Mariyani et al. : Genistein Menurunkan Kadar MMP-2 pada Kultur Sel Endometriosis
Genistein Menurunkan Kadar Matriks Metalloproteinase-2 (MMP-2) pada Kultur Sel Endometriosis Mariyani1, Sutrisno2, Yuyun Yueniwati3 1 Program Studi Magister Kebidanan, 2Divisi Fertilitas Endokrinologi Reproduksi, Departemen Obstetri dan Ginekologi 3 Departemen Radiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya, Rumah Sakit Umum Dr. Saiful Anwar Malang ABSTRAK Terapi genistein dikembangkan karena bersifat anti-estrogenik, berfungsi sebagai antioksidan, inhibitor proliferasi, dan anti-kanker. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan pemberian genistein dapat menurunkan kadar MMP-2 pada kultur sel endometriosis. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang dilakukan di Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Menggunakan jaringan endometriosis yang didapatkan dari pasien penderita endometriosis melalui tindakan laparoskopi, kemudian dilakukan proses kultur hingga konfluent. Kultur dibagi menjadi 7 kelompok, yaitu : kelompok tanpa perlakuan, pemberian genistein dosis 5μM/L, 10μM/L, 20μM/L, 30μM/L, 40μM/L, 50μM/L dengan waktu inkubasi 6 jam, 24 jam, 48 jam. Pengukuran kadar MMP-2 menggunakan ELISA kit. Data hasil pengamatan dianalisis dengan uji ANOVA dan uji regresi. Ada pengaruh pemberian genistein terhadap kadar MMP-2 pada kultur sel endometriosis (p<0,05).Genistein mampu menurunkan kadar MMP-2 terendah pada dosis 30μM/L (3.57±1.94ng/ml), 40μM/L (3.44±1.47ng/ml) dan 50μM/L (3.54±1.3 d ng/ml) bila dibandingkan dengan perlakuan dosis yang lain. Rata-rata kadar MMP-2 pada waktu inkubasi 6 jam (2.21±0.93a ng/ml)lebih kecil daripada waktu inkubasi 24 jam (3.81±0.91 ng/ml) dan 48 jam (7.94±3.08 ng/ml). Simpulan, genistein dapat menurunkan kadar MMP-2 pada kultur sel endometriosis, terutama pada dosis 40 μM/L dan waktu inkubasi 48 jam. (MOG 2014;22:79-85) Kata Kunci: endometriosis, genistein, Matriks Metalloproteinase 2
ABSTRACT Genistein therapy is developed as it is anti-estrogenic, has a function as antioxidant, proliferatory inhibitor, and anti-cancer. The objective of this study was to determine the effect of genistein to decrease MMP-2 levels in endometriosis cell culture. The design of this study was experimental, had been performed in Physiology Laboratory Medical Faculty of Brawijaya university. This study used endometriosis tissue from patients with endometriosis via laparoscopy, cultured process to make aconfluent.The culture was divided into 7 groups: untreated group, administration genistein dose of 5μM/L, 10μM/L, 20μM/L, 30μM/L, 40μM/L, 50μM/L with incubation time 6 hours, 24 hours, 48 hours. The measurement of MMP-2 using ELISA kits.The data were analyzed with ANOVA and regression test. There was effect on the administration genistein to MMP-2 levels in endometriosis cell culture (p <0.05).Genistein is able to decrease the MMP-2 level in the lowest dose 30μM/L (3.57 ± 1.94 ng/ml), 40μM/L (3.44 ± 1.47 ng/ml) and 50μM/L (3.54 ± 1.3d ng/ml) when compared with other treatment dose.The average of MMP-2 levels at 6 hours incubation time (0.93 ± 2.21 ng/ml) is smaller than 24-hour incubation time (3.81 ± 0.91 ng/ml) and 48 hours (7.94 ± 3.08 ng/ml). In conclusion, genistein decreases MMP-2 levels in endometriosis cell culture, especially at dose 40 μM/L and an incubation time of 48 hours. (MOG 2014;22:79-85) Keywords: endometriosis, genistein, Matrix Metalloproteinase 2 Correspondence: Mariyani, Program Studi Magister Kebidanan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang
PENDAHULUAN
pada peritoneum memerlukan enzim Matrix Metalloproteinase (MMP) dalam mendegradasi epitel peritoneum.4
Endometriosis merupakan hal yang menakutkan bagi wanita karena mengancam reproduksi yang menjadi fungsi utamanya.1 Diperkirakan 1 dari 10 wanita usia reproduksi menderita endometriosis, atau berkisar 176 juta perempuan diseluruh dunia menderita endometriosis.2 Penyebab endometriosis belum dapat diketahui secara pasti. Ada kemungkinan bahwa autoreactivity berkembang dalam pengaturan kerusakan jaringan lokal kronik. Hal ini yang menyebabkan mengapa sistem kekebalan tubuh merupakan target jaringan endometrium ektopik.3 Selain itu berdasarkan patogenesisnya hasil implantasi jaringan endometrium
MMP memiliki kemampuan untuk mendegradasi komponen matriks ekstraseluler (MES). Aktifitas MMP memiliki peran yang penting dalam endometriosis.5 Pada beberapa percobaan secara invitro, didapatkan keterkaitan antara MMP-2 dan endometriosis. Beberapa penelitian telah menunjukkan konsentrasi MMP-2 meningkat pada cairan peritoneal, pada kultur sel stromal pasien dengan endometriosis.6,7 Saat ini para peneliti memfokuskan terapi endometriosis pada
79
Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 22 No. 2 Mei - Agustus 2014 : 79-85
penghambatan MMP dan penghambatan reseptor estrogen betha (RE-β).8,9
agonist
gram NaHCO2, 0,0371 gram Ethylene Diamine Tetra Acid (EDTA) dalam 1 liter aquadest steril.
Genistein merupakan salah satu terapi hormonal yang dikembangkan karena bersifat anti estrogenik, yang mempunyai fungsi sebagai antioksidan, inhibitor proliferasi, anti kanker, berperan dalam sistem imun dan mampu berikatan dengan reseptor estrogen.10,11 Pada penelitian secara invitro genistein dosis tinggi dapat menurunkan kadar MMP2 mulai dari dosis 25 μM/L pada A-549 cell line.12 Penelitian lain mengungkapkan bahwa pemberian genistein dengan masa inkubasi mulai dari 6 jam pada sel kanker ovarium dapat menekan terjadinya proliferasi sel.13 Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan pengaruh pemberian genistein terhadap kadar MMP-2 pada kultur sel endometriosis, diharapkan dapat menjadi dasar bagi terapi endometriosis.
Medium kultur yang terdiri dari Hank’s F-12 dan DMEM (Delbecco Minimum Essensial Medium) 1:1 dengan 10% FCS (Fetal Calfs Serum), penicillin 50-100 μg/ml, L-Giutamine 2 mm, streptomycin 50-100 μg/ml merk Sigma, Fungizone 250 μg/ml. Prosedur Kultur Specimenakan diproses secara aseptik dan diantarkan dengan es dalam larutan I. Dimana jaringan akan ditempatkan dalam cawan petri steril diameter 9 cm, kemudian jaringan akan dicincang sehingga didapatkan potongan-potongan yang berukuran 0,5-2,0 mm2 dan tebal 1 mm2 dengan menggunakan scalpel steril. Potongan jaringan dimasukkan sebanyak 0,5-1,0 gram kedalam tabung sentrifugasi steril berukuran 15 ml, yang berisi 10 ml larutan II (enzim disosiasi).
BAHAN DAN METODE
Pisahkan specimen tersebut menjadi suspensi sel dengan cara menginkubasi dan mencampur potongan jaringan selama 2-6 jam pada suhu 370C. Inkubasi spesimen secara horizontal dalam tabung sentrifugasi untuk menyebarkan potongan jaringan keseluruh bagian tabung, selama 7 menit sampai terlihat suspensi sel yang telah terdisosiasi (terpisah) berwarna keruh, homogen, terdapat bagian jaringan yang sudah seperti bubur sehingga tampak medium dan sel terpisah. Sentrifugasikan preparat sel tersebut pada 1700 rpm dalam waktu 7 menit, buang larutan disosiasi dengan menggunakan pipet steril. Resuspensi (larutkan kembali) sel-sel dalam 10 ml medium kultur (DMEM), lakukan setrifuge dan buang supernatan. Tambahkan 10 ml 10 ml medium kultur komplit (DMEM, FCS, Penicillin, L-Giutamine, Streptomycin, Fungizone). Inkubasi spesimen secara vertikal dalam tabung kerucut selama 5 menit supaya fragmen-fragmen yang tidak terdisosiasi dapat dikeluarkan dari larutan.
Penelitian ini menggunakan desain eksperimental, Posttest only with control group, dilakukan di Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang pada bulan September – Desember 2013. Sampel yang dipergunakan adalah jaringan endometriosis, dari perempuan yang telah terdiagnosis mengalami endometriosis dan menjalani laparoskopi. Jumlah replikasi pada penelitian ini adalah 4 replikasi dengan 1 kelompok tanpa perlakuan dan 6 kelompok dengan perlakuan genistein yaitu 5 μM/L, 10 μM/L, 20 μM/L, 30 μM/L, 40 μM/L, 50 μM/L dengan waktu inkubasi 6 jam, 24 jam, 48 jam. Alat yang digunakan meliputi seperangkat alat bedah steril, cawan metri, lemari es dengan freezer (-200C), pH meter, LAF (Laminar Air Flow) vertical, Tissue Culture (TC) Plate, mikroskop inverted, mikroskop binokuler, camera digital, incubator dan tabung CO2, Micro Sentrifuge Tube 1,5 ml, syringe microfilter 0.2 μm, pipet mikro 1000μL dan 500μL, tip falcon15 ml, spuit, Sentrifuge, water bath, laboratory bottle 250 ml, timbangan analitik, lampu spritus, cover glass, object glass dan autoclave, serta Human MMP2 (Catalog # DMP2FO) Elisa kit R&D System (Minneapolis; USA) dan ELISA Reader.
Pindahkan supernatan yang mengandung suspensi sel dan medium kultur ke dalam TC Plate dengan menggunakan pipet steril. Inkubasi sel didalam incubator 95% humidified 370C, 5% CO2 agar sel tersebut dapat hidup. Diamkan selama 2 hari, lalu lakukan observasi dengan menggunakan mikroskop inverted untuk melihat apakah sel sudah tumbuh atau belum. Ganti medium hingga sel-sel tumbuh dan medium berwarna kuning, dengan menggunakan medium yang segar setiap 3 hari sampai sel-sel menjadi confluent di dalam TC Plate, yang ditandai dengan sel telah melekat pada attachment site dan saling bersentuhan atau berhubungan antar sel. Jarak antara sel yang teratur dan semakin rapat, permukaan sel rata ditandai dengan penampakan inti, membran plasma,
Jaringan endometriosis diperoleh saat laparoskopi sebanyak 0,5-1 gram. Tiga macam larutan meliputi larutan I merupakan larutan transfort dengan pencucian yang berisi HBSS (Hank,s Balanced Salt Solution) dengan gentamicin 50 μg/ml. Larutan II berisi 0,14% kolagenase IV (500 μg/ml), 0,1% Dnase (2,5μg/ml) dalam HBSS. Larutan III berisi 8,29 gram NH4CL, 1,0
80
Mariyani et al. : Genistein Menurunkan Kadar MMP-2 pada Kultur Sel Endometriosis
sitoplasma serta matriks ekstraseluler, dengan ukuran sel yang lebih besar.14
dilakukan dengan bantuan piranti lunak (soft-ware) SPSS for windows 19.0.
Saat sel confluent 70%, sel dipanen (harvest). Lakukan treatment dengan membagi menjadi 7 kelompok yaitu kelompok 1 sebagai kontrol (tanpa perlakuan), kelompok 2 ditambahkan genistein 5 µM/L, kelompok 3 genistein 10 µM/L, kelompok 4 genistein 20 µM/L, kelompok 5 genistein 30 µM/L, kelompok 6 genistein 40 µM/L, kelompok 7 genistein 50 µM/L. Masingmasing kelompok dilakukan pengulangan 3 kali dan inkubasi selama 6 jam, 24 jam dan 48 jam. Pindahkan medium kedalam Micro Sentrifuse Tube. Simpan dalam lemari pendingin pada suhu -20 sampai -40ºC untuk beberapa hari hingga akan dilakukan pemeriksaan kadar MMP-2 dengan tekhnik ELISA
HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini merupakan penelitian in vitro dengan menggunakan sampel jaringan endometriosis yang di dapat dari pasien endometriosis pada ovarium yang berasal dari dinding kista coklat endometriosis melalui tindakan laparoskopi. Jaringan endometriosis tersebut dibiakkan pada media kultur selama 7 hari kemudian dipapar dengan genistein dosis 5 µM/L, 10 µM/L, 20 µM/L, 30 µM/L, 40 µM/L, 50 µM/L dengan waktu inkubasi 6 jam, 24 jam dan 48 jam. Setelah sel 80% – 85 % confluent seperti yang ditunjukkan pada gambar 1, dilakukan pemeriksaan flowcytometri untuk menguji karakteristik sel endometriosis melalui ekspresi reseptor estrogen α dan reseptor estrogen β. Kultur sel endometriosis hari ke 9, sel Sel stroma dan sel epitel mulai memenuhi flask 85 90% confluent.
Pengukuran kadar MMP-2 menggunakan ELISA kit spesifik (Specific sandwich enzyme-linked immunosorbent Assays) buatan R&D R&D SystemCatalog # DMP2FO (Minneapolis; USA). Prosedur Pengukuran MMP-2 dengan ELISA Tambahkan 100µL diluent RD1A kedalam masingmasing sumuran microplate spesifik yang mengandung monoclonal antibody anti MMP-2 kemudian tambahkan 100µL larutan standar dan sampel kedalam masingmasing well. Larutan standar menggunakan well A1-H1 dan A2-H2. Well lainnyadigunakan untuk sampel. Mikroplate ditutup dengan strip perekat. Mikroplate diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar. Buang isi well dan cuci dengan buffer pencuci sebanyak 4 kali. Pencucian dilakukan dengan mengisi setiap well dengan buffer pencuci 300 µl dengan menggunakan pipet multichanel. Pada pencucian terakhir, setiap sisa buffer dibuang dengan dituang. Mikroplate dibalik dan dikeringkan dengan kertas penghisap yang bersih. Kemudian tambahkan 200µL conjugate MMP-2 kedalam masing-masing well, kemudian microplate ditutup strippe rekat dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruangan.
Hasil flowcytometri menunjukan sel endometriosis mengekspresikan reseptor estrogen α dan reseptor β, reseptor estrogen β lebih dominan dari reseptor estrogen α. Sel yang telah 85% - 90% confluent dari TC Flask selanjutnya di sub kultur dan diberikan paparan genistein dalam waktu inkubasi 6 jam, 24 jam dan 48 jam, kemudian dilakukan pemeriksaan kadar MMP-2 dengan menggunakan metode ELISA untuk mengetahui pengaruh Genistein terhadap kultur sel endometriosis.
Cuci microplate dengan wash buffer, kemudian tambahkan 200µL sub strateke masing-masing well, inkubasi selama 20 menit pada suhu ruangan dan lindungi dari sinar matahari. Terakhir ditambahkan 50µL stop solution kemasing-masing well. Densitas optic dari setiap sumuran dibaca dengan mikro ELISA BIORAD Mikroplate Reader 508dalam waktu 30 menit pada panjang gelombang 450nm.
Gambar 1. Kultur sel endometriosis konfluent Hasil Uji Penurunan Kadar MMP-2 Berdasarkan Dosis Genistein Berdasarkan pengujian ANOVA didapatkan rata-rata kadar MMP-2 berdasarkan dosis genistein. Hal ini dapat dilihat pada Tabel 1.
Data dianalisis dengan uji ANOVA, dilanjutkan uji perbandingan berganda LSD dan uji regresi. Uji statistik dikatakan bermakna bila p<0,05. Proses penghitungan
81
Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 22 No. 2 Mei - Agustus 2014 : 79-85
Tabel 1. Kadar MMP2 (ng/mL)Berdasarkan Dosis Kelompok Pengamatan Kontrol
Waktu Inkubasi (Mean ± SD) 6 Jam
24 Jam
3.25±0.22
a
ab
48 Jam
4.38±0.35
ab
4.38±0.46
ab
p a
6.72±4.50
b
5.70±3.84b
12.54±2.33
5 µM/L
2.21±1.23
10 µM/L
1.55±0.15bc
3.21±1.11c
9.02±0.71b
4.59±3.41c
20 µM/L
2.74±1.04a
3.79±0.46ac
8.46±0.88b
5.00±2.70bc
c
b
4.78±0.57
c
3.57±1.94
c
5.13±1.36
c
3.44±1.47c
30 µM/L 40 µM/L
1.01±0.22 2.32±0.09
4.92±0.61
ab
2.87±0.37
10.49±1.77
a
c
0.000<
2.37±0.86 ab 3.11±0.55c 5.15±0.35c 3.54±1.35c 50 µM/L Keterangan: Pada Rerata + SD jika memuat huruf yang berbeda berarti ada perbedaan yang bermakna (p-value<0,05) dan jika memuat huruf yang sama berarti tidak ada perbedaan yang bermakna (p-value>0,05).
Tabel 2. Kadar MMP2 (ng/ml) Berdasarkan Waktu Inkubasi Waktu Inkubasi
Dosis Genistein (Mean ± SD) 5 10 20 30 40 50 ∑ P µM/L µM/L µM/L µM/L µM/L µM/L 6 jam 3.25 2.21 1.55 2.74 1.01 2.32 2.37 2.21 ±0.22a ±1.23ab ±0.15bc ±1.04a ±0.22c ±0.09ab ±0.86ab ±0.93a 24 jam 4.38 4.38 3.21 3.79 4.92 2.87 3.11 3.81 0.000< ±0.35ab ±0.46ab ±1.11c ±0.46ac ±0.61b ±0.37c ±0.55c ±0.91b 48 jam 12.54 10.49 9.02 8.46 4.78 5.13 5.15 7.94 ±2.33a ±1.77b ±0.71b ±0.88b ±0.57c ±1.36c ±0.35c ±3.08c Keterangan: Rata-rata kadar MMP-2 pada masa inkubasi 6 jam (2.21+0.93ng/ml) meningkat pada masa inkubasi 24 jam (3.81+0.91ng/ml) dan 48 jam (7.94+3.08 ng/ml). Kontrol
Tabel 3. Kadar MMP2 (ng/mL) Berdasarkan Dosis dan Waktu Inkubasi Kelompok Pengamatan Kontrol
6 Jam
24 Jam
Rata-Rata ± SD 3.25±0.22
p
a
ab
48 Jam
Rata-Rata ± SD
p
Rata-Rata ± SD
4.38±0.35
ab
12.54±2.33
4.38±0.46
ab
10.49±1.77b
Genistein 5 µM/L
2.21±1.23
Genistein 10 µM/L
1.55±0.15bc
Genistein 20 µM/L
2.74±1.04a
Genistein 30 µM/L
1.01±0.22c
4.92±0.61b
4.78±0.57c
Genistein 40 µM/L
2.32±0.09ab
2.87±0.37c
5.13±1.36c
3.21±1.11c 0,005
3.79±0.46ac
p
a
9.02±0.71b 0,000
8.46±0.88b
0,000
2.37±0.86 ab 3.11±0.55c 5.15±0.35c Genistein 50 µM/L Keterangan : Pada Rerata + SD jika memuat huruf yang berbeda berarti ada perbedaan yang bermakna (pvalue<0,05) dan jika memuat huruf yang sama berarti tidak ada perbedaan yang bermakna (p-value>0,05).
82
Mariyani et al. : Genistein Menurunkan Kadar MMP-2 pada Kultur Sel Endometriosis
Gambar 2. Tren perubahan rerata kadar MMP-2 (ng/ml).
Hasil Analisis Regresi Pengaruh Dosis terhadap Kadar MMP-2
Adapun tren perubahan rerata kadar MMP-2 pada waktu inkubasi 6 jam, 24 jam, maupun 48 jam seiring dengan peningkatan dosis genistein. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 2.
Hasil regresi yang paling besar prosentase pengaruh dosis genistein terhadap kadar MMP-2 adalah pada waktu inkubasi 48 jam, yaitu 70.2% dan sangat bermakna secara statistik. Nilai negatif pada koefisien pengaruh -0.127 menjelaskan ada pengaruh yang bersifat kebalikan. Bila dosis genistein meningkat maka akan berakibat terjadi penurunan kadar MMP-2 pada kultur jaringan endometriosis. Hal ini dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 1 menunjukkan ada perbedaan yang bermakna (P=0.000<α) penurunan rerata kadar MMP-2antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan berbagai dosis.Tampak rerata tertinggi pada kelompok kontrol sebesar 6.72±4.50 (ng/ml) lalu berangsur menurun dengan semakin tingginya dosis sehingga didapatkan rerata kadar MMP-2 terendah pada dosis 40 µM/L sebesar 3.44±1.47(ng/ml).
Tabel 4. Hasil analisis regresi pengaruh genistein terhadap kadar MMP-2
Hasil Uji Penurunan Kadar MMP-2 Berdasarkan Waktu Inkubasi
Waktu inkubasi 6 jam 24 jam 48 jam
Berdasarkan hasil uji Anova two way, ada perbedaan yang bermakna kadar MMP-2 antar waktu inkubasi 6 jam, 24 jam, dan 48 jam. Hal ini dapat dilihat pada Tabel 2. Hasil Uji Penurunan Kadar MMP-2 terhadap Dosis Genistein dan Masa inkubasi
Persamaan regresi = 1.906 + 0.005 x = 4.189 –0.018 x = 10.462–0.127 x
Prosentase pengaruh 0.8% 10.1% 70.2%
p-value 0.674 0.129 0.000
Endometriosis merupakan hasil implantasi jaringan endometrium pada peritoneum berdasarkan patogenesisnya memerlukan enzim dalam mendegradasi epitel peritoneum. Enzim yang diperkirakan berperan penting dalam implantasi tersebut adalah MMP.4Penelitian ini bertujuan untuk menurunkan kadar MMP-2 pada kultur jaringan endometriosis dengan pemberian genistein berbagai dosis yakni, 5 µM/L, 10 µM/L, 20 µM/L, 30 µM/L, 40 µM/L, 50 µM/L serta diinkubasi selama 6 jam, 24 jam dan 48 jam sehingga degradasi MES dapat dihambat.
Ada perbedaan yang bermakna antar waktu inkubasi 6 jam, 24 jam, dan 48 jam, dan juga diperoleh ada perbedaan yang bermakna rerata kadar MMP-2 ketujuh kelompok sampel pengamatan, hal ini ditunjukkan dengan nilai p-value<∝=0.05. Selanjutnya pada uji perbandingan berganda dengan uji Beda Nyata Terkecil/BNT (Least Significant Difference/LSD) diperoleh dan ditampilkan secara lengkap. Hal ini dapat dilihat pada Tabel 3.
Kadar MMP-2 kelompok kultur jaringan endometriosis tanpa perlakuan genistein menunjukkan nilai rerata 6,72 83
Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 22 No. 2 Mei - Agustus 2014 : 79-85
ng/ml. Berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Huang et al (2004) didapatkan kadar MMP-2 Pada penderita endometriosis pada fase proliferasi di serum didapatkan nilai rerata 38,5 ng/ml, dan pada cairan peritoneal nilai rerata 26 ng/ml. Nilai rerata yang didapatkan Huang et al (2004) mengalami peningkatan kadar MMP-2 pada fase sekretorik yaitu pada serum nilai rerata 92,5 ng/ml dan pada cairan peritoneal 54,3 ng/ml. Bila dilihat berdasarkan inkubasi waktu, rata-rata kadar MMP-2 pada kultur jaringan endometriosis tanpa perlakuan selalu mengalami peningkatan. Kadar MMP2 pada inkubasi 6 jam menunjukkan nilai 3,25 ng/ml, terus meningkat pada inkubasi 24 jam (4,375 ng/ml), dan 48 jam (12,5448 ng/ml).
dan 48 jam. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Sha and Lin (2008), dikatakan bahwa konsentrasi < 5 μM/L tidak cukup untuk melindungi endometrium, karena aktifitas genistein yang rendah maka diperlukan jumlah yang cukup besar untuk mencapai konsentrasi lokal yang sufisien dan dapat berada sistem intrauterin. Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan bahwa genistein mulai menunjukkan penurunan kadar MMP-2 pada dosis 30 μM/L, 40 μM/L, 50 μM/L. Ketiga dosis ini dapat dikatakan mempunyai pengaruh yang sama dalam hal menurunkan kadar MMP-2 pada kultur sel endometriosis. SIMPULAN
Peningkatan kadar MMP-2 pada kontrol tanpa perlakuan ini didukung oleh penelitian yang lain, Perempuan dengan endometriosis terkait infertilitas memiliki kadar MMP-2 pada serum dan zalir peritoneal yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan perempuan tanpa penyakit itu. Kadar MMP-2 pada serum dan cairan peritoneal lebih tinggi pada fase proliferasi daripada fase sekretorik. Kadar MMP-2 pada serum dan cairan peritoneal pada perempuan endometriosis terkait infertilitas memiliki korelasi positif terhadap kadar 17βE2 pada fase proliferasi akan tetapi berkorelasi negatif terhadap progesteron pada fase sekresi.14
Genisteindosis 30 µM/L dan waktu inkubasi 6 jam terbukti yang paling berpengaruh terhadap penurunan kadar MMP2 pada kultur sel endometriosis. DAFTAR PUSTAKA 1. Muharam. Tingkatkan Imunitas Seluler Pasien Endometriosis dengan Stimulasi IL-2. Farmacia Universitaria. 2011;10(8):66. 2. Farrell E and Garad R. Endometriosis. ANJ Clinical Update. Australian Nursing Journal. 2012;20(5). 3. Barrier BF. Immunology Of Endometriosis. Clinical Obstetrics And Gynecology. 2010;53(2):397-402. 4. Levy RS, Sharabi S, Benharroch D, Piura B and Vardy NS. Matrix Metalloproteinases 2 and 9, Ecadherin, and β-catenin Expression in Endometriosis, Low-grade Endometrial Carcinoma and Non-neoplastic Eutopic Endometrium.European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 2008;139:226-32. 5. Pitsos M and Kanakas N. The Role of Matrix Metalloproteinases in the Pathogenesis of Endometriosis. Reproductive Sciences. 2009;16:717. 6. Zhang J, Xu Z, Zhang C, Dai H, Ji X, Wang X and Li C. Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits nuclear factor-kB pathway activation, and regulates adhesion, migration, invasion and apoptosis of endometriotic stromal cells. Molecular Human Reproduction. 2011;17(3):175-81. 7. Weigel MT, Kramer J, Schem C, Wenners A, Alkatout I, Jonat W, Maass N and Mundhenke, C. Differential Expression of MMP-2, MMP-9 and PCNA in Endometriosis and Endometrial Carcinoma. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 2011;160:74-8. 8. Amberkar MV, Kumari MK, Mor V, Semwal A and Adiga S. PPAR–gamma: a Dagger in endometriosis. Australian Medical Journal. 2010;12(3):814-20.
Hasil ini juga dapat disebabkan karena MMP-2 merupakan enzim utama untuk mendegradasi kolagen tipe IV,V, VII, X, XI dan XIV, gelatin, elastin, proteoglycan core protein, myelin basic protein, fibronektin, fibrilin-1dan prekursor TNF-α dan IL-1b dan mampu memecah kolagen tipe Idanmerupakan komponenutama yang membentuk struktur molekul stroma.14 Genistein dapat menurunkan kadar MMP-2 pada waktu inkubasi 6 jam dengan pemberian dosis 5 μM/L dan 10 μM/L, tetapi kemudian terjadi peningkatan kadar MMP2pada kelompok perlakuan pemberian genistein dosis 20 μM/L dan menurun pada dosis 30 μM/L terendah, selanjutnya meningkat lagi pada dosis 40 μM/Ldan 50 μM/L. Bila berdasarkan nilai rerata kadar MMP-2, tampak nilai terendah tercapai pada kelompok pemberian genistein dosis 30 μM/L (1.009ng/mL). Perubahan rerata kadar MMP-2 pada waktu inkubasi 6 jam menunjukkan perubahan yang sangat bermakna secara statistik (p-value=0.005<∝). Jadi pada waktu inkubasi 6 jam terjadi penurunan kadar MMP-2pada kultur sel endometriosis seiring pemberian genistein dengan dosis yang meningkat dan tercapai paling optimum pada dosis 30 μM/L(1.009ng/mL). Genistein belum mampu menurunkan kadar MMP-2 pada dosis 5 μM/L secara optimal meskipun sudah mulai terjadi penurunan pada inkubasi waktu 24 jam 84
Mariyani et al. : Genistein Menurunkan Kadar MMP-2 pada Kultur Sel Endometriosis
9. Jadoon B, Swanton A and McVeigh E. Endometriosis: Diagnosis And Recommended Management. Drug Review Endometriosis. 2012:3542. 10. Anggraini W, Rahardjo T, Ichramsjah A and Muchtadi D. Pengaruh Isoflavon Kedelai terhadap Deplesi Estrogen pada Tikus Betina. Sprague Dawley. 2008;23(2)73-8. 11. Sha G and Lie S. Genistein Inhibits Proliferation of Human Endometrial Endothelial Cell in Vitro. Chinese Medical Sciences Journal. 2008;23(1):4953.
12. Haitao L, Bing HJ, Sarah MK. and Yi CC. Inhibition of Cell Growth and VEGF Expression in Ovarian cancer Cells by Flavonoids. Nutrition and Cancer. 2008;60(6):800-9. 13. Huang H, Hong L, Yi T and SHeng J. Matrix Metalloproteinase 2 is Associated with Changes in Streroid Hormones in the Serum and Peritoneal Fluid of Patients with Endometriosis. Fertillity Sterility. 2004;81(5):1235-9. 14. Klein T and Bischoff R. Physiology and Pathofisiology of matrix Metalloprotease. Departemen of Pharmacy Analitical Biochemistry, University of Gromingen. Netherland. 2011.
85
