Helicohacter pylori Menggunakan Kultur Sel Lam bung

1626 UM

LAPORAN AKHIR PENELITIAN

Karakterisasi Molekuler Molekul Adhesin

Helicohacter pylori Menggunakan Kultur Sel Lam bung . Mencit (Mus musculus) dan Sel Line Cancer Colon (Studi Patogenesis Infeksi Helicobacterpylori pada Sel Lambung Mencit)

Peneliti: Made Agus Hendrayana Zainul Muttaqin Ni Made Adi Tarini

FAKULTASKEDOKTER AN UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR BALI 2012

-LAPORAN AKHIR PENELITIAN

Karakterisasi Molekuler Molekul Adhesin

Helicobacter pylori Menggunakan Kultur. Sel Lam bung Mencit (Mus musculus) dan Sel Line Cancer Colon (Studi Patogenesis Infeksi Helicobacter pylori pada Sel Lambung Mencit)

/

Peneliti : Made Agus Hendrayana Zainul Muttaqin Ni Made Adi Tarini

FAKULTASKEDOKTER AN UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR BALI 2012

. .

LJ

- .

3.J

-r.ll

..

LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN LAPORAN PENELITIAN RISBIN lPTEIO>OK 2012

1. Judul Penelitian : Karakterisasi Molekuler Molekul Adhesin Helicobacter pylori Menggunakan

Kultur Sel Lambung Mencit (Mus musculus) dan Sel Line Cancer Colon (Studi Patogenesis Infeksi Helicobacter pylori pada Sel Lambung Mencit) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------·----

2. Ketua Peneliti

a. Nama lengkap dengan gelar b. Jenis Kelamin c. Pangkat/Gol/NIP d. Jabatan Fungsional/Struktural e. Fakultasl Jurusan/ P. Studi

f Universitas

g. Bidang Ilmu yang diteliti

: dr.Made Agus Hendrayana,M.Ked : Laki-laki : Penata I III c I 1978071 7 200604 1004 : Lektor

: F.Kedokteran/Pendidikan Dokter : Udayana : Penyakit Menular

3. Jumlah Tim Peneliti

: 3 orang

4. lnstitusi

: Fak.ultas Kedokteran Universitas Udayana Jl. PB.Sudinnan Denpasar-Bali I Tip: 0361-222510 Fax :0361-246656/ [email protected]

5. Jangka waktu penelitian

: 1 (satu) tahun

6. Biaya yang Diperlukan

: Rp. 144.340.000,(Seratus empat puluh empat juta ti ga ratus empat puluh ribu rupiah)

Denpasar, 15 Februari 2013 Ketua Peneliti

e gus Hendrayana,M.Ked) : 19780717 200604 1004

SUSUNAN TIM PENELITI

J

Ketua peneliti :

Gelar:

Made Agus Hendrayana

Dokter,

Tanda tangan

Magister Kedokteran Tropis Peneliti pertama :

Gelar:

Zainul Muttaqin

Dokterandus (Drs)

Peneliti kedua :

Gelar:

I Ni Made Adi Tarini

Dokter Spesialis fv1ikrobiologi Klinik

Tanda tangan

�

PERJANJIAN KERJASAMA ANTARA BADAN P ENEUTIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN RI DAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS U_DAYANA TENTANG RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN & TEKNOLOGI KEDOKTERAN (RISBIN IPTEKDOK) Nomor: HK.06.01/1/1707/2012 Nomor: 478fUN.14.2/UKS/2012 Pada hari ini Kamis tanggal satu bulan

Maret tah�n dua ribu dua belas,

kami yang bertandatangan di bawah ini: 1. dr. Trisa Wahyuni Putri, MKes : Pejabat

Pembuat

Komitmen

Badan

Penelitian

dan

Pengembangan

Kesehatan Kementerian Kesehatan RI berkedudukan dan berkantor di Jalan

Percetakan

Negara

Nomor

29

Jakarta

10560,

dalam

hal

ini

bertindak dalam jabatannya untuk dan atas nama Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, selanjutnya disebut PIHAK KESATU; 2. Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, Sp.PD-KEMD: Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, pendelegasian

dari

Rektor

669/UN. l 4/KS/2012 untuk

dan

atas

Univers itas

berdasarkan

�dayana

surat

nomor

tanggal 14 Pebruari 2012 dalam hal ini bertindak

nama

Universitas

Kernentrian Pendidikan Dan

Udayana

yang

ditetapkan

Pada

Kebudayaan sebagai lnstansi Perncrintah

Yang Menerapkan Pengelolaan Keuangan Badan Layanan Umum rnetatui Keputusan

Menteri

441/KMK.05f2011

Keuangan

Tahun

2011,

Republik tanggal

Indonesia 27·

Desember

Nomor 2011,

berkeduduk?-n di Denpasar, selanjutnya disebut PIHAK KEDUA. PIHAK KESATU

dan PIHAK

KEDUA selanjutnya benmma-sama

disebut

PARA PIHAK, telah sepakat untuk mengadakan Perjanjian Kerjasama antara Badan

Penelitian

dan

Pengemba..T!gan Kesehatan dan Fakultas Kedokteran

Universitas U d aya n a dengan ketentuan dan syarat-syarat sebagai berikut:

(3)

Pe rj a nji a n ini ditand a ta n ga ni oleh PARA PIHAK, dibuat dalam

rangk ap

3

dan b c rm a te rai cukup scrta mem punyai kekuatan hukum yang

(tiga) sa n1 a

.

PIHAK KESATU,

PIHAK KEDUA,

Badan Penelitian dan

Fakultas Kedokteran

Pengembangan Kesehatan

Universitas Udayana

. W< � U � � mue �ID .o.;�--..,:.1 906D4AAF93572

dr. Trisa Wahyuni Putri, MKes NIP. 196304121989032001

�

26

·

Dr. dr. Ketut Suastika, Sp.PD-KEM[ NIP. 195503291980121001

Mengetahui, Kepala Badan Litbangkes

Dr. dr. Trihono, M.Sc NIP. 19540214 198012 1001

(3) Pe1�janjian ini ditRndatangani oleh PARA PIHAK, dibu2t dalam rangkap 3 (tigaj

dan

bermRtcrai

cukup serta mempunyai

kekuatan

hql�um

yang

sam a.

PfHAK KEDUA,

PlHAK KES.'\TU, Badan Penelitian dan.

·Fakultas Kedokteran

Pengem bangari Kesehatan

Universitas Udayana

9152DAAF935725321 lN , \M RJ&U '-Uf'l.\H

6�@�� -� dr. Trisa Wahyuni Pu t ri MKes

Pro

,

.

Dr. dr. Ketut Suastika, Sp.PD K EM -

NIP. 195503291980121001

NIP. 19630412198903200 l

Mengetahui, Kepala Badan Litbangkes

. Dr. dr. Trihono, M.Sc NIP. 19540214 198012 1001

iO

Lamp iran Perjanjian Kerja Sn rna Nomor : HK.06.0ljlfl707/'2012 Nomor : 478/UN.l4.2/UKS/2012 Tanggal : I Maret 2012 Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Denpasar

l.

Judul Penelitian

Peneliti

iio.

dan

Polifasik

Ang ga ran (Rp.)

.

Pengembangan

I Wayan Suardana,

Analisis

drh, MSi

Diagnostik

Berbasis

Cepat dan

Akurat Shiga Like Toxin-2

Kloning

Gen

untuk

150.000.000,-

Probe Deteksi

Producing

Escherichia coli Asal Hewan sebagai Agen Zoonosis Penyebab Gagal Ginjal pada Manusia

:!.

Made Agus

Karakterisasi

Hendraya na , dr,

dan

MKed

epitellambung mencit

reseptor

molekuler

molekul

Helycobacter

'

Pylori

pad a

____

II

144.340.000,-

adhesin

[_

·· - ---

-

H \ll \'\ 1'1

1'1·�\IE'\TLHI.\ '\ k:FSEH.\TY\ '\IiI i I\'\ fl ·,'\ 1'1 '\.(,(·\IH \'\.(t \'\ 1--.! Sl·ll \1'\'\

KEPUTUSAN KEPALA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN NOMOR : HK.03.051211273/2012 TENTANG PENETAPAN TIM PELAKSANA RISET PEMBINAAN ILMU PENGET AHUAN DAN TEKNOLOGI KEDOKTERAN TAHUN 2012 KEPALA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN, Menimbang

a

bahwa

tmtuk

meningkatkan

pengernbangan

di

penelitian

kapasitas keseh ata n

bidang

perlu

dan

dilakukan

pembinaan kepada para peneliti muda: b

bahwa

dalam

peneht1

rangka

muda

pemb1naan

perlu

dilakukan

dan

menggah

R•set

potens1

Pembmaan

llmu

Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran.

c.

bahwa berdasarkan pertirnbangan sebagaimana dimaksl•d pada

huruf a

dan b perlu

ditetapkan

Keputusan

Kepala

Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan tentang Pembentukan

Tim

Pelaksana

Rise!

Pembinaan

llmu

Pengetahuan dan Teknolog• Kedokteran Tahun 2012:

Mengingat

Undang-Undang

Nomor

Tai1Un 2002

18

tentang

Nasional Penehtian. Pengembangan dan Pengetahuan dan Teknolog1 Indonesia Tahun 2002

(lembaran Negara

Nomor

Sistem

Penerapan lhnu

84. Tambahan

Repubhk Lembaran

Negara Republik Indonesia Nomor 4219). 2.

Undang-Undang Nomor 36 Tahun 2009 tentang Kesehatan (lerr.baran

Negara

Tahun

2009

Nomor

144.

Tambahan

Lembaran Negara Nomor 5063): 3.

Peraturan Penehtian Negara

Pemerintah dan

Republik

Tambahan

Nomor

39

Pengembangan Indonesia

Lembaran

Negara

Tahun

1995

Kesehatan

Tahun Republik

1995

tentang

(Lembaran Nomor

Indonesia

67.

Nomor

3609).

4

Pe r a turan Pr·es1den Nomor 76 Ta h u n 2011 Perubahan atas Peraturan

Prestden

Nomor

47

T ahun

2009

Pemb_entukan dan Orgamsas1 Kementenan Negara

Tentang

�E,lE\'1 �.RI-\\ �ESEIL\T-\\ h

\1) \'\ 1'1

'\Ill i I\'\ I>\'- 1'1 '\l.l \11� \'\(,\'\ h.i ...._1·11.\l\� : ..'" p,_.,.. ,.•.l�.! ,, • ··� '-�· ---� .tr.l'l.l lt•...,l,, �"ll,li-.. p,

! .. I·:

f ... i.. p.·� ,I

I\.·. .

....,[,;HI·J

5

til.

;,dl.tll·..•

,,,, f I �. ... IIIHI, ,p' i J �-=-t �\:.�:

• �

\:...·l t

�

...

I'

!d.

:1

.. .

llttP

I

'.\ •\ \\

·�!!'l.lfj_! d�..ph\•,

Menten

Keput usan

•,1

Nomor

Kesehatan

Koordrnas1

ten tang

791/Menkes/SKIVII/1999 Penehllan

Penyelenggaraan

:-'''

Pengembangan

dan

Kesehatan 6

Peraturan

Menten

Kesehatan

1144/Menkes/Pe!NI!I/2010

tentang

Nomor

Organrsas 1

dan

Tata

Kerja Kement&rian Kesehatan Rl: MEMUTUSKAN :

Menetapkan

KEPUTUSAN

KEPALA

P ENE LITI AN

BADAN

DAN

PENGEMBANGAN KESEHATAN TENTANG TIM PELAKSANA RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN DAN TEKNOLOGI KEDOKTERAN TAHUN 2012: KESATU

T1m

Pelaksana

Riset

Pemb1naan

llmu

Pengetahuan

dan

Teknologi Kedokteran Tahun 2012 (selanjutnya disebut Risbin lptek.dok

2012)

sebagaimana

tercantum

dalam

lampiran

keputusan ini bertugas. 1

Mela ksanaKan penelitian

sesua1

ka1dah ilm1ah

dan etika

dengan waktu yang tela h ditetapkc.n:

2

Mempertanggungjawabkan

per,ggunaan

anggaran

sesuai

peraturan yang berlaku: 3

Membuat dan menyampaikan laporan kemajuan dan laporan akhir penelitian:

4.

Membuat ringkasan eksekutif berdasarkan hasil penelitian sebagai bahan masukan kepada peng ambil an kepu tusan da n pe nge lola program yang terkait dengan hasil penelitian.

KEDUA

Tim

P ela ksan a

Risbin

lptekdok Tahun

2012

sebagaimana

dimaksud pada diktum kesatu diberikan honor sesuai dengan ketentuan yang bertaku: KETIGA

Dalam melaksanakan tugasnya. Tim Pelaksano Risbin lptekdok

Tahun 2012 berpedoman pada peraturan perundang-undangan yang berlaku KEEMPAT

Oalam melaksanakan tugasnya. Tim Pelaksana R1sbin lptekdok Ta hun 2012 dapat berkonsultas1 dan berkoordinas1 dengan Trm Panel Pakar dan T1m Pengelola Administrasi Risbm lptek d ok .

K EL IM A

Biaya kf'qt
!otekdok Tahun ?0 12

dibebankmh DIPA ;)()k;etanat Badan Utb<�ngkes '�11
Desember 20 11

Nomor

0682/024-11

1 l) 1 /0 01 20 12 T anggai ��

h:E,IE\ I II \ I ) \ \.

!) I

Ll�l.\ \ 1-.:ESEU.-\T.:\:\

'\. i I I r I . \ \, I J \ \. I' I

',tl1tt•

�'...:rt.:vt,lr.,,:ll ,,:�

11.1

J .... :.....�'-·li !II_:!��

•1. :

KEENAM

,,· ...l�.:n.th:i··,!n:�·i�,·ii�<-,,

Dengan Badan

'··

'I·

··

\. �

.''1

,J \II { \ '\.l , \ \: k l � I II . \ 1". \ �

t.tJ...,IILi l�•'h\1 kll:;ll� 1',,,, 12�('

II,, I .L r.. ... iltUL: 1�1.' 1 ���

il.

·:..

hllt'

j

i� t

\\\\\\

!·I��

:oh..tn...:.kpkt.·,�l'il!

berlakunya Keputusan 1n1. rnaka Keputusan Kepata Penel1t1an

dan

HK 03 0�/1/39 3/2011

Pengembangan Tanggal

19

Kesehatan

Januan

2011

Nomor tentang

Penetapan T1111 Pelaksana Riset Pemb111aan llmu Pengetahuan dan Teknolog1

Kedokteran

Tahun 2011 dinyatakan tidak ber!aku

lag1. KETUJUH

Keputusan 1n1 berlaku sejak tanggal diletapkan Ditetapkan di Jakarta Pada tan gal17 FEBRUARI 2012 Kepal

� -,

.

... � ·.;

FK UNIVERSITAS SEBELAS MARET. SURAKARTA

K;;srr,"(l(:N E'il o��-n'lon� Cl'

'( .LarE

/- ,;,

:.-

. ·..

'ier :'>vse: J'

E.r:"r.a Oar1a,.an AMo

Analrs•s Genet•k Ma\,ptase-2 seo�g<J •

.·

,�

11.,': ;·,;:� [)(1

Usaha ME>ncarr Penyeb�t

Ket•dakbarcas•la•' SJpier"enta>� Bu,;. ca>;d lbu Ham11 FK UNIVERSITAS SYIAH KUALA. ACEH T·ts:t.a p,..A...oa 1f t/S:

..:.;

(u'lata J...:1·i•�

:1• SpP

q,ma R·st•a.,;

SS:

Anahsos Molekuler Resostens• lso.,.az•d

·.;� o"i. •):{!

R•famprsr" P11az•nam•d Etambutol Oar

r,1Kes

Streptomrcrn da11 1Solal

Mycobacten"� pada pendenta !ersangka TB paru res1sten g anda a: Ace11

\ubercuios•s FK UNIVERSITAS UDAYANA, DENPASAR I \ttJa·-:a" s,�wow�rt Tfl ��'15

1t.

t<�.r.,w'lg Jartva-t!":a P.-cra r nc:�'l.. or MK�s

N L�;; Ket,..t A'/U Rc;�r:awat· ,...

N. Kt:�uc Pt.����,

Pengembangan Prooe D•agnosbk !*-roas•s

Klonong Gen unluk Oete1<s. Sh•ga Lik e Tc..r

2 ProdUCing FscheriCn•a coh seoaga

•:;;::; '.'�Y.! CIY

A9'"'

Zoonos:s Pe�yebab Gaga! G•n1a1

�:

2

Maje .A..:;��::J HerH1r avaro ....

Za:r·::

rvbrt;m;n D·�

IAI(erl

N: Mao� Ad• Ta•·n· rtr

SoM!<

L�.�n PJ:u vrra lndah Peraanawa:· SE

Karaktensas: molekuler mo!el

1:1.1 Jd(l

Hehcot>acter pylon rnen �una kan ku•:u• Sli

.:,r,...

lambung mencn �Mus n'"U5CUIUSi 'lao se1

Caco·<' -� G

FKIK UNIVERSITAS JENO SOEDIRMAN, PURWOKERTO

C...r.H ..n� .Srtpr�l�(,.�'C1 u�·l; laksar�a Vr:asa· l lr-(]r:an

'.ll

'�1ScP� l

.....

Sn Lesla" S5

Pengaruh Po••morf,sme Gen Na�-K· ATP

MS•

Ase a2

Reseptor

V1tam1n 0 se'1a f,.Jtl AD

· ·5��

OC{) CJGt

terhadap Ke;ad1ar Hope1ens• A�tbao

Paparan Pb paoa Awa'<. Angkutan Ko;a Purwokeno

:!

VtJ:]J_; Sd···�d::

�r

SpPD

JCKI#

��·� C'lt..l

T•er T•sn;,.,a:·

:'!' MS<..

SP

POinnortosme Gena Transcropt•on F ac:t.r ' L•Ke

2 •TCF7L2;

:�() :;�1 �J,

Fat Mass and Ooes<�y

Assocoatea (FTOJ dar. Potass:um lnward:y, React1fy:ng Channel Sub Fam1ly J M.orno•:r 11 rKCNJ11, paoa Peng:oao OM T·po 2 Oces

3(;

s:··r�:'"lt0 Aqat:l

r.r Mt<es

Saefuaa•n _'
A:i; MJ.'ltaf•a� 'Jr

Tt:tl< lndra..,au AMa

Elek polrmorftsme gena 11\1!1 oks·di.l s•ntase3tNOS3, oan matnks metaioprote:nase-9 (MMP-9) tert�adap penrngkatan resSkleros:s paoa pas:en dengan

it,t,

h
� ·t. L�, o:.�

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat rabmat­ Nya kepada karni sehingga karni dapat menyelesaikan laporan penelitian Risbin Iptekdok Tahun 2012

pylori

yang beijudul "Karakterisasi Molekuler Mole !rul

Adhesin Helicobacter

Menggunakan Kultur Sel Lambung Mencit (Mus musculus) dan Sel line cancer

colon (Studi Patogenesis Infeksi

Helicobacter pylori pada

Sel Lambung Mencit)" dapat

kami selesaikan. Penelitian ini bertujuan mendapatkan karakteristik molekul adhesi sub unit pili

Helicobacter pylori (H pylori)

di lambung mencit dan di sel

line

cancer colon.

Keberhasilan karakterisasi ini diharapkan akan memperjelas pathogenesis

H pylori

sebagai penyebab dari tukak larnbung, maupun karsinoma larnbung. Kami mengucapkan terima kasih kepada : 1.

Kementrian Kesehatan melalui Badan Litbangkes dengan Risbin iptekdok atas kesempata.11 dan bantuan dana yang diberikan kepada peneliti untuk melaksanakan penelitian ini

2.

Bapak Prof. DRdr.I Made Bakta, Sp.PD-KHOM selaku Rektor Universitas Udayana atas arahan yang diberikan

3. Bapak Prof.DR.dr.l Ketut Suastika,Sp.PD-KEMD selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Udayana yang telah memberikan ijin, kesempatan, bantuan dan araban dalam pelaksanaan penelitian ini 4.

Bapak

DR.dr.l

Dewa

Made

Sukrama�MSi,Sp.MK

selaku

Kepala

Bagian/SMF.Mikrobiologi K.linik atas ijin, bantuan dan bimbingan dalam pelakSanaan penelitian ini 5. Bapak

Prof.DR.dr.Soemamo,DMM.Sp.MK

selaku

konsultan

penelitian

beserta staff beliau di FK.Universitas Brawijaya Malang atas bimbingan dan arahannya sehingga kami dapat melakukan penelitian ini 6.

Kepala Unit Riset Biomedik RSU.Mataram NTB beserta staf atas ijin serta banttla.n sarana dan prasarananya sehingga penelitian ini dapat dilaksanakan

7.

Kepala Unit Pengelolaan Mikroskop Elektron F.MIPA Unbraw atas bantuan dan keljasamanya dalam pemeriksaan mikroskop electron

8.

Serta

semua pihak yang

tclah berperan

serta. dalam penyelesaian penelitian

scrta penyusunan laporan renclitian ini dari awal sampai akl1ir.

Pada protokol awal penelitian ini sedianya akan menggunakan kultur sel primer lambung mencit dan sel Caco-2 w1tuk mempelajari karakter molekuler adhesin H. pyl01i isolat Mataram Lombok. Pada pelaksanaannya, pengadaan merupakan sel line kanker colon manusia

sel Caco-2

line

(Ca colon cell line) mendapatkan kendala

yang yaitu

tidak dapatnya pihak rekanan yang kami minta bantuan untuk membantu pembelian sel . ini di ATCC yang berkantor di Amerika Serikat. Awalnya pihak rekanan sudah memesankan

assasment,

sel

ini, tetapi setelah beberapa bulan menunggu proses document

pihak rekanan baru mengabarkan bahwa proses pemesanan tidak bisa

dilakukan oleh mereka dan harus peneliti langsung yang memesan ke pihak ATCC. Mengingat batas waktu akhir penelitian sudah dekat dan keterbatasan waktu untuk kami memesan ulang sel tersebut, kami kemudian berkonsultasi dengan Konsultan Penelitian Prof.DR.dr.Sumamo,DMM,Sp.MK masalah penggunaan sel Caco-2 menyarankan bisa mengganti dengan sel

line

line

ini. Beliau

kanker colon manusia lainnya· yang ada di

Indonesia dan sudah dimiliki oleh beberapa peneliti di Indonesia. Berkat kebaikan kolega peneliti dari LPPT UGM yang temyata memiliki stok sel

(Cancer Colon Human Cell line,

line

kanker colon manusia

WiDr) kami dibantu pengadaan sel line kanker colon

manusia WiDr ini dengan memesan dari LPPT UGM. Penelitian ini kami lanjutkan dengan menggunakan

Cancer Colon Human Cell line, WiDr untuk mempelajari

molekuler adhesin H. pylori isolat Mataram Lombok mengingat

Cell line,

karakter

Cancer Colon Human

WiDe ini memiliki karakteristik yang mirip dengan sel Caco-2

line

dan telah

sering digunakan untuk penelitian-penelitian pengembangan sel tumor dan sel kanker. Kami menyadari bahwa laporan penelitian ini masih jauh dari sempuma, Kritik dan saran dari semua pihak yang bersifat membangun sangat kami harapkan.Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Denpasar, 17 Desember 2012 Penulis

ii

Abstrak

H pylori

merupakan salah satu bakteri yang masih menjadi masalah kesehatan di

masyarakat. Bakteri ini penyebab gastritis dengan gejala dispepsia baik di negara-negara berkembang maupun di negara maj u. Penelitian ini bertujuan mendapatkan karakteristik molekul adhesi sub unit pili

Helicobacter pylori (H pylori) di lambung mencit dan sel cancer colon manusia. Keberhasilan karakteri sasi ini akan me�perjelas pathogenesis H pylori sebagai penyebab dari tukak larnbung, maupun karsinoma Jambung dengan harapan dapat memberikan kontribusi dalam penanganan kelainan lambung. Penelitian ini melakukan biakan dan konfirmasi isolat H pylori yang didapat dari RSU Mataram, dilakukan pengujian terhadap aktivitas hemaglutinasinya dengan menggunakan darah

kelinci untuk menemukan

Isolat yang akan digunakan untuk selanjutnya. Isolat

ditumbuhkan pada media TSB, dilakukan pengarnatan keberadaan pilinya menggunakan elektron mikroskop, isolasi pili H pylori menggunakan alat Pili Bacterial Cutter. Profil berat molekul isolat pili diketahui dengan metode SDS-P AGE. Dilakukan juga reaksi hemaglutinasi dari protein tersebut. Molekul hemaglutinin yang terikat pada Outer Membrane Protein (OMP) diisolasi. Puriflkasi protein yang terkandung pada bagian pili atau OMP dikerjakan. Kemudian diuji karakter molekul adhesin menggunakan metode indeks adhesi, imunositokimia dan imunoelektron mikroskop. Penelitian ini baru sampai menemukan analisis protein potongan menggunakan SDS-PAGE menemukan profile berat molekul protein pili H.pylori sebesar 49 kDa Komponen dalam

H pylori

whole cell extract

terd.apat adhesi yang melekat pada permukaan sel enterosit mencit dan pada

permukaan sel

line

cancer colon. Fraksi pili dan fraksi OMP menunjukkan basil uji

hemaglutinasi positif. Protein fraksi pili dan OMP dari H pylori mampu melekat pada permukaan enterosit mencit dan pada permukaan sel line cancer colon. Hasil pemeriksaan respon imun serum penderita gastrtitis terhadap antigen pili menggunakan metode GICA ditemukan Sensitifitas 26/30= 86,67%, Spesifisitas 30/30= 100% Kata kunci

:

H pylori, adhesi, pili,

sel enterosit, selline cancer colon

iii

DAFTAR ISI

Hal. Judul Penelitian Susunan Tim Peneliti Surat Keputusan Penelitian Kata Pengantar..................................................................................... . Abstrak

.

.. . ... . . . .. . . ... . ....... .. ....................................................................

111

Daftar isi... ..... ... .... ..................... .... . . ............ ....................... ....... .... .... ....... .....

1v

Daftar tabel ....... .......... ... ................. ................... .... .. .... ....... ........ .... ....

v1

Daftar grunbar

vn

......................................................................................

Daftar lamp iran ..... ......... ....... ...... .... ........ ...... ......... ...... .... ................... .

v1u

1 PENDAHULUAN . .. .. ... . . . .............................................................

1

.

.

..

... .

..

1.1 Latar Belakang....................... .................................... ................ ..

1

1.2 Rurnusan Masalah.......... .. .. .......................... ....... ..... . ...... ..... ..........

3

..

2 TINJAUAN PUSTAKA...........................................................................

5

2.1 Epidemiologi infeksi H pylori . .... . . .. ... ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

5

2.2 Morfologi Hpylori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5

2.3 Sifat hidup Hpylori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...

5

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . ....

6

... ............. ..................... ..... .......

7

2.4 Patogenesis lnfeksi Hpylori 2.5 Komponen pili Hpylori.

.

.....

.

..

2.6 Pengembangan tes diagnostik . . . . . . ... . .... . ...... . . . . . . .. . ............ . . .

7

3 TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN............................................

10

............. ... ... ... .... .... ..... ............... . .....

10

... .... .. ... .. .............. . .... . .. . .. .......... ....... .... ...............

I0

3.1 Tujuan Penelitian .. .... . .. . .... 3.2 Manfaat Penelitian 4

......

.

METODE PENELITIAN...................................................................... .. 4.1 Biakan

H Pylori........................................................................

11 11

Grrun . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

11

4.3 Pembuatan suspensi eritrosit 0,5% . .. ... .. . . .. . . .. .. . . . . .. .. ... . . . . . . . . . ...

12

4.2 Pengecatan

4.4 Pembuatan suspensi bakteri untuk uji hemaglutinasi 4.5 Uji hemaglutinasi whole 4.6 Kultur

..

..

.. .. ......... . ...

.

.

cell extract Hpylori. . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

H pylori untuk isolasi pili

4.7 Pemancnan H pylori dari hasi.l

..

... . .. ... .. . ... .. .. . .. .. .. . .... .. . ... .. ..

kultur........... . .. iv

.

.. .. ... .. .. ... .. .......

12 13 13 13

4.8 P emo o t ngan p il i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . ..

14

4.9 UjiS D S -PAGE bobo t mol ekul fra ks ipro tein p il i. . . . . . . . . . . . . . ...........

15

4 . 1 0 Isolas ih emaglu tinin dar ipro tein m embr an lua r(OMP) s el

16

4.1 I Uji H emagl utinasi Pili 4.12

H pylori ..

dan OMP . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .

Isolas i s el epi tel lambung/usus m enc it ............................................

17 17

.

4 . 1 3 Uji a dhes i H pylori pada s el en terosi t dan s el Caco 2 - ......................

18

4 . 1 4 P eng eca a t n Imu noh s i tokim a i (whole cell

18

extract) ............ . ............

t nlmuno his o t kim a i antig en p il idan OMP 4.15 P eng eca a

Hpylori . . . . . . . . . .

19

4.16 Vaksinas iAyam P etelur . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . .... . . . . . .... . . . . . . . . . . ... . . . . . . .

19

4.17 M eto de isolas ilg Y dar ikun ing telu r ....... ...................... ............... ...

20

4.18 P em eriksaa n Ig Y pa da k uning telu r denga nmicro dilu ter ... . . . ...... ....

20

4.19. M eto da u jiwes tern blo ti ng ...... .................................................. ....

21

4.20 P em er k i saan Mi kroskop El ektron ... . . . ..............................................

22

4.21 Uj i respo n imu np ender ita ga stritis terha dapa tpro tei n p ili . .. . . . . . . . . . . . . 22 5.

HASIL PENELITIAN............................................................................ 5 . 1 Sub kul u t r isola t Hpylori

. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . ... .

23 23

5.2. Uji H emaglu tinin . . . . . . . . . . . . . . ....... . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . .. . . . . ... . . . . . .. .

23

5.3 Sub Kultur

25

H pylori u ntuk

isolasi p li i . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.4 Ha sil u ji S D S-P AGE po o t ngan pili

Hpylori . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

25

5.5 Uji H emaglu ti nasi fraksi p ili da n OMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . .. . . . . . . . . . . . .

27

5.6 Uj ia dh es iwhole cell

28

extract H pylori pa da p errnukaa ns el

en terosi t...

5.7 Uji adhesi fraksi pili danOMP pa da s el en terosit............................... 5.8 Ha sil P eng eca a t nImu nohis tokimia a ntig enpil ,i OMP

whole cell bakt eri Hpylori p a da s el line

29

dan

cancer colo n. . . . . . . . ... . . .. . . . . . . .

5.9 Has il P em er k i saa nIg Y yo lk telu r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . .. 5 . 1 0 Hasil u ji western blotting.................................................................

31 33 33

5 . 1 1 H asil u jir es ponimu np enderi taga stritis terh adapat pro tein pil i ........... 34 6.

PEMBAHASAN . . . . . . . . .. . . . . .. ... . . . .. .. . . .. .... . . . .. . .. . ... ... .. .. ... ... .. . ... . ...

35

7.

KESIMPULAN DAN SARAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

38

8. UCAPAN TERIMA KASIH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .

39

DAFTAR PUSTAKA.........................................................................................

40

LAMPIRAN.. ................................... ...........................................

44

.

v

DAFTAR TABEL

Hal. Tabel 5.1 Hasil Titer pengenceran bakteri dengan hernaglutinasi (+) pad a isolat

Hpylori

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

:

.

.. . . . . . . . . . . . . . ..

24

Tabel 5.2 Hasil uji perneriksaan lgY yolk telur dengan rnetode rnicrodiluter dari ayarn yang sudah diirnunisasi dan pada kontrol . . . . . . . . . . . . . . . . .. .

33

Tabel 5.3 Hasil uji respon irnun serum penderita gastrtitis terhadap antigen pili rnenggunakan metode GICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

vi

34

DAFTAR GAMBAR

Gambar 4.1 Alat pemotong pili bakteri (pili cutter). . . ............... . . . . . . ......

Hal. 14

Gambar 5.1 Hasil pengecatan Gram dari isolat koloni

23

Hpylori ... . . . . . . . . ... .

Gambar 5.2 Hasil uji hemaglutinasi isolat

Hpylori H p l ,Hp2,Hp3

... ... . .. . . .

24

Gambar 5.3 Hasil uji hemaglutinasi isolat

Hp117,Hp135 dan kontrol ...... . . . . . . . . ............... . . . . .. .........

Hpylori Hp20, Johar, 25

Gambar 5.4 Profil protein hasil pemeriksaan dengan SDS-PAGE terhadap protein hasil pemotongan pili

H pylori

untuk menunjukkan

konsistensi jumlah protein utama. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... ..

26

Gambar 5.5 Hasil analisis SDS-PAGE bobot moleku1 fraksi protein pili.. . .

27

Gambar 5.6 Hasil uji hemaglutinasi salah satu isolat H.pylori, fraksi pili dan fraksi protein membran luar

H pylori ... ... .........

28

Gambar 5.7. Hasil pengecatan imunositokimia menunjukkan adanya penempelan whole

cell extract H pylori.. .. . . . . .. .. .. . .. . . . . .. . . . . .

29

Gambar 5.8 Hasil pengecatan im unositokimia menunjukkan adanya penempelan fraksi

pili, fraksi OMP

H pylori. . . ... . . ......... . .. .

30

Gambar 5.9 Hasil pengecatan imunositokimia yang menunjukkan adanya penempelan selline cancer colon.. . . . . . ........ . .. . .........

Gambar 5.10 Hasil uji western blotting protein pili

vii

H pylori.......... . . . .. . . .

31

33

DAFTAR LAMPIRAN

1.

Lembar Anggaran Biaya Penelitian

2.

Lembar Data Personil Peneliti'

3.

Surat Keterangan Kelaikan Etik

viii

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Helicobacter pylori (H pylori)

adalah bakteri berbentuk: spiral, merupakan

bakteri Gram-negatif dan hidup dalam lingkungan milaoaero:filik dalam mukosa, epitel dan jaringan lambung, yang dapat ditemukan (Zhang

et.al.,2005).

peptic ulcer

Infeksi H

pada harnpir separo penduduk dunia

telah diketahui sebagai penyebab utarna penyakit

pylori

(tukak Jarnbung dan duodenum), gastritis kronis dan bahkan karsinoma

larnbung dan gastric lymphoma (Lamarque

et al.,

1999). Kemarnpuan bakteri ini untuk

menimbulkan karsinoma unik, karena hanya satu bakteri inilah yang diketahui mampu menimbulkan karsinoma di lambung (Clyne,

et al. 2007) dan karsinoma yang

dihasilkan

termasuk tipe I. Hal ini disebabkan oleh berbagai faktor virulen yang dihasilkannya seperti

CagA,

VacA,

Urease

karsinogenesis (Sihombing,

dan

amonia

yang

kesemuanya

mampu

mernicu

et al. 2002).

Gejala klinis sering tidak dirasakan oleh penderita yang biasanya berupa nyeri lambung ringan. Oleh sebab itu penderita sering mengabaikan gejala tersebut (Enroth,

al. 2000).

Padahal tahapan

ini

sangat

mikrobiologis karena keberadaan H lambung (Parewangi,

pylori

2009). Peptic ulcer

penting

untuk

langkah

et

diagnosis

secara

bisa diisolasi dengan menggunakan

biopsi

adalah luk:a pada mukosa yang disebabkan

oleh tingginya keasaman pada mukosa yang akan diperparah oleh reaksi keradangan karena infeksi oleh

H pylori

analgetik (Soewignyo,

atau zat lain seperti aspirin yang digunakan sebagai obat

201 0). Infeksi H pylori masih

sampai saat ini belum diketahui dengan jelas

cara

merupakan masalah besar karena

penularan dan patofisiologisnya pada

saluran pencernaan. Diagnosis yang selama ini dilakukan ialah dengan cara biopsi lambung, uji nafas urea, dan uji serologis terhadap keberadaan antigen CagA dan VacA (Cover dan Blanke,

2005). Kelemahan penggunaan antigen

tersebut adalah antibodi terhadap CagA dan vacA

baru muncul setelah proses infeksi terjadi di masa lampau (Groves, al.

2005).

serologis

et al. 2001;

Leite,

et

Pemeriksaan yang paling banyak dilakuk:an adalah dengan pemeriksaan yang

pada

Chromatography Test).

umumnya

dengan

cara

ELISA

dan

FCT

(Florescens

Oleh karena itu perlu dicari alternatif dengan menggunakan

bahan dasar untuk diagnosis adanya ]nfeksi oleh H pylori.

1

Unit Riset Biomedik RSU Provinsi NTB di Mataram merupakan yang pertama di Indonesia yang menggunakan antigen H pylori isolat lokal. Kit tersebut menggunakan

secretory antigen namun tidak menyertakan antigen pili dan mempunyai sensitifitas 85% dan spesifisitas 92% (Muttaqin, 2004).

Bahan

dasar untuk

alat diagnosis infeksi H pylori yang belum pemah

dikembangkan sampai saat ini adalah yang berbasis pada molekul adhesi bakteri tersebut. Untuk infeksi saluran ke�h yang disebabkan oleh Escherichia coli ternyata dapat didiagnosis dengan menggunakan molekul adhesi sub unit pili berat molekul 36 kDa

bakteri tersebut dengan

metode

Dot

Blot dengan

sensitivitas 84,6%

dan

·'

spesifitasnya 88,9% (Sudana, et. al. 2009). Sedangkan I�lam et a/. 2011 melaporkan bahwa molekul adhesi pili Salmonella typhi berat molekul 48 kDa dengan metode imunositokimia ternyata dapat digunakan untuk diagnosis demam tifoid. Laporan terakhir dari Kumiawati et al. 2011 juga menggunakan protein pili untuk alat diagnosis penyakit infeksi, meskipun pada penelitian ini belum diteliti apakan protein pili tersebut merupakan molekul adhesi. Penyakit tersebut adalah pneumoni yang disebabkan oleh bakteri Pseudomonas aeruginosa. Hasil penelitian peneliti lain menggunakan H pylori yang berasal dari penderita pectic ulcer telah menemukan profil protein dengan SDS­ PAGE, yang ternyata

protein

dengan

berat

molekul

42

k.Da

adalah

protein

haemaglutinin. Manfaat lain dari molekul adhesi bakteri adalah untuk bahan dasar vaksin.

Vaksin Pertactine dengan nama dagang Invarynx temyata telah beredar di Indonesia. Pertactine mengandung rnolekul adhesi Bordetella pertussis, yang dapat menggantikan komponen Pertussis (P pada DPT). V aksin ini lebih mudah diterima pada bayi atau anak karena tidak menimbulkan panas (Salyers and untuk kolera yang mengandung

Whitt, 2002). Kandidat vaksin lain adalah

molekul adhesi sub unit pili V. cholerae EI Tor berat

molekul 38 kDa. Bahan dasar kandidat vaksin ini akan lebih potensial apabila digabung dengan protein sub B kolera toxin. Adapun yang digunakan binatang cobanya pada penelitian tersebut adalah mencit (Surname et a!. 2010). Faisal et al. 2011 dengan menggunakan binatang coba yang sama temyata dapat menunjukkan bahwa daya proteksinya molekul adhesi sub unit pili berat molekul 38 k.Da yang digabung dengan sub unit B kolera toksip akan lebih meningkat lagi apabila ditambah ajuvan susu kuda Sumbawa. Kandidat vaksin berbasis molekul adhesi lain yang diperuntukkan untuk

2

dernam tifoid juga telah dilaporkan yang temyata berat molekulnya adalah 36 k.Da (Santoso, 2002). Molekul adhesin

H pylori telah dipelajari oleh

peneliti luar negeri menggunakan

berbagai jenis kultur sel seperti kultur sel primer larnbung, AGS, KAT03, sel Hep2, CHO, dan Caco-2 (Lofting, J et al, 2008). Pada penelitian akan digunakan kultur sel primer larnbung mencit dan sel line cancer colon untuk mempelajari karakter molekUler adhesin

H pylori isolat Matararn Lombok.

Molekul adhesi sub unit pili dan molekul adhesi yang berasal dari OMP bakteri V.

cholerae El Tor temyata identik (Surnamo 2000).

H pylori

adalah bakteri batang

Gram negatif non Enterobacteriace sama dengan V. cholerae, menimbulkan pertanyaan apakah juga memiliki molekul adhesi pada bagian pili dan OMP nya oleh karena itu perlu dilakukan penelitian. Keberhasilan dari penelitian

ini akan membuka era baru

penelitian lanj utan untuk mendapatkan alat diagnosis dan vaksin dari penyakit peptic ulcer yang disebabkan oleh pencukuran pili

H pylori

H pylori

secara

yang berbasis pada molekul adhesin. Selain itu

bertahap belum pemah dilakukan oleh peneliti yang

lain, sehingga penelitian ini sangat penting untuk dilakukan. Pada protokol awal penelitian ini sedianya akan menggunakan kultur sel primer lambung mencit dan sel Caco-2 untuk mempelajari karakter molekuler adhesin H. pylori isolat Mataram Lombok. Pada pelaksanaannya, pengadaan sel Caco-2 line yang merupakan sel line kanker colon manusia (Ca colon cell line) mendapatkan kendala yaitu tidak dapatnya pihak rekanan yang karni minta bantuan untuk membantu pembelian sel ini di ATCC yang berkantor di Amerika Serikat. Awalnya pihak rekanan sudah memesankan sel

ini, tetapi setelah beberapa bulan menunggu proses document

assasment, pihak rekanan barn mengabarkan bahwa proses pemesanan tidak bisa dilakukan oleh mereka dan harus peneliti langsung yang memesan ke pihak ATCC. Mengingat batas waktu

akhir penelitian sudah dekat dan keterbatasan waktu untuk kanti

memesan ulang sel tersebut, kami kemudian berkonsultasi dengan Konsultan Penelitian Prof.DR.dr.S umarno,DMM,Sp.MK masalah penggunaan sel Caco-2 line ini. Beliau menyarankan bisa mengganti dengan sel line kanker colon manusia lainnya yang ada di Indonesia dan sudah dirniliki oleh beberapa peneliti di Indonesia. Berkat kebaikan kolega peneliti dari LPPT UGM yang ternyata memiliki stok. sel line kanker colon manusia

(Cancer Colon Human Cell line, WiDr) kami dibantu pengadaan sel line kanker colon manusia WiDr ini dengan memesan dari LPPT 3

UGM.

Penelitian ini kami lm�utkan

dengan menggunakan Cancer Colon Human Cell line, WiDr untuk mempelajari karakter molekuler adhesin H. pylori isolat Mataram Lombok mengingat Cancer Colon Human Cell line, WiDr ini memiliki karak:teristik yang mirip dengan sel Caco-2 line dan telah sering digunakan untuk penelitian-penelitian pengembangan sel tumor dan sel kanker.

1.2

Rumusan masalah -

Permasalahan dari penelitian ini adalah : l.

Apakah sei line cancer colon merupakan sel reseptor H pylori galur Mataram?

2.

Apakah molekul hemaglutinin pili 49 kDa H pylori galur Mataram merupakan molekul adhesin pada lambung mencit dan sel line cancer colon ?

3.

Bagaimana respons imun penderita gastritis di Mataram terhadap molekul hemaglutinin pili 49 kDa H pylori galur Mataram ?

4

BAB U TINJAUAN PUST AKA

2.1

Epidemiologi infeksi H. pylori

H

pylori merupakan salah satu bakteri penyebab infeksi yang masih menjadi

masalah kesehatan di masyarakat. Bakteri ini merupakan bakteri penyebab gastritis dengan gejala dispepsia baik di negara-negara berkembang maupun di negara maju. Menurut Suerbaum et a/., 2002, prevalensinya mencapai 80% pada usia pertengahan di negara-negara berkembang dan sebesar 20-50% di negara maju.

2.2

Morfologi H. pylori

H

pylori adalah bakteri Gram negatif yang berbentuk spiral dengan ukuran

panjang rata-rata 2,9 J..!ID (3 -5 J..!ID) dengan lebar sekitar 0,5-0,9 J!m. Ukuran diametemya rata-rata 0,8 J!m (0,5 - 1 J!ID). Dibawah pemeriksaan dengan mikroskop elektron, bentuk spiral

H

pylori akan tampak seperti basil dengan bentuk huruf U. Bakteri ini memiliki

flagela unipolar untuk motilitasnya bergerak dengan cepat pada 1apisan musin sebanyak

4-6 buah.

Flagela ini berukuran panjang 3 -5 Jlm dan ukuran diameter 30 - 35

nm

dengan bulbus di ujungnya (Rathbone, et.al., 1989, Murray et a/., 2005).

2.3

Sifat hidup H. pylori.

H

pylori merupakan bakteri mikroaerofilik dimana hanya dapat hidup optimal

pada kadar oksigen (02) 2-5% untuk tumbuh dengan kadar C02 5-10%,

H

optimal 37° C. Untuk ku1tur

bakteri ini memerlukan karbondioksida

pylori dapat tumbuh pada suhu

H

34-40° C dengan suhu

pylori, diperlukan keadaan lingkungan dengan kadar

nitrogen (N2) 85%, C02 10% dan 02 5%. Pertumbuhan bakteri ini akan terjadi pada pH

5,5-6 dan optimal pada pH netral (Murray et a/., 2005, Kusters et al., 2006)

H pylori

dapat memproduksi

urease

sehingga menghasilkan amonia yang dapat

menetralkan kondisi asam di sekitar bakteri. Keadaan ini membuat bakteri ini dapat bertahan hidup dan dapat beradaptasi dengan baik di mukosa lambung terutama di daerah antrum (Murray et a/., 2005).

5

2.4 Patogenesis lnfeksi H. pylori

H pylori merup akan penyebab ulkus peptikum dan merupakan faktor resiko utam a untuk kanker gaster. Setiap pasien dengan diagnosis ulkus peptikum yang disebabkan oleh infeksi H pylori sebaiknya mendapat terapi antimikrobial. Dalam rentang waktu sekitar 2 minggu, pasien yang terinfeksi H pylori mengalami gastritis akut dengan keluhan nyeri di daerah ulu hati, rasa mual sampai muntah. Keadaan seperti ini sebaiknya mendapatkan terapi antibiotika sebelum infeksi

H pylori

tersebut menjadi

kronis. H pylori juga dapat hidup di tempat lain pada mukosa lambung terutama pada pasien yang mengkonsumsi obat-obatan seperti proton pump inhibitor. H pylori juga dapat menimbulkan gastritis kronis dimana memberikan gejala abdominal yang sering kambuh. Pasien-pasien dengan garnbaran gastritis atropi memiliki faktor resiko yang lebih tinggi untuk menjadi karsinoma gaster.(Fox et al., 2007) H.

pylori merupakan bakteri yang mampu berkolonisasi di lambung dengan

suasana pH yang sangat rendah. Rendahnya pH lambung merupakan salah satu hambatan mikroba untuk berkolonisasi di l ambung Bakteri ini mampu mengalahkan sistem pertahanan tubuh pasien yang kemudian infeksinya dapat menimbulkan gastritis yang sering berlanjut pada ulkus gastrium dan duodenum, dan dapat menjadi kanker gaster. (Giannakis, et al. 2008, Pandey, et al. 2010). Setelah tertelan dan masuk ke dalam saluran cema, bakteri

H pylori berhadapan

dengan mukosa lambung. H. pylori harus menghindari aktivitas bakterisidal yang terd apat dalam isi lumen lambung dan masuk ke dalam lapisan mukus. H pylori mampu berkolonisasi

di epitel lambung. H. pylori tidak menembus langsung lapisan pertahanan

epitel lambung, sehinga bakteri

engulfing

ini tergolong bakteri non invasif. Dengan kemampuan

dari sel epitel terhadap H pylori maka bakteri ini bisa memasuki sel epitel

secara pasif.

Di bagian

ini pH relatif lebih tinggi jika dibandingkan dalam cairan mukus.

Mekanisme ditentukan oleh adanya produksi urease dan motilitas bakteri. Proses k.olonisasi bisa beijalan dengan baik karena urease mampu

ini menghasilkan C02 dan NH3 yang

menetralisasi keasaman pH lambung (Sclunidt dan Henzel, 2004). Keuntungan

lain dari sifat non-invasif ini sehingga

H pylori bisa

berkolonisasi di permukaan epitel

dengan aman adalah dimana infeksi bakteri ini tidak terlalu mempengaruhi mak:rofag dan sel dendri�ik di lapisan bawah epitel lambung (Mimuro et al. 2007).

6

Makrofag dapat mengeksk.resikan nitrooksida yang berperan dalam melemahkan mikroorganisme pathogen, tetapi H

mampu mencegah aktifnya nitrooksida ini

pylori

dengan arginase yang dimilikinya (Nathan dan Shiloh, 2000; Gobert et al. , 2001). Bakteri ini juga memiliki beberapa faktor virulensi yang membantunya dalam menyebabkan penyakit pada inangnya. Mekanisme infeksi H

pylori

pada lambung

inangnya melalui beberapa tahapan yaitu perlekatan, pengikatan, penetrasi dan perusakan sel

inang. Banyak faktor yang berperan dalam proses ini, antara lain berbagai protein

membran seperti BabA, SabA, AlpA, AlpB, dan HopZ membantu perlekatan bakteri pada membran sel epitel lambung. Agar dapat menempel sel-sel epitel, H

pylori

menghasilkan adhesin berupa protein BabA. Setelah terjadinya kontak, selanjutnya dimulai berbagai proses destruktif terhadap sel epitel lambung yang dimulai dari perusakan selaput permukaan mikrovili yang berisi granula mukoid. Faktor virulensi lainnya

H. pylori

dapat menghasilkan eksotoksin, Urease yang dihasilkan

H. pylori

berkontribusi terhadap ketahanan bakteri terhadap asam lambung. Urease berperan d.alam menjaga stabilitas sel bakteri dan proses perlekatannya di epitel lambung, (Murray et al, 2005, Algood, et al. 2006). VacA yang dapat masuk ke dalam membran sel epitel

dan

membuat saluran

untuk keluar masuknya ion-ion untuk nutrisi bakteri. VacA berperan merusak pertautan antar

epitel. Saat pertautan tersebut rusak, maka makrofag subepitel meresponinya

dengan cara memicu sekresi berbagai kemokin, termasuk interleukin 8, interleukin 1 J3, nitroksida, dan faktor tumor nekrosis

a

yang semuanya merupakan komponen

proinflamatorik dan memperparah kerusakan jaringan. Ada beberapa komponen dari di permukaan sel epitel lambung. Komponen tersebut adalah laktoferin sebagai pengikat Fe2+ ekstraseluler.

mukosa lambung dapat menghambat pertumbuhan

H. pylori

Komponen lain yaitu lisozim yang berperan merusak struktur peptidoglikan dinding sel mikroba, dan defensin yang merupakan peptida antibakteri (Mimuro et al. 2007).

2.5

Komponen pili H. pylori

Pili dan flagela merupakan antigen lain dari H pylori yang juga penting. Flagela merupakan salah satu struktur bakteri H. pylori untuk motilitas yang berperan membantu menembus kekentalan mukus dan menstabilkan kolonisasi lambung. Pili pada permukaan H

pylori

H. pylori

pada epitel

berguna untuk merekatkannya pada epitel

lambung inangnya. Pada tahap perlekatan terjadi kontak dengan sel target melalui 7

glikokaliks yang diduga kuat identik dengan pili. Menempelnya pada sel epitel ini juga diperankan oleh pili dengan residu N-asetilneuraminil-(alpha-2-3)-laktosa, dan juga oleh beberapa protein dan tampaknya protein berasosiasi dengan pili (Testermann,

et al.

2001). Pili sering disebut adhesin (protein perlekatan) karena � gsinya untuk perlekatan dengan sel epitel . H disebabkan oleh

pylori

memiliki pili yang masih belum jelas karaktemya. Hal ini

masih sedikitnya penelitian mengenai pili H

merupakan hal yang menarik mengingat fungsi

pylori,

H pylori memiliki

Oleh karena itu

5 macam adhesin

dengan kemampuan perlekatan pada berbagai organ, termasuk eritrosit (Linden, 2004). Pili bakteri H

pylori terdiri dari protein

yang bisa kontak langsung dengan cairan tubuh,

sehingga komponen ini sebenarnya berpeluang untuk merangsang pembentukan antibodi terhadap keberadaan pili. BabA merupakan salah satu pili H

pylori

yang banyak

dibahas, dengan bobot 78 kDa dan merupakan protein membran yang mampu berikatan dengan antigen Lewis yang terdapat pada eritrosit golongan B manusia (Parewangi, 2009). Selain sebagai fungsi perlekatan pada sel epitel lambung, pili juga berfungsi sebagai saluran sekresi CagA ke sel epitel inang terjadi dalam beberapa tahapan dimana awalnya terjadi perakitan pada sistem sekresi tipe 4, kemudian timbulnya sinyal dari sel inang/sel

epitel

(integins

a5

dan

P1 ).

Sinyal

tersebut menginduksi

pili yang

menyebabkan pertumbuhan pili. Selanjutnya terjadi aktivasi integrins dan penempelan pili dan aktivasi FAK dan Src. Selanjutnya terjadi injeksi CagA melewati pili, posporilasi dari CagA sehingga menyebabkan kerusakan pada sel inangnya Keberadaan pili

dan karakter antigenik suatu bakteri lain telah dikenal baik pada Hemophilus

influenzae tipe b (Gilsdorf, et a/.

1989), E.

coli (Runnels, et a/.

1987), Salmonella (Smith

dan Selander, 1991).

2.6

Pengembangan tes diagnostik Uji diagnostik serologis merupakan uj i yang tidak invasif untuk diagnosa cepat pada

kasus infeksi H

pylori yang

pylori.

Berbagai kit pemeriksaan serologis menggunakan antigen H

lengkap sudah tersedia di pasaran dengan spesifisitas dan sensitivitas yang

tinggi. Pengembangan tes diagnostik serologis untuk H. pylori dapat diawali dcngan meng identifikasi

protein

yang

paling

imunogenik. 8

Validitas

dan

keakuratan

tes

diagnostik dapat ditingkatkan dengan penggabungan antigen beberapa isolat atau kombinasi beberapa jenis antigen. Penggunaan gabungan antigen beberapa isolat atau kombinasi kombinasi antigen yang sering muncul dalam infeksi bakteri ini bisa membuat diagnosa menjadi lebih spesifik dan sensitif. Antigen yang biasa dipakai pada pembuatan kit komersial seperti CagA atau VacA. Protein membran luar (OMP) H

pylori memberi

.

harapan yang lebih baik karena OMP ini berperan sebagai perantara proses perlekatan bakteri pada sel inang (Sicheng, 2007).

9

BAB III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 3.1

Tujuan Penelitian

Tujuan umum : Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik molekul adhesi sub unit pili

Helicobacter pylori (H pylori) pada lambung mencit (Mus musculus) dan sel line cancer colon Tujuan khusus : 1.

Membuktikan sel line cancer colon dapat digunakan sebagai

sel reseptor H

pylori galur Mataram. 2. Membuktikan molekul

hemaglutinin pili 49 kDa H pylori galur Mataram

merupakan molekul adhesin pada sel lambung mencit dan sel line cancer colon. 3.

Mengetahui respons imun penderita gastritis di Mataram terhadap molekul hemaglutinin pili 49 kDa H pylori galur Mataram.

3.2

Manfaat penelitian

Manfaat dari penelitian ini ialah : l . Keberhasilan karakterisasi ini akan mempeijelas pathogenesis H pylori sebagai penyebab dari tukak lambung, maupun karsinoma lambung. Kejelasan dari patogenesis ini harapannya adalah dapat memberikan kontribusi kepada pemberi pelayanan kesehatan serta kepada klinisi dalam penanganan kelainan lambung yang disebabkan oleh H pylori. 2. Harapan dalam pengembangan vaksin ataupun alat diagnosis yang berbasis molekul

sub unit pili yang berperan sebagai molekul adhesi oleh infeksi H pylori. 3. Hasil penelitian ini dapat memberikan informasi kepada para peneliti lain mengenai aspek molekuler dan aspek klinis infeksi H pylori sehingga dapat dimanfaatkan untuk penelitian selanjutnya dalam perkembangan ilmu pengetahuan.

10

BAB IV METODE PENELITIAN

4.1 Biakan H. pylori Isolat H

pylori

isolat Mataram

yang dipakai pada penelitian ini berasal

yang sebelumnya tersimpan

RSU Mataram Semua biakan/ kultur H .

cara

.

dibiakan ulang di media untuk

dari stok kuman dari

di pendingi.h Unit Riset Biomedik

pylori yang

ada di segarkan kernbali dengan

H pylori (agar darah

domba 5% atau media Skirrow

atau juga dengan menggunakan media Trypticase Soy Agar/ TSA dan Trypticase Soy Broth/ TSB yang ditambahkan 10% darah atau serum domba serta suplemen Dent dan lsovitalex. Media padat TSA digunakan untuk sub-kultur sedangkan media cair TSB digunakan untuk pembuatan suspensi bakteri yang akan digunakan untuk kajian selanjutnya. Proses penanaman H pylori pada media memerlukan bahan : - TSA-B - Dent - Kultur H

pylori terbaru (Tahun 2012)

- Reagen pengecatan Gram Prosedur penanaman isolat H H

pylori

pylori pada media

TSA B adalah sebagai berikut : isolat

beku ( dari stok tahun 20 12) dicairkan lalu divortex untuk homogenisasi.

Kemudian diambil 30 J.Ll isolat dan dimasukan ke dalam TSA-B. Dengan menggunakan ose

lalu digores membentuk daerah quadran. Kemudian diinkubasi pada 8% C02 37°C

selama 48 jam. Koloni yang tumbuh kemudian dilakukan pengecatan Gram (Ahwan,

et

al., 2004).

4.2 Pengecatan Gram Pengecatan

Gram menggunakan empat macam larutan yang berperan dalam

pemeriksaan ini, yaitu:

crystal violet, methyl violet,

atau

gentian violet

sebagai pewarna primer; iodin gram yang dapat menyatu dengan

yang berperan

crystal violet

dan

membentuk ikatan pada bakteri gram positif; etanol 95%, aseton, atau campuran keduanya yang dapat melunturkan wama ungu pada bakteri gram-negatif, namun tidak pada gram-positif; dan yang terakhir adalah

sa.franin

atau

air foschin

sebagai pewarna

balasan yang memberikan warna merah pada bakteri gram-negatif tanpa mempengaruhi ·warna pada

gram-positif. kemudian dilanjutkan dengan pemeriksaan mikroskopis dengan

perbesaran lensa objektif I OOx terhadap hasil pengecatan.

11

...3 Pembuatan suspensi eritrosit 0,5% Suspensi eritrosit yang digunakan berasal dari eritrosit kelinci, pengambilan darah dilakukan melalui vena auricularis di telinga. Diambil sebanyak

1,5

ml darah,

kemudian darah segera dimasukan ke dalarn tabung yang telah berisi antikoagulan K3EDTA kristal.

Suspensi darah dihomogenkan

dengan antikoagulan agar tidak

membeku. Kemudian dilakukan pemeriksaan hematokrit untuk menentukan persentase eritrosit kelinci tersebut. Setelah diketahui nilai hematokritnya, kemudian darah dicuci dengan mencampurkan dengan larutan NaCI disentrifus dengan kecepatan

0,85% steril sebanyak 5 ml. kemudian

6000 rpm selama 10 menit. Setelah itu supernatant dibuang

hingga tertinggal endapan eritrositnya. Kemudian endapan tersebut dicuci lagi dengan Jarutan NaCI steril

0,85%

dan dilakukan pengulangan seperti diatas. Setalah dua kali

pencucian, endapan eritrosit kemudian diencerkan dengan larutan NaCI sedemikian hingga mencapai konsentrasi akhir

0,5%. Pembuatan suspensi H pylori dengan

konsentrasi sel sejumlah tertentu dilakukan dengan cara mencuci suspensi sel bakteri.

Suspensi ini disimpan dalam lemari pendingin dan siap untuk digunakan uji bernaglutinasi (Sumarno, et.al, 1992a).

4.4 Pembuatan suspensi bakteri untuk uji hemaglutinasi Pembuatan suspensi H

pylori dengan konsentrasi

sel sejumlah tertentu dilakukan

dengan cara mencuci suspensi sel bakteri yang ditanam pada media TSA/ TSB. Pencucian menggunakan larutan garam setimbang fosfat yang terbuffer (PBS) dingin dengan konsentrasi �ecepatan

0,01 M dan her-pH 7,2 dengan cara sentrifus suspensi sel bakteri

10.000 rpm selama 15 menit). Lalu supematannya dibuang

dan suspensi sel

kemudian ditambahkan sebanyak 5 ml larutan PBS dingin diatas, dihomogenkan kemudian disentrifus kembali

dan supematannya dibuang. Proses ini diulang sebanyak

2x dan terakhir dilarutk:an dalam larutan PBS. Suspensi

kemudian disesuaikan konsentrasi sel bakterinya dengan suspensi menggunakan spektrofotometer A600=0.1 dipatok sebesar

0,1) yang setara dengan 10 10 sel

dalarn larutan PBS tadi cara

mengukur absorbansi

(A. = 600 A0 dan nilai absorbansinya H

pylori/

ml suspensi. Penyesuaian

onsentrasi sel ini dilakukan dengart menggunakan larutan PBS dingin diatas dan tetap d.ihomogenkan sampai mencapai nilai absorbansi diatas. Kemudian suspensi bakteri ini mencerkan

2x dan ini siap untuk diuj i hemaglutinasi cepat dan titrasi hemaglutinasi

urnarno, et.al, 1 992b)

.

12

4.5

Uji hemaglutinasi whole cell extract H. pylori Untuk melacak keberadaan pili bisa dilakukan uji hemaglutinasi cepat dengan

menggunakan suspensi darah kelinci 0,5% yang telah disiapkan. Pengujian dilakukan dengan menggunakan 0,1 ml suspensi eritosit 1 % yang dicampur dengan 0,1

rnl

suspensi

bakteri diatas. Campur kedua suspensi tersebut di atas kaca obyek, kemudian goyang .

perlahan-lahan selama 2 sampai 3 menit. Perhatikan, apakah ada aspek seperti butiran pasir yang menandakan adanya hemaglutinasi. Titrasi aktivitas hemaglutinasi dilakukan pada isolat isolat H pylori basil dari uji hemaglutinasi cepat diatas agar bisa diketahui besarnya titer hemaglutininya secara kuantitatif. Pengujian dilakukan dengan pengenceran suspensi bakteri secara bertingkat (1 01 sampai 1 06) kali atau bisa juga dilakukan pengenceran serial (kelipatan 2) untuk menentukan nilai Hemagglutination Unit (HAU). Sebanyak 50 �1 suspensi dimasukan ke dalam sumur sumur microplate, setelah itu ditambah dengan 50

��

suspensi eritrosit

kelinci 0,5%. Campuran suspensi dihomogenkan menggur�akan rotator plate selama 1 menit, setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu kamar selama 1 jam. Nilai titer bemaglutinin dilihat pada sumur microplate yang masih mengalarni hemaglutinasi dengan pengenceran suspensi bakteri yang terakhir.

4.6

Kultur H. pylori untuk isolasi pili

Isolat isolat H pylori dengan aktivitas hemaglutinasi yang kuat dibiakan pada media TSB/ TGC selama 24 jam pada suhu inkubasi 24°C. Kemudian setelah dikultur di media TGC tersebut, bakteri ditanam pada media TSA. padat (di petri dish). Setelah itu H

pylori diisolasi dan dicuci dengan larutan garam setimbang fosfat (PBS) pH 7.4.

Kemudian suspensi isolat tersebut kemudian dimasukan ke dalam larutan BHI (Brain

Heart Infusion) dengan volume 1 5 sampai 20 ml dan dihomogenisasi menggunakan shaker

yang direndam dalam penangas air selama 30 menit. Kemudian sebanyak 10 ml

suspensi H pylori yang sudah dihomogenkan ini dimasukan ke dalam botol yang mengandung media TCG padat dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 3 7°C selama 2 x 24 jam (Ahwan, et al. 2004).

4.7

Pemanenan H. pylori dari basil kultur

Secara acak diambil dua botol kultur bakteri dari kultur yang ada untuk cek kemumian koloninya. Jika

semua sudah sesuai 13

dengan

harapan,

diambil

koloni bakteri

dengan cara mengeroknya perlahan laban dari media tadi dan kerokan tersebut dikumpulkan dalam botol steril. Permukaan media dikerok dengan menggunakan ose plastik tmtuk memperoleh koloni. Kemudian dilakukan suspensi kemudian di putar untuk mendapatkan endapan kuman. Hasil pemanenan berupa endapan/pellet sel H pylori 4 ml yang akan digunakan untuk pemotongan pili.

4.8

Pemotongan pili Koloni yang ada stap untuk diamati keberadaan pilinya secara mikroskopik

dengan pewarnaan khusus untuk pili atau dengan mengunakan rnikroskop elektron untuk 1ebih memastikan lagi keberadaan pilinya. Kemudian ke dalam botol yang telah berisi koloni H pylori hasil kerokan tadi ditambahkan larutan asam trikloro asetat (TCA) dengan kadar

3

-

5%. Perlahan lahan campuran ini digoyang goyang selama 1 menit dan

setelah itu dibiarkan selama

1 jam

pada suhu kamar.

Setelah itu disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Kemudian supernatant disimpan dan pellet yang ada diambil (usahakan minmal jumlah pellet sebanyak 3 ml padatan sel bakteri). Kemudian pelet disuspensikan kembali dengan larutan PBS sejumlah volume yang sama dengan volume larutan TCA diatas. Suspensi ini siap untuk dicukur pil inya dengan menggunakan alat pemotong pili (pili cutter) seperti pada gambar 4 . 1 .

x--

.......

___

Gambar 4.1 Alat pemotong pili bakteri (pili cutter)

Alat pili cutter disiapkan dan diatur kecepatan rotor serta waktunya, usahakan kecepatan rotor sebesar 5000 rpm dan waktu 30 detik. Setelah ini siap, kemudian 14

suspensi H

pylori yang tercampur dengan larutan PBS tadi dimasukan ke dalam tabung

pili cutter. Hasil potongan kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf steril dan disentrifus

(12000 rpm, 60 detik). Simpan supernatan hasil sentrifugasi, peletnya yang

berisi pili diambil, kemudian disuspensikan kembali dalam larutan PBS dan sentrifus kernbali dengan kecepatan

10000 rpm selama 60 detik. Lakukan kembali pemotongan

pili dengan cara diatas dan hasil potongan dimasukan kembali ke tabung eppendorf, sentrifus kembali dengan waktu dan kecepatan yang sama sampai supernatant jemih (gunakan larutan PBS sebagai blanko/ pembanding kejernihan).

4.9

Uji SDS-PAGE bobot molekul fraksi protein pili Bahan : -Acrylamid

- Coomassie blue

-Bis-acrylamid

- Running buffer

-TEMED

- Loading buffer

-Amonium persulfat - Suspensi bakteri yang telah tercukur -Tris Cl pH

8,8; 1 ,5M

-Tris Cl pH

8,8; 0,5M

-SDS Alat-alat : -Mini protean II Elphor cell (Biorad)

-Adjustable micropipate 0,5 - 1 OJ.tl -Adjustable micropipate 10 - 1 OOJ.tl Prosedur : Membuat separating gel : dH20

4,1 ml

1,5 M Tris-HCI pH 8,8

2,5 ml

10% (w/v) SDS

0,05 ml

Acrylamid/bis-Acrylamid

3,3

ml

(30% I 0,8% w/v)

10% (w/v) ammonium persulfat 0,05 ml TEMED

0,005 ml

Membuat stacking gel (5ml) dH20

3,075ml

0,5 M Tris-HCI, pH 8,8

1 ,25 ml 15

I 0% (w/v) SDS

0,025 ml

Acrylamid/bis-Acrylamid

0,67 ml (30% I 0,8% w/v)

10% (w/v)

0,025 ml

ammonium

persulfat

0,005 ml

TEMED

Resep :

RSB/Loading Buffer dd w

4 ml

UGB/Tris HCl

1 ml

Glycerol

80 ml

10% SDS

1,6 m l

2-P merchaptoethanol 0,4 ml 0,005% BPB

0,2 ml

Rwming Buffer (1 Ox stock solution, pH 8,3) Tris Glysin SDS Ddw to 1 L adjust pH with HCI

Disiapkan sistem elektroforesis gel sodium dodesil sulfat (SDS-PAGE) menurut Laemmli ( 1 974) untuk melihat bobot molekul fraksi protein pili yang ada. Protein pili basil pemotongan terakhir dipanaskan pada suhu 1 00°C selama 30 menit dalam larutan penyangga yang telah dicampur dengan pewama biru brom fenol. Sambil melakukan pemanasan tersebut, siapkan gel yang berisi 12,5% sodium dodesil sulfat (SDS) dengan

stacking gel yang

berkonsentrasi 4%. Alat elektroforesis juga disiapkan agar bisa dialiri

listrik dengan aliran listrik 125 rnA. Disediakan juga molekul standar yang berbobot

rendah sebagai penanda untuk posisi dan bobot protein pili.

.J.lO

Isolasi hemaglutinin dari protein membran luar (OMP) sci H. pylori Endapan dari hasil cukuran terakhir pili yang masih tersisa diambil� kemudian

disuspensikan .dengan larutan PBS 0,05 M, pH 7,4 yang telah dicampur oleh larutan �OG 0,5% dengan volume yang sama banyak. Suspensi ini di vortex dengan getaran maksimal selama I men it (homogenisasi). Setelah itu di sentrifus dengan kecepatan 16

°

12.000 rpm, suhu 4 C selan1a 30 menit agar suspensi menjadi homogen sempurna. Ambil supernatannya dan disimpan pada suhu dingin. Endapan disuspensikan kembali dengan campuran larutan PBS pH 7,4 dan larutan NOG 0,5% seperti diatas. Kemudian proses ini diulang sampai 4

-

5 kali agar benar benar tuntas dalam memisahkan protein membran

luar bakteri. Supernatan yang mengandung protein membran luar ini disimpan untuk proses dialisis menggunakan membran berpori. Dari sini diharapkan aka:n terisolasi hemaglutinin dari H

pylori.

Hasil isolasi protein membrane luar (OMP) ini dilakukan

pengulangan langkah dari vortex campuran yang telah dicampur larutan PBS-NOG diatas hingga mendapatkan supernatant kembali sebanyak 6 kali (Sumarno, 2003 ) .

4.11

Uji Hemaglutinasi Pili dan OMP Fraksi pili dan OMP yang ada akan diuji aktivitas hemaglutinasinya dengan

menggunakan suspensi eritrosit kelinci 0,5% yang telah difiksasi. Diperlukan bahan

(),85% NaCI serta fraksi pili dan OMP yang akan diuji. Cara keijanya pertama dibuat serial pengenceran fraksi pili pada U shaped-bottom microplate. Kemudian diteteskan sel eritrosit kelinci. Setelah dilakukan pencampuran dengan suspensi eritrosit kelinci,

microplate

digoyang-goyang diatas rotator plate sebanyak 60 kali, lalu didiamkan pada

suhu kamar selama

1

jam. Titer hemaglutinasi dibaca pada sumur pengenceran terakhir

yang masih mengalami hemaglutinasi sempurna. Diamati adanya hemaglutinasi ditandai dengan tidak adanya titik

(+).

Sebagai suspensi eritrosit bisa juga digunakan eritrosit

manusia untuk melihat pengaruh aktivitas hemaglutinin

H pylori

terhadap eritrosit

manus1a.

4.12

Isolasi sel epitel lambunglusus mencit Seekor mencit (Mus musculus) jantan sehat berumur tiga bulan dibunuh dengan

cervical dislocation,

kemudian rongga perutnya dibuka dan dicari lambung dan usus

balusnya. Usus tersebut diambil dan dipisahkan dengan jaringan sekitarnya kemudian dipotong potong dengan masing masing potongan berukuran 5 em. Pada setiap potongan dilakukan pembukaan lumennya dengan cara memotong melintang. lsi lambung/usus dibuang, kemudian lumen dibersihkan dengan menggunakan carran PBS pH 7,4 yang mengandung

dithiothreithol

lmM dingin hingga bersih.

!C.ernudian din1asukan potongan potongan tersebut kedalam cairan yang mengandung 1 ,5 :n.I.'V{ KCl, 9,6 mM NaCl, 2,7 mM Na-citrat, 8 mM KH2P04 dan 5,6 mM Na2HP04 pH 17

7,3 dingin. Masukkan dalam penangas air pada suhu 37° C penggoyangan perlahan-lahan selama 30 menit. Cairan dibuang dan diganti dengan cairan PBS pH 7,4 yang mengandung 1,5 mM EDTA dan 0,5 mM dithiothreitol pH 7,4. Jaringan usus dalam cairan tersebut digoyang kuat pada penangan air selama 20 menit pada bagian cairann ya dibuang jaringan usus dicuci dengan menggunakan PBS pH 7,4 dengan cara sentrifugasi .

memakai kecepatan 1000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C tiga kali. Kemudian jaringan usus disuspensikan dalam cairan PBS pH 7,4 dikocok perlahan-lahan bagian cairan yang tampak keruh diambil dengan pipet steril dan dimasukkan dalam tabung steril. Konsentrasi sel enterosit yang ada dalam cairan tersebut dibuat 106 setiap ml dengan cara menghitungnya terlebih dahulu menggunakan kamar hitung/ hemositometer (Sumarno, 2003).

4.13 Uji adhesi H. pylori pada sel enterosit dan sel line cancer colon Sel enterosit dan sel line cancer colon WiDr dikultur dalam mikroplate 8 sumur (Nunc, Denmark), difiksasi dengan 1% larutan paraformaldehid atau 30% acetone dalam methanol (v/v), kemudian dicuci dengan PBS dan disimpan pada 4°C sampai digunakan. Selanjutnya disiapkan mikroplate 8 sumur yang dicuci 3 kali dengan 50% ethanol, 5 menit air mengalir dan selanjutnya dibilas dengan PBS. Sumuran kemudian diblok dengan I %BSA dalam PBST selama 1 jam. Strain H pylori positif hemaglutinin isolat Mataram yang telah dibiakkan kemudian disuspensikan sampai konsentrasi 105 permL dan

dimasukkan kedalam sumuran yang telah berisi suspensi enterosit atau sel line

cancer colon. Adanya penempelan H pylori pada sel permukaan sel enterosit atau sel line cancer colon dilakukan dengan teknik imunositokimia menggunakan poliklonal anti­ H pylori dan Universal

Detection Kit-HRP (Dako) dan diamati menggunakan mikroskop

pembesaran 200x. Sedangkan analisa penempelan molekul adhesion dilakukan dengan teknik western blotting.

4.14

Pengecatan Imunohistokimia (wltole ceU extract) Pengecatan imunohistokimia pada whole cell extract H pylori bertujuan untuk

mengetahui penempelan antigen H pylori pada permukaan sel enterosit mencit. Bahan yang diperlukan :

LSAB2 system HRP (DAKO) Polyclonal anti H.

pylori (DAKO 8047 1 ) lot 00073400 18

Whole cell extract H pylori Cara kerja pengecatan adalah pertama suspen sel enterosit dicampur antigen ekstrak H

pylori.

Sebanyak 1001-11 campuran diusapkan dipermukaan obyek gelas,

dikering anginkan dan difiksasi dengan ethanol. Kemudian diteteskan antibodi primer anti

H pylori,

inkubasi selama 15 menit pada suhu

karnar, dicuci 3 kali dengan PBS.

Dilanjutkan dengan diteteskan berturut-turut peroxidase block, Biotin link, streptavidin

dan substrat. Kemudian baru diamati dibawah mikroskop

4.15

Pengecatan Imunohistokimia antigen pili dan OMP H. pylori Pengecatan

Imunohistokimia

dilakukan

dengan

tujuan

untuk

mengetahui

penempelan antigen pili dan OMP H pylori pada permukaan sel enterosit. Bahan yang diperlukan adalah: LSAB2 system HRP (DAKO #K0637) lot : 1 0055280 Pili OMP

Polyclonal anti H pylori Cara kerja pemeriksaan ini adalah pertama-tarna suspensi sel enterosit yang telah

dicampur dengan antigen pili dan OMP diusapkan pada permukaan gelas obyek, difi.ksasi dengan ethanol. Kemudian diteteskan antibodi primer, diinkubasi selama 15 menit, Setelah itu dicuci

3 kali dengan PBS. Ditarnbahkan peroxidase block, dicuci 3

kali. Dilanjutkan ditambahkan sfreptavidin

biotin link, dicuci 3 kali. Kemudian ditambahkan

HRP. Kemudian ditarnbahkan substrat, dicuci 3 kali dan dikeringanginkan.

Setelah itu baru kemudian diarnati dibawah mikroskop.

4.16

a.

Vaksinasi Ayam Petelur Preparasi Vaksin Spuite 5 cc berisi 2 ml antigen pili Spuite 5

cc

berisi 2 ml

complete Freud's adjuvant

Spuite 5 cc berisi 2 ml antigen OMP Spuite 5 cc berisi 2 ml complete b.

Kedua

UJung

spuite

Freud's adjuvant

dihubungkan

dengan

dicampurkanlemulstfYing dengan mendorong bergantian

19

connector,

kemudian

c.

Disuntikkan 30 J..tg antigen melalui sub kutan bawah sayap ayam. Ayam yang digunakan adalah jenis ayam petelur

(Layer) lzabrown.

Suntikan yang pertama

dicampur dengan complete Freund's adjuvant. d.

Antigen

dan adj uvant tercampur sempuma hila diteteskan di permukaan air tidak

menyebar e.

Kemudian juga dilakukan vaksinasi ke 2 dan ke 3

f.

Vaksinasi ke 3, adjuvant yang digunakan diganti dengan

incomplete Freud's

adjuvant g.

Panen telur pada hari ke 5 sampru hari ke 1 7 setelah dilakukan pemberian suntikan

booster

yang ke 2.

4.17 Metode isolasi lgY dari kuning telur Pisahkan bagian putih telur dan kulit kuning telur

Immunoglobulin

G

Yolk sac

untuk isolasi anti bodi

(IgGY) Suspensikan kuning telur dengan cairan buffer A

yang mengandung 10 mM kalium fosfat dan 100 mM NaCl pada pH 7, sampai volume mencapai 30 mi. Campurkan suspensi dengan larutan prophylene

ethylene glycol 6000

(PEG) 30 ml sehingga konsentrasinya mencapai 7%. Sentrifugasi dengan menggunakan keceptan 14.000 rpm selama 1 0 menit pada suhu 4°C Ambit supematans dan saring dengan kain kasa steril. Tambahkan PEG padat pada basil saringan cairan tersebut sampai konsentrasi mencapai 12% dan aduk sampai

seluruh PEG larut. Sentrifugasi

larutan dengan menggunakan kecepatanl 4.000 rpm selarna 1 0 menit pada suhu 4° C.

Ambil pelet yang mengandung IgG Y, suspensikan dengan menggunak:an bufer A dan dicampur dengan PEG pada volume yang sama pada konsentrasi 24% dalam bufer A Sentrifugasi suspensi di pada kecepatan 14.000 rpm selama 1 0 menit pada suhu 4° C. Larutkan pelet di dengan bufer A sebanyak 1 0 ml kemudian dilakukan dialisis dalam

bufer A selama 24 jam. Sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada sohu 4°C untuk menghilangkan kotoran. Simpan supematan pada suhu -20° C, disiapkan "'Dltuk penelitian selanjutnya (Sumarno, 2000).

4.18 Pemeriksaan IgY pada kuning telur dengan microdiluter Untuk melakukan pemeriksaan adanya IgY pada kuning telur

(egg yolk) pertama

disiapkan bahan telur ayam yang telah diimunisasi dan PHA sel anti H pylori. Langkah erjanya adalah pertama dengan menggunakan 20

microdiluter, dibuat serial pen genceran