A HAEMOCHROMATOSIS ÉS A HAEMOPHILIA A MOLEKULÁRIS GENETIKAI DIAGNOSZTIKÁJA
Ph.D. értekezés
dr. Andrikovics Hajnalka
Témavezetők: Dr. Tordai Attila és dr. Sarkadi Balázs Országos Gyógyintézeti Központ, Haematológiai és Immunológiai Intézet, Budapest, 2003 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Szigorlati bizottság: Dr. Fekete György, Dr. Sasvári Mária és Dr. Béres Judit Hivatalos bírálók: Dr. Marcsek Zoltán, Dr. Somogyi Anikó és Dr. Vásáhelyi Barna
TARTALOMJEGYZÉK
1. Bevezetés _________________________________________________________3 1.1. A molekuláris genetikai vizsgálatok alkalmazása az öröklődő betegségek diagnosztikájában _ 3 1.2. Öröklődő haemochromatosis - irodalmi háttér______________________________________ 6 1.3. Haemophilia A - irodalmi háttér _______________________________________________ 18
2. Célkitűzések______________________________________________________34 2.1. Öröklődő haemochromatosis __________________________________________________ 34 2.2. Haemophilia A _____________________________________________________________ 34
3. Módszerek _______________________________________________________36 3.1. Vizsgált egyének ___________________________________________________________ 36 3.2. DNS izolálás ______________________________________________________________ 37 3.3. PCR technikán alapuló molekuláris genetikai módszerek ____________________________ 38 3.4. Southern blot analízis________________________________________________________ 43 3.5. A vasanyagcsere klinikai paramétereinek mérése __________________________________ 44 3.6. Statisztikai feldolgozás ______________________________________________________ 44
4. Eredmények és megbeszélés _________________________________________46 4.1. Az öröklődő haemochromatosis molekuláris genetikai vizsgálata _____________________ 46 4.2. A haemophilia A molekuláris genetikai vizsgálata _________________________________ 63
5. Következtetések ___________________________________________________87 5.1. Öröklődő haemochromatosis __________________________________________________ 87 5.2. Haemophilia A _____________________________________________________________ 88
6. Összefoglalás _____________________________________________________89 7. Angol nyelvű összefoglalás __________________________________________90 8. Köszönetnyilvánítás _______________________________________________91 9. Saját közlemények jegyzéke _________________________________________92 10. Irodalomjegyzék _________________________________________________94
2
Bevezetés
1. Bevezetés 1.1. A molekuláris genetikai vizsgálatok alkalmazása az öröklődő betegségek diagnosztikájában A molekuláris genetika az orvostudomány, ezen belül a laboratóriumi diagnosztika egyre gyorsabban fejlődő területe, amely segítséget nyújthat a diagnózis felállításában, annak pontosításában, a genotípus-fenotípus összefüggések vizsgálatában, egyes örökletes rizikófaktorok azonosításában, valamint a súlyos, monogénes öröklésmenetű betegségek esetében a prenatális és a hordozó (carrier) diagnosztikában. Jelenleg több mint 10 000 olyan betegséget (vagy tulajdonságot) ismerünk, amelyek monogénesen, azaz a Mendel-i szabályok szerint öröklődnek (1). Az említett csoportból eddig azonban csak mintegy 1000 kórkép génjét azonosították. A betegség-gén azonosítása során a 3 gigabázisnyi humán genom mintegy harminc-harmincötezer génje közül kell azt az egyet megtalálni, amelynek hibája (eltérése) a kérdéses öröklődő betegség oka (2, 3). A monogénesen öröklődő betegségek génjeinek azonosítása két különböző módszerrel, a funkcionális illetve a pozicionális klónozással valósítható meg. A funkcionális klónozás akkor alkalmazható, ha a betegség tünetei utalnak a betegség kialakulásáért felelős, hibás fehérje élettani funkciójára és ez alapján a fehérje azonosítható. A fehérje aminosav sorrendjének ismeretében meghatározható a gén nukleotid sorrendje és helye megkereshető a megfelelő kromoszómán. A funkcionális klónozásnak köszönhető például a haemophilia A-ért felelős VIII. véralvadási faktor génjének az azonosítása. A pozicionális klónozás elve a funkcionális klónozás gondolat menetének az ellentéte: először a betegség génjének a kromoszómális elhelyezkedését azonosítják. Ha sikerült a gént 1-2 megabázisnyi szakaszon belülre lokalizálni, a következő feladat valamennyi, ezen a területen elhelyezkedő gén azonosítása. Az a gén a keresett betegség génje, amelyről sikerül kimutatni, hogy az egészségesekben és a betegekben különböző formában fordul elő, tehát a betegség megjelenése és az adott gén mutációi között egyértelmű ok-okozati összefüggés áll fenn. A gén nukleotid sorrendjének meghatározása után következik a kódolt fehérje funkciójának megismerése. Pozicionális klónozással
azonosították
az
öröklődő
3
haemochromatosis
génjét,
amelynek
Bevezetés
kromoszómális elhelyezkedésének azonosításában a HLA antigénekkel való kapcsolt öröklődésének a felismerése nyújtott segítséget. Egy adott gén nukleotid sorrendjének és mutációinak ismerete a molekuláris genetikai diagnosztika alap feltétele. A genetikai vizsgálatok segítséget nyújthatnak a diagnózis felállításában olyan esetekben, ahol a klinikai tünetek és az egyéb laborvizsgálatok nem utalnak egyértelműen az adott örökletes betegségre (pl. szerzett formák elkülönítése). Külön kiemelhető a preszimptomatikus, azaz még a klinikai tünetek előtt végzett diagnosztika is. A DNS-diagnosztika célja az is lehet, hogy a mutáció és a betegség lefolyása között összefüggéseket keressen. Egyes esetekben különböző mutációk azonosítása lehetőséget adnak arra, hogy optimális terápiát ill. életmódot lehessen kialakítani. Ez főként a kevésbé súlyos, (azonban legtöbbször gyakori) kórképek diagnosztikájában és megelőzésében játszik szerepet. Példaként említhető az V. véralvadási faktor Leiden mutációja (c.1691G>A; p.506R>Q), amelynek heterozigóta gyakorisága a kaukázusi populációkban mintegy 1-15%. Heterozigóta
formában
három-nyolcszorosára,
homozigóta
formában
ötven-
százszorosára növeli a mélyvénás trombózis kockázatát (4). Mutáció hordozóknál a trombózisra hajlamosító kockázati tényezők (így pl. orális fogamzásgátló tabletta, tartós immobilizáció) kerülése javasolt. Hasonló példa lehet a metilén-tetrahidrofolát-reduktáz termolabilis variánsa (c.677C>T; p.222A>V). Homozigóta formája (a populáció mintegy 15%-a) hiper-homociszteinémiára, így arterioszklerózisra, terhesség esetén a magzatnál velőcső záródási rendellenességekre hajlamosíthat (5, 6). A hiperhomociszteinémia kialakulása fólsav bevitellel megelőzhető. A súlyosabb, csak igen nehezen vagy egyáltalán nem kezelhető öröklődő betegségek (pl. cisztikus fibrózis, Duchenne–féle izomdisztrófia) esetében az érintett családok gyakran igénylik a prenatális, tehát a magzati korban elvégezhető diagnosztikát. A magzat genetikai státusának pontos meghatározása a modern genetikai tanácsadás alapja. Rendkívül fontos a mutációt hordozó, de egészséges családtagok azonosítása is (hordozó [carrier] diagnosztika). A súlyos, örökletes betegségek oki terápiájának, a génterápiának a betegség-gén és mutációinak ismerete szintén alap feltétele. Dolgozatomban a molekuláris genetikai diagnosztika fent említett, kétféle szerepét az öröklődő haemochromatosis és a haemophilia A példáján mutatom be. Mindkét betegségnél (bár eltérő módon) a molekuláris genetikai vizsgálat bevezetése, és
4
Bevezetés
elérhetősége a rutin laboratóriumi vizsgálatok között jelentős előrelépést jelentett a kórkép diagnosztikájában. Az öröklődő vagy herediter haemochromatosis (HH) a vasanyagcsere betegsége, amelyben a fokozott vasfelszívódás szabályozható kiválasztó mechanizmus hiányában a felszívódott vasfelesleg tárolásához vezet. A lerakódott vas a szervekben parenchymás szövetkárosodást okoz. A leggyakoribb szervi manifesztáció a májcirrhosis, szintén jellemző lehet a diabetes mellitus, a bronzszínű bőrpigmentáció, a cardiomyopathia, illetve az izületi panaszok. Az újabb genetikai kutatások révén vált ismertté, hogy a betegség hátterében az esetek jelentős részében a HFE gén p.282C>Y (C282Y) pontmutáció homozigóta formája áll a kaukázusi népcsoportokban. A HFE gén C282Y mutációja által okozott, autoszomális recesszív módon öröklődő haemochromatosis Nyugat-Európában mintegy minden 400-dik, Magyarországon saját vizsgálataink szerint minden 700-dik embert (főként férfit) érinti. Mindezek alapján a haemochromatosis egyike a kaukázusi populáció leggyakoribb örökletes betegségeinek. A tünetek gyakran lappangva alakulnak ki és a betegség korai szakában sem a klinikai kép, sem a laboratóriumi eltérések nem specifikusak. Egyes esetekben az örökletes és a szerzett formák elkülönítése is nehézséget jelenthet. Mindkét esetben segítséget nyújthat a diagnózis kialakításában a molekuláris genetikai vizsgálat. A korai preszimptomatikus (a tünetek megjelenése előtti) diagnosztika az egyszerű preventív terápia lehetősége miatt is kiemelt fontosságú. A haemophilia A (HA) X kromoszómához kötötten, recesszív módon öröklődő vérzékenység, amely minden 5000-10000-dik fiúgyermeket érint. Magyarországon mintegy 900 HA-beteget tartanak nyilván. A kórképet a VIII. véralvadási faktor csökkent illetve hiányzó aktivitása okozza. Az elhúzódó vérzések, az izületek és az izmok bevérzésének súlyossága a beteg maradék VIII. faktor aktivitásától függ és különböző mértékben, esetenként jelentősen csökkenti az élettartamot és rontja az életminőséget. A betegség diagnózisa az érintett betegeknél fenotípusos vizsgálatokkal biztonsággal felállítható. A tünetmentes hordozók azonosítása és a hordozók fiúmagzatainál a betegség kimutatása (prenatális vizsgálattal) fenotípus vizsgálatokkal nehézségekbe ütközik, míg molekuláris genetikai vizsgálatokkal könnyen megoldható.
5
Bevezetés
1.2. Öröklődő haemochromatosis - irodalmi háttér 1.2.1. Az öröklődő haemochromatosis patogenezise A kórkép lényege, hogy egy genetikai eltérés következtében fokozódik az intesztinális vasfelszívódás és ez szabályozható kiválasztó mechanizmus hiányában nagy mennyiségű vas lerakódásához, valamint következményes szövetkárosodáshoz vezet. A vas fehérjékhez kötése nemcsak a metabolikus, a tárolási és a szállítási funkciók szempontjából fontos, hanem a sejtalkotók védelmét is szolgálja a szabad vas toxikus hatásaival szemben (összefoglalásként lásd 7). A vas nagy redoxpotenciálja lehetővé teszi, hogy oldatban szabad oxigén gyököket képezzen. Ezek toxikus hatásúak a biológiai struktúrákra, különösen a membránszerkezetek foszfolipidjeire. A vas toxikus hatása következtében kialakuló lizoszómális membrán fragilitás sejtkárosító enzim kiszabadulást okoz, a mitochondriális membránkárosodás a sejt energia egyensúlyának megbomlását, az endoplazmatikus retikulum sérülése pedig a sejt metabolikus zavarát eredményezi. Mindezek a folyamatok sejtdegenerációhoz, sejthalálhoz és következményes fibrogenezishez vezetnek. A vas a kollagén szintézis legfontosabb enzimjeinek, a prolin- és szerin-hidroxilázoknak a kofaktora, így direkt kollagén szintézist fokozó hatását is megfigyelték. A szabad vas egyrészt közvetlenül, másrészt közvetett módon a szabad oxigéngyökökön keresztül, károsítja a DNS állományt. A szervezet a vasegyensúlyt döntően a vasfelszívódás változtatásával biztosítja. Normális vastelítettség esetén a napi 10 mg vasbevitelnek mintegy 10%-a szívódik fel. Ez az arány akár 30%-ra is emelkedhet vashiányos állapotokban, illetve jelentősen csökken vastúltelítettségben. A felszívódással ellentétben a vaskiválasztás fiziológiásan nem szabályozható. Napi 1 mg vasat veszít egy felnőtt szervezet a gasztrointesztinális, a genitourinális traktusból és a bőrről leváló sejtekkel, amelyhez nőknél további 1 mg vasveszteség társul a menstruáció miatt. Az öröklődő haemochromatosis (HH) egyik jellegzetessége a vastúltelítettség ellenére is megfigyelhető fokozott vasfelszívódás. A betegség korai szakaszában a vasfelszívódás akár napi 3-4 mg-ra is emelkedhet, amely a betegség előrehaladtával csökken. A szervezet normális össz-vastartalma 3-4 g. HH esetében évi 0,5-1 g többlet vas felszívódásával számolhatunk (7).
6
Bevezetés
1.2.2. Az öröklődő haemochromatosis kialakulásáért felelős gének 1.2 2.1. A HFE gén és fehérje A HH-nak megfelelő klasszikus klinikai és patológiai képet, a májcirrhosissal járó bronz-diabetest 1865-ben Trousseau írta le. A kórkép örökletes természetét 1935-ben Sheldon vetette fel, feltételezését azonban többen kétségbe vonták. Csak 1976-ban, a HH és a HLA-A3 antigén gyakori társulásának és kapcsolt öröklődésének felfedezésekor igazolódott biztosan a kórkép genetikai háttere (8), és ezzel a betegség génjét a 6. kromoszóma rövid karjára, a HLA-A antigént kódoló régió közelébe lokalizálták. A pozicionális klónozás alkalmas olyan gének azonosítására, amelyek génterméke, és annak aminosav sorrendje illetve funkciója ismeretlen. A pozicionális klónozás során a gént feltételezhetően tartalmazó régiót olyan kicsire kell leszűkíteni, amely már lehetővé teszi a teljes bázissorrend meghatározását. A primer haemochromatosist okozó mutáció valószínűleg egy D6S265-1, HLA-A3, D6S105-8 és D6S1260-4 haplotípusú kromoszómán keletkezett, mivel e DNS markerek nagy allél-asszociációt mutattak a HH-val. A régió alacsony rekombinációs gyakorisága elősegítette a konzervált haplotípus fennmaradását, viszont megnehezítette a pozicionális klónozást. Csak 20 évvel a HLA-antigénekkel való kapcsoltság felismerése után, 1996-ban sikerült Feder és munkatársainak azonosítaniuk egy új gént (HFE), amelynek az egyik pontmutációja a vizsgált haemochromatosisos betegek 83%-ánál homozigóta formában fordult elő, míg a kontrollok egyike sem volt homozigóta (9). Ez a mutáció (c.845G>A) az újonnan felfedezett gén 282. aminosavánál egy cisztein-tirozin cserét (C282Y) eredményez. A C282Y mutáció mellett egy másik polimorfizmust is találtak ezen a génen (c.187C>G), amely a 63. aminosav hisztidin aszparaginsav cseréjét (H63D) eredményezi. Ez a második polimorfizmus a haemochromatosisban szenvedő C282Y-heterozigóta betegek C282Y mutációt nem hordozó kromoszómáján 89%-ban volt kimutatható, a kontroll kromoszómák 17%-os allél-frekvenciájával szemben. A C282Y-negatív betegeknél nem volt gyakoribb a H63D mutáció a kontroll csoporthoz képest. Feder és mtsai ebből arra következtettek, hogy a két mutáció társulása, azaz kettős vagy „compound” heterozigóta állapot a C282Y és a H63D mutációk szempontjából, növeli a haemochromatosis kialakulásának
az
esélyét;
míg
önmagában
7
a
H63D
mutáció
nem
okoz
Bevezetés
haemochromatosist. Feder és mtsai az azonosított gént a HLA-A-hoz mutatott hasonlósága alapján HLA-H-nak nevezték el, de jelenleg a WHO ajánlása szerint HFE a hivatalos neve (10). Feder és mtsai felfedezését később több munkacsoport vizsgálata is megerősítette. Valamennyi tanulmány a C282Y-homozigótaság gyakori (64-100%-os) előfordulását igazolta a HH-ban szenvedő kaukázusi betegpopulációkban (11, 12, 13, 14, 15). A haemochromatosisos csoportok eltérései valószínűleg a diagnosztikus kritériumok és a populációk különbségeivel magyarázhatók. Azokban a tanulmányokban, ahol a pozitív családi anamnézis feltétele volt a besorolásnak nagyobb százalékban találtak C282Y homozigótákat, mint azokban a tanulmányokban, ahol csak klinikai diagnosztikai kritériumokat (lásd 1.2.3.2. fejezet) vettek figyelembe. Az észak-európai eredetű haemochromatosisos betegeknél nagyobb százalékban találták meg a mutációt, mint a dél-európai országokban. A kaukázusi népeknél a haemochromatosisban szenvedő betegeknél talált magas C282Y allél-frekvenciával szemben (69-100%) a normál populációban a mutáció allélfrekvenciája 1-10% között mozog, amely 2-19%-os heterozigóta és 0,1-1%-os homozigóta aránynak felel meg. A normál populációból kiszűrt, panaszmentes C282Yhomozigóta egyéneknél a vasfelhalmozódás gyakran laborvizsgálatokkal már kimutatható. A korábbi, vasparaméterek (szérum ferritin koncentráció és transzferrin szaturáció) mérésén alapuló szűrővizsgálatok a haemochromatosis előfordulási gyakoriságát, a homozigóta C282Y prevalenciához hasonlóan, szintén 0,05-0,5% közé tették (16). Merryweather-Clarke és mtsai (17) számos etnikai csoportban, összesen 2978 normál egyénnél vizsgálták a C282Y mutáció prevalenciáját. Azokban a populációkban
találtak
magas
mutáns
allél-frekvenciát,
ahol
az
öröklődő
haemochromatosis is gyakori, míg azoknál az etnikai csoportoknál, ahonnan eddig a betegség kisebb előfordulási gyakoriságáról számoltak be a C282Y mutációs ráta is alacsonyabb lett. A legmagasabb előfordulási gyakoriságot az ír kromoszómákon találták. Az afrikai, az ázsiai és az ausztráliai bennszülött kromoszómákon a mutáció gyakorlatilag
nem
fordult
elő.
A
C282Y
mutáció
előfordulása
különböző
népcsoportokban alátámasztotta azt a korábbi feltételezést, hogy a mutáció kelta eredetű népcsoportban keletkezett („founder effect”), és ennek megfelelően az allél-frekvencia nyugatról keletre és északról délre csökkenő tendenciát mutat Európában (1. ábra). A
8
Bevezetés
mutáns gén magas prevalenciájának oka nem ismert. Feltételezhető, hogy a mutáció jelenléte szelektív előny jelentett, mivel az védelmül szolgálhatott a vashiány ellen. 1. ábra: A HFE C282Y allél-frekvencia alakulása Európában.
A HFE H63D mutációjának társulása a C282Y mutációval elősegítheti a haemochromatosis kialakulását (18, 19). A C282Y mutációra nézve nem homozigóta haemochromatosisban szenvedő betegek között kettős C282Y és H63D heterozigóták gyakrabban fordulnak elő, mint a normál populációban. Valószínű, hogy önmagában a kettős heterozigóta állapot nem elég a haemochromatosis kialakulásához, mivel a homozigóták és kettős heterozigóták összesített előfordulása meghaladja az öröklődő haemochromatosis előfordulási arányát, ezen kívül a kettős heterozigóták a normál populáción belül is nagy százalékban fordulnak elő. A C282Y-negatív H63Dheterozigóta és homozigóta egyéneknél is fokozott a haemochromatosis kialakulásának kockázata a normál genotípusú egyénekhez képest, azonban a mutáció penetranciája igen alacsony. A HFE gén aminosav sorrendje alapján az MHC I. osztályba tartozó fehérjékkel mutat rokonságot (2. ábra): egy transzmembrán fehérjét kódol, amelynek három extracelluláris doménje az MHC fehérjék α1, α2 és α3 doménjeivel analóg. A fehérje fontos jellemzője az a négy cisztein aminosav, amelyek az α2 és az α3 domének diszulfid hídjait képezik. Az MHC I-es fehérjék α3 doménjének pontos konfigurációja
9
Bevezetés
nélkülözhetetlen a β2-mikroglobulinnal történő nem-kovalens kapcsolódáshoz és a sejtfelszíni expresszióhoz. 2. ábra: A HFE gén által kódolt fehérje feltételezett szerkezete (9).
Már a HFE gén klónozása előtt is számos indirekt bizonyíték utalt az MHC I-es osztályba tartozó fehérjék vasanyagcserében betöltött szerepére. A β2-mikroglobulinhiányos egerekben nemcsak a membránhoz kötött MHC I-es fehérjék expressziója hiányzik, hanem progresszív, a HH-hoz hasonló szöveti megoszlású vaslerakódás figyelhető meg (20, 21). Santos és mtsai (22) a β2-mikroglobulin-hiányos egereken csontvelő transzplantációt végeztek, így olyan kiméra állatokat hoztak létre, amelyek normál β2-mikroglobulin gént hordoztak a csontvelő eredetű sejtvonalaikban, (a reticuloendothelialis rendszerükben is), míg az összes többi sejtjeik β2-mikroglobulin hiányosak voltak. Ezeknél állatoknál fokozott enterális vasfelszívódást figyeltek meg, viszont a vasat a reticuloendothelialis rendszerhez tartozó, hepatikus makrofágjaik tárolták, nem a májsejtek. Ez arra utalt, hogy β2-mikroglobulin-hiányban (és valószínűleg
HFE
gén
defektusánál
is)
mind
az
enterocitákban,
mind
a
reticuloendothelialis rendszer sejtjeiben kóros a vasanyagcsere szabályozása. A HFEhiányos egértörzs létrehozása (23) bizonyította, hogy ennek a fehérjének a mutációja valóban okoz vasfelhalmozódást. A gén klónozása után elvégzett funkcionális vizsgálatok igazolták, hogy a HFE fehérje β2-mikroglobulint köt, valamint a sejtfelszínen komplexet képez a
10
Bevezetés
vasanyagcsere egyik kulcsfontosságú elemével, a transzferrin receptorral, és csökkenti a receptor transzferrin kötő képességét. A C282Y mutáció az α3 domén egyik cisztein aminosavát érinti, a cisztein hiányában nem jöhet létre diszulfid híd. A mutáns fehérje nem képes a β2-mikroglobulinnal kapcsolódni, transzláció után az endoplazmatikus reticulumban, illetve a Golgi-apparátusban marad és degradálódik, így a sejtfelszínen nem expresszálódik. A H63D mutáció a HFE fehérje α1 doménjét érinti, nem befolyásolja a fehérje sejtfelszíni expresszióját és a transzferrin receptorhoz való kötődését, azonban a vad típusú fehérjével ellentétben, nem csökkenti a receptor ligand kötő képességét (24, 25). A HFE fehérje szabályozó szerepet tölthet be a duodenális transzferrinhez kötött vas felvételben. HFE hiányos egér duodenális transzferrin receptorhoz kötött vasfelvétele csökkent (26). Jelenlegi feltételezések szerint ez a mechanizmus szolgálja a szervezet vasraktárainak érzékelését a duodenumban (27). A szervezet vasraktárainak érzékelése a májban szintén zavart HFE hiányban: az emelkedett vasraktárak ellenére hepcidin expresszió szint csökkenés figyelhető meg, amely szintén fokozott vasfelszívódáshoz vezet (28). Leírtak a H63D mutáció közelében egy másik aminosav cserével járó (missense) mutációt
(S65C),
amelynél
felmerült,
hogy
szintén
rizikófaktor
lehet
a
haemochromatosis kialakulásának szempontjából (29). Ismertek a HFE gén egyéb ritkább mutációi is, amelyek korai stop kodont [E168X, W169X] (30, 31), kóros mRNS érést („splice site” mutációk) [IVS3+1G>T, IVS5+1G>A] (32, 33), vagy aminosav cserét eredményeznek [V53M, V59M, Q127H, V212K, E277K, R330M] (34, 35). A leírt missense mutációk funkcionális vizsgálata a legtöbb esetben nem történt meg, így kapcsolatuk az öröklődő haemochromatosissal nem bizonyított.
1.2.2.2. Egyéb géndefektusok, amelyek haemochromatosis kialakulásához vezetnek A klinikai kritériumok alapján diagnosztizált haemochromatosisban szenvedő betegek 0-26%-a nem hordozza sem a C282Y, sem más HFE mutációt. Az elmúlt években több haemochromatosis gént is azonosítottak, ezért a HFE génnel kapcsoltan öröklődő haemochromatosist (HH) 1-es típusú, a juvenilis haemochromatosist (JH) 2-es típusú, a transzferrin receptor 2 mutációihoz kötődő haemochromatosist 3-as típusú és a
11
Bevezetés
ferroportin 1 génjéhez kötődő haemochromatosist 4-es típusú haemochromatosisnak nevezték el (összefoglalásként lásd 27, 36). A JH autoszomális recesszív módon öröklődő, progresszív vasfelhalmozódással jellemzett ritka kórkép, amely a HH-val ellentétben már fiatal felnőttkorban (<30 év) tüneteket okoz és a nőket és a férfiakat egyaránt érinti. A tünetek hasonlóak, azzal a különbséggel, hogy JH-ban a szív és az endokrin szervek érintettsége gyakrabban fordul elő. A betegség génje nem ismert, pozicionális klónozással az 1. kromoszóma hosszú karjára (1q21) lokalizálták (37). Két JH családban a hepcidin peptidet kódoló HAMP gén (19q13) mutációit azonosították (38). A transzferrin receptor 2 (TFR2) gén mutációi által okozott haemochromatosis autoszomális recesszív módon öröklődik. Mutációit (E60X, M172K, Y250X, AVAQ594-597del, Q690P) izolált non-HFE haemochromatosisos családokban azonosították (39, 40, 41, 42). A ferroportin 1 gén mutációi autoszomális domináns módon öröklődő haemochromatosist okoznak. Nemcsak öröklésmenete, hanem a klinikai képe is eltér a HH-tól. A betegség korai szakaszában főként a reticuloendothelialis rendszer sejtjei érintettek. A laboratóriumi eltérések közül a szérum ferritin emelkedés hamarabb kialakul, mint a transzferrin szaturáció emelkedés. A ferroportin 1 gén mutációi (N144H, A77D, Y64N) közül a V162del mutációt több különböző populációban is leírták (43, 44, 45, 46). A 2-4-es típusú HH-ra vonatkozóan pontos epidemiológiai adatok nem ismertek. Az 1-es típusú HH-val szemben ritkán fordulnak elő és izolált, non-HFE HH-ban szenvedő betegeknél azonosították az említett különböző gének mutációit. Egészséges és emelkedett vasparaméterekkel rendelkező véradók (300 illetve 178 fő) ismert TFR2 mutációkra történő szűrése során mutációt hordozó egyéneket nem azonosítottak (31, 47). Esetleg a ferroportin 1 gén V162del mutációja lehet gyakoribb, mivel több populációban is leírták előfordulását (44, 45).
1.2.3. Az 1-es típusú öröklődő haemochromatosis klinikai képe, diagnózisa és terápiája 1.2.3.1. Klinikai megjelenés A HFE gén mutációi által okozott 1-es típusú haemochromatosis klinikai tünetei (összefoglalásként lásd: 7, 48, 49) leggyakrabban 40-60 éves életkorban jelentkeznek. A tünetek súlyosságát számos endogén és exogén faktor befolyásolja (pl. táplálkozási
12
Bevezetés
szokások, alkoholfogyasztás). Nőknél a menstruáció és a terhesség alatti vasveszteség miatt a haemochromatosis klinikai képe 5-10-szer ritkábban alakul ki. A vastúltelítettség legtöbb tünete nem specifikus. A betegség korai szakaszában a betegek gyakran krónikus fáradtságról, gyengeségről, hasi és izületi fájdalmakról, impotenciáról panaszkodnak (50). A lappangó kezdetet jellemzi, hogy a tünetek megjelenése és a diagnózis felállítása között eltelt idő nőknél átlagosan 5, férfiaknál átlagosan 8 év (51). A klasszikus klinikai triász a bronz-diabetesszel járó májcirrhosis a betegség késői szakaszára jellemző. A máj érintettsége a kórkép egyik legállandóbb jellemzője. Mikroszkóposan a májsejtekben Berlini-kék festéssel nagy mennyiségű vas mutatható ki. A vaslerakódás főként a hepatocitákban mutatkozik és jellemző a reticuloendothelialis rendszerhez tartozó
makrofágok
(Kupffer-sejtek)
relatív
megkíméltsége.
Szekunder
haemochromatosisban a vaslerakódás főleg a Kupffer-sejtekben figyelhető meg. A vaslerakódás fokozódásával először fibrosis, majd cirrhosis alakul ki. Klinikai vizsgálattal hepatomegália a betegek több, mint 90%-ánál észlelhető. A májenzimek közül enyhe aminotranszferáz (AST, ALT) emelkedés gyakran megfigyelhető. A máj érintettség legfőbb komplikációja a hepatocelluláris karcinóma megjelenése, amely fibrosisnál és cirrhosisnál hozzávetőleg az esetek 20-30%-ában alakul ki. A haemochromatosisos betegek 90%-ánál figyelhető meg abnormális bőrpigmentáció. A klasszikus bronzszín ritka, gyakran fémes szürke pigmentáció figyelhető meg főleg a napnak kitett helyeken, a genitálékon és a hegvonalakban. A krónikus vasterhelés a hasnyálmirigy fibrosisához vezethet. A társuló hepatopathia szintén hozzájárul az inzulinrezisztencia kialakulásához. Diabetes mellitus (DM) a haemochromatosisos betegek 65%-ánál, főként a cukorbetegség szempontjából pozitív családi anamnézisűeknél és a cirrhosisban szenvedőknél alakul ki. A diabetes kezelése során nagyobb arányban számolhatunk inzulin rezisztencia megjelenésével. Az exokrin pancreas klinikai érintettsége nem jellemző a kórképre. A vas az izületekben a synoviumot borító epitheliumban rakódik le. Radiológiailag subchondralis csontciszták, izületi porcvesztés izületi rés szűkülettel, diffúz demineralizáció és hipertrófiás csontproliferáció figyelhető meg. Az említett eltérés legtípusosabban a kéz második-harmadik metacarpo-phalangealis izületeinél jelenik meg. Panaszokat okozó arthropathia a betegek 25-50%-ánál alakul ki, és általában 50 év
13
Bevezetés
felett jelentkezik, de a kórlefolyás bármely szakaszában megjelenhet, akár a betegség első tünete lehet vagy a venoszekciós terápia alatt is elkezdődhet. Kardiális diszfunkció a kezdeti diagnóziskor a betegek kb. 15%-ánál mutatható ki. A leggyakoribb kardiális manifesztáció a dilatatív cardiomyopathia és az ingerületvezetési zavarok. Kardiális tünetek fiatal betegeknél gyakrabban fordulnak elő és esetenként a beteg hirtelen halálát okozhatják. A pajzsmirigyben, a mellékpajzsmirigyekben, a hipofízis elülső lebenyében és a mellékvesék zona glomerulosájában kifejezett vaslerakódás figyelhető meg, míg a herékben nincs vaslerakódás. A hypogonadotrop hypogonadismus libidó csökkenéssel, impotenciával, tesztikuláris atrófiával vagy amenorrhoeaval történő megjelenése megelőzheti az egyéb tünetek jelentkezését. Hypothyreosis, hypoparathyreosis vagy hypadrenia ritkán alakul ki.
1.2.3.2. Az öröklődő haemochromatosis diagnózisa A haemochromatosis lehetősége a specifikus tünetek hiánya és a lappangó kezdet miatt minden krónikus parenchymás májbetegség, bőrpigmentáció, diabetes mellitus, cardiomyopathia vagy arrhythmia, arthropathia vagy endokrin diszfunkció diffenciál diagnózisánál fel kell, hogy merüljön, különösen, ha e tünetek társulása figyelhető meg (52). A diagnózis alappillére a szérum vas, illetve ferritin szintek és a transzferrin telítettség (szaturáció) meghatározása (53). A szérum vas szint HH-ban sokáig a normális tartományban marad. A transzferrin szaturáció mérése jobban megfelel szűrővizsgálat céljára, nőknél 50% feletti, férfiaknál 62% feletti érték jellemző a HH-ra. A szérum ferritin koncentráció általában jól jellemzi a szervezet vasraktárainak mennyiségét. Klinikailag manifesztálódott haemochromatosisnál a ferritin szint általában 1000 µg/l felett van, de alacsonyabb értékek lehetségesek a betegség korai szakaszában. Ugyanakkor a ferritin egy akut fázis fehérje és emelkedése nem specifikus a HH-ra. Amennyiben a szérum vas, illetve ferritin szintek vagy a transzferrin szaturáció értékei vastúlterhelésre jellemzők és a vaslerakódáshoz vezető szekunder okok kizárhatók, a diagnózis felállításához májbiopszia szükséges. A szövettani képen 3+, 4+ parenchymás Berlini-kék reakció mutatható ki. Magyarországon nem elterjedt a
14
Bevezetés
Nyugat-Európában diagnosztikus kritériumként alkalmazott májvas koncentráció (HIC) [>4500 µg/g száraztömeg] és a májvas index [HII=HIC (µg/g)/56 x életkor> 2,0] meghatározása (54, 55). A HH-ra jellemző a mobilizálható vasraktárak emelkedett szintje, azaz terápiás kvantitatív vérlebocsátással több, mint 4 g vas (=16 U vér) távolítható el anaemia kialakulása nélkül. A haemochromatosis fenotípusát mutató egyéneknél a C282Y-homozigóta (esetleg C282Y/H63D) genotípus kimutatása megerősíti a diagnózist, esetleg kiválthatja az invazív májbiopsziát (56), ugyanakkor egy negatív eredményt adó genetikai vizsgálat nem zárja ki a HFE gén másfajta mutációinak és egyéb gének mutációinak következtében kialakuló öröklődő haemochromatosist. Szekunder haemochromatosis alatt olyan vastúltelítettségi állapotokat értünk, amelyek más örökletes vagy szerzett betegségek (pl. diszeritropoetikus vagy hemolítikus anaemiák, különböző eredetű májcirrhosisok) vagy túlzott parenterális vasbevitel, transzfúziók következményei (57). Ezeknél a kórképeknél a kialakult vaslerakódás a HH laboratóriumi leleteit utánozza. A molekuláris diagnosztika ezekben az esetekben is új lehetőséget kínál a differenciál diagnózisban.
1.2.3.3. Az öröklődő haemochromatosis terápiája A szervezet vasraktárai hetenkénti 400-500 ml vér terápiás lebocsátásával csökkenthetők, amíg a szérum ferritin szint az alsó normál értékre süllyed. A betegek általában jól tűrik a vérveszteséget. A szérum ferritin szint normalizálódása kialakult haemochromatosis esetén 25 g-s vasterhelést feltételezve 2-3 évig tartó hetenkénti terápiás vérlebocsátással érhető el. Ekkor a vérlebocsátások közötti időtartam 1-3 hónapra emelhető és ez a teljes életen át folytatható. A vas-kelátor kezelés (desferoxamin) általában csak súlyos, pl. kardiálisan dekompenzált, illetve súlyos anaemiában szenvedő betegeknél szükséges. A hepatomegalia a terápiával párhuzamosan csökken vagy megszűnik. A fibrosis és a cirrhosis viszont irreverzibilis. Az inzulin és a venoszekciós terápia bevezetése óta a HH-ban szenvedő betegek haláloka megváltozott. Jelenleg a májrák tehető felelőssé a betegek körülbelül egyharmadának a haláláért. A hepatocellularis karcinóma kialakulásának valószínűségét a vastelítettség mértéke és fennállásának időtartama
15
Bevezetés
befolyásolja. Társuló májkárosító faktorok, pl. alkoholfogyasztás, krónikus hepatitis, növelik a daganat kialakulásának valószínűségét. Ha a diagnózis időpontjában már fibrosis vagy cirrhosis áll fenn, akkor a vasraktárak kiürítése nem akadályozza meg a karcinogenezist. Az ilyen betegeknél ajánlott a rendszeres hasi ultrahang vizsgálat és az α-fetoprotein (AFP) szűrés. A venoszekciós terápia csökkenti a bőrpigmentációt, és a betegek negyven százalékánál az inzulin szükségletet. A krónikus polyarthritist általában nem befolyásolja a kezelés, sőt az gyakran rosszabbodik a terápia mellett is. A kardiális funkció az esetek többségében javul, de annak kezelése így is gyakran nehézségekbe ütközik, mert a haemochromatosisos cardiomyopathia általában rosszul reagál a hagyományos antiarrhytmiás vagy a pozitív inotrop gyógyszerekre. A hypogonadismus általában irreverzibilis. Általánosságban elmondható, hogy a májfibrosis és a diabetes kialakulása előtt megkezdett venoszekciós terápiával a betegek várható élettartama nem különbözik a normál populáció várható élettartamától (58, 59).
1.2.4. A HFE mutációi myelodysplasiás szindrómában A HFE gén azonosítása előtt az átlag populációban nem volt lehetőség a haemochromatosis gén heterozigóta mutációhordozók kimutatására, így a heterozigóták vasparamétereinek
tanulmányozása
korábban
szűkebb
családvizsgálatokra
korlátozódott. A HLA-tipizálással azonosított heterozigóta egyéneknél progresszív vasfelhalmozódás nem volt megfigyelhető, de vasparamétereik magasabbak voltak a mutációt nem hordozó családtagjaikhoz viszonyítva. Többségüknél a szérum ferritin szint és a transzferrin szaturáció értéke a normál tartományban maradt, 10-20 százalékuknál azonban emelkedett vasparamétereket találtak. (60, 61). Hasonlóképpen egy ikertanulmány (62) is emelkedett vasparamétereket talált a HFE C282Y és H63D heterozigóta ikertestvéreknél a normál genotípusú testvérpárokhoz képest. Mindezek alapján felmerült, hogy a HFE viszonylag gyakran előforduló C282Y és H63D heterozigóta
genotípusai
befolyásolhatják
olyan
multifaktoriális
betegségek
kialakulását, illetve progresszióját, amelyekben a vaslerakódás patogenetikai szerepet játszhat. A myelodysplasiás szindróma (MDS) a haematopoetikus őssejtek klonális betegsége,
16
Bevezetés
amelyben kóros, ineffektív erythropoiesis és myelopoiesis figyelhető meg. A betegségre jellemző a leukémiás transzformációra való hajlam. A betegség, attól függően, hogy milyen fokban zavart a vérképzés, különböző klinikai képpel jelentkezhet. Kezdeti panasz gyakran az anaemiával összefüggő gyengeség és fáradékonyság. A trombociták és a fehérvérsejtek funkcionális és számbeli rendellenességének fokától függően vérzés, illetve fertőzéssel összefüggő láz jelentkezhet. A betegség kezelése jelenleg csak szupportív ellátásra irányul. Csontvelő transzplantáció, mint kóroki terápia az idős életkor és a gyakori társuló betegségek miatt általában nem kerül szóba. A sorozatos vérátömlesztések
egyre
növekvő
vérigénnyel
járnak,
amelyet
a
szerológiai
inkompabilitás kialakulásával magyarázhatunk. A transzfúziós haemosiderosist vaskelátor terápiával kezelik. A MDS-ben kialakuló haemosiderosis hátterében az ismételt transzfúziók mellett számos egyéb szerzett tényező is feltételezhető: az ineffektív erythropoiesissel járó anaemiákban gyakran megfigyelhető fokozott vasfelszívódás. A kórkép hátterében a mitokondriális vasanyagcserét, vas transzportot és ATP szintézist érintő, szerzett mitochondriális DNS mutációkat feltételeznek (63). A HFE gyakori mutációi nem játszanak elsődleges szerepet a szerzett klonális betegség kialakulásában, mégis feltételezhető, hogy jelenlétük, akár heterozigóta állapotban is súlyosbíthatja a vaslerakódás mértékét. A vasterhelés circulus vitiosus-ként pl. szabadgyökök generálásával, mutációk előidézésével az érintett MDS-ért felelős sejtklónban tovább ronthatja az alapbetegség progresszióját. Klinikai megfigyelések szerint az orális vaskelátor kezelés bevezetése már a korai szakban csökkenti a transzfúziók gyakoriságát.
17
Bevezetés
1.3. Haemophilia A - irodalmi háttér 1.3.1. A haemophilia A patogenezise A vérzéscsillapításhoz vaszkuláris, trombocita- és plazmafaktorok kombinált aktivitása szükséges. A plazmafaktorok alkotják az ún. véralvadási kaszkádot, amely pontos lezajlásához 12 alvadási faktor fehérje és sok egyéb tényező összehangolt működésére van szükség (összefoglalásként lásd 64). Ezek közül a VIII. alvadási faktor (FVIII) csökkent aktivitása okozza a haemophilia A-t (HA). A klasszikus véralvadási kaszkád két egymástól független úton aktiválódhat (extrinsic és intrinsic), és a FVIII-t az intrinsic oldalon tüntetik fel, a FIX kofaktoraként. Az extrinsic út faktorai (szöveti faktor és FVII) azonban önmagukban nem képesek elegendő protrombint aktiválni a stabil fibrinháló kialakulásához, ehhez a FIX és FVIII megfelelő aktivitása is szükséges (3. ábra). Mindezek alapján állítható, hogy a FIX és a FVIII is központi szerepet töltenek be a véralvadási folyamatban. 3. ábra: A véralvadás folyamata (65).
Az extrinsic út aktiválódásakor az aktivált FVII (FVIIa) a FX mellett kis mennyiségű FIX-t is aktivál. FXa jelenlétében a TFPI (tissue factor pathway inhibitor) gátolja a FXa és a FIXa további keletkezését, így a keletkezett FXa nem elegendő a stabil fibrinháló kialakításához. Az eddig keletkezett trombin azonban aktiválja a FVIII és FIX fehérjéket, így további, már megfelelő mennyiségű FXa keletkezhet. (A római számok a megfelelő alvadási faktorokat, a fekete nyilak az aktiválást, a piros nyilak a gátlást, a zöld nyilak a pozitív visszacsatolásként megjelenő aktiválást szemléltetik.)
18
Bevezetés
1.3.2. A VIII. alvadási faktor génjére és a keletkező fehérjére jellemző sajátosságok Patek
és
Taylor
1935-ben
azonosítottak
egy
plazma
komponenst
(az
antihaemophiliás globulint), amely az X kromoszómához kötötten öröklődő haemophiliás beteg plazmájának alvadási idejét korrigálta. 1952-ben három különböző csoport is leírta, hogy a klinikailag azonos tünetekkel bíró haemophiliás betegek plazmája egymás alvadási idejét korrigálhatja. Mindezek alapján derült fény arra, hogy a haemophilia hátterében több alvadási faktor (FVIII és FIX) defektusa állhat, és elkülönítették a haemophilia A-t és B-t (66). A FVIII fehérje tisztítására irányuló kísérletek az 1950-es években kezdődtek. Utólag egyszerű belátni, hogy a kezdeti munkákat miért nem koronázta siker. A FVIII tisztán nehezen izolálható, mivel a von Willebrand faktorhoz (vWF) kötődik, önmagában alacsony koncentrációban van jelen és instabil. A FVIII fehérje tiszta előállítása először 1979-ben sikerült. Elegendő mennyiségű FVIII izolálása után részleges fehérje szekvencia meghatározással lehetőség nyílt (funkcionális klónozással) a FVIII génjének azonosítására (66, 67). A FVIII gén az X kromoszóma hosszú karjának disztális végéhez közel, 1 megabázisra a telomertől található (Xq28). 186 kilobázisos méretével (26 exon) az egyik leghosszabb emberi gén. A génről 9 kilobázis méretű mRNS készül, amelyről egy 2351 aminosavból álló fehérje szintetizálódik. A FVIII fehérje endoplazmatikus retikulumba kerülésekor az N-terminális 19 aminosav lehasad és az aszparaginok oldalláncaihoz oligoszacharidok kapcsolódnak. A Golgi rendszerben kihasad a B domén egy része, a szerin és a treonin aminosav oldalláncokhoz szénhidrátok kötődnek és a hat tirozin oldallánc szulfatálódik. Alapállapotban a VIII. faktor a plazmában egy 90-200 kDa-os nehéz láncból, és egy 80 kDa-os könnyű láncból áll, amelyet a vWF stabilizál (66). A súlyos HA betegek (a FVIII aktivitás nem éri el a normál aktivitás 1%-át) mintegy 45%-ánál a FVIII gén egy speciális mutációja, a 22. intron inverziója és mintegy 3-5%ánál az 1. intron inverziója áll a betegség hátterében. A súlyos esetek további 50%-ában és a középsúlyos illetve enyhe esetekben nem ismerünk más mutációs predilekciós helyet. Eddig több mint 700 mutációt írtak le, amelyek a 26 exonon elszórtan helyezkednek el (68).
19
Bevezetés
1.3.2.1. A FVIII gén inverziói Higuchi és mtsai 1991-ben genomiális DNS-ről történő exon-amplifikálás és szekvenálás segítségével jellemezték a HA betegek mutációit (69). Meglepő módon az enyhe és a középsúlyos esetekben szinte mindig azonosították a mutációt, míg a súlyos eseteknek csak a felében találtak eltérést a kódoló szekvenciában. Naylor és mtsai reverz transzkripciót követő PCR-rel a súlyos HA betegek mintegy 40%-ánál a FVIII mRNS 22. és 23. exonja között az átíródás megszakadását észlelték (70). Ennek hátterében később Lakich és mtsai (71) és Naylor és mtsai (72) azonosították a FVIII gén 22. intronját érintő inverziót. Az inverzió gyakori előfordulásának oka a FVIII gén 22. intronjának és a gént környező telomerikus régió szerkezetében rejlik. A FVIII gén legnagyobb, 32 kilobázis (kb) hosszúságú 22. intronja tartalmaz egy CpG szigetet, amely kétirányú promoterként szolgál két másik átíródó gén, az F8A és az F8B (FVIII asszociált A és B gének) számára. Az F8B gén a FVIII génnel megegyező orientációjú, első exonja a 22. intronban található, míg további exonjait a FVIII gén 2326. exonjai adják. Az F8A egy rövid, intronmentes gén, amely a FVIII génnel ellentétes irányban íródik át és egy 9,5 kb nagyságú, repetitív szekvencia része (int22h-1 vagy A1). Az int22h-1 a 22. exontól mintegy 5 kb távolságra helyezkedik el. A FVIII gén 22. intronján kívül ez a repetitív szakasz még két példányban a génen kívül is megtalálható, attól mintegy 300 és 400 kb-nyira 5' (telomerikus) irányban (proximális és disztális kópiák: int22h-3 és int22h-2, más néven A3 és A2). A három homológ kópia DNSszekvenciáját összehasonlítva gyakorlatilag teljes (99,9%-os) azonosságot találtak (73). Az
intronikus
és
az
egyik
extragenikus
kópia
között
bekövetkező
intrakromoszómális homológ rekombináció eredményeként egy speciális mutáció (inverzió) jön létre, ami a FVIII gént két részre osztja: egy 1-22. exonokat tartalmazó és egy 23-26. exonokat tartalmazó részre, amelyek ellentétes orientációjúak és mintegy 500 kb távolságban találhatóak egymástól az inverziós kromoszómán. A két telomerikus F8A gén bármelyikével létrejöhet az intrakromoszómális rekombináció, ennek alapján elkülöníthetünk disztális (vagy 1-es típusú) illetve proximális (vagy 2-es típusú) inverziót (4/a ábra). Az esetek kis százalékában az inverzió egy FVIII génen kívül található harmadik extragenikus, vagy csonkolt homológ régióval jön létre (74, 75). Az egyes extragenikus régiók duplikációját az irodalom normál polimorfizmusnak tartja. A szám feletti disztális illetve proximális régióval bekövetkező intrakromoszómális
20
Bevezetés
rekombináció 3A illetve 3B típusú inverziót eredményez (4/b ábra). Az inverzió által érintett X kromoszómáról teljes hosszúságú FVIII mRNS, így FVIII fehérje sem képződhet (76). Férfiaknál az X kromoszóma monoszómiája a gametogenezis során kedvez az intrakromoszómális homológ rekombináció kialakulásának, ezért a 22. intron inverzió szinte mindig (az esetek 98%-ában) a spermatogenezis során alakul ki (77, 78). Egy 1041 bázispár hosszúságú repetitív szekvencia jelenléte az 1. intronban és extragenikusan a géntől telomerikus irányban a 22. intron inverzió keletkezéséhez hasonló mechanizmussal 1. intron inverziót eredményezhet, amelynek gyakorisága a súlyos HA-ban szenvedő betegek között mintegy 3-5% (79, 80, 81). 1.3.2.2. A FVIII gén pontmutációi Az ismert bázis-szubsztitúciók nagy része a missense (aminosav cserével járó) mutációk körébe tartozik. A missense mutációk legtöbbjénél nincs felderítve a struktúra-funkció háttér. Létrehozhatnak vagy kiejthetnek proteolítikus hasítási helyeket, a tirozinokat érintő mutációk gátolhatják a szulfatálódást, illetve túlzott glikozilációt is eredményezhetnek. Számos nonsense, azaz korai stop kodont eredményező, és számos mRNS hasítási helyet („splice-site”-ot) érintő mutáció ismert. Ritkán a bázis-szubsztitúció olyan nonsense mutációt eredményez, amely az érintett exon mRNS szinten történő kivágódásához vezet az olvasási keret elcsúszása nélkül („exon skipping”) (82, 83). A FVIII pontmutációk mintegy 35%-a a CpG dinukleotidoknál keletkezik, amelyek ismert mutációs „hot spot”-ot jelentenek bárhol a genomban. A guanintól 5’ irányban található citozin gyökök az emlős sejtekben metilációs helyek. A metiltranszferáz ezeket a citozinokat 5-metilcitozinná metilálja, amelyek spontán, nem-enzimatikus úton deaminálódhatnak timinné. Ilyen esetben a klasszikus nukleotid csere a CG → TG vagy a CG → CA csere, ha a mutáció az ellentétes (antisense) DNS szálon következik be (66).
21
Bevezetés
4/a ábra: Az 1-es típusú (vagy disztális) és a 2-es típusú (vagy proximális) 22. intron inverzió keletkezési mechanizmusa (66, 74).
4/b ábra: A 3A és a 3B típusú 22. intron inverzió keletkezési mechanizmusa (74).
Jelmagyarázat: FVIII: a VIII. alvadási faktor génje; “1-22” és “23-26” felirattal jelölt fehér téglalap: a FVIII gén exonjai; Kék téglalapok: homológ régiók; A1, A2, A3: intronikus, disztális illetve proximális homológ régiók; Vízszintes csíkozású téglalap: a 22. intron homológ régión kívül eső része; Piros színű P, Q, A, B: hosszú PCR primerek; Vékony nyilak: a FVIII gén átíródásának iránya; Vastag nyilak: a homológ régiókban található F8A gének átíródásának iránya; C: centromer; T: telomer; Kb: kilobázis.
22
Bevezetés
1.3.2.3. A FVIII gén deléciói Eddig több, mint száz nagyméretű (2-210 kb) deléciót ismertettek az irodalomban, amelyek a HA hátterében álló mutációk mintegy 5%-át képviselik. A legtöbb nagyméretű deléciónál nincs pontosan azonosítva a töréspontok helyzete. A FVIII gén deléciós betegek jelentős hányadánál a szubsztitúciós terápia során inhibitor képződés figyelhető meg. Számos rövid deléció is ismert, amelyek leggyakrabban korai stop kodont, így súlyos HA-t okoznak, egyes esetekben leírtak csak 1-1 kodont érintő, enyhe HA-t okozó deléciót is. Érdekes annak az enyhe HA-ban szenvedő betegnek a mutációja, akinél a 14. exonban található „AAAAAAAATAA”-szekvenciában a timin delécióját azonosították. A beteg mutációja az olvasási keret elcsúszásával jár, így súlyos HA-t kellene, hogy eredményezzen. A beteg FVIII mRNS-ének vizsgálata során kiderült, hogy transzkripciónál bekövetkező hibák során számos ép olvasási keretű mRNS is keletkezik. Mivel a 14. exon a B domént kódolja, amely a FVIII fehérje érése során kivágódik, a mutáns, de ép olvasási keretű mRNS-ről aktív FVIII keletkezhet (84). 1.3.2.4. A FVIII gén inszerciói Emberben a transzpozon inszerció patogenetikai szerepét először a FVIII génben írták le (85), bár a transzpozonokat korábban már az élőlények széles skálájában azonosították, beleértve az élesztőt, az ecetmuslicát és az egeret is. Az L1 elemek a humán genom körülbelül 5%-át alkotják. Nem ismert a genomban található aktív, teljes hosszúságú L1 elemek pontos száma. A mintegy 100 000 kópiából 300 teljes hosszúságú potenciálisan „ugráló gén” (transzpozon) lehet, a legtöbb példány csonkolt. A transzpozonokra jellemző, hogy RNS-re átíródásuk után megszintetizálódik az antisense szál, és duplaszálú DNS-sé alakulva beszúródnak a genom egy más részletébe. Az ismertetett HA beteg esetén egy de novo keletkezett L1 inszerciót találtak, amelynél egy 22. kromoszómán található aktív L1 elem kétharmada szúródott be a FVIII gén 14. exonjába. Azóta a HA-n kívül az L1 elemek retrotranszpozicióját leírták az adenomatosis polyposis coli és a dystrophin génekben is (66).
23
Bevezetés
1.3.3. A haemophilia A klinikai képe, diagnózisa és terápiája 1.3.3.1. Klinikai megjelenés A betegség súlyossága a keringésben található VIII. faktor mennyiségétől, illetve aktivitásától függ. Súlyos esetben, amikor a VIII. faktor aktivitása alacsonyabb, mint a normál aktivitás 1%-a, a kisebb traumát követő, illetve a spontán bekövetkező ízületi és izomközti vérzések kialakulása a legjellemzőbb tünet. 1-5%-os VIII. faktor-szint esetén (középsúlyos eset) a spontán vérzések előfordulása ritkább, kisebb sérülések után lépnek fel elhúzódó vérzések. Enyhe esetekben (VIII. faktor-szint 5-30%) elhúzódó vérzés csak foghúzás, fogászati illetve sebészeti beavatkozás, vagy nagyobb sérülések után fordul elő. A vérzések során leggyakrabban a könyök-, a térd-, a boka- és a csípőizület érintett. Faktorpótlás nélkül az ízületi intrakapszuláris vérzés komoly duzzanatot, fájdalmat és merevséget okoz. A vér irritálja a synoviumot, amely gyulladáshoz, proliferációhoz, degeneratív arthritis kialakulásához vezet. Izomvérzés bárhol előfordulhat, főként a nagy igénybevételnek kitett helyeken (pl. comb, lábikra és farizomzat). A haematuria nem gyakori, de szinte minden súlyos betegnél előfordul egyszer-kétszer az élete során. Központi idegrendszeri vérzés általában csak fejsérüléskor következik be. Korábban ez okozta a legtöbb halálesetet a haemophiliás betegek között. Műtéteknél nemcsak a vérveszteség, hanem a vérzés elhúzódása is gondot okoz (66, 86). Mivel a VIII. faktor fehérje nem jut át a placentán, ezért a vérzékenység már újszülött korban jelentkezhet. Gyakoriak az injekciók utáni haematomák, vagy a circumcisiót követő vérzések. Születéskor cephalhaematoma, illetve hosszantartó köldökvérzés is előfordulhat. Számos érintett újszülöttnek azonban nincsenek klinikai tünetei. Amint a gyermekek járni tanulnak, kiterjedt zúzódások jelentkeznek. Az ajak és a nyelv egyébként kicsiny sérülése, amely órákig vagy napokig is vérzik, vezet el leggyakrabban a diagnózishoz. A betegség súlyos formájában szenvedők 90%-ánál 1 éves korra a vérzékenység klinikailag már nyilvánvalóvá válik (87).
1.3.3.2. A haemophilia A diagnózisa A vérzékenység hátterében a véralvadási kaszkád faktorai, a trombocita és az érfal szerzett, illetve örökletes betegségei egyaránt állhatnak. A koagulopátiákra jellemző,
24
Bevezetés
hogy sérülések után a vérzés nem tartós, de újra kezdődik, mivel a plazmafaktorok defektusa miatt nem alakul ki stabil trombus. A felületes sérülések vérzése vagy a purpurák megjelenése nem jellemző, az inkább a trombocita funkció zavarára utal. A laboratóriumi vizsgálatok közül a protrombin idő (PI) vagy az aktivált parciális tromboplasztin idő (aPTI) megnyúlása utalhat koagulopátia jelenlétére. Izolált PI megnyúlás jellemzi az V. és a VII. faktorok hiányát. Izolált aPTI megnyúlás a IX. és a VIII. faktorok defektusai esetén fordul elő. Az I., II., X. alvadási faktorok defektusai esetén mind a PI, mind az aPTI megnyúlik. Ismert faktorhiányos plazmával történő keveréssel állapítható meg, hogy az izolált aPTI megnyúlás hátterében az FVIII vagy a FIX defektusa áll-e (88). Szerzett koagulopátiát okozhat a májkárosodás, a K-vitamin hiány, az antikoaguláns kezelés, a fokozott faktorfelhasználás (disszeminált intravaszkuláris koagulopátia, [DIC]) és az autoimmun betegségek (inhibitor képződés révén). Az általános laboratóriumi vizsgálatok közül a vérzékenység hátterében meghúzódó betegséget jelezhetnek a vérkép és a májfunkciós vizsgálatok. A haemophilia B (HB) öröklésmenete és klinikai képe megegyezik a HA-val. HB esetén a FIX génjének mutációi okozzák a betegséget (89). A HB a HA-tól csak laboratóriumi módszerrel különíthető el. A HB-ben szenvedő beteg plazmájának aktivált parciális tromboplasztin ideje ismerten VIII. faktor hiányos plazmával történő keverés után normalizálódik, míg ismerten IX. faktor hiányos plazmával történő keverésnél a korrekció elmarad. HA-ban ennek az ellentéte történik. A von Willebrand betegséget a vW faktor (vWF) fehérjét érintő defektusok okozzák. Mivel a vWF a trombociták aktiválásában és a FVIII stabilizálásában is részt vesz, a fehérje különböző régióit érintő mutációk többféle kóros fenotípus kialakulását okozhatják. Trombocita diszfunkcióra, illetve haemophiliára utaló fenotípus egyaránt kialakulhat. A vWF FVIII kötéséért és vérben történő szállításáért felelős régió mutációi a FVIII fél-életidejének csökkenéséhez, akár 10%-os FVIII aktivitáshoz és fenotípusosan enyhe HA-hoz vezet (a von Willebrand kór 2N típusa). A HA-tól az eltérő öröklésmenete (autoszomális recesszív) különítheti el, azonban sporadikus esetekben az öröklésmenet nem ad felvilágosítást. Csak speciális laborvizsgálattal, a vWF és a FVIII kötődésének a vizsgálata különíti el biztonsággal a két kórképet (90).
25
Bevezetés
Ritka, FVIII hiánnyal járó, azonban nem a FVIII génjéhez kötötten öröklődő betegség a kombinált FVIII és FV hiány, amelyért az ERGIC-53 és a MCFD2 gének mutációi a felelősek. E gének fehérje termékei az endoplazmatikus retikulum és a Golgi rendszer közötti átmeneti kompartmentekben találhatóak, és feltehetőleg a FVIII és FV celluláris transzportjában vesznek részt (91, 92).
1.3.3.3. A haemophilia A terápiája A legáltalánosabban elterjedt kezelési mód a hiányzó VIII. alvadási faktor pótlása (szubsztitúciós terápia). A kezelés történhet a vérzés első jelére („on demand”) vagy megelőzés-szerűen (profilaktikusan) hetente három alkalommal súlyos haemophilia Aban, vagy sebészeti beavatkozások előtt középsúlyos és enyhe haemophilia A esetén. Tanulmányok igazolták, hogy a profilaktikus kezeléssel csökken a vérzéses események száma (pl. izületi vérzések), ezáltal hosszútávon jobb életminőség érhető el közel ugyanolyan költséggel. Jelenleg minden súlyos HA-ban szenvedő gyermeknél és fiatalnál a profilaktikus kezelési mód választandó (93, 94, 95). A VIII. faktort korábban a véradók kevert („poolozott”) plazmakoncentrátumaiból nyerték. Mivel a szűrési lehetőségek korlátozottak voltak, és a vírus-inaktiválás ma ismert formái sem álltak rendelkezésre, a készítmények egy része hepatitis A, B, illetve C vírussal (HAV, HBV, HCV), parvovírussal, vagy human immundeficiencia vírussal (HIV) volt fertőzött. Az 1986-ban bevezetett vírus-inaktiválásos kezelések, és 1992 óta a rekombináns technikával előállított VIII. faktor készítmények bevezetésének köszönhetően ez a veszély jelentősen csökkent (65). A szubsztitúciós terápia egy másik, viszonylag gyakori szövődménye a beadott VIII. faktor ellenes antitestek megjelenése, amelyek egyrészt közvetlenül, már a beadás pillanatában gátolhatják az exogén VIII. faktor aktivitását (inhibitor képződés), másrészt csökkenthetik a keringő VIII. faktor fél-életidejét. Az inhibitor képződés előfordulásának prevalenciája 5-7% a haemophilia A-ban szenvedő betegek között. A súlyos HA-ban szenvedő betegek között ez az arány ennél jóval magasabb, mintegy 1213% (96). Középsúlyos és enyhe HA esetén dezmopresszin-acetáttal fokozható a VIII. faktor szekréciója, így emelhető a VIII. faktor szintje (97). A súlyos HA ideális kórkép
26
Bevezetés
génterápiás kezelésre, hiszen a FVIII aktivitás akár 1-2%-os emelése is elegendő a spontán vérzések kiküszöbölésére és a rendszeres FVIII szubsztitúció kiváltására. Jelenleg a génterápia humán alkalmazása kísérleti fázisban van, nagymértékű és tartós FVIII szint emelkedést jelenleg még nem sikerült elérni (65, 98).
1.3.4. Genetikai tanácsadás haemophilia A-ban A HA az X kromoszómához kapcsoltan, recesszív módon öröklődik, így a betegség néhány ritka kivételtől eltekintve férfiaknál alakul ki. Az X-hez kötött öröklésmenetből adódóan egy beteg apának valamennyi fia egészséges, viszont valamennyi lánya hordozó (carrier) lesz. Obligát hordozónak tekinthető (i) egy haemophiliás férfi lánya, (ii) az anya, akinek legalább két beteg fia van (akik nem egypetéjű ikrek) vagy akinek egy beteg fia és egy olyan lánya van, aki HA-ban szenvedő fiút szült, és (iii) az anya, akinek egy haemophiliás fia van, de családjában anyai oldalon más HA-ban szenvedő beteg is van. A hordozók lányai az esetek felében szintén hordozók, míg fiai az esetek felében betegek lesznek. Potenciális hordozónak tekintjük azokat a nőket, akiknek az anyja hordozó, de ők maguk nem obligát hordozók (pl. a haemophiliás férfi lányának a lánya, egy beteg fiú lánytestvére, az anyai ági unokatestvéreik és a leszármazottaik) (99). A hordozók az esetek túlnyomó többségében tünetmentesek, faktor-szintjük átlagosan a normál FVIII aktivitás 50%-a, azonban nagy az átfedés a obligát hordozók és az egészséges nők faktor aktivitása között. Az embrionális fejlődés során a nőknél a két X kromoszóma közül az egyik véletlenszerűen inaktiválódik a sejtekben (lyonizáció). Előfordulhat, hogy a FVIII-t termelő sejtekben főként a mutációt hordozó X kromoszóma inaktiválódott, és így normál mennyiségű VIII. faktor képződik (100). Ennek ellentéteképpen olyan eset is ismert, amikor főként az egészséges X kromoszóma inaktiválódik és a hordozó nőnél HA alakul ki. A potenciális hordozók vizsgálatakor talált alacsony FVIII aktivitás (<50%) a hordozói állapotra enged következtetni, míg a normál 70-150%-os FVIII aktivitás nem zárja ki a hordozó státuszt. A faktor-szint normál esetben is változik (pl. az életkorral növekszik) és szintjét bizonyos gyógyszerek (pl. ösztrogén-tartalmú fogamzásgátló tabletták), illetve a terhesség jelentősen befolyásolják. Mindezek alapján elmondhatjuk, hogy a hordozói státusz kimutatására a
27
Bevezetés
fenotípus vizsgálatok gyakran nem megbízhatóak, így a molekuláris vizsgálatok szerepe igen jelentős. HA-ban a genetikai diagnosztika célja egyrészt a hordozók azonosítása (carrierdiagnosztika), valamint az azonosított hordozóknál igény esetén a prenatális diagnosztika biztosítása. A prenatális diagnosztika magában foglalja mindazokat a vizsgálatokat, amelyek segítségével az embrió vagy a magzat állapotáról a terhesség során felvilágosítást nyerhetünk. HA-ban az első prenatális diagnózisok a magzat fenotípus vizsgálatán alapultak: ultrahang ellenőrzés
mellett
cordocentézissel
köldökzsinór vért vettek, amelyből magzati FVIII aktivitás meghatározás történt. A beavatkozás nagy kockázattal jár és csak a terhesség 20. hete után végezhető. Napjainkban leginkább a terhesség 16. hetében végzett magzatvíz vétel (amniocentesis, [AC]), vagy a terhesség 8-12. hetében végzett chorion boholy mintavétel (chorionic villus sampling [CVS]) terjedt el, amelyekkel magzati eredetű sejteket nyerhetünk citogenetikai és molekuláris genetikai vizsgálatra. Bár mindkét magzati mintavételi technika invazív, alkalmazásukkor a vetélések kockázata 1% alatt van. Ideális esetben a potenciális vagy az obligát hordozók korán, még terhességük előtt felkeresik a genetikai tanácsadást, és a genetikai laboratórium kimutatja a beteg családtagban a betegségért felelős mutációt vagy azonosítja a prenatális diagnosztikára alkalmas polimorf markert. Potenciális hordozóknál a vizsgálatok akár ki is zárhatják a hordozói státuszt, így elkerülhető az invazív prenatális vizsgálat. Az azonosított hordozóknál prenatális diagnózis igénye esetén chorion boholy mintavétellel akár a terhesség 8-10. hetes korában megtörténhet a magzati sex-kromoszóma meghatározás és fiú magzat esetén a genetikai vizsgálat is egy-két héten belül elvégezhető.
1.3.4.1. A genetikai tanácsadás során alkalmazott molekuláris biológiai módszerek Súlyos HA-ban a betegek 40-50%-ánál a 22. intron inverzió, 3-5%-ánál az 1. intron inverzió felelős a betegség kialakulásáért. A súlyos HA-családokban tehát az inverzió jelenlétének kimutatása az első feladat. Az inverzió-pozítív betegek családjában az inverzió direkt kimutatásával azonosíthatók a hordozók, és prenatális vizsgálat is végezhető. Az inverzió-negatív súlyos, a középsúlyos és az enyhe HA eseteknél a betegségért felelős mutációk a FVIII génen elszórtan helyezkednek el. Eddig több mint
28
Bevezetés
700, a VIII. faktor génjét érintő mutációt fedeztek fel, az ismeretlen mutációk száma azonban ennél valószínűleg sokkal nagyobb. A direkt mutáció azonosítás legbiztosabb módszere a kérdéses régió, esetünkben a FVIII gén kódoló régiójának és az exon-intron határoknak a mutáció szűrése és szekvenálása. Figyelembe véve a FVIII méretét (csak a kódoló régió mintegy 9 kilobázis) a direkt szekvenálás igen nagy munka-, idő- és költségráfordítással jár, amelynek rutinszerű alkalmazása jelenleg Magyarországon még nem megoldott. Így a géninverzió, mint leggyakoribb mutáció direkt kimutatása mellett szükségessé vált olyan, indirekt módszerek bevezetése, amelyek a mutáció fajtájától függetlenül képesek a gének öröklődésének nyomon követésére. A kimutatható polimorf DNS szekvenciák jelzésként szolgálnak (marker), ezáltal lehetőséget teremtenek arra, hogy egy családon belül megkülönböztessük, és nyomon követhessük a betegség génjét hordozó X kromoszóma öröklésmenetét. A direkt és az indirekt vizsgálati módszerek összehasonlítása a 1. táblázatban található. Az indirekt módszerek családvizsgálaton alapulnak és az esetek többségében szükség van a családból legalább egy beteg, és az összes olyan családtag vizsgálatára, akitől a kérdéses személy (a proband) örökölhette az X kromoszómáját. Korrekt diagnózis indirekt módszerekkel csak pontos családfa esetén adható, ami aláhúzza a genetikai tanácsadás fontosságát, beleértve az apaság kérdését is. Távoli oldalági rokonok vizsgálatakor szükség lehet az anyai nagyszülők, illetve dédszülők vizsgálatára is. Direkt mutáció azonosításkor nincs szükség a teljes család vizsgálatára, elegendő a mutáció azonosítása a betegnél vagy egy obligát hordozónál. Távoli, oldalági rokonok is biztonsággal vizsgálhatók. A kérdéses személyeket akkor is vizsgálhatjuk, ha a családban az érintett (beteg) személytől valamilyen okból nem áll rendelkezésre vérminta. A crossing over során az indirekt marker és a mutáció között bekövetkező rekombináció elválaszthatja a markert és a kóroki mutációt, amely téves diagnózishoz vezethet. Ennek az esélye minimálisra csökkenthető, ha intragenikus vagy a génhez közel eső extragenikus polimorfizmusokat elemzünk. Az így kapott eredmények valószínűség jellegűek, a leleten mindig fel kell tüntetni a rekombináció esélyét. A vizsgált marker és a betegségért felelős mutáció közötti rekombináció esélye intragenikus marker esetén kevesebb, mint 0,2%, megfelelően kiválasztott, azaz a FVIII génhez közeli extragenikus marker esetén kevesebb, mint 5%. Így intragenikus marker
29
Bevezetés
alkalmazása esetén a kapott eredmény valószínűsége nagyobb, mint 99,8%, és extragenikus marker esetén nagyobb, mint 95%. 1. táblázat: A haemophilia A genetikai tanácsadásában alkalmazott direkt és indirekt módszerek összehasonlítása. Definíció Direkt
A betegségért felelős DNS eltérés (mutáció) definitív kimutatása.
Indirekt
A betegségért felelős DNS eltérés öröklésmenetének követése kapcsolt markerekkel a kóroki mutáció azonosítása nélkül. Alkalmazott metodikák
Direkt
22. intron inverzió kimutatás Southern blot analízissel vagy hosszú PCR technikával; 1. intron inverzió kimutatás PCR technikával. Inverzió negatív esetekben a FVIII gén kódoló régiójának direkt szekvenálása.
Indirekt
Kapcsolt markerek vizsgálata PCR-RFLP-vel vagy mikroszatellita elemzéssel. Előnyök
Direkt
A rekombináció esélyével nem kell számolni. Elegendő lehet a proband vizsgálata. Sporadikus esetekben is megbízható diagnózis adható.
Indirekt
Kevesebb labormunka-, költség- és időbefektetést igényel. Előzetes kivizsgálás kivitelezhető.
nélkül
sürgősségi
esetekben
is
gyorsan
Hátrányok Direkt
Jelentős előzetes labormunka-, költség- és időbefektetést igényel.
Indirekt
Számolni kell a rekombináció lehetőségével. Családvizsgálat szükséges. Sporadikus családokban nagy biztonsággal csak kizáró diagnózis adható.
A haemophilia A-ban szenvedő betegek „genetikai fitness-e” jelentősen csökkent: a szubsztitúciós terápia bevezetése előtt a betegek többsége nem érte el a szaporodóképes kort. Így a betegség fennmaradásáért egyrészt a tünetmentes hordozókon történő továbbörökítés, valamint irodalmi adatok szerint az esetek mintegy egyharmadában-
30
Bevezetés
egynegyedében a mutációk de novo keletkezése felelős (78, 101, 102, 103). Egy adott sporadikus beteg édesanyja, akinek családjában fiú gyermekén kívül nincs más ismert HA-ban szenvedő beteg, az irodalmi adatok szerint az eseteknek csak 70-80%-ában hordozó, míg az esetek 20-30%-ában a mutáció de novo keletkezett az anyai gametogenezis során. Indirekt markerek alkalmazásakor ezekben a sporadikus családokban a kizáró diagnózis 99,8%-os illetve 95%-os biztonsággal (intragenikus vagy extragenikus markertől függően), a megerősítő diagnózis csak 70-80%-os biztonsággal állítható fel. Direkt mutáció azonosítással a sporadikus betegek családjában is 100%-os biztonsággal nyújtható hordozó és prenatális diagnosztika. A direkt mutáció elemzés az inverzió kimutatástól eltekintve jelentős munka-, és időbefektetéssel jár, ezért ezzel a módszerrel csak akkor nyújtható prenatális diagnosztika, ha a hordozó nő családjában még a terhessége előtt megtörtént a mutáció azonosítása. Ellenkező esetben az inverzió negatív családokban a mutáció azonosítása hónapokat vehet igénybe, amely prenatális diagnózisnál nem megfelelő. Bár az indirekt marker analízis néhány hét alatt kivitelezhető, ilyen esetben is csökkenthető a prenatális diagnosztika átfutási ideje, ha a laboratórium már a terhesség előtt azonosította az informatív markert a hordozónál. Két különböző típusú indirekt marker elemzése terjedt el. Az RFLP elemzésnél (Restriction Fragment Length Polymorphism) a markerként használt polimorfizmus általában egy pontmutáció (SNP, azaz single nucleotide polymorphism), amelynek jelenléte egy restrikciós hasítási hely jelenlétét vagy hiányát eredményezi. A különböző restrikciós enzim hasító-helyek jelenlétét először Southern blot módszerrel vizsgálták, amelyet fokozatosan kiváltottak a kevésbé munka- és időigényes polimeráz láncreakción alapuló PCR-RFLP módszerek (99). A mikroszatellita elemzésnél a markerként használt polimorfizmus egy rövid szekvencia szakasz különböző számú ismétlődése (pl. di-, tri- vagy tetranukleotid „repeat”-ek). Mikroszatellita elemzésnél a különböző
alléloknak
megfelelő
PCR
termékek
elválasztása
nagyfelbontású
poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) történik. Egy marker segítségével akkor adható diagnózis a hordozó nő lánygyermekei illetve fiúmagzata számára (vagyis akkor informatív a marker), ha a mutáns és a normál gént hordozó kromoszómán az adott marker eltérő alléljei találhatók, azaz hordozó nő heterozigóta az adott markerra nézve. A populációban meghatározható az allélek gyakorisága. Minél polimorfabb egy marker
31
Bevezetés
(minél többféle allélje van), és minél egyenletesebb az allél-gyakorisági eloszlás, annál nagyobb a valószínűsége annak, hogy a marker egy adott hordozóra nézve informatív lesz és annál nagyobb a marker gyakorlati értéke a DNS diagnosztikában. Az irodalomban közölt, VIII. faktor génnel kapcsoltan öröklődő markerek listája a 2. táblázatban található. A nagyobb allél számnak köszönhetően az informativitás jóval nagyobb a mikroszatelliták esetében, mint az RFLP-k esetében. Megfelelő azonosítható
marker-kombináció informatív
marker.
alkalmazásával A
az
kapcsoltsági
esetek viszonyok
közel miatt
100%-ában („linkage
disequilibrium”) azonban a marker-kombináció kiválasztása nem egyszerű. A BclI (39%-os heterozigóta arány a kaukázusi populációban), HindIII (38%) és BglI (25%) RFLP markerek erősen kapcsoltak. A három marker közül csak az egyet érdemes vizsgálni, mert a további markerek vizsgálata nem nyújt többlet információt. A BclI és XbaI (49%) markerek között is megfigyelhető kapcsoltság különböző populációkban, azonban kaukázusi populációban kombinált alkalmazásukkal 64-69%-ra emelhető az informativitási arány (99). Egy intragenikus RFLP (BclI, HindIII vagy BglI) és a két intragenikus CA repeat vizsgálatával 65-88%-os informativitási arányt írtak le (104, 105). Az extragenikus St14 polimorfizmus alkalmazásával az informativitási arány elérheti a 96-100%-ot, azonban ennél az extragenikus markernél a kóroki mutáció és a marker közötti rekombináció valószínűsége elérheti a 4%-ot (99).
32
Bevezetés
2. táblázat: A VIII. faktor génnel kapcsolt markerek. Marker (hivatkozás)
Elhelyezkedés Allélek Módszer száma
AlwNI (106, 107)
7. intron
Informativitás *
2
PCR-RFLP
16-33%
IVS13CA (104, 105, 108) 13. intron
8
PCR-PAGE
34-91%
BclI (99)
2
Southern blot 31-49%
18. intron
PCR-RFLP HindIII (99)
19. intron
2
Southern blot 34-41% PCR-RFLP
XbaI (99)
22. intron
2
Southern blot 48-50% PCR-RFLP
IVS22CA (104, 105, 109) 22. intron
4-6** PCR-PAGE
37-71%
BglI (99)
25. intron
2
Southern blot 2-38%
BglII (99)
Extragenikus
2
Southern blot 50%
MspI (99)
Extragenikus
2
Southern blot 43%
p39CA (110)
Extragenikus
8
PCR-PAGE
TaqI/St14 (99, 107, 111)
Extragenikus
84%
8-14** Southern blot 69-80% PCR-PAGE
Rövidítések: PCR-RFLP (polimerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism) polimeráz láncreakciót követően a PCR termék restrikciós enzimmel történő emésztése, a kapott fragmentumok agaróz gélelektroforézissel történő elválasztása. PCR-PAGE: polimeráz láncreakciót követően a PCR termékek poliakrilamid gélelektroforézissel történő elválasztása. A dőlt betűvel szedett markerek nevei az alkalmazott restrikciós endonukleázok neveire utalnak. IVS (intervening sequence): intron; CA: CA ismétlődések *: A markerek informativitási aránya a heterozigóták arányának felel meg, amely egyes populációkban eltér. **: A megkülönböztethető allélek száma az alkalmazott módszertől (Southern blot vagy PCR-PAGE) vagy a vizsgált populációtól függően változik.
33
Célkitűzések
2. Célkitűzések 2.1. Öröklődő haemochromatosis Mai ismereteink szerint a haemochromatosis a nyugat európai eredetű népek egyik leggyakoribb öröklődő betegsége, amelyet azonban (a specifikus tünetek késői kialakulása miatt) a becsült gyakoriságához képest sokkal ritkábban diagnosztizálnak, annak ellenére, hogy a korai diagnózissal a betegség kialakulása megelőzhető lenne. Magyarországon eddig nem voltak ismertek az öröklődő haemochromatosisra vonatkozó
epidemiológiai
adatok,
csak
szórványos
esetismertetések
és
egy
rizikócsoportokban történt szűrővizsgálat (112) utalt arra, hogy az öröklődő haemochromatosis Magyarországon sem olyan ritka, mint azt korábban gondolták. Munkánk célja egyszerű és rutin körülmények között alkalmazható DNS-technikák beállítása volt a HH kialakulásáért az esetek mintegy 80%-ában felelős HFE gén C282Y és H63D pontmutációinak kimutatására. A módszerek segítségével adatokat kívántunk gyűjteni a C282Y és H63D mutációk hazai allél-frekvenciájára vonatkozóan egyrészt a normál hazai populációban, másrészt különböző, a vasfelhalmozódás klinikai és labordiagnosztikai tüneteit mutató betegcsoportokban. A magyar, normál allélfrekvencia értékek megállapítása céljából két egészséges populációban végeztünk szűrővizsgálatot: egy főként intézeti dolgozókból álló önkéntes csoportban és egy véradókból álló csoportban. A véradó csoportban összefüggéseket kerestünk a korábbi véradások száma és a C282Y allél-frekvencia között, valamint összehasonlítottuk a vasanyagcsere paramétereket különböző C282Y genotípusú egyénekben. Vizsgálatunk másik célja a C282Y és a H63D allél-frekvenciák megállapítása volt az emelkedett vasparaméterekkel járó myelodysplasiás szindrómában. Bár a HFE génhez köthető haemochromatosis recesszív módon öröklődik, a heterozigótákban megfigyelt magasabb szérum ferritin illetve transzferrin szaturációs értékek felvetik a kérdést, hogy már a heterozigótákban nagyobb vasraktárak alakulhatnak ki, amely hajlamosíthat myelodysplasia kialakulására, illetve ronthatja prognózisát. 2.2. Haemophilia A A „Haemophilia A molekuláris genetikai diagnosztikai és prevenciós programja” az OGYK Haematológiai és Immunológiai Intézet és az MTA SZBK Enzimológiai Intézet közreműködésével 1995-ben indult. Célja a hordozó és a prenatális molekuláris
34
Célkitűzések
diagnosztika bevezetése és igény esetén rutinszerű elérhetőségének biztosítása a haemophilia A által érintett családok számára. Korábban a genetikai tanácsadáson résztvevő HA-hordozók magzatainál nem-meghatározás történt, és fiúmagzat esetén a magas (50%-os) kockázat miatt esetenként művi vetélést végeztek. A molekuláris genetikai vizsgálatok bevezetésével lehetőség nyílt arra, hogy megszülessenek azok az egészséges fiúgyermekek, akiket korábban a betegség nagy kockázata miatt szüleik nem vállaltak. A mutációk direkt kimutatása minden egyes családban munkaigényes és költséges feladatot jelentene, ezért olyan diagnosztikai stratégia bevezetését tűztük ki célul, amely kombinálja a könnyen kivitelezhető direkt és indirekt módszereket. A direkt mutáció azonosító módszerek közül a leggyakoribb mutációk, a 22. és az 1. intron inverzió kimutatására szolgáló Southern blot, illetve PCR technikák bevezetése volt első feladatunk. Szintén célul tűztük ki a munka során felfedezett, a FVIII gén 22. intronját
érintő
atípusos
génátrendeződések
hátterében
álló
molekuláris
mechanizmus(ok) felderítését. Az inverzió-negatív súlyos, valamint a középsúlyos és enyhe HA-ban szenvedők családjaiban indirekt módszerek (polimorf markerek) alkalmazását terveztük a mutációt hordozó kromoszóma azonosítására, és öröklésmenetének követésére. A program kialakítása
során
olyan
indirekt
módszerek
bevezetését
terveztük,
amelyek
kombinációjával a hordozók több, mint 95%-ában azonosítható legalább egy informatív marker. A markerek kiválasztásakor figyelembe vettük a nemzetközi ajánlásokat (99), azonban programunk kezdetekor a FVIII génhez kapcsolt markerek heterozigótasági arányát a magyar populációban nem ismertük. Az indirekt markerek alkalmazhatósága (a heterozigóták aránya) egy adott populációkban eltérhet az irodalmi adatoktól, így diagnosztikai stratégiánk hatékonyságát csak több érintett család bevonásával ellenőrizhettük és meg kellett határoznunk a FVIII génjével kapcsolt markerek heterozigótasági
arányát,
kapcsoltsági
viszonyaikat
35
a
magyar
populációban.
Módszerek
3. Módszerek 3.1. Vizsgált egyének Kontroll csoport: 277 véletlenszerűen kiválasztott, egymással rokoni kapcsolatban nem álló, egészséges, magyar egyénnél végeztük el a HFE gén C282Y és H63D mutációinak analízisét. A vizsgált személyek az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézetben HLA-tipizálás, illetve egyéb DNS vizsgálatok részvevői voltak (intézeti dolgozók, csontvelő donorok, apasági vizsgálat részvevői). Véradó csoport: 996 önkéntes véradó (362 nő, 634 férfi) vett részt a haemochromatosis genetikai szűrőprogramban. A véradók bevonását a vizsgálatba a budapesti
Országos
Vérellátó
Szolgálat
(OVSZ)
és
az
OVSZ
Szegedi
Tudományegyetemen működő Regionális Vérellátója végezte. A véletlenszerű mintavétel lehető legjobb megközelítése érdekében törekedtünk a konszekutív mintavételre. Szóbeli tájékoztatást követően a véradók írásbeli, tájékoztatáson alapuló beleegyező nyilatkozatot írtak alá. A pozitív eredményről írásos értesítést kaptak azok a véradók, akik ezt igényelték. 694 budapesti és 302 szegedi véradót vizsgáltunk, az átlagéletkor férfiaknál 35,7 év, nőknél pedig 37,0 év volt (tartomány: 18-65 év). A korábbi véradások száma a nőknél átlagosan 14,0 férfiaknál pedig 18,4 (tartomány: 095). A C282Y mutáció analízist minden véradónál, a H63D mutáció analízist a C282Yheterozigótáknál, 80 első véradónál és 80-80 közepes számú (6-13 korábbi véradás) illetve sokszoros (30-95 korábbi véradás) véradónál végeztük el. A résztvevőktől az alvadásgátolt vérminták mellett savómintákat is gyűjtöttünk, amelyeket -70oC-on tároltunk. Az első véradóknál, a C282Y-heterozigóta egyéneknél, valamint a heterozigótákhoz nemben, korban és véradási számban egyeztetett csoportban szérum ferritin, szérum vas és latens vaskötő kapacitás vizsgálatokat végeztünk. Haemochromatosis klinikai gyanúja miatt a dolgozat készítéséig 464 egyénnél (181 nő, 283 férfi) kértek C282Y mutáció analízist az ország egész területéről. A H63D vizsgálatát az azonosított C282Y-heterozigótáknál végeztük el. A legtöbb esetben részletes klinikai adatok nem álltak rendelkezésünkre, a vizsgálat elvégzésének okaként legtöbbször az emelkedett szérum vas illetve ferritin szintet és csökkent teljes vaskötő kapacitást jelölték meg. Gyakran ismert, másodlagosan vaslerakódáshoz vezető faktorok mellett (alkoholfogyasztás, vírusos hepatitis, többszörös transzfúziók stb.) az öröklődő haemochromatosis társulásának kizárása volt a vizsgálat célja. Több esetben
36
Módszerek igazolt homozigóta illetve heterozigóta családtag esetén család-szűrést végeztünk. Az azonosított C282Y-homozigóta, és a C282Y/H63D kettős heterozigóta egyének klinikai adatait retrospektíven dolgoztuk fel. A myelodysplásiában szenvedő betegeknél (32 nő, 18 férfi; átlagéletkor a betegség diagnózisakor: 70,3 év, tartomány: 37-87 év) mind a C282Y, mind a H63D mutáció előfordulási gyakoriságát vizsgáltuk. 26 beteg RA-ban (refrakter anaemia), 9 beteg RARS-ban (RA gyűrűs sideroblastokkal), 2 beteg RAEB-ban (RA blast túlsúllyal) és 13 beteg RAEBt-ben (RAEB transzformációval) szenvedett. Több beteg az anaemia kezeléseként korábban rendszeres transzfúzióban részesült. A haemophilia A genetikai tanácsadáson 137, egymással rokoni kapcsolatban nem álló HA-ban szenvedő beteg, illetve család vett részt. A betegek gondozása és a genetikai tanácsadás az Országos Haemophilia Központban, valamint a Heim Pál Gyermekkórházban történt. A VIII. faktor aktivitás meghatározása, valamint a családfa adatok felvétele a gondozást végző orvos irányításával történt. A betegek és az érintett családtagok a szóbeli tájékoztatást követően írásbeli, tájékoztatáson alapuló beleegyező nyilatkozatot írtak alá. A hordozó és prenatális vizsgálatok eredményét titkosan kezeltük, csak a vizsgálatot kérő orvosnak adtuk meg. A dolgozat írásakor, a laboratóriumba eddig beérkezett 137 magyar HA-családból (110 súlyos, 20 középsúlyos és 7 enyhe) 475 genomiális DNS mintát tároltunk. 3.2. DNS izolálás A DNS-t a frissen levett vagy a -20°C-on tárolt, alvadásgátolt perifériás vérmintából vagy prenatális vizsgálatnál a CVS mintából izoláltuk. 1995-2000 között a „kisózásos” módszert alkalmaztuk (113). A módszer lényege, hogy a vörösvérsejtek hipozmotikus lízisét követően a fehérvérsejteket proteináz K-val emésztjük, majd a megemésztett fehérjéket nagy koncentrációjú NaCl-dal, ezt követően a DNS-t etanollal csapjuk ki. A módszer munka- és idő-igényesebb, mint az újabb, gyári kiteket alkalmazó eljárások, de lényegesen olcsóbb azoknál. A mintaszám bővülésekor (2000-ben) áttértünk a gyári reagensek (PuregeneTM DNA Isolation Kit, Blood Kit; Gentra Systems; D-5000) rutinszerű alkalmazására. A DNS oldatot -20°C-on tároltuk.
37
Módszerek 3.3. PCR technikán alapuló molekuláris genetikai módszerek 3.3.1. A HFE gén C282Y és H63D pontmutációinak vizsgálata PCR-RFLP módszerrel A PCR-RFLP (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism) módszer lényege, hogy a pontmutációkat tartalmazó génszakaszokat polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikáljuk, majd a PCR terméket egy adott restrikciós enzimmel hasítjuk. A különböző méretű, emésztett DNS darabokat agaróz gélelektroforézissel választjuk el és UV fény alatt etidium-bromid festéssel tesszük láthatóvá. A pontmutáció jelenléte a restrikciós enzim hasítási helyének megjelenésétől vagy eltűnésétől függően meghatározható. A PCR reakciók során PCR Master Mixet (Promega, M7505) alkalmaztunk. A reagens 2x koncentrációban tartalmazza a megfelelő puffert (pH 8,5), MgCl2-t (3mM), négy dinukleotidot (400µM), és Taq DNS polimerázt (50 U/ml). A primerek (0,25 µM koncentrációban) a C282Y meghatározásnál: C282Yf: 5’-TGG CAA GGG TAA ACA GAT CC, C282Yr: 5’-CTC AGG CAC TCC TCT CAA CC; a H63D meghatározásnál: H63Df: 5’-ACA TGG TTA AGG CCT GTT GC, H63Dr: 5’-GCC ACA TCT GGC TTG AAA TT (9) voltak. A PCR 35 ciklusból állt (94°C 1 perc, 55°C 1 perc, 72°C 1 perc). A C282Y mutáció analízis esetén a PCR terméket RsaI (Fermentas, ER1121), a H63D mutáció analízis esetén BclI (Fermentas, ER0721) restrikciós endonukleázzal hasítottuk (114). A keletkezett DNS fragmentumokat 3%-os agaróz gélen (Sigma, A9539) választottuk el. A C282Y mutáció kimutatására egy alternatív módszert is kidolgoztunk, amelynek elve az amplifikáció generálta restrikciós hely keletkezésén alapul (AGRS-amplification generated restriction site). Ennél a módszernél az egyik primer (C282YKpn) egy bázispárnyi eltérése a mutáns allél jelenléte esetén egy új KpnI hasítási helyet hoz létre a keletkezett PCR termékben. A PCR reakció körülményei megegyeztek a korábban leírtakkal, eltekintve az alkalmazott primerektől (C282YKpn: 5'-GGG AAG AGC AGA GAT ATA GGT és a C282Yr). A PCR terméket KpnI (Fermentas, ER0521) restrikciós endonukleázzal emésztettük. A gélelektroforézis és a vizualizáció körülményei a fentiekkel megegyeztek.
38
Módszerek 3.3.2. A HFE gén C282Y és H63D pontmutációinak vizsgálata LightCycler technikával A LightCycler (LC) egy légbefúvással működő, így gyors hőmérséklet változtatásra képes (20°C/sec) PCR készülék és egy fluorimeter kombinációja (115). A pontmutációk kimutatása során a mutációt tartalmazó génszakaszt polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikáljuk az erre a célra kifejlesztett nagy hőátadású kapillárisokban. A keletkezett PCR terméket a pontmutációra specifikusan tervezett és flureszcensen jelölt hibridizációs szondák (szintetikus oligonukleotidok) jelenlétében olvadáspont analízisnek vetjük alá (116), amely során meghatározható a mutációra illeszkedő
hibridizációs
szonda
(„sensor
probe”)
olvadáspontja.
A
szonda
olvadáspontja csökken, ha a DNS szekvenciában bázis eltérés található, így a különböző genotípusú minták elkülöníthetőek. A módszert allél-diszkriminációnak nevezik. A PCR reakciók során „LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization Probes”-t (Roche Molecular Biochemicals, 3 003 248) alkalmaztunk, amely 10x koncentrációban tartalmazott Taq DNS polimerázt, puffert, dNTP-t és MgCl2-t. A primerek (LCF és LCR) és hibridizációs szondák (ANC és SENS) saját tervezésűek voltak [a C282Y mutáció meghatározáshoz HFE-C282Y-LCF: 5’-AAA GCA AGT TAA AGC CTT TG, HFE-C282Y-LCR: 5’-GTG ACC ACT CTA CGG TG, HFE-C282Y-ANC: 5’Bodipy630/650-CCC AGG GGG TAC AGC CAA GG-Phosphorilation, HFE-C282YSENS: 5’-CTG GCA CGT ATA TCT CTG CTC T-6FAM; a H63D mutáció meghatározáshoz: HFE-H63D-LCF: 5’-CTC TCC ACA TAC CCT TGC, HFE-H63DLCR: 5’-GAG CCT CAA CAT CCT GC, HFE-H63D-ANC: 5’- Bodipy630/650-CTG GTC ATC CAC GTA GCC CAA AGC- Phosphorilation, HFE-H63D-SENS: 5’-CGA CTC TCA TCA TCA TAG AAC ACG AAC-6FAM]. Mindkét pontmutáció kimutatásakor az alkalmazott MgCl2 koncentráció 2 mM, a primerek és hibridizációs szondák koncenctrációja 0,25 µM volt, kivéve a HFE-H63D-LCF 0,15 µM és HFEH63D-LCR 0,5 µM. A C282Y mutáció meghatározásakor a PCR körülmények a következőek voltak: 95°C 10 perc, majd 40 ciklus (10°C 10 sec, 50°C 10 sec, 72°C 10 sec). Ezt követte az olvadáspont analízis, amelynél 0,3°C/sec sebességgel 40°C-ról 90° C-ra melegítettük a mintákat folyamatos fluoreszcencia mérés mellett. A H63D meghatározáskor hasonló PCR és olvadáspont analízis körülményeket alkalmaztunk, kivéve a ciklusszámot (70 ciklus) és az olvasztási („melting”) sebességet (0,1°C/sec).
39
Módszerek 3.3.3. A FVIII gén 18. intron BclI polimorfizmusának vizsgálata PCR-RFLP módszerrel A módszer elve és kivitelezése megegyezett a 3.3.1. fejezetben leírtakkal. A PCR reakcióban alkalmazott primerek: BclI/1: 5'-TAA AAG CTT TAA ATG GTC TAG GC, BclI/2: 5'-TTC GAA TTC TGA AAT TAT CTT GTT C (117). A PCR 35 ciklusból állt (94°C 1 perc, 52°C 1 perc, 72°C 1 perc). A BclI restrikciós enzimmel történő hasítás körülményei megegyeztek a H63D-BclI-PCR-RFLP-nél leírtakkal.
3.3.4. Mikroszatellita elemzés A mikroszatellita elemzés célja a genom nem kódoló régióiban található polimorf ismétlődő szekvenciák, esetünkben a FVIII gén 13. intronjában található IVS13CA és az extragenikusan elhelyezkedő p39CA dinukleotid ismétlődések vizsgálata. A vizsgálatok radioaktívan jelölt primerrel végzett PCR amplifikációból, a kapott termékek nagy felbontású akrilamid gélen történő elválasztásából és autoradiográfiás megjelenítésből állnak (118). Az oligonukleotid primerek (100 ng) 5’ végének radioaktív jelölését T4 polinukleotid kinázzal (Boehringer, 709557) 1,6 MBq γ-32P-ATP-vel végeztük. Az IVS13CA repeat elemzésekor az IVS13/1, a p39CA repeat elemzésekor a p39/1 primert jelöltük. A PCR-ben a reakcióelegy (25 µl) 1 U Taq DNS polimerázt (Fermentas, EP0404), 1,5 mM MgCl2-t , 10% DMSO-t, 0,25 mM dNTP-t, 200 ng genomiális DNS-t és a megfelelő primereket tartalmazta. IVS13CA elemzésekor 75 ng IVS13/2 primert, 10 ng ng
32
32
P-jelölt IVS13/1 primert, p39CA repeat elemzésekor 10 ng p39/2 primert, 10
P-jelölt p39/1 primert adtunk a reakcióhoz [IVS13/1: 5'-TGC ATC ACT GTA
CAT ATG TAT CTT, IVS13/2: 5'-CCA AAT TAC ATA TGA ATA AGC C (108); p39/1: 5'-AGC ACA TGG TAT AAT GAA CCT CCA CG, p39/2: 5'-CAG TGT GAG TAG CAT GCTAGC ATT TG (110)]. A Taq DNS polimerázt reakcióelegy 94°C-ra melegítése után mértük a mintákhoz („hot start” eljárás). IVS13CA elemzéskor a PCR 42 ciklusból (94°C 1 perc, 53°C 1 perc, 72°C 1 perc 10 cikluson keresztül, majd 94°C 1 perc, 48°C 1 perc, 72°C 1 perc 32 cikluson keresztül), a P39CA elemzéskor 33 ciklusból (94°C 1 perc, 62°C 1 perc, 72°C 1 perc 8 cikluson keresztül, majd 94°C 1 perc, 58°C 1 perc, 72°C 1 perc 25 cikluson keresztül) állt. Az elektroforézis poliakrilamid gélen denaturáló körülmények között (0,4 mm vastagság, 6% akrilamid:
40
Módszerek bis-akrilamid 19:1, 6 M urea) 55oC-on, 30 V/cm feszültséggel történt. A megszárított gélre helyezett röntgenfilmet egy éjszakán át exponáltuk jelerősítő ernyővel, -70°C-on. Az amplifikált fragmens nagysága IVS13CA repeat esetén 133-149 bp, p39CA repeat esetén 152-166 bp. A keletkezett termékek méretét a családon belül egymáshoz viszonyítottuk.
3.3.5. Az FVIII gén exonok specifikus amplifikációja PCR technikával A Southern blot elemzések során azonosított négy, ritka restrikciós mintázatot mutató betegnél a kódoló régiók érintettségét a FVIII gén exon specifikus amplifikációival ellenőriztük. A FVIII. gén 22. és 23. exonjainak PCR amplifikációja Arruda és mtsai (119), a 14., 16. és 26. exonok amplifikációja Diamond és mtsai (120) által közölt primerekkel és PCR körülményekkel történt. Az adott exon delécióját a specifikus PCR termék hiánya jelezte a megfelelő pozitív és negatív kontrollok mellett.
3.3.6. Az FVIII gén 22. intron inverziójának kimutatása hosszú PCR technikával A 22. intron inverzió kimutatása sokáig kizárólag restrikciós fragmens hosszúság polimorfizmus (RFLP) módszerrel, Southern blot technika segítségével történt (lsd. 3.4. fejezet). Újabban az eltérés kimutatására hosszú PCR módszert („long-distance” PCR, LD-PCR) fejlesztettek ki (121). A módszer lényege, hogy az intronikus és az extragenikus F8A homológ régiók teljes hosszát és a környező szekvenciákat PCR technikával amplifikáljuk a homológ régión kívül elhelyezkedő primer párokkal. A kapott PCR termékek mérete eltér az ép intra- és extragenikus homológ régiók és az inverzióban résztvevő homológ régiók esetén. A LD-PCR során az alkalmazott DNS polimeráz típusa (különböző 5’→3’ és 3’→5’ exonukleáz aktivitású DNS polimerázok megfelelő arányú keveréke) és a ciklusidők (a lánchosszabbítás ideje 1 perc kilobázisonként) eltérnek a hagyományos PCR-ben megszokottaktól (122). A FVIII gén 22. intron inverzió kimutatására kifejlesztett LDPCR módszer (121) három ponton is eltér a standard LD-PCR során alkalmazott körülményektől: (i) magas DMSO koncentráció és (ii) 50% deaza-dGTP alkalmazása; (iii) Taq és Pwo DNS polimerázok mennyiségének emelése. Mindezekre a változtatásokra az amplifikált régió hossza (12 kb) és „GC” nukleotidokban való
41
Módszerek gazdagsága miatt (a GC-arány bizonyos szakaszokon elérheti akár a 70%-ot is) volt szükség. A PCR reakció összemérésekor az Expand Long Template PCR System (Roche Molecular Biochemicals, 1 681 834) útmutatásai és Liu és mtsai által fejlesztett módszer szerint (121) jártunk el. A reakcióelegy (50 µl) 3,3 U Expand Long Template DNS polimerázt (Roche Molecular Biochemicals), a 22,5 mM MgCl2-t tartalmazó 10x PCR Puffer 2-t, 7,5% DMSO-t, 250 µM dGTP-t, 250 µM deaza-dGTP-t (Amersham Pharmacia, 27-2090-02), 500 µM a dATP-t, 500 µM a dCTP-t, 500 µM a dTTP-t (Amersham Pharmacia, 27-2035-02), 100 ng genomiális DNS-t és a megfelelő primereket (0,4 µM koncentrációban): P: 5’- GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC, Q: 5’- GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA, (0,12 µM koncentrációban) A: 5’- CAC AAG GGG GAA GAG TGT GAG GGT GTG GGA TAA GAA, B: 5’- CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTA CCC TCT (121) tartalmazott. A DNS polimerázt és a PCR puffert közvetlenül a PCR reakció előtt, a 2 perc 94°C-os denaturálás után adtuk a mintákhoz, hogy a DNS polimeráz 3’ exonukleáz aktivitása ne vezethessen primer degradációhoz. A PCR 30 ciklusból állt: 94°C 12 sec, 65°C 30 sec, 68°C 12 perc 10 ciklusig (a fennmaradó 20 ciklusban az elongáció idejét minden ciklusban 20 másodperccel növeltük). A kapott PCR termékeket agaróz (0,6%; Seakem LE, FMC BioProducts, 1-800-341-1574) gélelektroforézissel választottuk el, és etidiumbromiddal tettük láthatóvá.
3.3.7. Az FVIII gén 1. intron inverziójának kimutatása PCR technikával Az FVIII gén 1. intron inverzió kimutatására szolgáló PCR technikát Bagnall és munkatársai dolgozták ki (79). A módszer elve hasonlít a 22. intron inverzió kimutatására szolgáló hosszú PCR elvéhez, miszerint az intronikus és az extragenikus homológ régiók teljes hosszát és a környező szekvenciákat PCR technikával amplifikáljuk a homológ régión kívül elhelyezkedő primer párokkal. A kapott PCR termékek mérete eltér az ép intra- és extragenikus homológ régiók és az inverzióban résztvevő homológ régiók esetén. Az amplifikált régió hossza azonban ez esetben nem haladja meg a 2 kilobázist, így a hagyományos PCR technika alkalmazható.
42
Módszerek A PCR reakcióelegy összeméréséhez PCR Master Mix-et (Promega, M7505) használtunk. Az alkalmazott primerek (0,25 µM koncentrációban) a következők voltak: 9F: 5’-GTT GTT GGG AAT GGT TAC GG, 9cR: 5’-CTA GCT TGA GCT CCC TGT GG, Int1h-2F: 5’-GGC AGG GAT CTT GTT GGT AAA, Int1h-2R: 5’-TGG GTG ATA TAA GCT GCT GAG CTA (79). A PCR 35 ciklusból állt (94°C 1 perc, 50°C 1 perc, 72°C 2 perc). A keletkezett PCR termékeket 1,5%-os agaróz gélen (Sigma, A9539) választottuk el. 3.4. Southern blot analízis A Southern blot módszer lényege, hogy egy adott restrikciós endonukleázzal (esetünkben a BclI-gyel) megemésztjük a genomiális DNS-t. Az emésztett genomiális DNS-sel agaróz gélelektroforézist végzünk, hogy a különböző méretű DNS fragmentumok elkülönüljenek egymástól. Az egyes fragmentumok mérete az adott restrikciós enzim hasítási helyeinek távolságától függ. Az emésztett DNS darabokat a futási sorrendet megőrizve passzív diffúzióval membránra visszük át (blottoljuk) és a membránhoz rögzített DNS-t hibridizáltatjuk egy olyan DNS szondával, amely a vizsgálni kívánt szakaszra (esetünkben az intronikus és az extragenikus homológ régiók egy 0,9 kb hosszúságú szakaszára) specifikus. A szonda radioaktív izotóppal (vagy nem radioaktív kovalens jelöléssel) jelölt, így a kérdéses régiót tartalmazó DNS fragmentumok
autoradiográfiásan
megjeleníthetőek,
méretük
meghatározható.
Megfelelő restrikciós endonukleáz és szonda kiválasztásával a módszer alkalmas nagyméretű génátrendeződések (pl. deléciók, inszerciók vagy inverziók) kimutatására. Az 5-10 µg genomiális DNS emésztése BclI restrikciós endonukleázzal (2-3U/µg DNS; Fermentas, ER0721) történt. A mintákat 0,6%-os agaróz gélen (Seakem LE, FMC BioProducts,
1-800-341-1574)
elektroforetizáltuk
λ
DNA/HindIII
markerrel
(Fermentas, SM0101) 2V/cm feszültséggel 36 órán át. A DNS fragmentumokat a gélben denaturáltuk, majd nylon membránra (Hybond N, Amersham Pharmacia, RPN 303B) vittük kapilláris transzfer segítségével. A membránt a blot szétszedése után 80°C-on egy órát szárítottuk, majd ultraibolya fénnyel világítottuk meg a DNS fixálása céljából (123). A homológ régiókra specifikus szondát plazmidba (p482.6; ATCC, 57203) klónozva termeltettük E. coliban (124). Plazmidot preparáltunk (125), majd a plazmidból a
43
Módszerek homológ régiókra specifikus szondát SacI és EcoRI enzimmekkel (Fermentas, ER1131 és ER0271) hasítottuk ki. Emésztés után a mintát 1,7%-os agaróz gélen futtattuk, majd a 0,9 kb-os DNS fragmentumot QIAquick Gel Extraction kittel (QIAGEN, 28704) a gélből izoláltuk a gyári protokoll szerint. A szonda koncentrációját ismert koncentrációjú DNS marker létra (GeneRulerTM 100bp DNA Ladder, Fermentas, SM0241) segítségével becsültük meg. A tisztított szondát -20°C-on tároltuk. 50 ng tisztított szondát a denaturálást követően radioaktívan jelöltünk α-32P-dCTPvel (0,8 MBq; Izinta) „random priming” módszerrel (Multiprime DNA labelling System, Amersham Pharmacia, RPN1601Z). A szondát a be nem épült radioaktív nukleotidoktól gél filtrációval választottuk el Sephadex G50 coarse gyöngyszuszpenziót tartalmazó oszlopon (Amersham Pharmacia, 17-0044-01). A szonda specifikus aktivitását β-számlálóban (Beckman LS6000SE) határoztuk meg. A prehibridizáció és a hibridizáció Techne hibridizációs hengerben történt QuikHyb oldattal (Stratagene, 201220) 68°C-on 0,5 illetve 4 órán át. A jelölés során a minimális specifikus aktivitás 1,25 x 106 cpm/ml volt. A mosási körülményeket szintén a Stratagene QuikHyb protokoll ajánlása alapján választottuk. Mosás után a fóliába csomagolt membránra röntgenfilmet helyeztünk és három napon át exponáltuk -70°Con jelerősítő ernyővel (126). 3.5. A vasanyagcsere klinikai paramétereinek mérése A véradóktól gyűjtött savómintákat -70oC-on tároltunk. A szérum vas (Olympus Diagnostica, OSR 6186) és a latens vaskötő kapacitás (OSR 6124) meghatározás standard kolorimetriás módszerrel történt. A szérum vas és a latens vaskötő kapacitás értékek összege megadta a totál vaskötő kapacitást, a szérum vas és a totál vaskötő kapacitás hányadosából számítottuk a transzferrin szaturációt. A szérum ferritin meghatározás immunradiometriás módszerrel történt (125I-Ferritin IRMA, Izinta). 3.6. Statisztikai feldolgozás Az adott populációban talált allél-frekvencia (a mutációt tartalmazó kromoszómák aránya az összes vizsgált kromoszómához képest) és a vizsgált egyedek száma (n) alapján standard hibát (error, SE) és 95%-os konfidencia tartományt (95% CI) számítottunk (127). Az egyes csoportokban talált heterozigóta illetve homozigóta gyakorisági
értékeket
a
Fischer-féle
exact 44
teszttel
hasonlítottuk
össze.
A
Módszerek betegcsoportokban észlelt hetero- és homozigóta gyakoriság alapján a HFE gén C282Y és H63D mutációinak rizikófaktorként betöltött esetleges szerepét az Odd’s ratio (OR és 95% CI) számításával vizsgáltuk. A folyamatos változók értékei átlag ± SD-ként vannak feltüntetve és az összehasonlítást kétmintás t-próbával végeztük.
45
Eredmények és megbeszélés
4. Eredmények és megbeszélés 4.1. Az öröklődő haemochromatosis molekuláris genetikai vizsgálata 4.1.1. A HFE C282Y és H63D pontmutációinak kimutatása Az öröklődő haemochromatosis kialakulásáért az esetek mintegy 80%-ában felelős HFE gén C282Y és H63D pontmutációinak kimutatására PCR-RFLP módszereket illetve LightCycler technikákat állítottunk be. A C282Y-RsaI RFLP esetén (5/a ábra) az emésztetlen PCR termék 393 bázispár (bp) hosszúságú, amelyet az RsaI restrikciós enzim normál nukleotid szekvencia esetén két szakaszra hasít (251 és 142 bp). Mutáns allél esetén egy további RsaI restrikciós hasítási hely jön létre, ilyen esetben három szakaszt kapunk (251, 112 és 30 bp). A 30 bp hosszúságú fragmentum az agaróz gélen nehezen tehető láthatóvá, így homozigóta esetben a 251 és a 112 bp-os, heterozigóta esetben a 251, a 142 és a 112 bp-os szakaszt látjuk. A C282Y-KpnI RFLP esetén (5/b ábra) a normál allél nem emésztődik (133 bp), a mutáns allél igen (114 bp és 19 bp). Agaróz gélen homozigóta mutáns esetben csak a 114 bp-os DNS szakaszt, míg heterozigóta esetben két csíkot (133+114 bp) láthatunk, mivel a 19 bp hosszúságú szakasz a gélen nem látszik. A C282Y pontmutáció kimutatására szolgáló két módszer közül az RsaI-RFLP előnye, hogy az amplifikált szakaszon található egy konstans, azaz a mutáció jelenlététől független RsaI hasítási hely. Mivel mind a mutáns, mind a normál szekvenciánál hasítódik a PCR termék (393 bp), a teljes emésztés létrejötte minden egyes mintában ellenőrizhető a 393 bp-os fragmentum eltűnésével. Több mint 1500 kisózásos módszerrel preparált DNS minta közül 2 esetben észleltünk ismételt esetben is részleges emésztést, a PuregeneTM DNA Isolation Kittel (Gentra Systems; D-5000) preparált minták között nem észleltünk hasonlót. A jelenséget a kisózásos DNS preparálási módszernél (113) a DNS mintában maradt magas sótartalommal magyaráztunk. KpnI-RFLP esetén az irodalomban ismertetett „forward” primer lokalizációját megváltoztattuk, így ezzel a kontroll vizsgálattal elkerülhetjük a 3-as intronban, a „forward” primer tapadási helyén található polimorfizmus okozta téves homozigóta eredményeket (128). Bár az RsaI és a KpnI PCR során az irodalomban ismertetett eredeti reverz primert (HHCC282Yr) használjuk, a 4-es intronban, a primer kötődés
46
Eredmények és megbeszélés
helyén
található
g.5569G>A
polimorfizmus
által
okozott
téves
homozigóta
eredményeket 55°C-on történő primer kötődés alkalmazásával kiküszöbölhettük (129, 130, 131). A kétféle PCR RFLP-vel meghatározott minták és a kontrollként szolgáló ismétlések (minden homozigóta, heterozigóta és a negatív minták random módon kiválasztott 6%-a) teljes egyezést mutattak az első analízis eredményével. 5. ábra: A HFE C282Y pontmutáció kimutatására szolgáló PCR-RFLP módszerek. A pontmutációkat tartalmazó DNS szakaszt PCR technikával amplifikáljuk, a PCR terméket restrikciós endonukleázzal emésztjük. A keletkezett DNS fragmentumokat agaróz gélelektroforézissel választjuk el egymástól és etidium-bromid festéssel tesszük láthatóvá. Az ábrák bal oldalán a gél képe látható (1. emésztetlen PCR termék, 2. normál, 3. heterozigóta; 4. homozigóta mintázat). Az ábra jobb oldalán az adott restrikciós endonukleáz hasító helyeinek elhelyezkedése látszik a PCR terméken.
a) C282Y-RsaI-RFLP
b) C282Y-KpnI-RFLP
A H63D polimorfizmus kimutatására szolgáló BclI-RFLP esetén (6. ábra) az amplifikálódott DNS szakasz 208 bp hosszúságú, amely a vad típus esetében két fragmentumra (138 és 70 bp) hasítódik, mutáció esetén a hasítási hely megszűnik. Homozigóta mutáns esetben csak a hasítatlan 208 bp DNS szakaszt látjuk, heterozigóta esetben a hasítatlan és a két hasított DNS szakaszt egyaránt megfigyelhetjük. Mivel itt az emésztettség részlegessége, illetve elmaradása tévesen a mutáció jelenlétének
47
Eredmények és megbeszélés
diagnózisához vezetne, a pozitív eseteket itt is ismételt vizsgálatnak vetettük alá, és eltérést egyetlen esetben sem találtunk. 6. ábra: A HFE H63D pontmutáció kimutatására szolgáló PCR-BclI-RFLP. Az ábra bal oldalán az agaróz gél képe látható (1. emésztetlen PCR termék, 2. normál, 3. heterozigóta; 4. homozigóta mintázat). Az ábra jobb oldalán a restrikciós endonukleáz hasító helyeinek elhelyezkedése látszik a PCR terméken.
A C282Y és a H63D mutációk LightCycler (LC) technikával történő kimutatásához új
primereket
és
hibridizációs
szondákat
terveztünk,
amelyekkel
egyrészt
lecsökkenthettük a meghatározások idejét, másrészt elkerülhettük a PCR-RFLP módszerek hátrányait is. A C282Y primer tervezésekor mindkét primer helyzetét eltoltuk, így az ismert polimorfizmusok által a PCR-RFLP módszer során jelentkező álnegatív illetve ál-pozitív eredmények kiküszöbölhetővé váltak. A H63D pontmutáció kimutatására szolgáló PCR-RFLP-ben a konstans hasítási hely hiánya által okozott álpozitív eredmény lehetősége megszűnt. Továbbá a H63D pontmutáció kimutatására szolgáló hibridizációs próbák lehetőséget teremtettek a H63D mutáció közelében található S65C mutáció egyidejű kimutatására is. A C282Y és a H63D pontmutáció kimutatására szolgáló LC technika típusos eredményeit a 7. ábra mutatja be. Az LC metodikák beállítását, PCR-RFLP módszerrel korábban már vizsgált, ismert genotípusú DNS mintákon végeztük. Mintegy 80 minta mindkét módszerrel elvégzett vizsgálata során nem találtunk eltérést. A C282Y mutáció kimutatására tervezett hibridizációs szonda a normál szekvenciára komplementer. Normál genotípus esetén olvadáspontja 62°C-nál van (7/a ábra). A C282Y mutációt eredményező guanin-adenin csere (c.845G>A) a PCR terméken a hibridizációs szonda olvadáspontjának mintegy 7°C-os csökkenését eredményezi.
48
Eredmények és megbeszélés
Heterozigóta genotípus esetén mind a 62°C-os, mind az 55°C-os olvadáspontot (azaz mind a két maximumot) észleljük. A H63D mutáció kimutatására tervezett szonda a 63D mutánsra (c.187G) komplementer, olvadáspontja 64°C-nál van (7/b ábra). A normál genotípus (c.187C) a szonda olvadáspontjának mintegy 8°C-os csökkenését eredményezi. A H63D mutációk elemzése során a minták kis százalékában mind a c.187C, mind a c.187G allélokétól eltérő (52°C-os) olvadáspontot tapasztaltunk. 7. ábra: A HFE gén C282Y (A panel), H63D és S65C (B panel) pontmutációinak kimutatása LightCycler technikával.
A tervezett sensor szondánk az irodalomban leírt S65C mutáció poziciójára (c.193A>T) is komplementer. Az S65C mutációra specifus HinfI-RFLP-vel igazoltuk, hogy valóban ez a mutáció okozta az olvadáspont 12°C-os csökkenését. A nagymértékű olvadáspont csökkenés hátterében az áll, hogy a minta a sensor szondához képest két báziseltérést is tartalmaz. A DNS minták többségét (kontroll csoport, véradó csoport) a HFE H63D genotípusára csak PCR-RFLP módszerrel vizsgáltuk, ezért az S65C mutáció allél-frekvenciájáról nem mutatok be a dolgozatban adatokat. A LC H63D meghatározás hátránya, hogy csak akkor ad megbízható eredményt, ha a H63D és az S65C mutációk külön kromoszómán találhatóak. A 6. kromoszóma MHC I-es fehérjéket tartalmazó régiója azonban ismerten az alacsony rekombinációs rátájú kromoszóma régiók közé tartozik. A C282Y és a H63D mutációkról már leírták, hogy nincsen köztük kapcsoltság, egymástól függetlenül öröklődnek, mivel szinte sosem fordulnak elő ugyanazon a kromoszómán (132, 133). Az irodalomban eddig csak egyetlen esetről számoltak be, ahol a két mutáció ugyanazon a kromoszómán volt (134). Az S65C
49
Eredmények és megbeszélés
mutáció kapcsoltsági viszonyairól még nem áll nagy mennyiségű irodalmi adat a rendelkezésünkre, azonban az allél-frekvenciája a HH-ban szenvedő betegek nonC282Y és non-H63D kromoszómáin emelkedett (29, 135). Ez a megfigyelés szintén azt veszi alapul, hogy az S65C a C282Y és a H63D mutációktól függetlenül öröklődik, azaz külön kromoszómán található.
4.1.2. C282Y és H63D allél-frekvenciák a kontroll és a véradó csoportokban A HFE C282Y és H63D pontmutációk normál magyarországi allél-frekvenciájának meghatározását két különböző módon kiválasztott, egészséges személyekből álló csoporton végeztük el. Az ún. kontroll csoport az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézetben HLA-tipizálás, illetve egyéb DNS vizsgálatok részvevőiből állt (intézeti dolgozók, csontvelő donorok, apasági vizsgálat részvevői) az ország egész területéről, de főként Budapestről. A véradó csoport genetikai szűrővizsgálatunkon önkéntesen résztvevő, budapesti és szegedi véradókból állt. A C282Y mutációra nézve a kontroll csoportban (n=277) 31 heterozigóta (11,2%) egyént találtunk. Az 554 allélből 31 hordozta a mutációt, ez 5,6±2,0% allélfrekvenciának ± 95% CI felel meg (3. táblázat). A C282Y mutációra nézve a véradó csoportban (n=996) 1 homozigóta (0,1%) és 65 heterozigóta (6,5%) egyént azonosítottunk. A C282Y allél-frekvencia ebben a csoportban 3,4±0,8% (3. táblázat). Nem találtunk szignifikáns C282Y allél-frekvencia eltérést a nők és a férfiak (3,5±1,4% vs. 3,3±1,0%) és a budapesti és a szegedi populáció között (3,4±1,0% vs. 3,3±1,5%) a véradó csoportban. Irodalmi adatok szerint a C282Y mutáció feltehetőleg kelta eredetű, és a mutáció allél-frekvenciája Európában nyugatról kelet-felé, valamint északról dél felé csökkenő tendenciát mutat (1. ábra). A kontroll csoport C282Y allél-frekvenciája meglepően magas, a német (136) és az osztrák allél-frekvenciákhoz (137) áll közel. A teljes véradó csoport allél-frekvenciája (3,4±0,8%) a kontroll csoporthoz képest szignifikánsan alacsonyabb (p=0,015). A véradó csoportban talált allél-frekvencia alacsonyabb a nyugat-európai országokból közölt allél-frekvenciánál, viszont magasabb, mint a keletmagyarországi allél-frekvencia (138). Bár a véradó csoportban észlelt C282Y allélfrekvencia jobban illeszkedik a C282Y allél-frekvencia irodalomban leírt nyugatról
50
Eredmények és megbeszélés
keletre csökkenő tendenciájába, mégis felmerül, hogy a többszörös véradók csoportja nem tekinthető reprezentatívnak a magyarországi átlag populációra nézve. A többszörös véradás szelekciós tényezőként szerepelhet a vasháztartást befolyásoló HFE mutációk vizsgálatakor, hiszen a vashiányra hajlamos egyének feltehetőleg nem vesznek részt életük során többször is véradáson. E megfontolásból a hazai átlagos C282Y allélfrekvenciát az alacsony korábbi véradás számú véradók csoportjában (korábbi véradások száma: 0-5) is kiszámítottuk. Ebben a csoportban a C282Y allél-frekvencia 3,8±1,5%-nek bizonyult, amely illeszkedik a C282Y allél-frekvencia irodalomban leírt nyugatról keletre csökkenő tendenciájába és nem különbözik szignifikánsan a kontroll csoport allél-frekvenciájától (p=0,12). Bár a HFE-hez kapcsolt öröklődő haemochromatosis autoszomális recesszív módon öröklődik, a heterozigóták vasparaméterei kismértékben emelkedettek a normál genotípusú egyénekhez képest (60, 61, 62), és a vashiányos anaemia gyakorisága is alacsonyabb az egyszerű és a kettős C282Y/H63D heterozigóta nők esetében (139). A sokszoros véradások során esetleg fellépő vashiánnyal szemben is feltehetőleg védő szerepet játszhatnak a HFE mutációk. Mindezek alapján felmerült, hogy a sokszoros véradók között talált HFE allél-frekvenciák esetleg nem reprezentatívak az átlagpopulációra. Ennek vizsgálatára összefüggéseket kerestünk a véradó csoportban a korábbi véradások száma és a C282Y allél-frekvencia között. A korábbi véradások száma alapján 3 csoportba soroltuk a véradókat [I-es csoport: 0-5 (n=343); II-es csoport: 6-21 (n=338); III-as csoport: >21 korábbi véradás (n=315)]. A határértékeket próbáltuk úgy megválasztani, hogy egy minimális, egy közepes és egy nagymértékű vasvesztésnek kitett csoportot kapjunk. A C282Y allél-frekvencia 3,8±1,5% volt az I-es, 2,8±1,3% a II-es és 3,5±1,5% a III-as csoportban (8. ábra). A női véradók között a véradások számának a növekedésével párhuzamosan megfigyelhető a C282Y allélfrekvencia növekedése (2,6±1,8% az I-es, 3,1±2,3% a II-es és 5,4±3,3% a III-as csoportban), amely eltérés azonban nem szignifikáns. Ez a C282Y allél-frekvencia növekedési tendencia nem volt megfigyelhető a férfi véradók között (4,8±2,2% az I-es, 2,7±1,5% a II-es és 2,7±1,5% a III-as csoportban). Mivel az egyes csoportok esetszámának emelésével az allél-frekvencia 95%-os konfidencia intervalluma csökkenhet, elvégeztük az elemzést úgy is, hogy két nagyobb csoportot képeztünk a női
51
Eredmények és megbeszélés
és férfi véradók között a korábbi véradások számának függvényében. A C282Y allélfrekvencia 2,2±1,5% volt a 0-8-szoros női véradók között és 4,8±2,3% volt a több mint 8-szoros női véradók között; (p=0,06). A férfi véradók között az allél-frekvencia csökkent, de a csökkenés mértéke nem volt szignifikáns (p=0,24). 8. ábra: A C282Y allél-frekvencia és a korábbi véradások számának összefüggése az összes véradónál (bal oldal), nőknél (közép), illetve férfiaknál (jobb oldal) három, korábbi véradás szerinti csoportra történő bontás esetén.
Nők (n=362)
Férfiak (n=634)
6%
6%
5%
5%
5%
4% 3% 2% 1%
C282Y allélfrekvencia
6%
C282Y allélfrekvencia
C282Y allélfrekvencia
Összes véradó (n=996)
4% 3% 2% 1% 0%
0% 0-5,
6-21,
>21,
Korábbi véradások száma
4% 3% 2% 1% 0%
0-5,
6-21,
22-,
K o ráb b i vérad áso k száma
0-5,
6-21,
22-,
Korábbi véradások száma
Vizsgálataink nem igazolták a HFE C282Y allél-frekvencia emelkedését a többszörös véradók körében. Előfordulhat, hogy a vasban gazdag táplálkozás, valamint a multivitamin és nyomelem készítmények rendszeres fogyasztásának elterjedésével a C282Y mutáció vashiánnyal szembeni védő szerepének jelentősége csökkent, s e miatt nem sikerült kimutatnunk az allél-frekvencia emelkedést a többszörös véradók között. Lehetséges azonban az is, hogy az évi 1-2-szeres vagy ennél ritkább véradás nem jelent nagyobb fokú vasveszteséget a szervezet számára, és a HFE mutációk védő szerepe csak az ennél nagyobb mértékű vasveszteségnél fejt ki szelekciós hatást. Erre utalhat a nők körében észlelt allél-frekvencia emelkedés tendenciája is, hiszen a nők a menstruáció miatt a férfiaknál több vasat vesztenek. A H63D pontmutációra nézve a kontroll csoportban (n=277) 58 heterozigóta (21%) és 5 homozigóta egyént (1,8%) azonosítottunk. A H63D allél-frekvenciája 12,3±2,8%
52
Eredmények és megbeszélés
(4. táblázat). 277 egészséges egyén között 5 kettős („compound”) heterozigóta genotípusú egyént találtunk, a C282Y-heterozigóta egészséges egyének 16,6%-a (5/30) volt egyben H63D hordozó is. A H63D mutáció analízist a véradó csoportban szűkebb körben 80 első, 80 közepes számú (a korábbi véradások száma: 7,2±1,3; tartomány 613) és 80 sokszoros véradónál (a korábbi véradások száma: 44,3±10,3; tartomány: 3095) végeztük el. A három csoportot nemben és C282Y genotípus státusza szerint egyeztettük. Nem találtunk szignifikáns H63D allél-frekvencia eltérést a többszörös véradók körében (4. táblázat). Az azonosított 65 C282Y-heterozigóta személy között 8 H63D heterozigóta volt (12,3%), ebben a csoportban H63D homozigóta egyént egyáltalán nem találtunk. A H63D allél-frekvencia 6,2±4,2% volt a C282Y heterozigóták között, összhangban az irodalmi adatokkal, amely szerint az C282Y és a H63D allélek nem fordulnak elő ugyanazon a kromoszómán (132, 133). A véradó és a kontroll csoportban talált H63D allél-frekvenciák nem különböztek egymástól (14,4±5,5% vs. 12,3±2,8%), és megfeleltek az európai átlagnak (17). Azoknál az elemzéseknél a továbbiakban, ahol a C282Y és a H63D együttes előfordulására voltunk kíváncsiak, a 80 fős első véradó csoportunk adataihoz (C282Y allél-frekvencia 3,7±3,0%, H63D allél-frekvencia 14,4±5,0%) viszonyítottunk, mivel ennek a csoportnak a kiválasztásakor feltehetőleg kevésbé érvényesültek szelekciós tényezők és a kapott C282Y allél-frekvencia jobban illeszkedik a várt európai kelet felé csökkenő tendenciájába.
53
Eredmények és megbeszélés
3. táblázat: A C282Y pontmutáció előfordulási gyakorisága Magyarországon egészséges egyének és betegek különböző csoportjaiban. Populáció
Kontroll csoport Véradó csoport Véradók (korábbi véradások száma: 0) Véradók (korábbi véradások száma: 0-5) Véradók (korábbi véradások száma: 6-21) Véradók (korábbi véradások száma: >21) HH gyanújával vizsgált betegek Myelodysplasiában szenvedő betegek
Esetszám Heterozigót Homozigóta a n (%) n (%) 277 31 0 (11,2) 996 65 1 (6,5) (0,1) 81 4 1 (4,9) (1,2) 343 24 1 (7,0) (0,3) 338 19 0 (5,6) 315 22 0 (7,0) 464 54 28 (11,6) (6,0) 50 5 0 (10,0)
Allélfrekvencia % ± 95% CI 5,6 ± 2,0 3,8 ± 0,8 3,7 ± 3,0 3,8 ± 1,5 2,8 ± 1,3 3,5 ± 1,5 11,9 ± 2,1 5,0 ± 4,4
4. táblázat: A H63D pontmutáció előfordulási gyakorisága Magyarországon egészséges egyének és a vizsgált betegek csoportjaiban. Populáció
Kontroll csoport Véradó csoport Véradók (korábbi véradások száma: 0) Véradók (korábbi véradások száma: 6-13) Véradók (korábbi véradások száma: 30-95) Myelodysplasiában szenvedő betegek
Esetszám Heterozigót Homozigóta a n (%) n (%) 277 58 5 (20,9) (1,8) 240 63 3 (26,3) (1,3) 80 19 2 (23,8) (2,5) 80 19 1 (23,8) (1,2) 80 25 0 (31,3) 50 21 1 (42,0) (2,0)
54
Allélfrekvencia % ± 95% CI 12,3 ± 2,8 14,4 ± 3,2 14,4 ± 5,5 13,1 ± 5,3 15,6 ± 5,7 23,0 ± 8,4
Eredmények és megbeszélés
4.1.3. A vasparaméterek alakulása a véradó csoportokban A különböző C282Y genotípusú egyének vasparamétereinek összehasonlítása céljából meghatároztuk az első véradók (korábbi véradások száma: 0-1; n=101) vasparamétereit (szérum vas, szérum ferritin, transzferrin szaturáció), mivel ezeknél a személyeknél a rendszeres véradás nem befolyásolta a vasháztartást. A 65 azonosított C282Y-heterozigóta egyén közül 40 fő esetében állt rendelkezésünkre szérum minta. A 40 C282Y-heterozigóta egyénhez hasonlítva 2 vagy 3 nemben, korban és korábbi véradási
számban
egyeztetett
normál
genotípusú
egyén
vasparamétereit
is
meghatároztuk. A nemek aránya (női véradók aránya 38% a heterozigóta és 33% a normál genotípusú csoportban), az átlag életkor (38,6±13,1 év; tartomány: 18-65 vs. 37,1±12,1 év; tartomány: 20-63) és a korábbi véradások száma (18,9±19,0; tartomány: 0-83 vs. 17,4±18,0; tartomány: 0-94) nem tért el szignifikánsan az utóbbi módon kiválasztott C282Y-heterozigóta és a normál genotípusú csoport között. 5. táblázat: Vasparaméterek (átlag±SD) a C282Y-homozigóta, heterozigóta és a normál genotípusú első véradóknál (korábbi véradások száma: 0-1). C282Y genotípus
A vizsgált személyek száma
Szérum vas (µmol/l)
Transzferrin szaturáció (%)
Ferritin (µg/l)
Homozigóta
1
27,6
53,4
256,7
Heterozigóta
10
18,1±5,4
31,3±8,5
90,4±46,8
Normál
90
19,2±6,4
31,4±10,1
82,4±65,2
Referencia tartományok: szérum vas: 14-27 µmol/l, transzferrin szaturáció: 20-50%, ferritin: 20-200 µg/l.
6. táblázat: Vasparaméterek (átlag±SD) C282Y-heterozigóta és nemben, korban és korábbi véradások számában egyeztetett normál genotípusú véradóknál. C282Y genotípus
A vizsgált személyek száma
Szérum vas (µmol/l)
Transzferrin szaturáció (%)
Ferritin (µg/l)
Heterozigóta
40
18,2±6,4
31,9±10,6
73,1±64,8
Normál
109
19,2±6,4
31,4±10,1
82,4±65,2
Referencia tartományok: szérum vas: 14-27 µmol/l, transzferrin szaturáció: 20-50%, ferritin: 20-200 µg/l.
55
Eredmények és megbeszélés
Az első véradók csoportjában nem találtunk szignifikáns különbséget a vizsgált vasparaméterek alakulásában a C282Y-heterozigóta és a normál genotípusú egyének között (5. táblázat). Az azonosított C282Y-homozigóta, 21 éves első véradónál emelkedett szérum vas, szérum ferritin szintet és transzferrin szaturációt mutattunk ki (5. táblázat). A nemben, korban és korábbi véradási számban egyeztetett C282Y normál genotípusú személyek vasparaméterei nem tértek el szignifikánsan a C282Y heterozigóták vasparamétereitől (6. táblázat). Korábban számos tanulmány igazolta, hogy a C282Y-heterozigóta egyének vasparaméterei (főként a szérum vas szint és a transzferrin szaturáció) magasabbak a normál egyének értékeihez képest, de a legtöbb tanulmány nem véradó populációt vizsgált. A véradók közül az első véradók túl fiatalok (csoportunkban az első véradók átlag életkora 22 év), hogy a vasterhelés jeleit mutassák; míg az idősebb többszörös véradók vasparaméterei inkább a korábbi véradások számától, mint a HFE mutáció hordozástól függenek. A populációs vizsgálatoknál mindezek a problémák nem állnak fenn (140, 141), de a résztvevők vasparamétereit ezeknél a vizsgálatoknál is számos genetikai és környezeti tényező befolyásolja. Egy nagy populációs vizsgálat (n=3011) (140, 141) nem talált vasparaméter-eltérést a C282Y-heterozigóta illetve normál genotípusú egyének között, csak a kettős C282Y/H63D egyének vasparaméterei voltak szignifikánsan magasabbak. Egy egészségmegőrző klinika betegeinél végzett mutáció és vasparaméter szűrés szerint (n=10198) az egyszerű C282Y vagy H63D hordozói státusz csak kismértékben (de szignifikánsan) emeli a transzferrin szaturációt és a szérum ferritin szintet, míg a C282Y/H63D kettős heterozigótáknál jelentősebb mértékben emelkednek a vasparaméterek (139). A vashiányos anaemia gyakorisága mind az egyszerű, mind a kettős heterozigóta nők esetében alacsonyabb volt. A család és az iker tanulmányok résztvevői közelebb álló, akár megegyező genetikai állománnyal és gyakran hasonló környezeti faktorokkal (étkezési szokások) rendelkeznek. Egy nagyszámú résztvevővel végzett iker tanulmány szerint (62) a HFE C282Y és H63D mutációinak szerepe a vasparaméter eltérések kialakulásában nem haladja meg az összes tényező által kiváltott hatás 5%-át. A szérum ferritin szint fenotípusos eltérésének további 45%-áért és a transzferrin szaturáció további 30%-áért egyéb ismeretlen gének mutációi a felelősek. A fenotípusos eltérések fennmaradó 50%-áért pedig nem genetikai, hanem környezeti faktorok a felelősek. A véradó csoportban
56
Eredmények és megbeszélés
végzett vasparaméter vizsgálataink eredménye a fenti irodalmi adatokhoz hasonlóan azt sugallják, hogy a vizsgált vasparaméterek értékei (szérum vas, ferritin, transzferrin szaturáció) kisebb mértékben függnek a C282Y mutáció státusztól, mint egyéb genetikai vagy környezeti (étkezési szokások, rendszeres véradás) tényezőktől.
4.1.4. C282Y és H63D allél-frekvenciák és vasparaméterek a haemochromatosis klinikai gyanújával vizsgált betegcsoportban Az emelkedett vasparaméterek miatt vizsgált betegeknél a C282Y és a H63D mutációk kimutatása egy nem invazív módszer, amely segítheti a haemochromatosis differenciál diagnosztikáját. A magyar populációban talált HFE allél-frekvenciák egyértelműen jelzik, hogy Magyarországon a többi európai országhoz hasonlóan magas öröklődő haemochromatosis gyakorisággal kell számolnunk. A kapott allél-frekvenciák alapján minden hétszázadik (450-1050) személy C282Y homozigóta Magyarországon, azaz fogékony a vasfelhalmozódásra. 464 haemochromatosis klinikai gyanúja miatt vizsgált egyénnél végeztünk C282Y mutáció-kimutatást, és az azonosított 54 C282Y-heterozigóta egyénnél H63D mutáció analízist. 28 C282Y-homozigóta és 21 C282Y/H63D kettős heterozigóta egyént azonosítottunk (3. táblázat). A 28 azonosított homozigóta genotípusú egyén közül 18 esetben (7. táblázat), a 21 kettős heterozigóta egyén közül 11 esetben álltak rendelkezésünkre klinikai adatok (8. táblázat). A C282Y-homozigóta férfiak 78%-ánál májérintettség, 44%-ánál cirrhosis volt kimutatható. Nőknél májérintettség csak a betegek 60%-ánál volt észlelhető, cirrhosis nem fordult elő. A C282Y-homozigóta csoportban, 11 esetben készült májbiopszia, a hisztológiai kép minden esetben haemochromatosist igazolt. A C282Y-homozigóta betegek szérum vas szintje az esetek 80%-ában (átlag±SD: 35±9 µmol/l), szérum ferritin szintje a betegek 71%-ánál (1503±2260 µg/l) transzferrin szaturációja pedig a betegek 88%-ánál (70±20%) volt kórosan emelkedett. A kettős heterozigóta betegek 60%-ánál HH szempontjából pozitív családi anamnézis miatt, és 40%-ánál véletlenszerűen, egyéb klinikai tünetek kivizsgálása során észlelt emelkedett szérum vas szint miatt kérték a genetikai vizsgálatot. Enyhe májenzim emelkedés a betegek 20%-ánál volt megfigyelhető. A szérum vas szint a kettős heterozigóta betegek 40%-ánál (29±9 µmol/l), a szérum
57
Eredmények és megbeszélés
ferritin szint 36%-ánál (254±344 µg/l) és a transzferrin szaturáció 18%-ánál (40±20%) volt emelkedett. (A referencia tartományokat lásd a 7. táblázatnál.) Két fiatal, panaszmentes homozigóta nőnél (7. táblázat 12. és 14. beteg) rutinszerű szűrővizsgálaton észlelt szérum vas szint emelkedés vetette fel a kezelőorvosban a haemochromatosis gyanúját. Sem a ferritin szint, sem a transzferrin szaturáció nem volt a kóros tartományban, és májérintettségre utaló klinikai jel sem volt. A többi esetben is jól megfigyelhető a nők körében az enyhébb fokú szervi érintettség a hasonló korú férfiakhoz képest. Vizsgálataink során találtunk olyan fiatal, HFE C282Y mutációját nem hordozó haemochromatosisban szenvedő beteget, akinél a klinikai kép (emelkedett vasparaméterek, kardiális funkció-zavar, bőrpigmentáció, csökkent mellékvesekéreg funkció) alapján felmerült a juvenilis haemochromatosis vagy más autoszomális recesszív módon öröklődő HH lehetősége (9. táblázat). A beteg szüleinél és húgánál fokozott vaslerakódás nem volt igazolható, amely az autoszomális domináns módon öröklődő 4-es típusú HH jelenléte ellen szól. A beteg hypadreniájának hátterében HIV, tuberkulózis, szarkoidózis, autoimmun betegség jelenléte kizárható volt. A haemochromatosis klinikai gyanúja miatt vizsgált 464 beteg között 28 (6%) C282Y homozigótát azonosítottunk. Irodalmi adatok szerint a HH diagnosztikai kritériumait teljesítő betegek körében 64-100% a C282Y-homozigóta betegek aránya (27). A legtöbb kért vizsgálatnál részletes klinikai adatok nem álltak rendelkezésünkre, így nem tudjuk megítélni, hogy a kért vizsgálatok hány százalékában volt megalapozott a DNS-vizsgálat indikációja. Gyakran ismert, másodlagos vaslerakódáshoz vezető faktorok mellett (alkoholfogyasztás, vírusos hepatitis, többszörös transzfúziók stb.) az öröklődő haemochromatosis társulásának kizárása volt a DNS-vizsgálat célja. Feltételezzük, hogy vizsgált betegeink nagy részében ismert, vagy még felderítetlen szekunder faktorok, míg kisebb részükben egyéb genetikai faktorok állhattak az emelkedett vasparaméterek és a vasfelhalmozódás hátterében. Mivel a vizsgált betegcsoport klinikailag nem homogén, így az összehasonlító statisztikai próbák elvégzése nem indokolt.
58
Eredmények és megbeszélés
7. táblázat: C282Y mutációra nézve homozigóta személyek klinikai adatai. Sor-
Nem Kor Diagnóziskor fennálló se Fe Ferritin TS AST/ALT
szám
Máj-
(év)
Tünetek
(µmol/l)
(µg/l)
(%)
(U/l)
biopszia
1.
Ffi
20
Panaszmentes, pozitív családi anamnézis
17
169
31
23/42
n.k.
2.
Ffi
24
Fáradékonyság
30
617
78
23/29
poz.
3.
Ffi
34
Fáradékonyság, hepatomegalia, arthropathia
43
-
70
47/95
poz.
4.
Ffi
37
Hepatomegalia
43
-
77
31/35
poz.
5.
Ffi
54
Cirrhosis, IGT
49
8000
115
65/86
poz.
6.
Ffi
55
Májenzimeltérések
41
312
98
29/55
n.k.
7.
Ffi
58
Cirrhosis, arthropathia, IGT, bőrpigmentáció
34
-
74
68/59
poz.
8.
Ffi
61
Cirrhosis
26
3000
97
43/41
poz.
9.
Ffi
66
Cirrhosis, DM
23
4330
47
170/200
poz.
10.
Nő
14
Fáradékonyság
35
219
35/30
n.k.
11.
Nő
21
Fáradékonyság
44
142
71
18/10
n.k
12.
Nő
25
Panaszmentes
35
164
47
20/17
n.k.
13.
Nő
26
-
-
-
-
-
poz.
14.
Nő
27
Panaszmentes
32
20
46
28/-
n.k.
15.
Nő
43
Panaszmentes
-
370
68
-
poz.
16.
Nő
47
Hepatomegalia
-
840
74
-
poz.
17.
Nő
61
Hepatomegalia, arthropathia
35
808
74
68/85
n.k.
18.
Nő
70
Arthropathia
34
2050
71
42/53
poz.
Rövidítések: ffi: férfi, se Fe: szérum vas, TS: transzferrin szaturáció, IGT: impaired glucose tolerance (csökkent glükóz tolerancia), DM: diabetes mellitus, n.k.: nem készült, poz.: pozitív. Referencia tartományok: se Fe: 14-27 µmol/l, szérum ferritin: 20-200 µg/l, TS: 20-55%, AST: 5-35 U/l, ALT: 5-40 U/l. (A vastagon szedett számok kóros értékeket jeleznek.)
59
Eredmények és megbeszélés
8. táblázat: C282Y/H63D kettős heterozigóta egyének klinikai adatai. Sor-
Nem Kor Diagnóziskor fennálló se Fe Ferritin TS AST/ALT
szám
(év)
Tünetek
Máj-
(µmol/l)
(µg/l)
(%)
(U/l)
biopszia
1.
ffi
20
Se Fe emelkedés
46
72
93
17/20
n.k.
2.
ffi
32
Poz. családi anamnézis
18
115
33
40/68
n.k.
3.
ffi
32
Poz. családi anamnézis
28
42
21
20/21
n.k.
4.
ffi
56
Poz. családi anamnézis
24
409
42
21/19
n.k.
5.
ffi
63
Myelodysplasiás szindróma
43
1230
64
28/44
n.k.
6.
nő
22
Se Fe emelkedés, allergia
26
31
41
25/24
n.k.
7.
nő
28
Poz. családi anamnézis
15
152
29
17/19
n.k
8.
nő
30
Poz. családi anamnézis
29
52
49
14/13
n.k.
9.
nő
40
Se Fe emelkedés, kardiális érintettség
-
151
-
21/22
n.k.
10.
nő
52
Poz. családi anamnézis
29
256
37
22/22
n.k.
11.
nő
59
Se Fe emelkedés
24
287
29
35/23
poz.
Rövidítések: ffi: férfi, seFe: szérum vas, TS: transzferrin szaturáció, IGT: impaired glucose tolerance (csökkent glükóz tolerancia), DM: diabetes mellitus, n.k.: nem készült, poz.: pozitív. Referencia tartományok: seFe: 14-27 µmol/l, szérum ferritin: 20-200 µg/l, TS: 20-55%, AST: 5-35 U/l, ALT: 5-40 U/l. (A vastagon szedett számok kóros értékeket jeleznek.)
9. táblázat: A HFE C282Y mutációjára negatív, fiatal, haemochromatosisban szenvedő betegünk adatai. Sor- Nem Kor Diagnóziskor fennálló se Fe Ferritin TS AST/ALT Máj(év) (%) (U/l) (µmol/l) (µg/l) szám Tünetek MRI 1. ffi 25 Hypadrenia, normál 40 1980 84 normál bőrpigmentáció, kardiális érintettség Rövidítések és referencia tartományok: lásd a 8. táblázatnál. MRI (mágneses rezonancia imaging): nem invazív képalkotó eljárás, amely alkalmas a nagy mennyiségű vas lerakódás jelenlétének kimutatására.
A magas C282Y allél-frekvencia az egészséges populációban és a kevés magyar diagnosztizált beteg közötti ellentmondás többféleképpen magyarázható. A gyakorló orvosok a haemochromatosist egyrészt eddig ritka betegségnek tartották és a specifikus tünetek hiánya miatt ritkán diagnosztizálták. A haemochromatosis jelentőségének
60
Eredmények és megbeszélés
felismerése csak az elmúlt évtizedben történt meg. Adams és mtsai egy 1997-s tanulmányában (142) 410 olyan primer haemochromatosisban szenvedő beteg klinikai tüneteit foglalja össze, akiknél a diagnózist 1962 és 1995 közötti időszakban állították fel. A betegek 51%-át az utolsó 5 év folyamán fedezték fel. A másik lehetséges magyarázat szerint a homozigóta C282Y mutáció penetranciája alacsony, azaz nem minden homozigóta egyénnél alakul ki a haemochromatosis klinikai képe. Az irodalomban eddig több olyan C282Y-homozigóta esetet is leírtak, akik nem mutatták a vastelítettség jeleit akár 70 éves korukig (143). A genotípus részleges (inkomplett) penetranciájára számos magyarázat lehetséges: krónikus vérveszteség (női nem, okkult vérzések, rendszeres véradás), vasfelszívódási zavarok (coeliakia és egyéb vékonybélbetegségek) vagy egyéb genetikai faktorok. A HFE gén C282Y-homozigóta genotípusának penetranciájáról az irodalmi adatok ellentmondásosak. Néhány évvel ezelőtt még a C282Y mutáció közel 100%-os penetranciáját valószínűsítették (144), jelenleg különböző populációs és családvizsgálatok adatai a C282Y mutáció penetranciáját 1% alá (145, 146, 147) vagy 10-25% közé teszik (148, 149). A HFE gén másik gyakori pontmutációjának (hisztidin-aszpartát csere a 63. aminosavban, H63D) penetranciája, még kettős C282Y/H63D heterozigótaság esetén is, jóval alacsonyabb, mint a C282Y-homozigóta genotípusé.
4.1.5. A HFE mutációi myelodysplasiás szindrómában Az HH gén klónozása lehetőséget nyújtott a heterozigóták kiszűrésére az átlagpopulációból. Ma már igazolt, hogy a heterozigóta genotípus is hajlamosíthat különböző multifaktoriális eredetű kórképek kialakulására [pl. porphyria cutanea tarda (150,
151)
vagy
nem-alkoholos
steatohepatitis
kialakulására
(152)].
Egyéb
vasfelhalmozódáshoz vezető faktorok (pl. társuló dyserythropoetikus anaemia) jelenlétében a heterozigóták fokozott, akár progresszív szervkárosodáshoz vezető vasfelhalmozódást is mutathatnak (153). Vizsgálataink célja ennek megfelelően a C282Y
és
a
H63D
allél-frekvenciák
megállapítása
volt
az
emelkedett
vasparaméterekkel járó myelodysplasiában. 50 myelodysplasiás szindrómában (MDS) szenvedő beteg C282Y és H63D mutáció analízise során 1 C282Y/H63D kettős heterozigóta, 4 C282Y-heterozigóta, 20 H63D
61
Eredmények és megbeszélés
heterozigóta és 1 H63D homozigóta egyént azonosítottunk. A C282Y allél-frekvenciája 5,0±4,4% (3. táblázat). A H63D allél-frekvenciája 23,0±8,4% (4. táblázat). A C282Y mutációt hordozó személyek aránya nem különbözik az MDS-ben szenvedő betegek és az első véradók csoportjában (Fischer-féle exact teszt: p=0,504; OR=1,67 [0,46-6,16]). A H63D mutációt hordozó személyek aránya a MDS-ban szenvedő betegeknél (44%) magasabb volt, mint az első véradók csoportjában (26%). A különbség valószínűleg az alacsony esetszám miatt nem szignifikáns (p=0,055). Ugyanakkor az „Odd’s ratio” (kockázati hányados) számítás szerint a H63D mutáció hordozása rizikófaktor az MDS kialakulása szempontjából (OR: 2,20 [1,04-4,66]). Ha a C282Y és a H63D mutációk együttes előfordulását vizsgáljuk a két csoportban, akkor azt találjuk, hogy a betegek 52%-a (26/50), míg a véradók csupán 31%-a (25/80) hordozza valamelyik HFEmutációt (p=0,042, OR: 2,25 [1,09-4,65]). Mindez arra utal, hogy a HFE gén mutációi akár heterozigóta formában is hozzájárulhatnak az MDS kialakulásához, illetve progressziójához. A vas a gyorsan proliferáló daganatos sejtek számára nélkülözhetetlen elem (154). Öröklődő haemochromatosisban szenvedő betegeknél és egyes tanulmányok szerint már heterozigóta hordozóknál is fokozott lehet egyes daganatos betegségek kialakulásának a kockázata (155). A vasfelesleg szabad oxigéngyökök keletkezését segíti elő, amelyek DNS és szövetkárosodást okoznak (156, 157). A vaslerakódás, és a HFE gén többlet vas felszívásra hajlamosító C282Y és H63D mutációi, szerepet játszhatnak az MDS patogenezisében is, gyorsíthatják a betegség lefolyását és elősegíthetik a leukémiás transzformációt. Grobois és mtsai 33 RARS-ban szenvedő beteget vizsgáltak a HFE C282Y és H63D mutációinak jelenléte szempontjából. A két mutáció összesített előfordulási gyakorisága tanulmányunkhoz hasonlóan 52% (17/33) volt (158). A vaslerakódás kezelése MDS-ben más vaslerakódással járó anaemiákhoz, pl. a thalassemia kezeléséhez hasonlóan vas-kelátor vegyületekkel (desferoxamin) történik. 36 többszörösen transzfundált MDS-ben szenvedő beteg desferoxamin kezelésekor Rose és mtsai 47%-os átlagos 10 éves túlélést talált, annak ellenére, hogy a desferoxamin kezeléseket a diagnózis felállítása után átlagosan 28 hónappal és az első transzfúzió után átlagosan 17 hónappal kezdték (159). Feltételezhetően a vas-kelátor vegyületek korai alkalmazásával a betegség progressziója is lassítható.
62
Eredmények és megbeszélés
4.2. A haemophilia A molekuláris genetikai vizsgálata 4.2.1. Diagnosztikai algoritmus A „Haemophilia A molekuláris genetikai diagnosztikai és prevenciós programja” az OGYK Haematológiai és Immunológiai Intézet és az MTA SZBK Enzimológiai Intézet közreműködésével 1995-ben indult. A diagnosztikai stratégia kidolgozását és az indirekt marker analízis módszereinek a beállítását dr. Klein Izabella Dr. Váradi András irányítása alatt végezte. A programba 1998-ban kapcsolódtam be és feladatom a géninverzió kimutatására alkalmas Southern blot technika beállítása és rutinszerű alkalmazása volt. Később inverzió kimutatására szolgáló alternatív módszerként beállítottuk dr. Klein Izabellával a hosszú PCR technikát, amellyel az azonosított Southern blot variánsokat is jellemeztük. Az indirekt marker analízis folyamatos elérhetőségét az érintett családok számára Bors András biztosította. Mivel a direkt és az indirekt vizsgálatokat több személy végezte, elengedhetetlen volt egy egységes számítógépes adatbank létrehozása, amelyben a vizsgálatok eredménye visszakereshető, valamint az elvégzett vizsgálatok száma, informativitási aránya gyorsan és naprakészen számolható. Az indirekt markerek alkalmazásánál feladatom a vizsgálati eredmények dokumentációjának egységesítése és a számítógépes adatfeldolgozás volt. A súlyos HA-ban szenvedő betegek 40-50%-ánál a 22. intron inverzió, és 3-5%-ánál az 1. intron inverzió áll a betegség hátterében. Stratégiánk szerint az érintett családokban első lépésként direkt mutáció elemzést végzünk Southern blot módszerrel, hogy igazoljuk vagy kizárjuk a 22. intron inverzió jelenlétét. Ezt követően a 22. intron inverzió negatív, súlyos HA-betegeknél az 1. intron inverzió jelenlétét PCR technikával vizsgáljuk. A mindkét inverzióra nézve negatív súlyos HA által érintett családokban, valamint a középsúlyos és az enyhe HA-családokban indirekt módszereket alkalmazunk (9. ábra). Programunk során olyan indirekt markerek beállítását végeztük el, amelyek kombinációjával a magyar HA családok több, mint 95%-ban biztonsággal tudunk hordozó és prenatális diagnosztikát biztosítani (2. táblázat). A markerek kiválasztásánál elsődleges szempont volt a magas informativitási arány, és a markerek kapcsoltságának elkerülése. Az intragenikus markerek alkalmazását előnyben részesítettük az extragenikus markerek alkalmazásához képest (10. ábra), mivel az intragenikus
63
Eredmények és megbeszélés
markereknél kisebb a marker és a betegségért felelős kóroki mutáció között bekövetkező rekombináció esélye (99). 9. ábra: Laboratóriumunkban használt diagnosztikai algoritmus a haemophilia A hordozó- és prenatális diagnosztikájában.
Az indirekt elemzések közül először a BclI PCR-RFLP vizsgálatát végezzük el, amely egy könnyen kivitelezhető, olcsó teszt. A BclI polimorfizmus a FVIII gén 18. intronjában található pontmutáció. Kétféle allélje lehetséges (bi-allélikus), az egyik tartalmazza a BclI restrikciós enzim hasítási helyet, a másik nem. Bár a PCR-RFLP meghatározások kivitelezése egyszerűbb a mikroszatelliták vizsgálatánál, további PCRRFLP tesztek (pl. BglI-, HindIII-PCR-RFLP) bevezetése a gyakori kapcsolt öröklődés miatt nem volt célszerű (lsd. 1.3.4.1. fejezet). A mikroszatellita elemzések a PCR-RFLP vizsgálatoknál informatívabbak (mivel multi-allélikusak), viszont a vizsgálat kivitelezése idő- és költség-igényesebb, valamint radioaktív izotóp felhasználását igényli. Amennyiben a BclI PCR-RFLP vizsgálat nem informatív, az intragenikus IVS13CA mikroszatellita elemzést végeztük el. Ez a mikroszatellita a gén 13. intronjában található dinukleotid (CA) „repeat” (ismétlődés). 8 allélikus variációja ismert, de az allélok eloszlása nem egyenletes, a leggyakoribb allélok frekvenciája 45 illetve 30%. Ez csökkenti annak az esélyét, hogy a marker heterozigóta, azaz informatív legyen egy konkrét esetben.
64
Eredmények és megbeszélés
10. ábra: A vizsgált polimorfizmusok elhelyezkedése a VIII. faktor génjéhez viszonyítva.
Rövidítések: C: centromer; T: telomer.
Ellentétben a direkt mutáció kimutatással, amely egyértelmű diagnózishoz vezet, az indirekt elemzéssel nyerhető információ mindig valószínűség jellegű, hiszen az addig egy kromoszómán öröklődő marker és mutáció rekombináció útján különböző kromoszómára kerülhetnek. Ez az esély azonban a két FVIII. génen belüli markernél a teljes genomra számított átlagos crossing over (rekombináció) gyakoriságot figyelembe véve kevesebb, mint 0,2% (160). Bár a leginformatívabb marker a p39CA (a 8 lehetséges alléljéből 5 allél-frekvenciája 21% és 12% között van, tehát egyenletes az eloszlása), mégis ezt a polimorfizmust elemezzük utoljára, mivel a FVIII génen kívül helyezkedik el, így a rekombináció valószínűsége a marker és a mutáció között nagyobb, bár még mindig kevesebb, mint 0,7% (118). Az általunk választott diagnosztikai stratégia eltér az általános gyakorlattól, amely szerint gyakran a 22. intronban levő XbaI illetve (CA)n polimorfizmusokat részesítik előnyben harmadik markerként a BclI és IVS13CA alkalmatlansága esetén. Az XbaI polimorfizmus hátránya, hogy a 22. intronban az inverziók kialakulásáért felelőssé tehető 9,5 kb homológ régión belül található. Az intronikus homológ régió polimorf a XbaI hasítóhely szempontjából, míg a két extragenikus homológ régióban az XbaI hasítóhely általában hiányzik. Az intragenikus XbaI marker kimutatására leírt hagyományos PCR primerek a homológ régión belül találhatóak (117), így az extragenikus homológ régiókat is amplifikálják. Mivel az extragenikus régiók nem emésztődnek XbaI RFLP-vel, a nők homozigóta illetve heterozigóta emésztett állapota nem különíthető el. Csak munkaigényes Southern blot technikával (161), és újabban
65
Eredmények és megbeszélés
hosszú PCR technikával (162) vizsgálható külön az intronikus XbaI hasítóhely. A szintén elterjedten alkalmazott IVS22CA marker 4-6 lehetséges alléllel rendelkezik, a polimorfizmus azonban gyakorlatilag bi-allélikus, mint egy PCR-RFLP, mert a két leggyakoribb allélje 67% illetve 30%-ban fordul elő és a számított heterozigóta gyakoriság 45% (105). Ahol a direkt mutáció elemzés negatív volt, vagy nem alkalmazható, az indirekt marker vizsgálatokat addig végeztük, amíg vagy mind a három használatára sor nem került, vagy legalább két informatív markert találtunk. Egy hordozónál mindhárom marker homozigóta formában fordult elő, nála egyéb indirekt markereket kell vizsgálnunk (XbaI vagy IVS22CA) vagy a direkt mutáció azonosítás módszerét kell választanunk. 4.2.2. A 22. intron inverzió kimutatása Southern blot módszerrel Az inverzió egy a FVIII. gén 22. intronjában található 9,5 kilobázis (kb) nagyságú régió és egy vele 99,9%-ban azonos extragenikus szekvencia (homológ régió) között jön létre, amelyből kettő (proximális és disztális) található a géntől telomerikusan (74). A homológ régió egy 0,9 kb nagyságú részét alkalmazva szondaként a 22. intron inverzió Southern blot technikával jól kimutatható: az intronikus és a két extragenikus homológ régiók normál esetben három jól elkülöníthető fragmentumot mutatnak az autoradiogrammon (21,5 kb, 16 kb és 14 kb) (11. ábra – „N” jelzésű sáv). Ezek közül a 21,5 kb fragmentum az intronikus, a 16 kb fragmentum a disztális extragenikus és a 14 kb fragmentum a proximális extragenikus homológ régiónak felel meg (4. ábra). Disztális inverzió esetén az intronikus és a disztális extragenikus homológ régió vesz részt az intrakromoszomális rekombinációban, ennek megfelelően az intronikus és a disztális extragenikus fragmentumok mérete módosul (20 kb, 17,5 kb, 14 kb). (11. ábra – „I1” jelzésű sáv). Proximális inverzió esetén az intronikus és a proximális extragenikus fragmentumok mérete módosul, míg a disztális homológ régió érintetlen marad (20 kb, 16 kb, 15,5 kb) (11. ábra – „I2” jelzésű sáv). Heterozigóta nők a normál és az inverziós mintázatot együttesen mutatják (10. ábra–„C1” sáv disztális, „C2” sáv proximális inverzió hordozó) (163).
66
Eredmények és megbeszélés
11. ábra: A FVIII 22. intron inverzió kimutatása Southern blot módszerrel.
Jelmagyarázat: N: normál; I1: 1-es típusú vagy disztális inverzió; I2: 2-es típusú vagy proximális inverzió; C1: 1-es típusú inverzió hordozó; C2: 2-es típusú inverzió hordozó; kb: kilobázis
Eddig 104 súlyos HA által érintett családból 191 személyt vizsgáltunk a 22. inverzió jelenléte szempontjából Southern blot módszerrel. 95 családban a beteg vizsgálata történt meg elsőként. Ha a beteg vizsgálata nem volt megoldható (9 családban), obligát (5 család) vagy sporadikus hordozókat (4 család) vizsgáltunk. Amennyiben a normáltól eltérő mintázatot észleltünk az autoradiogrammon, minden obligát és potenciális hordozót megvizsgáltunk a családban. A 104, egymással rokoni kapcsolatban nem álló családból 58 esetben (56%) találtunk a normáltól eltérő BclI hasítási mintázatot: 43 esetben disztális és 11 esetben proximális inverziót, 4 esetben atípusos RFLP mintázatot. A disztális és a proximális inverzió gyakorisága és egymáshoz viszonyított arányuk (80% illetve 20%) megfelelnek az irodalmi adatoknak (10. táblázat). 52 esetben igényeltek a beteg családjában hordozó vagy prenatális diagnosztikát, közülük 32 családban állt az inverzió a betegség hátterében. A 32 családból 10 potenciális hordozónál igazoltuk és 22-nél kizártuk a hordozói státuszt. A 10 diagnosztizált hordozó mellett további 16 obligát és 12 sporadikus hordozónál mutattunk ki inverziót. A 9 családból, ahol a HA-ban szenvedő beteg nem volt vizsgálható, 6 családnál azonosítottunk inverziót. 5 fiú magzat esetén adtunk ki prenatális diagnózist inverzió kimutatással.
67
Eredmények és megbeszélés
10. táblázat: A FVIII gén 22. inverzió irodalmi előfordulási gyakorisága súlyos HA-ban szenvedő betegeknél. Szerző
Vizsgált populáció FVIII intron 22 génátrendeződés (Betegek száma) Disztális Proximális Variáns n (%) n (%) n (%)
Antonarakis (74) nemzetközi (n=2093) Arruda (119) brazil (n=21) . Bock (164) magyar (n=46) Dardik (165) izraeli (n=65) Gaucher (166). francia (n=80) Goodeve (76) angol (n=23) Jenkins (126). angol (n=85) . Ljung (167) svéd (n=49) . Poláková (168) szlovák (n=44) . Poon (169) kanadai (n=27) Schröder (170) német (n=165) Shetty (171) indiai (n=25) Strmecki (172). szlovén (n=39) Tizziano (173) spanyol (n=102) Weinmann (174) amerikai (n=110) Windsor (163) kanadai (n=71) Saját adatok magyar (n=104)
740 (82) 8 (62) 14 (70) 29 (91) 30 (79) 10 (91) 32 (78) 15 (68) 18 (82) 9 (75) 55 (85) 6 (67) 14 (74) 31 (74) 34 (69) 23 (72) 43 (74)
68
140 (15) 4 (31) 6 (30) 3 (9) 7 (18) 1 (9) 8 (20) 5 (23) 4 (18) 2 (17) 4 (6) 3 (33) 2 (11) 11 (26) 14 (29) 5 (16) 11 (19)
25 (3) 1 (7) 0 0 1 (3) 0 1 (2) 2 (9) 0 1 (8) 6 (9) 0 3 (15) 0 1 (2) 4 (13) 4 (7)
Összes n (%) 905 (43) 13 (62) 20 (43) 32 (49) 38 (48) 11 (48) 41 (48) 22 (45) 22 (50) 12 (44) 65 (40) 9 (36) 19 (51) 42 (41) 49 (45) 32 (45) 58 (56)
Eredmények és megbeszélés
4.2.3. A 22. intron inverzió kimutatása hosszú PCR módszerrel Az inverzió kimutatás egy alternatív módszere a Liu és mtsai által (121) leírt hosszú PCR (LD-PCR: long distance-PCR) technika. A módszer azon alapszik, hogy az inverzióban résztvevő két extragenikus kópia környezete hasonló, míg az intragenikus kópia környezete eltérő. Így az extragenikus kópiák és az intragenikus kópia a homológ régión kívül eső primer párokkal az elemzés során megkülönböztethető módon amplifikálható. A primerek távolsága a homológ régió szélétől meghatározza a PCR termék méretét. A P és Q primerek a 22. intronban a homológ régió (9,5 kb) szélétől 1,2 illetve 1,3 kilobázis távolságra helyezkednek el. Ennek megfelelően az általuk amplifikált P-Q PCR termék 12 kb (1,3 kb+9,5 kb+1,2 kb) lesz. Az A és B primerek az extragenikus homológ régiók szélétől 0,2 illetve 0,3 kb távolságra helyezkednek el, az A-B PCR termék 10 kb (0,3 kb+9,5 kb+0,2 kb) (12/a ábra). 12. ábra: A FVIII gén 22. intron inverzió kimutatása szolgáló LD-PCR elve (121). A) Az LD-PCR során alkalmazott primerek (P, Q, A és B) és távolságuk a homológ régiók szélétől. B) A PCR termékek várható mérete normál genotípusúaknál (N), inverzió-pozitív HA-betegeknél (I) és hordozó nőknél (C).
Jelmagyarázat: FVIII: a VIII. alvadási faktor génje; Kék téglalapok: homológ régiók; A1, A2, A3: intronikus, disztális illetve proximális homológ régiók; Vízszintes sávozású téglalap: a 22. intron homológ régión kívül eső része; Szürke téglalap: az extragenikus homológ régiókon kívül eső rész, amely megegyezik a disztális és a proximális homológ régió esetén. P, Q, A, B: hosszú PCR primerek; Pontozott vonal: lehetséges töréspont, amely a homológ régión belül bárhol elhelyezkedhet. Nyilak: a homológ régió mérete és primerek távolsága a homológ régiótól. kb: kilobázis.
Normál esetben a multiplex PCR-ben alkalmazott P, Q, A és B primerekkel egy 12 és egy 10 kb hosszúságú PCR terméket kapunk (12/b és 14/c ábrák – „N” jelzésű sáv). Inverzió esetén a P a B primerrel és az A a Q primerrel amplifikál egy-egy 11 kb PCR terméket (P-B: 1,3 kb+9,5 kb+0,2 kb és A-Q: 0,3 kb + 9,5 kb + 1,2 kb), valamint az ép
69
Eredmények és megbeszélés
extragenikus kópiáról egy 10 kb, A-B PCR termék keletkezik (12/b és 14/c ábrák – „I” és „I1” jelzésű sávok). Hordozóknál értelemszerűen 12, 11 és 10 kb nagyságú PCR termék egyaránt keletkezik (12/b és 14/c ábrák – „C” és „C1” jelzésű sávok). Az LDPCR technikával az inverzió típusa (proximális vagy disztális) nem állapítható meg.
4.2.4. Az 1. intron inverzió kimutatása A FVIII gén 1. intron inverzió kimutatására szolgáló PCR technikát Bagnall és munkatársai dolgozták ki (79). A módszer elve hasonlít a 22. intron inverzió kimutatására szolgáló LD-PCR elvéhez, miszerint az intronikus és az extragenikus homológ régiók teljes hosszát és a környező szekvenciákat PCR technikával amplifikáljuk a homológ régión kívül elhelyezkedő primer párokkal. A kapott PCR termékek mérete eltér az ép intra- és extragenikus homológ régiók illetve az inverzióban résztvevő homológ régiók esetén. Az amplifikált régió hossza azonban ez esetben nem haladja meg a 2 kilobázist, így a hagyományos PCR technika alkalmazható. Az 1. intron inverzió kimutatásakor alkalmazott primerek közül a 9F és a 9cR primerek amplifikálják az intronikus (1. intronban található) és az Int1h-2F illetve az Int1h-2R primerek az extragenikus 1041 bp hosszúságú homológ régiót. A mintákat kétféle primer kombináció alkalmazásával amplifikáltuk: I. mix: 9F, 9cR és Int1h-2F; valamint II. mix: Int1h-2F, Int1h-2R és 9F primerekkel. Ép X kromoszómáról a 9F és a 9cR primerek egy 1908 bp-os (az I. mixben), az Int1h-2F és az Int1h-2R primerek (a II. mixben) egy 1190 bp-os PCR terméket amplifikálnak. 1. intron inverzió esetén az Int1h-2F és a 9cR primerek egy 1321 bp-os (az I. mixben), a 9F és az Int1h-2R primerek egy 1776 bp-os (a II. mixben) PCR terméket amplifikálnak. A 22. intron inverzióra nézve negatív, súlyos HA-ban szenvedő betegek (n=43) vizsgálata során nem találtunk 1. intron inverziót. Feltételezhetően az 58, 22. intront inverziót vagy más nagyméretű génátrendeződést hordozó egyén sem pozitív az 1. intron inverzióra. Ezek szerint az 1. intron inverzió gyakorisága 1% alatt van Magyarországon a súlyos HA-ban szenvedő betegek között.
70
Eredmények és megbeszélés
13. ábra: Az 1. intron inverzió kimutatása PCR technikával. A PCR terméket agaróz gélelektroforézis után etidium-bromid festéssel tettük láthatóvá. A PCR termékek mérete az I. mixben (9F, 9cR és Int1h-2F primerek alkalmazásakor) 1908 bp ép X kromoszóma vagy 1321 bp 1. intron inverziót hordozó X kromoszóma esetén; a II. mixben (Int1h-2F, Int1h-2R és 9F primerekkel) 1190 bp ép X kromoszóma vagy 1776 bp 1. intron inverziót hordozó X kromoszóma esetén. A bemutatott minták 1. intron inverzióra nézve negatívak.
Jelmagyarázat: I.: I. mix, II.: II. mix alkalmazása, 1: normál egyén, 2: súlyos HA-ban szenvedő beteg, dH2O: negatív kontroll; M100: marker (GeneRulerTM 100bp DNA Ladder, Fermentas, SM0241), Mλ: marker (λ DNA/HindIII marker, Fermentas, SM0101)
4.2.5. A ritka, 22. intront érintő VIII. faktor génátrendeződések vizsgálata A 104 vizsgált súlyos HA-ban szenvedő családból 4 esetben ritka, a normál és a disztális illetve a proximális inverzióra jellemző mintázattól eltérő képet kaptunk a Southern blot vizsgálat során. A kóros Southern mintázat hátterében álló molekuláris eltérés felderítéséhez az érintett betegeknél további vizsgálatokat (hosszú PCR-t, FVIII gén 14., 16., 22., 23. és 26. exonjaira specifikus PCR-t) végeztünk. Az alábbiakban a négy eset rövid ismertetését adom meg.
4.2.5.1. Esetismertetések 1. eset: Az 5 éves súlyos HA-ban szenvedő fiú anyai nagyapja szintén HA-ban szenvedett. Anamnézisében FVIII ellenes antitest (inhibitor) megjelenése nem szerepelt. A Southern blot analízis során az intronikus homológ régiót megjelenítő 21,5 kb fragmentum hiányzott, míg az extragenikus régiókat megjelenítő 16 és 14 kb fragmentumok épnek mutatkoztak (14/a ábra –„V1” jelzésű sáv). Az LD-PCR során csak az A és a B primerekkel kaptunk egy 10 kb terméket, a P és a Q primerekkel nem kaptunk PCR terméket (14/c ábra –„V1” jelzésű sáv). A 14., 16., 22., 23. és 26. exonok specifikus amplifikálásakor egy 16. exontól a 22. exonig terjedő deléciót találtunk, a 14., 23. és 26. exonok épnek bizonyultak (a 22-23. exonok amplifikációját lsd. a 14/b ábrán).
71
Eredmények és megbeszélés
2. eset: A 18 éves férfi családi anamnézise familiáris HA-ra utalt, anyai nagyanyjának testvére HA-ban szenvedett. Anamnézisében magas titerű inhibitor képződés szerepelt. Southern blot vizsgálattal egy 16,5, 16 és 14 kb nagyságú, egyenlő intenzitású fragmentumokból álló mintázatot kaptunk a betegnél és kombinált mintázatot (21,5, 16,5, 16, 14 kb) édesanyjánál (14/a. ábra –„CV2” jelzésű sáv). Az LDPCR során az 1. beteghez hasonlóan csak az A és a B primerekkel kaptunk egy 10 kb méretű terméket, a P és a Q primerekkel nem kaptunk PCR terméket. A 14., 16., 22., 23. és 26. exonok specifikus amplifikálásakor a 23. és a 26. exonokat érintő deléciót találtunk, a 14., 16. és 22. exonok épnek tűntek (a 22-23. exonok amplifikációját lsd. a 14/b ábrán –„V2” jelzésű sáv). 3. eset: A 48 éves súlyos HA-ban szenvedő betegnek fiútestvérén kívül nem volt más HA-ban szenvedő beteg a családjában. Inhibitor képződés anamnézisében nem szerepelt. Southern blot vizsgálattal egy 20, 17, 16 és 14 kb nagyságú, egyenlő intenzitású fragmentumokból álló mintázatot kaptunk a betegnél (14/a ábra –„V3” jelzésű sáv) és kombinált mintázatot (21.5, 20, 17, 16, 14 kb) a lányánál. Multiplex LDPCR-rel (a P, a Q, az A és a B primerek együttes alkalmazásával) a hordozókhoz hasonlóan három PCR terméket kaptunk, amelyek egymáshoz viszonyított intenzitása eltért a hordozóknál észlelttől (14/c ábra –„V3” jelzésű sáv). A PCR termékek eredetét a különböző primer pár kombinációkkal történő amplifikálások során tisztáztuk: a betegnél a P és a Q primerek egy 12 kb (14/d ábra), az A és a B primerek egy 10 kb és a P és a B primerek egy 11 kb PCR terméket amplifikáltak, míg az A és a Q primerekkel nem kaptunk PCR terméket. Az exon-specifikus amplifikációk ép kódoló régiót igazoltak (a 22-23. exonok amplifikációját lsd. a 14/b ábrán –„V3” jelzésű sáv). 4. eset: A 17 éves súlyos HA-ban szenvedő beteg anyai nagyapja szintén vérzékeny volt. Southern blot analízissel egy 21,5, 20, 16 és 14 kb nagyságú, hasonló intenzitású fragmentumokból álló mintázatot kaptunk a betegnél (14/a ábra – „V4” jelzésű sáv). LD-PCR-rel a 3. esethez hasonlóan három PCR terméket kaptunk (14/c ábra – „V4” jelzésű sáv), amelyek szintén a P-Q (14/d ábra – „V4” jelzésű sáv), a P-B és az A-B PCR termékeknek feleltek meg. Az A és a Q primerekkel ebben az esetben sem kaptunk PCR terméket. A korábban ismertetett exon specifikus amplifikációk ebben az esetben is ép kódoló régiót jellemeztek (a 22-23. exonok amplifikációját lsd. a 14/b ábrán –
72
Eredmények és megbeszélés
„V4” jelzésű sáv). A négy beteg közül egyik sem volt pozitív az 1. intron inverzióra nézve. 14. ábra: A ritka, 22. intront érintő VIII. faktor génátrendeződések vizsgálata Southern blot technikával (A panel), a FVIII gén 22. és 23. exonjaira specifikus PCR-rel (B), multiplex LD-PCR-rel P, Q, A és B primerekkel (C), és LD-PCR-rel P és Q primerekkel (D). A panel: Variáns mintázatok BclI-RFLP során. A Southern blot analízis során radioaktívan jelölt szondaként a homológ régió egy 0,9 kb fragmentumát használtuk, a képen az autoradiogram látható. B panel: A FVIII gén 22. és 23. exonjainak PCR amplifikációja. A PCR terméket agaróz gélelektroforézis után etidium-bromid festéssel tettük láthatóvá. A termékek mérete: 288 bp a 22. exon és 214 bp a 23. exon esetében. C panel: Az intronikus és az extragenikus régiókat két primerpárral (PQ és AB) egyszerre végzett LDPCR technikával amplifikáltuk. A PCR termékeket agaróz gélelektroforézissel választottuk el egymástól. D panel: Az ép intronikus homológ régió amplifikálása LD-PCR technikával P és Q primerekkel. Inverzió esetén HA betegeknél (I1) nem keletkezik PCR termék. Hordozóknál (C1) a 12 kb-os PCR termék az ép X kromoszómáról keletkezik.
Jelmagyarázat: N: normál, I1: 1-es típusú vagy disztális inverzió, C1: 1-es típusú inverzió hordozó; V1, V2, V3, V4: 1., 2., 3. és 4. betegünknél talált mintázatok. (C panel: A 2. betegünk V1-gyel megegyező mintázatot mutatott az LD-PCR során.) M: 288 és 181 bp méretű marker; M*: 222 bp méretű marker, • M : 1 kb marker létra. A fragmensek hossza illetve a PCR termékek mérete kilobázisban (kb) és bázispárban (bp) az ábrák oldalán jelölve.
Az 1-es és a 2-es típusú inverziótól eltérő, BclI hasítási mintázatok előfordulási gyakoriságát egy nagy nemzetközi tanulmány 1,2%-nak találta (74). A ritka BclI hasítási mintázatok 40%-a az ún. 3A vagy 3B típusú inverziók (4/b ábra) közé tartozott, míg a ritka variánsok további 60%-át nem jellemezték. Saját anyagunkban a 104 súlyos
73
Eredmények és megbeszélés
HA beteg között 4 (3,8%) ritka, BclI hasítási hely variánst találtunk. Ez a gyakoriság magasabb, mint a nemzetközi tanulmányban leírt előfordulási gyakoriság (p=0,056), inkább a Windsor és mtsai (163) és a Schröder és mtsai (170) által leírt előfordulási gyakorisági adatokhoz hasonló. Az irodalomban ismertetett, 1-3-as típusú inverzióknak nem megfelelő BclI restrikciós mintázatok felsorolását a 11. táblázat tartalmazza. 11. táblázat: Az 1-3-as típusú inverzióktól eltérő BclI restrikciós mintázatok. BclI restrikciós fragmensek mérete (kb) Szerző 16, 14
Schröder (170), Weinmann (174), 1. eset
16, 15.5
Windsor (163)
16, 15.5, 14
Enayat (175), Schröder (170)
16.5, 16,14
2. eset
17.5, 14
Poon (169)
17.5, 16, 14∗, 12∗∗
Naylor (75)
17.5, 16, 14
Yamazaki (176)
17.5, 16, 15.5, 14
Schröder (170)
19,17,16,14
Weinmann (174)
20
Schröder (170)
20, 17.5, 14 + egy rövid fragmens
Ljung (167)
20, 17, 16, 14
3. eset
21.5, 16, 15.5, 14
Windsor (163)
21.5, 16, 6.5
Strmecki (172)
21.5, 20, 16, 14
Arruda (119), Windsor (163), 4. eset
21.5, 20, 17.5, 14
Enayat (177)
22, 16, 15, 14
Ljung (167)
22, 21, 16, 14
Strmecki (172)
Jelmagyarázat: ∗A restrikciós fragmens intenzitása kétszerese volt a többi fragmenséhez képest. ∗∗ A restrikciós fragmenst a p482,6 plazmidból EcoRI/SacI restrikciós enzimekkel kihasított 0,9 kb szonda nem detektálta, a homológ régió egy másik szakaszára tervezett szonda viszont igen. kb: kilobázis. (A vastagon szedett BclI restrikciós mintázatok a saját anyagunkban vizsgált betegek mintázata.)
74
Eredmények és megbeszélés
4.2.5.2. Deléciós variánsok jellemzése Két súlyos HA-ban szenvedő betegünknél az eltérő Southern blot mintázat hátterében a FVIII gén 22. intronja homológ régióját érintő, nagyméretű deléció jelenlétét igazoltuk. Az 1. esetben a deléció a 16-22. exonokat és a 22. intront (feltehetőleg a hibridizációs szonda komplementer régióját is) egyaránt érintette. Hasonló BclI hasítási mintázatot Southern blot analíziskor korábban más szerzők is leírtak (11. táblázat). Érdekes, hogy mindkét korábban ismertetett esetben a deléció a 16-22. exonokat érintette a mi esetünkhöz hasonlóan. A beteg édesanyjának és húgának DNS mintáinak Southern blot analízisekor az intronikus fragmentum (21,5 kb) halványabbnak mutatkozott az autoradiogrammon. A Southern blot technika ugyanakkor nem egy kvantitatív módszer és elméletileg nem alkalmas hordozó diagnosztikára, amennyiben a deléció nem okoz a fragmensek méretében változást. Hosszú PCR technikával az anya és a lánytestvér DNS mintájának vizsgálatakor normál mintázatot kaptunk. Jelenleg a beteg családjában a laboratóriumunkban alkalmazott módszerekkel (Southern blot, hosszú PCR) csak prenatális diagnosztikát tudunk biztosítani, hordozó diagnosztikát nem. Lavergne és mtsai (178) leírtak egy „real-time” kvantitatív PCR technikát, amellyel az allélek egymáshoz viszonyított aránya meghatározható, és a hordozók a deléciós családokban azonosíthatóak. Alternatív PCR technikák, az egyes családokra jellemző deléciós töréspontra specifikusan tervezett és azokon kívül felvett primer pár segítségével szintén azonosíthatjuk a hordozókat a deléciós családban, ehhez azonban a deléciós töréspontok részletesebb jellemzése szükséges. A 2. betegnél talált BclI hasítási mintázat (16,5 kb, 16 kb és 14 kb fragmentumok) először a normál 21,5 kb-os normál intragenikus fragmensben található szám feletti (extra) BclI hasítási hely jelenlétét vetette fel. Az irodalomban egyetlen egy BclI hasítási variánst ismertettek ez idáig, amelyet egy HA által érintett család egészséges tagjainál írtak le (179). Exon amplifikációkkal és LD-PCR-rel azonban a ritka hasítási mintázat hátterében szintén egy nagyméretű deléció jelenléte igazolódott, amely a 22. intront és a 23-26. exonokat érinti. Hasonló BclI Southern blot hasítási mintázatot korábban nem írtak le. A HA mutációs adatbázisban két 23-26 exonokat érintő deléció szerepel, ezeket a betegeket azonban még a géninverzió azonosítása előtt írták le, és feltehetőleg nem vizsgálták BclI Southern blottal és az F8A génre komplementer
75
Eredmények és megbeszélés
szondával (180). Saját vizsgálataink során a beteg családjából 4 nőnél kizártuk, és 4 nőnél megerősítettük a hordozói státuszt Southern blot analízissel. A hosszú PCR analízis a hordozó nőknél normál mintázatot adott. Egy diagnosztizált hordozónál két esetben történt prenatális vizsgálat, az első esetben beteg, a második esetben egészséges fiú magzatot diagnosztizáltunk LD-PCR technikával.
4.2.5.3. Inszerciós variánsok jellemzése Két súlyos HA-ban szenvedő betegünknél (3. és 4. betegek) a Southern blot vizsgálat a normál három homológ régió helyett négy homológ régió jelenlétét igazolta. A 3. betegnél a normál 21,5 kb-os intragenikus fragmentum elvesztése és a 20 kb-os inverzióra jellemző fragmentum jelenléte alapján egy ritka típusú inverzió jelenlétét feltételeztük. A BclI hasítási mintázat egy 3A típusú inverzió Southern blot képére (20, 17,5, 16 és 14 kb) hasonlított leginkább, de a 3. betegnél a feltételezett inverzióban résztvevő egyik fragmentum mérete kisebb volt (megközelítőleg 17 kb), mint a 3A típusú inverzióra jellemző (17,5 kb) fragmentum. A 14/a ábrán ez jól megfigyelhető, ahol a 3. beteg mintája („V3” jelzésű sáv) egy disztális inverziós minta („I1” jelzésű sáv) mellett látszik. Bár az inverzió általában nem eredményezi a DNS állomány elvesztését vagy duplikációját, mégis esetünkben azt feltételeztük kezdetben, hogy egy 3A típusú inverzió történt, amelyhez az inverziós töréspontok mentén deléció is társult. Csonkolt, inverzió által érintett homológ régió(k) jelenlétekor LD-PCR technikával a PB vagy az AQ PCR termék(ek) amplifikációjának elmaradását vártuk. Azonban az AQ LD-PCR termék elmaradása mellett a P és a Q primerek az ép intragenikus régióra jellemző 12 kb-os PCR terméket is amplifikáltak (14/d ábra –„V3” jelzésű sáv), jelezve, hogy a betegnél egy ép és egy inverzió által érintett intronikus homológ régió egyaránt jelen van. A 3. és a 4. betegnél talált megegyező LD-PCR mintázat (14/c és d ábrák –„V3” és „V4” jelzésű sávok) azt sugallta, hogy mindkét betegnél hasonló molekuláris mechanizmus állhat az eltérő Southern blot mintázat és a HA hátterében. A LD-PCR eredmények meglepőek voltak, mert (i) az extragenikus homológ régiók számbeli polimorfizmusát már leírták az irodalomban, míg az intronikus régió duplikációját még nem; (ii) az inverzióban résztvevő két homológ kópia közül csak egyet sikerült LD-PCR
76
Eredmények és megbeszélés
és Southern blot technikával kimutatni. Egy ép és egy inverzió által érintett intronikus homológ régió együttes jelenléte ugyanazon az X kromoszómán egy olyan rekombináció bekövetkeztekor képzelhető el, amelyben egy normál és egy disztális inverzió által érintett X kromoszóma vesz részt (15. ábra). 15. ábra: Egy normál és egy disztális inverziót hordozó X kromoszóma közötti rekombinációt bemutató séma. A panel: Rekombináció a homológ régión belül. B panel: Rekombináció a homológ régión kívül.
Jelmagyarázat: FVIII: a VIII. alvadási faktor génje; “1-22” és “23-26” felirattal jelölt fehér téglalap: FVIII gén exonjai; Kék téglalapok: homológ régiók; A1, A2, A3: intronikus, disztális illetve proximális homológ régiók; Vízszintes sávozású téglalap: a 22. intron homológ régión kívül eső része; P, Q, A, B: hosszú PCR primerek; Vékony nyilak: a FVIII gén átíródásának iránya; Vastag nyilak: a homológ régiókban található F8A gének átíródásának iránya; Szaggatott vonalak: lehetséges töréspontok. (I: Töréspont a homológ régión belül; II: Töréspont a homológ régión kívül.) C: centromer; T: telomer; kb: kilobázis.
Ha a rekombináció a normál X kromoszóma intronikus és a disztális inverziós X kromoszóma ép proximális homológ régiója között, a homológ régión belül történik (15/a ábra), az egyik kromoszóma négy olyan homológ régiót tartalmaz, amelyek Southern blot analíziskor 20 kb, 17,5 kb, 16 kb és 14 kb fragmentumokat adnak (mint a 3A inverzió). Bár a 3A inverzió keletkezését az irodalom szám feletti extragenikus homológ
régiók
jelenlétével
magyarázza
77
(4/b
ábra),
alternatív
keletkezési
Eredmények és megbeszélés
mechanizmusként modellünk szintén elképzelhető. Hasonló rekombináció során, ha a törés a homológ régión kívül történik (15/b ábra), az egyik kromoszóma négy olyan homológ régiót tartalmaz, amely az LD-PCR amplifikáció során 12 kb (PQ), 11 kb (PB), 10 kb (AB) fragmentumokat ad, és Southern blot analíziskor 21,5 kb, 20 kb, 16 kb és 14 kb fragmentumok mutathatók ki (a 4. betegünknél megfigyelt mintázathoz hasonlóan – 14/a és c ábrák „V4” jelzésű sáv). A rekombináció során keletkezik egy másik X kromoszóma is, amely csak két homológ régiót tartalmaz, és amely az LDPCR amplifikáció során 11 kb (AQ), 10 kb (AB) fragmentumokat ad, és Southern blot analíziskor 17,5 kb és 14 kb fragmentumok mutathatók ki. E Southern blot variáns létezéséről Poon és mtsai számoltak be (169). Feltételezésünk szerint a 3. betegünknél hasonló rekombináció történhetett, de a töréspont a PQ régióhoz közelebb esett és ez a 21,5 kb-os fragmentum rövidülését eredményezte. Modellünk szerint a FVIII gén exonjai épek, irányultságuk, sorrendjük nem változott, azonban feltételezzük, hogy a 22. intronba beszúródó szekvencia nagysága miatt az mRNS átíródása akadályozottá válik, és ez okozza a 3. és 4. betegeinknél a súlyos HA-t. Ennek igazolása RT-PCR technikával lenne lehetséges, amellyel a szóban forgó atípusos esetekben az inverziós beteghez hasonlóan a FVIII cDNS-ben a 22. és 23. exonok között a transzkriptum megszakadását észlelhetnénk. Bár modellünk mindkét betegünknél magyarázatot ad a ritka Southern blot mintázat kialakulására, egyéb lehetőségek kizárására és modellünk megerősítésére további vizsgálatok lennének szükségesek. Naylor és mtsai (75) szerint a szám feletti homológ régiók keletkezésének hátterében elméletileg olyan alternatív mechanizmusok is állhatnak, mint pl. a transzpozíció. Betegüknél leírtak egy a FVIII génjétől telomerikusan mintegy 200 kb-ra elhelyezkedő, csonkolt homológ régiót, amely inverzió kialakulásában vett részt. Alternatív hibridizációs szondák alkalmazásával betegeinknél kizárhatjuk, vagy megerősíthetjük további, csonkolt homológ régiók jelenlétét a genomban, amelyek a jelenlegi Southern blot vagy LD-PCR technikával észrevétlen maradhattak. Sajnos betegeink édesanyja vagy nagyanyja nem volt vizsgálható, a típusos disztális inverzió jelenlétének igazolása a variáns betegek anyai felmenő ági rokonainál direkt bizonyítékul szolgálna hipotézisünk alátámasztására. Egy 3A inverziót mutató beteg LD-PCR analízise P és Q primerekkel szintén igazolhatná vagy kizárná modellünk helyességét. Ha 3A inverzióban a P és Q primerek nem
78
Eredmények és megbeszélés
amplifikálják a 12 kb-os PCR terméket, akkor a 4/b ábrán ábrázolt modell, ha amplifikálják, akkor a 15/a modell valószínűsíthető.
4.2.6. Indirekt marker analízis A diagnosztikai algoritmus keretében a két leggyakrabban alkalmazott, különböző típusú indirekt marker elemzés eredményeinek értékelését két kiválasztott család példáján mutatom be. Az 1. családban a PCR-RFLP elemzést mutatom be, ahol a markerként használt polimorfizmus egy pontmutáció, amelynek jelenléte egy restrikciós hasítási hely jelenlétét illetve hiányát eredményezi. A 2. család esetében az alkalmazott marker egy mikroszatellita (az IVS13CA), amelynél a polimorfizmust egy rövid szekvencia szakasz (CA dinukleotid) különböző számú ismétlődése jelenti. 4.2.6.1. PCR-RFLP elemzés bemutatása esetismertetés segítségével A BclI polimorfizmus a HA gén 18. intronjában található pontmutáció. Kétféle allélje lehetséges, az egyik tartalmazza a BclI restrikciós enzim hasítási helyet, a másik nem. Az emésztetlen PCR termék és a hasítási helyet nem tartalmazó allél 142 bp, a BclI-gyel hasítható allél a restrikciós enzimmel történő emésztés után 99 és 43 bp hosszúságú fragmentumokat ad. A 43 bp hosszúságú fragmentum az agaróz gélen nehezen tehető láthatóvá (gyengén festődik etidium bromiddal, valamint gyorsan kifut a gélből), de a 99 bp-os fragmens jelenlétéből következtetünk a restrikciós hasítóhely jelenlétére. Hemizigóta férfiaknál és homozigóta nőknél vagy a 142 bp (16/a ábra: II/1, II/2 és I/1 mintázat) vagy a 99 bp hosszúságú fragmentum figyelhető meg, heterozigóta nőknél mindkét allél látható (16/a ábra: I/2 és II/3 mintázat). Ez utóbbi esetben tekinthető a marker informatívnak a vizsgált személynél, ha tudjuk, hogy a mutáció melyik allélhez kapcsolódik. Az indirekt módszereknél, így a BclI PCR-RFLP-nél is, a vizsgált személy mellett a beteget és minden olyan családtagot is meg kell vizsgálni, akitől a vizsgált személy X kromoszómája származhat. A markerek véletlenszerűen kapcsolódnak a mutációhoz, ami azt jelenti, hogy az egyik család esetében a nem emésztődő, a másiknál esetleg az emésztődő allél kapcsolt a mutációval. Az 1. család esetében (16/b ábra) a HA-ban szenvedő férfi leánytestvéreinél kellett eldöntenünk, hogy hordozzák-e a betegségért felelős gént. Mindkét leánytestvér a közeljövőben gyermeket szeretne vállalni. Mind a leánytestvérek és mind az édesanyjuk
79
Eredmények és megbeszélés
plazma FVIII aktivitása meghaladta az 50%-os értéket, így a fenotípusos vizsgálatokkal a hordozói állapotra nem következtethettünk. A családfa adatok alapján az édesanya obligát hordozó (azaz a családjában más HA-ban szenvedő beteg is található – az ábrán nincsenek feltüntetve), így a leányai 50-50% eséllyel hordozók, illetve nem hordozók. 16. ábra: Családvizsgálat BclI-PCR-RFLP elemzéssel (1. család). A panel: Az emésztett PCR termékek agaróz gélelektroforézise után kapott gél képe; B panel: Családfa és a hozzá tartozó jelmagyarázat.
A 16/a ábrán látható, hogy a betegség génje a BclI emésztett (99 bp hosszúságú) alléljával kapcsolt, mert ezt az allélt hordozza a HA-ban szenvedő beteg családtag (II/1). Az édesanyja (I/2) heterozigóta, a 144 és 99 bp-os allélt egyaránt hordozza. A anya betegséget hordozó X kromoszómáján az emésztett allél (99 bp), az egészséges X kromoszómáján az emésztetlen allél (144 bp) található, tehát esetében ez a BclI marker informatívnak tekinthető. Az egészséges édesapa (I/1) szintén az emésztett allélt hordozza, de az ő X kromoszómája nem hordozza a betegséget. A II/3 jelzésű leány heterozigóta a BclI allélre nézve. Édesapjától csak az emésztett (egészséges) allélt örökölhette, édesanyjától tehát az emésztetlen allélt, azaz a szintén egészséges X kromoszómát kapta. A molekuláris genetikai vizsgálatok szerint tehát a II/3 lánytestvér nem hordozza a HA betegséget. A II/2 jelzésű leány homozigóta a BclI allélre nézve, mind az édesapjától, mind az édesanyjától az emésztett allélt kapta. Mivel tudjuk, hogy édesanyjánál az emésztett allél hordozza a betegséget, így nála a molekuláris genetikai vizsgálattal megállapítottuk, hogy hordozza a betegség génjét. Mivel a II/2 jelzésű leány homozigóta a BclI markerra nézve, így ezzel a markerral az esetleges fiúmagzatánál majd nem tudjuk eldönteni, hogy a betegséget hordozó X kromoszómát örökölte-e vagy
80
Eredmények és megbeszélés
sem (azaz a II/2 jelzésű leánynál a BclI marker nem informatív); így a családban további indirekt markerek vizsgálatára volt szükség. A rekombináció esélye a BclI marker és az ismeretlen FVIII gén mutáció között 0,2% alatt van, így eredményeink mindkét leánytestvér esetében 99,8 %-os biztonságúak. Más valószínűségi esélyekkel kell azonban számolnunk a sporadikus családokban. Amennyiben az édesanyának (I/2) csak egyetlen HA-ban szenvedő fia van, és nincsen a családjában más HA-ban szenvedő beteg, úgy 70-80%-os annak a valószínűsége, hogy hordozó (78, 101, 102, 103). Az esetek 20-30%-ában azonban a mutáció a gametogenezis során keletkezett a női szervezetben azon az egy X kromoszómán, amelyet továbbörökített beteg fiának. Ebből az következik, hogy a sporadikus hordozók 70-80 %-ánál a leánygyermekek 50%-os eséllyel, míg 20-30%-ánál 0%-os eséllyel lesznek hordozók. Ilyen családokban a kizáró diagnózist továbbra is 99,9%-os biztonsággal felállíthatjuk, míg ha azt az eredményt kapjuk, hogy a sporadikus hordozó lánya a betegséget hordozó X kromoszómát örökölte, úgy a leleten fel kell tüntetni, hogy annak a valószínűsége, hogy a vizsgált markerünk valóban egy betegséget hordozó X kromoszómán található csak 70-80%-os. Sporadikus családokban a kizárólag indirekt markerek alkalmazásával diagnosztizált (azaz normál FVIII aktivitású) hordozók az esetek 20-30%-ában tévesen tekintendők hordozónak, valamint ezekben a családokban a prenatális vizsgálat során kiszűrt beteg fiúgyermekek 20-30%-a feltehetőleg egészségesként jönne a világra. A sporadikus családokban a direkt mutáció kimutatás bevezetésével elkerülhető ez a probléma.
4.2.6.2. A mikroszatellita elemzés bemutatása esetismertetés segítségével A mikroszatellita elemzésnél a markerként használt polimorfizmus egy rövid szekvencia szakasz különböző számú ismétlődése (pl. di-, tri- vagy tetranukleotid „repeat”-ek). Diagosztikai algoritmusunk szerint, ha a BclI-PCR-RFLP nem informatív, akkor először az intragenikus IVS13CA, majd a p39CA mikroszatellita elemzést végeztük el. Az IVS13CA mikroszatellita a FVIII gén 13. intronjában található dinukleotid (CA) „repeat” (ismétlődés). 8 allélikus variációja ismert, de az allélok eloszlása nem egyenletes, a leggyakoribb allélok frekvenciája 45 illetve 30%. A p39CA
81
Eredmények és megbeszélés
a FVIII génen kívül helyezkedik el, attól mintegy 500 kb távolságra. 8 lehetséges alléljéből 5 allél-frekvenciája 21% és 12% között van. A mikroszatellita elemzések eredményeinek kiértékelését nehezíti a „shadow bandek” („árnyék csíkok”) jelenléte. A Taq DNS polimeráz a DNS szintézis során a CA-repeateknél (ismétlődéseknél) gyakran pontatlanul olvassa le a szekvenciát, és 2 vagy akár 4 bázispárnyit is kihagyhat. A keletkező PCR termék az eredeti allélnál így 24 bázispárral rövidebb lesz, és a következő ciklusban ez a rövidebb szál is templátként szolgál, és észrevehető mennyiségű rövidebb szál keletkezik. A CA-repeatek esetében a Taq DNS polimeráz szám feletti bázispárokat nem épít be, így az eredeti allélnál nagyobb „shadow band” nem látható (181). Előfordul olyan eset, amikor a leghosszabb allél halványabb, mint az alatta levő rövidebb allél. Ez abból adódik, hogy a kettő illetve a négy bázis eltérést mutató heterozigóták esetében a hosszabb allél „shadow bandje” és a rövidebb allél egymásra vetül. A valódi allél és a „shadow band” egymásra vetülése megfigyelhető a 17/a ábra II/1, II/2, III/1 és III/2 jelzésű sávjainál is. A CArepeatek pontos számát, azaz a keletkező PCR termék pontos méretét (bázispárban) nem szükséges meghatározni, elegendő, ha az egyes allélokat a családon belül egymáshoz viszonyítjuk. Ebben az esetben egy családban a legrövidebb allél kapja az „n” rövidítést, míg a többi a megfelelő bázisszámmal nagyobbat („n+2” vagy „n+4” stb.). A p39CA mikroszatellita kiértékelése megegyezik az IVS13CA kiértékelésével, ezért külön erről a markerről családvizsgálatot nem mutatok be. A 2. családban (17/b ábra) az I/1 jelzésű, HA-ban szenvedő férfi leányai biztosan hordozók, leányunokáinak (III/1 és 2) 50% az esélye, hogy hordozók legyenek. Ha találunk a II/1 jelzésű obligát hordozónál informatív markert, úgy 99%-os biztonsággal eldönthető, hogy az unokáknál megtalálható-e a betegség génje vagy sem. A BclI marker a II/1 jelzésű hordozónál nem volt informatív, így mikroszatellita elemzést (IVS13CA) végeztünk. A betegség okozó mutáció az „n+4”-es allélhoz kapcsolt, ez látható a beteg férfi (I/1) esetében. Leányai (II/1 és II/2) heterozigóták, az „n” és „n+4” allélekre, amelyből az „n+4” kapcsolt a betegséget hordozó, mutáns FVIII génnel. Unokái (III/1 és III/2) a mutációval kapcsolt „n+4”-es allélt az anyjuktól, az „n+6”-os allélt apjuktól örökölték. Tehát ők is hordozók (99,9% eséllyel), és a marker náluk is informatív, prenatális vizsgálatra felhasználható.
82
Eredmények és megbeszélés
17. ábra: Családvizsgálat IVS13CA mikroszatellita elemzéssel (2. család). A panel: A radioaktívan jelölt PCR termékek poliakrilamid gélelektroforézise után a gélről készült autoradiogram képe; B panel: Családfa és a hozzá tartozó jelmagyarázat.
4.2.6.3. A vizsgált polimorf markerek informativitása a magyar populációban A BclI marker szempontjából 73 családból 278 személyt vizsgáltunk. Az emésztett allél gyakorisága a vizsgált csoportban 71,9%-os volt, az emésztetlené pedig 28,1%-os. A vizsgált 111 obligát, diagnosztizált és sporadikus hordozó közül 45 (42%) bizonyult heterozigótának, azaz a marker ezekben az esetekben volt informatív. Az IVS13CA marker szempontjából 36 családból 145 személyt, a p39CA marker szempontjából pedig 27 családból 119 személyt vizsgáltunk. A vizsgált 51 hordozó közül 30 (59%) esetben volt az IVS13CA marker informatív. A p39CA-repeat 38 vizsgált hordozó közül 29-nél (76%) volt informatív. A magyar BclI, az IVS13CA és a p39CA polimorfizmusok heterozigótasági arányai (42%, 59% és 76%) megfelelnek más európai országokból leírt informativitási aránynak (12. táblázat).
83
Eredmények és megbeszélés
12. táblázat: A laboratóriumban vizsgált polimorf markerek (BclI, IVS13CA és p39CA) informativitási arányai különböző populációkban. A heterozigóták aránya (%) Szerző Peake (99)
Aseev (182)
Vizsgált populáció
BclI
európai
39
japán
42
kínai
33
maláj
33
amerikai fekete
31
ázsiai
43
maori
44
polinéz
49
IVS13CA
orosz
63
üzbég
34
olasz
57
thai
58
európai
64
izraeli
69
dél-afrikai fekete
82
dél-afrikai fehér
62
összesített
69
Jarjanazi (105)
török
50
Lalloz (108)
nemzetközi
91
Kochhan (185)
német
67
Windsor (104)
európai
71
Yip (186)
kínai
54
Wehnert (110)
európai
Saját adataink
magyar
Goodeve (183) Goodeve (184)
p39CA
84 42
59
76
4.2.7. Az alkalmazott diagnosztikai algoritmus összesített eredményei Diagnosztikai stratégiánkkal (a direkt és az indirekt módszerek kombinációjával) 88 család molekuláris genetikai vizsgálata során 54 potenciálisan hordozó nőnél kizártuk a
84
Eredmények és megbeszélés
hordozói státusz lehetőségét, és 28 nőnél megerősítettük a hordozói státuszt (diagnosztizált hordozók). 129 (28 diagnosztizált, 76 családfaadatok alapján obligát és 25 sporadikus) hordozó esetében azonosítottuk a FVIII géninverzió jelenlétét vagy találtunk legalább egy informatív markert, amellyel terhesség esetén prenatális diagnosztika végezhető illetve az idősebb hordozók leányainál eldönthető, hogy hordozzák-e a betegségért felelős X kromoszómát. Egy reproduktív korban levő diagnosztizált hordozónál mindhárom marker homozigótának bizonyult, így ebben az esetben terhesség esetén fiú magzatnál a jelenlegi módszerekkel nem tudjuk majd eldönteni, hogy beteg lesz-e. (Az említett hordozó nő két leányánál szintén nem tudjuk megmondani, hogy hordozzák-e a betegség génjét vagy sem, ami jelenleg fiatal koruk miatt [8 illetve 10 évesek] még nem szükséges.) Az alkalmazott diagnosztikai stratégia tehát 129/130 hordozónál (99,2 %) bizonyult informatívnak. A különböző markerekkel végzett vizsgálatok valamennyi esetben alátámasztották egymást. Az elemzett családokban a markerek között rekombinációt nem észleltünk. Abban az esetben, ha a beteg családtag inverzió-negatív és a családban valamely nőtagnál a három alkalmazott marker közül egy sem bizonyul informatívnak, a laboratóriumnak két választási lehetősége van: vagy újabb indirekt módszereket állít be (lsd. 2. táblázat) vagy az FVIII gén direkt szekvenálását alkalmazza. A három marker (BclI, IVS13CA, p39CA) elméletileg kiszámított kombinált informativitási aránya 94,3% (=1-[1-0,42]x[1-0,59]x[1-0,76]) az inverzió negatív családokban, amely 97,3%-ra emelkedik a súlyos HA-betegek családjaiban az inverzió kimutatás alkalmazásának figyelembe vételével. Vizsgálataink során, amennyiben eltekintünk a genetikai tanácsadáson hiányosan résztvevő családoktól, a kombinált informativitási arány 99,2 % volt. Ez arra utal, hogy a kiválasztott három marker nem öröklődik kapcsoltan. Egymást követő alkalmazásuk (és kombinációjuk az inverzió kimutatással a súlyos HA-családokban) egy megbízható, gyors és költségkímélő kivizsgálási algoritmust jelent a HA hordozó és prenatális diagnosztikájában a magyar populációban. A beállított módszerek lehetővé teszik, hogy egy korábban nem vizsgált család esetében is (prenatális vizsgálat igénye esetén) néhány héten belül eredményt adjunk. Prenatális diagnosztikát csak fiú magzatok esetén végeztünk. A programunk során vizsgált 27 magzatból 14 volt fiú. A fiú magzatok közül molekuláris genetikai
85
Eredmények és megbeszélés
vizsgálattal hét bizonyult egészségesnek és hat betegnek. Egy esetben a haemophilia Aban szenvedő beteg nem volt vizsgálható, és az obligát hordozó leányánál nem lehetett megállapítani, hogy melyik X kromoszóma hordozza a betegséget, így fiú magzatánál prenatális diagnózist nem tudtunk adni. A molekuláris genetikai vizsgálattal egészségesnek talált, utólagosan információt szolgáltató négy esetben a betegség mentes állapot fenotípus vizsgálattal is igazolást nyert. Egy esetben az édesanya a prenatális genetikai vizsgálattal előre jelzett betegség ellenére megtartotta a fiúmagzatot, akinél születése után HA kórképe fenotípusos vizsgálattal is igazolódott. 88 család vizsgálata során az indirekt módszerek alkalmazásának számos hátrányával szembesültünk, amelyeket csak a direkt mutáció azonosítás bevezetésével tudunk elkerülni. 25 családban csak egy haemophilia A-ban szenvedő beteg volt a családban (sporadikus családok). A 25 család közül 13-ban igazoltuk az inverzió jelenlétét, így ezekben a családokban a direkt mutáció analízissel 100%-os biztonsággal adhattunk hordozó és prenatális diagnózist. 9 családban a vizsgált potenciális hordozók (illetve egy fiú magzat) nem hordozták a beteggel megegyező allélt, így náluk kizárható volt a hordozói státusz (intragenikus markerral történt vizsgálat esetén 99,9%-os, extragenikus markerral történt vizsgálat esetén 99,3%-os biztonsággal). Három sporadikus családban három potenciális hordozó, illetve egy fiúmagzat a betegséget hordozó X kromoszómát örökölte, náluk az irodalmi adatok szerint indirekt markerekkel csak 70-80 %-os eséllyel állíthattuk, hogy hordozzák a betegséget. A családtagok hiányos elérhetősége miatt 7 családban 11 potenciális hordozónál nem tudtuk kizárni vagy megerősíteni hordozói státuszt, valamint egy obligát hordozó fiú magzatánál nem tudtunk prenatális diagnózist adni.
86
Következtetések
5. Következtetések 5.1. Öröklődő haemochromatosis a) Magyarországon elsőként határoztuk meg a HFE gén két, a haemochromatosis kialakulásának szempontjából fontos pontmutációjának (C282Y és H63D) allélfrekvenciáját. A magyar, átlag populációban talált HFE allél-frekvencia értékek (C282Y: 3,8±0,8% [n=1273] és H63D: 13,2±2,1% [n=517]) azt mutatják, hogy Magyarországon
a
többi
európai
országhoz
hasonlóan
magas
öröklődő
haemochromatosis gyakorisággal kell számolnunk. A kapott allél-frekvenciák alapján körülbelül minden hétszázadik (450-1050) személy C282Y homozigóta Magyarországon, azaz fogékony a vasfelhalmozódásra. b) A többszörös véradók körében szignifikáns C282Y és H63D allél-frekvencia emelkedést nem igazoltunk. A heterozigóta és a normál C282Y genotípusú első illetve többszörös véradók szérum vas, szérum ferritin szintjei illetve transzferrin szaturáció értékei nem különböztek. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy egészséges egyéneknél a C282Y és a H63D heterozigóta genotípus vasanyagcserére gyakorolt hatása kisebb mértékű, mint az egyéb genetikai és környezeti tényezők összesített hatása. c) Magyarországon először vizsgáltunk a HFE C282Y és H63D pontmutációit haemochromatosis klinikai tüneteit mutató betegeknél. 464 haemochromatosis klinikai gyanúja miatt vizsgált személy közül 28 C282Y homozigóta (6,0%) és 21 C282Y/H63D kettős heterozigóta (4,5%) egyént azonosítottunk. Az emelkedett vasparaméterek miatt vizsgált betegeknél a C282Y és a H63D mutációk kimutatása egy nem invazív módszer, amely segíti a haemochromatosis differenciál diagnosztikáját. d) Myelodysplasiában szenvedő betegek között a C282Y vagy a H63D mutációk előfordulása (52%) szignifikánsan magasabb volt, mint az egészséges egyének csoportjában (31%). Vizsgálataink szerint a HFE gén C282Y és H63D mutációi
87
Következtetések
bizonyos kórállapotban, pl. myelodysplasiában is, akár heterozigóta formában is hozzájárulhatnak a betegség kialakulásához vagy progressziójához. 5.2. Haemophilia A a) A laboratóriumunkban kidolgozott kivizsgálási algoritmus (a direkt FVIII gén 22. és 1. inverzió kimutatás és a három indirekt marker [a FVIII gén IVS18 PCR-BclIRFLP, IVS13CA és az extragenikus p39CA] kombinációja) az esetek mintegy 99%ában informatív, megbízható és költségkímélő eljárás a HA hordozó és prenatális diagnosztikájában. A fenti direkt és indirekt módszerekkel jelentős számú hordozó és prenatális vizsgálat történt: 54 potenciálisan hordozó nőnél kizártuk, 28 nőnél megerősítettük a hordozói státuszt; 129 hordozó esetében azonosítottuk a FVIII géninverzió jelenlétét vagy találtunk legalább egy informatív markert; 13 fiúmagzatnál történt prenatális vizsgálat. b) A FVIII gén 22. intronját érintő, nagyméretű génátrendeződések a magyar, súlyos HA-ban szenvedő betegek között gyakoriak (53%). Az atípusos, 22. intront érintő génátrendeződést mutató betegeknél végzett vizsgálataink alátámasztják, hogy a FVIII gén intronikus és extragenikus homológ régiói nemcsak a géninverzió, hanem más deléciók és duplikációk kialakulását is elősegítik. A 22. intron homológ régió duplikációjával
járó
ritka
génátrendeződések
molekuláris
mechanizmusára
vonatkozólag felállítottunk egy új modellt. A FVIII gén 1. intron inverzió előfordulási gyakoriságát a súlyos HA betegek csoportjában Magyarországon először vizsgáltuk (gyakorisága Magyarországon feltehetően nem haladja meg az 1%-ot). c) Az indirekt marker elemzések során meghatároztuk a három vizsgált, polimorf marker heterozigótasági arányát a hazai populációban (IVS18 PCR-BclI-RFLP: 42%, IVS13CA: 59%; p39CA: 76%). Megállapítottuk, hogy a vizsgált markerek nem öröklődnek kapcsoltan a magyar populációban.
88
Összefoglalás
6. Összefoglalás A molekuláris genetika a laboratóriumi diagnosztika egyre gyorsabban fejlődő ága. Alkalmazási
területeit
két
örökletes
haematológiai
betegség,
az
örökletes
haemochromatosis (HH) és a haemophilia A (HA) példáján mutatom be. A HH a vasanyagcsere autoszomális, recesszív módon öröklődő betegsége. Az esetek mintegy 64-100%-ában a HFE gén homozigóta C282Y, ritkábban C282Y/H63D kettős heterozigóta mutációja áll a kórkép hátterében. Munkánk célja e két pontmutáció magyarországi allél gyakoriságának meghatározása volt. Az egészséges egyének csoportjában a C282Y allél-frekvencia 3,8±0,8% (1273 fő), a H63D allél-frekvencia pedig 13,2±2,1% (517 fő) volt. Myelodysplasiában szenvedő betegek között a C282Y vagy a H63D mutációk előfordulása (52%) szignifikánsan magasabb volt, mint az egészséges egyének csoportjában (31%). A normál hazai populációban megfigyelt C282Y és H63D allél-frekvenciák jelzik, hogy a HH Magyarországon is igen gyakori. A mutáció elemzés új, a klinikai gyakorlatba egyre inkább beépülő, nem-invazív módszer a HH diagnosztikájában. A HA a VIII. alvadási faktor (FVIII) csökkent aktivitása következtében kialakuló, Xhez kötött, recesszív módon öröklődő vérzékenység. A súlyos HA-betegek mintegy 45%-ánál az FVIII gén a 22. intron, 5%-ánál az 1. intron inverziója áll a betegség hátterében. A súlyos esetek további 50%-ában és a középsúlyos illetve enyhe esetekben a kóroki mutációk a FVIII gén 26 exonján elszórtan helyezkednek el. A könnyen kivitelezhető direkt (22. és 1. intron inverzió kimutatás) és indirekt módszerekkel (BclIRFLP; IVS13CA és p39CA mikroszatellita elemzések) 54 potenciálisan hordozó nőnél kizártuk, és 28 nőnél megerősítettük a hordozói státuszt. 129 hordozó esetében azonosítottuk a FVIII géninverzió jelenlétét vagy találtunk legalább egy informatív markert, amellyel terhesség esetén prenatális diagnosztika végezhető. Az alkalmazott diagnosztikai stratégia 129/130 hordozónál (99,2%) bizonyult informatívnak. Prenatális diagnózist 13 fiú magzatnál adtunk. A laboratóriumunkban kidolgozott genetikai vizsgálati algoritmus az esetek mintegy 99%-ban informatív, megbízható és költségkímélő eljárás a HA hordozó és prenatális diagnosztikájában.
89
Summary
7. Summary Molecular genetics is a rapidly advancing field of laboratory medicine. In the current work, I illustrate the application fields of molecular genetics in laboratory medicine by using two examples of hematological diseases: hereditary haemochromatosis (HH) and haemophilia A (HA). HH is a disease of the iron metabolism with an autosomal recessive inheritance. In 64 to 100% of the cases, the disease is caused by homozygous C282Y, less frequently C282Y/H63D compound heterozygous mutation of the HFE gene. The aim of our work was to define the Hungarian allele frequency data for the two point mutations of the HFE gene. By testing a healthy control population, we found an allele frequency of 3.8±0.8% (n=1273) for the C282Y point mutation, and 13.2±2.1% (n=517) for the H63D mutation. In a patient group of myelodysplastic patients, the combined frequency (52%) of the C282Y and H63D mutations was significantly higher than in the control group (31%). The allele frequency data for the normal Hungarian population indicate that, HH is a frequent disease in Hungary. The mutation detection represents a new, non-invasive technique that becomes integral in HH-diagnostics. HA with an X-linked, recessive mode of inheritance is a bleeding disorder caused by the deficiency of the factor VIII (FVIII) coagulation protein. Approximately 50% of severe HA-cases are caused by the inversions of intron 22 and 1 of FVIII gene. The remaining 50% of severe HA-cases, as well as all moderate and mild HA-cases are caused by mutations randomly located on all 26 exons of the FVIII gene. By using the easily executable direct techniques (detection of inversions of introns 22 and 1) and indirect techniques (BclI-RFLP; IVS13CA and p39CA), the carrier state was excluded in cases of 54 potential carriers while this status was confirmed in cases of 28 women. We identified the presence of gene inversion or the existence of at least one informative indirect marker in cases of 129 carrier women. Our diagnostic strategy proved to be informative in 129/130 (99.2%) carriers. Prenatal diagnoses were completed in 13 male fetuses. The genetic diagnostic strategy introduced in our laboratory proved to be informative, reliable and cost effective for the carrier and prenatal diagnostics of HA.
90
Köszönetnyilvánítás
8. Köszönetnyilvánítás Mindenek előtt köszönetet mondok közvetlen témavezetőmnek, dr. Tordai Attilának, aki bevezetett a molekuláris biológia és a humán genetika módszertanába, munkámat mindvégig figyelemmel kísérte és tanácsaival mindenkor segítségemre volt. Dr. Sarkadi Balázs folyamatos szellemi irányítása, és a Dr. Váradi Andrással közösen kialakított tudományos műhelyének légköre ugyancsak nélkülözhetetlen volt munkámhoz, biztosította a helyes témaválasztást, valamint az egyes részfeladatokban az elméleti és gyakorlati
buktatók
elkerülését.
Munkámat
többen
is
segítették.
Köszönöm
munkatársaimnak, Bors Andrásnak, Kalmár Lajosnak és dr. Klein Izabellának a folyamatos konzultációs lehetőséget, a szakmai segítséget, és a közvetlen, vidám munkahelyi
hangulatot;
valamint
Horváth
Csongorné
és
Pfundt
Antalné
asszisztenseknek, hogy a sokszor fárasztó rutinfeladataik elvégzése mellett a kutatásban is a tőlük megszokott precíz, megbízható munkájukkal szerepet vállaltak. Az öröklődő haemochromatosis molekuláris diagnosztikai program résztvevői a következők voltak. A főként intézeti dolgozókból álló kontroll csoport korábban HLA tipizált DNS mintáit dr. Rajczy Katalin bocsátotta rendelkezésünkre. A véradók tájékoztatása és bevonása a vizsgálatba a budapesti Országos Vérellátó Szolgálatnál (OVSZ) dr. Kalász László, az OVSZ Szegedi Tudományegyetemen működő Regionális Vérellátójánál dr. Petri Ildikó irányítása alatt történt. A véradók vasparamétereinek meghatározásánál Barta Irén és dr. Lelkes Gábor (Szt. János Kórház) és dr. Németh Katalin (OGYK) nyújtott segítséget. A HFE C282Y mutáció pozitív, öröklődő haemochromatosisban szenvedő betegek klinikai adatainak retrospektív feldolgozása dr. Czink Edit (Szt. László Kórház) és még több kezelőorvos segítsége nélkül nem jöhetett volna létre. A myelodysplasiás szindrómában szenvedő betegek kivizsgálását és klinikai adatainak feldolgozását dr. Várkonyi Judit (SE III. Belklinika) és dr. Demeter Judit (SE I. Belklinika) végezte. A „Haemophilia A molekuláris genetikai diagnosztikai és prevenciós programban” a betegek gondozását és a genetikai tanácsadást dr. Nemes László (Országos Haemophilia Központ, OGYK), valamint dr. Marosi Anikó (Heim Pál Gyermekkórház) végezték. Végül, de nem utolsó sorban köszönetet mondok fiamnak, férjemnek és szüleimnek, akik a genetika és öröklődés egyéb szempontjait is megvilágították előttem.
91
Saját közlemények jegyzéke
9. Saját közlemények jegyzéke 9.1. A dolgozat alapjául szolgáló saját közlemények 1. Tordai, A, Klein, I, Andrikovics, H, Kalmár, L, Rajczy, K, Pénzes, M, Sarkadi, B, Váradi, A. High frequency of the haemochromatosis C282Y mutation in Hungary could argue against a Celtic origin of the mutation. J Med Genet 1998; 35: 878-879. 2. Andrikovics, H, Klein, I, Kalmár, L, Bors, A, Jermendy, Gy, Petri, I, Kalász, L, Váradi, A, Tordai, A. Új, molekuláris genetikai módszer az öröklődő haemochromatosis differenciáldiagnosztikájában. Orvosi Hetilap 1999; 140: 251722. 3. Várkonyi, J, Kaltwasser, JP, Seidl, C, Kollai, G, Andrikovics, H, Tordai, A. A case of
non-HFE
juvenile
haemochromatosis
presenting
with
adrenocortical
insufficiency. Br J Haematol 2000; 109: 252-3. 4. Várkonyi, J, Kaltwasser, JP, Seidl, C, Tordai, A, Andrikovics, H, Kollai, G, Müzes, Gy, Tulassay, Zs, Romics, L. A mellékvesekéreg csökkent működésében manifesztálódó juvenilis haemochromatosis. Lege Artis Medicinae 2000; 10: 126-9. 5. Andrikovics, H, Kalmár, L, Bors, A, Petri, I, Kalász, L, Tordai, A. Az öröklődő haemochromatosis genetikai háttere. Transzfúzió 2000; 33: 3-8. 6. Andrikovics, H, Kalmár, L, Bors, A, Petri, I, Kalász, L, Tordai, A. Az öröklődő haemochromatosis molekuláris genetikai szűrése véradók között. Transzfúzió 2000; 33: 55-61. 7. Andrikovics, H, Kalmár, L, Bors, A, Fandl, B, Petri, I, Kalász, L, Tordai, A. Genotype screening for hereditary hemochromatosis among voluntary blood donors in Hungary. Blood Cells Mol Dis 2001; 27: 334-41. 8. Klein, I, Andrikovics, H, Bors, A, Nemes, L, Tordai, A, Váradi, A. Haemophilia A and B molecular genetic diagnostic program in Hungary: a highly informative and cost effective strategy. Haemophilia 2001; 7: 306-12.
92
Saját közlemények jegyzéke
9. Várkonyi J, Tarkovács G, Karádi I, Andrikovics H, Varga F, Varga F, Demeter J, Tordai A. High incidence of hemochromatosis gene mutations in the myelodysplastic
syndrome:
The
Budapest
Study
on
50
patients.
Acta
Haematologica 2003; 109: 64-67. 10. Andrikovics, H, Klein, I, Bors, A, Nemes, L, Marosi, A, Váradi, A, Tordai, A. Analysis of large structural changes of the factor VIII gene, involving intron 1 and 22, in severe haemophilia A. Haematologica 2003; 88: 778-84.
9.2. Egyéb saját közlemények 1. Varga, I, Rácz, K, Tóth, M, Kiss, R, Fütő, L, Jakab, Cs, Andrikovics, H, Gláz, E. Cortisol és 6-beta-hydroxycortisol nyál és plazma szintek klinikai diagnosztikai jelentősége a mellékvese működésének vizsgálatában. Magyar Belorvosi Archivum 1997; 50: 149-52. 2. Pongrácz, E, Tordai, A, Andrikovics, H, Szén, L, Nagy, Z. A protrombin gén G20210A polimorfizmusának vizsgálata fiatalkori ishemiás stroke-os betegeknél. Agyérbetegségek 2001; 2: 9-13. 3. Lapicka-Bodzioch, K, Bodzioch, M, Krüll, M, Kielar, D, Probst, M, Kiec, B, Andrikovics, H, Böttcher, A, Hubacek, J, Aslanidis, C, Suttorp, N, Schmitz, G. Homogeneous assay based on 52 primer sets to scan for mutations of the ABCA1 gene and its application in genetic analysis of a new patient with familial highdensity lipoprotein deficiency syndrome. Biochim Biophys Acta 2001; 1537: 42-8.
93
Irodalomjegyzék
10. Irodalomjegyzék 1 Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM (TM). McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine, John Hopkins University (Baltimore, MD) and National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, MD), 2000. World Wide Web URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/. 2 Guttmacher, AE et al.: Genomic medicine – a primer. New Eng J Med 2002; 347: 1512-1520. 3 Jimenez-Sanchez, G et al.: Human disease genes. Nature 2001; 409: 853-5. 4 Franco, RF et al.: Genetic risk factors of venous thrombosis. Hum Genet 2001; 109: 369-84. 5 Welch, GN et al.: Homocysteine and atherothrombosis. New Eng J Med 1998; 338: 1042-50. 6 Van der Put, NM et al.: Mutated methylenetetrahydrofolate reductase as a risk factor for spina bifida. Lancet 1995; 346: 1070-1. 7 Buscher, H-P: Hämochromatose in Gerok, W and Blum, HE: Hepatologie, 1995, Urban und Schwarzenberg, pp.481-494. 8 Simon, M et al.: Association of HLA-A3 and HLA-B14 antigens with idiopathic haemochromatosis. Gut 1976; 17: 332-4. 9 Feder, JN et al.: A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis. Nat Genet 1996; 13: 399-408. 10 Mercier, B et al.: Putting a hold on ‘HLA-H’. Nat Genet 1997; 15: 234-5. 11 Borot, N et al.:Mutations in the MHC class I-like candidate gene for haemochromatosis in French patients. Immunogenetics 1997; 45: 320-4. 12 Carella, M et al.:Mutational analysis of the HLA-H gene in Italian haemochromatosis patients. Am J Hum Genet 1997; 60: 828-32. 13 Jazwinska, EC et al.: Haemochromatosis and HLA-H. Nat Genet 1996; 14: 249-51. 14 Jouanolle, AM et al.: Haemochromatosis and HLA-H. Nat Genet 1996; 14: 251-2. 15 The UK Haemochromatosis Consortium: A simple genetic test identifies 90 % of UK patients with haemochromatosis. Gut 1997; 41: 841-4. 16 Bell, H et al.: Prevalence of haemochromatosis among first-time and repeat blood donors in Norway. J Hepatol 1997; 26: 272-9. 17 Merryweather-Clarke, AT et al.: Global prevalence of putative haemochromatosis mutations. J Med Genet 1997; 34: 275-8. 18 Beutler, E et al.: Mutational analysis in hereditary haemochromatosis. Blood Cell Mol Dis 1996; 22: 187-94. 19 Beutler, E: The significance of the 187G (H63D) mutation in hemochromatosis. Am J Hum Genet 1997; 61: 762-4. 20 de Sousa, M et al.: Iron overload in beta 2-microglobulin-deficient mice. Immunol Lett 1994; 39: 10511.
94
Irodalomjegyzék
21 Rothenberg, BE et al.: β2-knockout mice develop parenchymal iron overload: a putative role for class I genes of the major histocompatibility complex in iron metabolism. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 1529-34. 22 Santos, M et al.: Defective iron homeostasis in β2-microglobulin knockout mice recapitulates hereditary haemochromatosis in man. J Exp Med 1996; 184: 1975-85. 23 Zhou, XY et al.: HFE gene knockout produces mouse model of hereditary hemochromatosis. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 2492-7. 24 Feder, JN et al.: The haemochromatosis founder mutation in HLA-H disrupts β2-microglobulin interaction and cell surface presentation. J Biol Chem 1997; 272: 14025-8. 25 Waheed, A et al.: Hereditary haemochromatosis: Effects of C282Y and H63D mutations on association with β2-microglobulin, intracellular processing, and cell surface expression of the HFE protein in COS-7 cells. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 12384-9. 26 Trinder, D et al.: Iron uptake from plasma transferrin by the duodenum is impaired in the Hfe knockout mouse. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 5622-6. 27 Bomford, A: Genetics of haemochromatosis. Lancet 2002; 360: 1673-81. 28 Bridle, KR et al.: Disrupted hepcidin regulation in HFE-associated haemochromatosis and the liver as a regulator of body iron homoeostasis. Lancet 2003; 361: 669-73. 29 Mura, C et al.: HFE mutations analysis in 711 haemochromatosis probands: evidence for S65C implication in mild form of haemochromatosis. Blood 1999; 93: 2502-5. 30 Piperno, A et al.: Two novel nonsense mutations of HFE gene in five unrelated Italian patients with hemochromatosis. Gastroenterology 2000; 119: 441-5. 31 Salvioni, A et al.: Prevalence of C282Y and E168X HFE mutations in an Italian population of Northern European ancestry. Haematologica 2003; 88:250-5. 32 Wallace, DF et al.: A novel mutation of HFE explains the classical phenotype of genetic hemochromatosis in a C282Y heterozygote. Gastroenterology 1999; 116: 1409-12. 33 Steiner, M et al.: A homozygous HFE gene splice site mutation (IVS5+1 G/A) in a hereditary hemochromatosis patient of Vietnamese origin. Gastroenterology 2002; 122: 789-95. 34 Bradbury, R et al.: Two novel polymorphisms (E277K and V212V) in the haemochromatosis gene HFE. Hum Mutat 2000; 15: 120. 35 de Villiers, JN et al.: Spectrum of mutations in the HFE gene implicated in haemochromatosis and porphyria. Hum Mol Genet 1999; 8: 1517-22. 36 Cazzola, M: Genetic disorders of iron overload and the novel ”ferroportin disease”. Haematologica 2003; 88: 721-4. 37 Roetto, A et al.: Juvenile hemochromatosis locus maps to chromosome 1q. Am J Hum Genet 1999; 64: 1388-93. 38 Roetto, A et al.: Mutant antimicrobial peptide hepcidin is associated with severe juvenile hemochromatosis. Nat Genet 2003; 33: 21-2.
95
Irodalomjegyzék
39 Camaschella, C et al.: The gene TFR2 is mutated in a new type of haemochromatosis mapping to 7q22. Nat Genet 2000; 25: 14-5. 40 Mattman, A et al.: Transferrin receptor 2 (TfR2) and HFE mutational analysis in non-C282Y iron overload: identification of a novel TfR2 mutation. Blood 2002; 100: 1075-7. 41 Girelli, D et al.: Clinical and pathologic findings in hemochromatosis type 3 due to a novel mutation in transferrin receptor 2 gene. Gastroenterology 2002; 122: 1295-302. 42 Roetto, A et al.: New mutations inactivating transferrin receptor 2 in hemochromatosis type 3. Blood 2001; 97: 2555-60. 43 Wallace, DF et al.: Novel mutation in ferroportin1 is associated with autosomal dominant hemochromatosis. Blood 2002; 100: 692-4. 44 Devalia, V et al.: Autosomal dominant reticuloendothelial iron overload associated with a 3-base pair deletion in the ferroportin 1 gene (SLC11A3). Blood 2002; 100: 695-7. 45 Roetto, A et al.: A valine deletion of ferroportin 1: a common mutation in haemochromatosis type 4? Blood 2002; 100: 733-4. 46 Rivard, SR et al.: Autosomal dominant reticuloendothelial iron overload (HFE type 4) due to a new missense mutation int he ferroportin 1 gene (SLC11A3) in a large French-Canadian family. Haematologica 2003; 88: 824-6. 47 De Gobbi, M et al.: Analysis of HFE and TFR2 mutations in selected blood donors with biochemical parameters of iron overload. Haematologica 2003; 88: 396-401. 48 Witte, DL et al.: Practice Guidline Development Task Force of the College of American Pathologists: Hereditary haemochromatosis. Clin Chim Acta 1996; 245: 139-200. 49 Harrison′s Principles of Internal Medicine. eds. KJ Isselbach et al.; 13th ed. New York: McGraw-Hill, 1994. pp. 2069-2073. 50 Niederau, C et al.: Long-term survival in patients with hereditary haemochromatosis. Gastroenterology 1996; 110: 1107-19. 51 Adams, PC et al.: Clinical presentation of haemochromatosis: a changing scene. Am J Med 1991; 90: 445-49. 52 Adams, PC et al.: EASL International Consensus Conference on haemochromatosis. J Hepatol 2000; 33: 485-504. 53 Lothar, T (ed.): Labor und Diagnose. Indikation und Bewertung von Laborbefunden für die medizinische Diagnostik. Eisenstoffwechsel. pp. 388-407. (Die Medizinische Verlagsgesellschaft Marburg 1992). 54 Bassett, ML et al.: Value of hepatic iron measurements in early hemochromatosis and determination of the critical iron level associated with fibrosis. Hepatology 1986; 6; 24-9. 55 Adams, PC et al.: Evaluation of the hepatic iron index as a diagnostic criterion for genetic hemochromatosis. J Lab Clin Med 1997; 130: 509-14.
96
Irodalomjegyzék
56 Guyader, D et al.: Noninvasive prediction of fibrosis in C282Y homozygous hemochromatosis. Gastroenterology 1998; 115: 929-36. 57 Bottomley, SS: Secondary iron overload disorders. Semin Haematol 1998; 35: 77-86. 58 Adams, PC et al.: Long-term survival analysis in herditary haemochromatosis. Gastroenterology 1991; 101: 368-72. 59 Niederau, C et al.: Survival and causes of death in cirrhotic and in noncirrhotic patients with primary haemochromatosis. New Eng J Med 1985; 313: 1256-62. 60 Bulaj, ZJ et al.: Clinical and bichemical abnormalities in people heterozygous for haemochromatosis. New Eng J Med 1996; 335: 1799-805. 61 Adams, PC et al.: Prevalence of abnormal iron studies in heterozygotes for hereditary haemochromatosis: an analysis of 255 heterozygotes. Am J Haematol 1994; 45: 146-9. 62 Whitfield, JB et al.: Effects of HFE C282Y and H63D polymorphisms and polygenic background on iron stores in a large community sample of twins. Am J Hum Genet 2000; 66: 1246-58. 63 Gattermann, N: From sideroblastic anemia to the role of mitochondrial DNA mutations in myelodysplastic syndromes. Leuk Res 2000; 24: 141-51. 64 Machovich, R.: Hemosztázis. pp. 589-609. in Ádám, V et al.: Orvosi biokémia. Medicina Könyvkiadó Rt., 2001, 2. kiadás. 65 Bolton-Maggs, PH et al: Haemophilias A and B. Lancet 2003; 361: 1801-9. 66 Kazazian, HH et al.: Hemophilia A and parahemophilia: deficiencies of coagulation factors VIII and V. pp. 3241-67 in: Scriver, CR et al. (eds): The metabolic and molecular bases of inherited disease vol III, McGraw-Hill, 1995, 7th edition. 67 Gitschier, J et al.: Characterization of the human factor VIII gene. Nature 1984; 312: 326. 68 Stenson PD et al.: Human gene mutation database (HGMD): 2003 update. Hum Mutat 2003; 21: 57781. 69 Higuchi, M et al.: Molecular characterization of severe hemophilia A suggests that about half the mutations are not within the coding regions and splice junctions of the factor VIII gene. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 7405-9. 70 Naylor, JA et al.: Factor VIII gene explains all cases of haemophilia A. Lancet 1992; 340: 1066-7. 71 Lakich, D et al.: Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A. Nat Genet 1993; 5: 236-41. 72 Naylor, JA et al.: Characteristic mRNA abnormality found in half the patients with severe hamophilia A. Hum Mol Genet 1993; 2: 1773-8. 73 Naylor, JA et al.: Investigation of the factor VIII intron 22 repeated region (int22h) and the associated inversion junctions. Hum Mol Genet 1995; 4: 1217-24. 74 Antonarakis, SE et al.: Factor VIII gene inversions in severe haemophilia A: Results of an international consortium study. Blood 1995; 86: 2206-12. 75 Naylor, JA et al.: A novel DNA inversion causing severe haemophilia A. Blood 1996; 87: 3255-61.
97
Irodalomjegyzék
76 Goodeve, AC et al.: Factor VIII rearrangements in patients with severe haemophilia A. Lancet 1994; 343: 329-30. 77 Rossiter, JP et al.: Factor VIII gene inversions causing severe hemophilia A originate almost exclusively in male germ cells. Hum Mol Genet 1994; 3: 1035-39. 78 Ljung, RCR et al.: Origin of mutation in sporadic cases of haemophilia A. Br J Haemat 1999; 106: 870-4. 79 Bagnall, RD et al.: Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a frequent cause of severe hemophilia A. Blood 2002; 99: 168-74. 80 Acquila, M et al: Frequency of factor VIII intron 1 inversion in a cohort of severe hemophilia A Italian patients. Haematologica 2003; 88: (05) ELT17. 81 Riccardi, F et al: Intron 1 factor VIII gene inversion in a population of Italian hemophilia A patients. Blood 2002; 100: 3432. 82 Tuddenham, EGD et al.: Haemophilia A: database of nucleotide substitutions, deletions, insertions and rearrangements of the factor VIII gene, second edition. Nucl Acid Res 1994; 22: 4851-8. 83 Peake, I.: The molecular bases of haemophilia A. Haemophilia 1998; 4: 346-9. 84 Young, M et al.: Partial correction of a severe molecular defect in haemophilia A because of errors during expression of the factor VIII gene. Am J Hum Genet 1997; 60: 565-73. 85 Kazazian, HH et al.: Haemophilia A resulting from de novo insertion of L1 sequences represents a novel mechanism for mutation in man. Nature 1988; 332: 164-6. 86 Roberts, HR et al.: Hemophilia and related conditions-inherited deficiencies of prothrobin (factor II), factor V, and factors VII to XII. pp 1413-23 in: Beutler, E et al. (eds.): Williams Hematology, McGraw-Hill, Inc.,1995, 5th edition. 87 Nelson: A gyermekgyógyászat tankönyve. Szerk.: Behrman, RE., Kliegman, RM, Melania Kiadó, 1995, 1. magyar kiadás. 88 Barthels, M et al.: Gerinnungsanalysen. Thieme Wissenschafft 1993, 4. Auflage, pp.21-51, 267-72. 89 Reiner, P: Introduction to haemostasis and the vitamin K-dependent coagulation factors. in.: Scriver, CR et al. (eds): The metabolic and molecular bases of inherited disease vol III, McGraw-Hill, 1995, 7th edition, pp.3193-200. 90 Sadler, JE: Von Willebrand disease in.: Scriver, CR et al. (eds): The metabolic and molecular bases of inherited disease vol III, McGraw-Hill, 1995, 7th edition, pp. 3269-80. 91 Nichols, WC et al.: ERGIC-53 gene structure and mutation analysis in 19 combined factors V and VIII deficiency families. Blood 1999; 93: 2261-6. 92 Zhang, B et al.: Bleeding due to disruption of a cargo-specific ER-to Golgi transport complex. Nat Genet 2003; 34: 220-5. 93 Panicker, J et al: The overall effectiveness of profilaxis in severe haemophilia. Haemophilia 2003; 9: 272-8.
98
Irodalomjegyzék
94 Fischer, K et al.: Prophylaxis for severe haemophilia: clinical and economical issues. Haemophilia 2003; 9: 376-81. 95 Berntorp, E et al.: Consensus perspectives on prophhylactic therapy for haemophilia: summary statement. Haemophilia 2003; 9 (Suppl. 1): 1-4. 96 Wight, J et al: The epidemiology of inhibitors in haemophilia A: a systematic review. Haemophilia 2003: 9: 418-35. 97 Hilgartner, MW: Factor replacement therapy in: Hilgartner, MW, Pochedly, C (eds.): Hemophilia in the child and adult. Raven Press, 1989, 3rd edition, p. 9. 98 Udvardy, M: A haemophilia génterápiája Transzfúzió 2001; 34: 225-30. 99 Peake, IR et al.: Report of a joint WHO/WFH meeting on the control of haemophilia: carrier detection and prenatal diagnosis. Blood Coag Fibrinol 1993; 4: 313-44. 100 Miller, CH: Genetics of hemophilia and von Willebrand's disease in: Hemophilia in the child and adult. Hilgartner, MW, Pochedly, C eds. Raven Press, 1989, 3rd edition, p. 306. 101 Haldane, JBS: The rate of spontaneous mutation of a human gene. J Genet 1935; 31: 317. 102 Becker, J et al.: Characterisation of the factor VIII defect in 147 patients with sporadic Hemophilia A: family studies indicate a mutation type-dependent sex ratio of mutation frequencies. Am J Hum Genet 1996; 58: 657-70. 103 Rosendaal, FR et al.: Sex ratio of the mutation frequencies in haemophilia A: estimation and metaanalysis. Hum Genet 1990; 86: 139-46. 104 Windsor, S et al.: Multiplex analysis of two intragenic microsatellite repeat polimorphisms in the genetic diagnosis of haemophilia A. Br J Haematol 1994; 86: 810-5. 105 Jarjanazi, H et al.: Analysis of the two microsatellite repeat polymorphisms of the factor VIII gene in the Turkish population. Br J Haematol 1998; 100: 589-93. 106 Kogan, S et al.: Mutations and a polymorphism in the factor VIII gene discovered by denaturing gradient gel electrophoresis. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 2092-6. 107 Caglayan, SH et al.: Polymorphisms associated with the FVIII and FIX genes in the Turkish population. Haemophilia 1995; 1: 184-9. 108 Lalloz, MR et al.: Haemophilia A diagnosis by analysis of a hypervariable dinukleotide repeat within the factor VIII gene. Lancet 1991; 338: 207-11. 109 Lalloz, MR et al.: Haemophilia A diagnosis by simultaneous analysis of two variable dinucleotide tandem repeats within the factor VIII gene. Br J Haematol 1994; 86:804-9. 110 Wehnert, M et al.: Four STR polymorfisms map to a 500 kb region between DXS15 and DXS134. Hum Mol Genet 1993; 2: 1503. 111 Richards, B et al.: Rapid PCR analysis of the St14 (DXS52) VNTR. Nucl Acids Res 1991; 19: 1944. 112 Czink, E: Idiopathias haemochromatosis. Kandidátusi értekezés. 1991. 113 Miller, SA et al.: A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl Acids Res 1988; 16: 1215-8.
99
Irodalomjegyzék
114 Martinez, PA et al.: Simple and rapid detection of the newly described mutations in the HLA-H gene. Blood 1997; 89: 1835-6. 115 Wittwer, CT et al.: The LightCyclerTM: A microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control. Biotechniques 1997; 22: 176-181. 116 Wittwer, CT et al.: Continuous fluorescence monitoring of rapid Cycle DNA amplification. Biotechniques 1997; 22: 130-8. 117 Kogan, SC et al.: An improved method for prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNA sequences. New Engl J Med 1987; 317: 985-90. 118 Klein, I et al.: Indirekt módszerek a haemophilia A genetikai diagnosztikájában. Orv Hetil. 1998; 139: 487-91. 119 Arruda, VR et al.: Eleven novel mutations in the factor VIII gene from Brazilian Haemophilia A patients. Blood 1995; 86: 3015-20. 120 Diamond, C et al.: Amino acid substitutions in consereved domains of factor VIII and related proteins: Study of patients with mild and moderately severe haemophilia A. Hum Mutat 1992; 1: 248-57. 121 Liu, Q et al.: Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in haemophilia A. Blood 1998; 92: 1458-9. 122 Foord, OS et al.: Long-distance PCR. in PCR primer. A laboratory manual. Eds Dieffenbach CW and Dveksler GS. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. 123 Sambrook, J et al.: Analysis of genomic DNA by Southern hibridization. Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, pp. 9.31-9.62 124 Sambrook, J et al.: Fresh competent E. coli prepared using calcium chlorid. Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, p. 1.82 125 Sambrook, J et al.: Small scale preparations of plazmid DNA. Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, pp. 1.25-1.28 126 Jenkins, PV et al.: Analysis of intron 22 inversions of the factor VIII gene in severe hemophilia A: Implications for genetic counseling. Blood 1994; 84: 2197-201. 127 Sham, P: Statistics in human genetics. Arnold Application of Statistics Series. London, 1998, pp. 201. 128 Beutler, E et al.: A common intron 3 mutation (IVS3 –48C→G) leads to misdiagnosis of the c.845G→A (C282Y) HFE gene mutation. Blood Cells Mol Dis 2000; 26: 229-33. 129 Beutler, E et al.: Commentary on significance of linkage disequilibrium between mutation C282Y and a MseI polymorphism in population screening and DNA diagnosis of hemochromatosis. Blood Cells Mol Dis 1999; 25: 253-4. 130 Merryweather-Clarke, AT et al.: Polymorphism in intron 4 of HFE does not compromise hemochromatosis mutation results. Nat Genet 1999; 23: 271-2.
100
Irodalomjegyzék
131 Chin, CYB et al.: PCR conditions for HFE C282Y: Lack of effect of 5569G/A polymorphism with 55°C annealing. Clin Chem 2000; 46: 303. 132 Beutler, E: Genetic irony beyond haemochromatosis: clinical effects of HLA-H mutations. Lancet 1997; 349: 296-297. 133 Mullighan, CG et al.: A rapid method of haplotyping HFE mutations and linkage disequilibrium in a Caucasoid population. Gut 1998; 42: 566-9. 134 Spriggs, EL et al.: Hemochromatosis mutations C282Y and H63D in ”cis” phase. Am J Hum Genet 1999; 65: A492 (abstract). 135 Holmstrom, P et al.: Mild iron overload in patients carrying the HFE S65C gene mutation: a retrospective study in patients with suspected iron overload and healthy controls. Gut 2002; 51: 723-30. 136 Nielsen, P et al.: Prevalence of the C282Y and H63D mutations in the HFE gene in patients with hereditary hemochromatosis and in control subjects from Northern Germany. Br J Haematol 1998; 103, 842-5. 137 Oberkanins, C et al.: Genotyping of common hereditary hemochromatosis in microtiter plates. Eur J Hum Gene. 1998; 6 (Suppl1): 62 (abstract). 138 Szakony, Sz et al.: The frequency of the hemochromatosis C282Y mutation in the ethnic Hungarian and Romany populations of Eastern Hungary. Br J Haematol 1999; 107: 464-5 139 Beutler, E et al.: The effect of HFE genotypes in patients attending a health appraisal clinic. Ann Intern Med 2000; 133: 329-37. 140 Olynyk, JK et al.: A population-based study of the clinical hemochromatosis gene. New Eng J Med 1999; 341 718-24. 141 Rossi, E et al.: Compound heterozygous hemochromatosis genotype predicts increased iron and erythrocyte indices in women. Clin Chem 2000; 46: 162-6. 142 Adams, PC et al.: The relationship between iron overload, clinical symptoms, and age in 410 patients with genetic haemochromatosis. Hepatology 1997; 25: 162-6. 143 Adams, PC et al: Clinical and family studies in genetic haemochromatois: Microsatellite and Hfe studies in five atypical families. Hepatology 1997; 26: 986-90. 144 Shaheen, NJ et al.: Clinical characteristics of hereditary hemochromatosis patients who lack the C282Y muation. Hepatology 1998; 28: 526-9. 145 Beutler, E et al.: Penetrance of 845G→A (C282Y) HFE hereditary haemochromatosis mutation in the USA. Lancet 2002; 359: 211-18. 146 Beutler, E: The HFE Cys282Tyr mutation as a necessary but not sufficient cause of clinical hereditary hemochromatosis. Blood 2003; 101: 3347-50. 147 Beutler, E: Rebuttal to Ajioka and Kushner. Blood 2003; 101: 3354-7. 148 Ajioka, RS et al.: Clinical consequences of iron overload in hemochromatosis homozygotes. Blood 2003; 101: 3351-4.
101
Irodalomjegyzék
149 Ajioka, RS et al.: Rebuttal to Beutler. Blood 2003; 101: 3358. 150 Santos, M et al.: Mutations of the hereditary hemochromatosis candidate gene HLA-H in porphyria cutanea tarda. New Eng J Med 1997; 336: 1327-8. 151 Sampietro, M et al.: High prevalence of the His63Asp HFE mutation in Italian patients with porphyria cutanea tarda. Hepatology 1998; 27: 181-4. 152 George, DK et al.: Increased hepatic iron concentration in nonalcoholic steatohepatitits is associated with increased fibrosis. Gastroenterology 1998; 114: 311-318. 153 Yaouang, J et al.: Haemochromatosis Cys282Tyr mutation in pyridoxine-responsive sideroblastic anaemia. Lancet 1997; 349: 1475-6. 154 Weinberg, ED. Iron withold: a defense against infection and neoplasia. Physiol Rev 1984; 64: 65102. 155 Nelson, RL et al.:Risk of neoplastic and other diseases among people with heterozygozity for hereditary hemochromatosis. Cancer 1995; 76: 875-9. 156 Halliwell, B et al.: Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview. Methods Enzymol 1990; 186: 1-85. 157 Loeb, LA et al.: Mutagenesis by autoxidation of iron with isolated DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 3918-22. 158 Grobois, B et al.: Hemochromatosis mutations and idiopathic acquired sideroblastic anemia (IASA). Eur J Int Med 1999; 10 (Suppl1): S66 (abstract). 159 Rose, C et al.: Modalities and effectiveness of iron chelation by deferoxamine (DFO) in multitransfused patients with low risk myelodysplastic syndrome (MDS). Leukemia Research 1999; 23 (Suppl1): S49 (abstract). 160 Strachan, T at al.: Human molecular genetics, Bios Scientific Publishers, Oxford, 1996; pp. 313-334. 161 Wion, KL et al.: A new polymorphism in the factor VIII gene for prenatal diagnosis of haemophilia A. Nucl Acid Res 1986; 14: 4535-4242. 162 De Brasi, CD et al.: Specific analysis of the intron 22 XbaI polymorphism of the human factor VIII gene using long-distance PCR. Br J Haematol 1999; 107: 566-8. 163 Windsor, S et al.: Direct detection of a common inversion mutation in the genetic diagnosis of severe hemophilia A. Blood 1994; 84: 2202-5. 164 Bock, I et al.: A VIII. faktor génjének molekuláris biológiai vizsgálata haemophilia A megbetegedésben. Orv Hetil 1996; 137: 2573-5. 165 Dardik, R et al.: Current strategy for genetic analysis of haemophilia A families. Haemophilia 1996; 2: 11-7. 166 Gaucher, C et al.: Characterization of factor VIII gene inversions using a non-radioactive detection method: a survey of 102 unrelated haemophilia A families from Northern France. Nouv Rev Fr Hematol 1995; 37: 131-6.
102
Irodalomjegyzék
167 Ljung, R et al.: Inversions of the factor VIII gene in Swedish patients with severe haemophilia A. Eur J Haematol 1995; 54: 310-3. 168 Poláková, H et al.: Factor VIII gene inversions in haemophilia A patients of Slovakia. Hum Hered 1998; 48: 34-7. 169 Poon, MC et al.: Factor VIII gene rearrangement analysis and carrier determination in haemophilia A. J Lab Clin Med 1995; 125: 402-6. 170 Schröder, W et al.: Intron 22 of factor VIII gene – A hot spot for structural aberrations causing severe haemophilia A. Blood 1996; 87: 3067-8. 171 Shetty, S et al.: Intron 22 inversions in factor VIII gene in Indian haemophiliacs. Thromb Haemost 1998; 79: 881. 172 Strmecki, L et al.: Inversions of the factor VIII gene in Slovenian patients with severe haemophilia A. Eur J Haematol 1999; 63: 64-6. 173 Tizziano, EF et al.: Inversions in the factor VIII gene in Spanish haemophilia A patients. Blood 1994; 83: 3826. 174 Weinmann, AF et al.: Clinical correlates among 49 families with haemophilia A and factor VIII gene inversions. Am J Haematol 1996; 51: 192-9. 175 Enayat, MS et al.: Another unique variant pattern of intron 22 rearrangement in factor VIII gene seen in a haemophilia A family. Blood 1995; 85: 2639. 176 Yamazaki, E et al.: Variant of intron 22 inversions in the factor VIII gene in severe haemophilia A. Blood Coag Fibrinol; 8: 445-9. 177 Enayat, MS et al.: Another variant pattern of intron 22 inversion in factor VIII gene seen in a severe haemophilia A patient. Thromb Haemost 1997; 78: 1303. 178 Lavergne, J et al.: Carrier diagnosis of haemophilia A in a family with partial deletion of the FVIII gene using quantitative real-time duplex PCR. Eur J Hum Genet 2001; 9 (Suppl. 1), 419 (abstract). 179 Benichou, B et al.: Possible misdiagnosis of factor VIII gene inversion in a case of severe haemophilia A. Blood 1996; 87: 3525-6. 180 Lavergne, JM et al.: A directed search for mutations in hemophilia A using restriction enzyme analysis and denaturing gradient gel electrophoresis. A study of seven exons in the factor VIII gene of 170 cases. Nouv Rev Fr Hemat 1992; 34: 85-91. 181 Murray, V et al.: The determination of the sequences present in the shadow bands of a dinucleotid repeat PCR. Nucl Acids Res 1993; 21: 2395-8. 182 Aseev, M et al.: Allele frenquencies and molecular diagnosis in haemophilia A and B patients from Russia and from some Asian republics of the former U.S.S.R. Prenat Diagn 1994; 14: 513-22. 183 Goodeve, AC et al.: A rapid and cost effective method for analysis of dinucleotide repeat polymorphisms in the factor VIII gene. Blood Coag Fibrinol 1996; 7: 672-7. 184 Goodeve, AC: Advances in carrier detection in haemophilia. Haemophilia 1998; 4: 358-64.
103
Irodalomjegyzék
185 Kochhan, I et al.: Haemophilia A diagnosis by automated fluorescent DNA detection of ten factor VIII intron 13 dinucleotide repeat alleles. Blood Coag Fibrinol 1994; 5: 497-501. 186 Yip, B et al.: Intragenic dinukleotide repeats in factor VIII gene for the diagnosis of haemophilia A. Br J Haematol 1994; 88: 889-91.
104
