Hmotnostní spektrometrie (1) 360 340
7) 0.67 12 ( CC A 1 y_ igsb DGr HCV 57 _ a dob Chu 12_ 0 71 10 43 55
%
69
41 28
29 32 27
0
320 300 280
85 83 81 67
79
67 54
183 165 155 3 111 5 7 1 125 127 13 180 113 99 160
97 95 93
105
197
211
225
260 240
220
200
140 120
100 80
60 40
20
Josef Chudoba
OBSAH
Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrum – základní pojmy, molekulová hmotnost, izotopy prvků způsoby měření spekter Rozlišovací schopnost spektrometru Ionizační techniky v hmotnostní spektrometrii Typy hmotnostních spektrometrů Historie hmotnostní spektrometrie Součásti hmotnostního spektrometru – iontový zdroj separátor iontů vakuový systém způsob dávkování vzorku
Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry – MS)
Analytická technika pro analýzu organických sloučenin Kvalitativní analýza – identifikace sloučenin (především nízkomolekulární sloučeniny), pomoc při odvození resp. potvrzení struktury molekuly (výšemolekulární sloučeniny) Kvantitativní analýza – sledování obsahu vybraných analytů v různých matricích Ale i sledování obsahu kovů (ICP MS) Speciální aplikace pak např. ISOTOPE RATIO MS Podstatou MS je detekce nabitých částic (iontů), které vznikají z molekul vzorku při IONIZACI – jedná se o destruktivní metodu – vzorek je při analýze znehodnocen
VZORKY JAKÉHO SKUPENSTVÍ A S JAK VELKOU MOLEKULOU LZE POMOCÍ MS ANALYZOVAT V hmotnostní spektrometrii se používají různé ionizační techniky, ale v praxi lze ionty vytvořit i z vysokovroucích, vysokomolekulárních sloučenin Od vodíku (1 Da) po proteiny s molekulovou hmotností v řádech 10 000 Da, záleží na ionizační technice a hmotnostním spektrometru CO LZE ROZLUŠTIT Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA 1) Hmotnost iontu (popř. molekulovou hmotnost sloučeniny) 2) Přítomnost prvků, které mají výrazné zastoupení izotopů (např. Cl, Br) 3) Při pokročilé fragmentaci molekuly informace o struktuře sloučeniny 4) Je-li hmotnost molekulového resp. pseudomolekulového iontu měřena s dostatečnou přesností tak i možné elementární složení sloučeniny
Hmotnostní spektrum Intenzita 1 ul, split 1:20
[ M + H ]+
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C37H68NO13
734.4691
100
Molekulový resp. pseudomolekulový ion
Magnet EI+ 6.35e12
%
Izotopické příspěvky
735.4691
736.4769
0 731
mass 732
733
734
735
736
737
738
m/z
739
Osa x: m/z – hmotnost iontu dělena jeho nábojem Osa y: intenzita (četnost) fragmentů, které detekuje detektor – je vždy normalizována na nejvyšší změřenou intezitu ve spektru – nejvyšší pík má výšku 100 %
Režim záznamu dat
Hmotnostní spektrum
centrovaný (centroid) – především u GC/MS instrumentace - intenzity m/z iontů tvar „čáry“ kontinuální (continous) – u LC/MS instrumentace intenzity m/z iontů tvar chromatografického píku O
H3C
[ M + H ]+
CH3
OH
H3C
OH
H3C
CH3HO
OH
1 ul, split 1:20 07_Blazek_PO5_1 (5.012) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C37H68NO13 734.4691
100
O CH3
N
CH3
Magnet EI+ 6.35e12
H3C O O
O
O
CH3
CH3
%
O
735.4691
O H3C
Erythromycin
CH3 CH3 OH
736.4769
0 07_Blazek_PO5_1 (15.245) Is (1.00,1.00) C37H68NO13
Magnet EI+ 6.35e12
734.4691
%
100
735.4725
736.4753
0 731
737.4780
732
733
734
735
736
737
mass 738
739
MOLEKULOVÁ HMOTNOST atomů Molekolová hmotnost - jednotka dalton (Da) 1 Da = 1 a.m.u. (atomic mass unit) = hmotnost 1/12 izotopu 12C 1 Da = 1,660 338 782 x 10-27 kg Molekulová hmotnost – hmotnost molekuly /prvků/ (jednotka a.m.u.) Molární hmotnost – hmotnost 1 molu molekul (jednotka g/mol) číselně molární hmotnost a molekulová hmotnost shodné monoisotopická - počítána z hmotností izotopů prvků průměrná - zohledňuje hmotnosti všech izotopů prvků (uvedená v periodické tabulce) nominální – zaokrouhlená (celočíselná) monoisotopická hmotnost
MOLEKULOVÁ HMOTNOST atomů Výpočet průměrné (relativní) hmotnosti atomu prvku (Mr) Mr = Σ (Ai * Mi) / Σ Ai
Mi – monoisotopická hmotnost izotopu Ai – intenzita (zastoupení) izotopu
Příklad chlor: - 35 Cl 37Cl
Mi = 34,96885 a.m.u.
Ai = 100 %
Mi = 36,96590 a.m.u
Ai = 31,96 %
Mr = (100 * 34,96885 + 31,96 * 36,9659) / 131,96 = 35,4525
MOLEKULOVÁ HMOTNOST bromobenzene
V MS spektrech vždy MONOISOTOPICKÁ hmotnost
Br
ve spektru jsou všechny izotopy 77
100
Br
Nominal Mass
= 156 Da
Monoisotopic Mass = 155.957455 Da Average Mass
50
= 157.0079 Da 0
Molecular Formula = C6H5Br
156
51 12
38
27
60
10 30 50 (mainlib) Benzene, bromo-
104 113 70
90
143
128
110
130
150
170
benzene
78
100
50
Nominal Mass
= 78 Da
Monoisotopic Mass = 78.04695 Da Average Mass
= 78.1118 Da
0
10 20 (mainlib) Benzene
51
39
26
15
30
74
63
40
50
60
70
80
Molecular Formula = C6H6
Informace z MS spektra – zastoupení izotopů prvků Relativní zastoupení izotopů prvků v přírodě Prvek
Izotop
% rel.
Izotop
% rel.
Uhlík
12C
100
13C
1,11
Vodík
1H
100
2H
0,016
Dusík
14N
100
15N
0,38
Kyslík
16O
100
17O
Síra
32S
100
33S
100
29 Si
Křemík
28 Si
Chlor
35Cl
Brom
79Br
A+2 prvky
A prvky
Izotop
% rel.
0,04
18O
0,20
0,78
34S
4,40
5,08
30 Si
3,35
100
37Cl
32,5
100
81Br
98,0
A+1 prvky
F, I, P, Na H(vzhledem k nízké intenzitě A+1)
90
1 ul, split 1:20 07_Blazek_PO5_1 (12.550) Is (1.00,1.00) Cl2 70 5.74e12 100
1 ul, split 1:20
Cl2
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br2 160 5.00e12 100
Br2
1 ul, split 1:20 07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br 78.9183 5.07e12 100
72
1 ul, split 1:20
80.9163
%
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Cl 34.9689 7.58e12 100
%
158
162
1 ul, split 1:20
74
07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br3 3.80e12 239 241 100
0
mass
0
%
%
66 68 70 72 74 76 78 80
mass 160
170
1 ul, split 1:20 07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Cl3 105 4.35e12 100
Br3
107
%
150
36.9659 237
Cl3 %
243
0
mass 70
75
80
85
0
90
0 25
mass 230
235
240
245
250
mass 30
35
40
45
Cl Br
109
I (m/z 35) : I (m/z 37) cca 3:1
I (m/z 79) : I (m/z 81) cca 1:1
111
0 100
m/z 77
112
100 Cl
0
m/z 113 6,9 %
77
50 25
51
32 38 43
20 30 40 50 (mainlib) Benzene, chloro-
m/z 114 32,9 % 56 61 60
74 70
84 80
97 90
100
110
120
Br
m/z 77
156
100 %
m/z 156 61,8 %
50
51 12
27
38
60
10 30 50 (mainlib) Benzene, bromo-
104 113 70
90
110
m/z 157
143
128 130
150
170
4,1 %
m/z 158 59,8 %
77
100
204
I
m/z 77
50 51 0
130
77
100
0
45,3 %
m/z 112 100 %
27 37
20 40 60 80 (mainlib) Benzene, iodo-
m/z 204 74,5 %
127
60 100
120
100 %
152 140
160
176 180
200
220
m/z 205
4,4 %
110
mass 120
Přibližný počet atomů uhlíku ve sloučenině (Cn) A:m/z 78
100 %
78
100
A+1:m/z 79
6,5 %
Cn =
( I ( A+1) / 1,1) I ( A)
50
*100
51 39 0
26
15
49
40
10 20 (mainlib) Benzene
30
40
74
63
53
50
60
70
80
90
154
100
A:m/z 154
100 %
A+1:m/z 155 12,9 % 50
76 51 0
27
39
20 30 40 (mainlib) Biphenyl
50
63 60
89 70
80
90
102 100
115 110
120
128 130
139 140
150
160
170
Nutné doplňující informace k hmotnostnímu spektru 1) Jaká ionizační technika byla při měření použita tvrdé ionizační techniky – vlivem přebytku dodané energie se vzniklý molekulový ion dále štěpí měkké ionizační techniky – malá nebo skoro žádná fragmentace 2) S jakým rozlišením bylo spektrum měřeno hmotnost s přesností celého čísla (jednotkové rozlišení) – v praxi nejvíce rozšířené u GC/MS přístrojů hmota s přesností na desetinná místa 3) Jaký experiment (MS vs MS/MS – typ fragmentace v MS) 4) Použitá instrumentace a podmínky měření
Rozlišovací schopnost spektrometru (R) – jak se rozdělí ionty s blízkou hmotností R = m/ ∆ m m … m/z iontu, ∆ m . . . rozdíl m/z dvojice sledovaných iontů Různé definice rozlišení: „valley“ definice vycházející s překryvu píků „FWHM“ (Full Width at Half Maximum) definice vycházející ze šířky píku
Převzato z materiálu Thermo Fischer Scientific
VYSOKÉ rozlišení (HIGH RESOLUTION) Jsou-li MS spektra měřena s vysokým rozlišením je možné rozdělit sloučeniny se stejnou nominální, ale odlišnou monoisotopickou hmotou [ M + H ]+
Je naměřená hmotnost iontu (m/z) správná? Před měřením se provádí kalibrace hmotnostní stupnice pomocí kalibračních standardů – chyba naměřené m/z a skutečné m/z závisí na rozlišovací schopnosti resp. typu spektrometru a kvalitě kalibrace Chyba při měření hmoty (∆ ∆ macc) ∆ macc = m ∆ macc (ppm)
= 106
MEASURED
- m TRUE
x ∆ macc / m TRUE Kalibrace externí nebo interní - přidavek referenční (lockovací) látky přímo při měření vzorku
Hmotnostní spektrum sloučeniny je vždy závislé na použité IONIZAČNÍ TECHNICE IONIZACE – tvrdá (vysoká energie stačí na vytvoření iontu z neutrální molekuly a na další štěpení vzniklých iontů) Elektronová ionizace (Electron Impact) s energií elektronů 70 eV / EI + 70 eV / rutinně používaná při GC-MS analýzách, proměřeny statisíce látek – databáze spekter (NIST, WILLEY) V praxi pouze kladný mód (tvorba kladně nabitých iontů) IONIZACE – měkká (dodaná energie stačí většinou pouze na vytvoření iontu z neutrální molekuly) Příklad: ionizační techniky rutinně používané při LC-MS analýzách Elektrosprejová ionazace / ESI /. chemická ionizace za atmosferického tlaku / APCI / - kladný i záporný mód (tvorba kladně resp. záporně nabitých iontů) MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption) – pro vysokomolekulární sloučeniny
Vliv použité ionizační techniky na MS spektrum
GC/MS analýza efedrinu
Molekulový ion v hmotnostním spektru Rozpoznání molekulového iontu v MS spektru není vždy jednoduché EI+ 70 eV u některých látek chybí (vysoký stupeň fragmentace) nebo je jeho intenzita velmi nízká (možnost záměny s ionty pozadí MS spektra) ESI – tvorba vícenásobně nabitých iontů, tvorba aduktů iontů s Na, K, tvorba dimerů APCI – možné štěpení (vlivem vyšší teploty ve zdroji) Existují však pravidla a postupy, které určení molekulového iontu usnadní EI+ 70 eV: Počet kruhů a dvojných vazeb (RINGS + Double Bonds R+DB); zakázané ztráty iontů, pořadí eluce látek na GC koloně (obvykle vyšší molekulová hmotnost – vyšší bod varu – delší retenční čas) ESI: Známé adukty, výpočet molekulové hmotnosti ze série vícenásobně nabitých iontů
Dusíkové pravidlo Dusík – m= 14 Da, třívazný prvek žádný nebo sudý počet atomů dusíku v molekule -> molekulová hmotnost látky je SUDÉ číslo lichý počet atomů dusíku v molekule -> molekulová hmotnost látky je LICHÉ číslo EI+70 eV: 0 nebo sudý počet N: m/z molekulového iontu sudé číslo m/z fragmentů liché číslo lichý počet N: m/z molekulového iontu liché číslo m/z fragmentů sudé číslo ESI+: 0 nebo sudý počet N:
m/z [M+H]+ iontu liché číslo
lichý počet N:
m/z [M+H]+ iontu sudé číslo m/z [M-H]- iontu liché číslo
ESI-: 0 nebo sudý počet N: lichý počet N:
m/z [M-H]- iontu sudé číslo
Počet kruhů a dvojných vazeb – Rings + Double Bonds (R + DB) Vyjadřuje stupeň nenasycenosti molekuly
R+DB = C – ½ H + ½ N +1 C = počet čtyřvazných atomů – C, Si H = počet jednovazných atomů - H, Cl, Br, F … (halogeny) N = trojvazných atomů N, P, As Počet dvouvazných se neuvažuje (dvouvazebná S, O), ale třeba DMSO – síra je čtyřvazná
1 kruh Příklad: fenol C6H5OH
R+DB = 6 –1/2*6+1/2*0+1 = 4
Aromáty : R+DB = minimálně 4
3 dvojné vazby
Využití R+DB a dusíkového pravidla EI+ 70 eV: Celočíselná hodnota R+DB ion s lichým počtem elektronů může být molekulový ion Neceločíselná hodnota R+DB ion se sudým počtem elektronů nemůže být molekulový ion Využití při strukturní analýze Elementární analýza z High Res MS spektra Vždy nutné předpokládat jaké prvky a kolik kterého maximum – org. látky C, H, N, O, popř. S, přítomnost halogenů lze zjistit z izotopického zastoupení, hrubý odhad max. počtu uhlíků (Cn) Cn (max) = Mw/14 (přesněji z izotop. zastoupení)
ELEMENTÁRNÍ ANALÝZA Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA O
Přesnost měření hmoty: High-RES MS spektrometry 1 – 3 ppm
H3C
CH3
OH
CH3HO
OH O CH3
H3C
OH
H3C
N
CH3
Erythromycin C37H67NO13 Mw monoiso = 734,4691 Da
H3C
O
Příklad vstupní parametry:
O O
O
CH3
CH3
Cmax = 52, Hmax = 106, Nmax = 15, Omax = 15
O O H3C
CH3 CH3
Výsledek: navržené kombinace CxHy(Nz,Oz,Sz …)
OH
Přesnost měření - chyba hmoty (ppm) 10 38 výsledků 5
17 výsledků
2
9 výsledků
1
4 výsledky
Aplikace „chemických“ pravidel (max. počet kruhů a dvoj.vazeb, dusíkové pravidlo, izotopické zastoupení prvků) snižuje počet nalezených kombinací !! – řešeno softwarově
Jakou ionizační techniku vybrat pro jaké sloučeniny?
GC/MS
Elektronová ionizace (EI+ 70 eV) - v praxi hmotnost do cca 1000 Da, nutná teplotní stálost sloučeniny, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua, není vyrazně omezena přítomností nějakých funkčních skupin ale např. problematické skupiny NH2-CO- (teplotně labilní) Chemická ionizace (CI) - v praxi hmotnost do cca 1000 Da, nutná teplotní stálost, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua s přídavkem ionizačního plynu (methan, isobutan) – většinou pouze na vybrané typy sloučenin LC/MS Elektrosprejová ionizace (ESI) – pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze), sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu (např. mají kyslík nebo dusík v molekule), vhodný pro iontové sloučeniny Atmosferická chemická ionizace (APCI) - pro teplotně stabilnější látky než ESI ionizace probíhá z plynné fáze po odpaření roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze), elektrickým výbojem dochází k tvorbě iontů MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION (MALDI) – ionizace vzorku v přítomnosti pevné matrice vzorku laserem – vhodné pro vysokomolekulární, teplotně nestálé sloučeniny i nepolární (polymery, proteiny) Existuje celá řada dalších ionizačních technik – cílem je vždy vytvořit nabitou částici, která je následně analyzována.
Jak velké molekuly lze analyzovat
Zdroj: Agilent Technologies
Jak velké molekuly lze analyzovat GC/MS LC/MS
Kvadrupol (Q) Iontová past (IT)
V praxi většinou jednotkové rozlišení, maximální m/z cca 1000 – 2000, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter) Měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~ 40000), maximální m/z až 500 kDa, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter)
GC/MS LC/MS
TOF (Time of Flight) LC/MS
měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~100000), maximální m/z ~4 kDa, pomalejší frekvence sběru dat (spekter)
ORBITRAP GC/MS
měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~40000), maximální m/z ~2000, pomalejší frekvence sběru dat (spekter),
Magnetický sektor
Přístroje hybridní – umožňují provedení tzv. MS/MS měření (více iontových separátorů) GC/MS LC/MS
Trojitý quadrupol
Tripple Quad (QQQ) LC/MS
Q-TOF
Quadrupol – Time Of Flight
LC/MS
Ion Trap – ORBITRAP
iontová past - Orbitrap nebo IT-TOF
Jak velké molekuly lze analyzovat ? MALDI
ESI
až 100 kDa
až 10 - 100 kDa
(vícenásobně nabité ionty)
APCI
až 1 - 2 kDa
EI+ 70 eV / CI
až 1 - 2 kDa
Historie hmotnostní spektrometrie První pokusy s výboji v plynech 1897 – J.J.Thomson Cathode Rays Philosophical Magazine, 1897, 44:293 1919 - Aston F.W. The Mass-Spectra of Chemical Elements Phil. Mag., 1919, XXXVIII(), p.707 – hmotnostní spektra izotopů prvků Ionizační techniky a přístroje 1922 – elektronová ionizace - Smyth na základě pokusů Dempstera 1934 - první magnetický sektorový hmotnostní spektrometr s dvojitou fokusaci J. Mattauch, R. Herzog Über einen neuen Massenspektrographen Zeitschrift fur Physik, 1934, 89(), p.786 1943 – první inzerce na komerční hmotnostní spektrometr The Mass Spectrometer: A new electronic method for fast, accurate gas analysis Westinghouse Electric International Company, 1943
Historie hmotnostní spektrometrie 1946 – objev TOF analyzátoru Stephens W. Pulsed Mass Spectrometer with Time Dispersion Bull. Am. Phys. Soc., 1946, 21(2), p.22 1953 - objev kvadrupolu a iontová pasti Paul W., Steinwedel H. Ein neues Massenspektrometer ohne Magnetfeld Z. Naturforschg., 1953, 8a(), p.448 1956 – spojení plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC/MS) - Golhke R.S., McLafferty F., Wiley B., Harrington D. First demonstration of GC/MS Bendix Corporation, 1956 1966 – chemická ionizace Munson M.S.B., Field F.H. Chemical Ionization Mass Spectrometry I. General introduction J. Am. Chem. Soc., 1966, 88(12), p.2621-2630 1968 - první počátky elektrosprejové ionizace (ESI) Dole M., Mack L.L., Hines R.L., Mobley R.C., Ferguson L.D., Alice M.B. Molecular beams of macroions ,Journal of Chemical Physics, 1968, 49(5), p.2240
Historie hmotnostní spektrometrie 1975 – atmosferická chemická ionizace (APCI) Carroll D.I., Dzidic I., Stillwell R.N., Haegele K.D., Horning E.C. Atmospheric Pressure Ionization Mass Spectrometry: Corona Discharge Ion Source for Use in Liquid Chromatograph - Mass Spectrometer - Computer Analytical System Analytical Chemistry, 1975, 47(14), p.2369 1978 – trojitý kvadrupol Yost R.A. and Enke C.G. Selected Ion Fragmentation with a Tandem Quadrupole Mass Spectrometer Journal of the American Chemical Society, 1978, 100(7), p.2274 1985 – počátky MALDI ionizace Tanaka K., Ido Y., Akita S., Yoshida Y., Yoshida T. Detection of High Mass Molecules by Laser Desorption Time-OfFlight Mass Spectrometry Proceedings of the Second Japan-China Joint Symposium on Mass Spectrometry, 1987, (), p.185
Historie hmotnostní spektrometrie 1989 - rozvoj elektrosprejové ionizace (ESI) Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M. Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules Science, 1989, 246(4926), p.64 2000 – ORBITRAP Makarov A. Electrostatic Axially Harmonic Orbital Trapping: A HighPerformance Technique of Mass Analysis Analytical Chemistry, 2000, 72(6), p.1156 2005 – DART ionizace Cody R.B., Laramee J.A., Durst H.D. Versatile New Ion Source for the Analysis of Materials in Open Air under Ambient Conditions Anal. Chem., 2005, 77(8), p.2297
Zdroj: http://masspec.scripps.edu/mshistory/mshistory.php
Nobelova cena a hmotnostní spektrometrie Joseph John Thomson 1906 Nobel Prize for Physics "in recognition of the great merits of his theoretical and experimental investigations on the conduction of electricity by gases" Francis William Aston 1922 Nobel Prize for Chemistry "for his discovery, by means of his mass spectrograph, of isotopes, in a large number of non-radioactive elements, and for his enunciation of the whole-number rule" Wolfgang Paul 1989 Nobel Prize for Physics "for the development of the ion trap technique" John Bennet Fenn 2002 Nobel Prize for Chemistry "for the development of soft desorption ionisation methods (ESI) for mass spectrometric analyses of biological macromolecules" Koichi Tanaka 2002 Nobel Prize for Chemistry "for the development of soft desorption ionisation methods (MALDI) for mass spectrometric analyses of biological macromolecules
Schéma hmotnostního spektrometru
Inlet Plynový chromatograf Kapalinový chromatgraf
Analyzátor Iontový zdroj
Iontový separátor Detektor
Direct Insertion (Infussion) Probe
Ionizační techniky:
MALDI destička
EI+, CI, APCI, ESI, MALDI
vakuum
Režimy snímání dat: MS experiment
SIM (SIR)
Intenzita
TIC
čas
Full SCAN (Total Ion Current TIC) cyklicky se snímá celé MS spektrum požadovaného rozsahu m/z Rekonstruovaný chromatogram (RIC) z TICu se vybere požadovaný ion a vykreslí se chromatografický záznam Selected Ion Monitoring (SIM) cyklicky se snímají jen vybrané ionty citlivější než TIC režim např. u kvadrupolu detegované absolutní množství analytu činí: TIC řádově ng (10–9g) SIM řádově pg (10–12g) až fg (10-15 g)
m/z
Režimy snímání dat: MS/MS experimenty Pouze hybridní MS spektrometry a tripple Quad
Detektor Iontový zdroj
Kolizní cela
Product Ion Scan: Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC detekce Instrumentace: Tripple Quad, Q-ToF (MS2); Ion Trap (až MS10) s vyšším MSn klesá citlivost!
Precursor Ion Scan: Q1:TIC (m/z1 – m/z2) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce Instrumentace: nelze na Ion Trap
Constant Neutral Loss Scan: Q1:TIC (m/z1 – m/z2) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC ((m/z1- ∆N) – (m/z2-∆N)) detekce; ∆N – rozdíl hmotností iontů – hmotnost odpadající neutrální částice z iontu
Instrumentace: nelze na Q-ToF a Ion Trap
Selective Reacrion Monitoring (SRM): Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce Fragmentace probíhá srážkou iontů s molekulami kolizního plynu (Argon)
Které vlastnosti MS spektrometru jsou v praxi důležité … Cena, provozní náklady, účel využití !!! Napojení na separační techniku: GC/MS X LC/MS Technické parametry: Single (jeden iont. separátor) x hybridní (více separátorů) Rozsah scanování m/z (nejnižší a nejvyšší m/z) Rychlost scanování (počet scanů/s) Citlivost, dynamický rozsah (pro kvantitativní analýzu) Rozlišovací schopnost (vysokorozlišující X jednotkové rozlišení) Kompatibilita s ionizačními technikami (dostupné iontové zdroje) Vakuum (je-li třeba vyšší stupeň vakua – vyšší cena) Požadavky na instalaci: Chlazení pump vakuového systému (vodní nebo vzdušné) Velikost systému - přenosné x stolní (BENCH-TOP) x velké (hmotnost > 500 kg) Plyny – např. LC-MS průtok N2 až 500 l/min – nutný generátor N2 nebo zdroj kapalného N2
MS - iontový zdroj a ionizační technika Electron Impact (EI + 70 eV) – elektronová ionizace nejpoužívanější u GC/MS, nejvíce prozkoumaná ionizační technika U většiny látek se hodnota energie pro tvorbu molekulového iontu pohybuje okolo 10 eV 70 eV přebytek energie dostatečný pro tvorbu molekulového iontu a také pro tvorbu fragmentů z molekulového iontu Dnes jsou k dispozici obsáhlé databáze (knihovny) spekter EI+ dnes běžně ve spojení s GC Látka je ionizována proudem elektronů ve vakuu z plynné fáze Ionizace probíhá ve vakuu
Schéma EI+ ionizačního zdroje
MS - iontový zdroj a ionizační technika ESI (Electrospray)
V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde v elektrickém poli k tvorbě spreje. V kapičkách kapaliny dojde k povrchové lokalizaci náboje a následné tvorbě iontu. Při této ionizaci vznikají často i vícenásobně nabité ionty a adukty např. (M+Na)+ - ionizace probíhá za atmosferického tlaku
MS - iontový zdroj a ionizační technika APCI (Chemická ionizace za atmosferického tlaku)
V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde k tvorbě spreje a vypařování látky i mobilní fáze. Na jehlu je vloženo vysoké napětí, výbojem vzniká plazma a v ní ionty H3O+ a OH● radikály. Ionty předají náboj analytu.
MS - iontový zdroj a ionizační technika Zdroj pro APCI a ESI je prakticky konstrukčně shodný, liší se v přítomnosti jehly pro koronový výboj (APCI). Existují i kombinované zdroje ESI/APCI. U sprayových ionozací vždy záleží na povaze analytu – nutno zvolit pozitivní nebo negativní mód APCI – první komerční využití – 1986 oproti ESI lze použít vyšší průtok mobilní fáze, vyšší teplota, vyšší stupeň fragmentace ESI – první komerční využití – 1988 2002 – Nobelova cena za chemii: John Bennett Fenn Kompatibilní pouze s LC s reverzním uspořádáním fází (polární mobilní fáze), tvorba vícenásobně nabitých iontů, ionizace z roztoku, lze analyzovat i soli
MS - iontový zdroj a ionizační technika MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption) Roztok vzorku je smíchán s roztokem matrice (nízkomolekulární UV absorbující látka) na spotovací destičce. Ta je vložena do zdroje, kde dochází k tvorbě „pevné směsi“ matrice a vzorku. Účinkem energie dodané laserovým pulzem dochází k ionizaci aduktu matrice-vzorek a následně odtržení matrice. Ionty analytu jsou měřeny obvykle TOF analyzátorem.
Příklad matrice: 2,5-dihydroxybenzoová kyselina, laser 337 nm. Vzorek µM roztok, matrice 100 mM roztok Tvorba obvykle jednonásobně nabitých iontů (M+H)+, (M+K)+, (M+Na)+ Spotovací destička
Zdroj:Agilent Technologies
Zdroj:Agilent Technologies
MS - separátory iontů lineární kvadrupol konstrukčně se jedná o 4 kovové tyče hyperbolického nebo kruhového průřezu, které jsou připojeny ke zdrojům DC a AC napětí. Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, se dostanou do střídavého elektrického pole a začnou oscilovat.
Při vhodném poměru DC a AC složky napětí a dané hodnotě těchto napětí projdou kvadrupolem pouze ionty o určitém poměru m/z. Zařízení se chová jako filtr nastavený na určitou hodnotu m/z. Změnou vkládaných napětí je možné nechat projít filtrem postupně ionty v celém rozsahu hodnot m/z
MS - separátory iontů Iontová past (ion trap) účinkem elektrického pole jsou ionty uzavřeny v ohraničeném prostoru. Iontová past se skládá ze vstupní a z výstupní elektrody kruhového průřezu a z prstencové středové elektrody. Krajní elektrody jsou uzemněny, na středovou elektrodu je vkládáno vysokofrekvenční napětí s proměnnou amplitudou.
Ionty jsou nuceny pohybovat se uvnitř iontové pasti po uzavřených kruhových drahách s rostoucí amplitudou napětí se ionty s rostoucím m/z dostávají na nestabilní trajektorie a opouštějí prostor iontové pasti směrem do detektoru
MS - separátory iontů Průletový analyzátor (time of flight TOF) je tvořen prázdnou trubicí. K časovému rozdělení iontů podle m/z dochází na základě jejich odlišné doby letu z iontového zdroje do detektoru. Nutná konstatantní stabilní teplota - st
Hmotnější ionty se pohybují nižší rychlostí než ionty lehčí a dorazí do detektoru později. Dosažené rozlišení závisí na délce dráhy, kterou ionty v průletovém analyzátoru urazí.
MS - separátory iontů Magnetický - sektorový hmotnostní analyzátor umožňuje prostorové rozdělení svazku iontů podle hodnoty m/z, konstrukčně se jedná o elektromagnet, mezi jehož pólovými nástavci prochází fokusovaný paprsek iontů z elektrického pole
B
m/ z =
B.r 2 2.V
r
V
ionty o rozdílném poměru m/z opisují dráhy o různých poloměrech dochází k prostorové disperzi iontů podle jejich hmotnosti
ORBITRAP
MS - separátory iontů
Svazek iontů je v C-trapu zbržděn kolizí s molekulami dusíku, stlačen a vystřelen do Orbitrapu. Na jeho centrální elektrodě se postupně zvyšuje napětí a ionty se začínají spirálově pohybovat – generují proudový signál, který je pomocí Fourierovy tranformace převeden na MS spektrum
Octapole
Osa z
elektroda
ωz ~
konst. m/ z
MS - detektor iontů detektor zařízení, které detekuje ionty separované hmotnostním separátorem Elektronový násobič konverzní dynóda umožňuje konvertovat ionty na sekundární elektrony a ty dále lavinovým jevem, v tzv. channeltronu tvaru rohu, emitují další elektrony. Měří se vzniklý proud. Elektronásobič je citlivý na přetížení.
Fotonásobič konverzní dynóda umožňuje konvertovat ionty na sekundární elektrony. Tyto elektrony při interakci s fosforem emitují fotony. Fotonový signál je zesílen ve fotonásobiči. Fotonásobič je zataven ve skle a je tak velmi rezistentní vůči poškození.
MS - vakuum EI+ 70 eV, CI, MALDI – vakuum i ve zdroji spektrometru, všechny spektrometry vakuum v analyzátoru: aby byla zachována dlouhá dráha letu nabitých částic (mohly být detekovány) Spektrometry mají vždy dvoustupňový systém vakua 1. Stupeň vakua rotační olejové vývěvy – vakuum cca 10-2 mBar – slouží pro provoz pump 2. stupně vakua
MS - vakuum 2. Stupeň vakua cca 10-5 až 10-8 mBar (1 mBar = cca 100 Pa) turbomolekulární pumpa
difuzní olejová pumpa
MS - způsob vnosu vzorku EI+ 70 eV: GC/MS – kapilární GC kolona (split, splitless, PTV inlet) evakuvatelný reservoar se septem kapilárou napojený do iontového zdroje sonda přímého vstupu (Direct insertion Probe - DIP) – vzorek je v mikrovialce v držáku vyhřívané sondy zaveden přímo do iontového zdroje přes vacuum lock
ESI, APCI: LC/MS – mobilní fáze je pumpou čerpána přes LC kolonu a (popř. přes celu UV detektoru) kapilárou do zdroje (v případě potřeby se průtok před vstupem do MS splituje) Direct Infusion (DI) - přímý nástřik robotickou stříkačkou (mechanický posuv pístu) kapilárou do zdroje Flow Injection Analysis (FIA) nástřik přes vebtil do proudu mobilní fáze čerpané pumpou LC chromatografu kapilárou do zdroje
Hmotnostní spektrometr Přenosný GC-MS HAPSITE (firma Inficon, Inc. U.S.A)
Nasazení v Afganistánu (britské jednotky)
Hmotnostní spektrometr Sektorový hmotnostní spektrometr
Hmotnostní spektrometr Kvadrupolový hmotnostní spektrometr s GC chromatografem
Hmotnostní spektrometr IT-ORBITRAP hybridní MS spektrometr
