Gyors DNS alapú mangalica specifikus kimutatási rendszer kidolgozás a MANGFIELD projekt keretében
SZÁNTÓ-EGÉSZ RÉKA1, MOHR ANITA1, SIPOS RITA1, MICSINAI ADRIENN1, KOPPÁNYNÉ SZABÓ ERIKA2, JÁNOSI ANNA2, ANTON ISTVÁN3, RÁTKY JÓZSEF3 ZSOLNAI ATTILA3 1Biomi
Biotechnológai Szolgáltató Kft. 2Központi Környezet- és Élelmiszer-tudományi Kutatóintézet 3Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet 2100 Gödöllő, Szent-Györgyi Albert út 4.
[email protected], www.biomi.hu
Mi is az a Mangalica? •Őshonos magyar sertés fajta •Eredete az Osztrák –Magyar Monarchia idejére tehető – 1830-as évek •Ellenálló fajta, nagy zsírtömeggel
Szőke mangalica
Vörös mangalica
Fecskehasú mangalica
A projekt célkitűzése
Egy olyan kimutatási rendszer kifejlesztése, amit mindenhol alkalmazni lehet insitu, ahol szükségessé válik meghatározni, hogy az adott sertés mangalica-e vagy a hústermék tartalmaz-e a mangalica összetevőt.
Alkalmazott módszerek
TwistDX kit – izometriális DNS kimutatási módszer
Milenia HybriDetect – gyors és univerzális detektálási módszer
Optimalizálás eredménye TwistDX reakció összetétele Vegyszer
Bemért mennyiség
Primer A (10 µM) Primer B (10 µM) Próba (10 µM) Puffer Víz MgAc (280mM) Templát DNS (10 ng/µl)
2,1 µl 2,1 µl 0,6 µl 29,5 µl 12,2 µl 2,5 µl 1 µl
Termosztálási protokoll 39°C-on 30 perces termosztálás
Kimutatás – Milenia HybriDetect
Negatív eredmény
Pozitív eredmény
Specificitás vizsgálata
Sertés
Vizsgált fajta neve
Mintaszám
Vizsgált fajta neve
Mintaszám
Mangalica
64 db
64
szója
1 db
0
F1 (MangalicaxDuroc)
18 db
18
Kukorica
1 db
0
Pietrain
12 db
0
Rizs
1 db
0
Hampshire
12 db
0
Bors
1 db
0
Nagyfehér
12 db
0
Fokhagyma
1 db
0
H39xNagyfehér
36 db
0
Kömény
1 db
0
Zeller
1 db
0
Csicseriborsó
1 db
0
Dió
1 db
0
Cukorrépa
1 db
0
Bab
1 db
0
Mák
1 db
0
Repce
1 db
0
Rozs
1 db
0
Nagyfehér x Magyar Lapáj
Egyéb állat
12 db
Pozitív eredmény
0
Vaddisznó
2 db
0
Ló
1 db
0
Házi tyúk
2 db
0
Pulyka
1 db
0
Kacsa
1 db
0
Lúd
1 db
0
Szarvas
1 db
0
Szarvasmarha
1 db
0
Növények
Pozitív eredmény
Kimutathatósági tartomány Hígítás mértéke
Kópiaszám Kimutathatóság
1x
2900
pozitív
2x
1450
pozitív
4x
725
pozitív
8x
362
pozitív
16x
181
pozitív
32x
90
pozitív
40x
72
pozitív
50x
58
pozitív
58x
50
pozitív
64x
45
negatív
Vizsgálat reprodukálhatósága
1. felhasználó 1
2
3
4
5
6
7
2. felhasználó
1
2
3
4
5
6
7
Feldolgozott termékek tesztelése 1. Izolálási mód kiválasztása a vizsgálati eredmény reprodukálhatóságának figyelembe vételével történt • 2g mintához 0,5 M
• • • •
Tesztelt izolálási mószerek: Nátrium hidroxidos előkészítés WizardDNS izolálási módszer Chelex gyanta DNArelasy izolálás
1
2
3
4
5
6
7
NaOH oldatot adtunk 100°C-on 5 perc adunk •• 300mg mintához termosztálás extarháló puffert, • 2g mintához adunk • EDTA-t, 5 perc hűtés NaCl-ot,100 protChelex •• 10%-os 100mg mintához adunk 0,5M HCl oldattal K-át, guanidingyantát DNAreleasy oldat semlegesítettük hidroklorid-ot •• 100°C-on 5 perc speciális termosztátban 2 perc után felülúszóból •• termosztálás 55°C-on 3 óra → 65°C-5 perc, 96°C-5 vettünk mintát termosztálás perc, 20°C 5 perc • 10 perc centrifugálás Az oldata viszkózussá •Előnye, mintát felülúszóból hogy előzetesen • Felülúszó Wizard Clean kaptunk vált, alkalmatlan a up oszlopon tisztítás nem homogenizált feldolgozásra • további E-velmintánál oldjuk le is aza Aoszlopról mintastruktúra jól a DNS-t mátrixstruktúra felbomlik.
oldódik, hátránya az Az izolált DNS nem ára. és Hosszú hozta az elvárt eszközigényes eredményt.
1-2: Nyers mangalica hús, 3-4: Mangalicát tartalmazó kolbász, 5-6: Mangalicát tartalmazó párizsi, 7-NTC
Feldolgozott termékek tesztelése 2. Kimutathatósági határ tesztelése Párizsi: 0%, 20%, 50%, 70%, 100% Kolbász: 0%, 20%, 50%, 70%, 100% Különböző mangalica tartalmú párizsik vizsgálata Különböző mangalica tartalmú kolbászok vizsgálata
1 1
2
3
4
5
2
3
4
5
6
6 1-0%; 2-20%; 3-50%; 4-70%; 5-100%; NTC
1-0%; 2-20%; 3-50%; 4-70%; 5-100%; NTC
A módszer validálása - Körvizsgálat eredményei • A körvizsgálatban 3, egymástól független, laboratórium vett részt • A körvizsgálat tárgya 9 db feldolgozott húsipari termékben a mangalica jelenlét meghatározása Körvizsgálatban alkalmazott minták és azok eredményei Minta típusa Hús Hús Hús Párizsi Párizsi Párizsi Kolbász Kolbász Kolbász
Mangalica tartalom (%)
Pozitivitásra kapott %-os eredmény
70
100
50
100
20
100
70
100
50
66
20
66
70
100
50
100
20
100
Összefoglalás
Sikerült egy olyan mangalica kimutatásra alkalmas rendszer kifejleszteni, amely: • • • • •
gyors megbízható olcsó nem igényel nagy laboratóriumi hátteret szinte bármely helyszínen alkalmazható
A MANGFIELD projekt a Vidékfejlesztési Minisztérium támogatásával valósulhatott meg, ÁHT azonosító: 334740
Köszönöm megtisztelő figyelmüket!
