuivere reagentia tot een diastereomeer. De gevormde diastereomeren bezitten wel verschillende fysische eigenschappen en kunnen dus chromatografisch gescheiden worden. Dit is een vrij simpele techniek maar succesvolle toepassing vereist dat de derivatisatie vlug en compleet is.
-
een variant hierop is het gebruik van een chirale mobiele fase (toevoeging van albumine, cyclodextrinen) of chirale counterionen (10-camphorsulfonzuur).
-
scheiding in kolommen met een chirale stationaire fase zodat derivatisatie overbodig wordt. In principe zou elk optisch actief molecule kunnen gebruikt worden om zulke fase te creëren. In de praktijk is dit beperkt tot volgende stoffen (in volgorde van ontwikkeling) [Tabel 5.16]
59
proteïnen gebonden op silica (albumine; -glycoproteïne)
Afgeleid van het Griekse woord "cheir" (hand).
107
relatief kleine chirale moleculen gebonden aan silica, beter bekend als Pirkle-fase, naar de ontwerper 60 (bv. dinitrobenzoyl-L-phenylglycine of D-isomer) [Figuur 5.42]
macrocyclische glycopeptiden-antibiotica geïntroduceerd door Armstrong en medewerkers 61 (bv. vancomycin)
circulaire oligosacchariden (cyclodextrinen) gebonden aan silica [Figuur 5.42], deze kunnen op twee manieren analyten tegenhouden en enantiomeren scheiden. De eerste gebaseerd op moleculaire interactie na inclusie in de holte (maar dan moet de juiste caviteit gekozen worden); de tweede een interactie met het oppervlak van de stationaire fase
Tabel 5.16. Overzicht van chirale gebonden fasen CHIRALE FASE
VOORDEEL
NADEEL
proteïnen
groot aantal chirale centra
multipele interactie met het hele proteïne enkel in waterig medium beperkte pH/solvent stabiliteit 62
pirkle
hoge dichtheid kleine molecule, dus retentie vooral gebaserd op chirale selectiviteit
macroliden
hoge capaciteit groot aantal chirale centra (18 voor vancomycin) verschillende interacties mobiele fase zowel waterig (reversed mode) als solvent (polaire mode)
cyclodextrine
verscheidenheid van buffers stabiel tussen pH 3 en 14 zowel polaire als reversed phase
5.7.2.2.
Argentatie chomatografie
Met behulp van RP-HPLC, worden analyten gescheiden volgens hun hydrofobiciteit. Voor analyten die tot een zelfde klasse behoren (bv. vetzuren) is het hydrofoob karakter gerelateerd met het aantal koolstof atomen. Op een C18-fase zal de elutietijd van verzadigde vetzuren dus evenredig zijn met het aantal koolstofatomen. De aanwezigheid van een dubbele (of tripele) binding, zorgt voor een meer polair karakter. Grosso modo is één dubbele binding gelijkwaardig met minus 1.5-koolstofatomen. Bv.
60
Pirkle W.H. & House D.W. (1979) Chiral high-pressure liquid chromatographicstationary phases. 1. Separation of the enantiomers of sulfoxides, amines, aminoacids, alcohols, hydroxy acids, lactones, and mercaptans. J. Org. Chem. 44, 1957-1960. 61 Armstrong D.W., Tang Y., Chen S., Zhou Y., Bagwill C. & Chen J.R. (1994) Macrocyclic Antibiotics as a New Class of Chiral Selectors for Liquid Chromatography. Anal. Chem. 66, 1473-1484. 62 Het zure 1-glycoproteïne (AGP) verdraagt pure organische solventen, hoge temperaturen en hoge/lage pH
108
N O2
O N Si
O
Si
N O
N O2
Figuur 5.42. Voorstelling van enkele chirale fasen en chirale scheidingen. Boven. Structuur van N-(3,5-dinitrobenzoyl)-D-phenylglycine), gebonden aan silica. Midden. Structuur van -cyclodextrin en gevormde caviteit. Onder (links naar rechts). Scheiding van Fenoprofen isomeren op een silica fase met -glycoprotein (AGP) of albumine (HSA); scheiding van Ibuprofen isomeren op een silica fase met -cyclodextrin (NUCLEODEX beta-PM 200 x 4 mm; methanol / 0.1% TEA pH 4.0 (60:40, v/v); 0.7 ml/min; UV 230 nm)
linoleenzuur (C18:2) zal elueren zoals pentadecaanzuur (C15:0) (zie ook Figuur 5.44, waar C22:6 vroeger elueert dan C16:0). Met behulp van zilver-ionchromatografie kan men gelijkaardige analyten (vetzuren, triglyceriden, cholesterolesters, ……..) scheiden volgens het aantal bindingen.
109
De makkelijkste manier om zulke fase te bekomen is een anionenwisselaar, reeds ingebed in een HPLC kolom, te laden met AgNO3 (opgelost in acetonitril). Na saturatie, kan men de kolom gebruiken in apolaire solvent en moleculen met dubbele bindingen elueren door een gradient van methanol of acetonitril. In Figuur 5.43 bemerkt men dat triglyceriden met drie verzadigde vetzuren (S3) het eerst elueren, die met drie onverzadigde vetzuren (M3) later.
Figuur 5.43. Zilver ion HPLC. Scheiding van palmolie triglyceriden volgens aantal dubbele bindingen in de vetzuurketens (Nucleosil 5SATM kolom geladen met zilver; dichloromethane-1,2-dichloroethane-acetonitril (50/50/0.025, v/v); 1.5 mL/min). S, verzadigd vetzuur, M, mono-onverzadigd vetzuur; D, di-onverzadigd vetzuur.
5.8. DERIVATISATIE VOOR HPLC De term derivatisatie duidt op een proces waarbij een molecule via een scheikundige reactie wordt omgevormd zodat het andere eigenschappen bezit. Bij analytische processen betekent dit beter identificeerbaar, en bij HPLC wordt tijdens de derivatisatie reactie dus meestal een absorberende, fluorescerende, of elektrochemische reactieve groep toegevoegd. Zoals in Tabel 5.17 weergegeven zijn derivatisaties gebaseerd op gekende reacties van de organische chemie. Figuur 5.44 toont een voorbeeld waarbij vetzuren, die weinig intrinsieke UV-absorptie hebben, worden gedetecteerd als UV-absorberende phenacylderivaten. Derivatisaties worden meestal uitgevoerd vóór het analyt op de kolom gaat (pre-column). Soms kan men ook een derivatisatie reactie uitvoeren na de chromatografie en vóór het analyt op de detector gaat. Dergelijke 'post-column' derivatisatie wordt on-line uitgevoerd in het chromatografisch systeem. Eén voorbeeld hiervan is de detectie van aminozuren via de ninhydrin reactie [Figuur 5.45].
110
Tabel 5.17. Derivatisatie reacties bij HPLC applicaties FUNCTIONELE GROEP
REACTIE
CHROMOTAG
carboxylzuren O CH2
Br
R2 Br
R1
CH2
CH2
(primaire + secundaire) alcohols
R1
Cl
Y Cl
O
O
C
C
Y R2
Cl O2N
H
O S
R1
Y = O, S, NH, NR' (R' = alkyl, aryl)
thiols R1
O
Y R2
C
naphthacylbromide
O2N
H O
Br
O
phenacylbromide aminen
CH2
Br
R2
C
R2 = alkyl, aryl
C
C
O
O
HO
C
O
O
O R1
FLUOROTAG
O
R2
R1
Y = O, S, NH, NR' (R' = alkyl, aryl)
S
3,5-dinitrobenzoyl-chloride Y
R2
O
N O
H R1
S Cl
O
Y R2
R1
N C O Y = O, S, NH, NR' (R' = alkyl, aryl)
N C H
O
Y R2 N C O
dansylchloride
phenylisothiocyanate primaire aminen
S R3 R
O
H2N R2 HS
R
O
R N R2
R3
(R2 = alkyl, aryl)
R
O O
o-phthalaldehyde
111
-aminozuren
O OH OH O
ninhydrin ketonen
R2
aldehyden R1
N
R3
NH2 H
N C R1
N
R3
O
N2O
R2
O C
O2N
N
NH2
N
O
H
H
R2 = alkyl, aryl R3 = H, alkyl, aryl
NH2
S N
2,4-dinitrophenylhydrazine
2,6-dansylhydrazide
R2 O C R1
O NH2
R3 R2 = alkyl, aryl R3 = H, alkyl, aryl
R2 R1
O N C R3
O NH2
O-benzylhydroxylamine
112
1) 6:0 2) 8:0 3) 10:0 4) 12:0 5) 14:1 6) 18:3 7) 14:0 8) 22:6 9) 16:1 10) 20:4 11) 18:2 12) 15:0 13) 18:2 tt 14) 20:3 15) 16:0 16) 18:1 c 17) 18:1 t 18) 20:2 19) 17:0 20) 18:0 21) 20:1 22) 22:1 c = cis; t = trans
Figuur 5.44. Analyse van vetzuren uit plasma lipiden als phenacylderivaten. Vetzuurderivaten werden gescheiden via RP-HPLC (GROM-SIL 100 ODS-0 AB, 3 µm; 250 x 4 mm; gradient elutie acetonitril/water/H3PO4 (30/70/1 - v/v) - acetonitril; 1.0 ml/min; 40°C; UV 242 nm)
5.9. PRAKTISCHE ELEMENTEN BIJ HPLC Enkele elementaire regels voor succesvol gebruik van HPLC. 1. Gebruik steeds erg zuivere solventen. 2. Filtreer loopvloeistof en soms ook het analyt om te voorkomen dat microscopisch kleine onzuiverheden de kolom verstoppen. Ontgas de loopvloeistof op voorhand (sonicatie onder vacuüm). 3. Gebruik een guard kolom ter bescherming van de kolom. Het eerste vuil wordt opgevangen in de guard kolom, welke goedkoper is om te vervangen dan de eigenlijke analytische kolom. 4. Bij gebruik van zouten, spoel kolom en systeem. Bij langdurig staan van een zoutoplossing verdampt de vloeistoffase en kristalliseren zouten uit wat tot beschadiging van de pomp of verstopping van leiding en/of kolom leidt. 5. Voor reversed phase kolommen: vermijd extreme pH (hydrolyse van fase; oplossen van matrix) vermijd puur water als solvent (collaps phase) stockeer de kolom in organisch solvent (methanol of acetonitril; verhinder groei van bacteriën en algen die de kolom verstoppen) zuiver regelmatig de kolom (proteïne neerslag; lipiden opstapeling) 6. Voor silica kolommen: vermijd hoge concentraties water vermijd alkalische pH
113
Figuur 5.45. Aminozuur analyse. Aminozuren, gescheiden via ionenwisselings-HPLC, worden post-column gemengd met ninhydrin en verwarmd tot 90°C en vervolgens bij 570 nm gedetecteerd. Boven : reactie mechanisme; midden : schema van een aminozuuranalyzer; onder, chromatogram.
114
