Hmotnostní spektrometrie Petr Man
[email protected]
Unikátní vlastnosti hmotnostní spektrometrie
Specifita Rychlost Jednoduchá interpretace dat Citlivost
Čísla k zapamatování (1 mol ~ 6.023 x 1023 molekul) molekul
molů
10-9
1 zrnko soli ~ 1 ug ~ 20 nmol
1015
1-10 pmol pro CBB 1 pmol pro Edmanovo odb. 100 fmol pro stříbrem barvené gely
1012
10-15
2 fmol: jedna kopie v 109 buněk
109
10-17
10 amol: ICR FTMS
106
10 zmol: Iontová past (300-1000 iontů)
103
10-12
10-21
Hmotnostní spektrometr Normální tlak
Vložení vzorku
Snížený tlak Ionizační technika
Hmotnostní analyzátor
Detektor
Počítač
• Měříme pseudomolekulární ionty v plynné fázi (M-H+, M+H+, M+Na+, atd.) • Jak spočítáme M? – nejlépe z elementárního složení. http://medlib.med.utah.edu/masspec/mole.htm
• Monoisotopická vs. Průměrná MW C6H12O6 Mmono = 180.0633; Mavg = 180.1576
C113H171N27O31S1 Mmono = 2434.2354 ; Mavg = 2435.8301
Přítomnost izotopů (13C, 15N, 17O, …) se projeví na tvaru píku.
13C
je 1.1%, tj. na každých 100 uhlíků je jeden 13C více uhlíků -> více 13C, to se projeví na tvaru píku Intenzita druhého izotopu je 1.1xpočetC – získáme % intenzity prvního píku. Máme ale i další izotopy…
Kouzla s izotopy
Ionizační metody • EI – Electron Impact • CI – Chemical Ionization • APCI / APPI – Atmospheric Pressure – Chemical Ionization / Photo Ionization • FD – Field Desorption • PD – Plasma Desorption
• FAB – Fast Atom Bombardment
• ESI / nanoESI – ElectroSpray Ionization • MALDI – Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
1985 Elektrosprej – J. B. Fenn
1994 – nanoelektrosprej – M. Mann a M. Wilm
Fenn JB; Mann M; Meng CK; Wong SF; Whitehouse CM: Science 1989, 246, 64.
Ionizace elektrospejem Rozpouštědlo/Pufr
+ +
ESI Jehla (5 kV)
+ +
Vstupní Vyhřívaná otvor kapilára (0-50 V)
+ ++ + +
Iontový Svazek
Ionizace elektrosprejem • Velmi měkká ionizace • Mnohonásobně nabité ionty – 1, 2, 3, …60x • Malá nebo téměř žádná fragmentace • proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery ... • Nekovalentní komplexy (proteinové komplexy, komplexy protein-ligand, atd.) • Vhodná pro kvantifikaci • Vysoká náročnost na čistotu • Napojitelné na LC • Spojení s jakýmkoliv analyzátorem
1987 – Desorpce laserem za přítomnosti matrice K. Tanaka / M. Karas, F. Hillenkamp
Karas M; Bachmann D; Bahr U; Hillenkamp F: Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987, 78, 53. Tanaka K; Waki H; Ido Y; Akita S; Yoshida Y; Yoshida T: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151.
MALDI Ionizační proces
MALDI Ionizační proces MALDI matrice dobrá absorpce za použité vlnové délky stabilita ve vakuu, netěkavá přenos protonu
2,5-DHB
vzorek : matrice = 1 : 104-105 mísitelné se vzorkem v tuhé fázi solventy: MeOH, EtOH, MeCN, H2O, THF, aceton ...
UV-MALDI 337 nm dusíkový laser 355 nm Nd:YAG 266 nm Nd:YAG 193 nm ArF
IR-MALDI 2.94 mm Er:YAG laser 10.6 mm CO2 laser
MALDI matrice
kys. 2,5-dihydroxybenzoová (DHB)
kys. sinapová (SA) (kys. 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová)
kys. α-kyano-4-hydroxyskořicová (CCA)
kys. ferulová (FA) (kys. 4-hydroxy-3-methoxyskořicová)
MALDI Ionizační proces • Měkká ionizace • Malá nebo žádná fragmentace, jednoduchá interpretace • Jednonásobně nabité ionty [M+H]+; [M-H]• Analýzy komplexních směsí • Rychlá a jednoduchá příprava a analýza • Proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy syntetické polymery ... • Tolerantní k detergentům, solím… • Krátké laserové pulsy; t ~ ns • Spojeno s TOF analyzátorem
Analyzátory • q, MSQ – quadrupole (Mono Stage Quadrupole) • TSQ – Triple Stage Quadrupole (QqQ) • qIT – quadrupole Ion Trap • LT – Linear Ion Trap • Sector B/E geometry • TOF – Time Of Flight • FT-ICR – Fourier Transform – Ion Cyclotron Resonance • Hybridní (q-TOF, TOF-TOF, q-FT-ICR, LT-FT-ICR)
Time Of Flight (TOF) Analyzátor
Ekin = ½ mv2
Time Of Flight (TOF) Analyzátor
Time Of Flight (TOF) analyzátor
• Velmi vysoká transmise iontů • Teoreticky neomezený hmotnostní rozsah • Využití chlazených detektorů • Téměř současná detekce všech iontů: kompletní spektrum během každého ionizačního pulsu • Vysoké rozlišení a přesnost
Post-Source Decay (PSD)
Kvadrupólový analyzátor
+
+
-
+
Iontová past Ionty
Vyhřívaná kapilára
Iontová brána
Fokusační multipóly
Iontová past
Iontová Past • • • •
Akumulace iontů Vysoká citlivost Schopnost MS/MS a MSn (MS/MS v čase) Malé rozměry
• • • •
Omezený dynamický rozsah Nižší rozlišení a přesnost Omezená fragmentační energie 1/3 pravidlo
Trojnásobný kvadrupól N2
RF Fokusace iontů
Prekursorové ionty
Q1
Q2 Kolizní cela
Fragmentace (CAD)
Q3 Detektor
Produktové ionty
Q-TOF
FT-ICR – Iontově cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací Pohyb iontů v magnetickém poli - iont s hmotností m, pohybující se s rychlostí v v homogenním magnetickém poli se silou B:
F = qv × B
Iont pohybující se po cyklotronové orbitě s frekvencí danou vztahem:
qB 2πf = m
Poloměr běžné cely: 1-3 cm Počáteční poloměr pohybu iontu: 0.01 - 0.1 mm Běžná síla magnetického pole: 1-12 Tesla
Pohyb iontů v magnetickém poli FTMS cela
Trapping Plates, +1.0 V
Detekce
B Excitace
+
Excitace a detekce iontů r=
EoTexc. 2B
Signál ∝ Nions Signál ∝ r
Eo
Působením rezonančního dipolárního pole jsou ionty „přinuceny“ pohybovat se po cyklotronových drahách s větším poloměrem pohybu. Finální r nezávisí na m/z.
Fourierova transformace (Iontově Cyklotronová Resonance)
Detekce
qB f = 2π m
+
+
+ + + +
+
+ + Koherentní cyklotronový pohyb indukuje „prodový obraz“, který je amplifikován a detekován. Přítomnost iontů s různými m/z se projeví Jako superpozice sinusoidalních signálů na Detektoru.
Fourierova transformace a rozlišení
FT
Rozlišení • Jednotkové – rozeznáme m/z 100 od 101 – kvadrupóly a iontové pasti • m/∆m – kde bereme ∆m bereme buď v 10% nebo v 50% výšky píku
• Př. - rozlišení 50000 znamená, že odlišíme dvě látky, lišící se o 1/50000 MW – 1296.6775 a 1296.7034
Přesnost Absolutní • Da – Dalton - 0.1 – 0.0001 • Th – Thompson – 0.1 – 0.0001 Relativní (mění se podle m/z • ppm – parts per million – 100 – 0.1 1000.0000 • % Iontová past 100-1000 ppm
TOF FT-ICR 10-100 ppm 0.1 – 1 ppm
Hmotnostní spektrometrie v analýze biomolekul • Kontrola kvality/čistoty • Určení MW • Identifikace • Sekvenování • Charakterizace modifikací • Studium nekovalentních komplexů • Analýza směsí • Kvatifikace • Studium 3D struktury s nízkým rozlišením
Určení MW – MALDI
Určení MW – ESI
R
NH3+
S T R S S R NH3+ + NH3+ + NH3 R NH3 V A A R NH3+ A R NH3+
Relativní intensita
G
R S T G R S S R NH3+ NH3+ NH3+ R V A A R A R NH3+
S G S R S + NH3 R A A R A R
R
T R
m/z
V
Určení MW – ESI Dekonvoluce…
Výpočet MW proteinu z m/z sousedních píků M – MW proteinu z – nábojový stav
Intensita
X = (M+z)/z Y = (M+z+1)/(z+1) X
Nábojový stav (z) píku X: zx= (Y-1)/(X-Y)
Y
MW: M = (X*zx)-zx = (Y*zy)-zy
m/z
Myoglobin: výpočet MW X = 998.25 Y = 942.82 zx = (Y-1)/(X-Y) = (942.82-1)/(998.25-942.82) ≈ 17 zx = 17, zy = 18 M = (X*zx) – zx = 998.25*17-17 = 16952.91 Teoretická MW = 16951.52
Neznámá molekula Í N T N A T DIS
I V K E U O S )J 4 E 4 N ( ! nu ! i ! e t o ER r p M Y L vy a1101.8 O t P Xs= E é Y = 1057.8 J v o j O T bo á O n T z = (Y-1)/(X-Y) = (1057.8-1)/(1101.8-1057.8) ≈ é x n z 24 Rů zx = 24, zy = 25
M = (X*zx) – zx = 1101.8*24-24 = 26419.2 M = (Y*zy) – zy = 1057.8*25-25 = 26420 M = (662.1*34) - 34 = 22477.4 M = (1762.1*9) - 9 = 15849.9
Identifikace proteinů Protein na gelu nebo roztoku Štěpení proteinu Peptidové mapování/ Peptidový fingerprinting
Identifikace proteinu - princip
Proteinové štěpení
• • • • • • •
Trypsin Chymotrypsin AspN GluC ArgC LysC CNBr
K/RY/W/K/F-D E-, E/DRKM-
\-P \-P \-P \-P \-P
Důležitá je přesnost… Čím vyšší přesnost měření, tím méně peptidů potřebujeme pro bezchybnou identifikaci
1000.0000 Iontová past 100-1000 ppm TOF 10-100 ppm FT-ICR 0.1 – 1 ppm
□ groEL protein
*
ATP synthase
Peptidové mapování ¾MOWSE – MRC/HGMP ¾Pro-Found – Proteometrics, Rockefeller University ¾MASCOT – Matrix Science ¾PepIdent, MultiIdent – SWISS-PROT ¾PepSEARCH – EMBL ~ PepSea – Protana ¾MS-Fit – Protein Prospector,UCSF ¾pepMAPPER – UMIST
Identifikace proteinu Protein na gelu nebo v roztoku Štěpení proteinu Peptidové mapování/ Peptidový fingerprinting
Bez výsledku
Peptidové mikrosekvenování (PSD, MS/MS)
Peptidové sekvenování
Fragmentace peptidu b1
b2
b3
R1
R3 R4 R2 NH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO2H N-konec
C-konec
y3
y2
y1
Fragmentace peptidu S-P-A-F-D-S-I-M-A-E-T-L-K MH+ = 1410.6 b-ions+ 88.1 185.2 256.3 403.5 518.5 605.6 718.8 850.0 921.1 1050.2 1151.3 1264.4
y-ions+ S PAFDSIMAETLK SP AFDSIMAETLK SPA FDSIMAETLK SPAF DSIMAETLK SPAFD SIMAETLK SPAFDS IMAETLK SPAFDSI MAETLK SPAFDSIM AETLK SPAFDSIMA ETLK SPAFDSIMAE TLK SPAFDSIMAET LK SPAFDSIMAETL K
1323.6 1226.4 1155.4 1008.2 893.1 806.0 692.3 561.7 490.6 361.5 260.4 147.2
Další typy fragmentových iontů C-konec x3
y3
z3
R1 O H2N
C H
N-konec
y2
R2 O
C
a1
x2
b1
N
C
H
H c1
C
z2
x1
y1
z1
R3 O N
C
H
H
a2 b2 c2
C
a3
b3
R4 N
C
H
H
c3
COOH
… a ještě další typy iontů … R1 O
+
R2
a2
H H
R1 O
R2
+
H2N C C N C C O H
b2
H H
R1 O
c2 H
R2 O H
+
R3 O
+
y2 H
R3 O
R4
+
z2 H
H2N C C N C H
H
N-koncové: a, b, c, d C-koncové: x, y, z, v, w
d2
H H
O
R4
H+
HN C C N C COOH
H
C C N C COOH H
R1 O
R4
H3N C C N C COOH H
H2N C C N C C NH3 H
R4
O C N C C N C COOH H H H H x2
H2N C C N C H
R3 O
+
+ H CHR'
H
v2
CHR' O C H
H H
R4
C N C COOH
w2
H H
H+
Nomenklatura fragmentových iontů peptidů Ion type
Ion mass
Ion type
Ion mass
a
[N]+[M]-CO
d
a-partial side chain
a*
a-NH3
v
y-complete side chain
ao
a-H2O
w
z-partial side chain
a++
(a+H)/2
x
[C]+[M]+CO
b
[N]+[M]
y
[C]+[M]+H2
b*
b-NH3
y*
y-NH3
bo
b-H2O
yo
y-H2O
b++
(b+H)/2
y++
(y+H)/2
c
[N]+[M]+NH3
z
[C]+[M]-NH
N C M
hmotnost N-koncové skupiny
hmotnost C-koncové skupiny hmotnost však AK zbytků
Jak spočítat hmotnost iontu? • b-ionty 1 + B1 + B2 + B3 + B4 + . . . . • y-ionty 1 + 18 + Y1 + Y2 + Y3 + Y4 + . . . . • a-ionty b – 28 (CO) • immoniové ionty AK zbytek – 27 • MW Σ(AK zbytek) + 18
Přehled aminokyselin v číslech AK G A S P V T C L I N D Q K E M H F R Y W
Gly Ala Ser Pro Val Thr Cys Leu Ile Asn Asp Gln Lys Glu Met His Phe Arg Tyr Trp
Hmotnost 57.02 71.08 87.03 97.05 99.07 101.05 103.01 113.08 113.08 114.04 115.03 128.06 128.09 129.04 131.04 137.06 147.07 156.10 163.06 186.08
Boční řetězec 1 15 31 41 43 45 47 57 57 58 59 72 72 73 75 81 91 100 107 130
Immoniové ionty 30 44 60 70 72 74 76 86(72) 86(72) 87(70) 88 101(84, 129) 101(129, 112, 84, 70) 102 104(61) 110(166, 138, 123, 121, 82) 120(91) 129(112, 100, 87, 73, 70, 59) 136 159
Pravidla pro čtení sekvence 1.
? Nábojový stav, hmotnost prekurzoru
2.
? C- nebo N-koncová AK – na základě štěpení
3.
? Komplementární ionty – nikdy nekombinovat různé série !!! y + b – 1 = [M+H]+
4.
? a- / b-iontové páry (dif. 28a.m.u.)
5.
? Ztráty H2O/ NH3/ CH3SOH (dif. 18 / 17 / 64 a.m.u.)
6.
? Vícenásobně nabité ionty + následné neutrální ztráty
7.
? Prolin
1069 y8
175 y1
W S V Q I Y F E D R a1 159
• • • • •
b2 274
b-ionty 1 + B1 + B2 + B3 + B4 + . . . . y-ionty 1 + 18 + Y1 + Y2 + Y3 + Y4 + . . . . a-ionty b – 28 (CO) Immoniové ionty AK zbytek – 27 MW Σ(AK zbytek) + 18
Hmotnost [M+H]+ [M+2H]2+ [M+3H]3+ [M+Na]+
1341.6 1342.6 671.8 448.2 1364.6
m/z 699.62 tryptic digest (-K/-R)
[M+H]+ = 1398.24
ends with -K
AAAAAAAAAAAAAAGAAGK
A
A
A
A KG
A A 6A
A
A A
A
A A
A
G A
A
G
A
A
K A G
A
A
A
2A
A 2A
[M+2H]2+
SSLPPLPGPDK
y82+
y8 y7
y5 y8
y5
y7
y3
GTPGELTYSVTYTPGASTNKHPDWWNEK y15
y26
y7
y263+
[M+3H]3+
y182+ y202+
y162+ y7 y152+
y212+ y222+ y232+
y172+
y192+
y252+
y262+
Jak rozbíjet peptidy (a jiné molekuly…) • • • • • •
CID – Collision Induced Dissociation CAD – Collisionally Activated Dissociation PSD – Post-Source Decay ISD/ISF – In-Source Decay/Fragmentation ECD – Electron Capture Dissociation IRMPD – Infrared Multi-Photon Dissociation
• Další – EI, FAB, atd.
Interpretace MS/MS Spekter ¾MASCOT MS/MS SEARCH - Matrix Science ¾MS/MS SONAR - Proteometrics, Rockefeller University
¾PepFrag – Proteometrics, Rockefeller University ¾MS Seq, MS Tag - Protein Prospector,UCSF ¾SEQUEST – Scripps, ThermoFinnigan
MASCOT – MS/MS
MASCOT – MS/MS výsledek Skóre
Report
„Error tolerant search“ report
Sequence Tagging Input information: ¾short sequence (e.g.3 AA) ¾exact peptide MW ¾fragment ion type
m/z1-X-Y-Z-m/z2 [M+H]+ 716.4-N-Q-Q-1086.6 [M+H]+ = 1475.7 y-ions search
gi|254622| (S43646) Cytokeratin 2 …..161 VNQSLLQPLN VKVDPEIQNV KAQEREQIKT LNNKFASFID KVRFLEQQNQ VLQTKWELLQ QMNVGTRPIN LEPIFQGYID SLKRYLDGLT 250…..
PepSea PROTANA
Sequence Tagging
...SEARCH…
Identifikace proteinů Protein na gelu nebo v roztoku
Identifikace proteinu Štěpení proteinu Peptidové mapování/ Peptidový fingerprinting
Bez výsledku
Peptidové mikrosekvenování (PSD, MS/MS)
Bez výsledku Oligonukleotidy Klonování Sekvenování DNA NEBO
„de novo“ sekvenování
Strategie peptidového sekvenování ¾ Zefektivnění fragmentace ¾ Preferenční tvorba jedné iontové série ¾ Odlišení iontových sérií ¾ „de novo” sekvenování
¾ Derivatizace: Chemically Assisted Fragmentation CAF ¾ H218O značení ¾ Esterifikace (EtOH: 28 Da / COOH skupinu) ¾ Ladder Sequencing
Chemically Assisted Fragmentation ¾ Modifikace lysinu (guanidylace) ¾ CAF reagens (NHS-ester se sulfonovou skupinou) ¾ negativně-nabité N-koncové ionty ¾ Spektra obsahují především y-ionty ¾ Reakce: 1-2 min v 50 mM NH4HCO3/MeCN (1:1) při lab. teplotě těsně před analýzou
MW = 184 Da
N-konec
∆m = 184 Da
Chemically Assisted Fragmentation
[M+H]+
-184 Da
Značení pomocí
18O
Štěpení ve směsi H2O:H218O (1:1) 18OH
H
+ trypsin 999.5
H2O
999.5 1001.5
H218O
normalní H2O
TQDFTDQ
značaná H218O
Q
D
T
F
D
Q
T
Esterifikace » Esterifikace směsí alkohol/acetyl chlorid » modifikace Glu, Asp, C-konce » COOH skupina změněna na COOCxHy » ∆m – ethanol - 28 Da na každou COOH skupinu v peptidu
Ethylesterifikace
Ethylesterifikace FTQDFTDQSVK
Alkylace • Cys – zlepšuje detekeci peptidů s Cys, brání tvorbě disulfidicky vázaných dipeptidů • 1.krok – redukce S-S na SH pomocí DTT, TCEP, ME. Za zvýšené teploty (65°C). • 2.krok – reakce s alkylačním činidlem. IAA, VP, AA, BrEA. Za normální teploty, v temnu a nejlépe pod dusíkem. • Při použití BrEA – Cys se mění na analog Lys – lze štěpit v daném místě pomocí Trypsinu nebo LysC. • Alkylace má význam i při kvantifikaci (ICAT, aj.)
alkylace Cys během elektroforézy 2+
y20
DSLLPVSAYCDMETDGGGWTVFQR MW + 71Da ??
DSLL PVSAYCDMETDGGGWTVFQR
AA
„Ladder Sequencing“ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
z N- nebo C-konce Chemická nebo enzymatická degradace Edmanova chemie (PITC) Karboxypeptidasy (Y, P, B) Aminopeptidasy Karboxypeptidasa Y Čistý peptid
Částečná oxidace methioninu – další pomoc při čtení sekvence YATFMESLR
Částečná oxidace methioninu – další pomoc při čtení sekvence YATFMoxESLR
Differenční proteomika – identifikace proteinů pH 3.0 250 kDa
MW
10 kDa
non-linear IPG
pH 10.0
Proteiny ovlivněné terapií 1
Protein Spot No. 6
2 6
Protein Disulfide Isomerase P55
No. 1 & 2: Calreticulin 3
4
5
No. 3, 4 & 5: ER p57 protein No. 6: Protein Disulfide Isomerase P55
malate dehydrogenase
Bottom up vs. Top down identifikace proteinů • Štěpení proteinu/směsi • MS, MS/MS (na úrovni peptidů) • LC-MS(/MS) • DTB prohledávání na bázi PMF, MS/MS
• • • • •
Pre-frakcionace Purifikace v plynné fázi Určení přesné MW MS/MS proteinu DTB prohledávání pomocí MW proteinu a sekvenčního „tagu“ • Zachována informace o PTM
TopDown
http://kelleher.scs.uiuc.edu/
Shotgun proteomics – Analýza proteinových směsí •Bez gelů - 1D nebo 2D – ztráta informace o PTM •Komplexní směsi (organely, celé buňky,…) •HPLC – 1D – RP C18 • 2D – SCX/SAX + RP C18 •3D – GF + SCX/SAX + RP C18 •2D or 3D + afinitní purifikace •data dependentní analýza •píkové parkování •“frakcionace v plynné fázi”
Full MS Mass range(350-1800) Scan 1479
Full MS/MS (CID) Scan 1480 Precursor 667.7
Data-Dependent MS & Dynamic Exclusion 1
100
735.7
Relative Abundance
90 80 70 60
1469.9
2
50 40 30 490.9
20 10 0
3
971.4
5
588.5
400
500
600
700
800
903.0
900
4 1070.7
1213.7
1353.8
1500.6
1666.7 1786.0
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 m/z
1486 - 88 AIIIFVPVPQLK (RPS7)
1478 - 80 NLQNLLILTAIK
1468 - 72 SVDPTLALSVYLR
1470 SVNESLNNLFITEEDYQALR
1450 - 52 TTGFGMIYDSLDYAK (RPS24)
1418 - 20 LLEPVLLLGK (RPS16)
1414 - 22 TDITYPAGFM*DVISIDK (RPS4)
1412 LTDQLPLIIVCDR
1410 WLLLTGISAQQNR
„Gas-phase Fractionation“ 100
Relative Abundance
90
1
735.7
1
2
3
80 70
1
60
1469.9
50 40
2
30 20 10 0
1
490.9
2
588.5
400
500
2
971.4
600
700
800
903.0
900
1070.7
1213.7
1353.8
1500.6
1666.7 1786.0
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 m/z
Kvatifikace pomocí MS • ESI, (MALDI) • Interní standart – stejné podmínky ionizace • Izotopické značení – ICAT – Isotope Coded Affinity Tags – značí jen některé AK, zjednodušuje komplexitu směsi, izotopický efekt H/D – PhIAT – Phosphoprotein Isotope Coded Affinity Tags – kvantifikace Pproteinů – D3/H3 acrylamid – značí jen Cys, nezjednodušuje komplexitu, menší izotopický efekt – D3/H3 esterifikace – značí C-konec, D, E, nezjednodušuje komplexitu, malý izotopický efekt – SILAC – Stable Isotope Labelling – přídavek L/I (C12/13, N14/15), žádný izotopický efekt, mnoho různých peptidů je značeno, komplexita směsi zůstává – AQUA – Absolute Quantification of Abundance
Isotope Coded Affinity Tag (ICAT) reagens O N
XX
O N
S Biotin tag
XX
O
XX
O
O
O XX N
Linker (těžký nebo lehký)
I
Thiol reaktivní skupina
100
Relative Magnitude
N
d0- or d8-ICAT (X= H nebo D)
LDQWLCEK d0 d8 1520 1525
50
0 800
1200
m/z 1600
1530 1535 1540
2000
2400
Kvatifikace a identifikace pomocí ICAT
ICAT-em značené cysteiny
Směs 2
y n ra ra l b o s m jád o e t y m c Případná frakcionace
Směs 1
100
Light
0
550
100
Smíchat a štěpit
560
Heavy
570
m/z
580
NH2-EACDPLR-COOH
Afinitní separace 0
200
400
600
m/z
800
Kvantifikace a identifikace proteinů
ICAT
vs .
in vitro značení Stav 1
SILAC in vivo značení
Stav 2
znační
Sklízení buněk Stav 1
Sklízení buněk
Stav 2
značení Stav 2
Stav 1
1+2
Smíchání buněk Přečištění
1+2
Smíchání proteinů Přečištění
Štěpení trypsinem a analýza LC-MS/MS
Štěpení trypsin a Analýza LC-MS/MS
AQUA
Absolute Quantification of Abundance
Gerber SA, PNAS 2003, 100:6940
Nutná znalost toho, co známe. Peptid vytipován na základě předchozích pokusů Vhodné pro “lovení” málo abundantních proteinů (SRM mode)
Výběr vhodného peptidu: Ne M, W, H Ne KK, KR, RR nebo i KXR, KXK, KXXK Vhodná velikost – Nábojový stav
Funkční proteomika – Analýza komplexů aneb kdo s kým.. Nativní elektroforéza S40 Ribosome subunit
kDa 667
Proteasome S26
440 230
Clathrin
ATP synth. F1
140 67
MARKER
Calreticulin
RNK16
KIDNEY
Monitorování místa zásahu enzymu gliadin fragment VSFQQPQQQYPSSQ
tTG enzym Q ⇔ E ∆1 Da
0 min
VSFQQPQQEYPSSQ +
30 min
VSFEQPQQEYPSSQ +
++
3 hrs
PostTranslační Modifikace
• Disulfidické můstky (CysCys) • Glykosylace • Fosforylace • Acylace
• • • • •
Oxidace Acetylace Zkrácení Ztráta N-konc.Met Glu -> pyro-Glu
Disulfidické můstky A - určení zda jsou nebo nejsou přítomné – diferenční alkylace B – určení kolik Cys je volných a kolik vázaných 1. denaturace, alkylace činidlem I (u menších proteinů lze rovnou měřit MS) 2. redukce a alkylace činidlem II 3. štěpení a MS, LC-MS/MS – určení C – přímá identifikace disulfidů - štěpení + LC-MS (FTICR) – hledání disulfidicky spojených peptidů podle přesné hmotnosti D – izolace disulfidicky spojených peptidů a jejich identifikace MS popřípadě Edman. oddouráváním
Diferenční alkylace – celý protein
Disulfidické můstky štěpnení pepsinem nebo chymotrypsinem ½ redukována, ½ nativní diferenční HPLC (RP, IXC) – vytipování frakcí MS analýza, +/- redukční činidlo MS/MS pro určení sekvence peptidů
Disulfidické můstky
+ DTT redukce S-S vazby
Disulfidické můstky PSD
Disulfidické můstky
Disulfidické můstky Y L D C G H G G F N Y G G N G G S W C A P Y K T M1 + M2 +H+ - 2H (z Cys) = [M1-S-S-M2+H]+ (967.4 + 1573.7) + 1 - 2 = 2540.1
Glykosylace • Mnoho důležitých funkcí: stabilizace struktury, dobré poskládání, ochrana před degradací, interakce ligandreceptor, targeting, modulace aktivity • N-glykosylace na sekvenci: NXT/S/C – v β-strukturách nebo smyčkách sacharid: větvený, 3 typy: mannosový, komplexní, hybridní • O-glykosylace nemá klasický motiv S, T, ale také hydroxyPro, Lys, atd. sacharid: cokoliv od monosacharidu pro dlouhé, případně mírně větvené struktury
N-glykosylace • Určení zda protein je nebo není glykosylován a - podle mobility na gelu+deglykosylace b - lektin-blot – určuje terminální sacharidy c - přímo v MS d - glykoproteinové barvení
b)
a) TMSF
PNGase F
c) 1 2 3 4 5 6
– – – – – –
ConA LCA PNA SBA WGA UEA
d) • • •
Oxidace kys. Jodistou Přidání Schiffova reagens (kys. fuchsinsiřičitá) Odbarvení pozadí
Alternativy s fluorescencí nebo biotinylací Použitelné i pro histologii
N-glykosylace 1. 2. 3. 1.
2.
3.
Charakterizace sacharidových struktur+určení heterogenity Nalezení míst glykosylace Přiřazení struktur na jednotlivá glykosylační místa a) uvolnění glykanu(-ů) – enzymaticky – PNGasa F, Endo H, Endo F1-3, postupné odštěpování pomocí exoglykosidas, Pronasa chemicky – hydrazinolýza, alkalické štěpení, TMSF – (pouze deglykosyluje – ničí sacharid) b) charakterizace glykanů – NMR, MS, MS/MS, permethylace+MS/MS, exoglykosidasy+MS a) Edmanovo odbourávání – nejlépe glykopeptidy peptidy po EndoH b) deglykosylace PNGasouF v H216O a H218O (+ štěpení AspN) – PNGasa F mění Asn na Asp (vzniká zásahové místo pro AspN) Štěpení proteinu – izolace glykopeptidů a opakovaní postupu na jednotlivých glykopeptidech
Glycan MS/MS – nomenclature
Domon-Costello (1998)
Glycosylation: PSD-MALDI MS
Deglykosylace PNGasouF v H216O a H218O
Asn -> Asp 16O -> 18O
+1 a.m.u. +2 a.m.u.
Posun proti hmotnosti původní sekvence
+ 3 a.m.u.
Jak to lze urychlit? - přímá analýza glykopeptidů
• Štěpení různými proteázami a LC-MS/MS (iontová past, q-tof, q-FT-ICR) nebo LC-MS (FT-ICR) • Jak identifikovat glykopeptidy a) hledáme v MS záznamu diference odpovídající sacharidům (např. 162, 81, 54 pro Hexosu) b) použijeme speciální nastavení a pomocí ISF generujeme charakteristické ionty v oblasti malých m/z (163, 204, 274, 292, 366) c) pomocí SW hledáme glykopeptidy podle velice přesných m/z (FT-ICR)
Glycopeptide: ESI MS/MS
(nejenom)
Peptidové sekvenování ve FTMS
Infrared Multiphoton Dissociation (IRMPD) • CO2 laserový paprsek • Vibrační excitace funkčních skupin OH, COOH, NH2… • Fragmentace peptidové páteře: b- a y-iontové series • Určení / ověření sekvence • Za mírnějších podmínek pouze ztráta labilních skupin - PTM
(nejenom)
Peptidové sekvenování ve FTMS
Electron Capture Dissociation (ECD) • Záchyt „studeného“ elektronu (E ≤ 0.1 eV) preferenčně na S-S můstcích a vazbě N-Cα • Neutralizace H+; [M+2H]+. Vodíkem nabohacený radikálový iont • Štěpení vazby N-Cα; extensivní fragmentace • c- a z-iontové série; b- a y-ionty chybí • Prefenční štěpení peptidové vazby, jsou zachovány labilní skupiny modifikací • „Horké“ ECD (3-13 eV); sekundární fragmentace – z ionty tvoří ionty w
ECD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
ECD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
Kombinace IRMPD & ECD • Komplementární techniky pro řešení peptidové/proteinové sekvence a lokalizaci a identifikaci PTMs • Může být provedeno během jednoho experimentu • Analýza glykopeptidů, fosfopeptidů, lokalizace γkarboxyglutamové kys., rozlišení Ile/Leu…
Fosforylace Signalizace, aktivace,… S, T, Y,
H
Ztráta (P) skupiny: -98, -80 - Směrovaná MS analýza (neutrální ztráta, precursor ion scanning, negativní mód) Nabohacení – protilátky, IMAC Působení fosfatázy / alkalií + diferenční mapování „Vychytávání“ fosfopeptidů: eliminace, adice afinitní skupiny 2D P-peptidové mapování (elektroforéza/TLC)
Fosforylace A
4 3 .3 0
100 90
3 2 .8 2
Relative Abundance
80 70 60 3 7 .3 5
50 40 2 6 .6 5
30
2 8 .0 1
3 5 .9 3
3 0 .0 3
20
4 2 .4 2
3 9 .3 1
10
3 4 .1 1
2 8 .9 8
4 4 .3 3
4 1 .1 3
0
B
2 9 .9 6
100 90
49 Da neutrální ztráta
Relative Abundance
80
Možné fosfopeptidy
70 60 50 40 30 2 6 .1 2
20
3 5 .9 1
10 0
2 7 .7 1
2 4 .9 0 25
26
27
28
29
3 2 .9 0
3 1 .0 1
2 8 .8 6 30
31
32
33
3 4 .2 7 34
35
3 7 .3 8 36
T im e (m in)
37
38
3 9 .0 9 4 0 .3 34 1 .2 6 39
40
41
4 2 .4 5
42
43
4 3 .8 7 4 4 .9 4 44
45
Fosforylace GVVTNGLDLSPADEK * Loss Ztráta of phosphate fosfátu (m/z749) (m/z749) Parent Rodičovský ion position iont (m/z (m/z798) 798)
IMAC – Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography • IDA (iminodiacetic acid) NTA (nitrilo-triacetic acid)
• Iont kovu – Ga3+, Fe3+ • Nespecifická vazba – esterifikace
Působení alkalického prostředí P-peptidy
P-peptidy po působení alkálií
Mol. Cell. Proteom. 2002, 1:186-196
“vychytání” fosfopeptidů •Oxidace Cys •Eliminace •Adice ethanedithiolu •Biotinylace •Afinitní purifikace •MS, MS/MS •POUZE PRO pS, pT !!!
Nat. Biotech. 2001, 19:379-382
Flavoprotein – lokalizace flavinu?
RP-HPLC tryptického/chymotryptického digestu
220 nm
450 nm
flavopeptid
Flavoprotein – lokalizace flavinu? MALDI-MS intaktního (?) flavopetidu PSD
[M+H]+
Flavoprotein – lokalizace flavinu? PSD MALDI-MS
H
a3-NH3-H2O a3-NH3 b3-H2O
S-T-H-W
[M+H]+
b3 y2
H W S T
y1
a2 b2
a4 a3 y3
b4
Flavoprotein – lokalizace flavinu? MALDI-MS intaktního (?) flavopetidu
PSD
[M+H]+
[f+2H]+ 348 [j+2H]+ 136 h+ 250
438
Struktura flavopeptidu
785 [d+2H]+ 428
O
H N
O HN
4
N
4a
5a 6
2
O
7
CH3
?
9
N
10a 1
N
8
9a
CH3
H
OH
H
OH CH2
5
HN
1
NH2
f O
6
N O
O P O P O HO
438 d
His
N
3 2
OH
Thr
4
CH2
H
5
Trp
OH
2
CH2 5
HO
h
N
5
4
O 4
3
N N
8
1 2
OH
j
Ser
QDPTDVGEAFANVEWSVAELKR 2461.2 did not fit + 17Da bigger
Gln
O NH2
C
C H2
C H2
O
H C
C
NH2
N H
R
(111)D PTDVGEAFANVEWSVAELKR
NH3 H2C
H C
H2C
NH
O C
N H
C O
pyro-Glu
R
128-17=111 pyro-Glu !!!
Určování 3D struktur pomocí FT-ICR MS – MS3D - proteiny jejichž str. není řešitelná krystalografií nebo NMR (MW > 30kDa, flexibilní domény, membránové proteiny, proteiny s PTMs,…) - Surface accessibility – povrchové značení a reaktivita AK – jedna reaktivní skupina O
N
O C CH3 O
O
- Intramolekulární zesíťovací činidla (cross-linkers) – dvě a více reaktivních skupin, odděleny raménkem o různé délce – tzv. molekulární pravítka O
O
O N
O
O
C
11.4 Å DSS
O
N O
O
O
O
C
N
O
O
O
O
O
C
O C
7.5 Å DSG
O N
O
N O
O
OH
O C
C OH
O
5.8 Å DST
O
N O
