HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ARI VE ARI ÜRÜNLERİ UYGULAMA VE ARAŞTIRMA MERKEZİ 16.08.2010 TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNY
Az organoszilikon kvaterner ammonium-klorid felszíni kötődése és antimikrobiotikus hatása az amerikai (nyúlós) költésrothadásra Kórokozó: Paenibacillus larvae
ÖSSZEFOGLALÁS Egy kvaterner aminosav tartalmú organoszilikon-só (Si-QAC) hidrolitikus terméke, a 3(trimethoxysilyl)-Propyldimethyloctadecyl ammonium klorid, antimikrobiotikus hatást gyakorolt mikroorganizmusok széles skálájára, miközben kémiai kötődést képezett különböző felületekkel. Ebben a tanulmányban ennek a kémiai anyagnak a hatásmechanizmusát vizsgáltuk az amerikai nyúlós költésrothadással (American Foulbrood AFB, kórokozó Paenibacillus larvae) kapcsolatban. Az AFB a mézelő méh (Apis mellifera L.) súlyos betegsége, amely a törökországi méhcsaládoknál gyakori, így gazdasági veszélyt jelent a török méhészeti ipar számára. A Si-QACot 28 különböző helyi Paenibacillus larvae baktériumtörzsön vizsgáltuk, vegetatív és spóra formákon, valamint P. larvae ATCC 9545-referencia baktériumtörzsön. A Si-QAC (BeeGuard®)ot az isztambuli Nanotechnology Company állította elő. Az összes vizsgált baktériumtörzsetfolyékony táptalajon (Brain-Heart Broth Medium Sigma, 42gr/L) tenyésztettük ki, majd áthelyeztünk 0.1 mL-t (1x108 CFU/mL) MYPG közegbe. A kísérletet a vegetatív és spóra alakokon 4 részben végeztük: 1. P.larvae spóra/vegetatív beoltása BHB agar közegbe, amely korábban Si-QAC-kal volt kezelve. 2. Si-QAC hozzáadása a közeghez, majd száradás után beoltás P.larvae (spóra/vegetatív) – val. 3. P.larvae (spóra/vegetatív) beoltása BHB agar közegbe, amelyet előtte Si-QAC-kal permeteztek be. 4. Si-QAC permetezése a közegre, majd száradás után beoltás P.larvae (spóra/vegetatív) – val. Az eredmények azt mutatják, hogy a Si-QAC szignifikánsan gátolja a baktérium szaporodását in vitro körülmények között, valamint baktériumölő (baktericid) hatása van a P. larvae spórára is. A kiterjesztett vizsgálatokat zárkás kísérletekkel tettük teljessé hogy a toxicitás mértékét megállapítsuk. Nem volt észlelhető toxicitás a méheknél, melyek közvetlen vagy közvetett kapcsolatba kerültek a Si-QAC – kal. Ezt tartjuk e termék legfőbb erősségének.
BEVEZETÉS A méhészet egyike a legfontosabb mezőgazdasági ágazatoknak nemcsak a méz és méhészeti termékek termelése miatt, hanem az összes mezőgazdasági területet érintő beporzás miatt is. A mézelő méheket folyamatosan sok betegséget hordozó kórokozó veszélyezteti. Az amerikai nyúlós költésrothadás (American foulbrood, AFB) a mézelő méhek (Apis mellifera L.) súlyos betegsége. Előfordulása nagyon gyakori a törökországi méhcsaládoknál, ahogy világszerte máshol is. Az AFB alapvető veszélytényező a törők méhészeti ipar számára. Az AFB kórokozója a Paenibacillus larvae, egy spórás, gram-pozitív, mikroaerofil baktérium. A P. larvae járványos megbetegedést okozó kórokozó a méhcsaládoknál az egész világon (Ozkirim and Keskin, 2002). Ezt az organizmust könnyen ki lehet tenyészteni Törökország méhcsaládjainak ≤20%-ánál. A P. larvae spórák életben maradnak a nyers és a feldolgozott mézben és így terjednek a méhek téli beetetése során. Megtalálhatóak a lépviaszban is. A méhviaszt Törökország-szerte évenként összegyűjtik, és egy helyen dolgozzák föl, növelve a spórák terjedését. A családok megkapják a P.larvae spórákat az újonnan készült, nem fertőtlenített műlépekkel (Ozkirim and Keskin,2005). Éveken keresztül végeztek kutatásokat az antibiotikumok kiiktatásával alternatív gyógymódokat keresve az AFB kezelésére. Egyes iparágakban több mint egy évtizede használnak alkoxilánokat (alkoxysilane) kapcsolt közegként arra, hogy kívánt tulajdonságokat/paramétereket közvetítsenek vagy rögzítsenek különböző anyagokhoz. Számos enzim biológiailag aktív maradt miután alkoxilánokkal szervetlen felületekhez kötődött. Aktivitásuk folytonos maradt ismételt lemosás után is. A 3(trimethoxysilyl)-propyldimethyloctadecyl ammonium chloride (Si-QAC) egy alkoxyszilán csoport képviselője. A Si-QAC (BeeGuard®) – ot a Nanotechnology Company, Istanbul állította elő. E vegyület csoport aktivitási helyét több különböző kutató membrán jelenséghez kapcsolódóként írta le pl.: membrán lízis, membrán enzim inaktiváció, vagy ion transzport interferencia (Lawrence, 1968). A Si-QAC antimikrobiotikus hatása a membrán funkció megzavarásának tudható be, amit a töltéssel rendelkező kémiai anyag (quaternary ammonium chloride) magas koncentrációja okoz a szubsztráton, lehetséges sejt lízis által (Vetter et al., 2009). Ebben a tanulmányban a Si-QAC antimikrobiotikus hatásmechanizmusát vizsgáltuk a P. larvae – ra in-vitro és ketreces kísérletekben.
ANYAG-MÓDSZER Laboratóriumi kísérletek A Si-QAC-ot 28 különböző helyi Paenibacillus larvae baktériumtörzsön vizsgáltuk, vegetatív és spóra-vegetatív formákon, valamint P. larvae ATCC 9545-baktériumtörzsön (Table 1.). A Si-QACot az isztambuli Nanotechnology Company állította elő. Az összes vizsgált baktériumtörzset folyékony táptalajon (Brain-Heart Broth Medium Sigma, 42gr/l) tenyésztettük ki, majd áthelyeztünk 0.1 ml-t (1x108 CFU/ml) az agar közegbe. A kísérletet a vegetatív és spóra alakokon 4 részben végeztük: 1. P.larvae spóra/vegetatív beoltása agy-szív agar közegbe, amely korábban Si-QAC-kal volt kezelve. 2. Si-QAC hozzáadása a közeghez, majd száradás után beoltás P.larvae (spóra/vegetatív) – val. 3. P.larvae (spóra/vegetatív) beoltása agy-szív agar közegbe, amelyet előtte Si-QAC-kal permeteztek be. 4. Si-QAC permetezése a közegre, majd száradás után beoltás P.larvae (spóra/vegetatív) – val. A P. larvae minden törzsének vizsgálatához hármas csoportban voltak a Petri csészék felállítva, hogy a SI-QAC prevenciós működését a P. larvae mindhárom formáján vizsgálhassuk. A laboratóriumi kísérletek második fázisában a klasszikus antibiogram tesztet használtuk az antimikrobiotikus aktivitás inhibíciós zónájának mérésére. Steril abszorbens papírból készült, 3,5 cm átmérőjű antibiotikus korongokat használtunk. Az összes baktériumtörzset agyszövetből és szívizomzatból előállított folyékony táptalajon (BrainHeart Broth Medium Sigma, 42gr/l) tenyésztettük ki, majd áthelyeztünk 0.1 ml-t (1x108 CFU/mL) BHB agar közegbe (Sigma, 42gr/l). Miután beoltottuk 0.1 ml P. larvae bakteriális oldattal, a papír korongokat a Petri csészék közepére helyeztük, majd e korongok 0.5 ml Si-QAC oldatot abszorbeáltak. Az összes csészét 24 órán keresztül 37°C-on inkubáltuk. Táblázat 1. 28 helyi P. larvae baktériumtörzs Törökország különböző területeiről P. larvae törzs kód
Provincia
01/15
Adana
01/17
Adana
01/33
Adana
01/37
Adana
01/38
Adana
31/09
Hatay
31/28
Hatay
31/27
Hatay
31/08
Hatay
31/11
Hatay
01/41
Adana
48/38
Muğla
31/18
Hatay
48/35
Muğla
31/32
Hatay
01/29
Adana
48/07
Muğla
31/24
Hatay
31/02
Hatay
01/19
Adana
48/27
Muğla
01/23
Adana
31/26
Hatay
48/31
Muğla
01/40
Adana
31/21
Hatay
01/43
Adana
31/16
Hatay
9545
ATCC
Zárkás kísérletek Zárkánként 50 fiatal méhet használtunk a zárkás kísérletekben. Mielőtt a zárkákat használtuk SiQAC oldatot permeteztünk 10 ml Si-QAc / 200cm2 felület arányban a fa alapanyagú zárkák minden oldalfalára. 10 perc várakozási idő eltelte után 50 fiatal méhet helyeztünk a zárkákba. Összesen 20 zárkát használtunk, 10 zárka volt a kezeléses / kísérleti csoport, 10 zárka pedig kontrol csoportként szolgált. Ezeknél nem alkalmaztunk semmilyen kémiai anyagot, fertőtlenítőszert. A zárkákat 18 napon keresztül tartottuk megfigyelés alatt. A zárkákban lévő méheket naponta 5 ml cukorsziruppal és 3 g pollen lepénnyel etettük. Az elhullást regisztráltuk. A zárkás kísérletek célja a Si-QAC toxicitás méheknél való előfordulásának determinálása volt.
EREDMÉNYEK A laboratóriumi kísérletek eredményei A laboratóriumi kísérletek eredményei igazolják, hogy a Si-QAC szignifikáns antimikrobiotikus hatást gyakorol a P. larvae tenyészetek bármely (spóra, spóra-vegetatív, vegetatív) formájára. Az
eredmények statisztikai analizálását a One Way ANOVA és a Mann-Withney Test rendszerekkel végeztük. Ahhoz, hogy a Si-QAC P. larvae – ra gyakorolt megelőző/prevenciós hatásmechanizmusát mérni tudjuk, a Petri csészéket 1ml steril sóoldattal (0.9% NaCl) mostuk le majd steril vattával töröltük. Miután a baktériumtenyészetnek a sóoldatban lévő összes sejtjét a mikro-tubusba gyűjtöttük, a vattákat az oldatba tettük. Az oldatból kivettünk 0.1 ml-t, majd ismételten heamocytométeres sejtszámlálást végeztünk, hogy a baktériumok számának növekedését vagy csökkenését meghatározzuk (Figure1). (A számláláshoz használt heamocytometer, Figure 2. A baktériumszámlálásra használt területek, Figure 3. BHI Petri csészék a laboratóriumi kísérletekben) Kép 1. Neubauer heamocytometer Kép 2. A heamacytométer számláláshoz használt területei Kép 3. A Si-QAC gátló zónája a P. larvae spóra és vegetatív formáira (VK: Vegetatív Kontrol, V1, V2, V3: Si-QAC-al kezelt vegetatív forma: három ismételt kísérlet, SK: Spóra Kontrol, S1, S2, S3: Si-QAC-al kezelt spóra alak: három ismételt kísérlet) Táblázat 2. Sejtszámok a Si-QAC –al kezelt Petri csészékben (CFU/ml) P. larvae tenyészet Kód
Spóra alak
Spóra-vegetatív alak
Vegetatív alak
01/15
310
303
225
01/17
348
308
223
01/33
220
309
276
01/37
245
344
253
01/38
318
22
251
31/09
356
277
224
31/28
344
256
223
31/27
256
324
227
31/08
238
356
219
31/11
267
322
250
01/41
332
244
263
48/38
355
213
216
31/18
343
244
218
48/35
326
255
291
31/32
287
231
235
01/29
267
278
281
48/07
265
300
227
31/24
301
277
216
31/02
255
212
212
01/19
286
200
209
48/27
299
210
207
01/23
381
233
229
31/26
305
212
45
48/31
365
276
249
01/40
356
298
273
31/21
377
301
232
01/43
311
306
261
31/16
254
220
251
9545
201
225
183
99
99
99
All Strains (Median) % Csökkenés
% Csökkenés = Kontrol- minta / kontrol x 100
Zárkás kísérleti eredmények A zárkás kísérletek nem mutattak statisztikailag kimutatható eltérést a Si-QAC-al kezelt, és a kontrol zárkákban észlelt elhullási ráták között (One way ANOVA, Mann-Withney Test P≤0.005).
4. Kép: zárkás kísérlet Megfigyeléseink szerint a zárkánként elhelyezett 50 fiatal méh kb. 3,5 ml cukorszirupot és 1,8 g pollen lepényt fogyasztott el naponta. Két csoport összehasonlításának eredményei azt mutatták, hogy korreláció áll fenn minden adat között, és a Si-QAC-nak nincs toxikus hatása a mézelő méhekre (Table 2). Kép 1. A Si-QAC-al kezelt és a kontrol zárkák összehasonlítása Ki kell hangsúlyoznunk, hogy a Si-QAC a bakteriális szaporodást csak azokon a helyeken akadályozza csíraölő/biocid és biofizikai hatásmechanizmusával, ahova felhordták. Felületmegkötő és vízálló tulajdonságai miatt a Si-QAC-ot nem ajánlott közvetlenül lárvákra, vagy kifejlett méhekre juttatni. Másrészről az eredmények azt mutatják, hogy a Si-QAC-nak fontos szerepe lehet a P. larvae szaporodásának megakadályozásában, amely egyébkent képes a kaptárokban vagy a földben akár 30-100 évig fennmaradni. Habár akár egyetlen spóra önmagában is szaporodni képes, az AFB fertőzés kialakulásának esélyét csökkenti a Si-QAC használata a kaptárokban. Az organoszilikon anyagok prevenciós működésmechanizmusa a fa alakváltozásaival és a páratartalommal kapcsolatos problémákat is kedvezően befolyásolja (Vetter et al., 2009). Ez a Si-QAC gombásodást gátló hatását is sugallja a világon általánosan használt fa alapanyagú kaptároknál. A Si-QAC antimikrobiotikus hatását ismertette Walters et al 1973-ban.
FELHASZNÁLT IRODALOM Lawrence, C.A. (1968), Quaternary ammonium surface-active disinfectants. In disinfection, Sterilization and Preservation (C.A Lawrence and S.S Block, Eds.), pp.430-452. Lea and Febiger Philadelphia. Ozkirim, A., Keskin, N., (2002), Distribution of the major bacterial brood diseases diagnosed in Ankara and its surroundings, Mellifera, 2-4: 40-44. Ozkirim, A., Keskin, N., (2005), The Culture of Bacillus spp. From Comb Foundation, Hacettepe Journal of Biology and Chemistry, 34:37-41. Vetter, D. L., Bulcke, J. W. D., Imke D. W., Stevens, Acker, J. V.,(2009), Preventive Action of organosilicon treatments against disfigurement of wood under laboratory and outdoo conditions, International Biodeterioration and Biodegrradation, 63 : 10931101.
Analysed and written by Dr. Aslı Özkırım Hacettepe University Bee Health Laboratory Beytepe-Ankara-TURKEY Phone:00 90 312 297 80 43 Fax: 00 90 312 299 20 28 e-mail:
[email protected] Dr. Aslı Özkırım Assoc. Director of Bee and Bee Product Research and Application Center (HARUM) www.harum.hacettepe.edu.tr
