Giliszta immunsejtek aktivációjának és lyseninexpressziójának vizsgálata
Doktori (PhD) értekezés
Opper Balázs
Pécsi Tudományegyetem, Klinikai Központ, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet
Doktori Iskola vezetője: Dr. Lénárd László egyetemi tanár Programvezető: Dr. Németh Péter egyetemi tanár Témavezetők: Dr. Németh Péter egyetemi tanár Dr. Engelmann Péter egyetemi adjunktus
Pécs, 2014
1
TARTALOMJEGYZÉK 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ............................................................................................. 4 2. BEVEZETÉS ......................................................................................................................... 5 2. 1. A veleszületett és az a adaptív immunitás kapcsolata az élővilágban ....................... 5 2. 2. A gilisztafajok immunrendszere ................................................................................... 6 2. 3. A kalciumion jelentősége a gerinctelenek és a gerincesek immunválaszában ....... 11 2. 4. Mitogének gerinctelen immunsejtek osztodására gyakorolt hatása ....................... 12 2. 5. Humorális faktorok szerepe a giliszták immunválaszában .................................... 13 3. CÉLKITŰZÉSEK ............................................................................................................... 16 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ......................................................................................... 17 4. 1. Vegyszerek .................................................................................................................... 17 4. 2. Coelomasejtek izolálása............................................................................................... 17 4. 3. A sejtek feltöltése Ca2+-szenzitív fluoreszcens indikátorral ..................................... 18 4. 4. Coelomasejtek stimulálása, proliferációjuk vizsgálata PI festéssel.........................18 4. 5. Ca2+-ATPáz enzim citokémia ...................................................................................... 19 4. 6. Monoklonális anti-lysenin ellenanyag létrehozása....................................................20 4. 7. Giliszta coelomasejtek immuncitokémiai vizsgálata ................................................ 20 4. 8. Immunhisztokémiai és immunfluoreszcens vizsgálatok giliszta szöveteken .......... 22 4. 9. In vitro baktérium kezelés vizsgálata ......................................................................... 22 4. 10. Coelomasejt-lizátum készítése .................................................................................. 22 4. 11. Indirekt ELISA-vizsgálat anti-EFCC5 ellenanyaggal ............................................ 23 4. 12. Szendvics ELISA a-EFCC5 ellenanyag alkalmazásával ........................................23 4. 13. SDS-poliakrilamid gél elektroforézis és Western blot ............................................ 23 4. 14. Áramlási citometria FITC konjugált a-EFCC5 ellenanyaggal.............................. 24 4. 15. Az eredmények értékelése és statisztikai elemzése ................................................. 25
5. EREDMÉNYEK ................................................................................................................. 26 5. 1. E. fetida és A. caliginosa fajokból származó coelomasejt alcsoportok nyugalmi kalciumszintje .............................................................................................................. 26 5. 2. Ionofór kezelés hatása coelomasejt alcsoportok kalciumszintjére .......................... 27 5. 3. A PMA kezelés nem indukált kalcium mobilizációt a coelomasejt alcsoportokban ............................................................................................................ 31 5. 4. Giliszta coelomasejtek thapsigargin-szenzitív kaclium pumpái. ............................. 33 5. 5. Fitohemagglutinin Ca2+-mobilizáló hatása E. fetida coelomasejtekben .................. 36
2
5. 6. Bakteriális formil peptid intracelluláris kalciumszint emelkedést okoz a coelomasejtekben ........................................................................................................ 38 5. 7. Coelomasejtek sejtciklusának vizsgálata ................................................................... 39 5. 8. Izolált coelomasejtek lysenin expressziója ................................................................. 40 5. 9. Szabad chloragocyta sejtek lysenin expressziója ......................................................41 5. 10. Gram pozitív baktériumok lysenin termelést befolyásoló hatása ......................... 44
6. DISZKUSSZIÓ ................................................................................................................... 46 6. 1. Coelomasejtek intracelluláris kalciumszintjei ......................................................... 46 6. 2. Coelomasejtek Ca2+-influxának indukciója ionomycinnel és gátlása PMA-val ..... 46 6. 3. Ca2+-ATPáz aktivitás coelomasejtekben ................................................................... 49 6. 4. Fitohemagglutinin és fMLP coelomasejtek kalciumjelére gyakorolt hatása ......... 49 6. 5. Ismételt sejtizolálások és mitogénstimuláció hatása a coelomasejtek osztódására .................................................................................................................. 50 6. 6. A lysenin expressziója Eisenia coelomasejtekben és szövetekben ........................... 51 6. 7. In vitro baktérium kezelés befolyásolja a coelomasejtek által termelt lysenin mennyiségét ................................................................................................................. 52
7. KONKLUZIÓK .................................................................................................................. 53 8. ÖSSZEFOGLALÁS............................................................................................................ 54 9. IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................................... 55 10. A DOLGOZAT ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA .......................................................................................................................... 65 11. EGYÉB TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA ............................................. 65 12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .......................................................................................... 67 13. MELLÉKLETEK .............................................................................................................68
3
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACD A.U. BrdU BSA CCF CD CFA ConA DAPI DGNBP DMEM EDTA EFCC EGTA EP FITC fMLP HRP IFA LPS NK NL557 PAGE PAMP PBS PHA PI PMCA PRR PWM RIPA SDS SERCA TBS TG
Citrate-dextrose solution (citrát-dextróz oldat) arbitrary units 5-bromo-2-deoxyuridine (5-bromo-2-deoxiuridin) Bovine serum albumin (borjú szérum albumin) coeloma cytolitic factor (coeloma citolítikus faktor) cluster of differentiation complete Freund’s adjuvant (komplett Freund adjuváns) Concanavalin A 4’, 6- diamino-2-phenylindoline (4’,6- diamino-2-fenilindolin) Drosophila Gram-negative bacteria-binding protein (Drosophila Gram-negatív baktérium-kötő protein) Dulbecco’s Modified Eagle Medium Ethylenediamine tetraacetic acid (etiléndiamin-tetraecetsav) Eisenia fetida coelomocyte cluster Ethylen glycol tetraacetic acid (etilénglikol-tetraecetsav) Eiseniapore Fluorescein isothiocyanate (fluoreszcein izothiocianát) N- formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine(N-formil L-metionil L-leucil fenilalanin) Horseradish peroxidase (tormaperoxidáz) incomplete Freund’s adjuvant (inkomplett Freund adjuváns) Lipopolysaccharide (lipopoliszacharid) natural killer cells (természetes ölősejtek) NorthernLights 557 Fluorochrome (NorthernLights 557 fluorokróm) Polyacrylamide gel electrophoresis (poliakrilamid gél elektroforézis) pathogen-associated molecular pattern (patogén asszociált molekuláris mintázat) Phosphate Buffered Saline (foszfát pufferolt sóoldat) Phytohaemagglutinin A (fitohemagglutinin A) Propidium iodide (propidium-jodid) Plasma membrane Ca2+-ATPase (plazma membrán kalcium ATPáz) pattern recognition receptor (mintázatfelismerő receptor) Pokeweed mitogen radioimmunoprecipitation assay Sodium dodecyl sulfate (nátrium-dodecil-szulfát) sarcoplasmatic reticulum calcium transport ATPase (szarkoplazmatikus retikulum kalcium ATPáz) Tris-buffered saline thapsigargin
4
2. BEVEZETÉS 2.1. A veleszületett és az adaptív immunitás kapcsolata az élővilágban Az immunrendszer legfontosabb feladata az egyedi integritás fenntartása. A túlélés feltétele a kórokozók vagy a szervezet saját, de módosult struktúrái elleni folyamatos védekezés. A gerinctelen és a gerinces szervezetek immunrendszerének összehasonlító szemléletű vizsgálata napjainkban mind az alapkutatások fontos részét, mind az alkalmazott kutatás ígéretes területét képezik. Számos gerinctelen faj szerepet játszik a fertőző betegségek
terjesztésében,
parazitaként,
vagy
mezőgazdasági
kártevőként.
Más,
gazdaságilag kevésbé jelentős fajok fontos tagjai az ökoszisztémának, vagy értékes tápanyagforrásként szolgálnak. Immunrendszerük vizsgálata ezért gyakorlati jelentőséggel is bír az ellenük való védekezés, vagy éppen a védelmük és tenyésztésük szempontjából (Cooper és mtsai, 2002; Kvell és mtsai, 2007). A gerinctelen fajok veleszületett, azaz nem antigén-specifikus immunitásának tanulmányozása jelentős tudományos eredményekhez vezetett a bonyolultabb felépítésű adaptív immunrendszerrel, klónspecifikus receptorokkal is rendelkező gerincesek esetében is. A fagocitózis folyamatát Mecsnyikov gerinctelen modellen végzett kísérletei alapján írta le, majd a későbbiekben a jelenség előfordulása igazolódott az adaptív immunrendszerrel rendelkező állatfajok esetében is (Cooper és mtsai, 2002). A gerinctelen állatmodellek vizsgálata napjainkban is jelentőséggel bír, mindemellett jövőbeni Drosophila modellen végzett tumorgenezis-kísérleteknek is nagy jelentőségük lehet (Neal és mtsai, 2011; Na és mtsai, 2013). Az adaptív immunrendszerrel nem rendelkező, gerinctelen állatfajok számos mechanizmust alkalmaznak szervezetük védelmére, pl. leukocyta jellegű immunsejteket, amelyek képesek immunprotektív molekulák szintézisére és szekréciójára. Ezek az immunsejtek sem morfológiai, sem pedig funkcionális szempontból nem egységesek. A veleszületett immunitás sejtes és molekuláris komponenseinek összehangolt rendszere teszi lehetővé az antimikrobiális peptidek termelését, a koagulációs, enkapszulációs, cytotoxikus és a fagocita funkció megvalósítását.
5
A lítikus hatású anyagok termelése már egysejtű élőlények esetében is megfigyelhető, pl. az Entamoeba histolytica fajban azonosították az ún. amoebapore polipeptidet, melynek lítikus hatásai a sertés cytotoxikus limfocitáiból ismert NK-lysinhez hasonlítanak (Leippe és mtsa, 1994). Ezzel a parazitával fertőzött betegek szervezetében az amoebapore ioncsatornákat képez a célsejtek membránjában, ami akár életveszélyes állapotot is előidézhet. További antibakteriális hatással rendelkező humorális faktorok megismerése az emlős szervezetekben lejátszódó kórfolyamatok jobb megértését teheti lehetővé. A hatékony veleszületett immunrendszer a kórokozók membránkomponenseit felismerő mintázatfelismerő receptorok (PRR) működésén alapul (Honti és mtsai, 2013). A receptorok jelátviteli útvonalakat aktiválnak, melyek végül gyulladásos mediátorokat, antimikrobiális peptideket és a fagocitózis elemeit kódoló géneket szabályoznak (Cooper és mtsai, 2002; Csikós és mtsai, 2009; Engelmann és mtsai, 2005). A gerinctelenek sejtes és szolúbilis faktorokból szerveződő veleszületett immunitása a saját-nem saját struktúrák elkülönítését, a károsodott saját struktúrák és külső antigének hatékony eliminálását biztosítja. Ezt a komplex immunrendszert számos, az evolúció során konzervált molekula és mechanizmus jellemzi az élővilágban, ezért a gerinctelen fajok immunrendszerének megértése fontos lépés a gerincesek immunitásának megismeréséhez is. Az emlősök szervezetében is a védelem első vonalában szerepelnek a veleszületett immunitás gyorsan aktiválódó komponensei, biztosítva a szervezet védelmét az adaptív immunitás lassabb aktivációjáig. A veleszületett immunitás részét képező antimikrobiális peptidek nagyban befolyásolhatják az adaptív immunitás antigénekre adott válaszát (Cooper és mtsai, 2002). 2.2. A gilisztafajok immunrendszere A gyűrűsférgek törzsébe (Annelida), a nyeregképzők osztályába (Clitellata) és a kevéssertéjűek alosztályába (Oligochaeta) sok eltérő megjelenésű gilisztafaj tartozik. A kisebb méretű fajok mindössze néhány centiméter hosszúságúak, a leghosszabbak elérhetik az egy méter körüli testhosszt is (1. és 2. kép).
6
1. kép L. terrestris (a) és L. castaneus (b) gilisztafajok egy-egy példánya. hindawi.com
2. kép Megascolides australis faj egy példánya. Fotó: Alan Yent/ Museumvictoria.com.au
3.kép A kísérleteinkhez használt Eisenia faj egy példánya.
A jelentős méretbeli különbségek ellenére a giliszták testfelépítése alapvetően hasonló (3 és 4. kép). A giliszta hosszúkás, hengeres teste homonóm szelvényekből épül fel. A giliszták testének külső felszínét nyálkás bőr fedi, ami összenőtt az alatta elhelyezkedő izomréteggel. Ezeket a rétegeket együttesen bőrizomtömlőnek nevezik, és fontos szerepe van az állatok mozgásában, légzőfunkcióiban, és érzékelésében. A kevéssertéjű gyűrűsférgek ősszájúak, háromszakaszos bélcsatornával rendelkeznek. Érdekesség, hogy zárt keringési rendszerrel rendelkeznek, ami egyedülálló a gerintelen állatfajok között. Vörös színű vérükben az oxigénszállító molekula a hemoglobin. A mezoderma tagolt, belőle számos szerv és szövet differenciálódik. A mezodermából alakul ki a valódi, másodlagos testüreg (ún. coeloma), mely hámmal bélelt. Ezt az üreget tölti ki a coelomafolyadék, melyben szabad immunsejtek és humorális komponensek is találhatók.
7
Veszély esetén a giliszták ezt a coelomafolyadékot bocsátják ki pórusaikon keresztül a környezetükbe.
4. kép A giliszták testfelépítését keresztmetszetben bemutató sémás rajz. http://www.esu.edu/~milewski/intro_biol_two/lab_10_platy_annelida_mol/Annelida.html
Az Oligochaeta alosztály számos tagját használják ökotoxikológiai, detoxifikációs és fémfelhalmozási kísérletekben. A gilisztafajok azután kerültek az összehasonlító immunológiai vizsgálatok előterébe, hogy transzplantációs (allo- és xenograft rejekciós) kísérletekkel sikerült bizonyítani immunrendszerük képességét a saját szövetek felismerésére (Cooper 1968, 1969, 1970). További érdekesség, hogy egy rövid távú immunológiai memória meglétét is próbálták igazolni ebben az állatcsoportban (Cooper, 1969b; Cooper és Roch, 1986). A
giliszták
immunrendszerének
celluláris
alkotóelemei
a
gerincesek
fehérvérsejtjeihez hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek, így képesek a fagocitózisra, sejtsejt kölcsönhatásokra és a lítikus folyamatokban való részvételre (Cooper, 1981; 1993). A gerinctelen állatok immunsejtjeire jellemző lítikus tulajdonságok jól vizsgálhatóak mikroorganizmusokat, vörösvértesteket vagy tumorsejteket célsejtekként felhasználó kísérleti rendszerekben (Cooper és mtsai, 1996; 1999).
8
A humorális és a sejtes elemek egymástól függetlenül vagy együttműködve is szolgálhatják a természetes immunitás folyamatait. A célsejt-immunsejt kapcsolatot igénylő folyamatoknál gyorsabb védelmet biztosítanak a coelomafolyadék lítikus hatású humorális faktorai, ezek termelése segíti az állatok túlélését a sokszor kedvezőtlen tulajdonságú, mikroorganizmusokat és szennyező anyagokat is tartalmazó talajban. Ez azonban csak egy aspektusa a giliszták immunvédelmének, és alapját a szolúbilis faktorokat termelő és szekretáló immunsejtek csoportjai képezik. A giliszták immunsejtjeit - a testüregükben előforduló úgynevezett coelomasejteketlítikus és fagocita folyamatok mediátorainak tartják. A coelomasejtek szerepét az immunitásban már korábbi munkákban is vizsgálták (Toupin és Lamoureux, 1976, Toupin és mtsai, 1977). Ezeket az immunsejteket ultrastruktúrájuk és citokémiai jellemzőik alapján több alcsoportba sorolták az elmúlt évtizedekben (Linthicum és mtsai, 1977; Stein és mtsai, 1977, Cossarizza és mtsai, 1996; Engelmann és mtsai, 2002). A kis coelomasejteket a cytotoxikus folyamatokért, a nagy coelomasejteket pedig a fagocitózisért tartották felelősnek (Cossarizza és mtsai, 1996). A sejtcsoportok további elkülönítéséhez elektronmikroszkópiát és áramlási citometriát használtak. A kis, elektrondenz coelomasejtek többféle emlős CD markerre (CD11a, CD45RA, CD45RO, CDw49B, CD54, CD90 (Thy-1), ß2m) specifikus ellenanyaggal mutattak keresztreakciót (Cooper és Mansour, 1989; Cooper és mtsai, 2002, Cossarizza és mtsai 1996; Roch és mtsai, 1983). Ezen immunsejtek hatékonyan lizálnak NK-szenzitív K562 célsejteket (Cossarizza és mtsai, 1996). A nagyobb méretű coelomasejtek negatívnak bizonyultak a fenti CD markerekre, nem kötődtek a K562 célsejtekhez sem, de fagocitózisra képesek voltak.
Klónspecifikus
receptorral
rendelkező
sejtek
előfordulása
a
gerinctelen
állatfajokban nem ismert, a cytotoxikus reakcióban természetes ölősejt-aktivitás játszhat szerepet. A giliszták hatékony természetes ölősejt-szerű lítikus aktivitása magyarázhatja a kialakuló malignus sejtek hatékony elpusztítását (Cooper és mtsai, 2002). Intézetünkben előállított, emlős konzervatív antigének (citokinek, peptidhormonok, enzimek) ellen termeltetett monoklonális ellenanyagok (a-Thy-1, a-CD24, a-TNF-α, aTSH, a-Cu/Zn SOD) felhasználásával is sikerült kimutatnunk keresztreakciókat a coelomasejtek két alpopulációjában (R1 és R2), míg a harmadik sejtcsoport (eleocyta, R3) konzekvensen negatívnak bizonyult (Engelmann és mtsai, 2002).
9
Más csoportosítás szerint granulált és hyalin coelomasejteket, továbbá szabad chloragocyta sejtcsoportot írtak le (Cooper és mtsai, 2002). Egyes tudományos közlemények szerint a coelomafolyadékban előforduló szabad chloragocyták (az úgynevezett eleocyták) végállapotú sejtek, melyek a középbelet körbevevő chloragogén szövetből származnak (Cholewa, 2006). Ez a sejttípus helyhez kötötten kezdi fejlődését, majd szabad sejtalakká válik. A giliszta immunsejttípusok pontosabb funkcionális elkülönítése, és giliszta coelomasejt CD markerek meghatározása (EFCC markerek, Engelmann és mtsai, 2005) érdekében monoklonális ellenanyagokat termeltettek a coelomasejtek ellen. A létrehozott ellenanyagok felhasználásával három coelomasejt alpopuláció különíthető el E. fetida gilisztában, melyek közül kettő effektor sejttípusként vesz részt az immunológiai folyamatokban (fagocitózis és enkapszuláció) (Engelmann és mtsai, 2005). A giliszták középbelének falát kívülről borító chloragogén szövetet felépítő chloragocyta sejtpopuláció funkcionális szempontból homológnak tekinthető a gerincesek máj sejtjeivel (Jamieson, 1981). A giliszták chloragocyta alcsoportját hozzák kapcsolatba bizonyos
lítikus
és
agglutinációs
hatással
rendelkező
molekulák
(hemolizinek)
termelésével, melyek közé olyan citolítikus faktorok tartoznak, mint a fetidinek, lyseninek és az eiseniapore (Eue és mtsai, 1998). Egyes szerzők szerint a chloragocyta sejtek elkülönült populációkra oszlanak: a perifériás chloragocyta sejtek a bélfalban, míg a centrális chloragocyta sejtek a typhlosolisban helyezkednek el (Ohta és mtsai, 2000). Ezek a sejtek tápanyagokat raktároznak (glikogént, lipideket), és általános anyagcsere folyamatok mellett szerepük lehet a hemoglobin, és fémeket kötő cisztein tartalmú proteinek (pl. metallothionein) termelésében is (Fischer, 1993; Morgan és mtsai, 2004). A chloragocyták autofluoreszcens sejtek, amit a chloragoszómáikban található riboflavin okozhat (Cholewa és mtsai, 2006). Korábbi in situ hibridizációs és poliklonális ellenanyagokkal végzett munkák a centrális chloragocyták lysenin expressziós szerepét valószínűsítették (Ohta és mtsai, 2000; Sekizawa és mtsai, 1996b). A szabad chloragocyták (ún. eleociták) a coelomaüreg granulált sejtcsoportja, eredetük ma is vita tárgya, valószínűleg a bél chloragogén szövetéből származnak. A szabad chloragocyta sejtek fagocita aktivitása a többi coelomocyta
10
sejtcsoporthoz képest elenyésző (Engelmann és mtsai, 2005), azonban fontos szerepük van az antimikrobiális anyagok termelésében (Cooper és mtsai, 2002). A nem-saját struktúrák felismerése valószínűleg számos, még nem teljesen felderített jelátviteli utat is aktiválhat a gilisztákban. 2.3. A kalciumion jelentősége a gerinctelenek és a gerincesek immunválaszában A kalciumionnak másodlagos hírvivőként számos sejttípus életfolyamatában van kiemelt szerepe (Carafoli, 2002, 2005). Az intracelluláris szabad kalciumszint szerepe emlősök jelátviteli útvonalaiban jól ismert (Case és mtsai, 2007; Langerbacher és Chen, 2008; Oh-Hora és Rao, 2008). A Ca2+-szint változása alapvető fontosságú az eukarióta sejtek aktivációjában és homeosztázisának fenntartásában (Case és mtsai, 2007): a kalciumionok kulcsszereplői az izomkontrakciónak (Panfoli és mtsai 1999), a reproduktív folyamatoknak (Whitaker, 2008), és az immunválasznak is (Oh-Hora és Rao, 2008; Vig és Kinet, 2009). Az élővilágban a kalciumszint változása plazmamembránhoz vagy sejtorganellumokhoz
kapcsolt
kalciumtranszporterek
és
ioncsatornák,
valamint
kalciumkötő fehérjék (pl. kalmodulin, kalmodulinszerű proteinek, kalcium-dependens protein-kinázok) által valósul meg (Batistic és Kudla, 2012). A kalciumcsatornákat potenciálváltozás vagy ligandok kötése aktiválhatja. A Ca2+-pumpák (Ca2+-ATPázok) előfordulhatnak
a
sejtek
plazmamembránjához
kapcsolódva
(PMCA),
vagy
az
endoplazmatikus, ill. szarkoplazmatikus retikulumhoz kötve (SERCA). A gerincesek veleszületett és adaptív immunrendszerében a sejtek aktivációja kalciumhoz köthető jelátviteli utakon keresztül valósulhat meg. Az intracelluláris kalciumszint kemotaxishoz,
emelkedése
számos
degranulációhoz,
immunológiai
fagocitózishoz,
folyamathoz citokinek
vezethet,
felszabadulásához
például vagy
proliferációhoz (Suzuki és mtsai, 2012). A gerinctelen fajok is hasonló evolúciósan konzervált biokémiai, jelátviteli mechanizmusokkal rendelkeznek (Crozatier és Meister, 2007). Irodalmi adatok utalnak arra, hogy a kalcium másodlagos hírvivőként rovar- és puhatestű fajok sejtjeinek intracelluláris jelátvitelében is szerepet játszik (Burlando és mtsai, 2001; Whitaker, 2006), illetve nehézfémek hatására pl. a kagyló hemocyták kalcium-homeosztázisa is megváltozott
11
(Marchi és mtsai, 2004; Viarengo és mtsai, 1993). A végrehajtott in vitro kísérleti eredmények azt sugallják, hogy a hemocyta sejtek citoszoljának kalciumszint emelkedése aktiválja a foszfolipáz A2 enzimet, ami a lizoszómák membránjának destabilizációjához vezet (Marchi és mtsai, 2004). Eisenia fetida gilisztákban azonosítottak egy evolúciósan konzervált kalciumkötő fehérjét, a kalretikulint. A protein számos sejt- és szövetféleség mellett a coelomasejtekben is expresszálódik (Kauschke és mtsai, 2001; Silerova és mtsai, 2007). 2.4. Mitogének gerinctelen immunsejtek osztódására gyakorolt hatása A mintázatfelismerő faktorok a kórokozókra jellemző molekuláris mintázatokat (PAMP) képesek megkötni. PAMP motívumként kerülnek felismerésre a Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok, valamint az élesztők számos sejtfalkomponense (pl. zymosan) is. A gerinces fajokkal végzett kísérletek alapján megállapították, hogy a különböző PAMP molekulák -mitogénként- képesek bizonyos sejttípusok proliferációját elősegíteni. Az LPS a monociták és makrofágok, illetve a limfociták poliklonális aktivációját okozza (Goodman és Sultzer 1979; Tough és mtsai, 1997), de beszámoltak már az LPS hatására létrejött nitrogén-monoxid termelés makrofágok proliferációját gátló hatásáról is (Vadiveloo és mtsai, 2001). Az egyik leggyakrabban alkalmazott mitogén a PMA, mely a protein-kináz C jelátviteli úton keresztül a sejtek aktivációját és proliferációját okozza (Ma és mtsai, 2009). A növényi lektinek közül a ConA és a PHA a legismertebb mitogén (Currie és mtsai, 2007; Fortier és mtsai, 2008). Gerinctelen modellállatok esetében korlátozott ismeretek állnak rendelkezésünkre a mitogének sejtosztódásra gyakorolt hatásairól. LPS és ConA hatására az Asterias rubens tengeri csillag coelomasejtjeinek száma megemelkedett (Holm és mtsai, 2008). PMA kezelést követően a Biomphalaria glabrata csigafaj osztódó hemopoetikus sejtjeinek aránya növekedett (Salamat és Sullivan, 2009). Az LPS és ConA apoptózist indukáló hatásáról is rendelkezünk adatokkal (Grant és mtsai, 1995). Eisenia fetida coelomasejtek osztódási képességét vizsgálva megfigyelték a szabad coelomasejtek proliferációs képességének növekedését ismételt antigénstimulust (arzénsav-
12
humán szérum albumin konjugátum) követően (Bilej és mtsai, 1992). Egy másik kísérletsorozat adatai szerint sejtizolálást követően áramlási citometria segítségével sikerült proliferáló
coelomasejteket
azonosítani
Dendrobaena
veneta
giliszták
coelomafolyadékában is (Homa és mtsai, 2008). 2.5. Humorális faktorok szerepe a giliszták immunválaszában A coelomasejtek a sejtes immunfolyamatok mellett a humorális folyamatokban is részt vesznek hemolítikus és antimikrobiális faktorok termelése révén (Bilej és mtsai, 2000; Cooper és mtsai, 2002). A coelomafolyadék fontos alkotóeleme a giliszták veleszületett immunválaszának, egyes szerzők szerint antigénkötő fehérjéket is tartalmazhat (Bilej és mtsai, 2000). A fetidin/lysenin fehérjecsalád a coelomafolyadék egyik központi összetevője. Az E. fetidában leírt fetidinek polimorf lipoproteinek, melyek antibakteriális és hemolítikus tulajdonságokkal rendelkeznek (Cooper és mtsai, 2002; Lasségues és mtsai, 1997), valamint a testfolyadék alvadási folyamatában (koaguláció) is részt vesznek. Korábbi vizsgálatok azt sugallják, hogy normál körülmények között a fetidinek a giliszták külső felszínén fordulnak elő, elkeveredve az állat teljes testfelszínét bevonó nyákkal, így egy nem specifikus barriert képeznek a környezet mikroorganizmusai számára (Cooper és mtsai, 2002). A fetidinek termelésében két független gén vesz részt. Vörösvértesteket célsejtekként használva két monomer fetidint azonosítottak, az egyik 40 kDa, a másik 45 kDa molekulatömegű. A klónozott 40 kDa tömegű fetidin szekvenciája tartalmaz egy peroxidáz motívumot, ami a faktor peroxidáz aktivitásáért felelős (Lasségues és mtsai, 1997). A rekombináns protein gátolta a Bacillus megaterium növekedését (Cooper és mtsai, 2002). Az E. fetida fajból izolált lysenin a fetidinekhez hasonló tulajdonságokkal rendelkezik. Ez a fehérje a sejtmembrán szfingomielin komponenseihez kötődik (Shogomori és Kobayashi, 2008), kísérletes körülmények között patkány simaizom kontraháló hatását is leírták (Sekizawa és mtsai, 1996a, Sekizawa és mtsai, 1997). Más lítikus faktorokhoz hasonló hemolítikus funkciójáról is beszámoltak (Cooper és mtsai, 2002). Gilisztaszövetekből származó RNS-sel végzett Northern blot analízis, illetve in situ
13
hibridizáció alapján valószínűsítették, hogy a lysenint nem a coelomaüregben, hanem a bélfalban található chloragogén sejtek termelik (Ohta és mtsai, 2000; Sekizawa és mtsai, 1996b). Ismertek a coelomafolyadékban előforduló, lyseninnel rokon fehérjék (lysenin related peptid 2 és a lysenin related peptid 3). Ezek képződési helye és pontos funkciója azonban még nem ismert. A lyseninnek és rokon vegyületeinek szerepe lehet a fizikai sérülést követően a giliszták coelomaüregébe kerülő kórokozók elleni védelemben (Cooper és mtsai, 2002; Kobayashi és mtsai, 2004; Bruhn és mtsai, 2006). A fetidin/lysenin proteincsalád tagjainak expresszióját befolyásoló mikrobiális hatások korábbi vizsgálatai alapján a fetidin in vitro bakteriális kezeléssel indukálható (Lasségues és mtsai, 1989). Későbbi in vivo E. coli és B. subtilis törzseket alkalmazó vizsgálatok nem igazoltak kimutatható fetidin mRNS szint emelkedést a coelomasejtek esetében, bár a coelomafolyadék összproteintartalma megnövekedett (Köhlerova és mtsai, 2004). Az előző kísérleteket kiegészítve, csökkent lysenin expressziót figyeltek meg E. coli O157:H7 törzzsel való kezelés után (Wang és mtsai, 2010). A lysenin expresszióját azonban a giliszták normál talajból kísérleti talajba történő áthelyezése is befolyásolhatja (Brulle mtsai, 2011). A hemolítikus faktorok kötődését a célsejtek membránjához ceramidrészből (például szfingomielinből) és hidrofil csoportból (foszforilkolin, galaktozil) felépülő szfingolipidek jelenléte teszi lehetővé. Felismerték, hogy a koleszterin fokozza a lítikus aktivitást a szfingomielin tartalmú lipid vezikulákkal szemben. A leghatékonyabb lízist akkor figyelték meg, amikor a vezikulák az emberi vörösvértestek felszíni lipid komponenseit modellezték (Cooper és mtsai, 2002; Lange és mtsai, 1999). Preparatív PAGE módszerrel sikerült izolálni az SDS-ben stabil H1 és H2 agglutinint, valamint egy két egységre hasadó (18 kDa és 21 kDa méretű) H3 agglutinint. A H1 és H2 agglutininek 56 oC hőmérsékleten elvesztik hemolítikus aktivitásukat, azonban a H3
protein
agglutinációs
hatása
továbbra
is
megfigyelhető.
Monospecifikus
antiszérumokkal, ezekből származó ellenanyagokkal, valamint szénhidrátokkal gátolva az agglutininek biológiai hatásait kiderült, hogy mindhárom faktor hasonló szerkezettel rendelkezik (Cooper és mtsai, 2002). A közelmúltban vált ismertté egy coelomasejtek által expresszált és a colomafolyadékban is előforduló, 42 kDa molekulatömegű protein, az ún. coeloma
14
citolítikus faktor (CCF). A CCF a mintázatfelismerő receptorok közé sorolható, szekvenciája az atlanti tőrfarkú rák (Limulus polyphenus) koagulációs faktor G molekulájával, és a selyemlepke (Bombyx mori) Gram-negatív baktériumkötő proteinjével mutat rokonságot (Cooper és mtsai 2002). Ez a különleges fehérje képes az élesztők és a Gram-negatív
baktériumok
sejtfalának
béta-1,3-glükán-,
N,N-diacetil-ketobióz-,
a
lipopoliszacharid O-antigén, illetve a Gram-pozítiv baktériumok muramil-dipeptid komponenseihez is kapcsolódni. Ezek felismerése egy szerin-proteáz rendszer, az ún. profenol-oxidáz kaszkád aktiválódásához vezet (Bilej és mtsai, 2001). Számos tanulmány rámutat, hogy a profenol-oxidáz rendszer kulcsszereplője a gerinctelen állatok immunrendszerének (Beschin és mtsai, 1998, 1999; Bilej és mtsai, 1998, 2001, 2006; Bloc és mtsai, 2002; Cerenius és mtsai, 2008). A profenol-oxidáz rendszer mediálja a sejtlízis és az opszonizáció folyamatát, valamint antimikrobiális anyagok felszabadulását, tehát a CCF molekulának az opszonizációban is szerepe van, ami a fagocitózis folyamatát megelőző esemény (Bilej és mtsai, 1995). A L. rubellus gilisztafajból azonosított, konstitutívan termelődő lumbricin I Grampozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben antimikrobiális hatással rendelkezik, azonban emberi vörösvértestekkel szemben nincs hemolítikus aktivitása. Prolinban gazdag fehérje, szekvenciája hasonlít a korábban felfedezett antimikrobiális peptidek szerkezetére, például az ízeltlábú fajokban leírt drosocinra és a PR39-re (Cooper és mtsai, 2002). A fetidin szekvenciája jelentős homológiát mutat a lysenin 1, lysenin 2 és lysenin 3 molekulákkal, de nincs számottevő homológiája a CCF és lumbricin I faktorokkal (Cooper és mtsai 2002). Szerin-proteázok közé tartozó enzimeket is azonosítottak E. fetida (Roch és mtsai, 1991) és L. terrestris (Kauschke és mtsai, 1997; Leipner és mtsai, 1993) fajokban. Affinitás kromatográfiát alkalmazva sikerült tisztítani egy 14 kDa méretű szerin-proteáz inhibítor monomert, aminek aminosavsorrendjében a növényi szerin-proteáz inhibítorok szerkezetével nagyfokú hasonlóságot mutató hidrofób rész is előfordul. Feltételezések szerint a szerin-proteáz enzimek szabályozó mechanizmusai kapcsolhatják össze a giliszták sejtes és humorális immunválaszának komponenseit (Cooper és mtsai, 2002). Rovarok hemolimfáját vizsgálva kiderült, hogy extracelluláris szerin-proteáz inhibítorok képesek gátolni intracelluláris proteolítikus enzimek aktivitását (Polanowski és mtsa, 1996).
15
3. CÉLKITŰZÉSEK A bevezetésben jeleztük, hogy fontos tisztázni a kalcium szerepét a giliszta immunrendszer működésében és az immunsejtek aktivációjában. Részleteiben nem ismert, hogy a coelomasejtek osztódásra képes sejtek-e vagy végállapotú differenciálódott sejtek illetve hogy a mitogének vagy ionofórok képesek-e bármilyen módon befolyásolni a giliszta immunsejtek kalciumszintjét. A gilisztafajok immunsejtjein végzett kísérleteinket az alábbi célokkal kezdtük meg: 1.
A giliszta coelomasejt alcsoportok nyugalmi intracelluláris kalciumszintjének
meghatározása. 2.
Ionofórok (ionomycin), valamint mitogének (növényi lektinek és lipopoliszacharid)
kalciumion-mobilizáló hatásának vizsgálata. 3.
Többféle mitogénstimulust és nyugalmi (regenerációs) periódust alkalmazva a
giliszták coelomaüregében in vivo osztódási fázisban lévő immunsejtek arányának tanulmányozása. A lysenin fehérjecsalád tagjai feltehetőleg fontos szerepet töltenek be a giliszták immunválaszában. Ezen fehérje termelődési helye és immunválaszban betöltött szerepe részleteiben még nem tisztázott. További kísérleteinkben a PTE KK Immunológiai és Biotechnológiai Intézetében létrehozott anti-lysenin monoklonális ellenanyagot használva céljaink között szerepelt: 4.
A lysenin sejtes és szöveti lokalizációjának térképezése.
5.
A szabad coelomasejtek baktérium expozíciót követő lysenin expressziós
változásainak nyomon követése.
16
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Vegyszerek Fitohemagglutininból
(PHA-P,
Sigma,
L1668,
St.
Louis,
MO,
USA),
lipopoliszacharidból (LPS, Sigma, L6529), concanavalin A-ból (ConA, Sigma, C0412) és Phytolacca americana lektinből (PWM, Sigma, L8777) 1 mg/ml koncentrációjú törzsoldatokat készítettünk LBSS (összetétel ld. 4.2. pont) felhasználásával. Formilmetionil-leucil-fenilalaninból (fMLP, Orpegen Pharma, Heidelberg, Németország) 1 mM koncentrációjú oldatot készítettünk. Abszolút alkoholban 1 mg/ml koncentrációban ionomycint, dimetil-szulfoxidban (DMSO, Sigma, D8418) pedig forbol 12-mirisztát 13acetátot (PMA, Sigma, P8319) oldottunk fel ugyanilyen koncentrációban. 1 mg/ml Fluo-3 AM (Invitrogen Molecular Probes, F-1242, Eugene, OR, USA) törzsoldatot 15% pluronsav F-127 (Sigma, P2443) tartalmú DMSO-val állítottunk elő, 1 mM koncentrációjú thapsigargint (Sigma, T9033) pedig DMSO-ban oldottunk. Mindegyik reagenst -20 oC hőmérsékleten tároltuk. Az immunizáláshoz a lysenin (PeptaNova GmbH, Sandhausen, Németország) fehérjét 1 mg/ml koncentrációban desztillált vízben oldottuk fel.
4.2. Coelomasejtek izolálása Kísérleteinkhez Eisenia fetida és Allolobophora caliginosa gilisztafajokat használtunk. A kísérletek megkezdése előtt a gilisztákat 2 napig nedves törlőkendőn tartottuk, béltartalmuk ezalatt kiürült. Az állatokat 3-4 ml izoláló puffert (71,2 mM NaCl; 5 mM EGTA; 50,4 mM guaiacol-glyceryl-éter; 5 v/v % etanol; pH 7,3) tartalmazó Petricsészébe helyeztük. Az állatok coelomasejteket tartalmazó coelomafolyadékot bocsátottak ki a testüregükből, amit összegyűjtöttünk, majd kétszeres térfogatra higítottunk LBSS pufferrel (71,5 mM NaCl; 4,8 mM KCl; 4,2 mM NaHCO3; 1,1 mM MgSO4*7 H2O; 0,4 mM KH2PO4; 0,3 mM NaH2PO4; pH 7,3). Az összegyűjtött sejteket kétszer mostuk LBSS-
17
ben (1000 rpm, 5 perc, szobahőmérsékleten). Az élő sejtek számát tripánkék festéssel határoztuk meg.
4.3. A sejtek feltöltése Ca2+-szenzitív fluoreszcens indikátorral Az izolált coelomasejteket 1% Fluo-3 AM tartalmú DMEM tápoldatban (Sigma) vagy Ca2+-mentes PBS-ben vettük fel 107 sejt/ml koncentrációban. A mintákat tartalmazó centrifugacsöveket 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk (Boldizsár és mtsai, 2002; Minta és mtsai, 1989). A csöveket 10 ml DMEM-mel, vagy Ca2+-mentes PBS pufferrel töltöttük fel, majd további 30 perc inkubáció következett szobahőmérsékleten. A mintákat 5 percig centrifugáltuk 1000 rpm-mel, majd DMEM vagy PBS hozzáadásával 106 sejt/ml állítottuk be a minták koncentrációját. A fluoreszcens jel intenzitását áramlási citometriával az FL-1 csatornában detektáltuk. A sejtszuszpenziók alap Ca2+-szintjét BD FACSCalibur áramlási citométerrel 50 másodpercig mértük, majd különböző kezeléseket (ionofór, eltérő koncentrációjú mitogén vagy kemoattraktáns stimulust) alkalmaztunk. Annak igazolására, hogy az FL1 csatornában megfigyelt jel az élő coelomasejtektől származott, 1 µg/ml propidium-jodidiot adtunk a mintákhoz a mérések megkezdése előtt. Az eredmények értékelése során a PI negatív, élő coelomasejtek adatait használtuk fel. A kontroll kísérletekben megfelelő koncentrációjú abszolút etanolt, illetve DMSO-t adtunk a sejtekhez. Az áramlási citometriával kapott adatokat CellQuest és FCS Express (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA), valamint FlowJo 7.5 (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA) programok segítségével analizáltuk.
4.4 Coelomasejtek stimulálása, proliferációjuk vizsgálata PI festéssel Ismételt sejtizolálások valamint mitogénstimulusok coelomasejt proliferációt befolyásoló hatásának tanulmányozásakor a gilisztákat egy éjszakán át nedves törlőkendőn tartottuk, majd hármasával kísérleti csoportokba osztottuk őket.
18
Az ismételt sejtizolálások hatásának vizsgálatakor az első coelomasejt izolálást még további három követte. Az izolálások között a gilisztákat talajba helyeztük regenerálódni. Az első és a második sejtizolálás között 1 nap, a második és harmadik izolálás között 3 nap, a végül a harmadik és negyedik izolálás között 7 nap regenerációs időt alkalmaztunk. Mitogén stimulus hatását tanulmányozva a coelomasejt izolálást követően az állatokat 5-5 ml LBSS-t tartalmazó Petri-csészébe helyeztük egy éjszakára, amit különböző koncentrációjú mitogénekkel (LPS, PHA, ConA, vagy PWM) egészítettünk ki. Kontrollként LBSS-ben tartott gilisztákat használtunk. Másnap a stimulus rövid távú hatásának ellenőrzésére a kísérleti csoportokból újra sejtizolálást végeztünk. A
stimulusok
hosszabb
távú
hatásának
felderítéséért
az
állatokat
a
mitogénstimulációt követően talajba helyeztük három napig regenerálódni, ezt követően az állatokat ismét nedves törlőkendőre kerültek egy éjszakára, amit sejtizolálás követett. Többszörös stimuláció során a gilisztákból sejteket izoláltunk, éjszakán át stimuláltuk őket mitogénekkel, majd 13 napra talajba kerültek regenerálódni. Ezt követően pedig egy éjszakát nedves törlőkendőn töltöttek az állatok, majd megismételtük a csoportokon korábban is alkalmazott stimulusokat. Ezek után az állatok két napra ismét talajba kerültek, majd végül sejtizolálás következett. Az izolálást követő mosási lépések és tripánkék festékkizárás után az LBSS-ben felvett coelomasejteket egyenlő térfogatokra osztva FACS-csövekben vettük fel. A centrifugálást követően a sejteket mostuk ACD pufferben (4,8 g/l citromsav; 13,2 g/l nátrium-citrát; 14,7 g/l dextróz; pH 5,0). További lépésben PI jelölőpufferben (10 mM Tris base;10 mM NaCl; 0,1 ml/100 ml Nonidet P-40; pH 8,0), illetve 1 μl RNáz-A-t és 10 μg/ml PI-t is tartalmazó PI jelölőpufferben reszuszpendáltuk a sejteket (Homa és mtsai, 2008). A mintákat 4 oC hőmérsékleten 30 percen keresztül fénytől védve inkubáltuk, majd áramlási citométerrel mértük.
4.5. Ca2+ -ATPáz enzim citokémia Sejtizolálást követően a coelomasejteket Cytospin 3 készülékkel (Shandon, Thermo Labsystems, Waltham, MA, USA) tárgylemezre ülepítettük. A lemezeket ezt követően 20
19
percen át 37 oC hőmérsékleten inkubáltuk 3mM ATP-t és 0,18 % kalcium-kloridot tartalmazó Na-barbitál pufferben (pH 9,4), majd 0,1% kalcium-kloriddal, 2% kobaltkloriddal és 0,5% ammónium-szulfiddal kezeltük. Az inkubációs idő letelte után Mayer-féle hematoxilinnal (Reanal, Budapest) kontrasztosítottuk a sejteket. Az enzimreakció terméke fekete csapadékként jelent meg a pozitív jelet adó sejtekben. A preparátumokat Nikon Eclipse 80i mikroszkóppal tanulmányoztuk (Auroscience Kft., Budapest), az értékeléshez a SPOT szoftvercsomagot használtuk (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA).
4.6. Monoklonális anti-lysenin ellenanyag létrehozása Desztillált vízzel 1 mg/ml koncentrációjú lysenin (PeptaNova, Sandhausen, Németország) törzsoldatot készítettünk. Nőstény 8 hetes BALB/c egerekbe 10 µg lysenint (komplett Freund adjuvánsban) (CFA, Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) injektáltunk, amit két további, inkomplett Freund adjuvánssal végrehajtott intraperitoneális injekció követett három hetes intervallumokban. Végül az antitest titer és izotípus alapján kiválasztott egerek egy további injekciót is kaptak 3 nappal a tervezett splenocyta/myeloma sejtfúziót megelőzően. A hibridóma sejtekkel a korábban ismertetett módon dolgoztunk (Köhler és Milstein, 1975; Engelmann és mtsai, 2005). A hibridóma felülúszókat indirekt ELISA módszer segítségével teszteltük lysenin és coelomasejt-lizátum antigénekkel, valamint BSA kontroll (Sigma) felhasználásával.
4.7. Giliszta coelomasejtek immuncitokémiai vizsgálata A coelomasejtekből (5*105 sejt/ml LBSS pufferben) 80-80 µl térfogatot tárgylemezekre vittünk fel Cytospin 3 készülék (Shandon, ThermoScientific, Waltham, MA, USA) segítségével. A mintákat jéghideg acetonnal fixáltuk, majd a sejtek endogén peroxidáz aktivitását 1 mg/ml fenil-hidrazin-hidrokloriddal blokkoltuk.
20
A tárgylemezeket ezután 5 %-os BSA oldatban inkubáltuk 20 percig a nemspecifikus kötődés kiküszöbölése céljából, majd lysenin ellen termeltetett hibridóma felülúszókkal (a-EFCC5) vagy Protein G sepharose oszlopon (GE Healthcare, München, Németország) tisztított IgG frakciókkal jelöltük a coelomasejteket szobahőmérsékleten, 60 percig. A következő lépésben HRP-konjugált anti-egér IgG másodlagos ellenanyagot használtunk (1:100, Dakopatts, Glostrup, Dánia). Kettős immunfluoreszcens jelölés során egérben termeltetett monoklonális aEFCC5 IgG frakciókat (1:100) mutattunk ki a másodlagos ellenanyagként használt NL557 konjugált szamár anti-egér immunglobulinnal (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Ezután FITC konjugált a-EFCC1, a-EFCC2, a-EFCC3 vagy a-EFCC4 monoklonális ellenanyagot alkalmaztunk (1:100). Másik kísérleti elrendezésünkben egér monoklonális a-EFCC1-4 IgG frakciókat (1:100) detektáltunk a mintákon, NL557 konjugált szamár anti-egér immunglobulinnal (R&D Systems, Minneapolis. MN, USA), majd a lyseninre specifikus, FITC konjugált monoklonális a-EFCC5 ellenanyagot használtuk (1:100). Pozitív kontrollként nyúl poliklonális anti-lysenin ellenanyagot (1:100; PeptaNova) használtunk, amit második lépésben NL557 konjugált anti-nyúl immunglobulinnal (R&D Systems) jelöltünk. A negatív kontroll mintákat normál egér szérummal inkubáltuk, majd a megfelelő másodlagos ellenanyagot használtuk. Az immuncitokémiai reakciókat acetátpufferben (pH 5,0) felvett 3-amino-9-etil karbazollal (Sigma) tettük láthatóvá. Magfestésre Mayer-féle hematoxilint (Reanal, Budapest, Magyarország), az immunfluoreszcens jelölések esetében DAPI-t (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, OR, USA) használtunk. A lemezeket Olympus BX61 mikroszkóppal és AnalySIS programmal (Olympus, Hamburg, Németország) értékeltük.
21
4.8. Immunhisztokémiai és immunfluoreszcens vizsgálatok giliszta szöveteken A gilisztákat boncoltuk, az így nyert szövetmintákat Zamboni-féle fixáló oldatba helyeztük (2% paraformaldehid; 15% pikrinsav; 0,1 M nátrium-foszfát puffer; pH 7,3; Zamboni és DeMartino, 1967), majd 30% szukrózba ágyaztuk. A mintákból 1% zselatinnal bevont tárgylemezekre 8-10 μm vastag metszeteket készítettünk kriosztáttal. A lemezekkel immunhisztokémiai vagy immunfluoreszcens módszerekkel vizsgáltuk. A szöveteken történő kivitelezés (antitestek, hígitás, inkubációs idő) hasonlóan történt, mint az immuncitokémiai vizsgálatoknál (ld. 4.7. alfejezet). Az egyes lépések között a mintákat 0,1% Triton-X 100 tartalmú PBS-ben mostuk. Az immunfluoreszcens vizsgálatok esetében az autofluoreszcencia csökkentése érdekében 15 percig 0,05 M ammónium-kloriddal inkubáltuk a mintákat. A metszeteket Olympus BX61 mikroszkóppal és AnalySIS programmal elemeztük.
4.9. In vitro baktérium kezelés vizsgálata Izolált giliszta coelomasejteket 6 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk hővel inaktivált Staphylococcus aureus (OKI II2001) vagy Escherichia coli (ATCC 25922) baktériumokkal. A coelomasejteket (106) a baktériumokkal (107) 1 ml térfogatban kevertük össze 12*75 mm-es Eppendorf csövekben (Falcon, BD Labware). A fagocitózist követően a mintákat LBSS-ben mostuk (Engelmann és mtsai, 2005). A felülúszót -80 oC-on tároltuk a további vizsgálatokig, az üledékből coelomasejt-lizátumot készítettünk.
4.10. Coelomasejt-lizátum készítése A coelomasejteket proteáz inhibítor keverékkel (Sigma) kiegészített RIPA pufferrel (50 mM TRIS/HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 1 v/v % NP-40; 0,5 w/v % Na- deoxicholat; 5 mM EDTA; 0,1 % SDS) lizáltuk jégen 15 percig, majd 4 oC-on centrifugáltuk 15 percig, 13000 rpm-mel. A coelomasejt-lizátumok és a felülúszók fehérjetartalmát BCA kit-tel határoztuk meg (Pierce, Rockford, IL, USA), immunreaktivitásukat ELISA és Western blot módszerekkel vizsgáltuk.
22
4.11. Indirekt ELISA-vizsgálat anti-EFCC5 ellenanyaggal Mikrotiter lemezeket (Nunc, Microelisa, Roskilde, Dánia) coelomasejt-lizátummal vagy 5 µg/ml lyseninnel érzékenyítettük éjszakán át 4 oC-on. A nem-specifikus kötőhelyeket 0,5% zselatinnal blokkoltuk 30 percen keresztül, 37 o
C-on. A lemezeket a-EFCC5 felülúszóval inkubáltuk 37 oC-on, 60 percig. A mosási
lépések után a lemezre a HRP-konjugált kecske anti-egér IgG ellenanyag került (Dakopatts) 37 oC-on, 60 percre. Az a-EFCC5 monoklonális ellenanyag izotípusát indirekt ELISA módszerrel határoztuk meg egér monoklonális ellenanyag izotípus meghatározó kittel a gyártó leírása alapján (Sigma). A színreakciót ortofenilén-diaminnal hívtuk elő, majd 4 M kénsavval állítottuk le. Az egyes lépések között a lemezeket 0,05 % Tween 20 (Sigma) tartalmú PBS-sel mostuk. A színreakció erősségét 490 nanométeren detektáltuk Dynatech ELISA reader segítségével.
4.12. Szendvics ELISA a-EFCC5 ellenanyag alkalmazásával Mikrotiter lemezeket (Nunc) poliklonális anti-lysenin ellenanyaggal (1:1000, PeptaNova) érzékenyítettük 4 oC-on, éjszakán át. A nem-specifikus kötőhelyeket 0,5% zselatinnal gátoltuk 37 oC-on, 30 percen keresztül. Ezután standard görbe készítéséhez különböző lysenin koncentrációkat alkalmaztunk, 2 µg/ml és 50 µg/ml közötti tartományban. Kontroll vagy bakteriális stimulust kapott coelomasejtekből nyert felülúszókkal inkubáltuk a mikrotiter lemezeket 37 oC-on, 60 percig. Ezután a-EFCC5 ellenanyagot (1:1000) adtunk a mintákhoz és a további lépésekben fentebb leírt ELISA protokolt követtük (ld. indirekt ELISA-vizsgálat anti-EFCC5 ellenanyaggal).
4.13. SDS-poliakrilamid gél elektroforézis és Western blot A fehérjék elválasztásához 10% poliakrilamid gélt használtunk (Mini Protean 3, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Az elválasztás után a proteineket nitrocellulóz membránra
23
(Bio-Rad) blottoltuk 4 oC-on, 2 órán keresztül. A membránokat 60 percen át blokkoltuk 1% BSA/TBS-Tween (25 mM Tris; 150 mM NaCl; 0,05 % Tween; pH 7,5) alkalmazásával. Ezután a géleket 60 percig inkubáltuk monoklonális a-EFCC5 ellenanyaggal (1:1000, 1% BSA/TBS-Tween), vagy nyúlból származó poliklonális anti-lysenin ellenanyaggal (1:1000, 1% BSA/TBS-Tween, PeptaNova). A következő lépésben HRP-konjugált anti-egér vagy anti-nyúl IgG (Dakopatts) ellenanyagot alkalmaztunk szobahőmérsékleten, 60 percig. A mosási lépésekhez TBS/ 0,05% Tween (Sigma) puffert alkalmaztunk, a reakciók előhívása pedig ECL reagenssel történt (Pierce). Töltés-kontrollként egér anti-α-tubulin ellenanyagot (1:1000, Sigma) használtunk, mellyel a „stripping” pufferes (Pierce) kezelés után inkubáltuk a membránokat. A kemilumineszcens jel detektálása Fuji LAS 4000 (Fuji, Japán) rendszerrel történt.
4.14. Áramlási citometria FITC konjugált a-EFCC5 ellenanyaggal Az izolált coelomasejteket PBS pufferben mostuk, majd 4% paraformaldehiddel fixáltuk a sejteket (105 sejt/minta). A mosási lépések során 0,1 % nátrium-azidot tartalmazó PBS-t, majd permeabilizáló puffert (0,1% nátrium-azidot és 0,1% szaponint tartalmazó PBS) használtunk. Permeabilizáló pufferben felvett FITC konjugált a-EFCC5 ellenanyagot adtunk a mintákhoz, amit 30 perc inkubáció követett 4 oC-on. A mintákat kétszer mostuk szaponintartalmú permeabilizáló pufferben, majd egyszer BSA-t és nátrium–azidot tartalmazó PBS pufferben. Végül a mintákat 0,5% paraformaldehiddel kiegészített PBS pufferben fixáltuk. FACSCalibur áramlási citométerrel (BD Biosciences, San Diego CA, USA) mértük a minták fluoreszcencia intenzitását az FL1 csatornában, a kapott adatok értékelésére CellQuest (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) és FCS Express programokat (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA) használtuk.
24
4.15. Az eredmények értékelése és statisztikai elemzése A statisztikai elemzés céljára Microcal Origin (Microcal Software Inc., Northhampton, MA, USA) programot alkalmaztuk. Az eredmények ábrázolásakor az átlagokat és a standard hibasávokat tüntettük fel. A kezelések hatásainak elemzését Student-féle (kétmintás, egyenlő varianciájú) t-teszttel, illetve három, vagy több értéksor összehasonlítása esetén ANOVA és post-hoc analízis segítségével végeztük. A p<0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
25
5. EREDMÉNYEK 5.1. Az E. fetida és A. caliginosa fajokból származó coelomasejt alcsoportok nyugalmi kalciumszintje A giliszta immunitásának sokrétű feladatait a coelomasejtek eltérő alcsoportjai látják el (Vetvicka és Sima, 2009). Az E.
fetida és
A. caliginosa
fajok
coelomafolyadékában szabadon előforduló coelomasejtek korábban leírt alpopulációit a vizsgálatok során fizikai tulajdonságaik; nagyság és granularitás alapján különítettük el (1.A és B ábra). Az intracelluláris kalciumszintet egy áramlási citometrián alapuló módszerrel határoztuk meg, a Fluo3-AM fluoreszcens festék jelintenzitása korrelál a sejtek szabad kalciumszintjével. Szignifikáns eltérést figyeltünk meg a coelomasejt-alcsoportok nyugalmi Ca2+-szintje között, az E. fetida chloragocyta populációja magasabb kalciumszinttel rendelkezik, mint a granulált és hyalin coelomasejtek populációi (1. C ábra). Megfigyeléseink szerint az A. caliginosa faj coelomasejt és chloragocyta alcsoportjai hasonló Ca2+-szinttel rendelkeznek, mint az E. fetida faj megfelelő populációi (1. C ábra).
1. ábra. Az E. fetida és A. caliginosa giliszták immunsejt-alcsoportjainak intracelluláris kalciumszintjei. Az ábrán jelölt chloragocyta és coelomocyta sejtpopulációk mellett a minták előkészítése során a sejtekből kiszabadult granulumok láthatóak.
26
5.2. Ionofór kezelés hatása coelomasejt alcsoportok kalciumszintjére Coelomasejt izolálást követően a sejteket 1,8 mM CaCl2 tartalmú DMEM médiumban töltöttük fel Fluo3-AM-mel. Az alap kalciumszint 50 másodpercig tartó mérése után 7 µM ionomycint adtunk a csövekhez. Az E. fetida sejtcsoportok közül a coelomocyta populáció nagymértékű, három-négyszeres Ca2+-szint emelkedést mutatott már néhány másodperccel az ionomycin hozzáadása után (2. ábra). A megemelkedett kalciumszint végig megfigyelhető volt a hét percen keresztül zajló mérés során.
2. ábra. Ionomycin kezelés jelentős kalcium szignál változást okoz E. fetida coelomasejtek esetében. A Fluo3-AM festékkel feltöltött coelomasejtek gyors, szignifikáns intracelluláris kalciumszint változással reagálnak a 7 µM koncentrációban alkalmazott ionomycin hatására. A dot-plot (2.A. ábra) a független vizsgálatok egy reprezentatív eredményét mutatja (átlag±SEM; n=12; # p<0,001).
27
Az előző sejtcsoporttal ellentétben a chloragocyta/eleocyta populáció nem reagált az ionomycin kezelésre a Ca2+ -szint emelkedésével (3. ábra).
3. ábra. Az E. fetida chloragocyta/eleocyta populációra nem volt detektálható hatással a 7 µM ionomycin stimuláció.
Vizsgáltuk, hogy van-e kimutatható különbség a két gilisztafaj coelomocyta populációjának a kalciumjelében. Az ionomycin A. caliginosa coelomasejtekben is szignifikáns mértékű Ca2+-szint emelkedést váltott ki (p<0,05), de ez a változás kisebb mértékű volt, mint az azonos körülmények között kezelt E. fetida coelomasejtek esetében (4. ábra). Hasonlóan az E. fetida chloragocyta/eleocyta sejtekhez, az A. caliginosa alcsoport sem mutatott Ca2+-jel változást az ionomycin kezelés hatására (5. ábra).
28
4. ábra. Az ionomycin kezelés mérsékelt kalciumszint változáshoz vezet A. caliginosa coelomasejtekben (1.B. ábrán jelölt sejtpopuláció), ami elmarad az E. fetida coelomasejtek esetében 7 µM ionomycin stimulus után tapasztalható változástól. Az ábrázolt dot-plot (4.A. ábra) 10 független vizsgálat egy reprezentatív eredményét mutatja (átlag±SEM; n=10; * p<0,05; † p<0,01).
29
5. ábra. A. caliginosa chloragocyta/eleocyta sejtek (1. B. ábrán látható sejtpopuláció) nem reagáltak 7 µM ionomycin kezelésre Ca2+-influx változással. Az ábrázolt dot-plot (5. A. ábra) a független vizsgálatok egy reprezentatív eredményét mutatja.
Ionomycin hatására a sejtmembrán és/vagy intracelluláris raktárak kalciumcsatornái is kinyílnak, ami a citoplazma Ca2+-szintjének megemelkedéséhez vezet. Kísérleteinkben a kalcium forrása ismeretlen volt, ezért a coelomasejteket Ca2+-mentes PBS-ben töltöttük fel Fluo3-AM-mel, majd áramlási citometriával vizsgáltuk az ionomycin hatását. Az E. fetida coelomasejt alpopuláció Ca2+-szintje magasabb lett a kezelést követően, de a változás elmaradt a Ca2+-tartalmú DMEM médiumban tartott sejteknél mért értéktől. A nyugalmi szinthez képest azonban szignifikánsan nőtt a citoplazma szabad kalciumion szintje (p<0,001), ami arra utal, hogy az ionomycin intracelluláris kalciumraktárak kiürülését is okozza (6. ábra).
30
6. ábra. Az E. fetida coelomasejtekben jelentős kalciumszignál emelkedést figyeltünk meg a nyugalmi kalciumszinthez képest 7 µM ionomycin stimulus után. A kiváltott kalciumjel kalciumtartalmú médiumban, és kalciummentes PBS pufferben is bekövetkezett (átlag±SEM; n=4; # p<0,001).
A. caliginosa gilisztákat vizsgálva kalciummentes PBS pufferben végzett feltöltés után nem figyelhető meg a Ca2+ -influx ilyen változása.
5.3. A PMA kezelés nem indukált kalcium mobilizációt a coelomasejt alcsoportokban A forbol 12-mirisztát 13-acetát (PMA) egy speciális protein kináz C aktiváló hatással rendelkező forbol észter. A vizsgálatban felhasznált gilisztafajok egyik sejttípusa sem reagált a PMA kezelésre a nyugalmi kalciumszint megváltozásával (7. ábra). Azonban, egy percig tartó ionomycin kezelést követően adott 1 nM vagy 10 nM PMA azonnal bekövetkező kalciumszignál csökkenéshez vezetett (8. ábra). A megfigyelt változás nem különbözött szignifikánsan a kizárólag ionomycinnel stimulált minták kalciumszintjének változásától, de a jel csökkenésének mértéke függött az alkalmazott PMA mennyiségétől és
31
tranziens folyamatot tapasztaltunk. Az ionomycinnel és PMA-val is kezelt coelomasejtek kalciumjele 200 másodperc elteltével nem különbözött a kizárólag ionomycinnel kezelt próbákétól.
7. ábra. A PMA kezelés (0,1 nM) nem vezetett az E. fetida coelomasejtek nyugalmi kalciumjelének megváltozásához (átlag±SEM; n=8).
8. ábra. A PMA kezelés (1 nM vagy 10 nM) alkalmazása 7 µM ionomycin stimulus után csökkentette az E. fetida coelomasejtek szabad intracelluláris kalciumszintjét.
32
5.4. Giliszta coelomasejtek thapsigargin-szenzitív kalciumpumpái További kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogy a coelomasejtek intracelluláris Ca2+raktárainak feltöltésében milyen szerepe lehet az endoplazmás retikulum membránjában található Ca2+-ATPázoknak (SERCA-pumpáknak). A kísérletsorozathoz thapsigargint (TG) használtunk, mely az endoplazmás retikulum SERCA pumpáinak specifikus gátlószere. A thapsigargin hatására a feltételezett előforduló SERCA-pumpák aktivitása csökken, így megfigyelhető a coelomasejtek citoplazmatikus szabad Ca2+-szint emelkedése. A 2 µM thapsigarginnal inkubált E. fetida coelomasejtek esetében a Ca2+-szint kezdetben gyengébb (p<0,05), majd kifejezettebb, szignifikáns (p<0,001) emelkedését detektáltuk (9. ábra).
9. ábra. Az E. fetida coelomasejtek intracelluláris Ca2+-szintje megemelkedik 2 µM thapsigargin hatására. Röviddel a stimulus után már szignifikáns különbség figyelhető meg a nyugalmi kalciumszinthez képest (* p<0,05), amit valamivel később még kifejezettebb emelkedés követ (átlag±SEM; n=8; † p<0,01; # p<0,001). A dot-plot reprezentatív példa a nyolc független vizsgálat közül.
33
Amikor a coelomasejteket 30 percig 2 µM thapsigarginnal előinkubáltuk, majd ionomycinnel kezeltük, a létrejött Ca2+-influx szignifikánsan kisebb mértékűnek (p<0,01) bizonyult, mint a kizárólag ionomycinnel kezelt minták esetében tapasztalt Ca2+-jel (10. ábra).
10. ábra. Az E. fetida coelomasejtek 2 µM thapsigarginnal történt előkezelése csökkentette a kalciumszint változását a kizárólag 7 µM ionomycinnel stimulált mintákhoz képest (átlag±SEM; n=6; †p<0,01).
Az A. caliginosa coelomasejtek esetében is megfigyeltük a thapsigargin Ca2+mobilizáló hatását. Thapsigargin adásával (2 µM) elnyúlt hatás ismerhető fel a mérés során. Az alapjelhez képest szignifikáns kalciumjel emelkedés figyelhető meg (p<0,001), ám ez az emelkedés elmarad az E. fetida coelomasejtek esetében tapasztalttól (11. ábra).
34
11. ábra. Az A. caliginosa coelomasejtek 2 µM thapsigargin adását követően intracelluláris Ca2+-szintjük szignifikáns emelkedésével reagáltak (átlag±SEM; n=8; #p<0,001; *p<0,05). Hasonlóan elnyújtott thapsigargin hatás figyelhető meg, mint az E. fetida coelomasejtek esetében (9. ábra).
Az
intracelluláris
Ca2+-pumpák
funkcionális
vizsgálatai
mellett
mindkét
2+
gilisztafajnál enzimcitokémiai reakciót is végeztünk az intracellulláris Ca -ATPázok lokalizálása és jellemzése céljából. A coelomasejtek jellegzetes festődési mintázatot mutattak. A legfeltűnőbb reakció a sejtmag közelében volt látható, bár néhány esetben a sejt teljes citoplazmája erős reaktivitást mutatott. Általában a kisméretű, aránylag nagy sejtmaggal
és
kisebb
citoplazmával
rendelkező
sejtek
festődtek,
míg
a
chloragocyták/eleocyták valamint a nagyméretű coelomasejtek nem mutattak reakciót (12. ábra).
35
12. ábra. Az E. fetida (A, B) és A. caliginosa (C, D) immunsejtek citokémiai vizsgálata számos sejttípusban a Ca2+-ATPáz enzim jelenlétét igazolta. A sejtmag körüli területen (nyilak), illetve a citoplazmában (nyílhegy, B) erős reakció volt megfigyelhető. A nagy coelomasejtek (számjel, C) és a szabad chloragocyták/eleocyták (csillag) nem mutattak enzimreakciót. Méretarány: 20 µm.
5.5. Fitohemagglutinin Ca2+-mobilizáló hatása E. fetida coelomasejtekben Vizsgálataink során gerincesek leukocytáin végzett tanulmányokban (Goodman és Sultzer, 1979; Vadiveloo és mtsai, 2001) használt mitogének (LPS, PHA, ConA, illetve PWM) giliszta coelomasejtek kalciumszintjére gyakorolt hatásának elemzésével is foglalkoztunk. A kísérletekben felhasznált vegyszerek közül egyedül a fitohemagglutinin (PHA) befolyásolta az E. fetida coelomasejtjeit. A vizsgált különböző PHA koncentrációk közül a 30 µg/ml (13. ábra), valamint a 60 µg/ml koncentráció (14. ábra) alkalmazásakor tapasztaltuk a legintenzívebb intracelluláris Ca2+-szint emelkedést (p<0,05), bár ez a hatás nem volt koncentrációfüggő. Az E. fetida chloragocyta sejtek nem reagáltak ezekre a stimulusokra, A. caliginosa esetében pedig egyik alkalmazott PHA koncentráció sem okozott a tanulmányozott sejtalcsoportokban jelentős kalciumszint változást.
36
13. ábra. A PHA (30 µg/ml) hatására a vizsgált E. fetida coelomasejt-populáció mérsékelt kalciumszint emelkedést mutatott a nyugalmi Ca2+ -szinthez képest (átlag±SEM; n=4; * p<0,05). A dot-plot (13. A. ábra) a független vizsgálatok egy reprezentatív eredményét mutatja.
14. ábra. A 60 µg/ml PHA mérsékelt intracelluláris kalciumszint emelkedést okoz E. fetida coelomasejtekben (átlag±SEM; n=4; * p<0,05). A dot-plot (14. A. ábra) egy reprezentatív kísérlet eredményét mutatja.
37
5.6. Bakteriális formil peptid intracelluláris kalciumszint emelkedést okoz a coelomasejtekben A baktériumból származó, rövid fMLP peptid egy kemoattraktáns molekula és az intracelluláris kalcium mobilizálása révén aktiválja a gerinces fagocitasejteket (Anderson és Mahomed, 1997; Bokoch, 1995). Egyre több kísérleti eredmény igazolja a gerinctelen immunsejtekben lezajló hasonló folyamatot (Garcia-Garcia és mtsai, 2009; Yip és mtsai, 2001). Kísérleteinkben vizsgáltuk, hogy az fMLP képes-e bármilyen hatást kifejteni giliszta immunsejtek Ca2+-szintjére. A kísérlet nem mutatott erős intracelluláris kalciumszint változást, míg a kinetikus diagram kivehető intracelluláris Ca2+-szint emelkedést mutat fMLP adását követően (15. ábra). Számos független kísérlet eredménye is alátámasztotta, hogy 5 µM fMLP hozzáadása a mintákhoz a nyugalmi kalciumszint szignifikáns, bár tranziens növekedéséhez vezetett a vizsgálat időtartama alatt (p<0,05). Kalciummentes PBS-ben felvett sejtekkel elvégezve ugyanezt a mérést szintén szignifikáns Ca2+-szint emelkedés történt, de ennek mértéke nem különbözött a jelentősen a DMEM médiumban mért eredményektől. A. caliginosa coelomasejtek esetében nem tapasztaltunk változást.
15.
ábra.
Az
coelomocytákon
E.
fetida
alkalmazott
többféle koncentráció közül az 5 µM fMLP bizonyult hatásosnak és vezetett
gyenge
kalcium
mobilizációhoz (átlag±SEM; n=4; *p<0,05). Az ábrázolt dot-plot a független
kísérletek
reprezentatív példája.
38
egyik
5.7. Coelomasejtek sejtciklusának vizsgálata Frissen izolált coelomasejtek proliferációs aktivitását vizsgáltuk PI festést követően áramlási citometriával. Ugyanazokból az E. fetida egyedekből végzett ismételt sejtizolálásokat és regenerációs időszakokat követően megfigyelhető volt a G0-G1 fázisban és az M-fázisban lévő coelomasejtek növekvő mennyisége (16. A. ábra).
A legtöbb
mitotikus aktivitással rendelkező sejt a második és a harmadik sejtizolálást követően fordult elő a vizsgált mintákban. Az utolsó, negyedik coelomasejt-izolálásból származó mintákban az M-fázisban lévő coelomasejtek már kisebb számban fordultak elő. Sejtizolálást, majd mitogénekkel végzett ismételt stimulusokat követően is megfigyeltük a coelomasejtek proliferációs aktivitásának fokozódását (16. B. ábra). A kezelések során 12 μg/ml LPS-t, 25 μg/ml PHA-t, 25 μg/ml ConA vagy 25 μg/ml PWM stimulust alkalmaztunk. Az alkalmazott stimulusok közül a PWM és a ConA lektinek hatására, valamint kis mértékben az LPS kezelést követően is megfigyelhető volt a mitotikus fázisban lévő coelomasejtek arányának emelkedése az LBSS-sel kezelt kontroll mintákhoz képest.
16. ábra. A. Az E. fetida coelomasejtek proliferációs aktivitása ismételt sejtizolálásokat és PI festést követően. A diagramok feletti időértékek minden esetben az előző sejtizolálás óta eltelt nyugalmi periódus hosszát mutatják. B. Ismételt antigénstimulusokat alkalmazva a lektinnel (PWM, ConA) kezelt mintákban emelkedett meg leginkább a mitotikus fázisban lévő coelomasejtek mennyisége.
39
5.8. Izolált coelomasejtek lysenin expressziója Korábbi tanulmányok már beszámoltak giliszta coelomasejtek által termelt anyagok cytotoxikus hatásairól (Cooper és mtsai, 1996; Cossarizza és mtsai, 1996; Engelmann és mtsai, 2011). További részletek tisztázása érdekében lysenin elleni monoklonális antitestet (a-EFCC5) hoztunk létre, amellyel az Eisenia coelomasejtek lysenin expresszióját vizsgáltuk. Méréseink során a coelomaüreg szabad immunsejt-alcsoportjai közül hármat tudtunk azonosítani (17. A ábra). Az R1 és R2 jelű csoportok effektorsejtek, hyalin és granulált coelomasejtek, míg az R3 csoport az erősen granulált és autofluoreszcens tulajdonságú chloragocyta/eleocyta alpopuláció (Plytycz et al. 2006). Az EFCC5 pozitivitást, bár eltérő intenzitással, de mindhárom alcsoport esetén megfigyeltük. A legtöbb a-EFCC5 pozitív sejtet az eleocytákat tartalmazó R3 populációban detektáltuk (17. B ábra).
17. ábra. Coelomasejt alcsoportok lysenin expressziójának azonosítása a-EFCC5 festés után. A. Coelomasejt alpopulációk elkülönítése áramlási citometriával. B. A legerősebb jelintenzitást a FITCkonjugált izotípus kontrollhoz képest (szaggatott vonal) az R3 kapuban lévő sejtek adták.
A pozitív immunreakciót adó sejtek nagy mennyiségű, granulált citoplazmával és aránylag kis sejtmaggal rendelkeznek (18. A. ábra). A pozitív jelet főleg a granulumban gazdag citoplazma mutatta. Az EFCC5 pozitív sejtek morfológiája leginkább a szabad chloragocyta/eleocyta sejtcsoportot jellemzi. Egy másik, kis citoplazmával és nagy
40
sejtmaggal rendelkező sejttípus nem adott specifikus jelet az a-EFCC5 immunfestés során. Ez az alcsoport valószínűleg megfeleltethető a hyalin sejtcsoportnak (18. A. ábra). A
korábban
létrehozott
coelomasejt-alpopulációk
azonosítására
használt
monoklonális ellenanyagokat is felhasználva kettős immunfluoreszcenciát végeztünk. Az aEFCC3 pozitív sejtek jellemzően adherenciára hajlamos, kisebb sejtcsoportokat hoznak létre, míg az a-EFCC5 pozitív sejtek inkább egyesével fordulnak elő (18. B ábra).
18. ábra. Izolált coelomasejtek lysenin expressziójának detektálása a-EFCC5 monoklonális ellenanyaggal. A. A pozitív jelet adó granulált chloragocyta sejtek (számjellel jelölve) láthatóak. Két nem festődő sejtcsoport különíthető el, a hyalin sejtek (nyíl), és a barna chloragoszómákat tartalmazó chloragocyta sejtek (nyílhegy). B. Kettős immunfluoreszcens festés. A-EFCC5 jelölt lysenin pozitív sejtek (nyíl) és aEFCC3-FITC jelölt coelomocyta sejtek (számjel) ismerhetők fel. Hematoxilin (A) és DAPI (B) magfestés. Méretarány: 100 µm (A) és 50 µm (B).
5.9. Szabad chloragocyta/eleocyta sejtek lysenin expressziója Immunhisztokémiai és in situ hibridizációs vizsgálatok eredményei szerint a lysenint a typhlosolis chloragocyta sejtjei termelik (Ohta és mtsai, 2000; Sekizawa 1996b). Immunhisztokémiai és immuncitokémiai kísérleteink alapján az a-EFCC5 pozitív (lysenint expresszáló) sejteket a coelomaüreg szabad coelomocyta sejtjei között (19. ábra A, B) találtunk. Az EFCC5 immunpozitív sejtek a coelomaüregben kisebb csoportokban illetve izomhoz, vagy idegdúchoz kötött magányos sejtekként is láthatóak voltak (19. ábra C, D).
41
19. ábra. Kriosztáttal készült giliszta metszetek a-EFCC5 immunfestése. A. és B. Szabad, lysenin pozitív coelomasejtek a coelomaüregben (nyilak). C. Izomszövet (Iz) mellett megfigyelhető immunpozitív sejtek (nyíl). D. A hasdúclánc (I) és subneurális ér (É) közelében elhelyezkedő lysenin pozitív sejt (nyíl). Hematoxilin (A és C) illetve DAPI magfestés (B és D). Méretarány: 50 µm (A); 100 µm (B, C, D).
20. ábra. A negatív kontroll metszeteken sem a bélfal (g), sem a chloragogén szövet (chl) nem mutatott immunreakciót. Hematoxilin (A), illetve DAPI magfestés (B). Méretarány: 100 µm (A); 200 µm (B)
42
A poliklonális anti-lysenin ellenanyag (PeptaNova) szabad coelomasejteket jelölt (21. ábra).
21. ábra. Poliklonális anti-lysenin ellenanyaggal készített immunhisztokémia Eisenia szöveteken. A typhlosolis szesszilis chloragocyta sejtjei nem festődtek (csillag), míg a coelomaüreg chloragocytái/eleocytái pozitív reakciót adtak (nyíl). A 21. A. ábrán téglalappal jelölt terület nagyítását a 21.B. ábra mutatja. Hematoxilin magfestés. Méretarány: 200 μm (A); 100 μm (B).
22. ábra. Immunhisztokémia poliklonális anti-lysenin ellenanyaggal Eisenia kriosztátos metszeten. A csillag a 22.A. ábrán a specifikus jelet nem adó typhlosolist jelöli, a nyíl egy anti-lysenin pozitív szabad chloragocyta sejtet. A 22.A. ábrán jelölt terület a 22.B. ábrán nagyobb nagyítással látható. DAPI magfestés. Méretarány: 200 μm (A); 100 μm (B).
43
5.10. Gram pozitív baktériumok lysenin termelést befolyásoló hatása A lysenin expressziót befolyásoló bakteriális hatás vizsgálata érdekében szükséges volt tisztázni, hogy az a-EFCC5 jelű monoklonális ellenanyag valóban a lysenint ismeri-e fel. A Western blot vizsgálatok azt mutatták, hogy az ellenanyag az Eisenia coelomasejt lizátumból csak egy proteincsíkot jelöl, aminek molekulamérete megegyezett a tisztított lysenin (PeptaNova) fehérjével. A kontrollként alkalmazott poliklonális anti-lysenin ellenanyag is ilyen molekulasúlyú csíkot adott, bár ebben az esetben az a-EFCC5 ellenanyaghoz képest jóval erősebb háttérjel keletkezett (23. ábra). Ebben az esetben - bár magas háttérjel mellett- is látható, hogy a poliklonális ellenanyag felismeri a lysenin fehérjét, a gyári, tisztított frakcióban és a coelomasejt lizátumban is. A negatív kontrollként alkalmazott Jurkat lizátumnál nem kaptunk egyik ellenanyag esetében sem reakciót.
23. ábra. Poliklonális (anti-lysenin pAb) és monoklonális (a-EFCC5 mAb) ellenanyaggal végzett Western blot reakció lysenin fehérjével (Lys), coelomasejt lizátummal (Co), és Jurkat sejtekből készült lizátummal (J). Az a-EFCC5 ellenanyag egy csíkot adott a coelomasejt lizátum mintával, ami megfelel a lysenin protein méretének (40 kDa). A Jurkat sejtek egyik vizsgált ellenanyaggal sem adtak pozitív jelet.
A coelomasejteket in vitro körülmények között hővel inaktivált E. coli és S. aureus törzsekkel inkubáltuk 6 órán át. A coelomasejtek intracelluláris lysenin expresszióját Western blottal, a stimulált sejtek által a felülúszóba kibocsátott lysenin proteint szendvicsELISA módszerrel mértük (24. ábra).
44
A S. aureus törzzsel inkubált coelomasejtek lysenin expressziója szignifikánsan megnőtt az E. coli törzzsel kezeltekhez képest (p=0,0043), valamint a kezeletlen kontroll mintákhoz képest is mutatott nem szignifikáns (p=0,058) növekedési tendenciát (24.A. ábra). Az E. coli baktériumokkal inkubált coelomasejt-minták lysenin expessziója a kontroll mintákhoz képest jelentősen csökkent (p=0,042). A felülúszó (coelomasejtek által szekretált) lysenin-tartalma a fehérje intracelluláris expressziójával azonos mintázatot mutatott, az S. aureus-sal kezelt minták esetében emelkedett lysenintartalmat figyeltünk meg a kontroll (p=0,018), valamint az E. coli-val inkubáltakhoz képest (p=0,012) (24. B. ábra). Az E. coli törzzsel végzett inkubáció nem okozott szignifikáns lyseninszint változást a kezeletlen kontrollhoz képest (p=0,55) a sejtek felülúszójában.
24. ábra. Az Eisenia coelomasejtek lysenin-expresszió változása E. coli és S. aureus baktériumok hatására. A. Western blot analízis alapján S. aureus kezelés fokozta a lysenin-expressziót (** p<0,01; n=4), míg E. coli hatására az expresszió csökkent (* p<0,05; n=4). A lysenin expresszió szintjét az a-α-tubulin szintjéhez normalizáltuk. B. Szekretált lysenin vizsgálata bakteriális kezelésnek kitett coelomasejtek felülúszójából szendvics ELISA módszerrel. S. aureus hatására szignifikáns lysenin szekréció detektálható (* p<0,05; n=4).
45
6. DISZKUSSZIÓ 6.1. Coelomasejtek intracelluláris kalciumszintjei A kalcium széles körben előforduló másodlagos hírvivő anyag, mely szerepet játszik számos immunsejttípus, például neutrofil granulocyták, makrofágok, T- és Blymphocyták proliferációjában, differenciálódásában és transzkripciós folyamataiban (Vig és Kinet, 2009). A kalcium influx szerepéről gerinctelen modellállatok immunsejtjeiben viszonylag kevés információ áll rendelkezésre, elsősorban a Drosophila melanogaster valamint a Crassotrea gigas fajok hemocytáit vizsgálták (Yagodin és mtsai, 1999, Aton és mtsai, 2006). Munkánkban egy áramlási citometrián alapuló módszert alkalmaztunk E. fetida és A. caliginosa coelomasejtek intracelluláris kalciumszintjének vizsgálatára. Első lépésként meghatároztuk a két gilisztafaj coelomasejt-alpopulációinak intracelluláris nyugalmi kalciumszintjét. A chloragocyta/eleocyta alcsoport magasabb kalciumjellel rendelkezett, mint a granulált vagy hyalin coelomasejtek. Monoklonális ellenanyagok felhasználásával a perifériás coelomosejtek három alcsoportját azonosították. Ezek közül az EFCC3 és EFCC4 markerekkel jellemezhető két sejtcsoport effektor sejtekként sokféle immunológiai folyamatban vesz részt (Engelmann és mtsai, 2005). A kalcium méréshez alkalmazott beállítások mellett azonban ez a két sejttípus nem volt elkülöníthető egymástól az áramlási citometriával végzett vizsgálatok során.
6.2. Coelomasejtek Ca2+ -influxának indukciója ionomycinnel és gátlása PMA-val A vizsgált sejttípusok nyugalmi kalciumszintjének meghatározása után munkánkat az intracelluláris kalciumszintet moduláló reagensek hatásának tesztelésével folytattuk. A széles körben alkalmazott ionomycin egy kalcium-ionofór, ami kalciumcsatornákon keresztül, vagy kalciumcsatornákat képezve fejti ki hatását (Boldizsár és mtsai, 2002;
46
McCarthy és mtsai, 1989; Morgan és Jacob, 1994; Pierce és Rowland-Faux, 1992; Yagodin és mtsai, 1999). Az ionomycin kezelés után az intracelluláris szabad kalciumszint háromszoros emelkedése volt megfigyelhető coelomasejtekben, ami azonban nem jelentkezett a chloragocyta/eleocyta sejtek esetében. A továbbiakban a különböző gilisztafajok coelomasejtjeinek esetlegesen eltérő reakcióját tanulmányoztuk az ionomycinnel való kezelést követően. Az E. fetida fajhoz képest az A. caliginosa coelomasejtek kisebb mértékű, de nyugalmi szintjükhöz képest szignifikáns kalciumjel emelkedést mutattak ionomycinnel stimulálva. Ezek az eredmények összhangban vannak más gerinctelen fajok hemocytáinak (elsősorban Drosophila) tanulmányozásából származó eredményekkel. Érdekes módon a chloragocyta/eleocyta populáció nem reagált az ionomycin kezelésre, ami részben magyarázható azzal, hogy korábban más sejttípusokon is megfigyeltek hasonló ionofórrezisztens folyamatokat (Debkova és mtsai, 2000; Ishida és Chused, 1988; Sigova és mtsai, 1999). Az egyes sejttípusok eltérő érzékenységgel rendelkeznek kalcium-ionofórokkal, például ionomycinnel, illetve A23187-tel szemben (Kubota és mtsai, 1995). Kalcium homeosztázisukat tekintve a naív és memória T-sejtek jellegzetes eltolódást mutatnak érésük során. A naiv T-sejteknél magas érzékenység figyelhető meg ionofórokkal, thapsigarginnal és ConA mitogénnel szemben is, míg a memória T-sejtek egyik felsorolt anyagra sem reagálnak (Miller és mtsai, 1991; Sigova és mtsai, 1999). A chloragocyta/eleocyta sejtcsoport differenciálódásuk/érésük folyamán elveszítheti a kalciummobilizáló képességét. A memória T-sejtek esetében már beszámoltak arról, hogy érési folyamatuk során elvesztik kalciummobilizáló képességüket (Miller, 1991). Az ionomycin hatásának hiánya chloragocytákon azonban a sejtmembrán kalciumcsatornáinak alacsony permeabilitásával vagy zárva maradásukkal is magyarázható. Az ionomycin hatására bekövetkező intracelluláris kalciumszint emelkedés során először a sejten belüli kalciumraktárak kiürülése zajlik le, amit a sejtmembrán kalciumcsatornáinak aktiválódása követ (Morgan és Jacob, 1994). Ezt a feltevést igazolandó, az ionomycin coelomasejtekre kifejtett hatását kalciummentes PBS-ben is vizsgáltuk. Eredményeink szerint a coelomasejtek kevésbé reagáltak az ionomycin stimulációra kalciumszintjük emelkedésével az 1,8 mM extracelluláris kalcium jelenlétében inkubált
47
mintákhoz képest, tehát az ionomycin jelentős sejten belüli szabad kalciumszint emelkedést okoz a nyugalmi szinthez képest, mégpedig az intracelluláris kalciumraktárakon keresztül. Az ionomycin más gerinctelen modellállatok immunsejtjeire gyakorolt hatásáról kevés ismeret áll rendelkezésünkre. A Drosophila embrionális szöveteiből izolált S2 sejtek, amelyek hemocyta előalakok, reagálnak az ionomycin és a thapsigargin kezelésre (Yagodin és mtsai, 1998 és 1999). Nem ismert azonban, hogy más differenciálódott Drosophila immunsejttípusokra, például plazmatocytákra, lamellocytákra vagy kristálysejtekre az ionofórok milyen hatással vannak (Crozatier és Meister, 2007; Meister és Lagueux, 2003). A forbol 12-mirisztát 13-acetát (PMA) a protein kináz C enzim aktiválására általánosan használt forbol-észter (Goel és mtsai, 2007). A PMA a protein kináz C enzim természetes ligandját, a diacilglicerolt helyettesíti, az enzimmel reagálva számos biológiai folyamatot indít el jelátviteli utakon keresztül, melyek a sejt növekedéséhez és differenciálódásához vezetnek. A protein kináz C előfordulását korábban számos gerinctelen faj (pl. rovarok) esetében bizonyították már, míg újabb eredmények beszámoltak a PKC1 és PKC2 részleges klónozásáról és jellemzéséről Eisenia coelomasejtekben (Brulle és mtsai, 2006). Kísérleti eredményeink szerint a PKC aktiváló hatással rendelkező PMA coelomasejtek esetében sem a plazmamembránon keresztül, sem intracelluláris kalciumraktárakból történő Ca2+-mobilizációt nem indukált. Vizsgálatainkban a mintákat ionomycin stimulációt követően többféle PMA koncentrációval kezeltük, melynek eredménye a PMA koncentráció függvényében csökkenő kalciumjelet mutatott, bár a megfigyelt változás nem tért el szignifikánsan a kontrollként használt coelomasejtek kalciumjelétől. A szakirodalom szerint emlős neutrofil sejtek intracelluláris kalciumszintje sem mutat változást PMA kezelést követően (Mahomed és Anderson, 2000), illetve az ionomycin hatására megemelkedett kalciumszint PMA adásával csökkenthető (McCarthy és mtsai, 1989).
48
6.3. Ca2+ -ATPáz aktivitás coelomasejtekben A thapsigargin az endoplazmás retikulum Ca2+-ATPáz enzimeinek elterjedt kísérletes gátlószere (Ballarin és mtsai, 1997; Baron és mtsai, 2009; Granfeldt és mtsai, 2002; Yagodin és mtsai, 1998,1999). Munkánkban thapsigargin alkalmazásával vizsgáltuk a konzervált Ca2+-ATPázok jelenlétét gilisztasejteken, továbbá tisztáztuk, hogy a fő intracelluláris kalciumraktár az endoplazmás retikulumban található. A thapsigargin kalciumszintre gyakorolt hatásának detektálásával mindkét vizsgált gilisztafaj funkcionális Ca2+-ATPáz aktivitását kimutattuk, továbbá a thapsigargin előkezelést kapott minták csökkent kalciumszint emelkedése az ionomycin kezelést követően arra utal, hogy az effektor coelomocyták elsődleges kalciumraktára az endoplazmás retikulum. Az enzimaktivitás helyének meghatározását Ca2+-ATPáz citokémia segítségével végeztük el. Korábbi vizsgálatok szerint a giliszták és piócák mezodermális eredetű szövetei rendelkeznek ATPáz enzimaktivitással (De Eguileor és mtsai, 1999; Gastaldi és mtsai, 2007). Mindkét faj coelomasejtjei között találtunk pozitív enzimreakciót adó sejteket, melyek jellegzetes festődési mintázata a sejtmag körül volt látható. A festési mintázat megfelelhet az endoplazmás retikulum ATPáz enzimeitől származó jelnek.
6.4. Fitohemagglutinin és fMLP coelomasejtek kalciumjelére gyakorolt hatása A lipopoliszacharid (LPS), illetve a növényi lektinek közül például a fitohemagglutinin (PHA), a konkanavalin A (ConA), vagy a pokeweed mitogén (PWM) in vivo és in vitro kísérletekben gyakran alkalmazott mitogének. Ismert, hogy ezek az anyagok gerinces leukocyták aktivációja és proliferációja során a sejtek kalciumszintjének változását okozhatják (Lichtman és mtsai, 1983; Sei és Arora, 1991; Siegl és mtsai, 1998). Munkánk során arra kerestünk választ, hogy a gerinctelen fajok immunsejtjeinek mitogénekkel történő aktivációjakor megfigyelhető-e kalcium mobilizáció.
49
A mitogénstimulus hatására (ConA, PHA, valamint endotoxin) bekövetkező coelomasejt proliferációt timidin inkorporáción alapuló mérésekkel igazolták (Roch és mtasi, 1975; Roch, 1977). Ezeket az eredményeket propidium-jodid festésen és BrdUinkorporáción alapuló sejtciklus vizsgálatokkal is megerősítették (Quaglino és mtsai, 1996). Saját eredményeink szerint az ismételt sejtizolálásokat követő LPS, PWM és ConA kezelés a coelomasejtek proliferációját okozta. A különböző mitogénkezelések közül csak a PHA kezelés váltott ki detektálható kalciumszint emelkedést. Az LPS, PWM és ConA proliferációt fokozó hatása feltehetőleg kalciumtól független jelátviteli útvonalakon zajlik. A kemoattraktánsok, például az fMLP hatására a fehérvérsejtek, különösen a neutrofil granulocyták sejten belüli kalciumraktárainak tartalma mobilizálódik (Mahomed és Anderson, 2000; McCarthy és mtsai, 1989). Az fMLP elnyújtott hatása a mérés során körülbelül 1 perccel a stimulus után jelentkezett, és 5 perc után állt vissza a nyugalmi kalciumszint. Ezt a hatásmechanizmust a raktárakhoz tartozó kalciumcsatornák működése magyarázhatja (Tintinger és mtsai, 2005). A coelomasejtek korai, de viszonylag gyenge aktivációjában lehet szerepe ennek a folyamatnak. Más gerinctelen fajok hemocytáival végzett kísérletek arra utalnak, hogy az fMLP receptoron keresztüli bakteriális formil peptid felismerésének kulcsszerepe lehet a kemotaxisban és fagocitózisban (Garcia-Garcia és mtsai, 2009; Malagoli és Ottaviani, 2004).
6.5. Ismételt sejtizolálások és mitogénstimuláció hatása a coelomasejtek osztódására A giliszták immunreakciói során a coelomasejtszám helyreállítása alapvető fontosságú. Korábbi adatok szerint a Dendrobaena veneta giliszta coelomaüregében előforduló szabad coelomasejtek proliferációs aktivitása növelhető elektromos stimulussal végrehajtott ismételt coelomasejtizolálást követően (Homa és mtsai, 2008). Munkánkban ismételt sejtizolálásokat és regenerációs periódusokat alkalmazva megfigyeltük a mitotikus fázisban lévő coelomasejtek arányának emelkedését a második, illetve harmadik coelomasej-tizolálást követően. Az utolsó, negyedik sejtizoláláskor már a proliferáló coelomasejtek arányának csökkenését tapasztaltuk.
50
Vizsgálták a mitogének coelomasejtek sejtciklusára gyakorolt hatását is. Eszerint E. andrei giliszták coelomasejtjeinek proliferációs aktivitását ConA mitogénnel végzett stimulus szignifikáns mértékben fokozta, míg LPS esetében egy sokkal gyengébb mértékű proliferációt serkentő tendencia volt csak megfigyelhető (Homa és mtsai, 2013). Vizsgálatainkban a mitogének hosszabb és rövidebb távú hatásait is elemeztük E. fetida és A. caliginosa coelomasejtek proliferációjára. Ismételt mitogénstimulusokat alkalmazva E. fetida esetében a ConA és a PWM lektin erősebb, míg az LPS stimulus gyengébb sejtproliferációt serkentő hatását tapasztaltuk.
6.6. A lysenin expressziója Eisenia coelomasejtekben és szövetekben Korábbi immunhisztokémiai megfigyelések -poliklonális lysenin antiszérumot használva- beszámoltak pozitív immunreakciót mutató centrális chloragocyta sejtekről (Ohta
és
mtsai,
2000).
Vizsgálatainkban
sikerült
meghatároznunk
az
izolált
coelomasejttípusok és a szövetek lysenin expresszióját. Eredményeink szerint a lysenint nem a helyhez kötött, a chloragogén szövetet alkotó, centrális chloragocyta sejtek termelik, hanem a fehérje kizárólag a coelomaüreg szabad chloragocyta/eleocyta sejtjeiből származik. Ezeket az adatokat nemcsak az Intézetünkben előállított lysenin specifikus monoklonális a-EFCC5 ellenanyag által adott festési mintázat alapján állítjuk, ugyanis párhuzamosan a poliklonális a-lyseninnel végzett immunfestések hasonló eredményekkel szolgáltak. Nem zárható ki, hogy ezek a centrális chloragocyta sejtek rendelkeznek lysenin kódoló mRNS-sel, míg a szabad, érett chloragocyta sejtek lehetnek a lysenin proteinnel rendelkező effektor sejtek. Az ellentmondás feloldására a giliszták lysenin expressziójának szezonális, vagy a sejtek érése során bekövetkező változásaira vonatkozó további adatok birtokában lenne esély, ezek azonban még nem állnak rendelkezésre.
51
6.7. In vitro baktérium-kezelés befolyásolja a coelomasejtek által termelt lysenin mennyiségét Kísérleteinkben E. coli és S. aureus baktériumok giliszta immunsejtek lysenin expresszióját befolyásoló hatását vizsgáltuk. Az általunk választott módszer kiválóan alkalmas a coelomasejt-baktérium arány pontos beállítására, de eredményeink nem hasonlíthatóak teljesen össze a baktériumokkal injektált gilisztákat, vagy baktériumokkal szennyezett talajban tartott gilisztákat használó in vivo kísérleti rendszerek adataival (Köhlerova és mtsai, 2004; Wang és mtsai, 2010). Megállapíthatjuk azonban, hogy az E. coli baktériumokkal történt inkubáció után leírt lysenin expresszió csökkenés összhangban van a szakirodalomban publikált eredményekkel (Wang és mtsai, 2010). Eredményeink szerint a lysenin expresszió Grampozitív baktériumok hatására in vitro rendszerben fokozódhat, aminek pontos magyarázatához további vizsgálatok szükségesek. A lysenin egy sokrétű funkcióval rendelkező fehérje, adataink alapján antibakteriális feladata egyértelmű. Újabb kísérleti adatok alapján elmondható, hogy a lysenin az opszonizáció folyamatában is szerepet játszik. Coelomasejteket, illetve coelomafolyadékot inkubálva ezüst-nanopartikulumokkal leírták, hogy a sejtek által szekretált lysenin, illetve a folyadékban található lysenin bevonta a partikulumok felszínét, ezzel nagymértékben elősegítve a nanorészecskék intracelluláris akkumulációját (Hayashi és mtsai, 2013).
52
7. KONKLUZIÓK Munkánkban elsőként figyeltük meg a giliszta coelomasejt alcsoportok eltérő kalciumjelét, valamint ennek változásait különböző mediátorok (ionofór, kalciumpumpa gátlók, lektinek és kemoattraktáns) adagolása után. Vizsgálataink kiegészítik a szakirodalomban korábban publikált gerinces vagy gerinctelen modelleket felhasználó tanulmányokat, megerősítve általánosan előforduló jelátviteli mechanizmusok meglétét az élővilágban. Elméletünk szerint a giliszta immunsejtcsoportok esetén a különböző stresszhatások eltérő aktivációt vagy kalcium mobilizációt okozhatnak. Megfigyeléseink illeszkednek azoknak az eredményeknek a sorába, melyek szerint a kalcium mobilizálása gerinctelen fajoktól a gerincesekig - általános az immunsejtek jelátvitelében. Az általunk alkalmazott intracelluláris kalciumszint detektálási módszer jól alkalmazható különböző ökotoxikológiai tanulmányokban is, amelyek során gyakran használnak giliszta fajokat modellként. Ismert, hogy a nehézfémszennyezés befolyásolja a sejtek homeosztázisát, és a jelátviteli utak működését (Franco és másai, 2009; Kim és mtsai, 2002; Marchi és mtsai, 2004; Vergani és mtsai, 2009; Worth és mtsai, 2001). Nem ismert azonban, hogy ezek a hatások milyen módon jelentkeznek a giliszták sejtjeinek kalciumszintjén, és hogy ez megegyezik-e más fajoknál tapasztaltakkal. A gyűrűsférgek immunválaszában kitüntetett szerepet játszanak a különböző cytotoxikus és antimikrobiális fehérjék. Korábbi tanulmányok nem tárgyalták egyértelműen a lysenin molekula expressziós mintázatát az Eisenia szövetekben és feladatát az immunitásában.
Eredményeink
alapján
megállapítható,
hogy
a
lysenin
egy
multifunkcionális fehérje, mely több eltérő feladatot is elláthat az giliszták immunválasza során. Adataink alapján nemcsak cytotoxikus, hanem antibakteriális funkcióval is bír a lysenin. Érdekesség, hogy a Gram + és Gram – baktériumkezelés eltérően modulálja a lysenin expresszióját. Az eltérő expressziós mintázat pontosabb megértéséhez további vizsgálatok szükségesek. Érdekesség, hogy a fehérje részt vehet a celluláris immunfunkciókban olyan szinten, hogy a partikulumok felszínére tapadva, opszonizálva elősegíti azok internalizációját, tovább árnyalva a lyseninről eddig alkotott tudományos képet.
53
8. ÖSSZEFOGLALÁS Munkánk új eredményei a következők: 1.
Vizsgálatainkban áramlási citometria segítségével meghatároztuk az E. fetida és az A. caliginosa gilisztafajok granulált/hyalin coelomasejtjeinek és
chloragocyta/eleocyta
sejtjeinek
nyugalmi
intracelluláris
kalciumszintjeit. 2.
Detektáltuk E. fetida coelomasejtek intracelluláris kalciumszintjének ionomycin hatására megfigyelhető emelkedését. Az A. caliginosa coelomasejteket ionomycinnel stimulálva kisebb mértékű kalciumszintemelkedés tapasztalható. A chloragocyta/eleocyta sejtpopuláció egyik vizsgált faj esetében sem reagált az alkalmazott kalcium ionofór stimulusra. PMA és ionomycin együttes jelenléte befolyásolta a kalciummobilizációt.
3.
Thapsigargin előkezelés és ionomycin adagolása segítségével tisztáztuk, hogy a coelomasejtek elsődleges kalciumraktára az endoplazmatikus retikulum.
4.
A vizsgált növényi mitogének és az LPS endotoxin közül a PHA valószínűleg kalciumcsatornákon keresztül, a ConA, a PWM és az LPS pedig kalciumfüggetlen lépések után vezet a giliszta coelomasejtek aktivációjához és proliferációjához.
5.
Eredményeink szerint a bakteriális eredetű fMLP a coelomasejtek receptoraihoz kötődve vezet kismértékű kalciumszint emelkedéséhez.
6.
A giliszták coelomaüregében előforduló szabad, lysenint termelő sejteket chloragocyta/eleocyta sejtekként azonosítottuk.
7.
A giliszták immunsejtjeiben S. aureus kezelés után fokozott, E. coli esetében csökkenő lysenin expressziót találtunk.
54
9. IRODALOMJEGYZÉK Aton E., Renault T., Gignaire B., Thomas-Guyon H., Cognard C., Imbert N., 2006. A flow cytometric approach to study intracellular-free Ca2+ in Crassostrea gigas hemocytes. Fish Shellfish Immunol. 20; 493-502. Anderson R., Mahomed G.A., 1997. Calcium efflux and influx in f-met-leu-phe (fMLP) activated human neutrophils are chronologically distinct events. Clin. Exp. Immun.110; 132-138. Bokoch G. M.1995. Chemoattractant signaling in leukocyte activation. Blood 86; 16491660. Ballarin L., Cima F., Sabbadin A. 1997. Calcium homeostasis and yeast phagocytosis in hemocytes of the colonial ascidian Botryllus schlosseri. Comp. Biochem. Physiol. A118; 153-158. Baron S., Struyf S., Wuytack F., Van Damme J., Missiaen L., Raeymaekers L., Vanoevelen J. 2009. Contribution of intracellular Ca2+ stores to Ca2+ signaling during chemokinesis of human neutrophyl granulocytes. Biochem. Biophys. Acta 1793; 1041-1049. Batistic O., Kudla J. 2012. Analysis of calcium signaling pathways in plants. Biochem Biophys Acta. 1820; 1283-1293. Beschin A., Bilej M., Hanssens F., Raymakers J., Van Dyck E., Revets H., Brys L. Gomez J., De Baetselier P., Timmermans M. 1998. Identification and cloning of a glucan- and lipopolysaccharide-binding protein from Eisenia fetida earthworm involved in the activation of prophenoloxidase cascade. J. Biol. Chem. 273; 24948-24954. Beschin A., Bilej M., Brys L., Torreele E., Lucas L., Magez S., De Baetselier P. 1999. Convergent evolution of cytokines. Nature 400; 627-628. Bilej M., Sima P., Slipka J. 1992. Repeaated antigenic challenge induces earthworm coelomocyte proliferation. Immunol Lett. 32; 181-184. Bilej M., Brys L., Beschin A.,Lucas L., Vercauteren E., Hanusova R., De Baetselier P. 1995. Identification of a cytolytic protein in the coelomic fluid of Eisenia fetida earthworms. Immunol. Lett. 45; 123-128. Bilej M., Rossmann P., Sinkora M., Hanusova R., Beschin A., Raes G., De Baetselier P. 1998. Cellular expression of the cytolytic factor in earthworm Eisenia fetida. Immunol. Lett. 60; 23-29. Bilej M., De Baetselier P., Beschin A. 2000. Antimicrobial defense of the earthworm. Folia Microbiol. 45; 283-300.
55
Bilej M., De Baetselier P., Van Dijck E., Stijlemans B., Colige A., Beschin A. 2001. Distinct carbohydrate recognition domains of an invertebrate defense molecule recognize Gram-negative and Gram-positive bacteria. J. Biol. Chem. 276; 45840-45847. Bilej M, Joskova R., Van der Bergh R., Prochazkova P., Silerova M., Ameloot P., De Baetselier P., Beschin A. 2006. An invertebrate TNF functional analogue activates macrophages via lectine-saccharide interaction with ion channels. Int. Immunol. 18; 1663-1670. Bloc A., Lucas R., Van Dijck E., Bilej M., Dunant Y., De Baetselier P., Beschin A. 2002. An invertebrate defense molecule activates membrane conductance in mammalian cells by means of its lectine-like domain. Dev. Comp. Immunol. 26; 35-43. Boldizsar F., Berki T., Miseta A., Nemeth P., 2002. Effects of hyperglycaemia on the basal cytosolic free calcium level, calcium signal and tyrosine-phosphorylation in human Tcells. Immunol. Lett. 82; 159-164. Bruhn H., Winkelmann J., Andersen C., Andrä J., Leippe M. 2006. Dissection of the mechanisms of cytolytic and antimicrobial activity of lysenin, a defense protein of the annelid Eisenia fetida. Dev. Comp. Immunol. 30; 597-606. Brulle F., Mitta G., Cocquerelle C., Vieau D., Lemiere S., Lepretre A., Vandenbulcke F. 2006. Cloning and real-time PCR testing of 14 potential biomarkers in Eisenia fetida following cadmium exposure. Environ. Sci. Technol. 40; 2844-2850. Brulle F., Lemier S., Waterlot C., Douay F., Vandenbulcke F. 2011. Gene expression analysis of 4 biomarker candidates in Eisenia fetida exposed to an environmental metallic trace elements gradient: a microcosm study. Sci. Total Environ. 409; 54705482. Burlando B., Panfoli I., Viarengo A., Marchi B. Free radical-dependent Ca2+ signaling: role of Ca2+ induced Ca2+ release. Antiox. Redox. Signal. 3; 525-530. Case R.M., Eisner D., Gurney A., Jones O., Muallem S., Verkhratsky A .2007. Evolution of calcium homeostasis: from the birth of the first cell to an omnipresent signalling system. Cell Calcium 42; 345-350. Carafoli E. 2002. Calcium signaling: A tale for all seasons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99; 1115-22. Carafoli E. 2005. Calcium- A universal carrier of biological signals. FEBS J. 272; 10731089. Cerenius L., Lee P.L., Söderhall K. 2008. The proPO system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trends Immunol. 29; 263-271.
56
Cholewa J., Feeney G.P., O’Reilly M., Sturzenbaum S.R., Morgan A.J., Plytycz B. 2006. Autofluorescence in eleocytes of some earthworm species. Folia Histchem. Cytobiol 44; 64-71. Cooper E.L. 1968. Transplantation immunity in annelids. I. Rejection of xenografts exchanged between Lumbricus terrestris and Eisenia fetida. Transplantation 6; 322-327. Cooper E.L. 1969. Neoplasia and transplantation immunity in annelids. Natl. Cancer Inst. Monogr. 31; 655-669. Cooper E.L. 1969b. Specific tissue graft rejection in earthworms. Science 166; 1414-1415. Cooper E.L. 1970. Transplantation immunity in helminths and annelids. Transplant. Proc. 2; 216-221. Cooper E.L. 1981. Phylogeny of cytotoxicity. Endeavor 4; 160-165. Cooper E.L., Roch P. 1986. Second-set allograft responses in the earthworm Lumbricus terrestris: kinetics and characteristics. Transplantation 4; 514-520. Cooper E.L., Mansour M.H. 1989. Distribution of Thy-1 in invertebrates and ectothermic vertebrates. In: Reif A.E. (Ed.) Cell surface antigen Thy-1. Immunology, Neurology and Therapeutic application. Marcel Dekker; pp 197-219. Cooper E.L. 1993. Comparative immunology: The value of annelids. In: Vetvicka V (Ed.) Immunology of annelids. Boca Raton CRC Press; pp 1-12. Cooper E.L., Suzuki M.M., Cossarizza A., Franceschi C.1996. Cytotoxic reactions in invertebrates: the eartworm model. In: Söderhall K., Iwanaga S., Vasta G.R. (Ed.) New directions in invertebrate immunology. SOS publications, Fair Haven, NJ; pp. 23-42. Cooper E.L. Kauschke E., Cossarizza A., Franceschi C. 1999. Cell adhesion and the immune system: a case study using earthworms. Microscopy Res. Tech. 44; 237-253. Cooper E.L., Kauschke E., Cossarizza A. 2002. Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff. Bioassays 24; 319-333. Cossarizza A., Cooper E.L., Suzuki M.M., Salvioli S., Capri M., Gri G., Quaglino D., Franceschi C. 1996. Eartworm leukocytes that are not phagocytyc and cross-react with several human epitopes can kill human tumor cell lines. Expl. Cell. Res. 224; 174-182. Crozatier M., Meister M. 2007. Drosophila hematopoisesis. Cell. Microbiol. 9; 1117-1126. Currie J.C., Fortier S., Sina A., Galipeau J., Cao J., Annabi B. 2007. MT1-MMP downregulates the glucose 6-phosphate transporter expression in marrow stromal cells: a molecular link between pro-MMP-2 activation, chemotaxis, and cell survival. J. Biol. Chem. 282; 8142-8149.
57
Csikós G, Lippai M, Lukácsovich T, Juhász G, Henn L, Erdélyi M, Maróy P, Sass M. 2009. A novel role for the Drosophila epsin (lqf): involvement in autophagy. Autophagy 5; 636-648. Debkova E.N., Sigova A.A:, Zinchenko V.P. 2000. Mechanism of action of calcium ionophores on intact cells: ionophore-resistent cells. Membr. Cell Biol 13; 357-368. De Eguileor M., Tettamatti G., Grimaldi A., Boselli A., Scari G., Valvassori R., Cooper E.L., Lanzavecchia G. 1999. Histopathological changes after induced injury in leeches. J. Inv. Pathol. 74; 14-28. Engelmann P., Pal J., Berki T., Cooper E.L., Nemeth P. 2002. Earthworm leukocytes react with different mammalian antigen-specific monoclonal antibodies. Zoology 105; 257265. Engelmann P., Palinkas L., Cooper E. L., Nemeth P., 2005. Monoclonal antibodies identify four distinct annelid leukocyte markers. Dev. Comp. Immunol. 29; 599-614. Engelmann P., Cooper E. L., Opper B., Nemeth P. 2011. Eartworm innate immune system. In: Karaca A. (Ed.) Biology of earthworms. Springer Verlag, Heidelberg pp. 229-245. Eue I., Kauschke E., Mohrig W., Cooper E.L. 1998. Isolation and characterization of earthworm hemolysins and agglutinins. Dev. Comp. Immunol. 22; 13-25. Fischer E. 1993. The myelo-erytroid nature of the chloragogenous like tissues of the annelids: a review. Exp. Gerontol. 12; 69-74. Fortier S., Touaibia M., Lord-Dufour S, Galipeau J, Roy R, Annabi B. 2008 Tetra- and hexavalent mannosides inhibit the pro-apoptotic, antiproliferative and cell surface clustering effects of concanavalin-A: impact on MT1-MMP functions in marrow-derived mesenchymal stromal cells. Glycobiology. 18; 195-204. Franco R., Sanchez-Olea R., Reyes-Reyes E.M., Panayiotidis M.I. 2009. Environmental toxicity, oxidative stress and apoptosis: ménage a trios. Mutat. Res. 674; 3-22. Garcia-Garcia E., Garcia-Garcia P.I., Rosales C. 2009. An fMLP receptor is involved in in activation of phagocytosis by hemocytes from specific insect species. Dev. Comp. Immunol. 33; 728-739. Gastaldi L., Ranzato E., Capri F., Hankard P., Pérés G., Canesi L., Viarengo A., Pons G. 2007. Application of a biomarker battery for the evaluation of the sublethal effects of pollutants in the earthworm Eisenia andrei. Comp. Biochem. Physiol.C146; 398-405. Goel G., Makkar H.P.S., Francis G., Becker K. 2007. Phorbol esters: structure, biological activity and toxicity in animals. Int. J. Toxicol. 26; 279-288.
58
Goodman G.W., Sultzer B.M. 1979. Endotoxin protein is a mitogen and polyclonal activator of human B lymphocytes. J Exp Med 149; 713–723. Granfeldt D., Samuelsson M., Karlsson A. 2002. Capacitative Ca2+ influx and activation of the neutrophil respiratory burst. Different regulation of plasma membrane- and granulelocalized NADPH-oxidase. J. Leukoc. Biol. 71; 611-617. Grant P., Clothier R.H., Johnson R.O., Schott S., Ruben L.N. 1995. The time course, localization and quantitation of T- and B-cell mitogen-driven apoptosis in vivo. Immunol Lett.47; 227-31. Hayashi Y., Miclaus T., Scavenius C., Kwiatkowska K., Sobota A, Engelmann P., ScottFordsmand J., Johannes Enghild J., Sutherland D.S. 2013. Species differences take shape at nanoparticles: protein-corona made of the native repertoire assists cellular interaction. Environ. Sci Technol 47; 14367-14375. Holm K., Dupont S., Sköld H., Stenius A., Thorndyke M., Hernroth D. 2008. Induced cell proliferation in putative haematopoietic tissues of the sea star, Asterias rubens (L.). J. Exp. Biol. 211; 2551-2558. Homa J., Bzowska M., Klimek M., Plytycz B. 2008. Flow cytometric quantification of proliferating coelomocytes non-invasively retrieved from the earthworm, Dendrobaena veneta. Dev. Comp. Immunol. 32; 9-14. Homa J., Zorska A., Wesolowski D., Chadzinska M. 2013. Dermal exposure to immunostimulants induces changes in activity and proliferation of coelomocytes of Eisenia andrei. J. Comp. Physiol. B. 183; 313-322. Honti V, Cinege G, Csordás G, Kurucz E, Zsámboki J, Evans CJ, Banerjee U, Andó I. 2013. Fly 7; 263-266. Ishida Y., Chused T.M. 1988. Heterogeneity of lymphocyte calcium metabolism is caused by T cell-specific calcium-sensitive potassium cannel and sensivity of the calcium ATPase pump to membrane potential. J. Exp. Med. 168; 839-852. Jamieson B.G.M. 1981. Chloragocytes in Jamieson B.G.M. (Ed.): The ultrastructure of the Oligochaeta. Academic Press, New York; pp 96-118. Kauschke E., Pagliara P., Stabili L., Cooper E.L. 1997. Characterization of proteolytic activity in coelomic fluid of L. terrestris. Comp. Biochem. Physiol. 116; 235-242. Kauschke E., Komiyama K., Moro I., Eue I., Konig S., Cooper E.L. 2001. Evidence for perforin-like associated with earthworm leukocytes. Zoology 104; 13-24. Kim S.H., Johnson V.J., Sharma R.P. 2002. Mercury inhibits nitric oxide production but activates proinflammatory cytokine expression in murine macrophage: differential
59
modulation of NF-Kappa beta and p38 MAPK signaling pathways. Nitric Oxide 7; 6774. Köhler G., Milstein C. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinied specificity. Nature 256; 495-497. Köhlerova P., Beschin A., Silerova M., De Baetselier P., Bilej M. 2004. Effects of experimental microbial challenge on the expression of defense molecules in Eisenia foetida earthworms. Dev. Comp. Immunol. 28; 701-711. Kobayashi H., Ohta N., Umeda M. 2004. Biology of lysenin a protein in the coelomic fluid of the earthworm Eisenia fetida. Int. Rev. Cytol. 236; 45-99. Kubota M., Kataoka A., Okuda A., Bessho R., Lin Y. W., Wakazono Y., Usami I., Akiyama Y., Furusho K., 1995. Selection and partial characterization of calcium ionophore (A23187) resistant cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 213; 541-549. Kvell K., Cooper E.L., Engelmann P., Bovari J., Nemeth P. 2007. Blurring borders: Innate immunity with adaptive features. Clin. Dev. Immunol. Article ID 83671. Lange S., Kauschke E., Mohrig W., Cooper E.L. 1999. Biochemical characteristics of eiseniapore, a pore foming protein in the coelomic fluid of earthworms. Eur. J. Biochem. 263; 1-11. Langenbacher A., Chen J.N. 2008. Calcium signaling: a common thread in vertebrate leftright axis development. Dev. Dyn. 237; 3491-3496. Lasségues M., Roch P., Valembois P. 1989. Antibacterial activity of Eisenia fetida andrei coelomic fluid: specificity of the induced activity. J. Inverteb. Pathol. 54; 28-31. Lasségues M., Milochau A., Doignon F., Du Pasquier L., Valembois P. 1997. Sequence and expression of an Eisenia fetida derived cDNA clone that encodes the 40 kDa fetidin antimicrobial protein. Eur. J. Biochem. 246; 756-762. Leipner C., Tuckova L., Rejneck J., Langer J. 1993. Serine proteases in coelomic fluid of annelids Eisenia fetida and Lumbricus terrestris. Comp. Biochem. Physiol. 105; 637641. Leippe M., Müller-Eberhard H. J.1994. The pore-forming peptide of Entamoeba histolytica, the prozoan parasite causing human amoebiasis. Toxicology 87; 5-18. Lichtman A.H., Segel G.B., Lichtman M.A. 1983. The role of calcium in lymphocyte proliferation. Blood 61; 413-422. Linthicum D.S., Stein E.A., Marks D.H., Cooper E.L. 1977. Electron-microscopic observations of normal coelomocytes from the eartworm Lumbricus terrestris. Cell Tissue Res. 185; 315-330.
60
Ma D., Yu H., Lin D., Sun Y., Liu L., Liu Y., Dai B., Chen W., Cao J. 2009. S6K1 is involved in polyploidization through its phosphorylation at Thr421/Ser424. J Cell Physiol. 219; 31-44. Mahomed A.G., Anderson R. 2000. Activation of human neutrophils with chemotactic peptide, opsonized zymosan and the calcium ionophore A23187, but not with a phorbol ester is accompanied by efflux and store-operated influx of calcium. Inflammation 24; 559-569. Malagoli D., Ottaviani E. 2004. Yessotoxin affects fMLP-induced cell shape changes in Mytilus galloprovincialis immunocytes. Cell Biol. Int. 28; 57-61. Marchi B., Burlando B., Moore M.N., Viarengo A. 2004. Mercury- and copper-induced lysosomal membrane destabilisation depends on Ca2+ dependent phospholipase A2 activation. Aquat. Toxicol. 66; 197-204. McCarthy S.A., Hallam T.J., Merritt J.E., 1989. Activation of protein kinase C in human neutrophils attenuates agonist-stimulated rises in cytosolic free in cytosolic free Ca2+ concentration by inhibiting bivalent-cation and intracellular Ca2+ release in addition to stimulate Ca2+ efflux. Biochem. J. 264; 357-364. Meister M., Lagueux M. 2003. Drosophila blood cells. Cell. Microbiol. 5; 573-580. Miller R.A. 1991. Accumulation of hypersensitive calcium extruding memory T cells as a key feature of age-dependent immune dysfunction. Clin. Immunol. Immunopathol. 58; 305-317. Minta A., Kao J. P., Tsien R. Y., 1989. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J. Biol. Chem. 264; 8171-8178. Morgan A.J., Jacob R. 1994. Ionomycin enhances Ca2+ influx by stimulating storeregulated cation entry and not by a direct action at the plasma membrane. Biochem. J. 300; 665-672. Morgan A.J., Stürzenbaum S.R., Winters C., Grime G. W. Aziz N.A., Kille P. 2004. Differential metallothionein expression in earthworm (Lumbricus rubellus) tissues. Ecotoxicol. Environ. Saf. 57; 11-19. Na H.J., Park J.S., Pyo J.H., Lee S.H., Jeon H.J., Kim Y.S., Yoo M.A. 2013. Mechanisms of metformin: Inhibition of DNA damage and proliferative activity in Drosophila midgut stem cell. Mech. Ageing Dev. 134; 381-390. Neal M.D., Richarddson W.M., Sodhi C.P., Russo A., Hackam D.J. 2011. Intestinal stem cells and their roles during mucosal injury and repair. JSR 167; 1-8. Oh- Hora M., Rao A. 2008. Calcium in lymphocytes. Curr. Opin. Immunol. 20.; 205-258.
61
Ohta N., Shioda S., Sekizawa Y., Nakai Y., Kobayashi H. 2000. Sites of the expression of mRNA for lysenin a protein isolated from the coelomic fluid of the earthworm Eisenia foetida. Cell Tissue Res. 302; 263-270. Pierce S.K., Rowland-Faux L.M. 1992. Ionomycin produces an improved volume recovery by an increased efflux of taurin from hypoosmoticallly stressed molluscan red blood cells. Cell Calcium 13; 321-327. Panfoli I., Burlando B., Viarengo A. 1999. Cyclic ADP-ribose-dependent Ca2+ release is modulated by free Ca2+ in the scallop sarcoplasmic reticulum. Biochem. Biophys. Res. Commun. 257; 57-62. Plytycz B., Homa J., Koziol B., Rozanowska M., Morgan A.J. 2006. Riboflavin content in autofluorescent earthworm coelomocytes is species-specific. Folia Histochem. Cytobiol. 44; 275-280. Polanowski A., Wilusz T. 1996. Serine protease inhibitors from insect hemolymph. Acta Biochem. Polonica 43; 445-454. Quaglino D., Cooper E.L., Salvioli S., Capri M., Suzuki M.M., Ronchetti I.P.Franceschi C., Cossarizza A. 1996. Earthworm coelomocytes in vitro: cellular features and “granuloma” formation during cytotoxic activity against the mammalian tumor cell target K562. Eur. J. Cell Biol. 70; 278-288. Roch P., Valembois P., Du Pasquirel L. 1975. Response of earthworm leukocytes to concanavalin A and transplantation antigens. Adv. Exp. Med. Biol. 64; 45-54. Roch P. 1977. Reactivity in vitro of the leukocytes of the earthworm Eisenia fetida Sav, to several mitogenic substanes. C. R. Acad. Sci. Hebd. Seances Acad. Sci. D284; 705-708. Roch P., Cooper E.L., Eskinazi D.P. 1983. Serological evidences for a membrane structure related to human ß2 microglobulin expressed by certain earthworm leukocytes. Eur. J. Immunol. 13; 1037-1042. Roch P., Stabili L., Pagliara P. 1991. Purification of serine proteases from the coelomic cell of earthworms (Eisenia fetida). Comp. Biochem. Physiol. 98; 597-602. Salamat Z., Sullivan J.T. 2009. Involvement of protein kinase C signalling and mitogenactivated protein kinase in the amebocyte-producing organ of Biomphalaria glabrata (Mollusca). Dev. Comp. Immun. 33; 725-727. Sei Y., Arora P.K. 1991. Quantitative analysis of calcium mobilization after stimulation with mitogens or anti-CD3 antibodies. Simultaneous flou-3 and immunofluorescence flow cytometry. J. Immunol. Meth. 137; 237-244.
62
Sekizawa Y., Hagiwara K., Nakajima T., Kobayashi H. 1996a. A novel protein, lysenin that causes contraction of the isolated rat aorta: its purification from the coelomic fluid of the earthworm Eisenia foetida. Buiomed. Res., 17; 197-203. Sekizawa Y., Ohta N., Natori S., Kobayashi H. 1996b. Immunocytochemical localization of lysenin a novel protein isolated from the coelomic fluid of earthworm Eisenia foetida. Biomed. Res. 17; 327-330. Sekizawa Y., Kubo T., Kobayashi H., Nakajima T., Natori S. 1997. Molecular cloning of lysenin, a novel protein in the earthworm Eisenia foetida that causes contraction of rat vascular smooth muscle. Gene 191; 97-102. Shogomori H., Kobayashi T. 2008. Lysenin: a sphingomyelin specific pore-forming protein. Biochem. Biophys. Acta 1780; 612-618. Siegl E., Nebe B., Blunk H., Rychly J. 1998. Detection of mitogen used stimulation of leukocytes from the rainbow trout (Oncorynchus mykiss) by flow cytometry analysis of intracellular calcium. Comp. Biochem. Physiol. 119A; 915-923. Sigova A., Debkova E., Zinchenko V., Litvinov I. 1999. A comparative study of the calcium system in memory T cells and naïve T cells. FEBS Lett. 447; 34-38. Silerova M., Kauschke E., Procházková P., Josková R., Tusková L., Bilej M. 2007. Characterization, molecular cloning and localization of calreticulin in Eisenia fetida earthworms. Gene 397; 169-177. Stein E., Avtalion R.R., Cooper E.L. 1977. The coelomocytes of the earthworm Lumbricus terrestris: morphology and phagióocytic propertties. J. Morphol. 153; 467477. Suzuki Y., Inoue T., Ra C. 2012. Calcium signaling in mast cells: focusing on L-type calcium channels. Adv. Exp. Med. Biol. 740:955-77. Tintinger G., Steel H.C., Anderson R. 2005. Taming the neutrophil: calcium clearance and influx mechanisms as novel targets for pharmacological control. Clin. Exp. Immunol. 141; 191-200. Tough D.F., Sun S., Sprent J. 1997. T cell stimulation in vivo by lipopolysaccharide (LPS). J. Exp. Med. 185; 2089-2094. Toupin J., Lamoureux G. 1976. Coelomocytes of earthworms: the T-cell-like rosette. Cell Immunol. 26; 127-132. Toupin J., Marks D.H., Cooper E.L., Lamoureux G. 1977. Earthworm coelomocytes in vitro. In vitro 13; 218-222.
63
Vadiveloo P.K., Keramidaris E., Morrison W.A., Stewart A.G. 2001. Lipopolysaccharideinduced cell cycle arrest in macrophages occurs independently of nitric oxide synthase II induction. Biochim Biophys Act 1539; 140–146. Valembois P., Roch P., Lasségue M. 1986. Antibacterial molecules in annelids in Bréhelin M. (Ed.) Immnity in invertebrates. Springer Verlag, Heeidelberg; pp 74-93. Vergani L., Lanza C., Scarabelli L., Canesi L., Gallo G. 2009. Heavy metal and growth hormone pathways in metallothionein regulation in fish RTH-149 cell line. Comp. Biochem. Physiol. C 149; 572-580. Vetvicka V., Sima P., 2009. Origins and functions of annelide immune cells: the concise survey. Inv. Surv. J. 6; 138-143. Viarengo A., Mancinelli G., Pertica M., Fabbri M., Orunesu M. 1993. Effects of heavy metals on Ca2+ ATPase activity present in gill cell plasma-membrane of mussels (Mytilus galloprovincialis Lam.) Comp. Biochem. Physiol. C 106; 655-660. Vig M., Kinet J.P. 2009. Calcium signaling in immune cells. Nat. Immunol. 10; 21-27. Wang X., Chang L., Sun Z., Zhang Y. 2010. Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins in the earthworm Eisenia fetida during Escherichia coli O157:H7 stress. J. Proteome Res. 9; 6547-6560. Whitaker M. 2006. Calcium microdomains and cell cycle control. Cell Calcium 40; 585592. Whitaker M. 2008. Calcium signaling in early embryos. Phílos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363; 1401-1418. Worth R.G., Esper R.M., Warra N.S., Kindzelski A.L., Rosenspire A.L., Todd R.F., Petty H.R. 2001. Mercury inhibition of neutrophil activity: evidence of aberrant cellular signaling and incoherent cellular metabolism. Scand. J. Immunol. 53; 49-55. Yagodin S., Hardie R.C., Lansdell S.J., Millar N.S., Mason W.T., Sattelle D.B. 1998. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium 23; 219-228. Yagodin S., Pivovarova N.B., Andrews S. B., Sattelle D.B. 1999. Functional in characterization of Thapsigargin and agonist-insensitive acidic Ca2+ stores Drosophila melanogaster S2 cell lines. Cell Calcium 25; 429-435. Yip E. C., Wong Y. H., Wong J. T. 2001. Bacterial formyl peptide mediated chemotaxis and extracellular acidification in shrim haemocytes. Dev. Comp. Immunol. 25; 269-277. Zamboni I., DeMartino C., 1967. Buffered picric acid-formaldehyde: a new rapid fixative for electron microscopy. J. Cell Biol. 35, 148.
64
10. A DOLGOZAT ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA Opper B., Németh P., Engelmann P.: Calcium is required for coelomocyte activation in earthworms. MOL IMMUNOL. 2010; 47(11-12): 2047-2056. IF: 2,9; Független idéző: 4 Engelmann P., Cooper E.L., Opper B., Németh P.: Earthworm innate immune system. In A. Karaca (Ed.): Biology of earthworms, Soil Biology 24. Springer Verlag Heidelberg, 2011; pp 229-245. Független idéző: 2 Engelmann P., Opper B., Németh P.: Interactions of intracellular calcium and immune response in earthworms. INV SURV J 2011; 8: 78-84. Opper B., Bognar A., Heidt D., Németh P., Engelmann P.: Revising lysenin expression of earthworm coelomocytes. DEV COMP IMMUNOL. 2013; 39(3):214-218. IF: 3,2 (2012); Független idéző: 2
11. EGYÉB TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA Horvath G., Reglodi D., Brubel R., Halasz M., Barakonyi A., Tamas A., Fabian E., Opper B., Toth G., Cohen M., Szereday L.: Investigatin of the possible functions of PACAP in human trophoblast cells. J MOL NEUROSCI 2014 May 30. [Epub ahead of print] Szakaly P., Laszlo E., Kovacs K., Racz B., Horvath G., Ferencz A., Lubics A., Kiss P., Tamas A., Brubel R., Opper B., Baba A., Hashimoto H., Farkas J., Matkovits A., Magyarlaki T., Helyes Z., Reglodi D.: Mice deficient in pituitary adenylate cyclase activating polypeptid (PACAP) show increased susceptibility to in vivo renal ischaemia/reperfuson injury. NEUROPEPTIDES. 2011; 5:113-121.
65
Horvath G., Brubel R., Kovacs K., Reglodi D., Opper B., Ferencz A., Szakaly P., Laszlo E., Hau L., Kiss P., Tamas A., Racz B.: Effects of PACAP on the oxidative stress-induced cell death in rat kidney and human hepatocyte cells. J MOL NEUROSCI. 2011; 43(1):6775. Horvath G., Reglodi D., Opper B., Brubel R., Tamas A., Kiss P., Toth G., Csernus V., Matkovits A., Racz B.: Effects of PACAP on the oxidative stress-induced cell death in chicken pinealocytes by the phase of the circadian clock. NEUROSCI LETT 2010; 484(2):148-52. Matics R., Varga S., Opper B., Klein A.K., Horvath G., Roulin A., Putnoky P., Hoffmann Gy.: Partitioning of genetic (RAPD) variability among sexes and populations of the Barn Owl (Tyto alba) in Europe. J RAPTOR RES. 2005; 39:142-148.
66
12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönöm témavezetőimnek, Dr. Engelmann Péternek és Dr. Németh Péternek, valamint a PTE Immunológiai és Biotechnológiai Intézet és Anatómia Intézet munkatársainak a dolgozat elkészítéséhez nyújtott segítségüket.
67
13. MELLÉKLETEK (A DOLGOZAT ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK)
68
Molecular Immunology 47 (2010) 2047–2056
Contents lists available at ScienceDirect
Molecular Immunology journal homepage: www.elsevier.com/locate/molimm
Calcium is required for coelomocyte activation in earthworms Balázs Opper a,b , Péter Németh a , Péter Engelmann a,∗ a b
Department of Immunology and Biotechnology, Clinical Center, University of Pécs, Szigeti u. 12, H-7643 Pécs, Hungary Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Pécs, Szigeti u. 12, H-7643 Pécs, Hungary
a r t i c l e
i n f o
Article history: Received 10 February 2010 Received in revised form 12 April 2010 Accepted 13 April 2010 Available online 1 May 2010 Keywords: Innate immunity Coelomocytes Ca2+ influx Flow cytometry Ca2+ ATPase Lectins
a b s t r a c t The role of calcium signaling in activation of both innate and adaptive immunity is basically important, however, the evolutionary aspects are not clarified yet. Currently limited data are available about calcium levels of coelomocytes, cellular mediators of earthworm immunity. We aimed to observe basal and induced Ca2+ levels of coelomocyte subgroups after various stimulations in Eisenia fetida and Allolobophora caliginosa using a Ca2+ -sensitive dye. E. fetida chloragocytes had the highest basal Ca2+ levels among subpopulations; however there was no detectable Ca2+ influx after any stimuli, while coelomocytes showed strong Ca2+ increase after ionomycin treatment, which could be attenuated using phorbol ester. A. caliginosa coelomocytes showed a weak response to ionophore, while chloragocytes, similar to those in E. fetida, exhibited no changes after this stimulation. Intracellular calcium is mainly stored in the endoplasmic reticulum of coelomocytes as proved by thapsigargin treatments. Among several mitogens only phytohemagglutinin caused increased Ca2+ level in E. fetida coelomocytes, but not in A. caliginosa coelomocytes. Moreover, the chemoattractant fMLP revealed calcium influx of Eisenia coelomocytes. For the first time we observed various basal Ca2+ levels and sensibility to Ca2+ influx inducers (including mitogens and chemoattractant) of coelomocyte subgroups using flow cytometry. These observations suggest that Ca2+ influx and signal transduction may play crucial roles in the innate immunity of the earthworm. © 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction Calcium acts as a second messenger in a variety of cellular processes (Carafoli, 2002, 2005). Transient variations of cytoplasmic Ca2+ are necessary for cell activation and to ensure homeostasis (Case et al., 2007). Ca2+ is also involved in various processes including muscle contraction (Panfoli et al., 1999), reproduction (Whitaker, 2008), and immune response (Oh-hora and Rao, 2008; Vig and Kinet, 2009). The importance of intracellular free calcium levels in mammalian signal transduction pathways is well described (Case et al., 2007; Langenbacher and Chen, 2008; Oh-hora and Rao, 2008). Calcium signaling is essential in the activation of cellular components of innate and adaptive immune response in vertebrates. The increase of intracellular calcium level will be followed by the activation of many signaling pathways resulting chemotaxis, degranulation, phagocytosis, production of cytokines and proliferation.
Abbreviations: CCF, coelomic cytolytic factor; EFCC, Eisenia fetida coelomocyte clusters; LBSS, Lumbricus balanced salt solution; TG, thapsigargin. ∗ Corresponding author at: Department of Immunology and Biotechnology, Clinical Center, University of Pécs, Pécs, H-7643, Szigeti u. 12, Hungary. Tel.: +36 72 536 288; fax: +36 72 536 289. E-mail address:
[email protected] (P. Engelmann). 0161-5890/$ – see front matter © 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.molimm.2010.04.008
Invertebrate species have evolved similar mechanisms for regulating their biochemical pathways by means of evolutionarily conserved molecular components (Crozatier and Meister, 2007). Indeed, calcium is involved as a second messenger in intracellular signaling of invertebrates (Whitaker, 2006); however, the role of calcium has been investigated mainly in insect and mollusk species (Burlando et al., 2001; Whitaker, 2006). An in vitro approach has demonstrated that cytosolic calcium induces activation of phospholipase A2 in mussel hemocytes (Marchi et al., 2004). Heavy metals induce alteration of calcium homeostasis in mussel hemocytes and earthworm coelomocytes (Homa et al., 2007; Marchi et al., 2004; Viarengo et al., 1993). Earthworms became a model for comparative immunologists by demonstrating graft rejections through transplantation experiments (Cooper, 1968, 1969, 1970). These pioneer experimental results showed the existence of self/non-self recognition and immune mechanisms, before more extensive analyses of immunity were even initiated. Numerous studies on humoral and cellular properties of earthworm immune systems have been published (reviewed in Bilej et al. (2000) and Cooper et al. (2002)). Based on their ultrastructural and cytochemical properties, three main populations of earthworm leukocytes, so called coelomocytes (immune cells of body cavity), can be defined and confirmed: granular, hyaline coelomocytes and chloragocytes (Cooper et al., 2002). Our own flow cytometric measurements have likewise identified three different populations of coelomocytes (R1, R2, R3), which
2048
B. Opper et al. / Molecular Immunology 47 (2010) 2047–2056
correspond to these previously identified coelomocyte populations (Engelmann et al., 2002). Recently, a lipopolysaccharide (LPS)-, 1,3-glucans-, muramic acid-, and N,N’-diacetylchitobiose-binding protein named coelomic cytolytic factor (CCF) has been identified and characterized. This molecule is a pattern recognition receptor (PRR) present in earthworm’s coelomic fluid and coelomocytes. Following binding to pathogen associated molecular patterns (PAMPs), CCF triggers the prophenoloxidase cascade, an important invertebrate immune mechanism (Beschin et al., 1998, 1999; Bilej et al., 1998, 2001, 2006; Bloc et al., 2002) and also exerts opsonising properties (Bilej et al., 1995) that aid in phagocytosis. The prophenoloxidase (proPO) system is well known from analyses of other invertebrates, mainly arthropods (insects, crustaceans) (Cerenius et al., 2008). These multiple biological activities point to a crucial role of CCF in innate immune reactions in earthworms and evidence accumulates that lectin-like interactions serve as initial recognition events. So far, it is known that CCF has unique antigen recognition characteristics; although non-self recognition by CCF may accelerate various signal transduction pathways still unknown in annelids. There are few data available concerning cytosolic calcium levels of earthworm coelomocytes and the effect of ionophores or mitogens. Recently, an evolutionary conserved calcium-binding protein the calreticulin was cloned and characterized from Eisenia fetida earthworms. Calreticulin was highly expressed in various earthworm ˇ tissues including coelomocytes (Kauschke et al., 2001; Silerová et al., 2007). With these observations in mind it is essential to clarify the role of calcium in earthworm leukocytes. This is fundamental in order to augment understanding of earthworm immune responses. Our aim in this present study was to measure intracellular calcium levels of coelomocyte subpopulations and to reveal the role of calcium in coelomocyte activation. Recently, we have characterized three subpopulations of peripheral coelomocytes using specific monoclonal antibodies. Two of these subpopulations are the immune effector coelomocytes (Engelmann et al., 2005). However during measurements of intracellular calcium, we observed no significant differences between these two subgroups and thus included them as one population for calcium measurements. In the following experiments we tested how Ca2+ ionophores like ionomycin effect the intracellular calcium levels. Furthermore, we applied various mitogens (plant lectins and lipopolysaccharide) used for leukocyte stimulations and also the bacterial formyl peptide to test their calcium mobilization in earthworm immunecompetent cells. 2. Materials and methods 2.1. Coelomocyte extrusion Prior to experimental procedures earthworms were placed on moist paper towels for at least two days until there was no more visible gut content. This was done to minimize large scale contamination. Then whole earthworms were placed into cold coelomocyte extrusion buffer in Petri dishes (71.2 mM NaCl; 5 mM EGTA; 50.4 mM guiacol–glycerol–ether; 5% (v/v) ethanol; pH 7.3). After a brief period, coelomocytes were rapidly shed, harvested and washed twice in Lumbricus balanced salt solution (LBSS; 71.5 mM NaCl; 4.8 mM KCl; 4.2 mM NaHCO3 ; 1.1 mM MgSO4 ·7H2 O; 0.4 mM KH2 PO4 ; 0.3 mM NaH2 PO4 ; pH 7.3). 2.2. Chemicals Stock solutions of phytohemagglutinin (PHA-P, Sigma L1668, St. Louis, MO, USA), lipopolysaccharide (LPS, Sigma L6529), concanavalin A (ConA, Sigma C0412), and pokeweed mitogen (lectin from Phytolacca americana, PWM, Sigma L8777) were prepared
in LBSS. 1 mM stock solution of fMLP was provided by Orpegen Pharma (Heidelberg, Germany). Ionomycin (Sigma I0634) was dissolved in absolute alcohol and phorbol 12-myristate 13acetate (Sigma P8319) was prepared in DMSO (Sigma D8418). 1 mg/ml Fluo-3AM (Invitrogen Molecular Probes, F-1242, Eugene, OR, USA) stock solution was dissolved in DMSO containing 15% Pluronic-F-127 (Sigma P2443). Thapsigargin was used in 1 mM stock concentration dissolved in DMSO. All reagents were kept in −20 ◦ C until used in experiments. 2.3. Loading of coelomocytes with Fluo-3 AM After harvesting, coelomocytes were resuspended in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma) or Ca2+ -free PBS at 107 /ml concentration and loaded with 1% Fluo-3 AM for 30 min at room temperature with gentle shaking (Boldizsar et al., 2002; Minta et al., 1989). Afterwards tubes were filled with 10 ml DMEM or Ca2+ free PBS and incubated additional 30 min. After this 1 h incubation period coelomocytes were centrifuged for 5 min at 1000 rpm and resuspended at 106 /ml concentration in DMEM or Ca2+ -free PBS. Fluo-3 AM fluorescent signal was measured in FL1 channel with flow cytometry. 2.4. Detection of intracellular calcium levels at basal state and upon treatments with ionophore, thapsigargin, mitogens and chemoattractant Aliquots of 700 l cell suspension were measured with BectonDickinson FACSCalibur flow cytometer. After 50 s measurement of the basal Ca2+ level, ionomycin, thapsigargin, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), different concentrations of mitogens (LPS, PHA ConA, PWM) and the bacterial peptide N-formyl-l-methionyl-lleucyl-l-phenylalanine (fMLP) were added to the tubes. To verify that the signal in FL1 channel was observed from living coelomocytes, 1 g/ml propidium iodide (PI) was added to the samples before measurements and stimulations. Data was collected from PI negative, viable coelomocytes. Absolute ethanol and DMSO (used for preparing ionomycin, thapsigargin and PMA solutions) were tested as controls in Ca2+ influx measurements. None of these tested reagents caused elevation of the intracellular Ca2+ . 2.5. Ca2+ ATPase enzyme cytochemistry Coelomocytes were spread onto glass slides using Cytospin 3 (SHANDON, Thermo Labsystems, Waltham, MA, USA) and dried overnight. Then, coelomocytes were incubated for 20 min at 37 ◦ C in Na-barbital buffer, pH 9.4, containing 3 mM ATP and 0.18% anhydrous CaCl2 . Slides were rinsed in 0.1% CaCl2 and 2% CoCl2 and then immersed in 0.5% ammonium sulfide for reaction development. After incubation coelomocytes were counterstained with Mayer’s haematoxylin (Reanal, Budapest, Hungary). Slides were observed with Nikon Eclipse 80i microscope (Auroscience Kft., Budapest, Hungary) equipped with a cooled CCD camera. Images were taken with SPOT imaging software package (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA). 2.6. Data analysis and statistics The collected flow cytometry data were analyzed with CellQuest and FCS Express softwares (De Novo Software, Los Angeles CA, USA). Kinetic plots were constructed with FlowJo 7.5 software (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Statistical analysis was performed with Microcal Origin (Microcal Software Inc., Northhampton, MA, USA). Results are presented as mean and all error bars represent the standard error of the mean. The effect of treatments was analyzed statistically by Student’s t-test (two
B. Opper et al. / Molecular Immunology 47 (2010) 2047–2056
2049
Fig. 1. Various intracellular calcium levels in coelomocyte and chloragocyte populations of Eisenia fetida and Allolobophora caliginosa. Earthworm coelomocytes isolated from coelomic cavity of E. fetida and A. caliginosa were analyzed using flow cytometry according to their size and granularity (A and B). Freshly isolated coelomocytes were loaded with Fluo-3 AM fluorescence dye and their FL1 fluorescence intensity was observed that corresponds to the intracellular free calcium level (C).
sample, equal variance). p < 0.05 was denoted as statistically significant. 3. Results 3.1. Basal calcium levels of coelomocyte subgroups of E. fetida and A. caliginosa Various coelomocyte subpopulations mediate distinct cellular functions of the earthworm immune system (Vetvicka and Sima, 2009). Earlier defined subgroups of free-floating coelomocytes in the coelomic fluid were observed by physical parameters such as their size and granularity in both E. fetida and Allolobophora caliginosa (Fig. 1A and B). We applied a flow cytometry-based assay to measure intracellular calcium levels. The intensity of Fluo-3 AM fluorescence dye corresponds to the free intracellular calcium levels. We observed significant differences in concentration of basal cytosolic Ca2+ among coelomocyte subgroups. In terms of the intracellular calcium of coelomocyte subpopulations in E. fetida, the highly granular chloragocyte subpopulation (upper gate) contained higher calcium level whereas granular and hyaline coelomocytes (lower gate) had moderate intracellular calcium levels. In addition, A. caliginosa has similar calcium levels in coelomocyte and chloragocyte subgroups as those observed in E. fetida (Fig. 1C). 3.2. Sustained calcium mobilization after ionomycin treatment in coelomocytes of both Eisenia and Allolobophora Freshly isolated coelomocytes were loaded with Fluo-3 AM in DMEM medium (containing 1.8 mM CaCl2 ). After 50 s of basal calcium level measurement, 7 M ionomycin were added to the tubes. Among subgroups of E. fetida coelomocytes we detected a cell population with a strong increase in intracellular Ca2+ levels (Fig. 2B and C). This coelomocyte population showed a significant 3–4-fold increase (p < 0.001) within seconds after adding iono-
mycin (Fig. 2D). The elevated Ca2+ level persisted over the 6 min observation period. However, concerning the other subpopulation, chloragocytes showed no difference in FL1 fluorescence intensity when comparing their basal intracellular Ca2+ amount to those treated with ionomycin (Fig. 2E–G). We also speculated whether there is any difference in the calcium response of coelomocytes that from different earthworm species. When we analyzed A. caliginosa coelomocytes using the same approach (Fig. 3A), coelomocytes showed a significantly increased Ca2+ response upon ionomycin treatment (p < 0.05), but the response was lower (1.3–1.5-fold) compared to E. fetida coelomocytes using the same ionomycin concentration (Fig. 3B–D). As for the chloragocytes of A. caliginosa, this cell population showed no response after ionomycin treatment similar to that in E. fetida (Fig. 3E–G).
3.3. Transient calcium mobilization of coelomocytes kept in calcium-free PBS after ionomycin treatment Ionomycin causes calcium increase in the cytoplasm by opening calcium channels in the plasma membranes and/or intracellular calcium stores. However in our experiments the source of the calcium influx in coelomocytes was not clear, and thus we performed the following experiment. Coelomocytes were loaded with Fluo3 AM in Ca2+ -free PBS and then flow cytometric measurements using ionomycin as calcium ionophore were performed. Coelomocyte subpopulation (lower gate) showed a characteristic increase upon ionomycin treatment, but it was lower (2-fold increase) when compared to those coelomocytes that were incubated in Ca2+ containing DMEM solution (3-fold change). Comparing their appropriate basal calcium levels, ionomycin triggered a significant increase (p < 0.001) in intracellular free calcium level (Fig. 4A) proving that ionomycin opens the intracellular calcium stores. Using coelomocytes from Allolobophora earthworms loaded Fluo-3 AM in PBS we have not found significant Ca2+ influx compared to basal level (data not shown).
2050
B. Opper et al. / Molecular Immunology 47 (2010) 2047–2056
Fig. 2. Ionomycin triggers high Ca2+ influx in coelomocytes but not in chloragocytes of E. fetida. Coelomocyte subpopulations (A, lower gate) loaded with Fluo-3 AM showed a significantly rapid increase of intracellular free Ca2+ levels upon 7 M ionomycin treatments (B and C). Analyzing results ionomycin treatment (D) caused significant elevated intracellular free Ca2+ level (mean ± SEM; n = 12; # p < 0.001). Chloragocytes (A, upper gate) showed no changes after exposure to different concentrations of ionomycin treatments (E–G). Fluorescent dot-plots (B and E) are representative examples from 12 independent experiments.
3.4. Phorbol 12-myristate 13-acetate caused no calcium influx itself, but together with ionomycin, it revealed calcium signal oscillation Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) is a phorbol ester activating specifically protein kinase C. Adding PMA to coelomocytes caused no increase of intracellular Ca2+ levels compared to basal calcium amount (Fig. 4B). Using various concentrations of this reagent we found no response in A. caliginosa coelomocytes (data not shown). Chloragocytes showed no changes in either species. However, after 1 min treatment with ionomycin we added 1 or 10 nM PMA to the coelomocytes, and we observed an immediate attenuation of intracellular Ca2+ signal (Fig. 4C). However, the observed attenuation effect was not significantly different from the ionomycin treated samples, but it was a PMA concentration dependent and a transient process. At 200 s of the observation period the ionomycin and PMA treated coelomocytes showed similar intracellular Ca2+ level as the ionomycin alone treated coelomocytes. 3.5. Evidence of thapsigargin sensitive calcium pumps in earthworm coelomocytes Thapsigargin is a specific inhibitor of the intracellular endoplasmic reticulum Ca2+ ATPases (SERCA pumps). We tested whether SERCA pump-like channels are involved in refilling the intracellular calcium stores in coelomocytes. Thapsigargin (TG) inhibited the provisory SERCA pumps of coelomocytes revealed by the elevation of intracellular free Ca2+ content (Fig. 5A and B). Applying 2 M of thapsigargin we observed first a weak (p < 0.05) and then a delayed but strongly significant Ca2+ efflux (p < 0.001) from intra-
cellular stores after 3 min of incubation with thapsigargin (Fig. 5C) in coelomocytes of E. fetida. Moreover, when coelomocytes of E. fetida were incubated with 2 M TG for 30 min and then ionomycin were added we observed significantly attenuated calcium influx (p < 0.01) compared to coelomocytes without thapsigargin pretreatment (Fig. 5D). Thapsigargin has a similar Ca2+ mobilization effect on the coelomocytes of A. caliginosa (Fig. 5E). Adding the same concentration of thapsigargin a similar delayed response was measured at the 200th second of the incubation period; however the significant Ca2+ efflux (p < 0.001) was lower compared to the coelomocytes of E. fetida. In addition to the analysis of functional intracellular Ca2+ pumps a cytochemical reaction was performed to localize and characterize the intracellular Ca2+ ATPases in earthworm coelomocytes. Coelomocytes stained positively for Ca2+ ATPase enzyme reaction in both earthworm species. The black cytochemical stainings showed a characteristic pattern in certain coelomocytes (Fig. 6A–D). The most prominent enzyme reaction was observed near to the nucleus; however in some occasion we could observed that the whole cytoplasm showed strong enzyme activity (Fig. 6B). Mostly small coelomocytes with less prominent cytoplasm and large nucleus were stained positively, while chloragocytes (eleocytes) and large coelomocytes appeared to be negative for this reaction. 3.6. Phytohemagglutinin transiently increases intracellular calcium levels in coelomocytes of Eisenia fetida To look at the effect of signal transduction pathway activators on Ca2+ influx, we tested commonly used mitogens from
B. Opper et al. / Molecular Immunology 47 (2010) 2047–2056
2051
Fig. 3. Ionomycin reveals moderate Ca2+ influx in coelomocytes but not in chloragocytes of A. caliginosa. Coelomocyte subpopulations of A. caliginosa (A, lower gate) have a weaker increase compared to E. fetida in intracellular free Ca2+ level upon 7 M ionomycin treatments (B and C). Results show that ionomycin (D) triggers the increase of intracellular free Ca2+ level (mean ± SEM, *p < 0.05; † p < 0.01). Chloragocytes (A, upper gate) showed no increase in the intracellular calcium level upon any concentration of ionomycin treatments (E–G). Fluorescent dot-plots (B and E) are representative examples from 10 independent experiments.
Fig. 4. Ionomycin releases Ca2+ from intracellular stores of coelomocytes and PMA causes moderate Ca2+ -oscillations. Coelomocytes increased moderately their intracellular free Ca2+ levels upon 7 M ionomycin treatment (A) when we omitted the extracellular calcium source using Ca2+ -free PBS solution. Results show that ionomycin triggers the elevation of intracellular Ca2+ amounts (mean ± SEM; n = 4; # p < 0.001) in both Ca2+ -containing and Ca2+ -free medium comparing to basal calcium level of coelomocytes. Moreover, we used PMA as another common signal transduction pathway activator, PMA itself did not cause Ca2+ mobilization (B) (mean ± SEM; n = 8). However applying 1 nM or 10 nM concentrations of PMA after ionomycin treatment have transiently decreased the intracellular free Ca2+ amount (C) in the coelomocytes of Eisenia fetida (mean ± SEM; n = 8);
2052
B. Opper et al. / Molecular Immunology 47 (2010) 2047–2056
Fig. 5. Thapsigargin inhibits Ca2+ sequestration of coelomocytes. Adding the 2 M thapsigargin to coelomocytes of E. fetida caused a rise in intracellular calcium level (A). The increase of intracellular Ca2+ showed a delayed kinetics (A and B). Shortly after TG addition we observed significant difference (*p < 0.05) compared to the basal calcium level (C), while later elevation of the calcium level showed much stronger significance (mean ± SEM; n = 8; † p < 0.01; # p < 0.001). Fluorescent dot-plot (A) is a representative example from eight independent experiments. Ionomycin stimuli caused an attenuated Ca2+ response in coelomocytes preincubated with 2 M thapsigargin (D) compared to coelomocytes of E. fetida without thapsigargin treatment (mean ± SEM; n = 6; p < 0.01). Adding the 2 M thapsigargin to coelomocytes of A. caliginosa caused a rise in intracellular calcium level (E). This increase of intracellular Ca2+ (mean ± SEM; n = 8; *p < 0.05; # p < 0.001) has a delayed kinetics similarly to TG coelomocytes of E. fetida (A and B).
Fig. 6. Ca2+ ATPase enzyme cytochemistry of earthworm coelomocytes. Ca2+ ATPase enzyme was detected by cytochemistry in different coelomocytes of E. fetida (A and B) and A. caliginosa (C and D) earthworms. Intense reactions can be observed around the nucleus in several coelomocytes (arrows) and in the cytoplasm (B, arrowhead). Large coelomocytes and chloragocytes (eleocytes) are negative for the enzyme reaction denoted with number sign (#) or asterisks (*), respectively. Scale bars: 20 m.
B. Opper et al. / Molecular Immunology 47 (2010) 2047–2056
2053
Fig. 7. Phytohemagglutinin causes Ca2+ influx in coelomocytes. Several mitogens were used to test their Ca2+ mobilization, among those only PHA proved to be active. 30 and 60 g/ml PHA solutions moderately increased the intracellular free Ca2+ level of coelomocytes from E. fetida (A–F). Our results clearly showed that PHA generates the mobilization of Ca2+ (C and F) compared to the basal calcium level (mean ± SEM; n = 4; *p < 0.05). Fluorescent dot-plots (A and D) are representative examples from four independent experiments at each concentration.
mouse and human experiments in coelomocytes, which included various concentrations of LPS, PHA, ConA and PWM lectins. Among them we only observed Ca2+ influx effect when PHA was applied to stimulate Eisenia coelomocytes. Phytohemagglutinin acts as polyclonal activator of T cells binding to sugar residues on the T cell receptor. We applied several PHA-P concentrations and observed an elevated intracellular Ca2+ level (1.4-fold, p < 0.05) at 30 and 60 g/ml concentrations (Fig. 7). Both concentrations caused transient Ca2+ influxes; however the effect was not strictly concentration dependent. Chloragocytes showed no response after this stimulation. Various concentrations of PHA were tested on Allolobophora coelomocytes and showed no significant Ca2+ influx.
3.7. Bacterial formyl peptide activates coelomocytes and transiently increases intracellular calcium Bacterial originated short fMLP peptide is a chemotactic molecule and potent activator for vertebrate phagocytes exerting intracellular calcium mobilization (Anderson and Mahomed, 1997; Bokoch, 1995), however there is increasing evidence about its similar function in invertebrate immune cells (Garcia-Garcia et al., 2009; Yip et al., 2001). We tested whether fMLP exerts a calcium mobilization effect in coelomocytes. Both 1 and 5 M formyl peptide caused Ca2+ influx in earthworm immune cells. The regular dot-plot of coelomocytes did not show a striking intracellular Ca2+ increase (Fig. 8A), how-
Fig. 8. Chemoattractant formyl-peptide evokes Ca2+ influx in coelomocytes. Various concentrations of the fMLP chemoattractant was applied to coelomocytes, 5 M fMLP evoked a weak, but ambiguous calcium mobilization in coelomocytes (A and B). The fMLP treatment triggered a transient Ca2+ flux in coelomocytes overtime compared to the basal coelomocyte intracellular Ca2+ level (C) (mean ± SEM; n = 4; *p < 0.05). Fluorescent dot-plot (A) is a representative example from four independent experiments.
2054
B. Opper et al. / Molecular Immunology 47 (2010) 2047–2056
ever the kinetic curve shows a clear elevation of intracellular Ca2+ level after adding fMLP (Fig. 8B). Moreover, analyzing several parallel independent measurements of intracellular Ca2+ level after 5 M fMLP addition showed a significant difference (p < 0.05) compared to the basal Ca2+ level (Fig. 8C). The fMLP treatment caused a transient rise of intracellular calcium in coelomocytes during the observation period (Fig. 8B and C). Using Ca2+ -free PBS we observed a similar rise of Ca2+ level after fMLP addition (data not shown), but there was no significant difference between the samples in PBS (without extracellular Ca2+ ) and DMEM (with 1.8 mM extracellular Ca2+ ). Allolobophora coelomocytes showed no Ca2+ influxes after fMLP treatment. 4. Discussion 4.1. Intracellular calcium levels of coelomocytes Calcium is a universal second messenger of signal transduction pathways in all cell types. Ca2+ controls proliferation, differentiation and transcription events in a variety of immune cells (neutrophils, macrophages, T and B lymphocytes) (Vig and Kinet, 2009). Knowledge concerning calcium influx involved in invertebrate immune cell signaling is sparse since studies have only analyzed hemocytes isolated from insects (Drosophila melanogaster) and mollusks (Crassotrea gigas) (Aton et al., 2006; Yagodin et al., 1999). In a recent study intracellular Ca2+ levels of hemocytes from the oyster C. gigas were analyzed for the first time with Fluo-3 AM staining using flow cytometry. Oyster hemocytes contained detectable amount of free calcium using different reaction solutions (hemolymph, artificial sea water). Moreover, the calcium modulator, ryanodine caused Ca2+ release from the endoplasmic reticulum (Aton et al., 2006). In the present study we applied a flow cytometry-based assay to measure intracellular calcium levels in the coelomocytes of Eisenia and Allolobophora earthworms. First, we compared the intracellular calcium levels of coelomocyte subpopulations in E. fetida and A. caliginosa. Chloragocyte subpopulation contained high calcium level whereas effector coelomocytes such as granular and hyaline coelomocytes had moderate intracellular calcium level. Recently, we have identified three distinct subpopulations of peripheral coelomocytes using specific monoclonal antibodies. Two of these populations designated with markers EFCC3 and EFCC4 are the immune effector coelomocytes. They exhibit several immune functions in particular phagocytosis and encapsulation (Engelmann et al., 2005). However during measurements of intracellular calcium, we observed no significant differences between these two subgroups and could thus consider them as one population for calcium measurements. 4.2. Ionomycin induces, while PMA attenuates the Ca2+ influx in coelomocytes In addition to basal coelomocyte Ca2+ levels, we were interested in how different calcium-modulators such as ionomycin and PMA could affect the intracellular calcium levels. Ionomycin is a widely used Ca2+ ionophore acting as a non-receptor mediated calcium channel activator (Boldizsar et al., 2002; McCarthy et al., 1989; Morgan and Jacob, 1994; Pierce and Rowland-Faux, 1992; Yagodin et al., 1999). Ionomycin induced a 3-fold increase in intracellular free Ca2+ levels. This Ca2+ influx appeared only in coelomocytes but not in chloragocytes. In the following we examined whether there was any difference in the calcium response of coelomocytes that originated from the different earthworm species. In contrast to E. fetida species A. caliginosa coelomocytes had a lower, but still significant, Ca2+ response after ionomycin treatment compared to the basal Ca2+ level. These results are consistent and correspond with
the ionomycin effect on haemopoetic cells from other organisms. However we had some conflicting results regarding to the other coelomocyte type, notable the chloragocyte (eleocyte) population. Surprisingly, chloragocytes have no intracellular calcium mobilization upon ionomycin stimulations. This is consistent with some other studies, which have demonstrated ionophore-resistant cells (Dedkova et al., 2000; Ishida and Chused, 1988; Sigova et al., 1999). Various types of cells differ in sensitivity to Ca2+ ionophores such as ionomycin and A23187 (Kubota et al., 1995). Naïve and memory T cells (CD44high CD45RBlow ) from mice show characteristic shift during maturation regarding to calcium homeostasis. Naïve T cells are highly responsible to ionophores, to the Ca2+ ATPase inhibitor thapsigargin and to ConA mitogen however, memory T cells appear to insensitive to all of the above mentioned compounds (Miller et al., 1991; Sigova et al., 1999). Some reports are suggesting that free floating chloragocytes (so called eleocytes) of the coelomic fluid are terminally differentiated cells originated from sessile chloragogenous tissue located around the midgut (Cholewa et al., 2006). During their maturation these cells change from sessile cells to freefloating cells and they may loose their calcium mobilization activity as it is already found on memory T cells (Miller, 1991). On the other hand, the lack of effect of ionomycin on chloragocytes may also be explained by that the plasma membrane channels have lower permeability for Ca2+ or remain closed. Reports on other invertebrates are very scarce with regards to the effect of ionomycin on immunocytes. Drosophila S2 cells respond upon ionomycin and thapsigargin treatments, but S2 cells are originally progenitor hemocytes isolated from embryonic tissues (Yagodin et al., 1998, 1999). In addition nothing is known about how ionophores act on distinct hemocyte types of Drosophila such as plasmatocytes, lammelocytes and crystal cells (Crozatier and Meister, 2007; Meister and Lagueux, 2003). Several studies indicate that ionomycin primarily acts on internal membranes releasing Ca2+ by activating storage operated Ca2+ channels of the plasma membrane (Morgan and Jacob, 1994). In order to support the hypothesis that ionomycin opens calcium channels in the plasma membranes and/or intracellular calcium stores, coelomocytes were loaded with Fluo-3 AM in calcium free PBS. We found that coelomocytes showed a lower increase of intracellular Ca2+ level after ionomycin treatments, when compared to those coelomocytes that were incubated in the presence of 1.8 mM extracellular Ca2+ source. This result suggests that ionomycin when comparing appropriate basal calcium levels, triggered a significant increase in intracellular free calcium. This increase is due to Ca2+ influx through plasma membrane and Ca2+ efflux from intracellular stores of coelomocytes. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) phorbol-ester is a common activator of the protein kinase C (PKC) enzyme (Goel et al., 2007). PMA mimics diacylglycerol the natural ligand of PKC molecules. Interaction between PMA and PKC affects several biological processes such as cell growth, differentiation and signal transduction pathways. PKC has been described in various invertebrates including insects and mollusks; however just recently PKC1 and PKC2 was partially cloned and characterized from Eisenia coelomocytes (Brulle et al., 2006). This report showed that worms exposed to different cadmium concentrations in soil have altered expression in genes encoding heat shock protein 60, catalase and metallothienin, but not in PKCs. Our experiments demonstrated that the PKC activator PMA neither induce Ca2+ influx through the plasma membrane; nor mobilizes Ca2+ from intracellular stores of coelomocytes. On the other hand when we applied different concentrations of PMA shortly after ionomycin treatments, a PMA concentration-dependent attenuation was observed; although this was not significant compared to control coelomocytes. These findings are consistent with those observed in mammalian cells (Mahomed and Anderson, 2000; McCarthy et al., 1989).
B. Opper et al. / Molecular Immunology 47 (2010) 2047–2056
2055
4.3. Existence of Ca2+ ATPase activity in coelomocytes
5. Conclusions
Thapsigargin is a commonly used drug to inhibit endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ ATPases in vertrebrate and invertebrate cells (Ballarin et al., 1997; Baron et al., 2009; Granfeldt et al., 2002; Yagodin et al., 1998, 1999). In our experiment we used thapsigargin to demonstrate the presence of functionally conserved Ca2+ ATPases in earthworms, and moreover to check whether the main intracellular Ca2+ store is located in the endoplasmic reticulum. Through thapsigargin treatments we demonstrated Ca2+ flux in both earthworm species which provided functional evidence of the existence of earthworm Ca2+ ATPases. Moreover, pretreatment with thapsigargin decreased the ionomycin evoked Ca2+ influx proving that one of the major Ca2+ stores of effector coelomocytes is located in the ER. In order to localize the Ca2+ ATPase activity coelomocytes were stained for Ca2+ ATPase enzyme cytochemistry. Earlier results showed ATPase activity in earthworm and leech tissues with mesodermal origin (De Eguileor et al., 1999; Gastaldi et al., 2007). Certain coelomocytes from both earthworm species appeared to be positive for this enzyme reaction. The most characteristic staining pattern was observed around the nucleus, which is consistent with the localization of ER ATPases.
This is the first report on calcium levels in coelomocytes of earthworm emphasizing subpopulation differences and activation events by different mediators such as ionophores, inhibitor of Ca2+ pumps, lectins and chemoattractant. The fact that our results do not seem to deviate significantly from those found in higher organisms including vertebrates is reassuring. Such findings underscore the universality of certain responses among divergent species. Our results lead us to propose a model where stress events cause activation/Ca2+ mobilization in earthworm immune cells with differences between coelomocyte and chloragocyte subpopulations. These results support the notion that calcium mobilization is an universally conserved activation mechanism which is essential in immune cell signaling from invertebrates to vertebrates. Finally, our approach to measure intracellular calcium in coelomocytes could be easily adapted for other applications for instance in ecotoxicology where earthworms are used as model organisms. It is well known that heavy metal pollution affects the cell homeostasis and its impact on signaling mechanisms is also well discussed (Franco et al., 2009; Kim et al., 2002; Marchi et al., 2004; Vergani et al., 2009; Worth et al., 2001). However, nothing is known about the effect of heavy metals or pesticides exposure on the calcium signaling in earthworms and whether it is similar or different compared to other organisms.
4.4. Immune molecules such as phytohemagglutinin and fMLP induce Ca2+ influx in coelomocytes
Acknowledgements Plant lectins such as phytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (ConA), wheat germ agglutinin, pokeweed mitogens (PWM) and lipopolysaccharide (LPS) endotoxins are commonly used mitogens in both in vitro and in vivo immunological experiments. It is known that some of these molecules evoke Ca2+ oscillations during the activation and proliferation processes of vertebrate leukocytes (Lichtman et al., 1983; Sei and Arora, 1991; Siegl et al., 1998). We tested whether mitogen induced calcium mobilization is an evolutionary conserved step in the activation of immune cells from invertebrates to vertebrates. So, we tested the effects of PHA, ConA, PWM and LPS on the intracellular calcium signals of coelomocytes. Among these four mitogens only PHA increased the intracellular calcium level in Eisenia coelomocytes. Previous studies indicate that coelomocytes proliferate upon mitogen stimulations (Roch et al., 1975; Roch, 1977). Coelomocytes show the strongest proliferation upon ConA treatment; however PHA and LPS stimulations have also mitogenic effect on certain coelomocyte types (Roch et al., 1975). More recently, these data were proved and complemented with cell cycle analysis using propidium iodide and BrdU stainings (Quaglino et al., 1996). Our data show that PHA evokes Ca2+ signal during activation of coelomocytes that may lead to proliferation, while other mitogens such as ConA and LPS may cause coelomocyte proliferation possibly through a Ca2+ -independent pathways. Chemoattractans such as bacterial formyl peptide fMLP lead to mobilization of calcium from intracellular stores of leukocytes notably neutrophil granulocytes (Mahomed and Anderson, 2000). Activation of neutrophils with fMLP results in a transient rise of intracellular Ca2+ level approximately 1 min after addition of the chemoattractant, and the elevated Ca2+ level return to the basal Ca2+ level within a 5 min. This pattern can be explained by the store operating calcium channels (Tintinger et al., 2005). We likewise observed transient increase of intracellular calcium levels after treatment with 5 M fMLP. This effect seemed to be cause early, but relatively weak activation of earthworm coelomocytes. Experiments on hemocytes from other invertebrates (shrimp, mussel) have proved that the fMLP receptor mediated recognition of bacterial formyl peptide has a crucial role in chemotaxis and phagocytosis of invertebrate cellular immunity (Garcia-Garcia et al., 2009; Malagoli and Ottaviani, 2004).
We thank Mária Pápa and Krisztina Fülöp for their great assistance, Tamás Nagy for providing thapsigargin, Mariann Szabó, Zhaoyun Zhang, Lars-Henrik Heckmann and Edwin L. Cooper for careful reading the manuscript and helping to improve it with useful advices. We also greatly appreciate the help of Ildikó Somogyi, Dóra Gunszt and László Molnár (Faculty of Sciences, University of Pécs) for maintaining and providing the experimental earthworm specimens. References Anderson, R., Mahomed, G.A., 1997. Calcium efflux and influx in f-met-leu-phe (fMLP)-activated human neutrophils are chronologically distinct events. Clin. Exp. Immunol. 110, 132–138. Aton, E., Renault, T., Gagnaire, B., Thomas-Guyon, H., Cognard, C., Imbert, N., 2006. A flow cytometric approach to study intracellular-free Ca2+ in Crassostrea gigas haemocytes. Fish Shellfish Immunol. 20, 493–502. Ballarin, L., Cima, F., Sabbadin, A., 1997. Calcium homeostasis and yeast phagocytosis in hemocytes of the colonial ascidian Botryllus schlosseri. Comp. Biochem. Physiol. A 118, 153–158. Baron, S., Struyf, S., Wuytack, F., Van Damme, J., Missiaen, L., Raeymaekers, L., Vanoevelen, J., 2009. Contribution of intracellular Ca2+ stores to Ca2+ signaling during chemokinesis of human neutrophil granulocytes. Biochim. Biophys. Acta 1793, 1041–1049. Beschin, A., Bilej, M., Brys, L., Torreele, E., Lucas, R., Magez, S., De Baetselier, P., 1999. Convergent evolution of cytokines. Nature 400, 627–628. Beschin, A., Bilej, M., Hanssens, F., Raymakers, J., Van Dyck, E., Revets, H., Brys, L., Gomez, J., De Baetselier, P., Timmermans, M., 1998. Identification and cloning of a glucan- and lipopolysaccharide-binding protein from Eisenia foetida earthworm involved in the activation of prophenoloxidase cascade. J. Biol. Chem. 273, 24948–24954. Bilej, M., Brys, L., Beschin, A., Lucas, R., Vercauteren, E., Hanusova, R., De Baetselier, P., 1995. Identification of a cytolytic protein in the coelomic fluid of Eisenia foetida earthworms. Immunol. Lett. 45, 123–128. Bilej, M., De Baetselier, P., Beschin, A., 2000. Antimicrobial defense of the earthworm. Folia Microbiol. 45, 283–300. Bilej, M., De Baetselier, P., Van Dijck, E., Stijlemans, B., Colige, A., Beschin, A., 2001. Distinct carbohydrate recognition domains of an invertebrate defense molecule recognize Gram-negative and Gram-positive bacteria. J. Biol. Chem. 276, 45840–45847. ˇ Bilej, M., Joskova, R., Van den Bergh, R., Prochazkova, P., Silerová, M., Ameloot, P., De Baetselier, P., Beschin, A., 2006. An invertebrate TNF functional analogue activates macrophages via lectin-saccharide interaction with ion channels. Int. Immunol. 18, 1663–1670. Bilej, M., Rossmann, P., Sinkora, M., Hanusova, R., Beschin, A., Raes, G., De Baetselier, P., 1998. Cellular expression of the cytolytic factor in earthworms Eisenia foetida. Immunol. Lett. 60, 23–29.
2056
B. Opper et al. / Molecular Immunology 47 (2010) 2047–2056
Bloc, A., Lucas, R., Van Dijck, E., Bilej, M., Dunant, Y., De Baetselier, P., Beschin, A., 2002. An invertebrate defense molecule activates membrane conductance in mammalian cells by means of its lectin-like domain. Dev. Comp. Immunol. 26, 35–43. Bokoch, G.M., 1995. Chemoattractant signaling and leukocyte activation. Blood 86, 1649–1660. Boldizsar, F., Berki, T., Miseta, A., Nemeth, P., 2002. Effect of hyperglycemia on the basal cytosolic free calcium level, calcium signal and tyrosine-phosphorylation in human T-cells. Immunol. Lett. 82, 159–164. Brulle, F., Mitta, G., Cocquerelle, C., Vieau, D., Lemiere, S., Lepretre, A., Vandenbulcke, F., 2006. Cloning and real-time PCR testing of 14 potential biomarkers in Eisenia fetida following cadmium exposure. Environ. Sci. Technol. 40, 2844–2850. Burlando, B., Panfoli, I., Viarengo, A., Marchi, B., 2001. Free radical-dependent Ca2+ signaling: role of Ca2+ -induced Ca2+ release. Antioxid. Redox. Signal. 3, 525–530. Carafoli, E., 2002. Calcium signaling: a tale for all seasons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 1115–1122. Carafoli, E., 2005. Calcium—a universal carrier of biological signals. FEBS J. 272, 1073–1089. Case, R.M., Eisner, D., Gurney, A., Jones, O., Muallem, S., Verkhratsky, A., 2007. Evolution of calcium homeostasis: from birth of the first cell to an omnipresent signalling system. Cell Calcium 42, 345–350. Cerenius, L., Lee, B.L., Söderhäll, K., 2008. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trends Immunol. 29, 263–271. Cholewa, J., Feeney, G.P., O’Reilly, M., Sturzenbaum, S.R., Morgan, A.J., Plytycz, B., 2006. Autofluorescence in eleocytes of some earthworm species. Folia Histochem. Cytobiol. 44, 65–71. Cooper, E.L., 1968. Transplantation immunity in annelids. I. Rejection of xenografts exchanged between Lumbricus terrestris and Eisenia foetida. Transplantation 6, 322–327. Cooper, E.L., 1969. Neoplasia and transplantation immunity in annelids. Natl. Cancer Inst. Monogr. 31, 655–669. Cooper, E.L., 1970. Transplantation immunity in helminths and annelids. Transplant. Proc. 2, 216–221. Cooper, E.L., Kauschke, E., Cossarizza, A., 2002. Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff. Bioessays 24, 319–333. Crozatier, M., Meister, M., 2007. Drosophila haematopoiesis. Cell. Microbiol. 9, 1117–1126. Dedkova, E.N., Sigova, A.A., Zinchenko, V.P., 2000. Mechanism of action of calcium ionophores on intact cells: ionophore-resistant cells. Membr. Cell Biol. 13, 357–368. De Eguileor, M., Tettamanti, G., Grimaldi, A., Boselli, A., Scari, G., Valvassori, R., Cooper, E.L., Lanzavecchia, G., 1999. Histopathological changes after induced injury in leeches. J. Inv. Pathol. 74, 14–28. Engelmann, P., Pal, J., Berki, T., Cooper, E.L., Nemeth, P., 2002. Earthworm leukocytes react with different mammalian antigen-specific monoclonal antibodies. Zoology 105, 257–265. Engelmann, P., Palinkas, L., Cooper, E.L., Nemeth, P., 2005. Monoclonal antibodies identify four distinct annelid leukocyte markers. Dev. Comp. Immunol. 29, 599–614. Franco, R., Sanchez-Olea, R., Reyes-Reyes, E.M., Panayiotidis, M.I., 2009. Environmental toxicity, oxidative stress and apoptosis: menage a trios. Mutat. Res. 674, 3–22. Garcia-Garcia, E., Garcia-Garcia, P.L., Rosales, C., 2009. An fMLP receptor is involved in activation of phagocytosis by hemocytes from specific insect species. Dev. Comp. Immunol. 33, 728–739. Gastaldi, L., Ranzato, E., Capri, F., Hankard, P., Pérés, G., Canesi, L., Viarengo, A., Pons, G., 2007. Application of a biomarker battery for the evaluation of the sublethal effects of pollutants in the earthworm Eisenia Andrei. Comp. Biochem. Physiol. C 146, 398–405. Goel, G., Makkar, H.P.S., Francis, G., Becker, K., 2007. Phorbol esters: structure, biological activity, and toxicity in animals. Int. J. Toxicol. 26, 279–288. Granfeldt, D., Samuelsson, M., Karlsson, A., 2002. Capacitative Ca2+ influx and activation of the neutrophil respiratory burst. Different regulation of plasma membrane- and granule-localized NADPH-oxidase. J. Leukoc. Biol. 71, 611–617. Homa, J., Sturzenbaum, S.R., Morgan, A.J., Plytycz, B., 2007. Disrupted homeostasis in coelomocytes of Eisenia fetida and Allolobophora chlorotica exposed dermally to heavy metals. Eur. J. Soil Biol. 43, S273–S280. Ishida, Y., Chused, T.M., 1988. Heterogeneity of lymphocyte calcium metabolism is caused by T cell-specific calcium-sensitive potassium channel and sensitivity of the calcium ATPase pump to membrane potential. J. Exp. Med. 168, 839–852. Kauschke, E., Komiyama, K., Moro, I., Eue, I., Konig, S., Cooper, E.L., 2001. Evidence for perforin-like activity associated with earthworm leukocytes. Zoology 104, 13–24. Kim, S.H., Johnson, V.J., Sharma, R.P., 2002. Mercury inhibits nitric oxide production but activates proinflammatory cytokine expression in murine macrophage: differential modulation of NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. Nitric Oxide 7, 67–74. Kubota, M., Kataoka, A., Okuda, A., Bessho, R., Lin, Y.W., Wakazono, Y., Usami, I., Akiyama, Y., Furusho, K., 1995. Selection and partial characterization of calcium ionophore (A23187) resistant cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 213, 541–549. Langenbacher, A., Chen, J.N., 2008. Calcium signaling: a common thread in vertebrate left-right axis development. Dev. Dyn. 237, 3491–3496. Lichtman, A.H., Segel, G.B., Lichtman, M.A., 1983. The role of calcium in lymphocyte proliferation. Blood 61, 413–422.
Mahomed, A.G., Anderson, R., 2000. Activation of human neutrophils with chemotactic peptide, opsonized zymosan and the calcium ionophore A23187, but not with a phorbol ester, is accompanied by efflux and store-operated influx of calcium. Inflammation 24, 559–569. Malagoli, D., Ottaviani, E., 2004. Yessotoxin affects fMLP-induced cell shape changes in Mytilus galloprovincialis immunocytes. Cell Biol. Int. 28, 57–61. Marchi, B., Burlando, B., Moore, M.N., Viarengo, A., 2004. Mercury- and copperinduced lysosomal membrane destabilisation depends on [Ca2+ ]i dependent phospholipase A2 activation. Aquat. Toxicol. 66, 197–204. McCarthy, S.A., Hallam, T.J., Merritt, J.E., 1989. Activation of protein kinase C in human neutrophils attenuates agonist-stimulated rises in cytosolic free Ca2+ concentration by inhibiting bivalent-cation influx and intracellular Ca2+ release in addition to stimulating Ca2+ efflux. Biochem. J. 264, 357–364. Meister, M., Lagueux, M., 2003. Drosophila blood cells. Cell. Microbiol. 5, 573–580. Miller, R.A., 1991. Accumulation of hyporesponsive, calcium extruding memory T cells as a key feature of age-dependent immune dysfunction. Clin. Immunol. Immunopathol. 58, 305–317. Miller, R.A., Flurkey, K., Molloy, M., Luby, T., Stadecker, M.J., 1991. Differential sensitivity of virgin and memory T lymphocytes to calcium ionophores suggests a buoyant density separation method and a model for memory cell hyporesponsiveness to ConA. J. Immunol. 147, 3080–3086. Minta, A., Kao, J.P., Tsien, R.Y., 1989. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J. Biol. Chem. 264, 8171–8178. Morgan, A.J., Jacob, R., 1994. Ionomycin enhances Ca2+ influx by stimulating storeregulated cation entry and not by a direct action at the plasma membrane. Biochem. J. 300, 665–672. Oh-hora, M., Rao, A., 2008. Calcium signaling in lymphocytes. Curr. Opin. Immunol. 20, 250–258. Panfoli, I., Burlando, B., Viarengo, A., 1999. Cyclic ADP-ribose-dependent Ca2+ release is modulated by free Ca2+ in the scallop sarcoplasmic reticulum. Biochem. Biophys. Res. Commun. 257, 57–62. Pierce, S.K., Rowland-Faux, L.M., 1992. Ionomycin produces an improved volume recovery by an increased efflux of taurine from hypoosmotically stressed molluscan red blood cells. Cell Calcium 13, 321–327. Quaglino, D., Cooper, E.L., Salvioli, S., Capri, M., Suzuki, M.M., Ronchetti, I.P., Franceschi, C., Cossarizza, A., 1996. Earthworm coelomocytes in vitro: cellular features and “granuloma” formation during cytotoxic activity against the mammalian tumor cell target K562. Eur. J. Cell Biol. 70, 278–288. Roch, P., 1977. Reactivity in vitro of the leukocytes of the earthworm Eisenia foetida Sav. to several mitogenic substances. C. R. Acad. Sci. Hebd. Seances Acad. Sci. D 284, 705–708. Roch, P., Valembois, P., Du Pasquier, L., 1975. Response of earthworm leukocytes to concanavalin A and transplantation antigens. Adv. Exp. Med. Biol. 64, 45–54. Sei, Y., Arora, P.K., 1991. Quantitative analysis of calcium Ca2+ mobilization after stimulation with mitogens or anti-CD3 antibodies. Simultaneous fluo-3 and immunofluorescence flow cytometry. J. Immunol. Meth. 137, 237–244. Siegl, E., Nebe, B., Blunk, H., Rychly, J., 1998. Detection of mitogen induced stimulation of leukocytes from the rainbow trout (Oncorynchus mykiss) by flow cytometric analysis of intracellular calcium. Comp. Biochem. Physiol. 119A, 915–923. Sigova, A., Dedkova, E., Zinchenko, V., Litvinov, I., 1999. A comparative study of the calcium system in memory T cells and naive T cells. FEBS Lett. 447, 34–38. ˇ Silerová, M., Kauschke, E., Procházková, P., Josková, R., Tuˇcková, L., Bilej, M., 2007. Characterization, molecular cloning and localization of calreticulin in Eisenia fetida earthworms. Gene 397, 169–177. Tintinger, G., Steel, H.C., Anderson, R., 2005. Taming the neutrophil: calcium clearance and influx mechanisms as novel targets for pharmacological control. Clin. Exp. Immunol. 141, 191–200. Vergani, L., Lanza, C., Scarabelli, L., Canesi, L., Gallo, G., 2009. Heavy metal and growth hormone pathways in metallothionein regulation in fish RTH-149 cell line. Comp. Biochem. Physiol. C 149, 572–580. Vetvicka, V., Sima, P., 2009. Origins and functions of annelide immune cells: the concise survey. Inv. Surv. J. 6, 138–143. Viarengo, A., Mancinelli, G., Pertica, M., Fabbri, R., Orunesu, M., 1993. Effects of heavy metals on the Ca2+ -ATPase activity present in gill cell plasma-membrane of mussels (Mytilus galloprovincialis Lam.). Comp. Biochem. Physiol. C 106, 655–660. Vig, M., Kinet, J.P., 2009. Calcium signaling in immune cells. Nat. Immunol. 10, 21–27. Whitaker, M., 2006. Calcium microdomains and cell cycle control. Cell Calcium 40, 585–592. Whitaker, M., 2008. Calcium signalling in early embryos. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 363, 1401–1418. Worth, R.G., Esper, R.M., Warra, N.S., Kindzelskii, A.L., Rosenspire, A.L., Todd, R.F., Petty, H.R., 2001. Mercury inhibition of neutrophil activity: evidence of aberrant cellular signalling and incoherent cellular metabolism. Scand. J. Immunol. 53, 49–55. Yagodin, S., Hardie, R.C., Lansdell, S.J., Millar, N.S., Mason, W.T., Sattelle, D.B., 1998. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium 23, 219–228. Yagodin, S., Pivovarova, N.B., Andrews, S.B., Sattelle, D.B., 1999. Functional characterization of thapsigargin and agonist-insensitive acidic Ca2+ stores in Drosophila melanogaster S2 cell lines. Cell Calcium 25, 429–438. Yip, E.C., Wong, Y.H., Wong, J.T., 2001. Bacterial formyl peptide mediated chemotaxis and extracellular acidification in shrimp haemocytes. Dev. Comp. Immunol. 25, 269–277.
Chapter 14
Earthworm Innate Immune System Pe´ter Engelmann, Edwin L. Cooper, Bala´zs Opper, and Pe´ter Ne´meth
14.1
Introduction
The immune system is an essential component for survival against a wide range of pathogens. Rapid deployment of innate immune cells and molecules in vertebrates including humans is the first line of defense against pathogens until interaction with the slower adaptive system becomes activated. This is essential since these cells correspond to the necessary antigen-presenting cells for lymphocytes that then proceed to complex effector activity. Recently, more invertebrate animals have become candidates for analyzing innate immunity to reveal the strategies and complexities of vertebrate adaptive immunity. Additional reasons for using invertebrate models while analyzing in parallel vertebrate organisms to study innate immunity concern vitality and ethical questions. First, these consider the facts that invertebrate animals have short life-spans, their laboratory maintenance is easy, and no ethical problems are derived from their use. Second, invertebrates have developed a variety of active immune mechanisms including production of antimicrobial peptides, coagulation, phagocytosis, and encapsulation reactions. These mechanisms depend on innate immune receptors, the so-called “pattern recognition receptors” (PRRs), that can discriminate “self ” from “non-self ” membrane components. Recognition of “pathogen associated molecular patterns” (PAMPs) by germ-line
P. Engelmann (*) and P. Ne´meth Department of Immunology and Biotechnology, Faculty of Medicine, University of Pe´cs, Szigeti u. 12, H-7643 Pe´cs, Hungary e-mail:
[email protected] E.L. Cooper Laboratory of Comparative Neuroimmunology, Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 90095-1763, USA e-mail:
[email protected] B. Opper Department of Immunology and Biotechnology and Department of Anatomy, Faculty of Medicine University of Pecs, Szigeti u. 12, H-7643 Pe´cs, Hungary
A. Karaca (ed.), Biology of Earthworms, Soil Biology 24, DOI 10.1007/978-3-642-14636-7_14, # Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2011
229
230
P. Engelmann et al.
encoded receptors initiates essential signaling pathways, which then lead to activation of various genes that encode inflammatory mediators, antimicrobial peptides, and regulators of phagocytosis. Third, invertebrate recognition receptors have unique pathways unknown in vertebrates, but that are also more universal mechanisms found throughout the animal kingdom. For example in Drosophila two distinctive signaling pathways, the toll and immune deficiency pathway (imd), share high similarity to mammalian counterparts of signaling pathways (Lemaitre and Hoffmann 2007). Essential knowledge of the seemingly less complex invertebrate immune strategies can help understand the more sophisticated vertebrate immune system, the evolution of the immune response and identify new biomolecules with possible therapeutic use (Salzet 2002).
14.2
Innate Immune Recognition in Earthworms
Oligochaeta annelids (earthworms) have become a model for comparative immunologists through several approaches that involved innate immunity. Some of the earliest experimental results focused on transplantation experiments that proved the existence of self/nonself recognition, immune mechanisms in earthworms, before more extensive studies on other forms of earthworm immunity were even initiated (Cooper 1968, 1969). Numerous works have focused on proteolytic, hemolytic, antibacterial, and cytolytic properties of coelomic fluid (Bilej et al. 2000; Cooper et al. 2002; Kauschke and Mohrig 1987). Recently Coelomic Cytolytic Factor (CCF) has been identified and characterized as an immune molecule of the coelomic fluid and coelomocytes (immune cells of body cavity) from Eisenia fetida recognizing lipopolysaccharide (LPS)-, b-1,3-glucans-, muramic acid-, and N,N0 diacetylchitobiose microbial molecules. Binding to microbial antigens CCF triggers the prophenoloxidase cascade, an important invertebrate immune mechanism (Beschin et al. 1998, 1999), and also exerts opsonizing properties helping phagocytosis (Bilej et al. 1995). The prophenoloxidase (proPO) cascade as an immune mechanism is well known since it exists in other invertebrates, especially well studied in arthropod species (insects, crustaceans). These multiple biological activities point to a crucial role of CCF in innate immune reactions in earthworms, and evidence accumulates that lectin-like interactions serve as the initial recognition events. So far, it is known that CCF has unique antigen recognition characteristics (Bilej et al. 2001); although it is possible that CCF-mediated nonself recognition may accelerate various signal transduction pathways still unknown in annelids.
14.3
Coelomocyte Proliferation After Depletion and Mitogen Stimulation
Coelomocytes are circulating leukocytes in the earthworm’s coelomic cavity (hyaline amoebocytes, granular amoebocytes, and chloragocytes; SC and LS), which possess various immune functions (phagocytosis, encapsulation, production of
14
Earthworm Innate Immune System
231
cytotoxic/antimicrobial molecules). We have characterized subgroups of earthworm coelomocytes using cytochemical, immunological [using specific monoclonal antibodies (mAbs)] and functional approaches (Engelmann et al. 2004, 2005a). Several studies have analyzed cellular and humoral immune compartments, but the precise molecular data of immune molecules are limited (Cooper et al. 2002; Engelmann et al. 2005b). Restricted data are available concerning activation of coelomocyte subgroups. Crucial results are contradictory concerning whether earthworm coelomocytes are terminally differentiated cells or do they proliferate (Liebmann 1942; Hostetter and Cooper 1972; Lemmi and Cooper 1981; Roch and Valembois 1978; Tuckova et al. 1988). A recent report reveals that isolated coelomocytes proliferate after cell depletion as analyzed by flow cytometry (Homa et al. 2008). In addition, several lines of evidence indicate mitotic activity of coelomocytes under stress conditions (Bilej et al. 1992) that could be triggered by lectins and transplantation antigens; however, cellular activation has not been analyzed at the molecular level. In our recent experiments, we observed in vivo proliferative ability of free coelomocytes from E. fetida by flow cytometry. Freshly isolated coelomocytes were stained with propidium iodide for cell cycle analysis. We did repeated isolations from the same earthworms and allowed various resting times. Results revealed an increase in proliferating cell numbers that indicate mitotic division of coelomocytes (Fig. 14.1a). We also measured coelomocyte proliferation after using various stimuli. Our results clearly show effects of different mitogens (lipopolysaccharide, pokeweed mitogen, concanavalin A). Lectin stimulations caused increased activation and proliferation (Fig. 14.1b).
Fig. 14.1 Mitotic activity of coelomocytes
232
14.4
P. Engelmann et al.
Earthworm Coelomocytes Are Positive for Different Mammalian Antigen-Specific Monoclonal Antibodies
14.4.1 Molecules with Cytokine-Like Activity In recent years, more attention has been focused on the evolution of immune systems in certain invertebrate species (Cooper 2008). Comparative studies for detecting analogous and perhaps homologous cellular and molecular mechanisms concerning immune-active components have become increasingly important. Molecules with cytokine-like activity are of particular interest as they may add a parallel dimension that could help to better understand immune reactions in vertebrates as well. There is evidence for the existence of cytokines during early phases of evolution, leading to the conclusion that these molecules were highly conserved during phylogenesis (Beck and Habicht 1991a; Ottaviani and Franceschi 1997). Analogs of inflammatory cytokine molecules (IL-1, IL-6, and TNF-a) have been described in invertebrates including sponges, mollusks, insects, annelids, and tunicates (Beck and Habicht 1991b; Clatworthy 1996; Cooper 1996; Hoffmann 1995; Hoffmann and Reichhart 1997; Hughes et al. 1990; M€uller et al. 1999; Ottaviani et al. 1993; Parrinello et al. 2008; Zhang et al. 2009). Annelid coelomocytes form rapidly immune mechanisms against bacteria, parasites, and yeast (Cooper and Stein 1981; Metchnikoff 1891; Porchet-Hennere´ and Vernet 1992; Valembois et al. 1985) through cellular reactions, for example, phagocytosis and encapsulation. This rapid response is mediated through soluble antibacterial molecules like lysozyme (Hirigoyenberry et al. 1990; Joskova´ et al. 2009), fetidin (Lassegues et al. 1997). We found host defense related cytokine molecules (TNF-a, TGF-a) and enzyme (Cu/Zn SOD) in earthworm coelomocytes. Anti-TNF-a antibody showed positive reaction both in coelomocyte cytoplasms and on cell surfaces (Engelmann et al. 2002). CCF-1 shows functional similarity with TNF-a (Bilej et al. 1995, 1998). In addition to CCF-1, several other humoral lytic components have been identified with respect to molecular sequence and function (fetidins, lysenin); these characteristics must be elucidated for still others: eiseniapore, H1 H2 H3, and perforin. Lumbricin I is a small antimicrobial peptide that appears to be unrelated to the lytic molecules as viewed by sequence analysis (for a review see Cooper et al. 2002; Kauschke et al. 2001). These results offer strong support for the in vivo existence of other bioactive molecules produced by earthworm coelomocytes (Hanusˇova´ et al. 1999).
14.4.2 FACS Reveals Distinct Coelomocyte Subtypes Based on CD Marker Properties Self and nonself tissue recognition is an important component of earthworm immune responses, which suggests the presence of recognition molecules and cell
14
Earthworm Innate Immune System
233
adhesion molecules on coelomocyte surfaces (Cooper et al. 1999; Shalev et al. 1983; Toupin and Lamoureux 1976). A nongranulated coelomocyte population, which can neutralize and recognize foreign antigens, has been described from an electron microscopic study (Toupin and Lamoureux 1976). Other reports have described the presence of Thy-1 and b2 microglobulin molecules on coelomocyte surfaces (Roch et al. 1983; Shalev et al. 1981). These molecules, present in other invertebrates as well, belong to the immunoglobulin (Ig) superfamily (Mansour and Cooper 1984; Mansour et al. 1985; Negm et al. 1991; Shalev et al. 1983). Surprisingly, serological evidence of homology with the J-chain of immunoglobulins has also been revealed in association with different invertebrate cells including earthworm’s (Takahashi et al. 1996). According to some reports, coelomocytes can be divided into more subpopulations by light- and electron-microscopic examinations. By flow cytometric analysis, two different subpopulations have been found in earthworm immune-competent cells that reacted with mammalian epitope-specific antibodies. Small coelomocytes (SC) had surface positivity with anti-CD11a, CD45RA, CD45RO, CDw49b, CD54, b2-m, and Thy-1 antibodies. These cells were negative using other markers. Large coelomocytes (LC) proved to be negative for each marker but were active in phagocytosis (Cooper et al. 1999; Cossarizza et al. 1996). By flow cytometric analysis we found three different cell populations. Although these populations have been well characterized by means of morphological methods, the third population has not been identified by flow cytometry. We were able to identify highly conserved molecules, including cell surface markers. Consistent with literature, we found cross-reactivity with anti-Thy-1 mAb and we described reactions with anti-CD24 and anti-TNF-a antibodies on coelomocyte surfaces. Other surface markers, for example, human CD45, CD4, CD8, and MHC molecules were negative in our experiments (Engelmann et al. 2002). However, as we mentioned earlier, other authors (Cossarizza et al. 1996) have found anti-CD45RA, CD45RO positivity on SC. When cocultured in vitro with tumor cell targets (e.g., K562) these small lymphocyte-like cells may release perforin-like molecules that seem to complete a contact-mediated cytolytic destruction process (Kauschke et al. 2001) (Fig. 14.2a, b). At this level of evolution this suggests the first evidence that supports the dissociation of phagocytosis from NK-like functions.
14.5
Earthworm Leukocytes Deploy Lysosomal Enzymes That Respond to Bacterial Challenge
Coelomocytes recognize nonself tissues that consequently trigger a rejection process that may be partially enzyme mediated (Cooper 1968, 1969; Linthicum et al. 1977). The released lysosomal acid phosphatase in the coelom may exert an effect during this response (Marks et al. 1981). In the various subpopulations of earthworm coelomocytes several enzyme activities with different patterns have been
234
a
P. Engelmann et al.
b
Large coelomocyte (LC) -Family of fetidin & lysenin -perforin-like molecules?
-Family of fetidin & lysenin -perforin-like molecules?
Chloragocyte / eleocyte
EFCC1
EFCC2 Granular amoebocyte (small coelomocyte) CD24-like molecule ?
Target cell LFA-1-like molecule (CD11a) ?
a 2-integrin-like molecule (CDw49b) ?
TNF-a -like molecule ? EFCC1
EFCC4 Thy-1-like molecule (CD90) ?
CD45-like molecule ? b 2-microglobulinlike molecule ?
ICAM-1-like molecule (CD54) ? EFCC3 Thy-1-like molecule (CD90) ?
TNF-a-like molecule ?
Small coelomocyte (LC) CD24-like molecule ?
EFCC1 Thy-1-like molecule (CD90) ? Hyaline amoebocyte (Large coelomocyte)
Fig. 14.2 Hypothetical drawings show coelomocyte subtypes from Eisenia fetida
defined. In our study, we have shown that bacterial infection of earthworms stimulated an increased number of lysosomes in coelomocytes (Engelmann et al. 2004). Cytochemical methods have been used to characterize earthworm coelomocytes including their enzymes. In our cytochemical experiments, granular and hyaline amoebocytes but not chloragocytes release acid hydrolase activity, in accordance with recent reports (Hamed et al. 2002). Enzyme reactivity was bound to discrete granules (e.g., lysosomes) in the cytoplasms of coelomocytes as observed by electron microscopy; however, the staining pattern was different. Variable staining patterns may indicate different cell activation and differentiation stages. Coelomocytes released the contents of the granules (including enzymes) into the coelomic cavity to inactivate pathogens. With Western blotting we found a 39-kDa peptide that reacts with anti-AcP antibody. Subsequently, intracellular acid phosphatase decreases compared to the controls in the samples which contain bacterial strains. In contrast, ELISA results show that the samples had an increased level of extracellular acid phosphatase after phagocytosis (Engelmann et al. 2004). One research group has isolated an acid phosphatase from another earthworm species, Eisenia veneta, which has two isoenzymes of acid phosphatase: one is 113 kDa composed of identical peptide chains of 36 kDa (Stubberud et al. 2000).
14
Earthworm Innate Immune System
235
As bacteria are bound to leukocytes they are removed from circulation and may be destroyed by the release of degradative enzymes, reactive oxygen metabolites, or any antimicrobial molecules secreted from blood cells of the mussel Mytilus edulis (Pipe et al. 1997). This release of digestive enzymes may play a role in autophagocytosis. Several reports have concluded that other coelomocyte types clear degraded chloragogen cells. Examinations have revealed chloragosomes inside “brown bodies” (encapsulated particles in earthworms). These bodies contain lipofuscin and melanin, which render them capable of killing parasites, microbes and of clearing altered cells (Valembois et al. 1994). In this process different coelomocytes may have specialized tasks. Granular coelomocytes may play a role in encapsulation, while hyaline amoebocytes affect primarily phagocytic activity. The functional distribution of different leukocyte types has been characterized in other annelid species, notably marine polychaetes (Porchet-Hennere´ 1990). Some reports indicate that chloragogen cells (which constitute the chloragogue tissue) have high acid phosphatase activities (Cancio et al. 1995). In contrast free chloragogen cells exhibited low enzymatic activities in our experiments. This coelomocyte type is found in all lumbricid worms, and chloragocytes change during the expulsion of granules and biochemical alterations of cytoplasmic inclusions (Valembois 1971; Valembois and Roch 1977; Valembois et al. 1985). Chloragocytes in the coelomic fluid have low acid phosphatase content as measured by flow cytometry, while immunocytochemical, enzyme cytochemical examinations could not detect any acid phosphatase in this coelomocyte subpopulation (Engelmann et al. 2004). This may refer to a developmental stage of chloragocytes that may occur causing loss of these hydrolytic enzymes, thus giving these cells a status of secondary importance in immune mechanisms.
14.6
Specific Monoclonal Antibodies Identify Four Distinct Earthworm Coelomocyte Markers
14.6.1 Establishing a CD Marker Library Modern biology has benefited enormously from the development of hybridomas for producing mAbs. mAbs are highly specific molecular probes that are widely used in analyzing cells of vertebrate immune systems (Caruso et al. 1997; Koumans-van Diepen et al. 1995). They are also potentially suitable for mapping of invertebrate immunity in broad terms as well, but specific antibodies against certain invertebrate immune cells are not always available. mAbs have been developed against some disparate invertebrate taxa (Dyrynda et al. 1997; Porchet-Hennere´ 1990; PorchetHennere´ and Vernet 1992; Reinisch et al. 1983; Yoshino and Granath 1983). However, most mAbs have been raised against insect hemocytes in order to characterize them during different developmental stages and according to certain functional differences (Gardiner and Strand 1999; Kurucz et al. 2003; Pech and
236
P. Engelmann et al.
Strand 1996; Strand and Johnson 1996; Willott et al. 1995). To extend our understanding of the earthworm immune system, focusing on coelomocytes, we have developed for the first time a family of mAbs against their leukocytes using hybridoma technology. We aimed to establish an earthworm cluster of differentiation (CD) library so that later we could then move further towards a more specific analysis of how leukocytes are organized functionally. Up to now we know that the cellular components consist of different coelomocyte populations; they are neither homogenous in morphology nor in certain functions. Although we used mAbs for further characterization of earthworm cell surface and intracellular markers, these were developed initially against different mammalian antigens and are apparently specific for conserved molecules (cytokines, cell surface molecules, and enzymes) (Engelmann et al. 2002). Thus, a more detailed analysis of cell differentiation markers (CD markers) using specific mAbs against earthworm coelomocytes is essential to further analyze and refine aspects of immunity. We raised selective antibodies to characterize earthworm coelomocyte subpopulations (EFCC). Different clones of anti-EFCC mAbs were selected for comparative analyses, especially with respect to origins and development. In this study we were able to: (1) define coelomocyte clusters using specific mAbs (anti-EFCC clones); (2) assess whether anticoelomocyte mAbs bind to other cells or tissues; (3) determine functional heterogeneity between coelomocyte subgroups; (4) compare the EFCC clusters determined by immunological markers to classical microscopic classifications and to flow cytometric classification; (5) investigate the possible origin of coelomocyte subgroups (Engelmann et al. 2005a).
14.6.2 Characterization of Coelomocyte Differentiation Clusters This was the first report that outlined the production and characterization of earthworm-specific mAbs against earthworm coelomocyte differentiation clusters (EFCC), as well as their use for comparative analysis (Fig. 14.2b). The anti-EFCC1 clones recognize common antigens present on earthworm cells and tissues, and certain distribution patterns in snails but localized only in well-circumscribed organs. In contrast, anti-EFCC mAbs were positive neither for Drosophila melanogaster hemocytes nor for different mammalian cells or tissues. These results suggest a close evolutionary relationship between cellular components of the immunodefense system in earthworms and snails but not with insects or vertebrates. Similar observations reveal reactivity patterns of antibodies specifically associated with immune cells of shrimp and the moth Manduca sexta compared to cells and tissues of other test animals from different evolutionary groups (Van de Braak et al. 2001; Willott et al. 1994). The anti-EFCC2, EFCC3, and EFCC4 antibodies are positive only for earthworm cells and tissues. This selective class/species specificity supports the view
14
Earthworm Innate Immune System
237
that differentiation of certain cellular functions occurred during species evolution. The anti-EFCC2, a-EFCC3, and a-EFCC4 antibodies can discriminate between coelomocyte clusters by selectively labeling different populations with characteristic morphological appearance and specific functions. The anti-EFCC2 mAb recognizes exclusively the chloragocyte population: the EFCC2 cluster seems to be equivalent with classical chloragocyte/eleocyte population. Chloragocytes play a role in various functions: in earthworms the chloragogenous tissue is often considered as a functional analog of the vertebrate liver and the hepatopancreas of mollusks and arthropods. They also have hemopoetic functions, producing the extracellular respiratory pigment in oligochaetas and leeches (Fischer et al. 1975, 1976; Fischer 1993). Both sessile and free wandering chloragocytes express the same marker suggesting common tissue origin but with different maturation stages. The EFCC3 cluster seems to be equivalent to hyaline coelomocyte populations. These leukocytes seem to be responsible for phagocytosis. The EFCC4 is a relatively small cell population in the coelomic fluid. They have been previously identified as granular amoebocytes and are present mainly in smaller numbers using flow cytometry. After labeling earthworm tissues with different anti-EFCC clones, especially with three and four, a characteristic staining pattern was found in the mesodermal area. The anti-EFCC3 clone labels epithelial cells of the somatoand splanchnopleure, while the anti-EFCC4 clone labels cells with splanchnopleural origin in the gut wall beneath the inner epithelium (Engelmann et al. 2005a, b).
14.7
Signaling Mechanisms by Mitogen-Activated Protein Kinases in Invertebrate Immunocytes
14.7.1 Signaling a Common and Important Mechanism Signaling by receptor tyrosine kinases (RTKs) has a highly conserved role in all metazoan organisms controlling cell fate, proliferation, migration, and differentiation (Friedman and Perrimon 2006). Sequencing of genomes shows early appearance of RTK in all metazoans and higher diversification in several subfamilies (Kurz and Tan 2004). One of the conserved signal transduction pathways is the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, which is crucial for stress response and immunity in plants and animals (Asai et al. 2002; Kyriakis and Avruch 2001; Troemel et al. 2006; You et al. 2007) (Figs. 14.3 and 14.4). MAPK system corresponds to immune response in invertebrates and vertebrates (Dong et al. 2002). Members of MAPK pathway are key players in pro- and antiinflammatory processes (Han et al. 1994; Salojin and Oravecz 2007). This signaling pathway is activated by the invader (inducer) in mammalian phagocytes. These have been analyzed extensively and include among others tyrosine kinases, serine kinase (MAPKs), small GTPases, and lipid signaling pathways (Nahas et al. 1996).
238
Fig. 14.3 Phylogenetic tree of p38 MAPK enzyme
Fig. 14.4 Phylogenetic tree of JNK protein
P. Engelmann et al.
14
Earthworm Innate Immune System
239
14.7.2 The Essential Role of Phosphorylation to Activate MAPKs Several lines of evidence demonstrate that the phosphorylation and activation status of MAP kinases exert a crucial impact on the outcome of downstream events that regulate cytokine production. For example, med-fly hemocytes, key mediators of cell-mediated immunity in insects, respond to Escherichia coli LPS by activating the three major MAPK subfamilies: extracellular signal-related kinase (ERK), c-jun N-terminal kinase (JNK), and p38 in a Ras/Rho-dependent manner. The functional association of E. coli phagocytosis with the activation of MAPKs appears to be the secretion of proPO-activating enzymes. Activation of hemocyte surface proPO via MAPKs activation is an important component of innate immunity and hence the process of phagocytosis (Lamprou et al. 2005, 2007). Information on MAPK signaling in invertebrate immunity is limited; most data have been derived from insects and mollusks (Canesi et al. 2002; Gaitanaki et al. 2004; Lacchini et al. 2006; Larade and Storey 2006; Zelck et al. 2007). No information is available from earthworms concerning MAP kinases or any other signaling mechanisms.
14.8
Is MAPK Pathway Involved in Earthworm Immune Response?
Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways likely exist in all eukaryotic organisms. Regarding their pivotal function and ubiquitous appearance of MAPK enzymes in eukaryotic cells, we propose to study MAPKs in earthworms. MAP kinases (p38, JNK-c jun terminal kinase) are conserved as in all living organisms. Although there are no available data from earthworms, our recent results clearly show evidence for the presence of MAPK enzymes in earthworm coelomocytes. Total coelomocyte lysates along with lysates from Jurkat human leukemia cell line were separated on SDS PAGE gels then blotted to nitrocellulose sheets. The nitrocellulose membranes were probed with commercially available p38 and JNK-specific antibodies for Western blot. The results revealed distinct bands from coelomocytes for both molecules and their molecular weights were similar compared to the bands from the Jurkat positive control (data not shown). In vivo Gram-positive and Gram-negative bacteria challenge will affect the expression of CCF in E. fetida. CCF expression is upregulated upon bacteria challenge within a few hours along with demonstrable lysozyme activity (K€ ohlerova´ et al. 2004). In a separate experiment, we used phospho p38 and phospho-JNK-specific antibodies; both antibody showed reaction pattern on earthworm coelomocyte lysates (data not shown). Another problem concerns the specificity of commercially available phospho-p38 and phospho-JNK antibodies. Commercial antibodies may not be phospho specific in earthworms in contrast to clearer specificity for mammalian proteins. In polychaete annelids and leeches MAPK pathway members have been detected. JNK was cloned and p38 detected
240
P. Engelmann et al. Pathogens (PAMPs) & lectins
CCF, lysenin, lysosyme, etc.
Ca2+ PRRs (e.g.CCF)
P P
RTK?
MAPK pathway ?
Ca 2+
Ca2+
Transcription factors ?
Ca2+
Cell proliferation, production of cytokine-like factors (eg.CCF),antimicrobial molecules (eg.lysenin)
Fig. 14.5 Hypothetical model that show proposed intracellular signaling events after activations of Eisenia fetida coelomocytes
at the protein level (Gonsalves and Weisblat 2007; Steinmetz et al. 2007). Thus, there is compelling evidence to propose that earthworm coelomocytes would possess a signaling system (Fig. 14.5). The challenge is to find the appropriate assay system.
14.9
Conclusions and Future Prospects
Indeed, earthworms possess a highly effective innate immune system against environmental pathogens. Enormous data are collected concerning humoral and cellular immune components. However, many important questions are still unanswered. One of them is related to signaling, whose conserved RTKs and/or MAP kinases are involved in the activation events. MAPK pathways likely exist in all eukaryotic cells as suggested by the recent identification of p38 and JNK orthologs in the phylogenetically oldest extant metazoans, the sponges (M€ uller et al. 2002). Interestingly, there are no experimental data available from earthworms about MAP kinases or even other signaling mechanisms. Why would there be interest in analyzing invertebrate signaling mechanisms in model organisms? Most studies concern the identification of PRRs and the subsequent signaling cascades in limited model organisms. MAPK cascade is induced by stress-signals; different organisms in various environments must face variable challenges. We must consider that earthworms are adapted to a special environment with somewhat different mechanisms and strategies for survival from those of other
14
Earthworm Innate Immune System
241
organisms. Uncovering major components of MAPK pathway would allow analysis of receptors, target molecules (transcription factors), and regulators of earthworm signaling mechanisms. Second, messengers such as intracellular calcium may also have an important role during coelomocyte activation and immune response. Further work should concentrate on cooperating partners of p38 and JNK kinases such as MAPK kinase (MEK) and MAPK phosphatase molecules. Another interesting question concerns a definition of the target/docking molecules for MAP kinases, and which transcription factors are affected by this signaling system in earthworms. The broad importance and implication of MAPK pathways draw attention to human diseases, primarily to cancer. Discovery of novel components of this pathway can show regulatory network that are required to control this system and also to reveal new implications for human diseases. Finally, novel regulators of MAPK cascades found by comparative analysis of signal transduction systems may even be attractive targets useful for drug discovery.
References Asai T, Tena G, Plotnikova J, Willmann MR, Chiu WL, Gomez-Gomez L, Boller T, Ausubel FM, Sheen J (2002) MAP kinase signaling pathway in Arabidopsis innate immunity. Nature 415:977–983 Beck G, Habicht GS (1991a) Purification and biochemical characterization of an invertebrate interleukin 1. Mol Immunol 28:577–584 Beck G, Habicht GS (1991b) Primitive cytokines: harbingers of vertebrate defense. Immunol Today 12:180–183 Beschin A, Bilej M, Hanssens F, Raymakers J, Van Dyck E, Revets H, Brys L, Gomez J, DeBaetselier P, Timmermans M (1998) Identification and cloning of a glucan and lipopolysaccharide-binding protein from Eisenia foetida earthworm involved in the activation of prophenoloxidase cascade. J Biol Chem 273:24948–24954 Beschin A, Bilej M, Brys L, Torreele E, Lucas R, Magez S, De Baetselier P (1999) Convergent evolution of cytokines. Nature 400:627–628 Bilej M, Sima P, Slipka J (1992) Repeated antigen challenge induces earthworm coelomocyte proliferation. Immunol Lett 32:181–184 Bilej M, Brys L, Beschin A, Lucas R, Vercauteren E, Hanusˇova´ R, De Baetselier P (1995) Identification of a cytolytic protein in the coelomic fluid of Eisenia foetida earthworms. Immunol Lett 45:123–128 Bilej M, Rossmann P, Sˇinkora M, Hanusˇova´ R, Beschin A, Raes G, De Baetselier P (1998) Cellular expression of the cytolytic factor in earthworms Eisenia foetida. Immun Lett 60:23–29 Bilej M, De Baetselier P, Beschin A (2000) Antimicrobial defense of earthworm. Folia Microbiol 45:283–300 Bilej M, De Baetselier P, Van Dijck E, Stijlemans B, Colige A, Beschin A (2001) Distinct carbohydrate recognition domains of an invertebrate defense molecule recognize gram negative and gram-positive bacteria. J Biol Chem 276:45840–45847 Cancio I, Ap Gwynn I, Ireland PM, Cajaraville MP (1995) Lysosomal origin of the chloragosomes in the chloragogenous tissue of the earthworm Eisenia foetida: cytochemical demonstration of acid phosphatase activity. Histochem J 27:591–596 Canesi L, Betti M, Ciacci C, Scarpato A, Citterio B, Pruzzo C, Gallo G (2002) Signalling pathways involved in the physiological response of mussel haemocytes to bacterial challenge: the role of stress-activated p38 MAP kinases. Dev Comp Immunol 26:325–334
242
P. Engelmann et al.
Caruso A, Licenziati S, Corulli M, Canaris AFD, de Francesco MA, Fiorentini S, Peroni L, Fallacara F, Balsari A, Turano A (1997) Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry 27:71–76 Clatworthy AL (1996) A simple systems approach to neuralimmune communication. Comp Biochem Physiol 115A:1–10 Cooper EL (1968) Transplantation immunity in annelids – I. Rejection of xenografts exchanged between Lumbricus terrestris and Eisenia foetida. Transplantation 6:322–337 Cooper EL (1969) Chronic allograft rejection in Lumbricus terrestris. J Exp Zool 171:69–73 Cooper EL (1996) Earthworm immunity. Prog Mol Subcell Biol 16:10–45 Cooper EL (2008) From Darwin to Metchnikow to Burnet and beyond. Contrib Microbiol 15:1–11 Cooper EL, Stein EA (1981) Oligochaetas. In: Ratcliffe RA, Rowley AF (eds) Invertebrate blood cells. Academic, San Diego, pp 75–140 Cooper EL, Cossarizza A, Kauschke E, Franceschi C (1999) Cell adhesion and the immune system: a case study using earthworms. Microsc Res Technol 44:237–253 Cooper EL, Kauschke E, Cossarizza A (2002) Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff. BioEssays 24:319–333 Cossarizza A, Cooper EL, Suzuki MM, Salvioli S, Capri M, Gri G, Quaglino D, Franceschi C (1996) Earthworm leukocytes that are not phagocytic and cross-react with several human epitopes can kill human tumor cell lines. Exp Cell Res 224:174–182 Dong C, Davis RJ, Flavell RA (2002) MAP kinases in the immune response. Annu Rev Immunol 20:55–72 Dyrynda EA, Pipe RK, Ratcliffe NA (1997) Sub-populations of haemocytes in the adult and developing marine mussel, Mytilus edulis, identified by use of monoclonal antibodies. Cell Tissue Res 289:527–536 Engelmann P, Pal J, Berki T, Cooper EL, Ne´meth P (2002) Earthworm leukocytes react with different mammalian specific monoclonal antibodies. Zoology 105:257–265 Engelmann P, Molnar L, Pa´linka´s L, Cooper EL, Ne´meth P (2004) Earthworm leukocyte populations specifically harbor lysosomal enzymes that may respond to bacterial challenge. Cell Tissue Res 316:391–401 Engelmann P, Pa´linka´s L, Cooper EL, Ne´meth P (2005a) Monoclonal antibodies identify four distinct annelid leukocyte markers. Dev Comp Immunol 29:599–614 Engelmann P, Cooper EL, Nemeth P (2005b) Anticipating innate immunity without a Toll. Mol Immunol 42:931–942 Fischer E (1993) The myelo-erythroid nature of the chloragogenous-like tissues of the annelids. Comp Biochem Physiol 106A:449–453 Fischer E, Lovas M, Nemeth P (1975) Zinkporphyrin-pigmente im botryoidgewebe von Haemopis sanguisuga L. und ihre mit der diaminobenzidin-H2O2 Reaktion. Acta Histochem 55:32–41 Fischer E, Lovas M, Nemeth P (1976) An experimental analysis of the vasofibrous tissue in the leech Haemopis sanguisuga L. Zool Anz 197:289–299 Friedman A, Perrimon N (2006) A functional RNAi screen for regulators of receptor tyrosine kinase and ERK signaling. Nature 444:230–234 Gaitanaki C, Kefaloyianni E, Marmari A, Beis I (2004) Various stressors rapidly activate the p38-MAP kinase pathway in Mytilus galloprovincialis (Lam.). Mol Cell Biochem 260:119–127 Gardiner EM, Strand MR (1999) Monoclonal antibodies bind distinct classes of hemocytes in the moth Pseudoplusia includens. J Insect Physiol 45:113–126 Gonsalves FC, Weisblat DA (2007) MAPK regulates of maternal and zygotal Notch transcript stability in early development. Proc Natl Acad Sci U S A 104:531–536 Hamed SS, Kauschke E, Cooper EL (2002) Cytochemical properties of earthworm coelomocytes enriched by Percoll. In: Cooper EL, Beschin A, Bilej M (eds) A new model for analyzing antimicrobial peptides with biomedical applications. NATO Science Series: life and behavioral sciences, vol 343. IOS, Amsterdam, pp 29–37
14
Earthworm Innate Immune System
243
Han J, Lee JD, Bibbs L, Ulevitch RJ (1994) A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells. Science 265:808–811 Hanusˇova´ R, Bilej M, Brys L, De-Baetselier P, Beschin A (1999) Identification of a coelomic mitogenic factor in Eisenia foetida earthworm. Immun Lett 65:203–211 Hirigoyenberry F, Lassalle F, Lassegues M (1990) Antibacterial activity of Eisenia fetida andrei coelomic fluid: transcription and translation regulation of lysozyme and proteins evidenced after bacterial infestation. Comp Biochem Physiol 95B:71–75 Hoffmann JA (1995) Innate immunity of insects. Curr Opin Immunol 7:4–10 Hoffmann JA, Reichhart JM (1997) Drosophila immunity. Trends Cell Biol 7:309–316 Homa J, Bzowska M, Klimek M, Plytycz B (2008) Flow cytometric quantification of proliferating coelomocytes non-invasively retrieved from Dendrobena veneta. Dev Comp Immunol 32:9–14 Hostetter RK, Cooper EL (1972) Coelomocytes as effector cells in earthworm immunity. Immunol Commun 1:155–183 Hughes KT, Smith EM, Chin R, Cadet R, Sinisterra J, Leung MK, Shipp MA, Scharrer B, Stefano GB (1990) Interaction of immunoactive monokines (interleukin 1 and tumor necrosis factor) in the bivalve mollusc Mytilus edulis. Proc Natl Acad Sci U S A 87:4426–4429 Joskova´ R, Silerova´ M, Procha´zkova´ P, Bilej M (2009) Identification and cloning of invertebratetype lysozyme from Eisenia andrei. Dev Comp Immunol 33:932–938 Kauschke E, Mohrig W (1987) Comparative analysis of hemolytic and hemagglutinating activities in coelomic fluid of Eisenia fetida and Lumbricus terrestris (Annelida, Lumbricidae). Dev Comp Immunol 11:331–341 Kauschke E, Komiyama K, Moro I, Eue I, K€ onig S, Cooper EL (2001) Evidence for perforin-like activity associated with earthworm leukocytes. Zoology 32:13–24 K€ohlerova´ P, Beschin A, Sˇilero´va´ M, De Baetselier P, Bilej M (2004) Effect of experimental microbial challenge on the expression of defense molecules in Eisenia foetida earthworms. Dev Comp Immunol 28:701–711 Koumans-van Diepen J, Egberts E, Peixoto BR, Taverne N, Rombout JH (1995) B cell and immunoglobulin heterogeneity in carp (Cyprinus carpio L); an immuno(cyto)chemical study. Dev Comp Immunol 19:97–108 Kurucz E, Zettervall CJ, Sinka R, Vilmos P, Pivarcsi A, Ekengren S, Hegedus Z, Ando I, Hultmark D (2003) Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A 100:2622–2627 Kurz CL, Tan M (2004) Regulation of aging and innate immunity in C. elegans. Aging Cell 3:185–193 Kyriakis JM, Avruch J (2001) Mammalian mitogen activated protein kinases signal transduction pathways activated by stress and inflammation. Physiol Rev 81:807–869 Lacchini AH, Davies AJ, Mackintosh D, Walker AJ (2006) Beta-1,3-glucan modulates PKC signaling in Lymnea stagnalis defence cells: a role for PKC in H2O2 production and downstream ERK activation. J Exp Biol 209:4829–4840 Lamprou I, Tsakas SGL, Theodorou Karakantza M, Lampropoulou M, Marmaras VJ (2005) Uptake of LPS/E. coli/ latex beads via different signaling pathways in medfly haemocytes: the role of MAP kinases activation and protein secretion. Biochim Biophys Acta 1744:1–10 Lamprou I, Mamali I, Dallas K, Fertakis V, Lampropoulou M, Marmaras VJ (2007) Distinct signaling pathways promote phagocytosis of bacteria, latex beads and lipopolysaccharide in medfly haemocytes. Immunology 121:314–327 Larade K, Storey KB (2006) Analysis of signal transduction pathways during anoxia exposure in a marine snail: a role of MAP kinase and downstream signaling effects. Comp Biochem Physiol B 143:85–91 Lassegues M, Milochau A, Doignon F, Du Pasquier L, Valembois P (1997) Sequence and expression of an Eisenia fetida-derived cDNA clone that encodes the 40 kDa fetidin antibacterial protein. Eur J Biochem 246:756–762
244
P. Engelmann et al.
Lemaitre B, Hoffmann J (2007) The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol 25:697–743 Lemmi CAE, Cooper EL (1981) Induction of coelomocyte proliferation by xenografts in the earthworm Lumbricus terrestris. Dev Comp Immunol 5:73–80 Liebmann E (1942) The coelomocytes of Lumbricidae. J Morph 71:221–249 Linthicum DS, Marks DH, Stein EA, Cooper EL (1977) Graft rejection in earthworms: an electron microscopic study. Eur J Immunol 7:871–876 Mansour MH, Cooper EL (1984) Serological and partial molecular characterization of Thy-1 homolog in tunicates. Eur J Immunol 14:1031–1039 Mansour MH, DeLange R, Cooper EL (1985) Isolation, purification and amino acid composition of the tunicate haemocytes. Thy-1 homolog. J Biol Chem 260:2681–2686 Marks DH, Stein EA, Cooper EL (1981) Acid phosphatase changes associated with response to foreign tissue in the earthworm Lumbricus terrestris. Comp Biochem Physiol 68A:681–683 Metchnikoff E (1891) Lectures on comparative pathology of inflammation (Starling EH 1968). Dover, New York, pp 67–73 M€ uller WEG, Blumbach B, M€ uller I (1999) Evolution of the innate and adaptive immune systems: relationships between potential immune molecules in the lowest metazoan phylum (Porifera) and those in vertebrates. Transplantation 68:1215–1227 M€uller WEG, B€ohm M, Grebenjuk VA, Skorokhod A, M€ uller IM, Gamulin V (2002) Conservation of the positions of metazoan introns from sponges to humans. Gene 295:299–309 Nahas N, Molski TF, Fernandez GA, Sha’afi RI (1996) Tyrosine phosphorylation and activation of new mitogen activated protein (MAP)-kinase cascade in human neutrophils stimulated with various agonists. Biochem J 318:247–253 Negm HI, Mansour MH, Cooper EL (1991) Identification and structural characterization of an LYT 2/3 homolog in tunicates. Comp Biochem Physiol 101B:55–67 Ottaviani E, Franceschi C (1997) The invertebrate phagocytic immunocyte: clues to a common evolution of immune and neuroendocrine systems. Immunol Today 18:169–174 Ottaviani E, Franchini A, Franceschi C (1993) Presence of several cytokine-like molecules in molluscan hemocytes. Biochem Biophys Res Commun 195:984–988 Parrinello N, Vizzini A, Arizza V, Salerno G, Parrinello D, Cammarata M, Giaramita FT, Vazzana M (2008) Enhanced expression of a cloned and sequenced Ciona intestinalis TNFalpha-like (CiTNF alpha) gene during the LPS-induced inflammatory response. Cell Tissue Res 334:305–317 Pech LL, Strand MR (1996) Granular cells are required for encapsulation of foreign targets by insect haemocytes. J Cell Sci 109:2053–2060 Pipe RK, Farley SR, Coles JA (1997) The separation and characterization of haemocytes from the mussel Mytilus edulis. Cell Tissue Res 289:537–545 Porchet-Hennere´ E (1990) Cooperation between different coelomocyte populations during the encapsulation response of Nereis diversicolor, demonstrated using monoclonal antibodies. J Invertebr Pathol 56:353–361 Porchet-Hennere´ E, Vernet G (1992) Cellular immunity in an annelid (Nereis diversicolor, Polychaeta): production of melanin by a subpopulation of granulocytes. Cell Tissue Res 269:167–174 Reinisch CL, Charles AM, Troutner J (1983) Unique antigens on neoplastic cells of the soft shell clam Mya arenaria. Dev Comp Immunol 7:33–39 Roch P, Valembois P (1978) Evidence for concanavalin A-receptors and their redistribution on lumbricid leukocytes. Dev Comp Immunol 2:51–64 Roch P, Cooper EL, Eskinazi DP (1983) Serological evidences for a membrane structure related to human b2-microglobulin expressed by certain earthworm leukocytes. Eur J Immunol 13:1037–1042 Salojin K, Oravecz T (2007) Regulation of innate immunity by MAPK dual-specificity phosphatases: knockout models reveal new tricks of old genes. J Leukoc Biol 8:860–869 Salzet M (2002) Antimicrobial peptides are signaling molecules. Trends Immunol 23:283–284
14
Earthworm Innate Immune System
245
Shalev A, Greenberg AH, L€ ogdberg L, Bj€ orck L (1981) b2-microglobulin-like in low vertebrates and invertebrates. J Immunol 127:1186–1191 Shalev A, Pla M, Ginsburger-Vogel T, Echalier G, L€ ogdberg L, Bj€ orck L, Colombani J, Segal S (1983) Evidence for b2 microglobulin and H-2-like antigenic determinants in Drosophila. J Immunol 130:297–302 Steinmetz PR, Zelada-Gonazales F, Burgtdorf C, Wittbrodt J, Arendt D (2007) Polychaete trunk neuroectoderm converges and extends by mediolateral cell intercalation. Proc Natl Acad Sci U S A 104:2727–2732 Strand MR, Johnson JA (1996) Characterization of monoclonal antibodies to hemocytes of Pseudoplusia includens. J Insect Physiol 42:21–31 Stubberud HE, Hønsi TG, Stenersen J (2000) Purification and partial characterisation of tentatively classified acid phosphatase from the earthworm Eisenia veneta. Comp Biochem Physiol 126B:487–494 Takahashi T, Iwase T, Takenouchi N, Saito M, Kobayashi K, Moldoveanu Z, Mestecky J, Moro I (1996) The joining (J) chain is present in invertebrates that do not express immunoglobulins. Proc Natl Acad Sci U S A 93:1886–1891 Toupin J, Lamoureux G (1976) Coelomocytes of the earthworm: the T-cell-like rosette. Cell Immunol 26:127–132 Troemel ER, Chu SW, Reinke V, Lee SS, Ausubel FM, Kim DH (2006) p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet 2:e183 Tuckova L, Rejnek J, Sima P (1988) Response to parenteral stimulations in earthworms L. terrestris and E. foetida. Dev Comp Immunol 12:287–296 Valembois P (1971) Etude ultrastructurale des coelomocytes du lombricien Eisenia fetida (Sav). Bull Soc Zool Fr 96:59–72 Valembois P, Roch Ph (1977) Identification par autoradiographie des leucocytes stimule´s a` la suite de plaies ou de greffes chez un ver de terre. Biol Cell 28:82–82 Valembois P, Lasse´gues M, Roch P, Vaillier J (1985) Scanning electron-microscopic study of the involvement of coelomic cells in earthworm antibacterial defense. Cell Tissue Res 240:479–484 Valembois P, Seymour J, Lasse`gues M (1994) Evidence of lipofuscin and melanin in the brown body of the earthworm Eisenia fetida andrei. Cell Tissue Res 277:183–188 Van de Braak CBT, Botterblom MHA, Taverne N, Van der Knaap WPW, Rombout JH (2001) Monoclonal antibodies against haemocyte molecules of Penaeus monodon shrimp react with haemolymph components of other crustaceans and disparate taxa. Dev Comp Immunol 25:279–283 Willott E, Trenczek T, Thrower LW, Kanost MR (1994) Immunochemical identification of insect hemocyte populations: monoclonal antibodies distinguish four major haemocyte types in Manduca sexta. Eur J Cell Biol 65:417–423 Willott E, Lowenberger C, Christensen BM, Kanost MR (1995) Monoclonal antibodies against Manduca sexta haemocytes bind Aedes aegypti hemocytes: characterization of six monoclonal antibodies that bind hemocytes from both species. Dev Comp Immunol 19:451–461 Yoshino TP, Granath WO (1983) Identification of antigenically distinct hemocyte subpopulations in Biomphalaria glabrata (Gastropoda) using monoclonal antibodies to surface membrane markers. Cell Tissue Res 232:553–564 You MK, Oh SI, Ok SH, Cho SK, Shin HY, Jeung JU, Shin JS (2007) Identification of putative MAPK kinases in Oryza minuta and O. sativa responsive to biotic stresses. Mol Cell 23:108–114 Zelck UE, Gege BE, Schmid S (2007) Specific inhibitors of mitogen activated protein kinase and PI3-K pathways impair immune responses by hemocytes of trematode intermediate host snails. Dev Comp Immunol 31:321–331 Zhang D, Jiang J, Jiang S, Ma J, Su T, Qiu L, Zhu C, Xu X (2009) Molecular characterization and expression analysis of a putative LPS-induced TNF-alpha factor (LITAF) from pearl oyster Pinctada fucata. Fish Shellfish Immunol 27:391–396
ISJ 8: 78-84, 2011
ISSN 1824-307X
MINIREVIEW
Interactions of intracellular calcium and immune response in earthworms P Engelmann1, B Opper1,2, P Németh1 1
Department of Immunology and Biotechnology, Clinical Center, University of Pécs, Szigeti u. 12, H-7643 Pécs, Hungary 2 Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Pécs, Szigeti u. 12, H-7643 Pécs, Hungary
Accepted May 4, 2011
Abstract Intracellular calcium level has a definite role in innate and adaptive immune signaling but its evolutionary aspects are not entirely clear yet. Very few information are accessible about calcium contents of invertebrate immunocytes, especially of celomocytes, the effector cells of earthworm immunity. Different basal and induced Ca2+ levels characterize the various celomocyte subgroups. Intracellular calcium is mostly located in the endoplasmic reticulum and celomocytes exert intracellular Ca2+ ATPase activity to maintain their calcium homeostasis. Immune molecules such as phytohemagglutinin and the chemoattractant fMLP caused the elevation of intracellular Ca2+ level in celomocytes. All the evidence suggests that Ca2+ influx may play a crucial role in the signal transduction of the earthworm’s innate immunity. Key Words: annelids; celomocytes; intracellular signaling; lectins; chemoattractants
Introduction Invertebrate organisms regulate their biochemical pathways by means of evolutionarily conserved molecular components (Crozatier and Meister, 2007). Calcium is one of the most ancient molecules participates in these intracellular pathways. Calcium acts as an intracellular mediator and its transient oscillations are necessary for cell activation and metabolism (Carafoli, 2002, 2005; Case et al., 2007). Indeed, calcium participates as a second messenger in intracellular signaling of invertebrates (Whitaker, 2006); however, the role of calcium has been investigated only in a limited number of species (Burlando et al., 2001; Whitaker, 2006). Leukocyte activation in vertebrates is mediated by calcium signaling. The elevated intracellular calcium will be followed by kinase phosphorylation, activation of transcription factors and gene expression (Oh-hora and Rao, 2008). As for the role of calcium signaling in invertebrate immunity the data are scarce; an in vitro approach has demonstrated that elevation of cytosolic calcium induces activation of phospholipase A2 in mussel hemocytes (Marchi et al., 2004). So far, there was no data available concerning
the cytosolic calcium levels and its oscillations upon immune stimulus from earthworm immune competent cells (so called celomocytes). Recently, an evolutionary conserved calcium-binding protein, the calreticulin was fully cloned and characterized from Eisenia fetida earthworms. Calreticulin was strongly expressed in celomocytes in addition to other earthworm tissues (Kauschke et al., 2001; Šilerová et al., 2007). Moreover, another conserved calcium-binding protein, calmodulin is partially sequenced from the celomocytes of E. fetida (Brulle et al., 2006). With these observations in mind we felt it is essential to clarify the possible role of calcium in earthworm immunocytes. In our recently published report we aimed to measure calcium levels of celomocyte subpopulations and uncover the role of intracellular calcium signaling in the celomocyte’s immune activation (Opper et al., 2010). Innate immunity of earthworms Earthworms (Oligochaeta, Annelida) similarly to other invertebrates possess humoral and cellular immune responses against environmental pathogens (reviewed in Cooper et al., 2002). Cellular immune responses of earthworms were first evidenced through transplantation experiments by rejecting allo- and xenografts of the body wall (Cooper, 1968, 1969, 1970). Within the body cavity (celom) of earthworm’s free-floating immune cells, the celomocytes are
___________________________________________________________________________
Corresponding author: Péter Engelmann Department of Immunology and Biotechnology Clinical Center, University of Pécs, Pécs H-7643, Szigeti u. 12, Hungary E-mail:
[email protected]
78
Fig. 1 Intracellular calcium harbored by earthworm celomocytes is responsible for mitogen stimuli. (A) Various subgroups of celomocytes are identified by May-Grünwald/Giemsa staining (H, hyaline amebocytes; G, granular amebocytes; C, chloragocytes/eleocytes). (B) Physical distribution of earthworm immunocytes (celomocytes/chloragocytes) analyzed by means of flow cytometry. Only effector celomocytes were responsive in 2+ 2+ terms of Ca influx. (C) Ca ATPase enzyme activity was detected by cytochemistry in different celomocytes of E. fetida (arrows). Note the Ca2+ ATPase negative celomocytes (amebocytes, number sign) and chloragocytes (arrowheads). Bars: 20 μm (A, C). (D) Addition of 120 µg/ml phytohemagglutinin caused Ca2+ influx in celomocytes demonstrated by using Fluo-3AM Ca2” sensitive fluorescent dye.
circulated. Earthworm celomocytes are responsible for self/non-self recognition, phagocytosis, encapsulation (called brown body formation in earthworms), and production of antimicrobial/cytotoxic molecules. The knowledge about the origin of earthworm celomocytes is rather limited, because there is no evidence of any active hematopoietic organs/glands in oligochaeta annelids with some exceptions (Vetvicka and Sima, 2009). Possible maturation sites for celomocytes could be the mesodermrelated celomic epithelium and the metanephridial tissue (Engelmann et al., 2005a, Vetvicka and Sima, 2009). Earthworm celomocytes can be distributed into several subpopulations. Earlier studies characterized celomocyte subgroups based on histochemical and microscopical properties
(Adamowicz, 2005). Nowadays, physico-chemical characteristics of these cells are taken more into account. Two or three main populations of earthworm leukocytes are distinguished using a flow cytometry-based approach (Quagliano et al., 1996; Engelmann et al., 2005a). According to the morphological terminology, those subpopulations are the granular-, hyaline amebocytes and chloragocytes/eleocytes distinguished previously by microscopy (Cooper et al., 2002 and Fig. 1A). Our group has been characterized three antigenically different populations of celomocytes (R1, R2 and R3) using specific monoclonal antibodies, which could correspond to these previously identified celomocyte populations (Engelmann et al., 2005a). These data were confirmed independently by other researchers (Fuller-Espie et al., 2010, Vernile et al., 2007).
79
2+ ATPase protein family balancing the Ca content among the intracellular cell organelles and the cytoplasm. Ca2+ ATPases are membrane located transport proteins of invertebrate and vertebrate cells (Ballarin et al., 1997; Yagodin et al., 1998; Yagodin et al., 1999; Granfeldt et al., 2002; Baron et al., 2009). Separate Ca2+ ATPase molecules can be distinguished in the plasma membrane (PMCA) and in the endoplasmic reticulum (SERCA). Functionally active SERCA pumps can be demonstrated by thapsigargin (TG) treatments. TG promptly inhibits this ATP dependent ion pumps, moreover later TG induces unfolded protein response and autophagy (Sakaki et al., 2008). Celomocytes were responsive upon this treatment, because we observed a delayed rise of intracellular calcium level after 2 µM TG addition. Besides, we localized the Ca2+ ATPases in the celomocytes. The cells were stained for Ca2+ ATPase activity using enzyme cytochemical approach (Opper et al., 2010 and Fig. 1C). Previously, annelid mesenchymal tissues proved to be positive for ATPase cytochemistry (De Eguileor et al., 1999; Gastaldi et al., 2007). 2+ Inhibition of Ca ATPase activity can diminish sufficient phagocyte response as it was demonstrated in the immunocytes of Botryllus schlosseri (Ballarin et al., 1997), which further strengthen the immunological relevance of calcium homeostasis in invertebrates.
Initiation of invertebrate innate immune response is based on germ-line pattern recognition molecules. Recently, a pattern recognition receptor (PRR) molecule, called celomic cytolytic factor (CCF) binding to lipopolysaccharide (LPS)-, β-1,3glucan-, muramic acid-, and N,N'-diacetylchitobiose, was identified from E. fetida. This protein is expressed in celomocytes and presents in the celomic fluid (Beschin et al., 1998, 1999). On the other hand Toll proteins have not been found yet in earthworms (Engelmann et al., 2005b), however just recently an in silico approach proved that Toll genes are present in annelid phyla (Davidson et al., 2008). Moreover, a transcriptomic analysis provided evidence about the expression of MyD88 homologue in E. fetida (Gong et al., 2008). So far, it is known that CCF has unique antigen recognition characteristics; although might other receptors also contribute in non-self recognition accelerating various signal transduction pathways still unknown in annelids. Calcium contents of celomocytes Concerning about the calcium content and signaling involved in invertebrate immunocyte activation only limited information is available since studies have been carried out mainly on the classical model organism Drosophila melanogaster (Yagodin et al., 1999). Similarly to those experiments performed on hemocytes from the Crassotrea gigas oyster (Aton et al., 2006), we assessed the intracellular calcium contents of earthworm celomocytes. Earlier, we characterized three subpopulations of earthworm celomocytes based on physical parameters and immunological properties using monoclonal antibodies (Engelmann et al., 2005a). During Ca2+ measurements we included only two populations for celomocytes. The first gate represents the effector celomocytes corresponds to hyaline and granular amebocytes, the second gate was applied for chloragocytes (Fig. 1B). Comparing the intracellular calcium levels of celomocyte subpopulations from E. fetida we observed characteristic differences. Effector celomocytes such as granular and hyaline amebocytes had lower intracellular calcium contents, while chloragocyte/eleocyte subpopulation harbors elevated calcium levels (Opper et al., 2010). In oysters only a low percentage (20-25 %) of hemocytes proved to be fluorescent after 2+ preincubation with the Fluo-3 AM Ca sensitive dye (Aton et al., 2006). In contrast, among earthworm celomocytes we observed 70-90 % Fluo-3 AM positive cells. This discrepancy could be due to species-specific differences and the different experimental conditions. C. gigas hemocytes were stained in hemolymph or artificial sea water while celomocytes were labeled in cell culture media or in PBS similarly to mammalian cells.
Celomocytes activation
exert
Ca2+-independent
PKC
Invertebrate immunocyte activation involves signal transduction events similarly to vertebrates. Emerging data shows that cytosolic enzymes, which are important in kinase mediated signal transductions such as mitogen activated protein kinases (MAPK), protein kinase C (PKC), phospatidyl-inosytol 3 kinase (PI-3K), are well conserved molecules from invertebrates to vertebrates (Canesi et al., 2006; Engelmann et al., 2011). Earthworm PKC1, PKC2 and mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 (MAP3K1 or MEKK1) were partially cloned and characterized from E. fetida (Brulle et al., 2006; Gong et al., 2008). According to the report of Brulle et al. (2006) worms challenged with cadmium-spiked soil have biased gene expression involved in oxidative stress response and metal detoxification while there was no alteration in kinase pathway genes. We tested that phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) as an agonist of PKC proteins is able to evoke Ca2+ response in earthworm celomocytes. PMA did not induce Ca2+ mobilization of celomocytes; however addition of various concentrations of PMA, just right after ionomycin challenge, caused a concentration-dependent 2+ decrease of Ca signal (Opper et al., 2010). Similar results were obtained from vertebrate leukocytes, where PMA treatment abolished the observed Ca2+ influx (McCarthy et al., 1989; Mahomed and Anderson, 2000). Moreover, experiments on mussel hemocytes proved the existence of dual, PMA resistant and sensitive isoforms of PKCs in invertebrates (Gonzales-Riopedre et al., 2009).
Ca2+ ATPase activity in celomocytes Intracellular calcium content harbored in celomocytes must be controlled by several mechanisms. One major component is the Ca2+
80
Fig. 2 The hypothetical model shows intracellular signaling events after activations of earthworm celomocytes. It proposes possible, yet uncovered signal transduction events that follow the recognition of pathogens or pathogen associated molecules (PAMPs). These activate several effector mechanisms such as phagocytosis and production of bioactive molecules (CCF, lysenin, lyzosyme, etc.). This modified figure is reproduced with kind permission of Springer Science + Business Media from Engelmann et al. (2011).
Ca2+ influx induced by a plant lectin
We were interested in whether mitogen stimulus of celomocytes involves calcium influx or not. Different concentrations of PHA caused an increase of intracellular calcium levels in 2+ celomocytes, but we were not able to detect Ca influx using other mitogens (Opper et al., 2010 and Fig. 1D). Based on this data we suggest that PHA 2+ may lead to proliferation based on a Ca dependent signaling, while other mitogens such as ConA and LPS may cause celomocyte proliferation through other, non Ca2+-related mechanisms in earthworms.
Microbial cell wall components and plant lectins are widely used mitogenic reagents in immunobiological research. These mitogens such as phytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (ConA), pokeweed mitogens (PWM), wheat germ agglutinin (WGA) lectins and lipopolysaccharide (LPS) endotoxin cause signal transduction events and proliferation of vertebrate leukocytes (Lichtman et al., 1983; Sei and Arora, 1991; Siegl et al., 1998). It is known that some of these mitogens evoke activation and cell proliferation of invertebrate immunocytes as well (Holm et al., 2008). Earthworm celomocytes were increased in numbers upon treatment with LPS, ConA and PHA mitogens, however highest proliferation rate was observed upon ConA stimulation (Roch et al., 1975; Roch, 1977). Flow cytometry-based cell cycle analysis (BrdU uptake and propidium iodide staining) of mitogen-treated celomocytes complemented these findings (Quaglino et al., 1996, Engelmann et al., 2011).
2+
Bacterial chemoattractant peptides evoked Ca oscillations in celomocytes
Microbial products such as LPS, zymosan and N-formylmethionine-leucine-phenylalanine (fMLP) can recruit immunocytes into the site of infection (Heit et al., 2002). This migration requires the events of intracellular activation and cytoskeletal reorganization in both invertebrate and vertebrate immunocytes (Mahomed and Anderson, 2000).
81
Recent evidence show that fMLP receptors are involved in the migration and engulfment of foreign particles mediated by the hemocytes of mollusks and arthropods (Yip et al., 2001; Malagoli and Ottaviani, 2004; Garcia-Garcia et al., 2009). Until now there was no experimental data about fMLP receptor expression or fMLP mediated activation of earthworm celomocytes. However, celomocytes from the sipunculan Themiste petricola worms were reactive for fMLP stimulus (Cabrera et al., 2002). In earthworm celomocytes, we were able to detect a transient intracellular calcium rise after fMLP treatment. This effect was evoked by similar concentration (5 µM) of fMLP (Opper et al., 2010) which was effective for the migration of sipunculan celomocytes and for the activation of vertebrate leukocytes (Tintinger et al., 2005). Our data claim for a functional evidence of fMLP receptor-like molecule in celomocytes, however we have not got direct nucleic acid information yet. The mammalian chemoattractant receptor is a G-protein coupled receptor (GPCR) sharing functional and sequence similarities with other GPCRs such as pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor (PAC1) and vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 (VPAC1) proved by molecular communication (El Zein et al., 2008). More interestingly, earthworm celomocytes express an immune-reactive PAC1 receptor-like structure (Somogyi et al., 2009). This data may suggest further evidence for the immune-neuroendocrine cross-talk in invertebrate immune systems discussed by Ottaviani et al. (2007).
Moreover we have no information so far how these toxicants influence the dynamic changes of calcium levels in celomocytes and other invertebrate immunocytes. Heavy metals alter the intracellular calcium homeostasis in earthworm celomocytes demonstrated by X-ray microanalysis (Homa et al., 2007). Just recently it has been showed that chronic 2+ Cu exposure of Penaeus monodon shrimp caused impaired hemocyte counts, biased the immune functions and elevated the intracellular calcium contents (Xian et al., 2010). These data further supports that our proposed method could be applied by toxicologists to study the toxic effects of heavy metal-, chemical pollutions or the possible harmful effects of emerging nanomaterials using functional assays such as intracellular calcium level measurements by fluorescence dyes. References Adamowicz A. Morphology and ultrastructure of Dendrobaena veneta (Lumbricidae) coelomocytes. Tissue Cell 37: 125-133, 2005. Aton E, Renault T, Gagnaire B, Thomas-Guyon H, Cognard C, Imbert N. A flow cytometric 2+ in approach to study intracellular-free Ca Crassostrea gigas haemocytes. Fish Shellfish Immunol. 20: 493-502, 2006. Ballarin L, Cima F, Sabbadin A. Calcium homeostasis and yeast phagocytosis in hemocytes of the colonial ascidian Botryllus schlosseri. Comp. Biochem. Physiol. 118A: 153-158, 1997. Baron S, Struyf S, Wuytack F, Van Damme J, Missiaen L, Raeymaekers L, et al. Contribution of intracellular Ca2+ stores to Ca2+ signaling during chemokinesis of human neutrophil granulocytes. Biochim. Biophys. Acta 1793: 1041-1049, 2009. Beschin A, Bilej M, Brys L, Torreele E, Lucas R, Magez S, et al. Convergent evolution of cytokines. Nature 400: 627-628, 1999. Beschin A, Bilej M, Hanssens F, Raymakers J, Van Dyck E, Revets H, et al. Identification and cloning of a glucan- and lipopolysaccharidebinding protein from Eisenia foetida earthworm involved in the activation of prophenoloxidase cascade. J. Biol. Chem. 273: 24948-24954, 1998. Brulle F, Mitta G, Cocquerelle C, Vieau D, Lemiere S, Lepretre A, et al. Cloning and real-time PCR testing of 14 potential biomarkers in Eisenia fetida following cadmium exposure. Environ. Sci. Technol. 40: 2844-2850, 2006. Burlando B, Panfoli I, Viarengo A, Marchi B. Free 2+ 2+ radical-dependent Ca signaling: role of Ca 2+ induced Ca release. Antioxid. Redox Signal. 3: 525-530, 2001. Cabrera PV, Blanco G, Ernst G, Alvarez A, Cooper EL, Hajos S. Coelomocyte locomotion in the sipunculan Themiste petricola induced by exogenous and endogenous chemoattractants: role of a CD44-like antigen-HA interaction. J. Invertebr. Pathol. 79: 111-119, 2002. Canesi L, Betti M, Ciacci C, Lorusso LC, Pruzzo C, Gallo G. Cell signalling in the immune response of mussel hemocytes. Inv. Surv. J. 3: 40-49, 2006.
Conclusions and future prospects Our results emphasize the variation of calcium levels in the celomocyte subpopulations and the activation induced calcium influx mediated by different immunogen molecules such as lectins and bacterial chemoattractants. These data lead us to propose a model where stress events cause 2+ mobilization along with other activation/Ca possible signaling events in earthworm’s immune cell subpopulations (Fig. 2) proving that intracellular calcium release is the most ancient signaling mechanism which is required for sufficient immune response in all organisms (Opper et al., 2010; Engelmann et al., 2011). There are further applications which could have benefit from our observations and flow cytometry is an easily adaptable tool that can be used for many cellular-based functional assays. It is widely accepted that cellular homeostasis and intracellular signaling are strongly influenced by environmental pollutions (Worth et al., 2001; Kim et al., 2002; Marchi et al., 2004; Franco et al., 2009; Vergani et al., 2009). For instance earthworms are a well established model organism for ecotoxicology. Celomocytes can be isolated from toxicants exposed worms and the functional status of 2+ celomocytes (cell survival, ROS production, Ca levels) could be quantitatively assessed using assay-specific fluorescent probes for flow cytometry. However, we have very limited information how environmental toxicants such as pesticides and heavy metals affect the calcium homeostasis.
82
Carafoli E. Calcium signaling: a tale for all seasons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1115-1122, 2002. Carafoli E. Calcium - a universal carrier of biological signals. FEBS J. 272: 1073-1089, 2005. Case RM, Eisner D, Gurney A, Jones O, Muallem S, Verkhratsky A. Evolution of calcium homeostasis: from birth of the first cell to an omnipresent signaling system. Cell Calcium 42: 345-350, 2007. Cooper EL. Transplantation immunity in annelids. I. Rejection of xenografts exchanged between Lumbricus terrestris and Eisenia foetida. Transplantation 6: 322-327, 1968. Cooper EL. Neoplasia and transplantation immunity in annelids. Natl. Cancer Inst. Monogr. 31: 655669, 1969. Cooper EL. Transplantation immunity in helminths and annelids. Transplant. Proc. 2: 216-221, 1970. Cooper EL, Kauschke E, Cossarizza A. Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff. BioEssays 24: 319-333, 2002. Crozatier M, Meister M. Drosophila haematopoiesis. Cell. Microbiol. 9: 1117-1126, 2007. Davidson CR, Best NM, Francis JW, Cooper EL, Wood TC. Toll-like receptor genes (TLRs) from Capitella capitata and Helobdella robusta. Dev. Comp. Immunol. 32: 608-612, 2008. De Eguileor M, Tettamanti G, Grimaldi A, Boselli A, Scari G, Valvassori R, et al. Histopathological changes after induced injury in leeches. J. Invertebr. Pathol. 74: 14-28, 1999. El Zein N, Badran B, Sariban S. The neuropeptide pituitary adenylate cyclase activating 2+ and propolypeptide modulates Ca inflammatory functions in human monocytes through G protein-coupled receptors VPAC-1 and formyl peptide receptor-like 1. Cell Calcium 43: 270-284, 2008. Engelmann P, Palinkas L, Cooper EL, Nemeth P. Monoclonal antibodies identify four distinct annelid leukocyte markers. Dev. Comp. Immunol. 29: 599-614, 2005a. Engelmann P, Cooper EL, Nemeth P. Anticipating innate immunity without a Toll. Mol. Immunol. 23: 931-942, 2005b. Engelmann P, Cooper EL, Opper B, Németh P. Earthworm innate immune system. In: Karaca A (ed), Biology of earthworms, Springer-Verlag, Berlin, Germany, pp 229-245, 2011. Franco R, Sanchez-Olea R, Reyes-Reyes EM, Panayiotidis MI. Environmental toxicity, oxidative stress and apoptosis: menage a trios. Mutat. Res. 674: 3-22, 2009. Fuller Espie SL, Nacarelli T, Blake EL, Bearoff FM. The effect of oxidative stress on phagocytosis and apoptosis in the earthworm Eisenia hortenis. Inv. Surv. J. 7: 89-96, 2010. Garcia-Garcia E, Garcia-Garcia PL, Rosales C. An fMLP receptor is involved in activation of phagocytosis by hemocytes from specific insect species. Dev. Comp. Immunol. 33: 728-739, 2009. Gastaldi L, Ranzato E, Capri F, Hankard P, Pérés G, Canesi L, et al. Application of a biomarker battery for the evaluation of the sublethal
effects of pollutants in the earthworm Eisenia andrei. Comp. Biochem. Physiol. 146C: 398405, 2007. Goel G, Makkar HPS, Francis G, Becker K. Phorbol esters: Structure, biological activity, and toxicity in animals. Int. J. Toxicol. 26: 279288, 2007. Gong P, Guan X, Inouye LS, Deng Y, Pirooznia M, Perkins EJ. Transcriptomic analysis of RDX and TNT interactive sublethal effects in the earthworm Eisenia fetida. BMC Genomics 9: S15, 2008. Gonzalez-Riopedre M, Barcia R, Ramos-Martinez 2+ JI. The Ca -independent PKC (p105) mediates the PMA-activation of marine mussel hemocytes and Ca2+-dependent PKC (p60) does not intervene. Mol. Cell. Biochem. 332: 243-249, 2009. Granfeldt D, Samuelsson M, Karlsson A. 2+ Capacitative Ca influx and activation of the neutrophil respiratory burst. Different regulation of plasma membrane- and granule-localized NADPH-oxidase. J. Leukoc. Biol. 71: 611-617, 2002. Heit B, Tavener S, Raharjo E, Kubes P. An intracellular signalling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159: 91-102, 2002. Holm K, Dupont S, Sköld H, Stenius S, Thorndyke M, Hernroth B. Induced cell proliferation in putative haematopoietic tissues of the sea star Asterias rubens (L.) J. Exp. Biol. 211: 25512558, 2008. Homa J, Sturzenbaum SR, Morgan AJ, Plytycz B. Disrupted homeostasis in coelomocytes of Eisenia fetida and Allolobophora chlorotica exposed dermally to heavy metals. Eur. J. Soil Biol. 43: S273-S280, 2007. Kauschke E, Komiyama K, Moro I, Eue I, Konig S, Cooper EL. Evidence for perforin-like activity associated with earthworm leukocytes. Zoology 104: 13-24, 2001. Kim SH, Johnson VJ, Sharma RP. Mercury inhibits nitric oxide production but activates proinflammatory cytokine expression in murine macrophage: differential modulation of NFkappaB and p38 MAPK signaling pathways. Nitric Oxide 7: 67-74, 2002. Lichtman AH, Segel GB, Lichtman MA. The role of calcium in lymphocyte proliferation. Blood 61: 413-422, 1983. Mahomed AG, Anderson R. Activation of human neutrophils with chemotactic peptide, opsonized zymosan and the calcium ionophore A23187, but not with a phorbol ester, is accompanied by efflux and store-operated influx of calcium. Inflammation 24: 559-569, 2000. Malagoli D, Ottaviani E. Yessotoxin affects fMLPinduced cell shape changes in Mytilus galloprovincialis immunocytes. Cell Biol. Int. 28: 57-61, 2004. Marchi B, Burlando B, Moore MN, Viarengo A. Mercury- and copper-induced lysosomal 2+ membrane destabilisation depends on [Ca ]i dependent phospholipase A2 activation. Aquat. Toxicol. 66: 197-204, 2004.
83
McCarthy SA, Hallam TJ, Merritt JE. Activation of protein kinase C in human neutrophils attenuates agonist-stimulated rises in cytosolic 2+ free Ca concentration by inhibiting bivalentcation influx and intracellular Ca2+ release in 2+ addition to stimulating Ca efflux. Biochem. J. 264: 357-364, 1989. Oh-hora M, Rao A. Calcium signaling in lymphocytes. Curr. Opin. Immunol. 20: 250-258, 2008. Opper B, Németh P, Engelmann P. Calcium is required for coelomocyte activation in earthworms. Mol. Immunol. 42: 2047-2056, 2010. Ottaviani E, Malagoli D, Franceschi C. Common evolutionary origin of neuroendocrine and immune systems: from morphological and functional evidences to in silico approaches. Trends Immunol. 28: 497-502, 2007. Quaglino D, Cooper EL, Salvioli S, Capri M, Suzuki MM, Ronchetti IP, et al. Earthworm coelomocytes in vitro: cellular features and "granuloma" formation during cytotoxic activity against the mammalian tumor cell target K562. Eur. J. Cell Biol. 70: 278-288, 1996. Roch P. Reactivity in vitro of the leukocytes of the earthworm Eisenia foetida Sav. to several mitogenic substances. C. R. Acad. Sci. Hebd. Seances Acad. Sci. D 284: 705-708, 1977. Roch P, Valembois P, Du Pasquier L. Response of earthworm leukocytes to concanavalin A and transplantation antigens. Adv. Exp. Med. Biol. 64: 45-54, 1975. Sakaki K, Wu J, Kaufmann KJ. Protein kinase C theta is required for autophagy in response to stress in the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283: 15370-15380, 2008. Sei Y, Arora PK. Quantitative analysis of calcium 2+ Ca mobilization after stimulation with mitogens or anti-CD3 antibodies. Simultaneous fluo-3 and immunofluorescence flow cytometry. J. Immunol. Meth. 137: 237-244, 1991. Siegl E, Nebe B, Blunk H, Rychly J. Detection of mitogen induced stimulation of leukocytes from the rainbow trout (Oncorynchus mykiss) by flow cytometric analysis of intracellular calcium. Comp. Biochem. Physiol. 119A: 915-923, 1998. Somogyi I, Boros A, Engelmann P, Varhalmi E, Nemeth J, Lubics A, et al. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-like compounds could modulate the activity of coelomocytes in the earthworm. Ann. NY Acad. Sci. USA 1163: 521-523, 2009.
Šilerová M, Kauschke E, Procházková P, Josková R, Tučková L, Bilej M. Characterization, molecular cloning and localization of calreticulin in Eisenia fetida earthworms. Gene 397: 169177, 2007. Tintinger G, Steel HC, Anderson R. Taming the neutrophil: calcium clearance and influx mechanisms as novel targets for pharmacological control. Clin. Exp. Immunol. 141: 191-200, 2005. Vergani L, Lanza C, Scarabelli L, Canesi L, Gallo G. Heavy metal and growth hormone pathways in metallothionein regulation in fish RTH-149 cell line. Comp. Biochem. Physiol. 149C: 572-580, 2009. Vernile P, Fornelli F, Bari G, Spagnuolo M, Minervini F, de Lillo E, et al. Bioavailability and toxicity of pentachlorophenol in contaminated soil evaluated on coelomocytes of Eisenia andrei (Annelida: Lumbricidae).Toxicol In Vitro 21: 302-307, 2007. Vetvicka V, Sima P. Origins and functions of annelide immune cells: the concise survey. Inv. Surv. J. 6: 138-143, 2009. Whitaker M. Calcium microdomains and cell cycle control. Cell Calcium 40: 585-592, 2006. Worth RG, Esper RM, Warra NS, Kindzelskii AL, Rosenspire AL, Todd RF, et al. Mercury inhibition of neutrophil activity: evidence of aberrant cellular signalling and incoherent cellular metabolism. Scand. J. Immunol. 53: 4955, 2001. Xian JA, Wang AL, Ye CX, Chen XD, Wang WN. Phagocytic activity, respiratory burst, cytoplasmic free-Ca(2+) concentration and apoptotic cell ratio of haemocytes from the black tiger shrimp, Penaeus monodon under acute copper stress. Comp. Biochem. Physiol. 152C: 182-188, 2010. Yagodin S, Hardie RC, Lansdell SJ, Millar NS, Mason WT, et al. Thapsigargin and receptormediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium 23: 219-228, 1998. Yagodin S, Pivovarova NB, Andrews SB, Sattelle DB. Functional characterization of thapsigargin 2+ and agonist-insensitive acidic Ca stores in Drosophila melanogaster S2 cell lines. Cell Calcium 25: 429-438, 1999. Yip ECH, Wong YH, Wong JTH. Bacterial formyl peptide mediated chemptaxis and extracellular acidification in shrimp hemocytes. Dev. Comp. Immunol. 25: 269-277, 2001.
84
Developmental and Comparative Immunology 39 (2013) 214–218
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Developmental and Comparative Immunology journal homepage: www.elsevier.com/locate/dci
Short communication
Revising lysenin expression of earthworm coelomocytes Balázs Opper a,b, András Bognár a, Diána Heidt a, Péter Németh a, Péter Engelmann a,⇑ a b
Department of Immunology and Biotechnology, Clinical Center, University of Pécs, Szigeti u. 12, H-7643 Pécs, Hungary Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Pécs, Szigeti u. 12, H-7643 Pécs, Hungary
a r t i c l e
i n f o
Article history: Received 23 September 2012 Revised 20 November 2012 Accepted 20 November 2012 Available online 28 November 2012 Keywords: Innate immunity Coelomocytes Antimicrobial activity Monoclonal antibodies
a b s t r a c t Lysenin is a species-specific bioactive molecule of Eisenia andrei earthworms. This protein is a potent antimicrobial factor; however its cellular expression and induction against pathogens are still not fully understood. We developed a novel monoclonal antibody against lysenin and applied this molecular tool to characterize its production and antimicrobial function. We demonstrated by flow cytometry and immunocytochemistry that one subgroup of earthworm immune cells (so called coelomocytes), the chloragocytes expressed the highest amount of lysenin. Then, we compared lysenin expression with earlier established coelomocyte (EFCC) markers. In addition, we determined by immunohistology of earthworm tissues that lysenin production is only restricted to free-floating chloragocytes. Moreover, we observed that upon in vitro Staphylococcus aureus but not Escherichia coli challenged coelomocytes over-expressed and then secreted lysenin. These results indicate that among subpopulations of coelomocytes, lysenin is mainly produced by chloragocytes and its expression can be modulated by Gram-positive bacterial exposure. Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction Earthworm’s coelomic fluid exerts a wide spectrum of biological functions including immunity against environmental pathogens. Humoral factors of this compartment control the growth of commensal and pathogenic microorganisms. Coelomic fluid has been a subject of intensive research since many years in earthworms (Bilej et al., 2000; Kauschke et al., 2007; Valembois et al., 1986; Wang et al., 2010). The most extensively characterized factors are the unique fetidin/lysenin group of earthworm’s coelomic fluid. First, fetidin is described as a glycoprotein with antibacterial and haemolytic properties (Lassegues et al., 1997). In addition, another bioactive molecule, designated as lysenin, has been cloned (Sekizawa et al., 1997). Lysenin was described primarily as a smooth muscle contraction factor (Sekizawa et al., 1996a). Membrane biological studies proved that lysenin binds specifically to the sphingomyelin compartments of the cell membrane (Shogomori and Kobayashi, 2008). Initially, lysenin and fetidin were considered as separate molecules exhibiting similar molecular weights (Cooper and Roch, 2003). However, recently it is known that both lysenin and fetidin
Abbreviations: EFCC, Eisenia coelomocyte clusters; LBSS, Lumbricus balanced salt solution. ⇑ Corresponding author. Tel.: +36 72 536 288; fax: +36 72 536 289. E-mail address:
[email protected] (P. Engelmann). 0145-305X/$ - see front matter Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.dci.2012.11.006
belong to the same multimolecular family, that consist of four members such as lysenin, lysenin related protein 1, lysenin related protein 2 (fetidin), and lysenin related 3 (Bruhn et al., 2006). Lysenin/fetidin molecules were found abundantly in the coelomic fluid; however their exact production site and function in earthworms remained elusive. Chloragogenous tissue covers the gut of earthworms. Chloragocytes, thus forming this tissue, are considered as a functional homologue cell type for vertebrate hepatocytes (Jamieson, 1981). Chloragocytes can be separated into two distinctly localized cell populations such as the peripheral chloragocytes found on the gut wall, while the other one termed as central chloragocytes settled inside of the typhlosolis (Ohta et al., 2000). It is suggested that lysenin expression is coupled mainly with the central chloragocytes demonstrated by in situ hybridization and polyclonal antibody-based immunohistochemistry (Sekizawa et al., 1996b; Ohta et al., 2000). Previously we have developed a group of monoclonal antibodies (mAbs) against earthworm coelomocytes and with the aid of these molecular tools we characterized three subpopulations of freefloating coelomocytes (Engelmann et al., 2005). Furthermore, recently we paid more attention to characterize the functional status of coelomocytes (Engelmann et al., 2011). For this purpose we have developed a mAb against lysenin to characterize its cytotoxic nature. In addition, we aimed to revise lysenin expression profile in free-floating coelomocytes, its tissue localization and expression patterns upon bacterial challenge.
B. Opper et al. / Developmental and Comparative Immunology 39 (2013) 214–218
215
2. Materials and methods
2.6. Statistical analysis
2.1. Earthworm culture Eisenia andrei earthworm species were maintained at room temperature and fed with manure complemented soil. Prior to coelomocyte isolations earthworms were placed onto moist tissue paper for depuration.
Statistical analysis was performed with Microcal Origin (Microcal Software Inc., Northhampton, MA USA). The results in the figures are representative values from four independent experiments. All results are presented as mean with standard error shown as error bar. The effect of treatments was analyzed by one way-ANOVA. p < 0.05 was denoted as statistically significant.
2.2. Preparation of mouse anti-lysenin monoclonal antibody
3. Results and discussion
Lysenin (PeptaNova GmbH, Sandhausen, Germany) were dissolved in distilled water at 1 mg/ml concentrations and used for immunizing 8 weeks old female BALB/c mice. Mice were injected with lysenin protein (10 lg) mixed in complete Freund’s adjuvant (CFA, Sigma–Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) into each hind footpad followed with two intraperitoneal (i.p.) boosts in incomplete Freund’s adjuvant (IFA, Sigma) 3 weeks intervals. Finally, one booster was injected in mice selected, according to its antibody titer and isotype, 3 days prior to splenocyte/myeloma-cell fusion. Hybridomas were developed as we described earlier (Engelmann et al., 2005). Hybridoma supernatants were screened by enzyme linked immunosorbent assay (indirect ELISA, for technical details please see the Supplementary Material) using lysenin, coelomocyte lysate as target antigen, and bovine serum albumin (BSA, Sigma) as control antigen. Selected hybridomas were cloned three times by limiting dilution.
3.1. Lysenin expression of isolated coelomocytes
2.3. Extrusion of coelomocytes Coelomocytes were isolated as we described earlier (Engelmann et al., 2005) and living cell numbers were evaluated by trypan-blue exclusion method. Cell viability was above 95%. Coelomocytes of individual worms were analyzed further by immunocytochemistry, immunofluorescence, and flow cytometry. For technical details please see the SM.
2.4. In vitro bacterial challenge Isolated, pooled coelomocytes (6 106/ml) were incubated with heat-inactivated Staphylococcus aureus (OKI II2001) and Escherichia coli (ATCC 25922) at room temperature by end-over-end rotation for 6 h (Bacterial strains were obtained from Dr. Béla Kocsis MD, PhD, Department of Medical Microbiology and Immunology, Clinical Center, University of Pécs). Coelomocytes (106) and bacteria (107) were mixed in 1 ml final volume in 12 75 mm tubes (Falcon, BD Labware). Following phagocytosis, coelomocyte samples were washed in LBSS, centrifuged at 1000 rpm for 5 min (Engelmann et al., 2005). Then supernatant was kept at 80 °C for further analysis and the pellet was applied for the preparation of coelomocyte lysates.
2.5. Preparation of coelomocyte lysate Coelomocytes were lysed in RIPA buffer (50 mM Tris/HCl; pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) NP-40, 0.5% (w/v) Na-deoxycholate, 5 mM EDTA, 0.1% SDS) complemented with Protease Inhibitor Cocktail (Sigma) on ice for 15 min and then centrifuged by 13,000 rpm (15 min, 4 °C). Total protein concentrations of the coelomocyte lysates and supernatants were measured with BCA Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Immunoreactivity of supernatants and coelomocyte lysates were analyzed by ELISA and Western blot assays (further technical details can be obtained in SM).
Coelomocytes are multi-tasking cellular mediators of immune response in earthworms. In addition to their cellular immune functions (e.g. phagocytosis, encapsulation) they participate in the humoral immune mechanisms by producing haemolytical and antimicrobial factors (Bilej et al., 2000; Cooper et al., 2002). Most of these proteins belong to the fetidin/lysenin multiprotein family characterized mainly by membrane biologists. However, the exact role of lysenin in the immune response of earthworms is not so well understood (Kobayashi et al., 2004). Previously, we observed the cytotoxicity mediated by earthworm coelomocytes produced factors (Engelmann et al., 2011). Now we intend to uncover more details about the cytotoxic mechanisms (Macsik et al., in preparation). For this purpose we raised a monoclonal antibody against lysenin (a-EFCC5) and first we initiated to characterize its expression profile in coelomocytes. Antibody positive cells have large granular cytoplasm and relatively small nucleus revealed by immunocytochemistry (Fig. 1A). Immune positive reaction is localized mainly in the intracellular granules. This morphology marks one characteristic subgroup of coelomocytes, the free-floating chloragocytes (sometimes denoted as eleocytes). Other cell types with larger nucleus and smaller cytoplasm (effector coelomocytes, presumably hyaline amoebocytes) were negative for a-EFCC5 staining (Fig. 1A). Using the previously generated mAbs against coelomocyte subgroups we revealed co-expression with lysenin positive coelomocytes (Fig. S1). A-EFCC3 positive coelomocytes are tend to attach together and form aggregates, while EFCC5 positive cells are mainly solitary (Fig. 1B, Figs. S1 and S2). By means of flow cytometry, circulating coelomocytes of the body cavity has several subgroups (Engelmann et al., 2005; Fuller-Espie et al., 2010; Vernile et al., 2007). In our experiments, we could identify three physically distinct subpopulations of coelomocytes denoted as R1, R2, and R3 (Fig. 1C). R1 and R2 populations resemble effector coelomocytes such as hyaline and granular coelomocytes, while R3 subgroup is the highly granular and autofluorescent eleocyte population (Plytycz et al., 2006) (Fig. 1C). EFCC5 positivity could be observed in all three subgroups with various intensities compared with appropriate isotype control antibodies (Fig. 1D). R3 group majorly consisting eleocytes had the highest percentage (39.5 ± 10.2%) of EFCC5 antibody positive cells (Fig. 1D and Table S1). 3.2. Solitary free-floating chloragocytes are restricted for lysenin expression Chloragocytes are usually very abundant, highly granular coelomocyte subpopulation of the coelomic cavity. Their origin is a matter of debate, however most authors agreed that free-floating chloragocytes derived from the chloragogenous tissue of the gut (Jamieson, 1981). These cells are harboring nutrient factors such as glycogens, lipids and participate mainly in general metabolism. Moreover, they are able to produce haemoglobin and metalsequestering cysteine-rich proteins as well (Fischer, 1993; Morgan
216
B. Opper et al. / Developmental and Comparative Immunology 39 (2013) 214–218
Fig. 1. Lysenin expression of coelomocytes using a-EFCC5 mAb. Isolated coelomocytes were stained with a-EFCC5 mAb, discrete granular reactions were observed mainly in the chloragocyte population (arrows, A). Note that not all eleocytes were positive for EFCC5 staining, because numerous negative eleocytes with brownish colored chloragosomes are clearly visible (asterisks) in the coelomocyte samples (A). While some smaller cells with peripherally shifted nucleus (arrowhead, A) were also positive for EFCC5, but large hyaline cells were negative for a-lysenin specific mAb (number sign, A). For double immunofluorescence analysis (B) lysenin positive cells were marked with anti-EFCC5 (arrows), while hyaline coelomocytes stained with FITC conjugated a-EFCC3 (number sign). Flow cytometry revealed the presence of three distinct subpopulations of earthworm coelomocytes (C). After staining with a-EFCC5-FITC antibody (solid line) the strongest positivity appeared in the R3 population compared with FITC conjugated isotype antibody (dashed line) (D). Cryostat cross-sections of earthworm tissues were stained with a-EFCC5 mAb to reveal lysenin expression in the whole organism. EFCC5 positive cells only appeared among free-floating coelomocytes (arrows) in the coelomic cavity (E, H). Some solitary EFCC5 positive coelomocytes were in the close proximity of other tissues (arrows) such the ventral nerve cord (F) and muscle layers (G). Chloragogenous tissue was consistently negative compared with control tissues (I and J). Figure abbreviations: bv, blood vessel; chl, chloragogenous tissue; g, gut; mu, muscle layers; n, nerve cord. Haematoxylin (A, E, G, I) and DAPI (B, F, H, J) were used for nuclear counter staining. Scale bars: 50 lm (B and E), 100 lm (A, F, G, H, I), 200 lm (J).
B. Opper et al. / Developmental and Comparative Immunology 39 (2013) 214–218
et al., 2004). Regarding to their role in immune mechanisms, freefloating chloragocytes are not phagocytic as other coelomocyte subgroups (Engelmann et al., 2005) but they are potential source of antimicrobial molecules (Cooper et al., 2002). Initial research data claim that lysenin is mainly produced by sessile chloragocytes located in the typhlosolis (so called central chloragocytes) revealed by in situ hybridization and immunohistochemistry (Ohta et al., 2000; Sekizawa et al., 1996b). In addition, fetidin (considered yet as a separate antimicrobial molecule) is also mentioned to be produced by coelomocytes; however it is not specified exactly which cell group is the source of this protein (Valembois et al., 1986; Lassegues et al., 1997). Our immunohistochemical and immunofluorescence staining of earthworm tissues evidently marked free-flotating chloragocytes for lysenin expression (Fig. 1E–H and Fig. S3). Lysenin (EFCC5) positive cells appeared in the group of coelomocytes of coelomic cavity (Fig. 1E and H) or solitary coelomocytes bound to nerve cord or muscle layers (Fig. 1F and G). Anti-lysenin pAb marked mainly the free-floating coelomocytes as well (Fig. S3A–D). Applied negative controls of immunohistochemical staining confirmed the observation of lysenin negative sessile chloragocytes (Fig. 1I and J). Sessile chloragocytes forming the chloragogenous tissue were negative for a-EFCC5 staining. This staining pattern was regardless to the applied polyclonal anti-lysenin or a-EFCC5 mAb. Indeed, we cannot rule out the possibility that central chloragocyte population express lysenin only at mRNA level and then free-floating matured chloragocytes are the protein-secreting ‘‘effector’’ cells, however Ohta et al. (2000) demonstrated that central chloragocytes express lysenin at protein levels by immunohistochemistry using polyclonal lysenin antiserum. Another explanation for these discrepancies could be considered by any seasonal or maturational fluctuation of lysenin expression. However till now no information is available about any switch in lysenin production during seasonal changes or maturation in the earthworms.
217
to measure the released lysenin content from the supernatant of exposed coelomocytes. Lysenin expression of coelomocytes was significantly elevated after 6 h of S. aureus challenge compared with E. coli treatment (p = 0.0043). We observed non-significant elevation compared with untreated coelomocyte samples (p = 0.058). Moreover, E. coli treated samples had a significantly decreased lysenin expression (p = 0.042) compared with unchallenged coelomocytes (Fig. 2A). In addition, secreted lysenin showed a similar pattern that we noticed in the coelomocyte lysates (Fig. 2B). In the supernatant of S. aureus exposed coelomocytes we measured elevated lysenin concentration compared with unchallenged samples or E. coli treated coelomocytes (p = 0.018, p = 0.012; respectively). We have not observed significant decrease of lysenin expression in E. coli challenged samples compared with control coelomocytes (p = 0.55). Reduction of lysenin expression following E. coli treatment is in agreement with previous observations (Wang et al., 2010). Indeed, our in vitro approach is not comparable with the previously mentioned experiments where whole earthworms were exposed to various bacteria strains (Köhlerová et al., 2004; Wang et al., 2010). However, in these experiments also different approaches were used for bacteria administration (injection of worms and bacteria-spiked soil) that may explain the differences in the experimental read-outs. In our case we chose a not physiological but experimentally well controlled in vitro setup where we determined exactly the coelomocytes–bacteria ratio. In summary, we revised lysenin expression in earthworm coelomocytes and whole tissues, confirming that it is produced rather by free-floating chloragocytes of the coelomic cavity, and not by the sessile central chloragogenous tissue. For the functional point of view, we found that lysenin expression is increased by in vitro
3.3. Gram positive bacteria enhance lysenin production Another debated question is whether lysenin expression is altered by any microbial challenge. Initially, fetidin was considered as an inducible factor upon in vivo bacterial exposure (Lassegues et al., 1989). In contrast to the previous observations, in vivo treatment with E. coli and Bacillus subtilis bacteria strains did not modulate noticeable fluctuation of fetidin mRNA expression in the coelomocytes, however coelomic protein levels were significantly elevated (Köhlerová et al., 2004). In addition, a recent proteomic and transcriptomic approach showed that lysenin expression was decreased after E. coli O157:H7 bacteria strain challenge (Wang et al., 2010). Fluctuation of lysenin expression in general was noted when earthworms were removed from breeding soil and placed into experimental (OECD) soils (Brulle et al., 2011). After the cytochemical and histological localization of lysenin, we aimed to observe the lysenin expression of coelomocytes after bacterial challenge. First, we analyzed that if our anti-EFCC5 mAb recognizes lysenin from coelomocyte lysate and its size is identical with the protein used for immunization. Indeed, anti-EFCC5 mAb recognizes one discrete single band in coelomocyte lysates and its molecular size was identical to the lysenin protein detected parallel by Western blot. In addition, the anti-lysenin pAb recognized a protein band in the lysates similarly to the size of lysenin protein, however applying this antibody we observed much stronger background compared to the reaction of a-EFCC5 mAb (Fig. S3E). Next, coelomocytes were exposed in vitro to heat-inactivated E. coli and S. aureus bacteria strains for 6 h along with untreated controls. Lysenin expression was determined by Western blot from the coelomocyte lysate. Furthermore, sandwich ELISA was applied
Fig. 2. Lysenin expression is modulated by bacterial challenge. Lysenin expression of coelomocytes was measured after in vitro E. coli and S. aureus challenge (A and B). Western blot analysis of coelomocyte lysates (A) revealed that S. aureus treatment increased lysenin expression (⁄⁄p < 0.01, n = 4), while E. coli treatment inhibited lysenin expression (⁄p < 0.05, n = 4). Lysenin protein expression was normalized to a-a-tubulin. Moreover, secretion of lysenin was also observed by sandwich ELISA (B) from the supernatant of exposed coelomocytes. S. aureus treatment of coelomocytes induced significant lysenin secretion (⁄p < 0.05, n = 4). Figure abbreviations: A.U., arbitrary units.
218
B. Opper et al. / Developmental and Comparative Immunology 39 (2013) 214–218
Gram-positive bacteria challenge which is in contrast with previous findings based on in vivo and mRNA studies, so it needs further investigations concentrating on the lysenin expression at protein level. Acknowledgements We gratefully acknowledge the financial support of Medical Faculty Research Foundation, University of Pécs (PTE-ÁOK-KA 34039/10-06). We thank to Mária Pápa, Márta Szelier for their great assistance and to Mariann Szabó for careful reading the manuscript and helping to improve it with useful advices. Earthworm species identification was performed with the aid of Kinga Futó and József Orbán (Dept. of Biophysics, University of Pécs). We also greatly appreciate the help of Ildikó Somogyi, Dóra Gunszt and László Molnár (Faculty of Sciences, University of Pécs) for maintaining and providing the experimental earthworm specimens. Appendix A. Supplementary data Supplementary data associated with this article can be found, in the online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.dci.2012.11.006. References Bilej, M., De Baetselier, P., Beschin, A., 2000. Antimicrobial defense of the earthworm. Folia Microbiol. 45, 283–300. Bruhn, H., Winkelmann, J., Andersen, C., Andrä, J., Leippe, M., 2006. Dissection of the mechanisms of cytolytic and antibacterial activity of lysenin, a defense protein of the annelid Eisenia fetida. Dev. Comp. Immunol. 30, 597–606. Brulle, F., Lemiére, S., Waterlot, C., Douay, F., Vandenbulcke, F., 2011. Gene expression analysis of 4 biomarker candidates in Eisenia fetida exposed to an environmental metallic trace elements gradient: a microcosm study. Sci. Total Environ. 409, 5470–5482. Cooper, E.L., Kauschke, E., Cossarizza, A., 2002. Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff. Bioessays 24, 319–333. Cooper, E.L., Roch, P., 2003. Earthworm immunity: a model of immune competence. Pedobiologia 47, 676–688. Engelmann, P., Palinkas, L., Cooper, E.L., Németh, P., 2005. Monoclonal antibodies identify four distinct annelid leukocyte markers. Dev. Comp. Immunol. 29, 599– 614. Engelmann, P., Cooper, E.L., Opper, B., Németh, P., 2011. Earthworm innate immune system. In: Karaca, A. (Ed.), Biology of Earthworms. Springer Verlag, Heidelberg, pp. 229–245.
Fischer, E., 1993. The myelo-erytroid nature of the chloragogenous like tissues of the annelids: a review. Exp. Gerontol. 12, 69–74. Fuller-Espie, S., Nacarelli, T., Blake, E.L., Bearoff, F.M., 2010. The effect of oxidative stress and apoptosis in the earthworm Eisenia hortensis. Invertebr. Surviv. J. 7, 89–106. Jamieson, B.G.M., 1981. Chloragocytes. In: Jamieson, B.G.M. (Ed.), The Ultrastructure of the Oligochaeta. Academic Press, New York, pp. 96–118. Kauschke, E., Mohrig, W., Cooper, E.L., 2007. Coelomic fluid proteins as basic components of innate immunity in earthworms. Eur. J. Soil Biol. 43, S110–S115. Kobayashi, H., Ohta, N., Umeda, M., 2004. Biology of lysenin, a protein in the coelomic fluid of the earthworm Eisenia foetida. Int. Rev. Cytol. 236, 45–99. Köhlerová, P., Beschin, A., Šilerová, M., De Baetselier, P., Bilej, M., 2004. Effect of experimental microbial challenge on the expression of defense molecules in Eisenia foetida earthworms. Dev. Comp. Immunol. 28, 701–711. Lassegues, M., Milochau, A., Doignon, F., Du Pasquier, L., Valembois, P., 1997. Sequence and expression of an Eisenia fetida derived cDNA clone that encodes the 40 kDa fetidin antibacterial protein. Eur. J. Biochem. 246, 756–762. Lassegues, M., Roch, P., Valembois, P., 1989. Antibacterial activity of Eisenia fetida andrei coelomic fluid: specificity of the induced activity. J. Invertebr. Pathol. 54, 28–31. Morgan, A.J., Stürzenbaum, S.R., Winters, C., Grime, G.W., Aziz, N.A., Kille, P., 2004. Differential metallothionein expression in earthworm (Lumbricus rubellus) tissues. Ecotoxicol. Environ. Saf. 57, 11–19. Ohta, N., Shioda, S., Sekizawa, Y., Nakai, Y., Kobayashi, H., 2000. Sites of the expression of mRNA for lysenin a protein isolated from the coelomic fluid of the earthworm Eisenia foetida. Cell Tissue Res. 302, 263–270. Plytycz, B., Homa, J., Koziol, B., Rózanowska, M., Morgan, A.J., 2006. Riboflavin content in autofluorescent earthworm coelomocytes is species-specific. Folia Histochem. Cytobiol. 44, 275–280. Sekizawa, Y., Hagiwara, K., Nakajima, T., Kobayashi, H., 1996a. A novel protein, lysenin that causes contraction of the isolated rat aorta: its purification from the coelomic fluid of the earthworm Eisenia foetida. Biomed. Res. 17, 197–203. Sekizawa, Y., Ohta, N., Natori, S., Kobayashi, H., 1996b. Immunocytochemical localization of lysenin a novel protein isolated from the coelomic fluid of earthworm Eisenia foetida. Biomed. Res. 17, 327–330. Sekizawa, Y., Kubo, T., Kobayashi, H., Nakajima, T., Natori, S., 1997. Molecular cloning of lysenin, a novel protein in the earthworm Eisenia foetida that causes contraction of rat vascular smooth muscle. Gene 191, 97–102. Shogomori, H., Kobayashi, T., 2008. Lysenin: a sphingomyelin specific pore-forming protein. Biochim. Biophys. Acta 1780, 612–618. Valembois, P., Roch, P., Lasségues, M., 1986. Antibacterial molecules in annelids. In: Bréhelin, M. (Ed.), Immunity in Invertebrates. Springer-Verlag, Heidelberg, pp. 74–93. Vernile, P., Fornelli, F., Bari, G., Spagnuolo, M., Minervini, F., de Lillo, E., Ruggiero, P., 2007. Bioavailability and toxicity of pentachlorophenol in contaminated soil evaluated on coelomocytes of Eisenia andrei (Annelida: Lumbricidae). Toxicol. In Vitro 21, 302–327. Wang, X., Chang, L., Sun, Z., Zhang, Y., 2010. Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins in the earthworm Eisenia fetida during Escherichia coli O157:H7 stress. J. Proteome Res. 9, 6547–6560.
SUPPLEMENTARY MATERIALS
Revising lysenin expression of earthworm coelomocytes
Balázs Opper1,2, András Bognár1, Diána Heidt1, Péter Németh1, Péter Engelmann1,* 1
Department of Immunology and Biotechnology, Clinical Center, University of Pécs, Szigeti u. 12, H-7643
Pécs, Hungary 2
Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Pécs, Szigeti u. 12, H-7643 Pécs, Hungary
* Corresponding author: Department of Immunology and Biotechnology, Clinical Center, University of Pécs, Pécs, H-7643, Szigeti u. 12, Hungary. Tel: + 36-72-536-288, Fax: + 36-72-536-289, email:
[email protected]
MATERIALS AND METHODS Immunocytochemisty and immunofluorescence of coelomocytes
Coelomocytes (80 μl of 5x105/ml) were spread onto slides using Cytospin 3 (SHANDON, ThermoScientific, Waltham, MA, USA) apparatus. Coelomocyte layers were fixed in ice-cold aceton, endogenous peroxidase activity was blocked by phenyl-hydrazine-hydrochloride (1 mg/ml in PBS). Samples were incubated with 5% BSA for 20 min to avoid non-specific binding then hybridoma supernatants and Protein G Sepharose (GE Healthcare, Munich, Germany) purified IgG fractions (1:100) against lysenin were used to stain coelomocytes during one hour at room temperature both in cytochemical and fluorescence assays. Horseradish peroxidase (HRP) conjugated anti-mouse IgG antibody (1:100, Dakopatts, Glostrup, Denmark) was used as a second reagent. In double immunofluorescence assays mouse IgG fractions of aEFCC5 mAb (1:100) was detected with NL557 conjugated donkey anti-mouse Ig (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) and then FITC conjugated anti-EFCC1-4 mAb (1:100) was used. Alternatively, mouse IgG fractions of a-EFCC1-4 mAbs (1:100) was detected with NL557 conjugated donkey anti-mouse Ig (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) and then FITC conjugated anti-lysenin mAb (1:100, a-EFCC5) was used (Figure S1). Anti-lysenin polyclonal antibody (1:100, raised in rabbit, PeptaNova GmbH) was visualized with NL557 conjugated anti-rabbit Ig (R&D Systems). Control slides were incubated with nonimmune mouse serum, otherwise prepared similarly. For color development we used 3-amino-9-ethyl carbazole (Sigma) in acetate buffer (pH: 5.0). Mayer-haematoxylin (Reanal, Budapest, Hungary) or 4',6diamidino-2-phenylindole (DAPI, Invitrogen Molecular Probes, Eugene, OR, USA) was used for counterstaining. Slides were observed by Olympus BX61 microscope and AnalySIS software (Olympus, Hamburg, Germany).
Immunohistochemistry and immunofluorescence of earthworm tissues Whole earthworms were dissected with scissors and fixed in Zamboni fixative (2% paraformaldehyde, 15% picric acid, 0.1M sodium phosphate buffer, pH:7.3; Zamboni and DeMartino 1967) 2
then embedded in 30% of sucrose and used for cryostat sectioning. Tissue sections were affixed onto 1% gelatin coated slides. Slides were then used for immunohistochemical and immunofluorescence protocols as detailed previously, in intervals of incubations samples were rinsed with PBS/0.1% Triton X-100. Sections for immunofluorescence were incubated for 15 min in 0.05 M NH4Cl in order to reduce the autofluorescence. Slides were observed by Olympus BX61 microscope and AnalySIS software (Olympus).
Indirect and isotype ELISA Microtiter plate (Nunc, Microelisa, Roskilde, Denmark) wells were coated with coelomocyte lysate or lysenin (5 μg/ml) overnight at 4°C. Non-specific binding was blocked with 0.5% gelatin for half an hour at 37 °C. The wells were incubated anti-EFCC5 hybridoma supernatants for one hour at 37 °C. Following three washing steps, the plates were incubated with HRP conjugated anti-mouse IgG (goat) antibody (Dakopatts) for one hour at 37 °C. Anti-EFCC5 mAb was isotyped using indirect ELISA method with mouse monoclonal antibody isotyping reagent (Sigma) used according to the manufacturer’s instructions. Color reaction was developed with ortophenylene diamine (OPD) and stopped with 4 M H2SO4. After each step the plates were washed with PBS containing 0.05% Tween 20 (Sigma). A Dynatech ELISA reader at 490 nm wavelength measured the color reaction.
Flow cytometry and data analysis Isolated coelomocytes were washed in PBS and then 105 cells were fixed in 4% PFA/PBS. During washing steps, one was performed with PBS containing 0.1% NaN3 followed with permeabilizing buffer (PBS containing 0.1% saponine and 0.1% NaN3). FITC conjugated anti-EFCC5 were added to the samples in the same buffer and incubated with the coelomocytes for 30 min at 4 °C. After this incubation samples were washed twice in saponine buffer and once in PBS/BSA/NaN3. Finally samples were fixed in PBS containing 0.5% formaline. A FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) was
3
used in our experiments. Collected flow cytometry data were analyzed with CellQuest (BD Biosciences) and FCS Express softwares (De Novo Software, Los Angeles CA, USA).
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blots Proteins were separated by on 10% polyacrylamide gels, topped by a 4% stacking gel using MiniProtean 3 apparatus (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Separated proteins were blotted onto nitrocellulose membranes (Bio-Rad) in blotting buffer at 4 ºC for 2 hours. Then nitrocellulose sheets were blocked with 1% BSA in TBS-Tween for one hour. Afterwards blots were incubated with anti-EFCC5 mAb (1:1000) or rabbit anti-lysenin pAb (1:1000, PeptaNova) in 1%BSA/TBST for one hour. HRP conjugated anti-mouse or anti-rabbit IgG (Dakopatts) was used in the next step for one hour at room temperature, respectively. ECL reagents (Pierce) were used to visualize the membranes. TBS/0.05% Tween (Sigma) was used to wash the nitrocellulose sheets between the reaction steps. After rinsing in stripping buffer (Pierce) membranes were re-probed with anti- α-tubulin (mouse, Sigma, 1:1000) for loading control antibody. Chemiluminescent signals were detected with Fuji LAS4000 Imaging System (Fuji, Japan).
Sandwich ELISA Microtiter plate (Nunc) wells were coated with polyclonal anti-lysenin antibody (1:1000, PeptaNova) as capture antibody overnight at 4°C. Non-specific binding was blocked with 0.5% gelatin for half an hour at 37 °C. Then various concentrations of lysenin (ranges from 50 μg/ml to 2 μg/ml) were applied for standard curve. In addition the supernatant of control and bacteria challenged coelomocytes were added to the wells for one hour at 37°C. Next, we added a-EFCC5 IgG (1:1000) as detector antibody and followed the standard ELISA protocol (please see above). Samples were applied at least in duplicates.
4
SUPPLEMENTARY TABLES
R1
20.33±12.17%
R2
5.41±2.02%
R3
39.5±10.2%
Table S1. Percentages of a-EFCC5 mAb positive coelomocyte subgroups. The values represent mean ± SD of three independent experiments. More than 104 cells were counted in each separate experiment.
5
SUPPLEMENTARY FIGURES Co-expression of lysenin (EFCC5) and other EFCC markers of earthworm coelomocytes.
Figure S1. Double immunofluorescence analysis revealed co-expression pattern of lysenin (EFCC5) with established EFCC markers. Anti-EFCC1 labels all coelomocyte subtypes along with solitary a-EFCC5 positive cells (arrows, A). A-EFCC2 marks mainly intracellular structures of eleocytes, however it does not overlap with lysenin demonstrated by a-EFCC5 staining (arrow, B). EFCC3 positive hyaline amoebocytes (C) form pseudopodiums (arrowhead) and big aggregates with other coelomocytes including EFCC5 positive cells (arrows). EFCC4 marks solitary coelomocytes (D) rarely found in coelomocyte smears (arrowhead) compared with the more abundant EFCC5 positive cells (arrows). DAPI was used for nuclear counterstaining. Scale bars: 100 μm.
6
Evidence of lysenin (EFCC5) expression in earthworm chloragocytes.
Figure S2. Double immunofluorescence analysis is performed for lysenin (arrow, staining with FITC conjugated a-EFCC5) and EFCC4 (arrowhead) marker (A). Phase contrast image of the same coelomocytes along with DAPI fluorescence (B). Phase contrast image of the same coelomocytes along with FITC fluorescence (B). Note that lysenin positive cell (arrow) contains brownish colored granules (B, C) that are very abundant in chloragocytes. Scale bars: 50 μm.
7
Staining pattern of polyclonal anti-lysenin on earthworm tissues. Western blot analysis of a-EFCC5 mAb and anti-lysenin pAb.
Figure S3. Sessile chloragocytes of the typlosolis (asterisks) were negative for polyclonal anti-lysenin antibody staining. Only chloragocytes (arrows) located in the coelomic fluid (arrows) were positive both in immunohitochemical (A, B) and immunofluorescence (C, D) analysis. Haematoxylin (A, B) and DAPI (C, D) were used for nuclear counterstainings. Scale bars: 200 µm (A, C), 100 µm (B, D). 8
Total proteins were isolated from coelomocytes and Western blots were used for lysenin detection (E) using polyclonal anti-lysenin antibody and anti-EFCC5 mAb antibody.
Indeed, anti-lysenin pAb
provided positive reaction with lysenin protein (Lys) and lysates of coelomocytes (Co); however next to the detected lysenin very high background occurred in coelomocyte lysate. Anti-EFCC5 mAb recognized an approx. 40kDa single protein band from coelomocyte lysate (Co) that is identical with lysenin protein (Lys) in molecular weight. Total proteins of Jurkat cell line (J) were used as a negative control.
REFERENCES Zamboni, I., DeMartino, C., 1967. Buffered picric acid-formaldehyde: a new rapid fixative for electron microscopy. J. Cell Biol. 35, 148.
9
