11. előadás: A génektől a fehérjékig – A genetikai információ áramlása • A DNS információtartalma specifikus nukleotidsorrend formájában van jelen • Az átörökített DNS fehérjék szintézisét szabályozva tulajdonságok megjelenéséhez vezet, • Így a fehérjék jelentik a kapcsolatot a genotípus és a fenotípus között • A gén expresszió/kifejeződés, az a folyamat, mely során a DNS információinak irányításával fehérjék képződnek.
A gének a fehérjéket a transzkripció és a transzláció folyamatain keresztül határozzák meg • Transzkripció: Az élő sejtekben végbemenő folyamat, melynek során a DNS genetikai információja egy hírvivő (messenger) RNS molekulára (mRNS) íródik át, a fehérjeszintézis első lépéseként.
• Transzláció: Az élő sejtekben az a biokémiai folyamat, amelyben a hírvivő RNS-ben kódolt genetikai információ „lefordítódik” egy polipeptidláncban levő aminosavak sorrendjére a fehérjeszintézisben.
Történeti áttekintés: • 1902-ben Archibald Garrod britt orvos elsőként utalt rá hogy a gének a fenotípust specifikus kémiai reakciókat katalizáló enzimeken keresztül alakítják ki • Az öröklődő betegségek tüneteit arra vezette vissza, hogy a beteg nem tud számos enzimet megtermelni. (pl. alkaptonuria – tirozin anyagcsere zavar) • A gének és enzimek szerepének megértését segítette annak felismerése, hogy a sejtben a felépítő és a lebontó folyamatok metabolikus útvonalakon mennek végbe
Neurospora gomba mutánsai: • George Beadle és Edward Tatum a penészgombát Röntgen sugaraknak tette ki, és olyan mutánsokat állított elő, melyek nem tudtak túlélni minimál tápközegben (ionok, sók, cukor, biotin) • Keresztezéseket használva, az arginin hiányos mutánsok három csoportját azonosították: mindegyik más arginin szintézishez szükséges enzimre volt hiányos • Ők fejlesztették ki az egy gén – egy enzim hipotézist, mely szerint minden gén egy specifikus enzim termelésért felel
EREDMÉNYEK
KÍSÉRLET
Nincs növekedés: a mutáns sejtek nem tudnak növekedniés osztódni
Vad típus
Class I mutáns
Class II mutáns Class III mutáns
Minimal medium (MM) (kontroll)
“Minimal medium”
MM + ornithin Feltételek
Növekedés: Vad-típusú sejtek növekednek és osztódnak
Neurospora crassa mutánsok osztályozása
MM + citrullin
MM + arginin (control) kiegészítők Eredmény: hiányában is növekszik KÖVETKEZTETÉS
Gének (enzimket kódolnak)
Vad típus Prekurzor
A gén
enzim A
Ornithin B gén C gén
növekszik: ornithin, citrullin vagy arginin mellett Class I mutáns (mutáció az A génben) Prekurzor enzim A
Ornithin
növekszik: citrullin vagy arginin mellett
Csak arginin jelenlétében nő
Class II mutáns Class III mutáns (mutáció a (mutáció a B génben) C génben) Prekurzor
Prekurzor
enzim A
enzim A
Ornithin
Ornithin
enzim B
enzim B
enzim B
enzim B
Citrullin
Citrullin
Citrullin
Citrullin
enzim C
enzim C
enzim C
enzim C
Arginin
Arginin
Arginin
Arginin
Az egy gén – egy enzim elmélet finomítása • Számos fehérje nem enzim (keratin, inzulin) • Számos fehérje több alegységből (fehérjeláncból) áll, melyek mindegyikét másmás gén kódolja • Ezért az eredeti elképzelést egy gén – egy polipeptid hipotézisre módosították • még ez sem pontos: • egy génről több fehérjeváltozat is készülhet (alternatív splicing) • Néhány gén csak RNS-t kódol
A transzkripció és a transzláció alapjai • Az RNS molekula kapcsolat a fehérjék és az azokat kódoló gének között • A transzkripció során hírvivő/messenger RNS (mRNS) képződik, • melyről a transzláció helyén, a riboszómákon képződnek a fehérjék • Prokariótákban a transzláció már a transzkripció alatt megindulhat • Eukariótákban a sejtmaghártya térben elválasztja a két folyamatot • Eukariótákban az RNS transzkriptum módosul, mielőtt mRNS lesz belőle
• Az elsődleges átirat bármely gén RNS átirata mielőtt a processzálódás megtörténne • Az információ áramlás centrális dogmája kimondja, hogy a genetikai információ kifejeződése az alábbiak szerint történik:
DNS
RNS
Protein
Sejtmaghártya
DNS
Transzkripció
RNS processzálás
Pre-mRNS
mRNS DNS
Transzkripció
mRNS Riboszóma
Transzláció
Transzláció
polipeptid
Polipeptid
(a) Prokarióta sejt
Riboszóma
(b) Eukarióta sejt
A Genetikai kód • A genetikai kód az a szabályrendszer, amely megadja, hogy a nukleinsav sorrend hogyan határozza meg (kódolja) az aminosav sorrendet. • A fehérjéket 20 féle aminosav alkotja, de csak 4 féle nukleotid bázissal találkozunk a DNS-ben • Hány nukleotid felelős akkor 1 aminosav kódolásáért?
Kodonok: Nukleotid tripletek • A gén – fehérje irányú információ átadás triplet kódon alapul: három nukleotidos, nem-átfedő szavak sorozatán • A gének szavai az mRNS három nukleotidos, nem-átfedő szavaivá íródnak át • Ezek a szavak fordítódnak le aminosav sorrendé
DNS templát szál
3ʹ
A C C T
5ʹ
A A A C
G G T
T
C G A G T
T G G C
T
C A
5ʹ
DNS molekula
3ʹ
Gén 1
Transzkripció Gén 2 mRNS
5ʹ
U G G
U U
U G G C U C A
3ʹ
Kodon Transzláció Protein
Trp
Aminosav
Phe
Gly
Ser
Gén 3
• A transzkripció alatt a DNS két szála közül az egyik szál, a templát szál, szekvenciája szolgál az RNS molekula készítéséhez mintául • A templát szál az adott gén esetén mindig ugyanaz a szál • Transzláció alatt, az mRNS triplets, kodonjai, lesznek leolasva 5ʹ - 3ʹ irányban
“A kód feltörése” • Mind a 64 kodont leírták a 60-as évek közepéig • A 64 tripletből, 61 aminosavat kódol; 3 triplet stop signálként funkcionál (leállítja a transzlációt) • A genetikai kód redundáns, de egyértelmű • A kodonokat megfelelő leolvasási keretben (reading frame), megfelelő csoportosításban kell olvasni, hogy a megfelelő polipeptidhez jussunk
második mRNS bázis UUU
Első mRNS bázis (5ʹ vég a kodonon)
U
UUC UUA
A
Phe Leu
UCC UCA
Ser
UAC
Tyr
UGU UGC
Cys
U C
UAA Stop UGA Stop A UAG Stop UGG Trp G
CUU
CCU
CAU
CUC
CCC
CAC
CUA
Leu
CCA
Pro
CAA
CUG
CCG
CAG
AUU
ACU
AAU
ACC
AAC
AUC
Ile
AUA AUG
ACA Met vagy start
GUU G
UAU
UCU
G
UCG
UUG
C
A
C
GUC GUA GUG
Val
Thr
AAA
ACG
AAG
GCU
GAU
GCC GCA GCG
Ala
GAC GAA GAG
His Gln
Asn Lys
Asp Glu
CGU
U
CGC
C
CGA
Arg
CGG AGU AGC AGA AGG
G Ser Arg
GGU GGC GGA GGG
A
U C A G U
Gly
C A G
Harmadik mRNS bázis (3ʹ vég a kodonon)
U
A genetikai kód tulajdonságai: •
Triplet szerkezetű, vagyis egy aminosavat három egymást követő nukleotid egység határoz meg.
•
Nem átfedő, vagyis minden nukleotid egység legfeljebb egy triplethez tartozik.
•
Vesszőmentes, vagyis az egyes tripletek között nincs szünetjel.
•
A leolvasása speciális kezdő tripletnél indul (start kodon), és speciális záró tripleteknél (stop kodonok) fejeződik be.
•
A kód egyértelmű, vagyis egy adott triplet csak egyféle aminosavat jelent.
•
A kód redundáns (illetve „degenerált”), vagyis a legtöbb aminosavat egynél több triplet kódolja.
•
A kód (szinte) univerzális, vagyis minden élőlényben ugyanaz (a mitokondriumokban kissé eltér a kód).
(a) dohány növény szentjános- (b) sertés medúza gént fejez ki bogár gént fejez ki
A transzkripció molekuláris komponensei • RNS szintézist az RNS polimeráz katalizálja, mely szétnyitja a DNS szálakat, és összekapcsolja az RNS nukleotidokat • a képződő RNS komplementer a DNS templát szállal • az RNS szintézis ugyanazokat a szabályokat követi, mint a DNS esetén, csak T helyett U van • Az a DNS szekvenciát, ahova az RNS polimeráz kapcsolódik promóternek nevezzük; baktériumokban, a transzkripciót leállító szekvencia a terminator • a kinyújtott, átíródó DNS szakaszt, transzkripciós egységnek hívjuk
Promóter
Transzkripciós egység
5ʹ 3ʹ Start pont RNS polimeráz
3ʹ 5ʹ
DNS 1 Iniciáció
nem-templát szál (DNS)
5ʹ 3ʹ RNS átirat
Kitekert DNS
3ʹ 5ʹ
templát szál (DNS) 2 Elongáció
Visszatekert DNS 5ʹ 3ʹ
3ʹ 5ʹ
3ʹ 5ʹ RNS átirat
3 Termináció 3ʹ 5ʹ
5ʹ 3ʹ 5ʹ
Kész RNS átirat Az átírás iránya
3ʹ
RNS polimeráz kötése és a transzkripció kezdete • A promóterek a transzkripció start pontját jelzik, és általában több tíz nukleotidra kiterjednek a start pont elé (upstream) • A transzkripciós faktorok szabályozzák az RNS polimeráz kötését és a transzkripció kezdetét • A transzkripciós faktorok és az RNS polimeráz II összeszerelődésével és promóterhez való kapcsolódásával létrejön a transzkripciós iniciációs komplex • Eukariótákban a TATA box-nak nevezett promóter alapvető az iniciációs komplexben
1 Eukarióta promóter Promóter
nem-templát szál
DNS 5ʹ 3ʹ
3ʹ 5ʹ
T A T A A AA A T AT T T T
TATA box
transzkripciós faktorok
Start pont
templát szál
2 Számos transzkripciós faktor köt a DNS-hez
5ʹ 3ʹ
3ʹ 5ʹ 3 A transzkripciós iniciációs komplex kialakul
RNS polimeráz II transzkripciós faktorok 5ʹ 3ʹ
5ʹ
3ʹ RNS átirat
transzkripciós iniciációs komplex
3ʹ 5ʹ
RNS szál hosszabítása (elongáció) • Ahogy az RNS polimeráz mozog a DNS-en, kicsavarja a kettős hélixet, 10-20 bázist egyszerre • A transzkripció sebessége 40 nukleotid / mp eukariótákban • egy gént egyidejűleg számos RNS polimeráz átírhat • a nukleotidok a növekvő RNS molekula 3’ végéhez kapcsolódnak
nem-templát szál (DNS) RNS nukleotidok RNS polimeráz
A
3ʹ
T
C
5ʹ
5ʹ
C
C
A A
5ʹ
3ʹ end
C A
U
C
C A
T
A
G
G T
3ʹ
T
Az átírás iránya templát szál (DNS) Újonan képződő RNS
A transzkripció leállítása (Termináció) • A termináció mechanizmusa különböző prokariótákban és eukariótákban • Baktériumokban, a polimeráz megállítja az átírás a terminátor szakasz végén, és az mRNS további módosítások nélkül transzlálható • Eukariótákban az RNS polimeráz II átírja az ún. poliadenilációs szignál szekvenciát; az átírt RNS 10–35 nukleotiddal e szekvencia után leválik
Az eukaróta sejtek módosítják az RNS-t a transzkripciót követően • az enzimek a sejtmagban módisítják a pre-mRNS (RNS processzálás) mielőtt a genetikai üzenet kikerülne a citoplazmába • Az RNS processzálás alatt az elsődleges átirat mindkét vége módosul általában • valamint a molekula számos belső szakasza kivágódik és a távolabbi részek összeillesztődnek
Az mRNS végeinek módosításai • A pre-mRNS molekula végei egyénileg módosítódnak – Az 5ʹ vég módosított nukleotidokat kap: 5ʹ sapka/cap – A 3ʹ végen poli-A farok alakul ki
• Ezek a módosítások számos funkciót eredményeznek – gyorsítják az mRNS exportját a citoplazmába – megvédik az mRNS-t a hidrolitikus enzimektől – segítik, hogy a riboszómák hozzákapcsolódjanak az 5ʹ véghez
RNS processzálás
5ʹ G
Protein-kódoló szakasz
P P P
5ʹ sapka 5ʹ UTR
poliadenilációs szignál AAUAAA
Start kodon
UTR: nem transzlálódó régió
Stop kodon
3ʹ UTR
3ʹ
AAA… AAA
Poli-A farok
A gének szerkezet és az RNS “splicing” • a legtöbb eukarióta gén és így elsődleges RNS átirataik is mozaikos szerkezetű: a fehérjében megjelenő információ a DNS-ben nem egyetlen, folyamatos „szövegként” van tárolva, hanem egymást követő kisebb egységekre van tördelve. • melyekben kódoló régiók (exon) és nem-kodóló régiók (intron) váltják egymást • Az RNS vágás/splicing eltávolítja az intronokat, és folyamatos kódoló szekvenciával rendelkező RNS molekulát állít elő
RNS splicing
5ʹ Exon Intron Exon Pre-mRNS 5ʹ Cap kodon 1−30 31−104 számok
Intron
Exon 3ʹ Pol-A farok 105− 146 Az intronok kivágódnak és az exonok összeillesztődnek
mRNS 5ʹ Cap 5ʹ UTR
UTR: nem transzlálódó régió
Poli-A farok 1−146 kódoló szakasz
3ʹ UTR
• Számos esetben az RNS splicing ún spliceosomákban történik • A Spliceosoma számos különböző fehérjéből és kis magi ribonukleoproteinből (snRNPs) épül fel , melyek a vágási helyeket ismerik fel
5ʹ
RNS átirat (pre-mRNS) Exon 1
Intron
Protein snRNS
Exon 2 Más proteinek
snRNPs Spliceosoma
5ʹ
Spliceosoma komponensek 5ʹ
mRNS Exon 1
Exon 2
kivágott intron
Ribozimek • Ribozimek katalitikus RNS molekulák, melyek enzimként képesek funkcionálni, és hasítják az RNS-t • Az RNS három tulajdonsága teszi lehetővé, hogy enzimként funkcionáljon – önmagával képes bázispárokat kialakítani, így lehet 3D szerkezete – RNS számos bázisa funkciós csoporttot tartalmaz, mely részt vehet katalízisben – RNS hidrogén-kötést alakíthat ki más nukleotid molekulákkal
Az intronok funkcionális és evolúciós jelentősége • Számos intron olyan szekvenciákat tartalmaz, melyek a génexpressziót szabályozzák • Ugyanarról a génről többféle polipeptid is keletkezhet, annak függvényében, hogy az mRNS-be mely exonok kerülnek bele • ezt a folyamatot alternatív RNS splicing-nak nevezzük • A fehérjék gyakran moduláris szerkezetűek, a modulokat doméneknek nevezzük. • Számos esetben a különböző exonok a fehérje különböző doménjeit kódolják • Exon keverődés/shuffling új, evolúciósan sikeres fehérjét eredményezhet
Gén DNS Exon 1 Intron Exon 2 Intron Exon 3 Transzkripció RNS processzálás Transzláció
Domain 3
Domain 2 Domain 1 Polipeptid
II. Transzláció: molekuláris komponensek • A sejt az mRNS üzenetét szállító/transzfer RNSek (tRNS) segítségével fordítja le • tRNSs az aminosavakat szállítja a riboszómákhoz • tRNS molekulák nem egyformák – mindegyik egy specifikus aminosvat szállít a végén – mindegyik rendelkezik antikodonnal, mely az mRNS-en található kodonok komplementer párja
Aminosav kapcsolódási hely
•
3ʹ
• 5ʹ
A tRNS molekula egyszálú RNSből áll, mely kb. 80 nukleotid hosszú A hidrogén kötések miatt megcsavarodik és 3D szerkezettel rendelkezik
Aminosav kapcsolódási hely
5ʹ 3ʹ
hidrogén kötések hidrogén kötések
A A G
3ʹ Antikodon (a) Két dimenziós struktúra
Antikodon (b) három dimenziós strukrúra
5ʹ Antikodon
• A pontos transzláció két lépést igényel – Elsőként: megfelelő egyezést a tRNS és az aminosav között, ezt az aminoacil-tRNS szintetáz biztosítja – Másodszor: megfelelő egyezést a tRNS antikodonja és az mRNS egy kodonja között
• A kodon harmadik bázisának “lötyögése” (flexibilis párosodása) lehetővé teszi, hogy számos tRNSs egynél több kodonhoz is kapcsolódhasson
Aminoacil-tRNS szintetáz (enzim) Aminosav P P P P
Adenozin
P Pi
Adenozin
ATP
Pi
Pi
tRNS
Aminoacil-tRNS szintetáz (enzim)
tRNS
Aminosav
P
Adenozin
AMP
Számítógépes modell
Aminoacil tRNS ( töltött tRNS )
Riboszóma • Riboszómas elsősegítik a megfelelő tRNS antikodonok mRNS kodonokhoz történő kapcsolódását a fehérjeszintézis során • A kis és a nagy riboszómális alegység fehérjékből és riboszómális RNSből (rRNS) épül fel • A pro- és eukarióta riboszómák hasonlóak, de van néhány jellegzetes különbség : • különbözik az alegységek mérete • számos antibiotikus a bakteriális riboszómákat veszi célba, de nem hat az eukarióta riboszómákon
•
növekvő polipeptid
tRNS molekulák
A Riboszóma három tRNS kötőhellyel rendelkezik: • P hely tartalmazza a növekvő polipeptid láncot hordozó tRNS-t • A hely tartalmazza a következő aminosavat szállító tRNS-t • E hely a kilépési pont, az üres tRNS elhagyja a riboszómát
E P
kilépő alagút (exit tunnel)
nagy alegység A
kis alegység 5ʹ
mRNS
3ʹ
(a) működő riboszóma modellje növekvő polipeptid
P hely (Peptidil-tRNS kötőhely)
Exit tunnel
Amino terminális
Következő aminosav adódik a lánchoz
A hely (AminoaciltRNS kötőhely)
E hely (Exit site) E
P
A
mRNS kötőhely (b) A kötőhelyek sematikus modellje
E
nagy alegység
mRNS
kis alegység
5ʹ
tRNS 3ʹ kodons
(c) sematikus modell mRNSsel és tRNSekkel
Építsünk polipeptidet! • A transzláció három szakaszra osztható – Iniciáció – Elongáció – Termináció
I. Riboszóma asszociáció és a transzláció iniciációja • Az iniciációs fázisban áll össze az mRNS, az első aminosavat hordozó tRNS és a két riboszómális alegység • Elsőként a kis alegység köti az mRNS-t és hozzákapcsolódik az iniciátor tRNS • Majd a kis alegség elmozdul az mRNS-en, míg a start kodonhoz (AUG) nem ér • Az iniciációs faktor fehérjék a nagy alegységet a komplexhez kapcsolják
nagy riboszómális alegység
3ʹ U A C 5ʹ 5ʹ A U G 3ʹ
P hely Pi
iniciátor tRNS
+
GTP GDP E
mRNS 5ʹ Start kodon mRNS kötőhely
3ʹ kis riboszómális alegység
5ʹ
A
3ʹ
transzlációs iniciációs komplex
II. A polipeptid lánc elongációja • Az elongációs fázis alatt a következő aminosav az előző C terminálisához adódik hozzá. A folyamat az elongációs faktor jelenlétét ígényli • három lépésből ál: 1. 2. 3.
kodon felismerés, a peptid kötés kialakulása transzlokáció
• a transzlokáció az mRNS 5′ - 3′ irányában történik
Amino terminális
mRNS Riboszóma kész fogadni a következő tRNS-t 5ʹ
E
3ʹ P A site site
GTP GDP + P i
E
E P A
P A GDP + P i GTP
E P A
III. A transzláció befejezése (termináció) • A termináció bekövetkezik, ha az mRNS-en egy stop kodon a riboszóma A helyére ér • Az A hely release faktor fogad • A release factor víz molekula hozzáadását okozza aminosav helyett, a riboszóma elengedi a fehérjét és a transzlációs komplex szétesik
Release faktor
szabad polipeptid 5ʹ
3ʹ
3ʹ 5ʹ
5ʹ Stop kodon (UAG, UAA, or UGA)
2
GTP 2 GDP + 2 P i
3ʹ
Poliriboszómák • Számos riboszóma tudja ugyanazt az mRNS molekulát egyidejűleg használni: ún. poliriboszóma (vagy poliszóma) • A poliriboszómák lehetővé teszik, hogy nagyon gyorsan képződjön több fehérje kópia
növekvő polipeptids
kész polipeptid
érkező ribosomális alegységek mRNS (5ʹ vég)
mRNS (3ʹ vég)
(a)
Riboszómák mRNS
(b)
0.1 µm
DNS
Transzkripció
3ʹ
5ʹ
RNS átirat
Exon
RNS polimeráz
RNS Processzálás
RNS átirat (pre-mRNS) AminoaciltRNS szintetáz
Intron NUKLEUSZ
Aminosav
Aminosav aktiváció
tRNS
CITOPLAZMA mRNS
Növekvő polipeptid 3ʹ
A
Aminoacil (töltött) tRNS
P E
Ribosomális alegységek
Transzláció E
A
Antikodon kodon Riboszóma
A transzláció során elkészült fehérje módosítása és irányítása • Gyakran a transzláció önmagában nem elegendő a funkcionális fehérje elkészítéséhez • A polipeptid láncok általában módosulnak a transzlációt követően és/vagy a sejt megfelelő helyére irányítódnak
A fehérjék felgombolyodása és a poszttranszlációs módosítások • A fehérjeszintézis alatt és után a polipeptid lánc spontán 3 dimenziós alakba gombolyodik • A poszttranszlációs módosítások (pl. glikoziláció) egyes fehérjék esetén elengedhetetlenek a fehérje működéséhez • Számos fehérje enzimatikus hasításra aktiválódik • Más fehérjék csak alegységeket képeznek és az alegységek összeállva hoznak létre működő fehérje együttest
A polipetidek megfelelő helyre irányítása • A sejtekben szabad és kötött riboszómákat találunk • A citoplazmatikus szabad riboszómák elsősorban a citoszólban szerepet játszó fehérjéket szintetizálnak • A kötött riboszómák az endomembrán rendszer fehérjéit és exportfehérjéket szintetizálnak • A két csoport riboszómái egyformák, és állapotukat változtathatják
• A polipeptid szintézis mindig a citoplazmában kezdődik • Ha a fehérje nem tartalmaz szignál szakaszt , akkor a szintézis a citoplazmában fejeződik is be • A kötött riboszómákon szintetizálódó fehérjék szignál peptiddel jelöltek
• A szignál felismerő részecske (signalrecognition particle – SRP) köti a szignál peptidet és irányítja a riboszómát az ERhoz
1 Riboszóma 4
mRNS Szignál peptid 3
SRP 2 ER LUMEN
SRP receptor fehérje
transzlokációs komplex
5
Szignál peptid lehasad
ER membrán Protein 6 CITOSZÓL
