Kotlan Beatrix. A rosszból is a jót kihozni! A tumorban rejlő immunsejtek hordozta genetikai információ a rákterápiában hasznosítható

Kotlan Beatrix „A rosszból is a jót kihozni!” A tumorban rejlő immunsejtek hordozta genetikai információ a rákterápiában hasznosítható.

Budapest, 2011. Május 10.

www.meetthescientist.hu

1 | 26

„A rosszból is a jót kihozni!” A tumorban rejlő immunsejtek hordozta genetikai információ a rákterápiában hasznosítható.

„A rosszból is a jót kihozni.” Ez a mottó kísér évek óta, hogy az egészségügy nehéz keretei között a betegellátáshoz közvetlen közel dolgozzam biológus kutatóként.

És a másik most is fülembe csengő mondat: „Jöjjön, nézze meg a betegeinket!” www.meetthescientist.hu

2 | 26

Az „ezerarcú immunológia” néhány oldaláról és főbb alapfogalmairól kell először rövid képet adnom. A veleszületett / természetes immunitás főbb vonásai: A törzsfejlődés ősibb un veleszületett immunitása (komplement, macrophagok, Natural Killer sejtek, hízósejtek, citokinek, citokin receptorok stb) gyorsabban alakul ki, nem antigén specifikus, nem rendelkezik memóriával.


3 | 26

A szerzett / adaptív immunválasz főbb elemei és tulajdonságai: Plasma sejt

- Antitestek, limfociták, dendritikus sejtek, - Az antigén specificitás sejt és molekulaszinten jellemző az antitestekre,T sejt receptorokra, és az ezeket hordozó B és T sejtekre, - Az immunválasz erősítése exponenciális.

B sejt

- Immun memoria jelensége van. - Az antigénnel való kölcsönhatás szelektív. - Latencia van. Dendritikus sejt


CD8+ T sejt

4 | 26

A rákos megbetegedések tumorimmunológiai vonatkozásai és az immunrendszer rákos megbetegedéssel szembeni potenciális reakciója. A tumor ellenes sejtes és humorális immunválasz fontos elemei a szolid tumorokban felhalmozódó immunkompetens sejtek. Az tumorba beszűrődő, tumorszövetet infiltráló immunsejtek (TIL, tumor infiltrating lymphocytes) legnagyobb része T sejt, makrofágok, dendritikus sejtek, természetes ölő (NK) sejtek és általában minor mennyiségben humorális immunválasz elemek. A TIL sejtek tumor és gazdaszervezet kapcsolatát jobban tükrözik, mint a perifériás vér és nyirokszervek sejtes komponensei. Ezen effektor sejtek funkciója azonban csökkentett a perifériás vér értékeihez képest. A tumor mikrokörnyezete alapvetően befolyásolja a gazdaszervezet és a tumor közti kapcsolatot.


5 | 26

Az igen ritka az un. „tumorkilökődési folyamat” jelensége. Nagyon összetett immunológiai mechanizmusok időnként a „tumor kilőkődését” eredményezhetik, ami sok átfedést mutat az egyéb, immun rendszer által közvetített szövet specifikus leépítési folyamatokhoz (TSD, „tissue specific destruction”), mint pl: allograft kilökődés, graft versus host jelenség, patogének eliminálása és az autoimmunitás.


6 | 26

Hogyan lehet megtalálni és kimutatni az immunrendszer akár minor mennyiségben rejtőzködő speciális immunsejtjeit a daganatokban? Nodular melanoma

IH: Haematoxilin & Eosine

IC: CD20 + B cells 200X www.meetthescientist.hu

Superficially spread melanoma

IH: Haematoxilin & Eosine

IC: CD20 + B cells 200X 7 | 26

Tumor infiltráló sejtek / TIL: Tumor infiltrating lymphocytes

Medullary breast carcinoma

IC: CD3 + T cells 100X www.meetthescientist.hu

(Haematoxilin & Eosine) 100X

IC: CD1a + DC 100X

IC: CD20 + B cells 100X

IC: CD5 + cells 200X 8 | 26

Szeretnék képet adni azon sejtes immunológiai, molekuláris genetikai és biotechnológiai módszerrepertoárról, amely az „ immunsejtek vallatására alkalmazható” lehetőséget adja, és amelyek révén feltárt genetikai információ az eredmények alapján hasznosítható.


9 | 26

Novel tumor diagnostics a/ Tissue sections, tissue microarray / Immunohistochemistry,

Human organism

Cancerous tissue Immune cells Peripheral blood

Novel immunotherapies & targeted therapeutics

b/ Cultured cancer cells -tumor cell growth -tumor cell death, apoptosis

Cellular processes:

Molecular processes:

EBV transform & cloning IF FACS analysis ELISA

RT PCR technique Antibody phage display DNA sequence analysis Microarray studies

-B cell phenotype -Produced antibody types & repertoire

-Immunoglobulin VH and VL repertoire -tumor antigen recognition -expressed genes in B cell regulation and function

Immunoconjugates/ Antibody engineering

Comparative DNA analysis / Bioinformatics www.meetthescientist.hu

10 | 26


11 | 26

Módszer: TIL-B antitest fág megjelenítéses scFv konstrukció: St 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8…n VH

VL

Amber L Tag gene3 Amp

Phagemid M13

Cytoplasm E. Coli bacteria

Fág megjelenített scFv antitest fragmens: Ref: Kotlan B et al, Disease Markers, 2000 Kotlan B & M C Glassy, RT PCR Protocols, 2010 www.meetthescientist.hu

12 | 26

OD

1/ ScFvk fagmid könyvtár + indukáló segítő fág.

Phage scFv ELISA 2,5 2 1,5

ScFv fag könyvtár

1 0,5 0 1

2 3 4 5 6 7

Positive (1,2, 4,5) and negative (7,8) phage display scFv preps and background Controls (9,10)

kapocsVH 2/ „Mester tálca” rekombináns fág részecskék termelése

3/ Fág tartalmú felülúszok tesztelése tumorsejt membránokon www.meetthescientist.hu

VL g3p

4/A nem kötődött fág részecskék eltávolítása

Szelektált ScFvk fágok

8 9 10

6/ ELISA anti-M13 fág ellenes antitest

5/Tumor antigén kötő fág részecskék kinyerése, E.Coli bacteriumok transzformációja. 13 | 26

DNS szekvenciaelemzés alapja


14 | 26

Results: „ The proof of principle” VH1

Distribution of cloned sequences

VH3 V3/ 1

10 VH3/1

8

9

121

1

VH4 VH5

1

V1

5 6

Cut pie chart diagram : Ig VH sequences distributed to families and clusters

4

V2 V3 VH5

6

11 3

3 111 1 2 3

10

3 8

V1/1

V4 V1 V2 V3

Tumor binder ScFvk clones selected by Ab phage ELISA

Ref: Kotlan B et al J. Immunol 2005 www.meetthescientist.hu

15 | 26

GD3 GANGLIOSIDOK – kulcsfontosságú tumorasszociált antigének Az aberráns glikoziláció – és a malignus folyamatok kapcsolata

Fontos szerep: a tumorprogresszió fő pathofiziológiás folyamataiban tumor invazióban és metastazisban apoptozis, motilitás angiogenesis, adhezio EGFR tyrosine kinase aktivitas, epithel sejtek

Hakomori S. PNAS 2002 www.meetthescientist.hu

16 | 26

SK Mel 28 sejttenyesztő

kamra: G2 scFv GD3/ poz.

Immunofluorescencia–confocalis laser microscop Criostatos metszet / melanoma szövet / GD3 ab pozitivitás

Criostatos metszet /melanoma M3407 G2 scFv GD3/ poz.

Cytospin Inv. ductal emlő carc.TU2/ Citocentrifuga: G2 scFv GD3/ pozitivitás

Immunhisztokémia


Mel 3357 GD3 Ab 200x

17 | 26 Mel 3357 neg control 200x

MTT proliferation - HT199 melanoma OD x 10 -3 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 S2

1

2

3

4

Anti GD3 Ab treatment www.meetthescientist.hu

S1 5

6 18 | 26

KONKLÚZIÓ:

Az ektodermális eredetű tumorokban levő B sejtekből kinyert immunglobulin variabilis genregiók kulcsfontosságú tumorasszociált struktúrákat ismernek fel. A kimutatott egyedi GD3 gangliozid membrán antigének igen fontos szerepet játszanak a tumor növekedési és áttétképzódési folyamataiban. Ezen tulajdonságok alapján az egyedi gangliozid struktúrákkal specifikusan reagáló ellenanyag fragmensek jó alapjai lehetnek új korai tumor diagnosztikus és célzott terápiás gyógyszerfejlesztéseknek.

Irányvonalak amelyek révén a kinyert genetikai információ a rák korai diagnosztizálását segíti és egy új, hatékony célzott rákterápiás szer kifejlesztéséhez alapot ad. www.meetthescientist.hu

19 | 26

REDEFINING CANCER THERAPY


20 | 26

A CITIM / Budapest 2011. konferencián tárgyalt főbb rák immunterápiás lehetőségek: - Tumor vaccinák megelőzésre és terápiára - Antitest alapú immunterápia - Adoptive sejtes immunterápiák és génterápiák rákban. - Kombinációs rák terápiás lehetőségek - Új targetek az új immunterápiás lehetőségekhez - Új biomarkerek az immmunterápiára adott válasz előrejelzéséhez

Egyéb kapcsolódó témák: - A rák és a gyulladási folyamatok. - Immunregulációs sejtek és citokinek működése. - Immuntolerancia és immune „escape” / menekülés mechanizmusa. - A tumor mikrokörnyezete. - Rák immunmarkerek immundiagnosztikában és immun monitorizálásban www.meetthescientist.hu

http://www.cancerITIM.org

21 | 26

ACKNOWLEDGEMENTS: * Harry J Lloyd Charitable Trust, * Fulbright Grant No 1206103, * OTKA T048933 * Rajko Medenica Research Foundation, * NATO CLG LST 978639 * Eötvös XLI/34/2000, * OTKA T030380, * French Government’s Scholarships * INSERM , * IARC

Prof Dr Mark C Glassy, PhD IMSA Foundation, San Diego Prof Dr Mepur H Ravindranath, PhD Terrasaki Laboratory, Los Angeles Prof Dr Francesco M Marincola, DSci, MD IDIS/ DTM CC/CHI, NIH, Bethesda MD Prof Dr Rainer Fischer, PhD RWTH, Aachen University Prof Dr Jean-Luc Teillaud, PhD, DSci Prof Dr Wolf H Fridman, PhD, MD INSERM U255, UPMC, Paris

Prof Dr Jozsef Timar, DSci, MD Semmelweis University Prof Dr Miklos Kasler, DSci, MD Prof Dr Jozsef Toth, DSci, MD, Prof Dr Zoltan Szentirmay, PhD, MD Dr Gabriella Liszkay, PhD Dr Andrea Ladanyi, PhD National Institute of Oncology, Budapest Prof Dr Gyozo Petranyi DSci, MD Special thanks to my sister: National Blood Transfusion Service, Sylvia Kotlan www.meetthescientist.hu

22 | 26

Köszönöm!


23 | 26

Kotlan Beatrix. A rosszból is a jót kihozni! A tumorban rejlő immunsejtek hordozta genetikai információ a rákterápiában hasznosítható

Recommend Documents