Mangalica specifikus DNS alapú módszer kifejlesztés és validálása a MANGFOOD projekt keretében Szántó-Egész Réka1, Mohr Anita1, Sipos Rita1, Dallmann Klára1, Ujhelyi Gabriella2, Koppányné Szabó Erika2, Jánosi Anna2, Zsolnai Attila3, Egerszegi István3, Anton István3, Tóth Gábor4, Molnár János1, Stéger Viktor4, Marincs Ferenc4, Tóth Péter5, Rátky József3, Szigeti Tamás6, Micsinai Adrienn1 Biotechnológai Szolgáltató Kft. Környezet- és Élelmiszer-tudományi Kutatóintézet 3Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet 4Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont 5Olmos és Tóth Kft. 6WESSLING Hungary Kft. 1Biomi
2Központi
A projekt céljai: Elsődleges cél: - Egy diagnosztikai rendszer kifejlesztése és validálása mangalica minőségi és mennyiségi kimutatására élelmiszeripari termékekből
Másodlagos cél: -Mangalica biobank kiépítése -A mangalica állomány széleskörű genomikai feltérképezése -Genetikai markerek keresése -A zsír kémiai összetételének vizsgálata -Az élelmiszer-ipar számára hasznos információk gyűjtése
MANGFOOD konzorcium
Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet
Olmos és Tóth Kft.
Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet
WESSLING Hungary Kft.
Központi Élelmiszertudományi Kutatóintézet
Biomi Kft.
Mangalica specifikus DNS alapú módszer kifejlesztés
Genomszekvenálási adatok
Több száz ígéretes lókusz Primerek tervezése az SNP-kre – elsődleges PCR szűrés Sanger szekvenálások 1 db mangalica specifikus gén Markergén
13 db sertés specifikus referenciagén PCR szűrés 1 db referenciagén V1 Referenciagén
V2 Referenciagén
Specifitás vizsgálat Vizsgált minták
Markergén
Referenciagén
mangalica sertés
pozitív
pozitív
F1 keresztezett egyedek (mangalica x egyéb sertés)
pozitív
pozitív
nem mangalica sertés
negatív
pozitív
vaddisznó
negatív
pozitív
egyéb állatfajok (szarvasmarha, őz, ló, rackajuh, vadnyúl, pulyka, házityúk, lúd, kacsa, fácán, lazac, magyar szürke)
negatív
negatív
egyéb növényfajok (búza, burgonya, szója, rizs, feketebors, fokhagyma, kömény, kukorica, repce, takarmány, zeller)
negatív
negatív
Real-time PCR TaqMan technika
Primer optimalizálás
QRT-PCR Optimalizálás
Próba optimalizálás Linearitás kimutatási tartomány Hatékonyság Szelektivitás Mérés megbízhatósága Mennyiségi mérések 8
V1 Referenciagén -- primer koncentrációjának kiválasztása 50x50
300x50
900x50
50x300
300x300
900x300
50x900
300x900
900x900
≥300 50x… 50x50
Kiválasztott primer koncentráció: Fw: 200 nM, Rv: 200 nM
9
V1 Referenciagén -- próba koncentráció kiválasztása 50 100 150
100-250
50
200 250
Kiválasztott próba koncentráció: 200 nm
V2 Referenicagén -- primer koncentrációjának kiválasztása
50x50
300x50
900x50
50x300
300x300
900x300
50x900
300x900
900x900
Kiválasztott primer koncentráció: Fw: 50 nM, Rv: 300 nM
50x300 50x900
300x50 900x50
V2 Referenciagén -- próba koncentráció kiválasztása 50 100 150
100-250
50
200 250
Kiválasztott próba koncentráció: 200 nm 12
Markergén -- Primer koncentráció kiválasztása 400x400 50x50
400x50
50x200
400x200
50x400
400x400
50x900
400x900
200x50
900x50
200x200
900x200
200x400
900x400
200x900
900x900
Kiválasztott primer koncentráció: Fw: 400 nM, Rv: 400 nM
50x50
Markergén -- Próba koncentráció kiválasztása 50 100 150
250 100-200 50
200 250
Kiválasztott próba koncentráció: 250 nM
V1 Referenciagén primerszett hatékonysága
-2,00
-1,50
-1,00
-0,50
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
200 ng
y = -3,522x + 32,175 R² = 0,9952
100 ng
50 ng
1 ng
0,1 ng
42,0 41,0 40,0 39,0 38,0 37,0 36,0 35,0 34,0 33,0 32,0 31,0 30,0 29,0 28,0 27,0 26,0 25,0 24,0 23,0 22,0 21,0 20,0 -2,50
0,01 ng
Ct értékek
Hatékonyság: E=92%
2,50
3,00
V2 Referenciagén primerszett hatékonysága
0,01 ng
200 ng
50 ng
y = -3,5181x + 32,134 R² = 0,9933
100 ng
1 ng
38,0 37,0 36,0 35,0 34,0 33,0 32,0 31,0 30,0 29,0 28,0 27,0 26,0 25,0 24,0 23,0 22,0 21,0 20,0
0,1 ng
Ct értékek
Hatékonyság: 41,0 40,0 E=92% 39,0
LOG Hígítás
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
SNP1-3 Linearitás
Markergén primerszett hatékonysága y = -3,4785x + 32,346 R² = 0,9933
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
LOG hígítás
1
1,5
200 ng
20 ng
2 ng
0,2 ng
0,02 ng
Ct ÉRTÉKEK
Hatékonyság: E=94%
42,0 41,0 40,0 39,0 38,0 37,0 36,0 35,0 34,0 33,0 32,0 31,0 30,0 29,0 28,0 27,0 26,0 25,0 24,0 23,0 22,0 21,0 20,0
2
2,5
Mangalica specifikus DNS alapú módszer validálása
A nemzetközi körvizsgálatban résztvevő laboratóriumok Résztvevő laboratóriumok Állami kutatólaboratórium Egyetemi kutatólaboratórium Független laboratórium Egyetemi kutatólaboratórium Független laboratórium Egyetemi kutatólaboratórium Állami kutatólaboratórium Állami kutatólaboratórium Állami kutatólaboratórium Hatósági laboratórium Állami kutatólaboratórium Egyetemi kutatólaboratórium Független laboratórium Független laboratórium
Real-Time PCR készülék
Ország
Rotor-Gene RG-3000
Magyarország
BioRad CFX96 ABI 7300 BioRad iCycle ABI StepOne Plus ABI 7000 ABI 7500 Eppendorf ABI 7500 ABI 7500 ABI 7900 ABI 7300 ABI 7500 ABI 7500
Magyarország Magyarország Magyarország Magyarország Magyarország Magyarország Magyarország Magyarország Magyarország Észtország Németország Németország Magyarország
Biztosított reagensek Markergén reverz primer Markergén forward primer Markergén próba
Ismeretlen minta jelölése U1 U2 U3 U4 U5
Referenciagén reverz primer Referenciagén forward primer Referenciagén próba
F1 (mangalicaxdurok) hús menyisége % 0 20 50 70 100
Standard (S1-S5) Nem mangalica sertéshús mennyisége % 100 80 50 30 0
Mangalica tartalom %
Termék
0 10 25 35 50
párizsi kolbász kolbász kolbász kolbász
Standard görbék statisztikai eredményei
Referenciagén
Markergén
Meredekség
Hatékonyság
R2
Meredekség
Hatékonyság
R2
Átlag (10)
-3,621
89,04%
0,997
-3,601
89,69%
0,997
Szórás
0,129
0,042
0,001
0,114
0,038
0,002
Mangalica tartalmak eltérését a várt értéktől
A megbízhatóság és reprodukálhatósági értékek alapján megállapítható, hogy az általunk kidolgozott, saját fejlesztésű mangalica-specifikus TaqMan alapú real-time PCR diagnosztikai rendszer a 0-50%-os mangalica tartalom tartományban minden adatpontban megfelel az elvárásoknak.
Köszönöm a megtisztelő figyelmet!
A MANGFOOD projekt a Nemzeti Innovációs Hivatal támogatásával valósulhatott meg, TECH_08 A3/2 2008 0405.
