HIV-1 superinfectie: detectie en frequentie van voorkomen
Laura Hebberecht
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Chris Verhofstede Begeleidster: Dr. Virginie Mortier Vakgroep Klinische biologie, Microbiologie en Immunologie
Academiejaar 2013-2014
HIV-1 superinfectie: detectie en frequentie van voorkomen
Laura Hebberecht
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Chris Verhofstede Begeleidster: Dr. Virginie Mortier Vakgroep Klinische biologie, Microbiologie en Immunologie
Academiejaar 2013-2014
Toelating tot bruikleen
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum
Laura Hebberecht
Prof. Dr. Chris Verhofstede
Voorwoord Tijdens het praktisch werk en het schrijven van mijn masterproef, heb ik enorm veel hulp en steun gehad. Daarom zou ik graag volgende mensen willen bedanken. Eerst en vooral wil ik mijn promotor Prof. Dr. Chris Verhofstede bedanken, die tevens een uitstekende begeleidster was tijdens het hele proces. Ik kreeg de kans om samen met u en de andere collega’s in 1 bureau te werken, wat zeker niet vanzelfsprekend is en het werk voor mij gemakkelijker maakte. U stond ook altijd klaar om mijn vragen te beantwoorden en onderdelen van mijn masterproef te bespreken en te verbeteren. Als tweede zou ik mijn begeleidster Dr. Virginie Mortier willen bedanken voor de hulp bij de fylogenetische analyse van mijn resultaten, het beantwoorden van al mijn vragen en de suggesties (verbetering) bij het schrijven van mijn masterproef. Ook Marlies Schauvliege, Delfien Staelens, Els Demecheleer, Kenny Dauwe en Leen Vancoillie verdienen een dankwoordje. Marlies en Delfien, van jullie heb ik het praktisch werk aangeleerd en samen met Els en Leen stonden jullie altijd klaar om mij te helpen in het labo of te antwoorden op mijn vragen. Kenny wil ik bedanken voor de uitvoering (samen met Delfien) van de deep sequencing en de uitleg errond. Leen, jij bent de specialist als het op computers en Microsoft Office aankomt en hebt mij vaak uit de nood geholpen, waarvoor ik je enorm bedank. Verder wil ik ook mijn medestudenten en goede vriendinnen Dacha, Malicorne en Elien bedanken voor de aangename lunch- en koffiepauzes en de steun. In het bijzonder wil ik ook mijn ouders en beste vrienden bedanken, omdat die er onvoorwaardelijk voor mij zijn. Jullie stonden altijd klaar als ik nood had aan steun of leuke ontspanningsmomenten. Allen hartelijk bedankt, Laura
INHOUDSTAFEL
SAMENVATTING .................................................................................................................. 1 ABSTRACT ............................................................................................................................. 2 1. INLEIDING ......................................................................................................................... 3 1.1. Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) .......................................................................... 3 1.1.1. Algemeen ....................................................................................................................... 3 1.1.2. Moleculaire mechanismen van een HIV-1 infectie ........................................................ 4 1.1.3. Recombinatie .................................................................................................................. 6 1.1.4. Pathogenese .................................................................................................................... 7 1.2. HIV-1 superinfectie ......................................................................................................... 10 1.2.1. Frequentie van voorkomen ........................................................................................... 11 1.2.2. Invloed op het ziekteproces .......................................................................................... 12 1.2.3. Methodologie voor de detectie van superinfectie......................................................... 13 1.2.4. Probleemstelling ........................................................................................................... 15 1.3. Doelstelling ..................................................................................................................... 15 2. MATERIAAL EN METHODEN....................................................................................... 16 2.1. Omschrijving van de testgroep ........................................................................................ 16 2.2. Analyse van de PR-RT sequentie .................................................................................... 16 2.3. Analyse van de virale ladingen ....................................................................................... 17 2.4. Bepaling en analyse van de V3 sequentie via Sanger sequencing .................................. 17 2.4.1. Sequentieanalyse V3 .................................................................................................... 17 2.4.2. Dataverwerking en analyse .......................................................................................... 21 2.5. Deep sequencing ............................................................................................................. 22 3. RESULTATEN .................................................................................................................. 27 3.1. Analyse van de PR-RT sequentie .................................................................................... 27 3.2. Analyse van de virale ladingen ....................................................................................... 27
3.3. V3 sequentieanalyse ........................................................................................................ 28 3.4. Datapooling ..................................................................................................................... 29 3.5. Deep sequencing analyse................................................................................................. 31 3.5.1. Fylogenie ...................................................................................................................... 31 3.6. Reflectie naar de gebruikte methodologie ....................................................................... 35 4. BESPREKING ................................................................................................................... 36 5. ALGEMEEN BESLUIT .................................................................................................... 43 6. REFERENTIELIJST .......................................................................................................... 44
SAMENVATTING HIV-1 superinfectie kan optreden wanneer een met HIV-1 geïnfecteerde patiënt opnieuw geïnfecteerd wordt met het virus. De frequentie van voorkomen van HIV-1 superinfectie is niet gekend en zal verschillen naargelang het risicogedrag van de patiënten die worden onderzocht. Ook over de invloed van superinfectie op het ziekteproces is nog weinig geweten. Eén van de obstakels voor de studie van superinfectie is het gebrek aan goede methoden om superinfectie aan te tonen. Het doel van dit werk was dan ook een goede methodologie op punt te zetten om superinfectie op te sporen in grotere patiëntenpopulaties. Op basis van een literatuurstudie werden 3 methoden geselecteerd voor het bepalen van mogelijke HIV-1 superinfectie in een geselecteerde groep van 99 patiënten. Er werd gekeken naar het aantal nucleotide mengsels in de protease en reverse transcriptase sequentie van het eerste bloedstaal, er werd onderzocht naar plotse stijgingen in virale lading tussen opeenvolgende stalen en verschillen in de V3 sequentie tussen 2 opeenvolgende stalen van eenzelfde patiënt werden bepaald. Tijdens de V3 sequentieanalyse werd er tevens nagegaan of de virussen een co-receptor tropisme switch ondergaan hadden. Na het toekennen van scores aan alle patiënten op basis van deze analyses, werden 20 patiënten met een vermoeden van superinfectie geselecteerd voor deep sequencing van de V3 regio in het virale enveloppe gen. De resulterende sequenties werden vervolgens geanalyseerd op variabiliteit via de constructie van een fylogenetische boom en de berekening van distance matrices. Op deze manier werden 5 patiënten geselecteerd die met grote waarschijnlijkheid HIV-1 gesuperinfecteerd zijn. De resulterende frequentie van 5,1% (5 van de 99 onderzochte patiënten) ligt binnen de marges van wat andere onderzoekers reeds documenteerden en bewijst nogmaals dat HIV-1 superinfectie geen zeldzaam fenomeen is. Door de gebruikte methodologie en de beperkingen ervan is deze waarde hoogstwaarschijnlijk een onderschatting van de werkelijke frequentie. Na evaluatie van de gebruikte methoden blijkt dat enkel via deep sequencing duidelijke gevallen van superinfectie kunnen aangetoond worden. Ideaal zou zijn om via longitudinaal onderzoek binnen een grote patiëntenpopulatie, door middel van deep sequencing, het volledige HIV-1 genoom te analyseren. Dit is momenteel echter moeilijk realiseerbaar wegens de hoge kost. Toch zijn verdere studies, met als doel inzicht te krijgen in het mechanisme en de effecten van superinfectie en meer accurate cijfers over de frequentie van voorkomen van superinfectie te verkrijgen, vereist.
1
ABSTRACT Background. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) superinfection occurs when an HIV-1 infected individual gets infected for the second time, with another HIV-1 variant. The worldwide frequency of HIV-1 superinfection remains unknown partly because of the lack of adequate tools for its detection. Methods. A selection of possible HIV-1 superinfected patients was made, based on 3 different methods described in literature. The genetic variability of the viral variants in the plasma of the selected patients was then analysed using deep sequencing of the V3 gene fragment. Variability was assessed by calculation of distance matrices and construction of phylogenetic trees. Results. From a total of 99 patients, 20 were selected for deep sequencing based on 3 selection criteria (the amount of degenerate base codes in the protease and reverse transcriptase sequence, a sudden rise in viral load and the amount of V3 nucleotide differences between 2 consecutive samples from the same patient). For 5 of those 20 patients there were indications that the virus variability was higher than expected from normal evolution, indicating superinfection. With these 5 confirmed superinfections, the frequency of superinfection in our initial patient population is at least 5,1%. Conclusions. The frequency of HIV-1 superinfection found in the studied population is inline with the results of other investigations on HIV-1 superinfection and confirms the hypothesis that superinfection is not an uncommon event. After evaluation of the used methods, deep sequencing turned out to be the only reliable method for the detection of HIV1 superinfection.
2
1. INLEIDING 1.1. Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) 1.1.1. Algemeen Het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) is een lentivirus dat behoort tot de familie van de retrovirussen (Retroviridae) en verantwoordelijk is voor het Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). Er kunnen 2 types HIV onderscheiden worden met name HIV-1 en HIV-2. HIV-1 is het meest algemeen verspreid. HIV-2 is vooral endemisch in West-Afrika en is minder pathogeen dan HIV-1 (1, 2). Transmissie van HIV-1 kan plaatsvinden via de injectie of transfusie van besmet bloed, het gebruik van niet gesteriliseerde injectienaalden, onbeschermd seksueel contact of van moeder op kind. Heteroseksuele transmissie is wereldwijd nog steeds de voornaamste route van overdracht maar intraveneuze druggebruikers, homoseksuele mannen (MSM = men who have sex with men) en individuen die in de seksindustrie werken hebben een verhoogd risico op besmetting met HIV-1 (2, 3). HIV-1 omvat 4 verschillende groepen zijnde M (major), N (non-M en non-O), O (outlying) en P. Groep M wordt nog onderverdeeld in 9 verschillende subtypes (A, B, C, D, F, G, H, J en K), waarvan subtype B het meest verspreid is in West Europa en de Verenigde Staten en het vaakst bestudeerd is (1, 4). De verschillende subtypes kunnen genetisch tot 30% van elkaar verschillen (5, 6). Het is de M groep van HIV-1 die grotendeels verantwoordelijk is voor de HIV pandemie wereldwijd. Er zouden naar schatting zo een 34 miljoen mensen met HIV leven, waarvan er jaarlijks ongeveer 1,7 miljoen sterven ten gevolge van AIDS. De incidentie van HIV infectie blijft dan ook zeer hoog, met zo’n 2,5 miljoen gevallen per jaar (7). Dankzij de beschikbare antiretrovirale middelen die gecombineerd worden in behandelingscocktails (combined Antiretroviral Treatment, cART) daalt de morbiditeit en mortaliteit langzaam. Genezing is echter nog altijd niet mogelijk en er zijn ook geen aanwijzingen dat er in de eerstvolgende jaren een geschikt vaccin zal zijn. De problematiek betreffende HIV is dus nog steeds aanzienlijk met als gevolg dat onderzoek in dit domein zeer belangrijk is (4).
3
1.1.2. Moleculaire mechanismen van een HIV-1 infectie Het circa 9 kb lange genoom van HIV-1 bestaat uit 2 identieke kopijen enkelstrengig RNA die opgebouwd zijn uit 3 belangrijke structurele genen (Figuur 1) :
Figuur 1. Organisatie van het HIV-1 genoom (8)
•
Gag codeert voor 4 structurele proteïnen p24, p7, p6 en p17 waarvan de eerste 3 de core opbouwen en de laatste bijdraagt tot de structuur van de matrix (9).
•
Pol codeert enerzijds voor het protease (p10), een enzym dat instaat voor het knippen van de gag en gag-pol precursor in hun afzonderlijke functionele proteïnen. Anderzijds codeert dit gen voor 2 enzymen die een belangrijke rol spelen in de virale replicatie. Het reverse transcriptase (p66/p51), dat het virale RNA naar DNA omzet en het integrase (p32) dat instaat voor de integratie van het provirale DNA in het gastheer genoom (2, 9).
•
Env codeert voor 2 enveloppe eiwitten: het oppervlakte glycoproteïne gp120 dat instaat voor de herkenning en binding van cellulaire oppervlakte receptoren en het transmembrane glycoproteïne gp41 dat een rol speelt in de fusie van het virus met de celmembraan en het binnendringen van de gastheercel (2, 9).
Naast deze 3 genen beschikt het HIV genoom over 6 accessoire genen (Tat, Rev, Nef, Vif, Vpr en Vpu) die voornamelijk een regulatorische rol uitoefenen bij de virusreplicatie (9). Het viruspartikel zelf (Figuur 2) heeft een diameter van slechts 100 nm en is opgebouwd uit een membraan van lipoproteïnen met daartussen heterodimere complexen van gp120/gp41 en soms bijkomende eiwitten afkomstig van de gastheercel. De daaronder gelegen matrix is verankerd aan dit lipoproteïne membraan en omringt het capside, dat op zijn beurt de 2 RNA moleculen omsluit en samengesteld is uit p24 polymeren. Het virale genoom wordt vergezeld van nucleoproteïnen, het integrase en het reverse transcriptase (9, 10).
4
Figuur 2. Structuur van het HIV-1 partikel (10)
De replicatie cyclus van HIV-1 kan opgedeeld worden in verschillende stappen (Figuur 3). 1. Binding en entry: het uit gp120 en gp41 bestaande enveloppe complex is essentieel voor de herkenning en het binnendringen van de gastheercel (CD4+ T-cel in figuur 3). Naast binding van gp120 met het CD4 glycoproteïne, zal gp120 eveneens binden aan een chemokine coreceptor. Deze dubbele binding zorgt voor extra stabilisatie bij de aanhechting van het virus aan de gastheercel en triggert conformationele veranderingen waardoor gp41 de fusie met de celmembraan kan verwezenlijken en de gastheercel kan penetreren (3, 4, 9). De meerderheid van de virussen gebruikt co-receptor CCR5 op de gastheercel om zich aan te hechten en worden daarom R5 virussen genoemd. X4 virussen verkiezen daarentegen de CXCR4 co-receptor om hun entry in de cel mogelijk te maken. Daarnaast zijn ook R5X4 virussen gekend, die op beide co-receptors kunnen binden. Deze co-receptors zijn een grote determinant voor het HIV tropisme, dat de groei en evolutie van het virus beïnvloedt (9, 11). 2. Uncoating: de RNA moleculen binnenin het viruspartikel worden als het ware ontmanteld en komen terecht in het cytoplasma van de cel (4, 9). 3. Transcriptie: het virale RNA wordt door middel van het reverse transcriptase omgezet naar dubbelstrengig DNA (4, 9).
5
4. Integratie: het integrase zorgt voor de integratie van het dubbelstrengig DNA in het gastheer genoom (4, 9). 5. Proteïne synthese en assemblage: na transcriptie van het virale DNA in messenger RNA, kunnen de structurele proteïnen via translatie in het cytoplasma gesynthetiseerd en nadien geassembleerd worden (4, 9). 6. Budding: de assemblage van de structurele proteïnen in immature virions vindt plaats dichtbij de celmembraan van de gastheer, waarna de nieuwe infectieuze partikels vrijgelaten kunnen worden via vesiculaire budding (afsnoering) (3).
Figuur 3. HIV-1 replicatie cyclus (9)
1.1.3. Recombinatie HIV is een genetisch zeer variabel virus. Deze hoge mate van variabiliteit is het gevolg van een hoge replicatie, die kan oplopen tot de productie van meer dan 1010 viruspartikels per dag (3), en een slecht werkend reverse transcriptase dat veel fouten maakt en bovendien geen proofreading activiteit heeft. Wanneer eenzelfde cel door 2 verschillende HIV virussen geïnfecteerd wordt, kan recombinatie optreden wat de variabiliteit nog extra verhoogd (1214). Na integratie van het genetisch materiaal van beide virussen in het gastheergenoom, kunnen heterozygote virussen ontstaan die 1 RNA streng van de ene variant en 1 RNA streng van de andere variant bevatten. Wanneer deze heterozygote virussen een cel infecteren, kan het reverse transcriptase van de ene op de andere streng overspringen en zo gecombineerde DNA strengen aanmaken, die stukjes sequenties bevatten van beide virussen (15). Dit
6
fenomeen wordt ook wel het “copy choice model” of template switching genoemd en zou zich gemiddeld 2,8 keer per replicatiecyclus voordoen (16) (Figuur 4).
Figuur 4. Copy choice model of template switching (12)
Na integratie in het gastheergenoom en replicatie kunnen vervolgens recombinante virussen geproduceerd worden (12). Dit is een mechanisme dat ervoor zorgt dat virussen op een snelle manier de diversiteit van hun virale sequenties kunnen verhogen, in tegenstelling tot de trage accumulatie bij mutatievorming. Ook kan dit bijdragen tot het ontstaan van meer virulente of drug resistente virussen (13, 14). Recombinatie tussen virussen van verschillende HIV-1 subtypes worden het makkelijkst herkend. Dergelijke recombinante virussen die delen van 2 of meer verschillende subtypes bevatten, kunnen worden doorgegeven (circulating recombinant forms, CRFs) of slechts bij 1 patiënt worden teruggevonden (unique recombinant forms, URFs). Momenteel zijn er al meer dan 58 circulerende recombinante vormen (CRFs) geïdentificeerd en ze staan in voor meer dan 20% van alle HIV infecties wereldwijd (17). Deze CRFs krijgen ook allen een nummer toegewezen. Zo zijn CRF01 en CRF02 ontstaan door recombinatie van respectievelijk subtype A en E en subtype A en G (3). Het isoleren van recombinante virussen leverde ook het eerste bewijs voor het bestaan van co-infectie en superinfectie (18, 19). 1.1.4. Pathogenese HIV-1 zal voornamelijk dendritische cellen, macrofagen en geactiveerde CD4+ T-cellen infecteren. Deze cellen transporteren de virussen vervolgens naar de lymfeknopen en andere cellen van het immuunsysteem om zo in de bloedbaan terecht te komen, alsook naar de vaginale of anorectale mucosa. Na infectie zullen deze cellen ofwel lyseren ofwel latent geïnfecteerd blijven. Dit laatste vindt vooral plaats in macrofagen en rustende CD4+ T-cellen en is ook de reden waarom een HIV-1 infectie niet volledig geklaard kan worden (9, 20). Na besmetting met HIV-1 duurt het ongeveer 10 tot 12 dagen eer het virus gedetecteerd kan worden in het bloed via amplificatie van het virale RNA. Dit is een belangrijk tijdstip aangezien vanaf dan transmissie mogelijk wordt en ook de diagnose uit een bloedstaal kan 7
gesteld worden. De periode waarin antilichamen nog ondetecteerbaar zijn, wordt de window periode genoemd en deze kan sterk verschillen tussen individuen. Tijdens de seroconversie, die meestal 3 tot 5 weken na de infectie plaatsvindt, kan de virale lading stijgen tot zo’n 100 miljoen RNA kopijen/ml (9). Vanaf dan kan de HIV-1 infectie ook gediagnosticeerd worden op basis van de detectie van antilichamen (3). Het aantal viruspartikels zal nadien sterk dalen omwille van de humorale en cellulaire immuunrespons van de gastheer. Daaropvolgend wordt een viraal setpoint bereikt dat individueel verschilt. De cytotoxische CD8+ T-cellen zouden hierbij als eerste een belangrijke rol spelen, gevolgd door het opkomen van neutraliserende antilichamen (9, 20, 21). Neutralisatie gebeurt rechtstreeks via binding aan de HIV-1 antigenen en voorkomt zo infectie of promoot hiermee de eliminatie van geïnfecteerde cellen. Slechts een minderheid van de neutraliserende antilichamen kan meerdere virusvarianten gaan neutraliseren en beschikt dus over een brede activiteit (20). De karakteristieken van een HIVinfectie en de progressie tot AIDS worden in de samenvattende Figuur 5 nog eens weergegeven.
Figuur 5. Het verloop van een acute HIV-1 infectie tot aan het AIDS stadium (3)
8
De meerderheid van de individuen (40-90%) ontwikkelen enkele dagen tot weken na de blootstelling aan HIV-1 een antiretroviraal syndroom. Dit fenomeen is het gevolg van een sterke daling in het aantal CD4+ T-cellen en wordt gekenmerkt door griepachtige symptomen als o.a. koorts, hoofdpijn, spierpijn en vermoeidheid, die gemiddeld 7 tot 14 dagen aanhouden (9, 20, 21). De progressie van de ziekte wordt gekarakteriseerd door een verlies aan CD4+ T-cellen en de destructie van lymfoïd weefsel. Geheugen CD4+ T-cellen zijn namelijk de eerste doelwitten van HIV-1 en langdurige ART kan het reservoir van deze cellen slechts gedeeltelijk herstellen (20). Wanneer de gastheer bovendien de virale replicatie niet langer kan bedwingen, kan het CD4+ T-cel aantal tot lager dan 200 cellen/µl zakken en wordt het risico op opportunistische infecties daarmee verhoogd (9, 21). De meest voorkomende en levensbedreigende onder hen, die mede het AIDS stadium definiëren, zijn Microcystis carinii, Candida albicans, cytomegalovirus, Herpes zoster of enteropathische parasieten (9). Het AIDS stadium wordt dus gekenmerkt door een verdere daling van het CD4+ T-cel aantal en is frequent geassocieerd met anemie (bloedarmoede) en lymfopenie (abnormaal laag aantal lymfocyten in het bloed) (9, 20). De gemiddelde tijd tussen de HIV-1 infectie en dood als gevolg van het AIDS stadium is 11 jaar, weliswaar in afwezigheid van behandeling. Maar ook daar heerst er een grote individuele variatie die, op basis van klinische evaluaties, geleid heeft tot de classificatie van HIV-1 geïnfecteerde individuen in slow progressors, non-progressors, rapid progressors en long term non-progressors. Zowel de eigenschappen van de infecterende virussen als de immuunrespons van de gastheer zullen de pathogenese van de infectie en de progressie tot het AIDS stadium beïnvloeden (9). Bij patiënten met duidelijke klinische symptomen van immuundeficiëntie of met een CD4+ Tcel aantal van lager dan 200 cellen/µl wordt uiteraard onmiddellijk cART opgestart. Momenteel is er een tendens om steeds vroeger therapie op te starten, zelfs direct na de diagnose. Dit kan doordat de huidige cART minder toxisch is en wetenschappelijke studies aangetoond hebben dat het snel opstarten van medicatie niet alleen gunstig kan zijn voor de patiënt (beter behoud van het immuunsysteem en lagere virusvariabiliteit) maar ook het risico op transmissie van het virus verminderd (3).
9
1.2. HIV-1 superinfectie Wanneer een individu geïnfecteerd wordt met 2 verschillende HIV varianten, wordt dit een tweevoudige infectie genoemd. Men kan hierbij onderscheid maken tussen superinfectie en co-infectie. Superinfectie kan omschreven worden als de her-infectie van een reeds geïnfecteerde persoon, na de ontwikkeling van een immuunrespons als gevolg van de primaire infectie. Wanneer de tweede infectie gebeurt vóór de immuunrespons zich heeft ontwikkeld, gelijktijdig met of kort na de eerste infectie en voor de seroconversie, spreekt men van coinfectie (22). Het diagnosticeren van HIV-1 superinfectie is zeer moeilijk. De timing van staalafname is hierbij cruciaal. Superinfectie is namelijk vaak slechts voor een korte periode detecteerbaar omdat één van beide virussen óf een recombinant virus de andere varianten snel kan overgroeien. Als gevolg kan een viruspopulatie verschillende patronen aannemen. De originele viruspopulatie kan op de voorgrond blijven, maar deze kan ook uitgeroeid worden door opkomst en proliferatie van de nieuwe gesuperinfecteerde viruspopulatie. Beide virusstammen kunnen ook tegelijk circuleren of het is mogelijk dat een recombinant de overhand neemt (Figuur 6) (23, 24).
Figuur 6. De mogelijke viruspopulaties na HIV-1 superinfectie (24)
De 2 virusvarianten moeten bovendien genetisch voldoende verschillen om ze van elkaar te kunnen onderscheiden en beide moeten in voldoende hoge aantallen aanwezig zijn om gedetecteerd te kunnen worden met behulp van de klassieke methode voor sequenering, de Sanger methode (25). 10
Door het ontbreken van geschikte methoden om superinfectie te detecteren bij grote patiëntengroepen heeft men momenteel slechts beperkte informatie over de frequentie van voorkomen van HIV-1 superinfectie. 1.2.1. Frequentie van voorkomen De eerste patiënt met HIV-1 superinfectie werd pas in 2002 gedocumenteerd. Sindsdien worden regelmatig gevallen van superinfectie beschreven (Figuur 7), zowel met virussen van hetzelfde subtype als met virussen van verschillende subtypes (25). Dit levert dan ook het bewijs voor het gebrek aan verworven immuniteit na de eerste infectie met HIV-1 (26).
Figuur 7. Aantal gevallen van HIV-superinfectie die wereldwijd gedocumenteerd zijn (23) In alle landen die wit gekleurd zijn, is er nog geen onderzoek naar HIV-superinfectie uitgevoerd. MSM = men who have sex with men; IDU = injecting drug users; HS = heterosexual; FSW = female sex workers (23).
Ook mensen met drievoudige infecties zijn beschreven (25). Door het ontbreken van een goede methodologie om superinfectie aan te tonen, is de werkelijke prevalentie van HIV-1 superinfectie echter nog onbekend en de cijfers die in de literatuur worden gegeven zijn meestal schattingen. De meeste studies zijn bovendien uitgevoerd op een beperkt aantal patiënten. De frequentie van HIV-1 superinfectie varieert binnen de literatuur van 0 tot 20% (27) en er zijn zelfs onderzoekers die beweren dat de frequentie ervan dezelfde is als die van een primaire HIV-1 infectie binnen een bepaalde populatie (28). Als dit laatste het geval zou zijn, wil dit zeggen dat de immuunrespons die opgewekt wordt bij een initiële HIV-1 infectie geen 11
invloed heeft bij een tweede infectie (29). Intrasubtype HIV-1 superinfectie zou wel frequenter voorkomen dan intersubtype HIV-1 superinfectie als gevolg van het feit dat meestal 1 bepaald subtype overheerst in een geografische regio, niettegenstaande intersubtype HIV-1 superinfectie gemakkelijker te detecteren is (30). Anderzijds zou men verwachten dat de initiële immuunrespons meer beschermend is tegen superinfectie met een dichter gerelateerde variant van hetzelfde subtype (31). Er zijn verschillende factoren die de frequentie van HIV-1 superinfectie beïnvloeden. Eerst en vooral de testgroep waarop men het onderzoek uitvoert en de grootte ervan. Patiënten die reeds een hoger risico hebben op HIV-1 besmetting zullen logischerwijs ook een hogere kans hebben op HIV-1 superinfectie i.t.t. laag-risico groepen. De geografische locatie waarin het onderzoek wordt uitgevoerd, met een al dan niet hoge HIV-1 prevalentie, zal dus ook een invloed hebben op de frequentie van superinfectie (17, 22). De frequentie van cART gebruik zal eveneens een invloed hebben want bij patiënten die succesvol worden behandeld zal het risico op een superinfectie veel kleiner zijn (17, 32). Andere noemenswaardige factoren zijn de tijd en frequentie van staalafname en de lengte van follow-up. Hetgeen de resultaten echter het meest zal beïnvloeden is de gebruikte methodologie om HIV-1 superinfectie te detecteren (25, 33). 1.2.2. Invloed op het ziekteproces Er zijn sterke aanwijzingen dat HIV-1 superinfectie de ziekteprogressie kan doen versnellen. HIV-1 superinfectie wordt namelijk vaak geassocieerd met een stijging in virale lading, een tekort aan neutraliserende antilichamen (22), een daling van het CD4+ T-cel aantal en als gevolg een snellere progressie tot het AIDS stadium. Ook kan de aanwezigheid van meerdere en bovendien drug resistente viruspopulaties het succes van HAART beïnvloeden (17). Toch bestaat er twijfel of HIV-1 superinfectie rechtstreeks leidt tot versnelling van de ziekteprogressie of dat patiënten met een reeds snellere ziekteprogressie gewoon meer vatbaar zijn voor een tweede infectie (34). Andere onderzoekers beweren dan weer dat enkel superinfectie met een “fitter” virus invloed zou hebben op het ziekteproces. Verschillende factoren met betrekking op het virus en de gastheer kunnen de effecten van superinfectie beïnvloeden, maar verder onderzoek is vereist om deze te achterhalen (23).
12
1.2.3. Methodologie voor de detectie van superinfectie In de eerste studies die gedaan werden naar HIV superinfectie werd ELISA gebruikt (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) als detectiemethode. ELISA is gebaseerd op de interactie tussen antigenen en antilichamen. Met deze techniek kan men een onderscheid maken tussen infectie met HIV-1 en HIV-2 en, binnen HIV-1, infectie met groep M virussen en infectie met groep O virussen (22, 23). Daarnaast werd ook restriction fragment length polymorphism (RFLP) beschreven als methode voor de detectie van HIV superinfectie. Bij deze techniek worden PCR producten door middel van restrictie-enzymen in fragmenten geknipt, die na gelelektroforese waargenomen kunnen worden als typische restrictieprofielen. Wanneer deze overeenstemmen met restrictiepatronen van bepaalde referentiesequenties, zullen er geen verschillende HIV populaties binnen dit staal aanwezig zijn. Bij recombinante virussen of een twee –of meervoudige infectie zullen er verschillende patronen waargenomen kunnen worden. Superinfectie moet dan bij deze stalen bevestigd worden door clonering, sequenering en fylogenetische analyse. Het nadeel van deze methode is echter dat enkel intersubtype superinfecties opgespoord kunnen worden (35, 36). Uit studies is gebleken dat bij patiënten met HIV-1 superinfectie een plotse stijging in virale lading kan waargenomen worden (Figuur 8). Dit werd dan ook in een aantal onderzoeken als methode toegepast voor het screenen van HIV-geïnfecteerde patiënten op superinfectie (22, 25, 37, 38). Figuur 8. Verloop van de virale lading tijdens de verschillende fasen van HIV infectie (22) Als een persoon geïnfecteerd wordt met HIV, wordt er plots een hoge virale lading waargenomen in het plasma van die patiënt. Naarmate de tijd vordert, komt de patiënt in een chronische fase terecht. Wanneer de patiënt gesuperinfecteerd wordt, kan zich opnieuw een plotse stijging van de virale lading voordoen. In het geval van co-infectie zal deze 2e stijging meestal onopgemerkt blijven aangezien hier de tweede infectie nog voor de immuunrespons van de primaire infectie plaatsvindt (22).
13
Sequenering is hierbij uiteraard nodig om de gevallen waarvan superinfectie vermoed wordt, op basis van de virale lading, te bevestigen. Een stijging in virale lading kan namelijk ook andere oorzaken hebben (23). Naarmate er meer onderzoek gevoerd werd naar HIV-1 superinfectie, kwamen nieuwe technieken op de voorgrond voor de detectie ervan (23). De Heteroduplex Mobility Assay (HMA) is daar één van. Deze relatief snelle en gevoelige methode is gebaseerd op het verschil in mobiliteit van heteroduplex DNA en homoduplex DNA, tijdens polyacrylamide geleketroforese. Een heteroduplex wordt gevormd wanneer er bepaalde nucleotiden mismatchen, al dan niet door insertie of deletie. Dit leidt tot het ontstaan van ‘bellen’ in de heteroduplex, waardoor de migratiesnelheid in de gel trager zal zijn dan bij een homoduplex. De resulterende patronen kunnen dan vergeleken worden met bepaalde referentie sequenties. HMA kan dus met hoge gevoeligheid intrasubtype superinfecties detecteren maar geeft vaak vals-positieve resultaten (lage specificiteit) (6, 28, 39, 40). Multiregion Hybridisation Assays (MHA) kunnen enkel intersubtype superinfecties detecteren en worden daardoor minder frequent gebruikt. Deze techniek maakt gebruik van real-time PCR (qPCR) voor de amplificatie van verschillende genfragmenten, met subtypespecifieke probes voor de detectie ervan (16, 22, 41). Een derde en tevens meest gebruikte methode om HIV-1 superinfectie op te sporen, valt onder de noemer “bulk viral sequence analysis”. Bij bulk sequencing worden 1 of meerdere delen van het HIV-1 genoom in bulk gesequeneerd om vervolgens te gaan kijken naar genetische variabiliteit in de virale populatie (13, 28). Zo gaat men ofwel door middel van fylogenie stalen van verschillende tijdstippen gaan bekijken ofwel gaat men in de sequenties gaan zoeken naar mengsels van nucleotiden, ook wel gedegenereerde basen genoemd (42). Aangezien deze methoden de aanwezigheid van HIV-1 superinfectie enkel kunnen voorspellen, is er steeds confirmatie nodig via single genome sequencing (24, 30) of clonale PCR, gevolgd door een fylogenetische analyse. Bij single genome sequencing worden er via limiting dilution individuele sequenties bekomen en geamplificeerd. Beide technieken zijn echter zeer duur en arbeidsintensief om op grote schaal te kunnen gebruiken (23). Het gebruik van bulk sequencing zoals bij Sanger sequencing heeft als nadeel dat varianten binnen de HIV populatie van eenzelfde patiënt met een frequentie van minder dan 15-25% niet gedetecteerd kunnen worden (43).
14
De nieuwe Next Generation Sequencing technologie biedt nieuwe mogelijkheden voor de detectie van HIV superinfectie. Met ultradeep sequencing (UDS) kunnen namelijk virussen gedetecteerd worden die slechts 1% van de populatie uitmaken. De resultaten zijn ook kwantitatief en geven een idee over de mate van voorkomen van de verschillende virusvarianten. Deze techniek werkt snel en biedt de mogelijkheid om meerdere stalen in 1 keer te sequeneren (24, 44, 45). Nadelen zijn de hoge kostprijs en arbeidsintensiviteit (23). 1.2.4. Probleemstelling Het fenomeen van superinfectie, samen met de hoge genetische diversiteit van HIV die er wereldwijd bestaat, plaatst vraagtekens bij de haalbaarheid van bescherming tegen HIV infectie door een vaccin. Het feit dat superinfectie bestaat, toont immers aan dat de immuniteit die ontwikkeld wordt na een primo-infectie niet volstaat om een nieuwe infectie met HIV te verhinderen (13, 14). Komt dit doordat de eerste immuunrespons te specifiek is? Bouwt het immuunsysteem geen geheugen op na de eerste infectie met HIV? Treedt superinfectie enkel op nadat het immuunsysteem al te sterk is aangetast door het virus? En wat zijn de klinische effecten van HIV-1 superinfectie? Dit zijn vragen die nog onbeantwoord blijven en waar verder onderzoek voor nodig is. Superinfectie zal de samenstelling van de viruspopulatie in een patiënt plots wijzigen en dit kan zich uiten in onverwachte stijgingen van de virale lading of plotse wijzigingen in de drug resistentie (wanneer her-infectie met een drug resistente stam optreedt). Hoe belangrijk dit is in de praktijk en of een systematische screening op superinfectie nuttig kan zijn, zal afhangen van de frequentie van voorkomen van superinfectie in de patiëntenpopulatie. 1.3. Doelstelling Het verkrijgen van informatie over de frequentie van voorkomen van superinfectie wordt bemoeilijkt door het ontbreken van goede technieken of criteria om superinfectie te identificeren. Het doel van dit onderzoek is om een goede methodologie op punt te zetten voor de screening op superinfectie en deze methodologie toe te passen op een geselecteerde groep van patiënten in opvolging in het Aids Referentie Centrum (ARC) van het Universitair Ziekenhuis (UZ) te Gent.
15
2. MATERIAAL EN METHODEN 2.1. Omschrijving van de testgroep De patiënten waarop dit onderzoek wordt uitgevoerd, zijn allen geïnfecteerd met HIV-1 en worden opgevolgd in het Aids Referentie Centrum (ARC) van het Universitair Ziekenhuis (UZ) te Gent. Voor de selectie van de patiënten en voor de eerste screening op mogelijke superinfectie werden resultaten gebruikt van testen uitgevoerd in het Aids Referentie Laboratorium (ARL) in het kader van de routineopvolging van HIV patiënten. De extra analyses (tropisme bepaling en deep sequencing) gebeurden op beschikbaar restmateriaal van deze testen. In totaal werden 99 patiënten geselecteerd op basis van volgende criteria: -
Infectie met het subtype B van HIV-1
-
In opvolging in het ARL/ARC
-
Beschikbaarheid van de sequentieanalyse van het protease en reverse transcriptase (PR-RT) gen, bepaald op het eerste bloedstaal van de patiënt in het kader van de opsporing van baseline drug resistentie
-
Beschikbaarheid van regelmatige (minstens 2) bepalingen van de virale lading
-
Beschikbaarheid van 2 plasmastalen, afgenomen met een tijdsinterval van minstens 6 maanden vóór het starten van therapie
Alle stalen werden geanonimiseerd en de studie werd goedgekeurd door het Ethisch Comité van het ziekenhuis (2014/0173). 2.2. Analyse van de PR-RT sequentie Visualisatie van de PR-RT sequenties gebeurde door middel van chromatogrammen in de Smartgene databank (46) (Figuur 9). Indien de frequentie van het meest voorkomende nucleotide op een bepaalde positie in het gen fragment, zich boven een drempel bevindt (typisch rond 80%), dan zal de Sanger methode dit meest voorkomende nucleotide op die bepaalde plaats in het chromatogram zetten. Wanneer er verschillende nucleotiden op 1 bepaalde plaats voorkomen, en deze een frequentie hebben onder de drempelwaarde, zal dit in het chromatogram weergegeven worden als een mengsel van nucleotiden (25, 47). Men ziet dan ook 2 of meerdere pieken verschijnen i.p.v. 1 enkele piek (Figuur 9). Het totaal aantal nucleotidenmengsels in de PR-RT sequentie van elk van de 99 patiënten werd geteld. 16
Figuur 9. Chromatogram met omlijnde mengsels R (G of A), Y (T of C) en K (G of T)
2.3. Analyse van de virale ladingen Van de 99 geselecteerde patiënten werden de virale ladingen, bepaald vóór het opstarten van therapie, bekeken. Elke stijging in virale lading van minstens 0,50 log10 RNA kopijen/ml werd genoteerd. 2.4. Bepaling en analyse van de V3 sequentie via Sanger sequencing Van elke patiënt werden 2 verschillende stalen, afgenomen met een tijdsinterval van minstens 6 maanden en vóór de start van therapie, geselecteerd voor sequentieanalyse van het in het enveloppe gen gelegen V3 fragment. 2.4.1. Sequentieanalyse V3 2.4.1.1. RNA extractie Voor de extractie van viraal RNA uit plasma (afkomstig van EDTA bloed) werd gebruik gemaakt van de High Pure Viral RNA kitTM (Roche Applied Science, Vilvoorde, België). De RNA extractie start met 200 µl plasma om uiteindelijk 50 µl RNA extract over te houden. Daarvan wordt 10 µl gebruikt voor de reverse transcriptie en de eerste amplificatie. Deze 2 stappen gebeuren na elkaar, maar binnen hetzelfde PCR programma. 2.4.1.2. Reverse transcriptie en eerste amplificatie De RNA strengen worden eerst omgezet in cDNA door middel van reverse transcriptie zodat vervolgens de V3 regio van het enveloppe gen geamplificeerd kan worden. Er wordt gebruik gemaakt van de Titan OneTube RT-PCR System kitTM (Roche Applied Science, Vilvoorde, België). 17
Mastermix (per reactie): -
1,50 µl Aqua Dest (AD)
-
5 µl 5x Reverse Transcriptase (RT) buffer
-
0,20 µl deoxyriboNucleotide TriPhosphate (dNTPs) (25 mM)
-
1,25 µl DiThioThreïtol (DTT) oplossing
-
0,25 µl RNAsin
-
0,50 µl Enzyme mix
-
1,60 µl van elk van de 4 verschillende primers (Tabel 1)
Tabel 1. Primers voor de eerste amplificatie Primer (5 pmol/µl)
Sequentie (5’
3’)
Positie nucleotiden 6540 6560 7701 7721
GAG GAT ATA ATC AGT TTA TGG ENV_1 sense GGT GGG TGC TAT TCC TAA TGG 7294 anti-sense ENV_11 (aangepaste en GGA TAT AAT CAG YYT ATG GGA 6542 sense gedegenereerde ENV_1) ENV_22 (gedegenereerde GGT GGG TGC TAY TCC YAA ITG 7701 anti-sense 7294) IUPAC code: G = Guanine; A = Adenine; T = Tyrosine; C = Cytosine; I = Inosine; Y = C of T
6562 7721
Per staal wordt er 15 µl van deze mastermix gemengd met 10 µl van het geëxtraheerd RNA. Voor de positieve controle wordt er RNA extract gebruikt van een reeds positief geamplificeerd staal dat eerder werd geëxtraheerd en voor de negatieve controle wordt het geëxtraheerde RNA vervangen door AD. Voor een overzicht van het gebruikte PE9700 programma titan 2XL wordt er verwezen naar Tabel 2. Tabel 2. Titan 2XL PCR programma Stap
Temperatuur
Tijd
1 2 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 1
45°C 94°C 94°C 45°C 68°C 94°C 50°C 68°C 94°C 55°C 68°C 68°C 8°C
30' 2' 30" 30" 3' 30" 30" 4' 30" 30" 5' 7' blijvend
Aantal cycli
10x
10x
15x
18
2.4.1.3. Tweede amplificatie De tweede amplificatie is een nested PCR. Hierbij wordt het PCR product van de eerste amplificatie door middel van het Taq polymerase opnieuw geamplificeerd maar nu met primers die binnen het amplificatiegebied van de vorige primers liggen. Een nested PCR verhoogt de sensitiviteit en de specificiteit van de reacties. Mastermix (per reactie): -
28 µl AD
-
5 µl 10x PCR buffer
-
4 µl MgCl2
-
8 µl dNTPs (1,25 mM)
-
0,25 µl Taq polymerase
-
0,75 µl van elk van de 4 verschillende primers (Tabel 3)
Tabel 3. Primers voor de tweede amplificatie Primer (5 pmol/µl)
Sequentie (5’
3’)
Positie nucleotiden 6561 6580 7645 7667
GAT CAA AGC CTA AAG CCA TG ENV_2 sense ACT TCT CCA ATT GTC CCT CAT AT 7238 anti-sense ENV_33 (aangepaste en GAT CAA AGC CTA AAR CCA TGT 6561 6581 sense gedegenereerde ENV2) ENV_44 (aangepaste en CTC CAA TTG TCC YTC ATH TYT CC 7641 7663 anti-sense gedegenereerde 7238) IUPAC code: G = Guanine; A = Adenine; T = Tyrosine; C = Cytosine; Y = C of T; R = A of G; H = A, C of T
Per staal wordt 48 µl van deze mastermix gemengd met 2 µl van het PCR product dat verkregen werd na de eerste amplificatie. Voor een overzicht van het gebruikte PE9700 programma 10XL verwijzen we naar Tabel 4. Tabel 4. 10XL PCR programma Stap
Temperatuur
Tijd
1 1 2 3 1 1
94°C 94°C 50°C 72°C 72°C 8°C
1' 30" 30" 1' 30" 7' Blijvend
Aantal cycli
30 x
19
2.4.1.4. Submarine agarosegelelektroforese Visualisatie van de geamplificeerde producten gebeurt via submarine agarosegelelektroforese. 5 µl sample buffer (een oplossing van 25 mg broomfenolblauw [Sigma-Aldrich, Bornem, België], 5 mL glycerol en 5 mL ultrapuur water) wordt gemengd met 10 µl van het PCR product om nadien 10 µl van dit mengsel op een 2% agarosegel, met een ethidium bromide concentratie van 0,5 µg/ml, te laden. 10 µl van een 100 bp ladder (MBI Fermentas, Sankt Leon-Rot, Duitsland) wordt eveneens op de gel geladen. Het toestel wordt afgesteld op 100 Volt, 40 mAmpère en 30 minuten. Visualisatie van het resultaat gebeurt op de computer door middel van een UV-lamp en een camera. Na amplificatie van de V3 sequentie met bovenstaande primers (Tabel 3) verwacht men een product met een lengte van ongeveer 360 bp. 2.4.1.5. QIAquick PCR zuivering De PCR producten worden vervolgens gezuiverd met de QIAquick PCR purification kitTM (QiagenGmbh, Hilden, Germany). Deze stap is noodzakelijk om de primers, nucleotiden, enzymes en zouten, die tijdens de sequenering zouden kunnen interfereren, te verwijderen. 2.4.1.6. Sequencing PCR Voor de sequentiereactie wordt gebruik gemaakt van de BigDye Terminator Cyclesequencing Ready Reaction kitTM versie 3.1 (Applied Biosystems, Lennik, België). Mastermix (per reactie): -
3,25 µl AD
-
1,75 µl 5x verdunbuffer
-
0,50 µl reactiemix
-
2,50 µl van elk van de 4 primers (Tabel 5)
Tabel 5. Primers voor de sequencing PCR Positie nucleotiden AGY RCA GTA CAA TGY ACA CAT GG 6951 6973 6951 sense TCA ACH CAA YTR CTG TTA AAT GG 6990 7012 6990 sense ATT TCT GGR TCY CCK CCT G 7336 7318 7336 anti-sense ATT ACA RTA GAA AAA TTC YCC TCY AC 7382 7357 7382 anti-sense IUPAC code: G = Guanine; A = Adenine; T = Tyrosine; C = Cytosine; Y = C of T; R = A of G; H = A, C of T; K = G of T Primer (2 pmol/µl)
Sequentie (5’
3’)
20
In tegenstelling tot de vorige amplificaties gebeurt de amplificatie nu met 1 primer en in de aanwezigheid van fluorescent gemerkte ddNTPs. Er worden 4 verschillende epjes per staal bereid zodat er telkens 4 chromatogrammen gegenereerd zullen worden. Per staal wordt 8 µl van de mastermix gemengd met 2 µl van het gezuiverd PCR product. Amplificatie gebeurt door middel van het PE9700 programma CycleSeq ENV (Tabel 6). Tabel 6. CycleSeq ENV PCR programma Stap
Temperatuur
Tijd
1 2 3 1
96°C 50°C 60°C 8°C
10" 5" 4' Blijvend
Aantal cycli 30 x
2.4.1.7. Cleanseq zuivering De overmaat aan fluorescent gemerkte ddNTPs moet vervolgens uit het reactiemengsel verwijderd worden om interferentie met de amplicons tijdens de sequenering te vermijden. Deze zuivering met magnetische beads, wordt uitgevoerd aan de hand van de Agencourt CleanSEQ kitTM (Beckman Coulter, Massachusetts, VS). 2.4.1.8. Capillaire elektroforese De gezuiverde amplicons worden vervolgens gesequeneerd en geanalyseerd via capillaire elektroferese met de ABI3130XL Genetic AnalyserTM (Life technologies, Gent, België). 2.4.2. Dataverwerking en analyse Chromatogrammen worden in Smartgene opgeladen en vervolgens gecorrigeerd of verwijderd indien nodig. Het co-receptor tropisme werd bepaald via het geno2pheno algoritme met “recommendations from the European Consensus Group on clinical management of HIV-1 tropism testing (10% FPR)” als significantie level (48). FPR (False Positive Rate) geeft de kans aan dat een R5virus vals wordt geclassificeerd als zijnde een X4-virus. Bij een FPR van 10% of meer wordt dus een R5-virus verwacht, terwijl een FPR van minder dan 10% met een grote waarschijnlijkheid op een X4-virus wijst. Vervolgens werden de V3 sequenties, in FASTA formaat, in BioEdit gealigneerd. De uiteinden van de sequenties werden getrimd opdat alle sequenties even lang zouden zijn. Vervolgens werden de verschillen in nucleotiden tussen beide sequenties manueel geteld, waarbij een deletie van een nucleotide binnenin de sequentie 21
eveneens als een verschil beschouwd werd. Het aantal verschillen in nucleotiden werd dan uitgezet t.o.v. het totaal aantal nucleotiden waaruit 1 sequentie bestaat en het resulterend percentage is dan een maat voor de diversiteit tussen 2 stalen, afgenomen op verschillende tijdstippen bij eenzelfde patiënt. 2.5. Deep sequencing 2.5.1. RNA extractie Deze wordt op dezelfde manier uitgevoerd als bij de bepaling van V3 via Sanger sequencing (zie 2.4.1.1.) 2.5.2. Reverse transcriptie en eerste amplificatie Dit wordt op dezelfde manier uitgevoerd als bij de bepaling van V3 via Sanger sequencing (zie 2.4.1.2.), maar in plaats van de titan 2XL wordt nu het PE9700 programma 454-20C gekozen voor het inzetten van de PCR (Tabel 7) . Tabel 7. 454-20C PCR programma Stap
Temperatuur
Tijd
1 2 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 1
45°C 94°C 94°C 45°C 68°C 94°C 50°C 68°C 94°C 55°C 68°C 68°C 8°C
30' 2' 30" 30" 3' 30" 30" 4' 30" 30" 5' 7' blijvend
Aantal cycli
2x
3x
20x
2.5.3. Tweede amplificatie De tweede amplificatie is een nested PCR, waarbij gebruik gemaakt wordt van de FastStart High Fidelity PCR System kitTM (Roche Applied Science, Vilvoorde, België) voor het maken van de mastermix. De primers die hier aan toegevoegd worden, zijn gekoppeld aan een MID (Multiplex Identifier), dat voor elk staal verschillend is (Tabel 8). Door de aanwezigheid van een MID, kunnen de stalen achteraf gemakkelijk onderscheiden worden van elkaar.
22
Tabel 8. De 20 geselecteerde stalen voor deep sequencing met respectievelijke MIDs Patiënt ID
Datum
MID
Sequentie MID
11073 04/09/2011 1 ACGAGTGCGT 07022 07/11/2008 2 ACGCTCGACA 11014 04/03/2011 3 AGACGCACTC 10004 16/06/2011 4 AGCACTGTAG 10013 10/03/2010 5 ATCAGACACG 11044 06/07/2011 6 ATATCGCGAG 06042 05/12/2006 7 CGTGTCTCTA 09094 21/10/2009 8 CTCGCGTGTC 09076 07/09/2009 9 TAGTATCAGC 11002 18/01/2011 10 TCTCTATGCG 09022 09/11/2011 11 TGATACGTCT 08095 19/01/2010 12 TACTGAGCTA 10031 11/09/2012 13 CATAGTAGTG 09061 30/08/2010 14 CGAGAGATAC 11098 27/05/2013 15 ATACGACGTA 10051 19/07/2013 16 TCACGTACTA 10006 24/09/2010 17 CGTCTAGTAC 11066 29/03/2013 18 TCTACGTAGC 09020 03/05/2010 19 TGTACTACTC 12031 11/12/2012 20 ACGACTACAG IUPAC code: G = Guanine; A = Adenine; T = Tyrosine; C = Cytosine
Mastermix (per reactie): -
12,375 µl AD
-
2,5 µl High Fidelity (Hifi) reaction buffer (vial 2)
-
1 µl DiMethylSulfOxide (DMSO) (vial 5)
-
4 µl dNTPs (1,25 mM)
-
0,125 µl Faststart HifiTaq DNA Polymerase (vial 1)
-
2 µl van elk van de 2 primers (Tabel 9), die dus voor elke patiënt verschillend zijn
Tabel 9. Primers voor de tweede amplificatie Primer (5 pmol/µl)
Sequentie (5’
3’)
6990-MID
sense
TCA ACH CAA YTR CTG TTA AAT GG - MID
7336-MID
anti-sense
ATT TCT GGR TCY CCK CCT G - MID
IUPAC code: G = Guanine; A = Adenine; T = Tyrosine; C = Cytosine; Y = C of T; R = A of G; H = A, C of T; K = G of T
Per staal wordt er 24 µl van deze mastermix gemengd met 1 µl van het PCR product dat verkregen werd na de eerste amplificatie. Amplificatie gebeurt door middel van het PE9700 programma 454-MID-35C (Tabel 10).
23
Tabel 10. 454-MID-35C PCR programma Stap
Temperatuur
Tijd
1 1 2 3 1 1
95°C 94°C 50°C 72°C 72°C 8°C
2' 30" 1' 1' 30" 7' Blijvend
Aantal cycli
35 x
2.5.4. Submarine agarosegelelektroforese 2 µl sample buffer (een oplossing van 25 mg broomfenolblauw [Sigma-Aldrich, Bornem, België], 5 mL glycerol en 5 mL ultrapuur water) wordt gemengd met 5 µl van het PCR product om vervolgens 5 µl van het mengsel op de agarosegel te laden. 5 µl van een 100 bp ladder (MBI Fermentas, Sankt Leon-Rot, Duitsland) wordt eveneens geladen. Visualisatie van het resultaat gebeurt op de computer door middel van een UV-lamp en een camera. De verwachte lengte van de bandjes is ongeveer 360 bp. 2.5.5. Ampure zuivering De PCR producten werden vervolgens gezuiverd met de Agencourt AMPure XP DNA purification kitTM (Analis, Gent, België) om de primers, nucleotiden, enzymes en zouten te verwijderen. 2.5.6. Submarine agarosegelelektroforese Als controle voor een geslaagde zuivering worden de stalen opnieuw op een agarosegel geladen (zie 2.5.4.). 2.5.7. Concentratiebepaling De DNA concentratie van elk staal moet vervolgens bepaald worden zodat alle stalen uiteindelijk op eenzelfde concentratie kunnen gebracht worden. De concentratiebepaling gebeurt met de Qubit 2.0 fluorometer, door middel van de QubitdsDNA HS Assay kitTM en met volgende aanpassingen van het protocol. De concentratie van elk staal wordt teruggebracht op 1 x 109 moleculen/µl door 2 µl van het staal te verdunnen in TE buffer. Om dit te kunnen berekenen worden de stappen gevolgd van “Amplicon dilution and pooling” uit de Amplicon Library Preparation Method Manual GS Junior Titanium Series (Roche Applied Science, Vilvoorde, België). 24
Na samenvoegen van alle verdunde stalen werd een oplossing met een totaalvolume van 160 µl bekomen. Deze werd opnieuw gezuiverd met de Agencourt AMPure XP DNA purification kit (Analis, Gent, België). Elutie gebeurt met 20 µl TE buffer. De concentratie van de oplossing wordt daarna opnieuw bepaald met de Qubit 2.0 fluorometer, door middel van de QubitdsDNA HS Assay kit. Deze bedroeg uiteindelijk 5,18 ng/ml, wat na berekening met de formules van “Amplicon dilution and pooling” uit de Amplicon Library Preparation Method Manual GS Junior Titanium Series (Roche Applied Science, Vilvoorde, België) overeenstemt met een concentratie van 4,99 x 108 moleculen/µl. Om nu tot een uiteindelijke concentratie van 106 moleculen/µl te komen, moet de gezuiverde oplossing 1:499 verdund worden. Hiervoor wordt 3 µl van de oplossing samengevoegd met 1,494 µl Molecular Biology Grade Water en met deze oplossing kan dan de emulsie PCR uitgevoerd worden. 2.5.8. Emulsie PCR De emulsie PCR wordt uitgevoerd volgens de emPCR Amplification Method Manual – Lib-A (GS Junior Titanium Series, Roche Applied Science, Vilvoorde, België) met volgende aanpassingen. Voor het maken van de Live Amp Mixes A en B wordt 235 µl Molecular Biology Grade Water en 10 µl Amp Primer (A en B) toegevoegd. Er wordt 7 µl van de gezuiverde en verdunde oplossing (DNA library) aan de Capture Beads A en B toegevoegd. Dit volume werd berekend door in de formule 1,4 gewenste moleculen per bead te nemen. Het programma van de emulsie PCR staat beschreven in Tabel 11. Tabel 11. Emulsie PCR programma Stap
Temperatuur
Tijd
Aantal cycli
1 1 2 3 1
94°C 94°C 58°C 68°C 10°C
4' 30" 4' 30” 30" Blijvend
35 x
2.5.9. 454 Deep Sequencer Voor de sequencing met de 454 GS Junior Sequencer (Roche Applied Science, Vilvoorde, België) en de voorbereiding ervan wordt de bijhorende Sequencing Method Manual (GS Junior Titanium Series) gevolgd. Finaal werden er 500.000 DNA beads geladen op de picotiterplaat met 1,4 cpb (copy per beads). 25
2.5.10. Analyse De sequenties die per MID en dus per patiënt gegenereerd zijn, worden eerst bewerkt (de reversed sequenties worden omgezet naar forward sequenties) in BioEdit en vervolgens getrimd, zodat enkel het V3 stuk behouden wordt. Gelijke sequenties worden geclusterd door middel van de 454 Sequence Processor v3.0 (in-house software). Sequenties die te lang zijn als gevolg van een insertie van 1 nucleotide worden verwijderd. Nadien worden per patiënt gemiddeld 85% van de sequenties geselecteerd voor alignering. De sequenties die minder dan 4 keer voorkomen worden namelijk eveneens verwijderd (Tabel 12). Tabel 12. Aantal sequenties voor en na alignering Initiële Aantal Uiteindelijk Initiële Aantal Uiteindelijk aantal verwijderde aantal MID aantal verwijderde aantal sequenties sequenties sequenties sequenties sequenties sequenties 2086 354 1732 1938 410 1528 1 11 408 100 308 2603 391 2212 2 12 2008 258 1750 2868 473 2395 3 13 2008 192 1816 1240 161 1079 4 14 2300 185 2115 2350 293 2057 5 15 1595 155 1440 2311 212 2099 6 16 2273 304 1969 1809 294 1515 7 17 868 131 737 2434 264 2170 8 18 2759 301 2458 2292 366 1926 9 19 2773 358 2415 2034 204 1830 10 20 Sequenties die minder dan 4 keer voorkwamen, werden verwijderd (= aantal verwijderde sequenties). Het aantal sequenties dat toen nog overbleef (= uiteindelijk aantal sequenties) en het aantal sequenties vóór deze cut-off (= initiële aantal sequenties) worden eveneens weergegeven in de tabel per patiënt MID. MID
Na alignatie van de sequenties per patiënt afzonderlijk en voor alle patiënten samen, werd een fylogenetische boom geconstrueerd. 2.5.11. Fylogenie De FASTA file waarin de sequenties van alle patiënten vervat zitten én een extra sequentie (HIV-1 subtype J) die als root functioneert, wordt eerst geconverteerd naar een phylip 4 file met de extensie phy. Vanuit deze file wordt vervolgens een fylogenetische boom (Neighborjoining) gegenereerd met het PHYLIP pakket. Er worden 1000 datasets gecreëerd via bootstrapping. Deze datasets kunnen nadien geopend worden in iTOL (49) voor visualisatie van de fylogenetische boom en er wordt nog een extra dataset aan toegevoegd voor de kleuring van de fylogenetische boom. Hierop wordt dan de analyse gedaan om de patiënten met superinfectie op te sporen.
26
3. RESULTATEN Na een literatuurstudie werden drie methoden weerhouden voor een eerste screening naar superinfectie. Bij patiënten met een verhoogd risico op superinfectie werd vervolgens deep sequencing analyse van de V3 regio van het enveloppe gen uitgevoerd. 3.1. Analyse van de PR-RT sequentie Het aantal nucleotidenmengsels in de baseline sequentie van het PR-RT gen werd voor elk van de 99 patiënten afzonderlijk bepaald (Figuur 10). De meerderheid van de patiënten (87%) hebben minder dan 10 nucleotidenmengsels in de PRRT sequentie en slechts 2% van de patiënten hebben een PR-RT sequentie met een hoog aantal mengsels (>30). 100% 90% Totale populatie (%)
80% 70% 60%
52%
50% 40%
35%
30% 20% 8%
10%
3%
1%
20-29
30-39
1%
0% 0
1-9
10-19
40-49
50-60
Aantal mengsels PR/RT Figuur 10. Aantal mengsels in PR-RT Op de X-as wordt het aantal mengsels weergegeven onder de vorm van intervallen. De Y-as toont het percentage patiënten per interval.
3.2. Analyse van de virale ladingen Voor elk van de 99 patiënten werden opeenvolgende resultaten van de bepaling van de virale lading op bloedstalen afgenomen vóór start van therapie, gecontroleerd op de aanwezigheid van onverwachte stijgingen (≥0,50 log10 RNA kopijen/ml). De meerderheid van de patiënten vertoonde geen stijging in virale lading van ≥0,50 log10 RNA kopijen/ml. Bij 39 van de 99 patiënten (39%) was wel een stijging in virale lading waar
27
te nemen van minstens 0,50 log. Binnen deze groep waren er 8 patiënten (8%) met een stijging in virale lading van 1 log. 3.3. V3 sequentieanalyse Voor elke patiënt werd de V3 sequentie van 2 stalen, afgenomen vóór start therapie en met een interval van minstens 6 maanden, vergeleken. Een groot aantal V3 sequenties (83) waren reeds beschikbaar. Voor de overige stalen (115) werden de V3 sequenties bepaald. Het aantal nucleotiden die tussen beide sequenties verschillend was, werd geteld (Figuur 11). 100%
Totale populatie (%)
90% 80%
77%
70% 60% 50% 40% 30% 20%
15%
10%
2%
3%
3%
10-14
15-19
20-25
0% 0-4
5-9
Nucleotidenverschillen V3 sequenties Figuur 11. Nucleotidenverschillen binnen de V3 sequenties van 2 stalen afgenomen bij eenzelfde patiënt Op de X-as zijn de V3 verschillen in percentages weergegeven onder de vorm van intervallen. Op de Y-as kan dan het bijhorende percentage van patiënten dat tot deze intervallen behoort, afgelezen worden.
Als bijkomende analyse werd het co-receptor tropisme van al deze sequenties bepaald (Figuur 12).
28
B 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
79%
Totale populatie (%)
Totale populatie (%)
A
21%
CXCR4
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
CCR5
75%
25%
CXCR4
Co-receptor tropisme
CCR5
Co-receptor tropisme
Figuur 12. Co-receptor tropisme Op de X-as van beide grafieken wordt weergegeven of het om een X4 –of een R5 viruspopulatie gaat. De Y-as geeft het percentage van patiënten weer in overeenstemming met het tropisme. A toont de resultaten afkomstig van het eerste staal van de patiënt en B die van het tweede staal.
Bij enkele patiënten heeft de viruspopulatie een co-receptor tropisme switch ondergaan. Bij 6 van de 99 patiënten (6%) werd er een switch van X4 naar R5 waargenomen en bij 10
Totale populatie (%)
patiënten (10%) gebeurde deze switch van R5 naar X4 (Figuur 13). 100% 80% 60% 40% 20%
6%
10%
0% CXCR4 --> CCR5 CCR5 --> CXCR4 Tropisme switch
Figuur 13. Tropisme switch
3.4. Datapooling Alle resultaten werden per patiënt in een tabel gezet (zie Addendum I). Vervolgens werden de gegevens gerangschikt volgens 4 criteria: -
Het aantal mengsels binnen het PR-RT gen
-
De grootte van de stijging in virale lading 29
-
Het aantal verschillen in nucleotiden tussen de V3 sequenties van 2 stalen van eenzelfde patiënt
-
Het verschil in FPR (%) tussen deze 2 verschillende V3 sequenties
Op deze manier werden 4 verschillende lijsten bekomen (zie Addendum II-V) en aan de hand daarvan werden voor elk criterium de 10 patiënten met de hoogste score geselecteerd. Op basis van deze lijsten werden vervolgens 20 patiënten geselecteerd voor deep sequencing. Patiënten die voor 2 of meer criteria bij de 10 hoogste werden geklasseerd, werden ingesloten. Aanvullend werden vooral patiënten met een groot aantal mengsels in de PR-RT sequentie en patiënten met plotse stijgingen in virale lading opgenomen in de selectie voor deep sequencing omdat deze kenmerken in de literatuur het duidelijkst gelinkt worden aan superinfectie. Tabel 13 toont de karakteristieken van de geselecteerde patiënten. Tabel 13. De 20 geselecteerde patiënten voor deep sequencing
4/09/2011
Aantal mengsels 56
Stijging virale lading < 0,50 log
16,57%
Verschil FPR (%) in abs. waarde 15,40
07022
7/11/2008
33
0,97
4,08%
45,40
3
11014
4/03/2011
26
0,52
3,67%
73,10
4
10004
16/06/2011
23
< 0,50 log
3,58%
0,00
5
10013
10/03/2010
22
< 0,50 log
25,25%
6,10
6
11044
6/07/2011
19
< 0,50 log
4,82%
1,60
7
06042
5/12/2006
17
0,53
5,08%
10,20
8
09094
21/10/2009
16
0,62
4,27%
0,50
9
09076
7/09/2009
15
0,51
4,01%
22,20
10
11002
13/01/2012
13
< 0,50 log
6,19%
29,20
11
09022
9/11/2011
2
< 0,50 log
21,29%
34,60
12
08095
19/01/2010
1
2,19
20,31%
12,60
13
10031
11/09/2012
2
1,87
10,38%
0,30
14
09061
30/08/2010
0
1,36
9,38%
3,90
15
11098
27/05/2013
10
1,45
1,90%
5,00
16
10051
19/07/2013
4
1,32
2,23%
0,00
17
10006
24/09/2010
9
1,21
1,04%
0,30
18
11066
29/03/2013
8
1,18
1,31%
2,40
19
09020
3/05/2010
1
1,07
2,11%
6,40
20
12031
11/12/2012
0
0,98
1,56%
2,50
MID
Patiënt ID
Datum staal
1
11073
2
Verschil V3
Voor de patiënten die geselecteerd werden op basis van een hoog aantal mengsels in de PRRT sequentie, werd het eerste staal gekozen voor deep sequencing. De grote variatie die in dat staal waargenomen werd, kan er op wijzen dat de patiënt op dat tijdstip reeds 30
gesuperinfecteerd was. Bij een staal, afgenomen op een later tijdstip, zou het kunnen dat de superinfectie niet meer opgemerkt wordt in de deep sequencing analyse. Bij de andere patiënten werd geopteerd voor het tweede staal (van recentere datum). Deze patiënten vertoonden immers geen hoog aantal mengsels in de PR-RT sequentie waardoor vermoed wordt dat superinfectie op een later tijdstip kan plaatsgevonden hebben. 3.5. Deep sequencing analyse Het aantal reads dat per patiënt met de deep sequencing analyse bekomen werd, varieerde tussen 408 en 3017, met een gemiddelde van 2145 reads (Tabel 14). Tabel 14. Aantal reads/sequenties per patiënt – deep sequencing MID
Aantal reads
MID
Aantal reads
MID
Aantal reads
MID
Aantal reads
1 2 3 4 5
2099 408 2015 2012 2396
6 7 8 9 10
1636 2369 875 2808 2798
11 12 13 14 15
1962 2627 2914 1253 2365
16 17 18 19 20
2331 1966 3017 2999 2046
3.5.1. Fylogenie De bekomen sequenties werden getrimd, geclusterd en nadien bewerkt in BioEdit. Een fylogenetische boom werd vervolgens geconstrueerd. In eerste instantie werd een fylogenetische boom gegenereerd via PHYLIP. Deze toonde een aantal sequenties die zich niet op de te verwachten locatie in de fylogenetische boom bevonden, bv. sequenties van de patiënt met MID6 die clusterden met sequenties van de patiënt met MID7 (Figuur 14). De meest voor de hand liggende verklaring voor deze waarneming is contaminatie. Het waren sequenties met een klein aantal reads die clusterden naast sequenties met een zeer hoog aantal reads van een andere patiënt.
31
Figuur 14. Contaminatie van sequenties binnen een fylogenetische boom Twee sequenties van de patiënt met MID6 situeren zich binnen de cluster van sequenties van de patiënt met MID7 en naast de sequenties van MID7 die het meest voorkomen. Elke verschillende sequentie werd in de fylogenetische boom gecodeerd. Vb.: M07 1 1213 staat voor de sequentie van patiënt met MID7 die het meeste voorkomt (1213 reads), M07 2 579 is dan de tweede meest voorkomende sequentie (579 reads) .
De 11 sequenties die toegeschreven werden aan contaminatie werden verwijderd. De fylogenetische boom werd hierna opnieuw geconstrueerd in PHYLIP (zie Addendum VI). Via PhyML (50) werd verzekerd dat de clustering van de fylogenetische boom betrouwbaar is. Na analyse van de fylogenetische boom werden 4 patiënten (MID10, MID11, MID12, MID13) met sterke aanwijzingen op HIV-1 superinfectie geselecteerd: -
Aanwezigheid van 2 duidelijk gescheiden clusters of in het geval van MID12 een aantal sequenties die samen clusterden met de sequenties van een andere patiënt
-
Een grote variatie tussen de verschillende sequenties op zowel nucleotide als aminozuur niveau, die te groot is om te kunnen verklaren als gevolg van natuurlijke evolutie
MID16 lijkt superinfectie te zijn. Sequenties van deze patiënt worden teruggevonden op verschillende plaatsen in de fylogenetische boom. Om de variatie tussen sequenties beter te kunnen definiëren, werd vervolgens voor elke patiënt de distance matrix berekend op aminozuur niveau via de applicatie “Prot dist protein distance matrix” in BioEdit. Deze toepassing berekent genetische afstanden tussen alle sequenties onderling en zet deze uit in een matrix. Vervolgens werd de gemiddelde distance per patiënt berekend (Figuur 15). 32
Figuur 15. De gemiddelde distance binnen elke patiënt Op deze grafiek zijn de 20 patiënten (M = MID), met hun gemiddelde distances op de Y-as, weergegeven. De 5 patiënten die geïdentificeerd werden als gesuperinfecteerd zijn hierbij in het rood omcirkeld.
De 4 patiënten die we reeds geselecteerd hadden als mogelijks gesuperinfecteerd (MID10, MID11, MID12 en MID13), hadden een gemiddelde distance die duidelijk boven het gemiddelde van alle patiënten samen (0,14) lag. Een uitzondering is MID2, die bovendien zelfs de hoogste gemiddelde distance vertoont. Bij verdere analyse van de MID2 sequenties op nucleotide en aminozuur niveau, werd duidelijk dat er een grote variatie te zien is tussen de verschillende sequenties, hetgeen op superinfectie wijst. Heranalyse van de fylogenetische boom, toonde inderdaad 2 clusters. Deze superinfectie werd in eerste instantie niet opgemerkt omdat beide clusters naast elkaar gelegen zijn. In totaal hebben we dus sterke aanwijzingen voor superinfectie bij 5 van de 99 onderzochte patiënten (Figuur 16) .
33
Figuur 16. Fylogenetische boom Fylogenetische boom bevattende de sequenties, bekomen door deep sequencing analyse, van de 20 geselecteerde patiënten. Er werd in iTOL een extra dataset toegevoegd zodat de patiënten waarbij superinfectie vermoed wordt, in een kleur zijn aangeduid.
Ook voor de patiënten met MID8 en MID19 is de gemiddelde distance hoog in vergelijking met de andere patiënten. In de boom zien we eveneens een opsplitsing van de clusters met de sequenties van deze patiënten. Dit zou kunnen wijzen op superinfectie met genetisch nauw verwante varianten. Extra stalen van deze patiënten zouden onderzocht moeten worden om dit te kunnen bevestigen.
34
3.6. Reflectie naar de gebruikte methodologie Voor de evaluatie van de gebruikte methodologie werden de positief en negatief voorspellende waarden berekend voor de 4 methoden die initieel werden gebruikt voor de selectie en met de resultaten van de deep sequencing als standaard methode. Op basis van de resultaten van de deep sequencing werden 5 van de 20 patiënten beschouwd als gesuperinfecteerd en 15 als niet gesuperinfecteerd (Tabel 15). Tabel 15. Statistische test
Referentie (Deep Sequencing)
Test
Positief
Negatief
A C
B D
Positief Negatief
A = echt positief; B = vals positief; C = vals negatief; D = echt negatief
Test = Aantal nucleotide mengsels is groter dan 10 2 (A) 3 (C)
8 (B) 7 (D)
PVW = 2/10 (20%) NVW = 7/10 (70%)
Test = Stijging in virale lading is groter dan 0,50 log10 RNA kopijen/ml 3 (A) 2 (C)
11 (B) 4 (D)
PVW = 3/14 (21%) NVW = 4/6 (67%)
Test = Verschil in V3 sequenties is groter dan 10% 3 (A) 2 (C)
2 (B) 13 (D)
PVW = 3/5 (60%) NVW = 13/15 (87%)
Test = Scoren op minstens 2 merkers 4 (A) 1 (C)
4 (B) 11 (D)
PVW = 4/8 (50%) NVW = 11/12 (92%)
PVW = Positief Voorspellende Waarde = A/(A+B); NVW = Negatief Voorspellende Waarde = D/(C+D)
De positief voorspellende waarde geeft hier het percentage weer van de patiënten die positief scoren op de gebruikte methode en ook werkelijk positief (gesuperinfecteerd) zijn. De negatief voorspellende waarde geeft dan het percentage weer van de patiënten die negatief scoren op de gebruikte methode en ook werkelijk negatief (niet gesuperinfecteerd) zijn. Idealiter zouden deze beide waarden 100% moeten zijn.
35
4. BESPREKING HIV is een genetisch zeer variabel virus ten gevolge van een hoge replicatie en een slecht werkend reverse transcriptase dat veel fouten maakt en geen proofreading activiteit heeft. Deze variabiliteit kan nog extra verhoogd worden wanneer eenzelfde cel door 2 verschillende HIV virussen geïnfecteerd wordt en recombinatie plaatsvindt. Recombinatie tussen genetisch verschillende virusvarianten kan optreden wanneer deze verschillende varianten eenzelfde cel infecteren. Hiervoor moet eerst co-infectie of superinfectie plaatsvinden. Men spreekt over superinfectie wanneer een reeds met HIV geïnfecteerd individu opnieuw geïnfecteerd wordt met een andere HIV variant. Wanneer een individu gelijktijdig of bijna gelijktijdig met 2 varianten wordt geïnfecteerd spreekt men van co-infectie. Een duidelijk bewijs voor het feit dat HIV-1 superinfectie kan optreden zijn de tot nu toe reeds 58 gedocumenteerde CRFs (17). De werkelijke frequentie van voorkomen van HIV-1 superinfectie is echter nog onduidelijk. Wel is het zeker dat deze in belangrijke mate zal verschillen naargelang de patiëntenpopulatie die men bestudeert. In theorie zou men ervan kunnen uitgaan dat patiënten met een hoog risico op HIV infectie ook een hoog risico hebben op superinfectie. Vele onderzoekers hebben getracht de prevalentie van HIV-1 superinfectie in bepaalde populaties te achterhalen, maar door de moeilijkheid om superinfectie te detecteren en te identificeren, blijven dit ruwe schattingen. De methode die gebruikt wordt om superinfectie op te sporen verschilt van studie tot studie (25). Het bestuderen van superinfectie is belangrijk om nieuwe inzichten te verschaffen met betrekking tot de infectie, de afweer tegen de infectie en de genetische evolutie van het virus (zodat deze zich ideaal kan aanpassen aan de gastheer). Deze kennis is essentieel voor bv. het ontwikkelen van een bruikbaar vaccin tegen HIV (14). Vandaar het belang om te beschikken over een goede methodologie voor de detectie van HIV-1 superinfectie. De mogelijkheid om op een betrouwbare en relatief eenvoudige manier superinfectie op te sporen bij grotere groepen van patiënten zal toelaten om een duidelijk beeld te krijgen over de frequentie van voorkomen van superinfectie, de karakteristieken van patiënten met superinfectie, de effecten van superinfectie op de ziekteprogressie én om patiënten met superinfectie te selecteren voor verder onderzoek. In deze studie werden 99 patiënten, allen opgevolgd in het Aids Referentie Centrum (ARC) van het Universitair Ziekenhuis (UZ) te Gent, geselecteerd op basis van volgende criteria: de sequentieanalyse van het PR-RT gen, dat bepaald werd op het eerste bloedstaal van de patiënt 36
voor het opsporen van baseline drug resistentie, moet beschikbaar zijn, evenals regelmatige bepalingen van de virale lading. Ook moeten 2 verschillende therapie-naïeve plasmastalen, met een interval van minstens 6 maanden, beschikbaar zijn voor het uitvoeren van een V3 sequentieanalyse. Tenslotte werden enkel patiënten die geïnfecteerd zijn met HIV-1 subtype B opgenomen in de testgroep omdat dit het subtype is dat voor de meerderheid van de HIV transmissies in België verantwoordelijk is. Na een literatuurstudie werden 3 methoden weerhouden voor het aantonen van eventuele superinfectie bij deze 99 geselecteerde patiënten. Een eerste methode bestond uit het bepalen van het aantal posities met nucleotidenmengsels in de sequentie van het HIV-1 PR-RT gen. Hiervoor werden de PR-RT sequenties bekeken die beschikbaar waren via analyses voor de routine klinische opvolging van HIV-1 patiënten. Deze analyse gebeurt op het eerste staal van elke nieuwe patiënt om na te gaan of de patiënt mogelijks geïnfecteerd is met een drug resistente variant. Verschillende onderzoekers hebben aangetoond dat een groot aantal nucleotidenmengsels, ook wel gedegenereerde basen genoemd, een gevolg kan zijn van HIV1 superinfectie (25, 39, 47). In deze studie werd bij 64 van de 99 (65%) patiënten minstens 1 nucleotidenmengsel teruggevonden (met een gemiddeld aantal van 7 mengsels). Het laagste en hoogste aantal nucleotidenmengsels dat tussen deze patiënten werd waargenomen, bedroeg respectievelijk 1 en 56. Hoe hoog het aantal nucleotidenmengsels moet zijn om suggestief te zijn voor superinfectie is onduidelijk. Veel zal afhangen van hoe sterk de 2 aanwezige varianten genetisch van elkaar verschillen. Bovendien zullen, door de natuurlijke evolutie van het virus over de tijd, ook meer nucleotidenmengsels worden gezien bij patiënten die pas lang na de infectie gediagnosticeerd worden dan bij patiënten met een recente infectie. Cornelissen et al. selecteerden in hun onderzoek enkel stalen met 34 mengsels of meer voor verdere analyse op superinfectie. Bij 43% hiervan werd superinfectie bevestigd. Wanneer de grens verlegd werd naar 45 mengsels of meer, steeg dit percentage tot 73% (42). Wij hebben de 10 patiënten met het hoogst aantal mengsels (>13) geselecteerd voor verder onderzoek. Van deze 10 toonden slechts 2 (20%) in de finale deep sequencing analyse aanwijzingen voor superinfectie. Dit resulteert in een positief en negatief voorspellende waarde van respectievelijk 20% en 70% voor het bepalen van het aantal mengsels in de PRRT sequentie als merker voor superinfectie, met deep sequencing als standaard. De patiënten met MID2 en MID10 die geselecteerd werden op basis van een hoog aantal 37
nucleotidenmengsels en die ook effectief gesuperinfecteerd bleken te zijn op basis van de deep sequencing analyse hadden nucleotidenmengsels op respectievelijk 33 en 13 posities. Bij de patiënt met het hoogste aantal mengsels (56) kon deep sequencing geen superinfectie aantonen. Er zijn een aantal beperkingen waar we bij het beoordelen van de bruikbaarheid van deze methode voor de selectie van superinfectie rekening moeten mee houden. Ten eerste werd enkel het eerste bloedstaal van de patiënt geanalyseerd. Enkel patiënten die op dat moment reeds gesuperinfecteerd waren, konden dus worden opgemerkt. Ideaal zou zijn om deze methode te herhalen op longitudinale stalen. Dit geeft meteen ook een beter idee van de evolutie die zich voordoet in een viruspopulatie. Wanneer het aantal nucleotidenmengsels plots stijgt zou dit een sterke aanwijzing kunnen zijn voor superinfectie i.t.t. een geleidelijke toename van het aantal mengsels als gevolg van natuurlijke evolutie. Een tweede beperking is het feit dat HIV-1 superinfectie ook onopgemerkt kan blijven wanneer 1 of enkele stalen worden gesequeneerd en gecontroleerd op nucleotidenmengsels. Het is immers vastgesteld dat bij superinfectie de aanwezigheid van verschillende viruspopulaties vaak van voorbijgaande aard is en 1 variant (de originele, de superinfecterende of een recombinant van beide) snel de overhand kan nemen (51). Als tweede selectiemethode werd gekeken of er, tussen opeenvolgende stalen van dezelfde patiënt, een significante stijging in virale lading waargenomen kon worden. In veel studies wordt een plotse stijging in virale lading namelijk geassocieerd met HIV-1 superinfectie (22, 37, 38, 52, 53). Als significante stijging wordt een toename van de virale lading van minstens 0,50 log10 RNA kopijen/ml beschouwd. De normale fout (standaarddeviatie) op de analyse die gebruikt wordt voor het bepalen van de virale lading bedraagt 0,30 log10 RNA kopijen/ml. Patiënten met een stijging in virale lading werden geselecteerd en gesorteerd op basis van de grootte van de stijging (uitgedrukt als ∆ log10 RNA kopijen/ml). Vervolgens werden de 10 patiënten met de grootste stijging in virale lading geselecteerd voor deep sequencing. Van de 10 patiënten die via deze methode werden geselecteerd, vonden we bij 3 ook aanwijzingen voor superinfectie na deep sequencing. Dit geeft een positief en negatief voorspellende waarde van respectievelijk 21% en 67% met deep sequencing als standaard. Een belangrijke waarneming is wel dat 2 van de 5 patiënten die na deep sequencing weerhouden werden als gesuperinfecteerd, de hoogste stijging in virale lading hadden, wat de theorie van een associatie tussen superinfectie en plotse stijgingen in virale lading bevestigt 38
(23). Anderzijds tonen de bevindingen ook aan dat HIV-1 superinfectie niet noodzakelijk aanleiding geeft tot stijgingen in virale lading of dat deze stijgingen van heel korte duur kunnen zijn en daardoor niet altijd worden waargenomen in de routine analyses. Als laatste methode werd een vergelijking gemaakt tussen de sequenties van een zeer variabel deel van het HIV enveloppe gen (V3) bekomen van twee stalen, afgenomen met een tijdsinterval van minimum 6 maanden. Vele onderzoekers opteren voor een V3 sequentieanalyse, gebaseerd op Sanger sequencing en meestal gevolgd door een fylogenetische analyse, om de variatie tussen verschillende stalen van eenzelfde patiënt te bekijken en als gevolg HIV-1 superinfectie te kunnen detecteren. De V3 regio heeft een goede verhouding van geconserveerde en variabele gebieden en is bijgevolg zeer goed geschikt voor fylogenetische analyse met als doel het bepalen van de variabiliteit binnen een viruspopulatie. Een variabiliteit die hoger is dan wat verwacht wordt als gevolg van de natuurlijke evolutie van het virus, kan wijzen op superinfectie (40, 54, 55). In deze studie werd zowel het aantal nucleotidenverschillen tussen beide sequenties als het verschil in FPR (%) gekozen als potentiële merkers voor superinfectie. Het aantal nucleotidenverschillen tussen de 2 sequenties werd geteld en als percentage (op het totaal aantal nucleotiden van de sequentie) uitgedrukt. Daarnaast werd ook het co-receptor tropisme voorspeld op basis van de V3 sequentie. Het resultaat daarvan werd weergegeven als FPR (%). Een FPR<10% is sterk geassocieerd met affiniteit voor de CXCR4 co-receptor, een FPR>10% is geassocieerd met affiniteit voor de CCR5 co-receptor. Een switch in co-receptor gebruik na superinfectie is recent beschreven (56). Van de 10 patiënten met de hoogste resultaten voor elk van deze merkers werden vervolgens enkel diegene geselecteerd voor deep sequencing die ofwel voor beide merkers tot de selectie behoorden ofwel voor één van beide merkers plus minstens 1 van de 2 andere merkers (nucleotidenmengsels in PR-RT en stijging in virale lading). Voor deze strategie: scoren op 2 of meer merkers, werd een negatief voorspellende waarde van 92% bekomen en een positief voorspellende waarde van 50%. Dit is bijgevolg geen ideaal criterium voor de screening van superinfectie. 4 van de 5 patiënten met via deep sequencing geconfirmeerde superinfectie scoorden wel op minstens 2 merkers, maar dit was ook het geval bij 4 andere patiënten waarbij geen superinfectie werd vastgesteld. Wanneer afzonderlijk naar de V3 nucleotidenverschillen als methode voor de screening op HIV-1 superinfectie werd gekeken (met een cutoff op 10%), bleken de positief en negatief 39
voorspellende waarde (respectievelijk 60% en 87%) duidelijk hoger te liggen dan voor de andere methoden. Dit is waarschijnlijk te verklaren door het feit dat hier 2 stalen met een tijdsinterval werden bekeken. Een andere mogelijks belangrijke verklaring is dat de deep sequencing die als standaard werd gebruikt ook het V3 genfragment als target regio had. Op basis van de resultaten van de hierboven beschreven analyses werden aldus 20 patiënten geselecteerd voor verder onderzoek door middel van deep sequencing. Deep sequencing is een methode die uitermate geschikt is voor het bepalen van de HIV intrapatiënt genetische variabiliteit. Varianten binnen de HIV populatie van eenzelfde patiënt, die een frequentie hebben van minder dan 15-25%, kunnen niet gedetecteerd worden via Sanger sequencing, maar zullen wel zichtbaar zijn na deep sequencing analyse. Met deze methode kunnen namelijk virussen gedetecteerd worden die slechts 1% van de populatie uitmaken. De resultaten zijn bovendien kwantitatief en geven een idee over de mate van voorkomen van de verschillende varianten. Deze relatief snelle techniek biedt de mogelijkheid om meerdere stalen in 1 run te combineren door het gebruik van specifieke merkers (MIDs) (24, 44). Dit alles maakt deep sequencing een geschikte methode voor het opsporen van HIV-1 superinfectie. Na een eerste opzuivering van de door deep sequencing gegenereerde sequenties (reads) op basis van de kwaliteit van de sequentie, worden de identieke reads gegroepeerd in een reeks unieke reads die met een bepaalde frequentie voorkomen. Via de berekening van distance matrices kan de grootte van de variatie nagegaan worden en om de variabiliteit te visualiseren kan een fylogenetische boom geconstrueerd worden. Virusvarianten geïsoleerd bij eenzelfde patiënt clusteren normaliter nauw samen in de fylogenetische boom. Wanneer dit niet het geval is, kan dit het gevolg zijn van superinfectie (en/of recombinatie). Een probleem bij het opsporen van superinfectie via deep sequencing is de moeilijkheid om de grens (cut-off) die het onderscheid maakt tussen variatie als gevolg van natuurlijke evolutie en variatie als gevolg van superinfectie te bepalen. Chohan et al. beweert dat bij intra-subtype superinfectie de virussen tot ongeveer 10% kunnen verschillen in het enveloppe gen en bij inter-subtype superinfectie zou dit oplopen tot 30% (55) . In deze studie werd voor de analyse van de deep sequencing resultaten de gemiddelde distance van de reads per patiënt berekend en de topologie van de boom bekeken, met de bedoeling om superinfectie op te sporen. Wanneer de sequenties van eenzelfde patiënt zich 40
opsplitsten in subclusters of wanneer bepaalde reads zich elders in de boom positioneerden, werd superinfectie vermoed. Voor deze patiënten werd vervolgens de gemiddelde distance vergeleken met die van de andere patiënten en werden de sequentie-alignments van zowel de nucleotiden als de aminozuren bekeken. Een hoge gemiddelde distance en de aanwezigheid van 2 of meer duidelijk verschillende sequenties zonder evolutionaire overgang in de alignments, werden als extra aanwijzing op superinfectie beschouwd. In totaal werden 20 patiënten (1 staal per patiënt) geanalyseerd via deep sequencing. Vier patiënten (MID10, MID11, MID12 en MID13) werden geïdentificeerd als met grote waarschijnlijkheid gesuperinfecteerd. Voor 1 patiënt (MID2) werd superinfectie niet direct weerhouden na een eerste inspectie van de fylogenetische boom maar de hoge gemiddelde distance deed superinfectie wel vermoeden. Bij het herbekijken van de boom werd ook bij deze patiënt duidelijk subclustering gezien. Bij 2 patiënten (MID8 en MID19) was de gemiddelde distance eveneens hoog in vergelijking met de andere patiënten maar op basis van de fylogenetische boom en de sequentieanalyse kon hier geen superinfectie bevestigd worden. Deze resultaten resulteren in een frequentie van voorkomen van HIV-1 superinfectie binnen dit onderzoek van 5 op 99 patiënten (5,1%). Deze waarde ligt tussen de gemiddelde range van 0 en 20%, die gerapporteerd wordt in de literatuur (16, 27, 29, 57). De kans is zeer groot dat de frequentie van 5.1% een onderschatting is van de werkelijke frequentie omwille van volgende redenen. Er werden slechts 20 van de 99 patiënten geselecteerd voor deep sequencing. Deze selectie gebeurde op basis van testen waarvan de resultaten een aanwijzing zouden moeten geven van superinfectie. Uit later uitgevoerde vergelijkingen bleek echter dat geen van deze methodes zeer efficiënt was voor het opsporen van superinfectie. De kans is dus groot dat ook tussen de 79 patiënten die niet werden geselecteerd voor deep sequencing, patiënten met superinfectie zitten. In de deep sequencing analyse werd slechts 1 staal per patiënt meegenomen. Deze stalen werden geselecteerd als met grote waarschijnlijkheid afgenomen na het optreden van de superinfectie, op basis van de resultaten van de andere methoden. De dynamiek van HIV-1 virussen is echter zo groot dat een tweede virusvariant vaak snel geëlimineerd wordt en dat de periode waarin beide virusvarianten aanwezig zijn meestal een korte overgangsfase is (33, 58, 59). Bij bepaalde stalen, afhankelijk van het tijdstip van afname, kan het dus zijn dat daardoor superinfectie niet opgemerkt werd. 41
Bovendien werd enkel de V3 regio van het HIV-1 genoom geamplificeerd en geanalyseerd via deep sequencing. Recombinanten die het V3 fragment van de originele viruspopulatie bevatten, zullen hierdoor niet als gesuperinfecteerd herkend worden. Verschillende studies hebben immers aangetoond dat de kans op detectie van HIV-1 superinfectie vergroot met het aantal regio’s van het HIV-1 genoom dat men gaat analyseren (29, 33). Er zijn ook nadelen verbonden aan het gebruik van de deep sequencing techniek. Er moet uiterst zorgvuldig worden gewerkt om contaminatie uit te sluiten. In deze studie hebben we gemerkt dat contaminatie inderdaad kan voorkomen. Deze was waarschijnlijk te wijten aan de onervarenheid van de uitvoerder van de PCR analyse. Om voldoende amplicon te kunnen genereren wordt een nested PCR protocol gebruikt. Contaminatie kan optreden tijdens het overbrengen van de PCR producten van de eerste amplificatie naar de reactiemix voor de tweede amplificatie. De contaminatie werd opgemerkt na het genereren van de fylogenetische boom wat het belang toont van deze fylogenetische boom vooraleer men definitieve analyses uitvoert op deep sequencing data. Andere nadelen van deep sequencing zijn de hoge kostprijs en de arbeidsintensieve analyses die erop volgen. Deze hinderen het onderzoek naar HIV-1 superinfectie op grotere schaal (30). Hierdoor zal steeds eerst een selectie van patiënten met een hoger risico op HIV-1 superinfectie moeten plaatsvinden om de uiteindelijke testgroep te verkleinen (22). Voor het betrouwbaar detecteren van superinfectie via deep sequencing zal er ook meer informatie moeten worden verzameld over de mate van natuurlijke evolutie in de regio die men analyseert om zo een duidelijke cut-off te kunnen vastleggen voor het onderscheid tussen variabiliteit door natuurlijke evolutie en variabiliteit door superinfectie. Ook het aantal geanalyseerde stalen, het tijdstip waarop deze stalen zijn afgenomen en het aantal regio’s van het HIV-1 genoom die via deep sequencing geanalyseerd worden, zijn van belang voor het betrouwbaar vaststellen van superinfectie (33). Het is duidelijk dat superinfectie met een genetisch nauw verwant virus slechts zal kunnen worden aangetoond na het analyseren van longitudinale stalen. In de toekomst kan ook worden gedacht aan full genome sequencing voor een meer efficiënte detectie van superinfectie maar vooral voor een beter inzicht in de mechanismen van recombinatie na superinfectie (29, 52, 60). De resultaten van deze studie op een beperkt aantal stalen bewijzen dat HIV-1 superinfectie geen zeldzaam fenomeen is. Verder onderzoek naar superinfectie is dus zeker vereist. Het kan nieuwe inzichten geven die o.a. belangrijk kunnen zijn voor vaccin ontwikkeling en de 42
behandeling van HIV (12, 28, 35). Het is ook belangrijk te weten waarom het ene individu wel gesuperinfecteerd wordt en het andere dan weer niet, zodat het mechanisme van de immuunrespons die zo’n superinfectie kan voorkomen, achterhaald kan worden (28). Hiernaast moet de invloed van HIV-1 superinfectie op de ziekteprogressie verder onderzocht worden want niet alleen voor onderzoekers, maar ook voor de arts is het belangrijk te weten wat de kenmerken van zo’n superinfectie nu precies inhouden. Als er bijvoorbeeld een plotse stijging in virale lading gezien wordt, moet de arts weten dat dit te wijten kan zijn aan superinfectie, voor hij naar andere verklaringen gaat zoeken. Vaak wordt ook de therapie pas jaren na diagnose opgestart en wordt deze gekozen op basis van de baseline resistentie die toen op het eerste staal werd uitgevoerd. Het is dan belangrijk te weten dat superinfectie kan plaatsgevonden hebben en dat de drug resistentie dus opnieuw bepaald zal moeten worden voor men overgaat tot de keuze van behandeling. Ook als de therapie niet meer aanslaat zou men superinfectie als oorzaak hiervan moeten overwegen en de drug resistentie, samen met het co-receptor tropisme opnieuw moeten gaan bepalen en analyseren (25). HIV superinfectie werkt recombinatie in de hand. Nieuwe recombinanten kunnen gevormd worden en zich vervolgens verspreiden. Potentieel ‘fittere’ varianten kunnen zo ontstaan. Ook dit is een proces dat moet worden opgevolgd (61). 5. ALGEMEEN BESLUIT Het is bekend dat een met HIV-geïnfecteerde persoon opnieuw met het virus geïnfecteerd kan worden. De frequentie van voorkomen van superinfectie én de invloed ervan op het ziekteproces zijn echter nog onduidelijk. De kans op superinfectie zal voor een deel worden bepaald door het risicogedrag van de patiënt maar mogelijks spelen ook andere factoren een rol in de susceptibiliteit voor superinfectie. Een betere kennis hiervan kan nieuwe inzichten geven die nuttig kunnen zijn voor onder andere vaccin-onderzoek. Onderzoek naar superinfectie wordt beperkt door het ontbreken van betrouwbare detectiemethoden. Het doel van deze studie was het evalueren van een aantal eenvoudige methoden voor het opsporen van HIV-1 superinfectie. De resultaten toonden dat geen enkele van deze methoden een voldoende hoge predictieve waarde had voor het aantonen van superinfectie. De resultaten bekomen met deep sequencing lijken wel veelbelovend en deze techniek zal dan ook in de toekomst verder geoptimaliseerd worden. Deze verdere optimalisatie omvat het vastleggen van een cut-off voor het onderscheiden van genetische variabiliteit als gevolg van natuurlijke evolutie en genetische variabiliteit als gevolg van 43
superinfectie, het verhogen van het aantal te testen stalen per run om de kostprijs van de analyse te verlagen, het nemen van extra maatregelen om contaminatie te vermijden en het ontwikkelen van bio-informatica programma’s om het analyseren van de resultaten te automatiseren. Het verder investeren in deze methode lijkt zinvol omdat deze studie, met een beperkt aantal patiënten en het analyseren van slechts 1 staal per patiënt, een hoge prevalentie van superinfectie doet vermoeden (≥ 5.1%). 6. REFERENTIELIJST 1. 2. 3. 4. 5.
6.
7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.
15. 16.
17.
18. 19. 20. 21. 22.
Hemelaar J. The origin and diversity of the HIV-1 pandemic. Trends Mol Med 2012 Mar;18(3):182-92 doi: 101016/jmolmed201112001 Epub 2012 Jan 11. Verhofstede C. Cursus HIV & AIDS. 3de Bachelor Biomedische Wetenschappen. Pathogenese 2011. Simon V, Ho DD, Karim QA. HIV/AIDS epidemiology, pathogenesis, prevention, and treatment. Lancet. 2006 Aug;368(9534):489-504. PubMed PMID: WOS:000239569000032. English. Engelman A, Cherepanov P. The structural biology of HIV-1: mechanistic and therapeutic insights. Nat Rev Microbiol 2012 Mar 16;10(4):279-90 doi: 101038/nrmicro2747. Powell RL, Urbanski MM, Burda S, Nanfack A, Kinge T, Nyambi PN. Utility of the heteroduplex assay (HDA) as a simple and cost-effective tool for the identification of HIV type 1 dual infections in resource-limited settings. AIDS Res Hum Retroviruses 2008 Jan;24(1):100-5 doi: 101089/aid20070162. Manigart O, Courgnaud V, Sanou O, Valea D, Nagot N, Meda N, et al. HIV-1 superinfections in a cohort of commercial sex workers in Burkina Faso as assessed by an autologous heteroduplex mobility procedure. AIDS 2004 Aug 20;18(12):1645-51. http://www.unaids.org/en/dataanalysis/knowyourepidemic/. http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=1865047_gkm046f1&req=4. Fanales-Belasio E, Raimondo M, Suligoi B, Butto S. HIV virology and pathogenetic mechanisms of infection: a brief overview. Ann Ist Super Sanita 2010;46(1):5-14 doi: 104415/ANN_10_01_02. Shum KT, Zhou J, Rossi JJ. Aptamer-based therapeutics: new approaches to combat human viral diseases. Pharmaceuticals (Basel) 2013 Nov 25;6(12):1507-42 doi: 103390/ph6121507. Schuitemaker H, van 't Wout AB, Lusso P. Clinical significance of HIV-1 coreceptor usage. J Transl Med 2011 Jan 27;9 Suppl 1:S5 doi: 101186/1479-5876-9-S1-S5. Najera R, Delgado E, Perez-Alvarez L, Thomson MM. Genetic recombination and its role in the development of the HIV-1 pandemic. AIDS 2002;16 Suppl 4:S3-16. Fang G, Weiser B, Kuiken C, Philpott SM, Rowland-Jones S, Plummer F, et al. Recombination following superinfection by HIV-1. AIDS 2004 Jan 23;18(2):153-9. Soares de Oliveira AC, Pessoa de Farias R, da Costa AC, Sauer MM, Bassichetto KC, Oliveira SM, et al. Frequency of subtype B and F1 dual infection in HIV-1 positive, Brazilian men who have sex with men. Virol J 2012 Sep 29;9:223 doi: 101186/1743-422X-9-223. Smyth RP, Davenport MP, Mak J. The origin of genetic diversity in HIV-1. Virus Res 2012 Nov;169(2):415-29 doi: 101016/jvirusres201206015 Epub 2012 Jun 21. Herbinger KH, Gerhardt M, Piyasirisilp S, Mloka D, Arroyo MA, Hoffmann O, et al. Frequency of HIV type 1 dual infection and HIV diversity: analysis of low- and high-risk populations in Mbeya Region, Tanzania. AIDS Res Hum Retroviruses 2006 Jul;22(7):599-606. Nunes ER, Zukurov JP, Maricato JT, Sucupira MC, Diaz RS, Janini LM. Analysis of HIV-1 protease gene reveals frequent multiple infections followed by recombination among drug treated individuals living in Sao Paulo and Santos, Brazil. PLoS One 2014 Jan 3;9(1):e84066 doi: 101371/journalpone0084066 eCollection 2014. Aldrich C, Hemelaar J. Global HIV-1 diversity surveillance. Trends Mol Med 2012 Dec;18(12):691-4 doi: 101016/jmolmed201206004 Epub 2012 Jul 14. Clerc O, Colombo S, Yerly S, Telenti A, Cavassini M. HIV-1 elite controllers: beware of superinfections. J Clin Virol 2010 Apr;47(4):376-8 doi: 101016/jjcv201001013 Epub 2010 Feb 13. Perreau M, Levy Y, Pantaleo G. Immune response to HIV. Curr Opin HIV AIDS 2013 Jul;8(4):333-40 doi: 101097/COH0b013e328361faf4. Sierra S, Kupfer B, Kaiser R. Basics of the virology of HIV-1 and its replication. J Clin Virol 2005 Dec;34(4):233-44 Epub 2005 Sep 29. van der Kuyl AC, Cornelissen M. Identifying HIV-1 dual infections. Retrovirology 2007 Sep 24;4:67.
44
23. 24.
25. 26.
27.
28.
29.
30.
31. 32. 33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
Redd AD, Quinn TC, Tobian AA. Frequency and implications of HIV superinfection. Lancet Infect Dis 2013 Jul;13(7):622-8 doi: 101016/S1473-3099(13)70066-5 Epub 2013 May 31. Chaillon A, Wagner GA, Hepler NL, Little SJ, Kosakovsky Pond SL, Caballero G, et al. Dynamics of Viral Evolution and Neutralizing Antibody Response after HIV-1 Superinfection. J Virol 2013 Dec;87(23):12737-44 doi: 101128/JVI02260-13 Epub 2013 Sep 18. Waters L, Smit E. HIV-1 superinfection. Curr Opin Infect Dis 2012 Feb;25(1):42-50 doi: 101097/QCO0b013e32834ef5af. Koning FA, Badhan A, Shaw S, Fisher M, Mbisa JL, Cane PA. Dynamics of HIV type 1 recombination following superinfection. AIDS Res Hum Retroviruses 2013 Jun;29(6):963-70 doi: 101089/AID20130009 Epub 2013 Apr 18. Vidal N, Diop H, Montavon C, Butel C, Bosch S, Ngole EM, et al. A novel multiregion hybridization assay reveals high frequency of dual inter-subtype infections among HIV-positive individuals in Cameroon, West Central Africa. Infect Genet Evol 2013 Mar;14:73-82 doi: 101016/jmeegid201211017 Epub 2012 Dec 8. Kraft CS, Basu D, Hawkins PA, Hraber PT, Chomba E, Mulenga J, et al. Timing and source of subtypeC HIV-1 superinfection in the newly infected partner of Zambian couples with disparate viruses. Retrovirology 2012 Mar 20;9:22 doi: 101186/1742-4690-9-22. Piantadosi A, Ngayo MO, Chohan B, Overbaugh J. Examination of a second region of the HIV type 1 genome reveals additional cases of superinfection. AIDS Res Hum Retroviruses 2008 Sep;24(9):1221 doi: 101089/aid20080100. Pacold M, Smith D, Little S, Cheng PM, Jordan P, Ignacio C, et al. Comparison of methods to detect HIV dual infection. AIDS Res Hum Retroviruses 2010 Dec;26(12):1291-8 doi: 101089/aid20100042 Epub 2010 Oct 18. Taylor JE, Korber BT. HIV-1 intra-subtype superinfection rates: estimates using a structured coalescent with recombination. Infect Genet Evol 2005 Jan;5(1):85-95. Gross KL, Porco TC, Grant RM. HIV-1 superinfection and viral diversity. AIDS 2004 Jul 23;18(11):1513-20. Rachinger A, Manyenga P, Burger JA, Derks van de Ven TL, Stolte IG, Prins M, et al. Low incidence of HIV-1 superinfection even after episodes of unsafe sexual behavior of homosexual men in the Amsterdam Cohort Studies on HIV Infection and AIDS. J Infect Dis 2011 Jun 1;203(11):1621-8 doi: 101093/infdis/jir164. Gottlieb GS, Nickle DC, Jensen MA, Wong KG, Kaslow RA, Shepherd JC, et al. HIV type 1 superinfection with a dual-tropic virus and rapid progression to AIDS: a case report. Clin Infect Dis 2007 Aug 15;45(4):501-9 Epub 2007 Jul 10. Ramos A, Hu DJ, Nguyen L, Phan KO, Vanichseni S, Promadej N, et al. Intersubtype human immunodeficiency virus type 1 superinfection following seroconversion to primary infection in two injection drug users. J Virol 2002 Aug;76(15):7444-52. Hu DJ, Subbarao S, Vanichseni S, Mock PA, Ramos A, Nguyen L, et al. Frequency of HIV-1 dual subtype infections, including intersubtype superinfections, among injection drug users in Bangkok, Thailand. AIDS 2005 Feb 18;19(3):303-8. Pacold ME, Pond SL, Wagner GA, Delport W, Bourque DL, Richman DD, et al. Clinical, virologic, and immunologic correlates of HIV-1 intraclade B dual infection among men who have sex with men. AIDS 2012 Jan 14;26(2):157-65 doi: 101097/QAD0b013e32834dcd26. Jurriaans S, Kozaczynska K, Zorgdrager F, Steingrover R, Prins JM, van der Kuyl AC, et al. A sudden rise in viral load is infrequently associated with HIV-1 superinfection. J Acquir Immune Defic Syndr 2008 Jan 1;47(1):69-73. Rachinger A, van de Ven TD, Burger JA, Schuitemaker H, van 't Wout AB. Evaluation of pre-screening methods for the identification of HIV-1 superinfection. J Virol Methods 2010 May;165(2):311-7 doi: 101016/jjviromet201002016 Epub 2010 Feb 21. Grobler J, Gray CM, Rademeyer C, Seoighe C, Ramjee G, Karim SA, et al. Incidence of HIV-1 dual infection and its association with increased viral load set point in a cohort of HIV-1 subtype C-infected female sex workers. J Infect Dis 2004 Oct 1;190(7):1355-9 Epub 2004 Aug 25. McCutchan FE, Hoelscher M, Tovanabutra S, Piyasirisilp S, Sanders-Buell E, Ramos G, et al. In-depth analysis of a heterosexually acquired human immunodeficiency virus type 1 superinfection: evolution, temporal fluctuation, and intercompartment dynamics from the seronegative window period through 30 months postinfection. J Virol 2005 Sep;79(18):11693-704. Cornelissen M, Jurriaans S, Kozaczynska K, Prins JM, Hamidjaja RA, Zorgdrager F, et al. Routine HIV-1 genotyping as a tool to identify dual infections. AIDS 2007 Apr 23;21(7):807-11.
45
43.
44.
45.
46. 47.
48. 49. 50. 51.
52.
53. 54.
55. 56.
57.
58.
59.
60.
61.
Messiaen P, Verhofstede C, Vandenbroucke I, Dinakis S, Van Eygen V, Thys K, et al. Ultra-deep sequencing of HIV-1 reverse transcriptase before start of an NNRTI-based regimen in treatment-naive patients. Virology 2012 Apr 25;426(1):7-11 doi: 101016/jvirol201201002 Epub 2012 Feb 4. Redd AD, Collinson-Streng A, Martens C, Ricklefs S, Mullis CE, Manucci J, et al. Identification of HIV superinfection in seroconcordant couples in Rakai, Uganda, by use of next-generation deep sequencing. J Clin Microbiol 2011 Aug;49(8):2859-67 doi: 101128/JCM00804-11 Epub 2011 Jun 22. Redd AD, Mullis CE, Serwadda D, Kong X, Martens C, Ricklefs SM, et al. The rates of HIV superinfection and primary HIV incidence in a general population in Rakai, Uganda. J Infect Dis 2012 Jul 15;206(2):267-74 doi: 101093/infdis/jis325 Epub 2012 Jun 5. https://apps.idns-smartgene.com/apps/IDNSPortal.po. Kouyos RD, von Wyl V, Yerly S, Boni J, Rieder P, Joos B, et al. Ambiguous nucleotide calls from population-based sequencing of HIV-1 are a marker for viral diversity and the age of infection. Clin Infect Dis 2011 Feb 15;52(4):532-9 doi: 101093/cid/ciq164 Epub 2011 Jan 10. http://coreceptor.geno2pheno.org/index.php. http://itol.embl.de/. http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/. Bartha I, Assel M, Sloot PM, Zazzi M, Torti C, Schulter E, et al. Superinfection with drug-resistant HIV is rare and does not contribute substantially to therapy failure in a large European cohort. BMC Infect Dis 2013 Nov 12;13(1):537. Kiwelu IE, Novitsky V, Margolin L, Baca J, Manongi R, Sam N, et al. HIV-1 subtypes and recombinants in Northern Tanzania: distribution of viral quasispecies. PLoS One 2012;7(10):e47605 doi: 101371/journalpone0047605 Epub 2012 Oct 31. Gottlieb GS, Nickle DC, Jensen MA, Wong KG, Grobler J, Li F, et al. Dual HIV-1 infection associated with rapid disease progression. Lancet 2004 Feb 21;363(9409):619-22. van der Kuyl AC, Bakker M, Jurriaans S, Back NKT, Pasternak AO, Cornelissen M, et al. Translational HIV-1 research: from routine diagnostics to new virology insights in Amsterdam, the Netherlands during 1983-2013. Retrovirology. Aug;10:12. PubMed PMID: WOS:000323780000001. English. Chohan B, Lavreys L, Rainwater SM, Overbaugh J. Evidence for frequent reinfection with human immunodeficiency virus type 1 of a different subtype. J Virol 2005 Aug;79(16):10701-8. Mortier V, Dauwe K, Vancoillie L, Staelens D, Van Wanzeele F, Vogelaers D, et al. Frequency and predictors of HIV-1 co-receptor switch in treatment naive patients. PLoS One 2013 Nov 7;8(11):e80259 doi: 101371/journalpone0080259 eCollection 2013. Wagner GA, Pacold ME, Kosakovsky Pond SL, Caballero G, Chaillon A, Rudolph AE, et al. Incidence and Prevalence of Intrasubtype HIV-1 Dual Infection in At-Risk Men in the United States. J Infect Dis 2013 Dec 13. Powell RL, Urbanski MM, Burda S, Kinge T, Nyambi PN. High frequency of HIV-1 dual infections among HIV-positive individuals in Cameroon, West Central Africa. J Acquir Immune Defic Syndr 2009 Jan 1;50(1):84-92 doi: 101097/QAI0b013e31818d5a40. Templeton AR, Kramer MG, Jarvis J, Kowalski J, Gange S, Schneider MF, et al. Multiple-infection and recombination in HIV-1 within a longitudinal cohort of women. Retrovirology 2009 Jun 3;6:54 doi: 101186/1742-4690-6-54. Ronen K, McCoy CO, Matsen FA, Boyd DF, Emery S, Odem-Davis K, et al. HIV-1 superinfection occurs less frequently than initial infection in a cohort of high-risk Kenyan women. PLoS Pathog 2013 Aug;9(8):e1003593 doi: 101371/journalppat1003593 Epub 2013 Aug 29. Yebra G, de Mulder M, Martin L, Rodriguez C, Labarga P, Viciana I, et al. Most HIV type 1 non-B infections in the Spanish cohort of antiretroviral treatment-naive HIV-infected patients (CoRIS) are due to recombinant viruses. J Clin Microbiol 2012 Feb;50(2):407-13 doi: 101128/JCM05798-11 Epub 2011 Dec 7.
46
ADDENDUM I. Tabel met alle data van de 99 patiënten Patiënt ID
Datum staal 1
FPR (%)
Datum staal 2
FPR (%)
Verschil FPR (abs. waarde)
Stijging VL (log)
Aantal mengsels PR-RT
Verschil V3
04091
21/10/04
35,1
01/04/09
3,8
05063
21/09/05
41,2
29/11/06
1,8
31,3
0,72
3
6,50%
39,4
< 0,50
2
2,78%
06026
27/04/06
10,5
31/08/10
5,3
5,2
0,82
2
5,49%
06042
05/12/06
15,0
17/04/09
4,8
10,2
0,53
17
5,08%
07022
07/03/07
07032
03/05/07
48,0
07/11/08
2,6
45,4
0,97
33
4,08%
17,0
08/05/09
7,9
9,1
< 0,50
8
3,08%
07046
13/06/07
8,5
21/06/10
65,4
56,9
< 0,50
0
4,44%
07062
31/08/07
49,0
25/06/09
7,3
41,7
< 0,50
7
2,52%
08042
30/05/08
48,7
03/04/13
50,2
1,5
0,88
2
5,00%
08066
19/01/09
23,3
28/09/10
6,9
16,4
< 0,50
0
3,41%
08072
26/09/08
13,4
19/05/11
9,0
4,4
0,62
9
5,33%
08095
21/11/08
3,8
19/01/10
16,4
12,6
2,19
1
20,31%
09002
23/01/09
94,4
21/03/11
95,4
1,0
< 0,50
0
3,44%
09011
20/02/09
20,2
03/12/12
14,7
5,5
< 0,50
0
5,45%
09013
03/03/09
16,4
23/06/11
16,4
0,0
0,60
0
2,23%
09014
25/02/09
60,5
14/01/10
49,0
11,5
< 0,50
3
2,81%
09020
17/03/09
15,0
03/05/10
8,6
6,4
1,07
1
2,11%
09022
23/03/09
61,8
09/11/11
96,4
34,6
< 0,50
2
21,29%
09023
20/03/09
1,30
04/08/11
9,6
3,4
0,51
0
7,18%
09025
01/04/09
31,3
20/04/11
45,4
14,1
0,59
0
5,00%
09027
10/04/09
14,3
05/03/10
13,0
1,3
< 0,50
2
17,39%
09037
12/05/09
22,0
03/03/10
27,5
5,5
< 0,50
1
0,22%
09038
19/05/09
67,3
12/01/10
74,0
6,7
< 0,50
2
5,15%
09042
03/06/09
93,8
10/11/10
93,8
0,0
< 0,50
4
1,16%
09043
10/06/09
31,3
08/04/11
42,6
11,3
< 0,50
0
4,14%
09046
16/06/09
2,7
02/02/10
4,8
2,1
0,70
5
2,58%
09047
15/06/09
3,8
14/09/10
3,7
0,1
0,72
0
3,88%
09048
15/06/09
3,8
29/06/11
0,7
3,1
< 0,50
0
2,91%
09052
18/06/09
7,4
23/01/12
44,9
37,5
0,66
1
3,86%
09054
26/06/09
3,8
17/12/13
1,7
2,1
< 0,50
0
5,23%
09056
29/06/09
9,6
09/02/10
9,6
0,0
< 0,50
1
2,10%
09061
15/07/09
41,6
30/08/10
37,7
3,9
1,36
0
9,38%
09063
22/07/09
14,7
28/06/10
78,8
64,1
< 0,50
1
0,90%
09064
13/08/09
24,6
03/05/10
25,0
0,4
< 0,50
2
16,57%
09073
28/08/09
42,5
14/03/11
96,6
54,1
< 0,50
9
2,54%
09076
07/09/09
17,8
30/05/11
40,0
22,2
0,51
15
4,01%
09078
07/09/09
0,0
05/07/11
0,5
0,5
< 0,50
0
4,13%
09085
16/09/09
42,6
22/04/10
42,6
0,0
< 0,50
2
0,00%
09094
21/10/09
8,5
16/04/12
9,0
0,5
0,62
16
4,27%
09102
30/11/09
3,7
24/12/10
3,8
0,1
0,92
3
1,32%
09106
26/11/09
16,9
27/07/12
9,60
7,3
0,66
5
4,92%
09111
16/12/09
22,4
10/10/11
21,2
1,2
< 0,50
9
5,19%
10001
06/01/10
31,3
14/09/11
34,8
3,5
< 0,50
2
3,68%
10004
16/06/11
20,9
24/01/13
20,9
0,0
< 0,50
23
3,58%
10006
08/01/10
4,0
24/09/10
3,7
0,3
1,21
9
1,04%
10009
15/01/10
77,2
20/03/12
42,9
34,3
< 0,50
0
2,48%
10013
10/03/10
16,6
26/01/12
10,5
6,1
< 0,50
22
25,25%
10016
16/02/10
17,0
03/10/11
17,5
0,5
0,78
3
2,29%
10017
18/02/10
35,1
02/12/10
54,7
19,6
0,75
5
3,89%
10031
19/04/10
21,5
11/09/12
21,2
0,3
1,87
2
10,38%
10032
19/04/10
9,6
20/10/11
21,2
11,6
0,52
0
2,80%
10033
22/04/10
27,8
02/02/12
27,8
0,0
< 0,50
0
1,69%
10036
12/05/10
42,0
17/10/11
46,0
4,0
< 0,50
5
2,73%
10041
03/06/10
9,6
26/03/12
35,3
25,7
< 0,50
0
2,87%
10046
14/06/10
3,9
30/03/12
3,8
0,1
0,78
0
2,42%
10050
24/06/10
23,4
18/04/11
23,4
0,0
< 0,50
0
0,25%
10051
24/06/10
76,0
19/07/13
76,0
0,0
1,32
4
2,23%
10056
15/07/10
50,9
25/10/11
50,9
0,0
< 0,50
1
1,69%
10057
07/07/10
43,0
12/07/13
60,9
17,9
< 0,50
11
5,26%
10060
27/07/10
56,3
25/03/11
43,2
13,1
< 0,50
0
1,17%
10065
05/08/10
50,5
23/03/11
44,2
6,3
< 0,50
5
2,43%
10069
13/09/10
32,7
06/09/11
48,0
15,3
< 0,50
1
2,30%
10080
22/09/10
38,8
11/04/11
65,7
26,9
< 0,50
2
1,93%
10103
16/11/10
8,5
05/07/13
5,7
2,8
< 0,50
2
7,21%
10106
03/11/10
74,4
15/11/12
89,3
14,9
0,86
1
1,66%
10114
20/12/10
35,6
07/06/13
41,3
5,7
0,83
0
2,66%
10117
23/12/10
1,7
28/06/12
1,7
0,0
0,57
0
1,16%
11002
18/01/11
86,2
13/01/12
57,0
29,2
< 0,50
13
6,19%
11012
23/02/11
32,0
21/02/13
16,4
15,6
0,69
0
2,37%
11014
04/03/11
96,5
01/10/13
23,4
73,1
0,52
26
3,67%
11020
14/02/12
57,1
19/02/13
79,5
22,4
< 0,50
0
1,48%
11022
08/04/11
7,4
12/03/12
7,4
0,0
< 0,50
0
1,18%
11026
02/05/11
74,3
15/04/13
54,7
19,6
< 0,50
0
3,77%
11028
18/05/11
36,9
02/10/13
49,2
12,3
< 0,50
1
3,25%
11032
23/05/11
41,2
05/11/12
41,2
0,0
< 0,50
2
0,62%
11033
23/05/11
41,2
05/03/12
41,2
0,0
< 0,50
7
1,39%
11043
01/07/11
6,8
12/04/13
4,0
2,8
0,56
0
1,83%
11044
06/07/11
49,0
02/10/13
50,6
1,6
< 0,50
19
4,82%
11054
25/07/11
42,3
12/09/13
48,4
6,1
< 0,50
4
3,57%
11063
25/08/11
17,3
24/02/12
44,8
27,5
< 0,50
7
2,11%
11066
24/08/11
79,5
29/03/13
77,1
2,4
1,18
8
1,31%
11073
14/09/11
38,8
12/04/12
23,4
15,4
< 0,50
56
15,62%
11075
23/09/11
96,5
18/07/12
98,0
1,5
< 0,50
4
0,61%
11077
27/09/11
44,8
17/07/12
38,0
6,8
< 0,50
0
1,20%
11090
27/10/11
11,1
27/09/12
13,0
1,9
0,74
0
1,00%
11093
18/11/11
72,8
16/10/13
72,8
0,0
< 0,50
0
1,09%
11098
28/11/11
79,9
27/05/13
74,9
5,0
1,45
11106
09/12/11
16,6
09/10/12
11107
26/03/12
61,1
24/01/13
12018
07/03/12
29,7
12019
19/03/12
12028
10
1,90%
11,5
5,1
< 0,50
2
0,75%
89,3
28,2
0,78
0
0,54%
13/05/13
29,7
0,0
0,65
1
0,72%
1,7
03/07/13
0,7
1,0
< 0,50
11
11,24%
12/04/12
10,1
17/07/13
5,3
4,8
< 0,50
0
2,13%
12031
18/04/12
44,2
11/12/12
41,7
2,5
0,98
0
1,56%
12047
13/06/12
22,0
12/08/13
38,0
16,0
0,83
1
1,12%
12074
06/08/12
59,2
09/08/13
47,8
11,4
< 0,50
1
4,36%
12087
04/09/12
41,3
24/04/13
43,6
2,3
< 0,50
0
1,56%
12090
07/09/12
9,0
22/07/13
14,7
5,7
< 0,50
3
1,90%
12093
19/09/12
45,5
18/09/13
45,5
0,0
< 0,50
5
0,90%
12116
31/10/12
63,4
28/08/13
24,6
38,8
< 0,50
0
1,21%
II. Tabel gerangschikt volgens aantal mengsels in de PR-RT sequentie Nr.
Patiënt ID
Aantal mengsels PR-RT
1
11073
56
34
09014
3
67
09002
0
2
07022
33
35
09102
3
68
09011
0
3
11014
26
36
10016
3
69
09013
0
4
10004
23
37
12090
3
70
09023
0
5
10013
22
38
05063
2
71
09025
0
6
11044
19
39
06026
2
72
09043
0
7
06042
17
40
08042
2
73
09047
0
8
09094
16
41
09022
2
74
09048
0
9
09076
15
42
09027
2
75
09054
0
10
11002
13
43
09038
2
76
09061
0
11
10057
11
44
09064
2
77
09078
0
12
12019
11
45
09085
2
78
10009
0
13
11098
10
46
10001
2
79
10032
0
14
08072
9
47
10031
2
80
10033
0
15
09073
9
48
10080
2
81
10041
0
16
09111
9
49
10103
2
82
10046
0
17
10006
9
50
11032
2
83
10050
0
18
07032
8
51
11106
2
84
10060
0
19
11066
8
52
08095
1
85
10114
0
20
07062
7
53
09020
1
86
10117
0
21
11033
7
54
09037
1
87
11012
0
22
11063
7
55
09052
1
88
11020
0
23
09046
5
56
09056
1
89
11022
0
24
09106
5
57
09063
1
90
11026
0
25
10017
5
58
10056
1
91
11043
0
26
10036
5
59
10069
1
92
11077
0
27
10065
5
60
10106
1
93
11090
0
28
12093
5
61
11028
1
94
11093
0
29
09042
4
62
12018
1
95
11107
0
30
10051
4
63
12047
1
96
12028
0
31
11054
4
64
12074
1
97
12031
0
32
11075
4
65
07046
0
98
12087
0
33
04091
3
66
08066
0
99
12116
0
Nr.
Patiënt ID
Aantal mengsels PR-RT
Nr.
Patiënt ID
Aantal mengsels PR-RT
III. Tabel gerangschikt volgens grootte in stijging van virale lading Nr.
Patiënt ID
Grootte VL stijging (log)
Nr.
Patiënt ID
Grootte VL stijging (log)
Nr.
Patiënt ID
Grootte VL stijging (log)
1
08095
2,19
34
11043
0,56
67
10033
< 0,50
2
10031
1,87
35
06042
0,53
68
10036
< 0,50
3
11098
1,45
36
10032
0,52
69
10041
< 0,50
4
09061
1,36
37
11014
0,52
70
10050
< 0,50
5
10051
1,32
38
09023
0,51
71
10056
< 0,50
6
10006
1,21
39
09076
0,51
72
10057
< 0,50
7
11066
1,18
40
05063
< 0,50
73
10060
< 0,50
8
09020
1,07
41
07032
< 0,50
74
10065
< 0,50
9
12031
0,98
42
07046
< 0,50
75
10069
< 0,50
10
07022
0,97
43
07062
< 0,50
76
10080
< 0,50
11
09102
0,92
44
08066
< 0,50
77
10103
< 0,50
12
08042
0,88
45
09002
< 0,50
78
11002
< 0,50
13
10106
0,86
46
09011
< 0,50
79
11020
< 0,50
14
10114
0,83
47
09014
< 0,50
80
11022
< 0,50
15
12047
0,83
48
09022
< 0,50
81
11026
< 0,50
16
06026
0,82
49
09027
< 0,50
82
11028
< 0,50
17
10016
0,78
50
09037
< 0,50
83
11032
< 0,50
18
10046
0,78
51
09038
< 0,50
84
11033
< 0,50
19
11107
0,78
52
09042
< 0,50
85
11044
< 0,50
20
10017
0,75
53
09043
< 0,50
86
11054
< 0,50
21
11090
0,74
54
09048
< 0,50
87
11063
< 0,50
22
04091
0,72
55
09054
< 0,50
88
11073
< 0,50
23
09047
0,72
56
09056
< 0,50
89
11075
< 0,50
24
09046
0,70
57
09063
< 0,50
90
11077
< 0,50
25
11012
0,69
58
09064
< 0,50
91
11093
< 0,50
26
09052
0,66
59
09073
< 0,50
92
11106
< 0,50
27
09106
0,66
60
09078
< 0,50
93
12019
< 0,50
28
12018
0,65
61
09085
< 0,50
94
12028
< 0,50
29
08072
0,62
62
09111
< 0,50
95
12074
< 0,50
30
09094
0,62
63
10001
< 0,50
96
12087
< 0,50
31
09013
0,60
64
10004
< 0,50
97
12090
< 0,50
32
09025
0,59
65
10009
< 0,50
98
12093
< 0,50
33
10117
0,57
66
10013
< 0,50
99
12116
< 0,50
IV. Tabel gerangschikt volgens nucleotidenverschillen V3 sequenties Nr.
Patiënt ID
Verschil V3 sequenties
Nr.
Patiënt ID
Verschil V3 sequenties
Nr.
Patiënt ID
Verschil V3 sequenties
1
10013
25,25%
34
09047
3,88%
67
10080
1,93%
2
09022
21,29%
35
09052
3,86%
68
12090
1,90%
3
08095
20,31%
36
11026
3,77%
69
11098
1,90%
4
09027
17,39%
37
10001
3,68%
70
11043
1,83%
5
09064
16,57%
38
11014
3,67%
71
10056
1,69%
6
11073
15,62%
39
10004
3,58%
72
10033
1,69%
7
12019
11,24%
40
11054
3,57%
73
10106
1,66%
8
10031
10,38%
41
09002
3,44%
74
12087
1,56%
9
09061
9,38%
42
08066
3,41%
75
12031
1,56%
10
10103
7,21%
43
11028
3,25%
76
11020
1,48%
11
09023
7,18%
44
07032
3,08%
77
11033
1,39%
12
04091
6,50%
45
09048
2,91%
78
09102
1,32%
13
11002
6,19%
46
10041
2,87%
79
11066
1,31%
14
06026
5,49%
47
09014
2,81%
80
12116
1,21%
15
09011
5,45%
48
10032
2,80%
81
11077
1,20%
16
08072
5,33%
49
05063
2,78%
82
11022
1,18%
17
10057
5,26%
50
10036
2,73%
83
10060
1,17%
18
09054
5,23%
51
10114
2,66%
84
09042
1,16%
19
09111
5,19%
52
09046
2,58%
85
10117
1,16%
20
09038
5,15%
53
09073
2,54%
86
12047
1,12%
21
06042
5,08%
54
07062
2,52%
87
11093
1,09%
22
08042
5,00%
55
10009
2,48%
88
10006
1,04%
23
09025
5,00%
56
10065
2,43%
89
11090
1,00%
24
09106
4,92%
57
10046
2,42%
90
09063
0,90%
25
11044
4,82%
58
11012
2,37%
91
12093
0,90%
26
07046
4,44%
59
10069
2,30%
92
11106
0,75%
27
12074
4,36%
60
10016
2,29%
93
12018
0,72%
28
09094
4,27%
61
09013
2,23%
94
11032
0,62%
29
09043
4,14%
62
10051
2,23%
95
11075
0,61%
30
09078
4,13%
63
12028
2,13%
96
11107
0,54%
31
07022
4,08%
64
11063
2,11%
97
10050
0,25%
32
09076
4,01%
65
09020
2,11%
98
09037
0,22%
33
10017
3,89%
66
09056
2,10%
99
09085
0,00%
V. Tabel geranschikt volgens verschil in FPR (%) tussen de V3 sequenties Nr.
Patiënt ID
Verschil FPR (%) in abs. waarde
Nr.
Patiënt ID
Verschil FPR (%) in abs. waarde
Nr.
Patiënt ID
Verschil FPR (%) in abs. waarde
1
11014
73,1
34
09014
11,5
67
11090
1,9
2
09063
64,1
35
12074
11,4
68
11044
1,6
3
07046
56,9
36
09043
11,3
69
08042
1,5
4
09073
54,1
37
06042
10,2
70
11075
1,5
5
07022
45,4
38
07032
9,1
71
09027
1,3
6
07062
41,7
39
09106
7,3
72
09111
1,2
7
05063
39,4
40
11077
6,8
73
09002
1
8
12116
38,8
41
09038
6,7
74
12019
1
9
09052
37,5
42
09020
6,4
75
09078
0,5
10
09022
34,6
43
10065
6,3
76
09094
0,5
11
10009
34,3
44
10013
6,1
77
10016
0,5
12
04091
31,3
45
11054
6,1
78
09064
0,4
13
11002
29,2
46
09023
6,1
79
10031
0,3
14
11107
28,2
47
12090
5,7
80
10006
0,3
15
11063
27,5
48
10114
5,7
81
10046
0,1
16
10080
26,9
49
09011
5,5
82
09047
0,1
17
10041
25,7
50
09037
5,5
83
09102
0,1
18
11020
22,4
51
06026
5,2
84
09013
0
19
09076
22,2
52
11106
5,1
85
09042
0
20
10017
19,6
53
11098
5
86
09056
0
21
11026
19,6
54
12028
4,8
87
09085
0
22
10057
17,9
55
08072
4,4
88
10004
0
23
08066
16,4
56
10036
4
89
10033
0
24
12047
16
57
09061
3,9
90
10050
0
25
11012
15,6
58
10001
3,5
91
10051
0
26
11073
15,4
59
09048
3,1
92
10056
0
27
10069
15,3
60
10103
2,8
93
10117
0
28
10106
14,9
61
11043
2,8
94
11022
0
29
09025
14,1
62
12031
2,5
95
11032
0
30
10060
13,1
63
11066
2,4
96
11033
0
31
08095
12,6
64
12087
2,3
97
11093
0
32
11028
12,3
65
09046
2,1
98
12018
0
33
10032
11,6
66
09054
2,1
99
12093
0
VI. Fylogenetische boom van alle sequenties (20 patiënten samen), in het geheel weergegeven en opgesplitst in kwadranten
