RESPON PERTUMBUHAN KULTUR SEL LIMFOID UDANG VANAME

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

SKRIPSI

RESPON PERTUMBUHAN KULTUR SEL LIMFOID UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei) PADA MEDIA YANG BERBEDA

Oleh : INDRA TRI PRAYUGI JOMBANG – JAWA TIMUR

FAKULTAS PERIKANAN DAN KELAUTAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2014

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


SKRIPSI


Oleh : INDRA TRI PRAYUGI NIM : 141011105

Menyetujui, Komisi Pembimbing

Pembimbing Utama

Pembimbing Serta

Dr. Ir. Endang Dewi Masithah, M.P. NIP. 19690912 199702 2 001

Dr. Widjiati, M.Si., HIDAYATUL drh. UDCHIYAH NIP. 19620915 199002 2 001

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


SKRIPSI


Oleh : INDRA TRI PRAYUGI NIM : 141011105 Telah diujikan pada Tanggal

: 24 Juni 2014

KOMISI PENGUJI SKRIPSI Ketua

: Moch. Amin Alamsjah, Ir., M.Si., Ph.D

Anggota

: Rr. Juni Triastuti, S.Pi., M.Si. Dr. Gunanti Mahasri, Ir. M.Si. Dr. Endang Dewi Masithah, Ir. M.P. Dr. Widjiati, M.Si., drh.

Surabaya, 7 Juli 2014 Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Dekan,

Prof. Dr. Hj. Sri Subekti,drh.DEA NIP. 19520517 197803 2 001

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


RINGKASAN INDRA TRI PRAYUGI. Respon Pertumbuhan Kultur Sel Limfoid Udang Vaname (Litopenaeus vannamei) pada Media yang Berbeda. Dosen Pembimbing I Dr. Ir. Endang Dewi Masithah, M.P. dan Dosen Pembimbing II Dr. Widjiati, M.Si., drh. Masalah utama pada budidaya udang vaname hingga saat ini adalah munculnya penyakit yang disebabkan oleh virus, bakteri dan jamur. Informasi tentang karakteristik penyakit yang diperlukan untuk pencegahan dan pengendalian penyakit pada udang belum banyak diketahui. Salah satu cara yang bisa dipakai untuk mengetahui karakteristik penyakit adalah dengan menggunakan kultur sel. Kultur sel ini nantinya bisa membantu untuk menentukan dan memahami hubungan antara udang dan patogen pada tingkat seluler dan molekuler sehingga memberikan kemudahan dalam pencegahan dan pengendalian penyakit yang menyerang udang. Pembuatan kultur sel udang memerlukan media yang tepat untuk pertumbuhan dan perkembangan sel yang dikultur. Media yang sering digunakan untuk kultur sel udang adalah media MEM, media L-15 dan media TCM. Namun, sampai saat ini belum ada referensi khusus perihal media mana yang dapat memberikan hasil terbaik terhadap pertumbuhan sel limfoid udang yang sedang dikultur. Berdasarkan hal tersebut, maka penelitian tentang jenis media pertumbuhan yang paling baik dalam kultur sel limfoid udang vaname sangat diperlukan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui perbedaan pertumbuhan dan media terbaik bagi pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname (L. vannamei) pada media yang berbeda. Penelitian dilakukan di Laboratorium In Vitro, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga Surabaya pada bulan Februari 2014. Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 3 perlakuan dan 3 kali ulangan. Data hasil penelitian dianalisis menggunakan ANAVA. Apabila menunjukkan adanya perbedaan maka dilanjutkan dengan uji Jarak Berganda Duncan. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah udang vaname berumur 2 bulan dengan panjang tubuh ± 8 cm, media L-15, media MEM, media TCM, penicilin-streptomycin, amphoterycin B, Fetal Calf Serum (FCS), NaHCO3, aquabidest, tripsin, phenol red, trypanblue dan larutan fiksatif. Parameter utama yang diamati adalah jumlah dan viabilitas sel limfoid udang vaname sedangkan parameter pendukungnya adalah ada tidaknya kontaminasi. Hasil analisis varian (ANAVA) yang dilakukan mulai pengamatan awal hingga hari ke-18 menunjukkan bahwa perlakuan B (media L-15) memberikan hasil kultur sel limfoid udang vaname tertinggi (39 x106 sel/ml) yang berbeda nyata (p<0,05) dengan perlakuan C (media TCM sebesar 28,667 x106 sel/ml) dan perlakuan A (media MEM sebesar 22,333 x106 sel/ml). Berdasarkan perhitungan viabilitas sel semua perlakuan masih layak dan baik untuk mendukung kelangsungan hidup sel yang dikultur yakni diatas 95% tanpa adanya kontaminasi. iv Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


SUMMARY INDRA TRI PRAYUGI. Growth Response of White Shrimp (Litopenaeus vannamei) Lymphoid Cell Cultures in Different Media. Academic Advisor I Dr. Ir. Endang Dewi Masithah, M.P. and Academic Advisor II Dr. Widjiati, M.Si., drh. The main problem in vaname culture is the emergence of diseases caused by viruses, bacteria and fungi. Information about disease characteristics is necessary for the prevention and control of disease in shrimp is not widely known. One way that can be used to determine the characteristics of the disease is by using cell culture. This cell culture will help determining and understanding the relation between shrimp and pathogens at cellular and molecular level so it can provide ease in the prevention and control of in shrimp. Shrimp cell culture requiring an exact medium for proper growth and development of cultured cells. Medium that often used for shrimp cell culture are MEM, L-15 and TCM. However, until now there is no specific reference regarding which medium can provide the best results on the growth of shrimp lymphoid cells that was cultured. Based on this fact, the research of the best media for the growth of white shrimp lymphoid cell cultures is indispensable. The purpose of this study was to determine the differences in growth and the best medium for the growth of white shrimp lymphoid cell cultures (L. vannamei) in different media. The study was conducted in the In Vitro Laboratory, Faculty of Veterinary Medicine, Airlangga University in February 2014. Research design used Completely Randomized Design with 3 treatments and 3 replications. The data was analyzed using ANOVA. If it shows a difference than Duncan 's Multiple Range Test is used. Materials used in this study were 2 months old white shrimp with a body length of ± 8 cm, L-15 medium, MEM medium, TCM medium, penicillinstreptomycin, amphoterycin B, Fetal Calf Serum (FCS), NaHCO3, aquabidest, trypsin, phenol red, trypanblue and fixative solution. The main parameters measured were the amount and viability of white shrimp lymphoid cells while the supporting parameter is contamination . Results of analysis of variance (ANOVA) were conducted from initial observations up to day 18 showed that treatment B (medium L-15) gave the best results white shrimp lymphoid cell cultures (39 x 106 cells/ml) were significantly different ( p < 0,05 ) with treatment C (medium TCM at 28.667 x 106 cells/ml) and treatment A (medium MEM at 22,333 x 106 cells/ml). Based on the calculation of all the cell viability still viable and better treatments to support survival of cultured cells which is above 95 % without contamination.

v Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rakhmat, taufiq dan hidayah-Nya, sehingga Skripsi tentang Respon Pertumbuhan Kultur Sel Limfoid Udang Vaname (Litopenaeus vannamei) pada Media yang Berbeda dapat penulis selesaikan. Laporan ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang telah dilaksanakan di Laboratorium In Vitro, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga pada bulan Februari 2014. Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari kesempurnaan, sehingga kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan demi perbaikan dan kesempurnaan Skripsi ini. Akhirnya penulis berharap semoga Karya Ilmiah ini bermanfaat

dan memberikan informasi bagi semua pihak, khususnya bagi

Mahasiswa Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga guna kemajuan serta perkembangan ilmu dan teknologi dalam bidang perikanan, terutama budidaya perairan.

Surabaya, Juli 2014

Penulis

vi Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


UCAPAN TERIMA KASIH Pada kesempatan ini, tidak lupa pula penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada: 1. Ibu Prof. Dr. Hj. Sri Subekti, drh. DEA., selaku Dekan Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Surabaya. 2. Ibu Dr. Endang Dewi Masithah, Ir. M.P. selaku Dosen Pembimbing Pertama dan Ibu Dr. Widjiati, M.Si., drh. selaku Dosen Pembimbing Kedua yang telah memberikan arahan, petunjuk dan bimbingan sejak penyusunan usulan hingga selesainya Skripsi. 3. Bapak Moch. Amin Alamsjah., Ir. M.Si.,Ph.D., Ibu Rr. Juni Triastuti, S.Pi., M.Si., dan Ibu Dr. Gunanti Mahasri., Ir. M.Si. selaku Dosen Penguji yang telah bersedia meluangkan waktu untuk menguji serta memberikan masukan dan saran atas perbaikan laporan Skripsi. 4. Bapak Yudi Cahyoko., Ir. M.Si. dan Bapak Moch. Amin Alamsjah., Ir. M.Si.,Ph.D. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang senantiasa memberi nasehat dan pengarahan selama masa perkuliahan. 5. Bapak/Ibu dosen dan staf pendidikan di Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga. 6. Kedua orangtua atas doa yang selalu terlantun dan nasehat bijak yang menjadi penguat dalam studi. 7. Kedua kakakku tercinta atas doa dan dukungan yang diberikan. 8. Nur Faizah, Latifah dan Arlisa yang telah berjuang bersama dalam penelitian.

vii Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


9. Azhar, Arifah, Dyah Sunaring, Januar, Onad, Sapron dan Sofi yang banyak membantu dalam penyelesaian Skripsi ini, serta teman-teman seperjuangan angkatan 2010 atas dukungan dan doa yang telah kalian berikan. 10. Teman-teman BLM FPK UA 2013, Mapanza 2010 dan paduan suara fakultas yang telah memberi dukungan selama penyusunan Skripsi. 11. Semua pihak yang telah membantu sehingga Skripsi ini bisa terselesaikan.

viii Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


DAFTAR ISI Halaman RINGKASAN ......................................................................................

iv

SUMMARY .........................................................................................

v

KATA PENGANTAR .........................................................................

vi

UCAPAN TERIMA KASIH ................................................................

vii

DAFTAR ISI ........................................................................................

ix

DAFTAR TABEL ...............................................................................

xi

DAFTAR GAMBAR ..........................................................................

xii

DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................

xiii

I

II

PENDAHULUAN ........................................................................

1

1.1 Latar Balakang ........................................................................

1

1.2 Rumusan Masalah ...................................................................

3

1.3 Tujuan .....................................................................................

3

1.4 Manfaat ...................................................................................

3

TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................

4

2.1 Klasifikasi dan Morfologi Udang Vaname .............................

4

2.2 Organ Limfoid.........................................................................

5

2.3 Kultur Sel ................................................................................

7

2.4 Media Pertumbuhan Kultur Sel .............................................. 2.4.1 Minimum Esensial Medium (MEM) ............................ 2.4.2 Leibovitz (L-15) ............................................................ 2.5.3 Tissue Culture Medium (TCM)/ Medium 199..............

7 8 9 9

2.5 Kultur Sel Udang ...................................................................

10

2.6 Media Kultur Sel Udang ........................................................

11

2.7 Teknik Aseptik .......................................................................

12

2.8 Faktor Pendukung Kultur Sel.................................................

13

2.8.1 Suhu ..............................................................................

13

ix Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


2.8.2 pH .................................................................................. 2.8.3 CO2................................................................................ 2.8.4 Metode Pemisahan Sel ..................................................

14 14 14

III KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS ......................

16

3.1 Kerangka Konseptual ............................................................

16

3.2 Hipotesis ...............................................................................

17

IV METODOLOGI PENELITIAN ....................................................

19

4.1 Tempat dan Waktu Penelitian .................................................

19

4.2 Materi Penelitian ..................................................................... 4.2.1 Bahan Penelitian ........................................................... 4.2.2 Alat Penelitian ...............................................................

19 19 19

4.3 Metode Penelitian ................................................................... 4.3.1 Rancangan Penelitian ....................................................

19 19

4.4 Prosedur Kerja ....... ................................................................ 4.4.1 Persiapan Peralatan ....................................................... 4.4.2 Pembuatan Media Kultur Sel ........................................ 4.4.3 Pengambilan Organ Limfoid......................................... 4.4.4 Kultur Sel ...................................................................... 4.4.5 Pengamatan ................................................................... 4.4.6 Parameter Penelitian ..................................................... 4.4.7 Analisis Data .................................................................

20 20 21 21 22 22 23 24

HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................

25

5.1 Hasil ........................................................................................ 5.1.1 Pertumbuhan Kultur Sel Limfoid.................................. 5.1.2 Viabilitas Sel Limfoid Udang Vaname .........................

25 25 30

5.2 Pembahasan ............................................................................

32

VI KESIMPULAN DAN SARAN.....................................................

36

5.1 Kesimpulan ............................................................................

36

5.2 Saran ......................................................................................

36

DAFTAR PUSTAKA ..........................................................................

37

LAMPIRAN .........................................................................................

40

V

x Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


DAFTAR TABEL

Tabel

Halaman

5.1 Penghitungan Jumlah Sel Limfoid pada Media Berbeda ...............

28

5.2. Viabilitas Sel Limfoid pada Media Berbeda .................................

30

xi Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


DAFTAR GAMBAR Gambar

Halaman

2.1. Morfologi Udang Vaname .................................................................

5

2.2. Letak Organ Limfoid Udang Penaeid ................................................

6

3.1. Skema Kerangka Konseptual .............................................................

18

4.1. Diagram Alir Penelitian .....................................................................

23

5.1. Pertumbuhan Sel Limfoid pada Hari Ketiga Kultur ..........................

26

5.2. Pertumbuhan Sel Limfoid pada Hari Keenam Kultur ........................

27

5.3. Grafik Pertumbuhan Sel Limfoid Udang Vaname .............................

29

5.4. Grafik Viabilitas Sel Limfoid Udang Vaname ..................................

31

5.5. Viabilitas Sel Limfoid ........................................................................

31

xii Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran

Halaman

1. Komposisi Media MEM, TCM dan L-15 ........................................

40

2. Peralatan dan Bahan Penelitian ........................................................

42

3. Pertumbuhan Kultur Sel Limfoid pada Media Berbeda ...................

44

4. Hasil Analisis Data Pertumbuhan dengan SPSS ..............................

46

5. Hasil Analisis Data Viabilitas dengan SPSS....................................

52

xiii Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Udang merupakan salah satu komoditas utama dalam program industrialisasi perikanan budidaya dan merupakan andalan ekspor produk perikanan budidaya disamping ikan tuna, tongkol, cakalang dan rumput laut. ASEAN Free Trade Zone (AFTA) yang akan diterapkan pada tahun 2015, mendorong peningkatan kualitas produk dalam negeri. Salah satu komoditas unggulan yang saat ini menjadi pilihan pembudidaya udang adalah udang vaname (Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya, 2013). Rata-rata pertumbuhan produksi udang vaname di Indonesia sekitar 25 persen/tahun antara tahun 2005 hingga 2010 (Smith et al., 2012). Prosentase peningkatan produksi tahun 2012 mencapai 32,87%, dari 400.385 ton pada tahun 2011 menjadi 457.600 ton pada tahun 2012 dan pada tahun 2014, ditargetkan adanya peningkatan produksi sebesar 200 ribu ton (Hariyanto dan Maskur, 2013). Masalah utama yang masih sulit dikendalikan pada budidaya udang vaname hingga saat ini adalah munculnya penyakit yang disebabkan oleh virus, bakteri dan jamur. Penyakit yang menyerang udang vaname dapat mengakibatkan kematian sehingga menimbukan kerugian ekonomi yang besar (Harijanto, 2012). Penyakit yang menyerang udang pada umumnya menyerang sistem kekebalan tubuh dimana pada udang, sistem kekebalan tubuh ini diperankan oleh organ limfoid (Kondo et al., 1994). Pencegahan dan pengendalian penyakit ini harus dilakukan sedini mungkin agar tidak mewabah menjadi lebih besar (Alifuddin, 2002).

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


2

Informasi

tentang

karakteristik

penyakit

yang

diperlukan

untuk

pencegahan dan pengendalian penyakit pada udang belum banyak diketahui. Salah satu cara yang bisa dipakai untuk mengetahui karakteristik penyakit adalah dengan menggunakan kultur sel (Nuryati, 2000). Kultur sel ini nantinya bisa membantu untuk menentukan dan memahami hubungan antara udang dan patogen pada tingkat seluler dan molekuler. Selain itu, juga untuk memahami fungsi kekebalan tubuh pada udang sehingga memberikan kemudahan dalam pencegahan dan pengendalian penyakit yang menyerang udang (Claydon, 2009). Pembuatan kultur sel udang memerlukan media yang tepat untuk pertumbuhan dan perkembangan sel yang dikultur. Media kultur sel terdiri dari sejumlah besar asam amino, vitamin, mineral, glukosa dan hormon dimana setiap media kultur mempunyai kandungan nutrisi yang berbeda (Maurer, 1992). Media yang digunakan untuk kultur sel limfoid udang harus dapat menyediakan nutrisi yang dapat mendukung pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel limfoid. Jenis media yang digunakan dalam kultur sel limfoid udang masih bermacam-macam tergantung keinginan peneliti. Menurut Toullec (1999) media yang sering digunakan untuk kultur sel udang adalah media MEM, media L-15 dan media TCM. Namun, sampai saat ini belum ada referensi khusus perihal media mana yang dapat memberikan hasil terbaik terhadap pertumbuhan sel limfoid udang yang sedang dikultur. Berdasarkan hal tersebut, maka penelitian tentang jenis media pertumbuhan yang paling baik dalam kultur sel limfoid udang vaname sangat diperlukan. Dengan begitu, akan didapatkan informasi tentang media

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


3

terbaik yang dapat dijadikan referensi dalam proses pembuatan kultur sel limfoid udang vaname. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang tersebut, maka terdapat dua rumusan masalah sebagai berikut : 1. Apakah terdapat perbedaan pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname (L. vannamei) pada media yang berbeda? 2. Pada media manakah kultur sel limfoid udang vaname (L. vannamei) yang menunjukkan pertumbuhan paling baik? 1.3 Tujuan Penelitian Berdasarkan rumusan masalah tersebut, maka tujuan penelitian sebagai berikut : 1. Untuk mengetahui perbedaan pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname (L. vannamei) pada media yang berbeda. 2. Untuk mengatahui media terbaik bagi pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname (L. vannamei). 1.4 Manfaat Penelitian Memberikan informasi

mengenai perbedaaan pertumbuhan dan media

terbaik bagi pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname (L. vannamei) pada media yang berbeda. Lebih jauh penelitian ini nantinya bisa dijadikan referensi dalam kultur sel udang yang digunakan untuk pengembangan ilmu molekuler.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Klasifikasi dan Morfologi Udang Vaname Wyban and Sweeney (1991) menyatakan bahwa udang vaname diklasifikasikan sebagai berikut: Phylum Subphylum Class Subclass Superorder Order Suborder Superfamily Family Genus Subgenus Species

: Arthropoda : Crustacea : Malacostraca : Eumalacostraca : Eucarida : Decapoda : Dendrobranchiata : Penaeoidea : Penaeidae : Penaeus : Litopenaeus : L. vannamei

Udang vaname merupakan salah satu jenis udang penaeid yang tubuhnya terdiri dari 19 segmen. Lima segmen membentuk kepala, delapan segmen terletak di dada dan enam segmen di perut. Kepala dan dada yang menyatu disebut cephalothorax, atau dikenal sebagai pereon. Pada ruas kepala terdapat mata majemuk yang bertangkai dan memiliki dua buah antena (antena dan antennulae) yang memeiliki fungsi sensorik (Ruppert dan Barnes, 1994; Budd, 2002) yang dikutip oleh Corteel (2013).

Pada bagian kepala terdapat mandibula yang

berfungsi untuk menghancurkan makanan yang keras dan dua pasang maxilla yang berfungsi membawa makanan ke mandibula (Pusluh KP, 2011). Masing-masing ruas pada bagian dada mempunyai sepasang anggota badan disebut thoracopoda. Thoracopoda 1-3 disebut maxiliped yang berfungsi dalam memegang makanan. Thoracopoda 4-8 berfungsi sebagai kaki jalan

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


5

(periopod). Periopod 1-3 mempunyai capit kecil yang merupakan ciri khas udang penaeidae. Ruas 1-5 pada bagian abdomen memiliki sepasang kaki renang disebut pleopod. Pada ruas keenam terdapat uropod dan telson yang berfungsi sebagai kemudi (Pusluh KP, 2011). Ciri khas dari udang vaname adalah pada rostrum terdapat dua gigi di sisi ventral, dan sembilan gigi di sisi dorsal. Badan udang vaname tidak terdapat rambut-rambut halus (setae). Pada jantan, petasma memiliki panjang 12 mm yang tumbuh dari ruas pertama dari kaki jalan dan kaki renang (coxae). Pada betina thelycum terbuka berupa cekungan yang ditepinya banyak ditumbuhi oleh bulubulu halus, terletak dibagian ventral dada, antara ruas kaki jalan ketiga dan keempat (Pusluh KP, 2011). Morfologi udang vaname dapat dilihat pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1. Morfologi Udang Vaname (Bailey- Brock and Moss, 1992 yang dikutip oleh Giang, 2012). 2.2 Organ Limfoid Organ limfoid pertama kali diperkenalkan oleh Masao Oka pada tahun 1969, yang terdapat pada Penaeus orientalis sehingga organ limfoid juga sering disebut dengan organ oka. Bell and Lightner (1988) yang dikutip oleh Alifuddin

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


6

(2002) menjelaskan bahwa organ oka ini terdiri dari dua lobus, terletak di dorsoanterior hepatopankreas dan ventro-lateral lambung anterior dan posterior. Menurut Lu et al., (1995) organ limfoid memiliki letak yang unik dan relatif kecil, sehingga tidak mudah untuk identifikasi dan pemotongan organ, apalagi ketika udang yang digunakan ukurannya kurang dari 10 gram. Nuryati (2000) mengatakan bahwa organ limfoid terletak di bagian depan hepatopankreas. Organ ini terdiri atas dua lobus yang menyatu membentuk bulatan dengan diamater kirakira 3 mm berwarna putih. Berdasarkan observasi yang dilakukan ditemukan adanya pembuluh aferen dan eferen pada organ limfoid. Pembuluh aferen dihubungkan oleh arteri antena yang membagi dua dan menjadi pusat dari tubula. Organ limfoid pada krustasea memainkan peran penting dalam respon imun. Organ ini diketahui sebagai pusat akumulasi benda-benda asing yang masuk ke tubuh udang termasuk patogen (Oka, 1969).

Gambar 2.2. Letak Organ Limfoid Udang Penaeid (Giang, 2012)

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


7

2.3 Kultur Sel Kultur sel adalah kultur sel-sel yang berasal dari organ atau jaringan yang telah diuraikan secara mekanis atau enzimatis menjadi suspensi sel. Suspensi sel ini selanjutnya dibiakkan secara in vitro di atas permukaan yang keras misalnya botol, tabung atau cawan atau menjadi suspensi sel dalam media penumbuh (Malole, 1990). Kultur primer mengacu pada tahap kultur setelah sel-sel yang terisolasi dari jaringan kemudian dikembangbiakkan di bawah kondisi yang tepat dan terkontrol sampai menempati semua substrat yang tersedia (yaitu, mencapai konfluen). Pada tahap ini, sel-sel harus disubkultur dengan memindahkannya ke dalam substat dan medium pertumbuhan yang baru sehingga memberikan lebih banyak ruang untuk pertumbuhan selanjutnya (Gibco, 2011). Sel yang telah dikultur biasanya tanpa struktur dan kehilangan bentuk histotypic serta sifat biokimianya. Umumnya kultur sel tidak mencapai keadaan stabil kecuali dalam kondisi tertentu. Kultur sel bisa diperbanyak dan terbagi menjadi replikasi yang identik. Kultur sel dapat diawetkan dengan pembekuan dan dapat dimurnikan dengan cara menumbuhkannya pada media selektif. Pemisahan sel secara fisik atau kloning dilakukan untuk memberikan informasi tentang karakteristik sel (Freshney, 1992). 2.4 Media Pertumbuhan Kultur Sel Media kultur sel merupakan campuran dari karbohidrat, vitamin, asam amino, hormon, mineral dan beberapa unsur yang lain. Formulasi nutrisi ini bervariasi tergantung sel yang akan dikultur. Karbohidrat diberikan terutama dalam bentuk glukosa. Pada beberapa kasus, glukosa diganti dengan galaktosa

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


8

untuk mengurangi terbentuknya asam laktat karena metabolisme galaktosa lambat. Sumber karbon yang lain misalnya asam amino (terutama L-glutamin) dan piruvat (ATCC, 2012). Media dapat membantu mempertahankan pH dan osmolaritas pada saat kultur disamping penyedia nutrisi. pH dipertahankan dengan satu atau lebih buffer misalnya CO2/ sodium bikarbonat, fosfat dan hydroxyetil piperazine ethane sulfonic acid (HEPES). Serum biasanya juga digunakan sebagi buffer. Phenol red sebagai indikator pH biasa ditambahkan dalam media untuk mengamati perubahan pH dari warna media yang digunakan (ATCC, 2012). Berdasarkan kandungan asam amino dan komponen lainnya media ini terdiri dari beberapa jenis misalnya Eagle’s MEM, Ham’s F-12, CMRL 1066, RPMI 1640, medium 199/TCM, Leibovitz’s L-15 dan sebagainya (Maurer, 1992). 2.4.1 Minimum Esensial Medium (MEM) MEM merupakan modifikasi dari Basal Medium Eagle (BME). Media ini dikembangkan oleh Harry Eagle untuk memenuhi kebutuhan gizi spesifik subtipe tertentu dari sel HeLa dan fibroblas mamalia normal. Konsentrasi asam amino MEM yang tinggi sangat mendekati komposisi protein sel mamalia. MEM dapat digunakan baik dengan garam Earle atau garam Hank dan bisa juga ditambah suplemen dengan asam amino non-esensial. Media ini dapat lebih dimodifikasi dengan menghilangkan kalsium untuk memfasilitasi pertumbuhan sel-sel pada kultur suspensi (Himelab, 2011). Kandungan nutrisi yang ada di dalam media MEM dapat dilihat pada Lampiran. 1.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


9

2.4.2 Leibovitz (L-15) Media Leibovitz secara khusus dirancang untuk menumbuhkan sel dalam suasana bebas CO2. Sistem buffer sodium bikarbonat/CO2 diganti dengan kombinasi dari asam amino dasar, buffer fosfat dan kadar galaktosa yang tinggi dan sodium piruvat. Akibatnya, media tidak memerlukan suplementasi dengan sodium bikarbonat dan dapat digunakan dalam kondisi bebas bertukar gas. Media dapat digunakan untuk menumbuhkan sel-sel tumor manusia dan embrio sel dan juga bisa digunakan untuk kultur sel yang stabil seperti HeLa dan Hep-2. Media ini sering digunakan dalam diagnostik virologi di mana tissue cell lines atau strain ditumbuhkan dalam sistem tertutup (Himelab, 2011). Kultur sel dapat tumbuh pada inkubator CO2 asalkan tidak ada pertukaran udara antara media kultur dan inkubator (ATCC, 2012). Kandungan nutrisi yang ada di dalam Leibovitz-15 dapat dilihat pada Lampiran. 1. 2.4.3

Tissue Culture Medium (TCM) / Medium 199 Medium 199 adalah media pertama yang dikembangkan oleh Morgan,

Morton, dan Parker pada tahun 1950. Media kompleks ini diformulasikan khusus untuk penelitian nutrisi pada fibroblast primer embrio ayam tanpa adanya aditif. Terlihat bahwa ekplantasi jaringan bisa bertahan pada Medium 199 tanpa serum tapi untuk kultivasi sel dalam jangka panjang diperlukan suplementasi media dengan serum. Medium 199 diformulasikan baik dengan garam Hank atau garam Earle. Media yang disuplementasi dengan serum dapat digunakan untuk pertumbuhan berbagai sel. Medium 199 saat ini digunakan untuk pemeliharaan sel, vaksin dan produksi virus dan eksplan primer sel epitel (Himelab, 2011).

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


10

Kandungan nutrisi yang ada di dalam TCM/Medium 199 dapat dilihat pada Lampiran. 1. 2.5 Kultur Sel Udang Kultur

sel

krustasea

khususnya

udang

penaeid

pertama

kali

didokumentasikan oleh Quiot et al pada tahun 1968. Pada penelitiannya, para peneliti memperoleh sebagian besar fibroblas dari embrio dan ovari crayfih (Astacus pallipes). Kultur monolayer tersebut dapat menjaga aktivitas mitotik sel selama empat bulan dengan pergantian medium setiap lima hari sekali. Pada tahun yang sama Quiot et al juga melaporkan kelangsungan hidup dan replikasi kultur sel jantung dan perut dari kepiting laut Pachygrabsus marmoratus (Luedeman, 1990). Pada tahun 1986 Chen et al pertama kalinya melakukan kultur sel primer dari grass prawn (P. monodon). Jaringan yang dikultur adalah hati, gonad, perut, saraf, kulit dan hepatopankreas. Jaringan tersebut diambil dari udang muda dengan berat 20 gr. Selanjutnya pada tahun 1989, Chen and Kou melakukan penelitian tentang infeksi Monodon Baculovirus (MBV) pada kultur sel primer dari organ limfoid P. monodon. Spesies udang yang sering digunakan dalam kultur sel adalah P. monodon karena penyebarannya yang luas dan termasuk komoditas akuakultur yang memiliki nilai ekonomis tinggi. P. japonicus tercacat digunakan sebanyak delapan kali penelitian kultur sel, P. stylirostris enam kali dan P. vannamei lima kali. Jenis penaeid yang lain yang telah digunakan dalam kultur sel tercacat hanya satu atau dua kali saja. Hanya empat jenis spesies krustasea lain selain udang yang telah diteliti untuk kultur sel yakni kepiting pasir (Emireta asiatica), kepiting renang

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


11

(Liocarcinus depurator), North American lobster (Homarus americanus) dan crayfish (Orconectus limosus) (Claydon, 2009). Kultur sel udang dapat berfungsi untuk mengetahui efek patogen secara in vitro dan untuk menambah pengetahuan dalam pengembangan dan proses maturasi seksual atau regulasi endokrin pada krustasea (Toullec, 1999). Satu dari tujuan utama dalam pengembangan kultur sel udang adalah diagnosis penyakit. Oleh karena itu, cell line harus memiliki potensi yang mendukung pertumbuhan penyakit secara in vitro. Organ limfoid merupakan target untuk banyak agen infeksius, sehingga sel dari organ limfoid sesuai untuk mempelajari mekanisme patogen yang menginfeksi udang. Inilah alasan mengapa organ limfoid paling banyak digunakan dalam penelitian kultur sel udang (Claydon, 2009). Ovary tissue

juga banyak digunakan karena lokasinya yang mudah dan sangat

menjanjikan untuk pembentukan cell line karena selnya aktif membelah secara mitosis(Luedeman and Lightner, 1992). Jaringan lain yang telah digunakan dalam kultur

sel

krustasea

adalah

hepatopankreas,

hati,

embrio,

haemosit,

haematopoietik, insang, saraf, mata, epitel, testis dan usus (Claydon, 2009). 2.6 Media Kultur Sel Udang Banyak penelitian yang mencoba variasi formulasi media kultur (kombinasi dari media basal dan suplemen) untuk kemampuan mereka dalam mendukung replikasi atau pemeliharaan sel krustasea yang dikultur. Setidaknya ada 25 media yang telah digunakan dalam kultur sel udang (Claydon, 2009). Media yang sering digunakan dalam kultur sel udang adalah M199, L-15 dan MEM (Toullec, 1999).

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


12

Tercatat beberapa peneliti kultur sel udang menggunakan media M199 (Maeda et al. 2003; Crane and William, 2002; Lang et al. 2002; Shimizu et al. 2001; Itami et al. 1999; Hu, 1990 dan Brody and Chang, 1989), media L-15 (Chen and Kou, 1989; Fuerst et al. 1991; Najafabadi et al. 1992; Tapay et al. 1995; Lu et al. 1995; Kasornchandra et al. 1999; Mulford et al. 2001; dan Uma et al. 2002) dan media MEM (Neumann et al. 2000; Chen and Wang, 1999; Walton and Smith, 1999; Puroshothaman et al. 1998; Frerichs, 1996; Rosenthal and Diamant, 1990; dan Itami et al. 1989). Media lain yang pernah digunakan dalam kultur sel udang adalah Grace’s medium, RPMI-1640, CMRL-1066, McCoy’s 5A medium, DMEM dan Ham F-12 (Claydon, 2009). 2.7 Teknik Aseptik Metode aseptis pada kultur jaringan adalah upaya untuk memberikan batas antara mikroorganisme yang banyak terdapat dalam lingkungan bebas dan lingkungan kultur yang tidak terkontaminasi di dalam dish atau flask. Oleh karena itu semua alat dan bahan yang akan berkontak langsung dengan lingkungan kultur harus dalam kondisi steril (Boediono, 2002). Pengerjaan kultur sel dalam Laminar Air Flow (LAF) adalah upaya untuk memperkecil kemungkinan terjadinya kontaminasi selama penanganan sediaan kultur. LAF yang digunakan dalam penelitian adalah LAF dengan tipe horizontal, dimana aliran udara berasal dari arah depan mengalir paralel dengan permukaan area kerja. Pada tipe ini aliran udara lebih stabil dan merupakan tipe yang ideal untuk mencegah kontaminasi sediaan kultur jaringan (Boediono, 2002).

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


13

Kontaminasi merupakan permasalahan umum dan biasa ditemukan pada kultur sel. Kontaminan ini terbagi atas dua jenis yaitu kontaminasi kimia dan kontaminasi biologi. Kontaminasi kimia seperti yang disebabkan oleh serum, kemurnian media, air, endotoksin, bahan plastik dan deterjen. Kontaminasi biologi biasanya disebabkan oleh bakteri, jamur, ragi, virus, mycoplasma dan kontaminasi silang oleh sel lain (Gibco, 2011). Bakteri, ragi, jamur, lumut dan mycoplasma adalah jenis kontaminasi yang sering terjadi melalui peneliti pelaksana, udara, area kerja, media dan sumber lain yang memungkinkan kontak langsung dengan sistem kultur jaringan. Kontaminasi bisa terjadi secara minor dan terbatas pada satu atau dua dish, namun bisa juga menyebar pada sediaan yang lain bahkan bisa mengontaminasi seluruh pekerjaan kultur jaringan dalam satu laboratorium (Boediono, 2002). 2.8 Faktor Pendukung dalam Kultur Sel 2.8.1 Suhu Suhu optimal untuk kultur sel sangat tergantung pada suhu tubuh hewan dari mana sel-sel tersebut diisolasi, dan untuk tingkat yang lebih rendah pada variasi anatomi suhu (misalnya, suhu kulit mungkin lebih rendah dari suhu otot rangka). Overheating adalah masalah yang lebih serius daripada underheating untuk kultur sel, sehingga seringkali suhu di inkubator diatur sedikit lebih rendah dari suhu optimal (Gibco, 2011). Temperatur yang direkomendasikan untuk sebagian besar kultur sel mamalia adalah 370C, mendekati panas tubuhnya, tetapi untuk keamanan kultur suhu diatur sedikit lebih rendah (Freshney, 2005).

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


14

2.8.2 pH Stabilitas pH pada media sangat penting untuk pertumbuhan dan metabolisme sel. Sebagian besar kultur sel tumbuh dengan baik pada pH 7,4. Meskipun pH optimum untuk pertumbuhan sel relatif bervariasi antara strain sel yang berbeda. Beberapa sel fibroblas tumbuh baik pada pH 7,4-7,7, dan beberapa sel fibroblas yang lain tumbuh lebih baik pada pH 7,0-7,4 (Gibco, 2011). Sel-sel epidermis dapat tumbuh pada pH 5,5 tetapi tingkat ini belum diadopsi secara universal (Eisinger et al., 1979 dalam Freshney, 2005). Freshney (2005) menjelaskan bahwa phenol red umumnya digunakan sebagai indikator pH. Media yang berwarna merah menunjukkan bahwa media tersebut berada pada kisaran pH 7,4 dan warna orange pada pH 7,0, kuning pada pH 6,5, lemon kuning di bawah pH 6,5, lebih merah muda pada pH 7,6 dan ungu pada pH 7,8. 2.8.3

CO2 Sistem karbondiokasida-bikarbonat adalah sistem buffer yang biasa

terdapat dalam media. CO2 perlu ditambahkan pada ruangan di atas medium untuk mencegah keluarnya CO2 yang dapat meningkatkan ion hidroksida sehingga menyebabkan menurunnya pH media (Malole, 1990). CO2 yang biasa digunakan dalam penelitian adalah 4-10% dan yang paling sering digunakan adalah 5-7% CO2 (Gibco, 2011). 2.8.4

Metode Pemisahan Sel Kultur sel primer dapat diperoleh dari pemisahan jaringan menjadi sel.

Pemisahan jaringan menjadi sel ini dapat dilakukan secara mekanis ataupun

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


15

enzimatis. Pemisahan secara mekanis dapat menggunakan magnetic stirrer atau dengan diaspirasi menggunakan pipet atau syringe. Pemisahan secara enzimatis menggunakan enzim tripsin, pronase, kolagenase atau enzim campuran seperti kolagenase/dispase. Penggunaan enzim ini tidak aman untuk semua jaringan karena bila enzim berlebihan atau tidak cocok malah akan merusak jaringan (Toullec, 1999).

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


III KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS 3.1 Kerangka Konseptual Perkembangan produksi udang Indonesia setiap tahun selalu menunjukkan peningkatan, namun dalam proses budidayanya sering mengalami masalah. Masalah utama yang masih sulit dikendalikan pada budidaya udang vaname adalah munculnya penyakit. Penyakit yang menyerang udang pada umumnya menyerang sistem kekebalan tubuh dimana pada udang sistem kekebalan tubuh ini diperankan oleh organ limfoid (Kondo et al., 1994). Informasi tentang karakteristik penyakit yang diperlukan untuk pencegahan dan pengendalian pada udang belum banyak diketahui sehingga perlu adanya penyediaan biakan sel udang (Nuryati, 2000). Kultur sel limfoid udang merupakan cara yang bisa digunakan untuk mengetahui karakteristik penyakit karena organ limfoid merupakan target dari banyak agen infeksius, sehingga sel dari organ limfoid sesuai untuk mempelajari mekanisme patogen yang menginfeksi udang (Claydon, 2009). Faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap keberhasilan kultur sel diantaranya adalah CO2, pH, suhu dan media pertumbuhan. Dari faktor-faktor tersebut, media pertumbuhan merupakan faktor yang berpengaruh langsung terhadap pertumbuhan sel. Media kultur merupakan komponen terpenting pada kultur sel karena media menyediakan kebutuhan nutrisi, faktor pertumbuhan dan hormon bagi pertumbuhan sel, maupun regulasi pH dan tekanan osmotik pada kultur sel (Gibco, 2011). Media pertumbuhan kultur sel ini terdiri dari berbagai macam

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


17

media. Berdasarkan kandungan nutrisinya, media yang sering digunakan dalam kultur sel udang adalah M199, L-15 dan MEM (Toullec, 1999). Adanya perbedaan nutrisi asam amino dan buffer yang terkandung dalam setiap media akan menunjukkan media terbaik bagi pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname. Media terbaik yang digunakan, akan menyebabkan sel menjadi cepat tumbuh stabil dan konfluen. Kultur sel yang diperoleh diharapkan dapat digunakan sebagai media dalam penelitian penyakit yang biasa menyerang budidaya udang vaname di Indonesia. Adanya penelitian lanjutan akan diperoleh informasi mengenai karakteristik penyakit. Informasi tersebut nantinya bisa dijadikan referensi untuk pengembangan pengendalian penyakit udang sehingga pada akhirnya masalah penyakit pada budidaya udang vaname dapat teratasi. Skema konseptual dapat dilihat pada Gambar. 3.1. 3.2 Hipotesis 1. Terdapat perbedaan pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname (L. vannamei) pada media yang berbeda. 2. Terdapat media terbaik bagi pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname (L. vannamei).

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


18

Udang vaname

Sel limfoid

Penyakit

Kultur sel Lingkungan

CO2

pH

Media kultur sel

MEM

Leibovitz L-15

Suhu

TCM

Asam amino dan buffer yang sesuai dengan kebutuhan sel limfoid

Kultur sel limfoid tumbuh cepat Konfluen Stabil Gambar. 3.1. Skema Kerangka Konseptual Keterangan: : Aspek yang diteliti : Aspek yang tidak diteliti

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


IV METODOLOGI PENELITIAN 4.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium In Vitro, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga pada bulan Februari 2014. 4.2 Materi Penelitian 4.2.1

Bahan Penelitian Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah udang vaname berumur

2 bulan dengan panjang tubuh ± 8 cm, media MEM, media L-15, media TCM, penicilin-streptomycin, amphoterycin B, Fetal Calf Serum (FCS), NaHCO3, aquabidest, tripsin, phenol red, trypanblue dan larutan fiksatif. 4.2.2

Alat Penelitian Peralatan penelitian yang digunakan adalah Petri dish, substrat, botol 250

ml, pinset, gunting, gelas ukur, centrifuge, mikroskop inverted, pipet Pasteur, syringe injeksi, mikrofilter, timbangan, tally counter, penggaris, Laminar Air Flow (LAF), inkubator CO2, autoclave dan lemari es. 4.3 Metode Penelitian 4.3.1

Rancangan Penelitian Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap

(RAL) dengan asumsi media dan bahan percobaan sama dari pengambilan sampel sampai dengan pengerjaan serta kondisi laboratorium. Perlakuan yang digunakan sebanyak 3 perlakuan dengan 3 kali ulangan.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


20

Perlakuan A

: menggunakan media kultur MEM

Perlakuan B

: mengunakan media kultur L-15

Perlakuan C

: menggunakan media kultur TCM

Variabel penelitian ini adalah: Variabel bebas

: media kultur MEM, L-15 dan TCM

Variabel tergantung

: jumlah sel limfoid udang vaname dan viabilitas

Variabel kendali

: inkubator anaerob, alat dan bahan yang digunakan penelitian.

4.4 Prosedur Kerja 4.4.1

Persiapan Peralatan Alat-alat yang akan digunakan disterilkan terlebih dahulu untuk mencegah

adanya kontaminasi. Sterilisasi peralatan yang tahan terhadap panas seperti pipet, Petri dish, botol, gunting, pinset dan gelas ukur dapat dilakukan dengan metode panas basah yaitu memanaskan alat ke dalam autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit. Sterilisasi untuk media kultur dilakukan secara mekanik yaitu dengan metode filtrasi. Penyaringan dilakukan dengan menggunakan mikrofilter dengan bantuan syringe injeksi. Sterilisasi area kerja dilakukan dengan menyemprot meja menggunakan alkohol 70%, kemudian dilap. Selama proses pengerjaan, teknik aseptis harus selalu diterapkan yakni dengan mencuci tangan dengan sabun kemudian menyemprot alkohol 70% ke tangan sebelum dan sesudah melakukan kegiatan.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


21

4.4.2 Pembuatan Media Kultur Sel Media merupakan salah satu hal terpenting dalam pertumbuhan kultur sel. Media yang digunakan dalam penelitian kultur sel limfoid udang vaname adalah MEM, L-15 dan TCM. Masing-masing media tersebut mempunyai kandungan asam amino, vitamin dan garam mineral yang berbeda-beda. Cara membuat media kultur sel yakni dengan mencampurkan media dalam 100 ml aquabidest, 0,1 µl penicillin - streptomycin, 0,1 µl amphoterycin B, 0,2 gr NaHCO3 dan 3 ml FCS. Semua bahan tersebut dimasukkan ke dalam botol 250 ml kemudian dikocok hingga seluruh bahan tercampur. Setelah media tercampur selanjutnya disterilkan dengan mikrofilter ukuran 0,22 µm. 4.4.3

Pengambilan Organ Limfoid Udang vaname yang akan diambil organ limfoidnya disemprot dengan

alkohol 70% merata ke seluruh tubuh udang. Pisau maupun gunting yang digunakan untuk membedah udang juga disemprot dengan alkohol 70%. Pengambilan organ dilakukan dengan cara membuka bagian ventral udang menggunakan gunting secara hati-hati sampai organ dalam udang terlihat. Organ limfoid kemudian digunting dan dipisahkan dari organ lainnya. Pengambilan organ limfoid harus dilakukan secepat mungkin untuk menghindari lamanya kontak dengan udara bebas. Organ limfoid yang terambil diletakkan pada cawan Petri steril dan diberi media sebanyak 0,5 ml. Organ dipotong kecil-kecil selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge yang telah terisi 2 ml media dan disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Supernatan yang didapat dibuang dan endapan

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


22

yang terbentuk ditambah dengan media 2 ml kemudian disentrifuge untuk kedua kalinya. 4.4.4 Kultur Sel Organ limfoid yang mengendap di dalam tabung sentrifuge ditambah dengan 1 ml media kemudian dimasukkan ke dalam substrat dan ditambah media sebanyak 2 ml. Substrat yang digunakan diberi label sesuai dengan nama masingmasing media (MEM, L-15 dan TCM). Substrat yang telah terisi diinkubasi dalam inkubator pada suhu 28°C dengan kadar CO2 5%. 4.4.5

Pengamatan Pengamatan terhadap kultur sel limfoid udang vaname dilakukan setiap

tiga hari sekali menggunakan mikroskop inverted dengan perbesaran 400 kali. Penghitungan sel dilakukan setiap enam hari sekali dengan menggunakan haemocytometer. Pengamatan dan penghitungan sel dilakukan dalam LAF untuk mengurangi risiko kontaminasi. Sel yang teramati di foto dan hasil penghitungan yang didapat kemudian dibuat data. Menurut Phelan (1998), jumlah sel yang tumbuh dapat dihitung dengan menggunakan rumus: Sel/ml = jumlah sel x pengencer x 104 Penghitungan viabilitas sel dilakukan pada hari terakhir kultur. Viabilitas sel dapat diketahui dengan cara menambahkan trypan blue sebanyak ± 0,5 ml ke dalam substrat. Sel yang hidup bewarna bening dan yang mati bewarna biru. Hal tersebut dikarenakan sel yang hidup tidak bisa menyerap trypan blue (Ott, 2004). Viabilitas sel dihitung dengan menggunakan rumus (Butler, 2004).

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


23

% sel yang hidup =

4.4.6

Jumlah sel yang hidup Jumlah sel yang hidup + jumlah sel yang mati

x 100 %

Parameter Penelitian Pada penelitian ini parameter utama yang diamati adalah pertumbuhan sel

pada media kultur (sel mampu memperbanyak diri) serta viabilitas yang tinggi. Parameter penunjang adalah ada tidaknya kontaminasi pada kultur sel. Bagan alir pelaksanaan penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.1. Persiapan alat dan bahan Pembuatan media kultur sel (MEM, L-15 dan TCM) Pengambilan organ limfoid Kultur sel organ limfoid MEM A1

A2

Leibovitz L-15 A3

B1

B2

TCM B3

C1

C2

C3

Perhitungan jumlah sel setiap enam hari sekali Perhitungan viabilitas sel pada hari terakhir kultur Analisis data Gambar 4.1. Diagram Alir Penelitian

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


24

4.4.7

Analisis Data Data hasil penelitian disajikan dalam bentuk tabel dan gambar serta

dianalisis menggunakan ANAVA. Apabila hasil yang didapat menunjukkan adanya perbedaan maka dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan untuk mengetahui perbedaan antara perlakuan yang satu dengan perlakuan yang lainnya (Kusriningrum, 2012).

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


V HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Hasil 5.1.1

Pertumbuhan Kultur Sel Limfoid Pertumbuhan sel limfoid

udang vaname diamati di bawah mikroskop

inverted dengan perbesaran 400 X setiap tiga hari sekali. Hal ini bertujuan agar sel dapat tumbuh baik dan menempel pada dasar plate. Hasil penelitian kultur sel limfoid udang vaname pada media MEM, L-15 dan TCM menunjukkan pertumbuhan yang berbeda pada setiap media. Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan, sel limfoid yang tumbuh berbentuk bulat kecil dan tersebar di seluruh bagian plate. Pada semua media yang diujikan, kultur sel limfoid udang vaname tumbuh di sekitar eksplan. Hal ini menunjukkan bahwa ketiga media mampu menyediakan nutrisi yang dibutuhkan sel limfoid untuk berproliferasi. Hasil pengamatan pertumbuhan sel limfoid udang vaname pada hari ketiga dapat dilihat pada Gambar. 5.1.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


26

(a)

(b)

(c) Gambar 5.1. Pertumbuhan Sel Limfoid pada Hari Ketiga Kultur Keterangan : bagian yang ditunjuk anak panah adalah sel limfoid yang tumbuh pada (a) Media MEM, (b) Media L-15, (c) Media TCM Pada pengamatan selanjutnya yakni hari keenam dari penanaman sel, kultur dalam media MEM, L-15 maupun TCM menunjukkan sel limfoid tumbuh lebih padat dibandingkan saat pengamatan hari ketiga. Sel limfoid terlihat lebih rapat dan jarak antar sel yang tumbuh menjadi semakin sempit. Beberapa sel yang lain juga terlihat bertumpukan sehingga ketika diamati, sel menjadi tidak jelas akibat tumpukan antar sel. Sel yang tumbuh padat (konfluen) kemudian dihitung jumlah selnya dan selanjutnya dilakukan subkultur. Pengamatan mikroskopik

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


27

pertumbuhan sel limfoid udang vaname pada hari keenam dapat dilihat pada Gambar 5.2.

(a)

(b)

(c) Gambar 5.2. Pertumbuhan Sel Limfoid pada Hari Keenam Kultur (a) Media MEM, (b) Media L-15, (c) Media TCM Pada penelitian ini dilakukan subkultur sebanyak 3 kali setiap enam hari sekali. Subkultur dilakukan untuk mempertahankan pertumbuhan sel dalam kultur. Pada hari keenam kultur terlihat perubahan warna dari yang mulanya berwarna merah menjadi oranye. Hal ini menunjukkan bahwa pH media menurun dan kemungkinan nutrisi yang tedapat dalam media telah berkurang. Media juga terlihat lebih keruh dibandingkan hari-hari sebelumnya menandakan bahwa sel

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


28

telah tumbuh padat sehingga apabila tidak dilakukan penggantian media atau subkultur maka sel akan mati. Pertumbuhan kultur sel secara in vitro dapat diketahui dengan cara menghitung jumlah sel dibawah mikroskop pada interval waktu tertentu. Penghitungan sel dilakukan dengan menggunakan haemocytometer dan hasil yang didapat dimasukkan ke dalam rumus penghitungan. Penghitungan jumlah sel yang tumbuh dilakukan ketika sel telah mencapai kondisi konfluen. Pada penelitian ini, penghitungan dilakukan setiap enam hari sekali sebelum melakukan subkultur. Hasil penghitungan jumlah sel limfoid pada ketiga media dapat dilihat pada Tabel. 5.1. sedangkan data jumlah kepadatannya dapat dilihat pada Lampiran 3. Tabel 5.1. Rata-Rata Penghitungan Jumlah Sel Limfoid pada Media Berbeda Media

Kultur Hari ke-6

MEM ± SD ( x 106 sel/ml) 8,333 ± 1,155 c

L-15 ± SD (x 106 sel/ml) 19,667 ± 1,528 a

TCM ± SD (x 106 sel/ml) 15 ± 1,000 b

Hari ke-12

14,667 ± 1,528 c

29,667 ± 1,155 a

20,667 ± 1,155 b

Hari ke-18

22,333 ± 1,155 c

39 ± 1,000 a

28,667 ± 1,528 b

Keterangan: perbedaan notasi pada kolom yang berbeda menunjukkan bahwa setiap perlakuan memberikan pengaruh yang berbeda signifikan (p<0,05) Grafik pertumbuhan sel limfoid udang vaname pada media MEM, L-15 dan TCM disajikan pada Gambar 5.3.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


29

Kepadatan sel limfoid (x 106 sel/ml)

45 40 35 30 25

MEM

20

L-15

15

TCM

10 5 0

Hari ke-6

hari ke-12 Waktu kultur

hari ke-18

Gambar 5.3. Grafik Pertumbuhan Sel Limfoid Udang Vaname Hasil Analisis of Varian (ANOVA) jumlah sel limfoid udang vaname yang dikultur pada media MEM, L-15 dan TCM hingga hari ke-18 kultur menunjukkan bahwa perlakuan media memberikan pengaruh yang berbeda nyata (p<0,05) terhadap jumlah sel limfoid udang vaname. Hasil analisis data dapat dilihat pada Lampiran 4. Uji statistika dilanjutkan dengan menggunakan Uji Jarak Berganda Duncan. Hasil Uji Jarak Berganda Duncan pada hari ke-6, ke-12 dan ke-18 kultur disimpulkan bahwa perlakuan B (media L-15) memberikan hasil kultur sel limfoid udang vaname tertinggi yang berbeda nyata dengan perlakuan C (media TCM) dan perlakuan A (media MEM). Sedangkan hasil kultur sel limfoid udang vaname terendah diperoleh pada perlakuan A. Antara perlakuan A dan perlakuan C juga berbeda nyata.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


30

5.1.2 Viabilitas Sel Limfoid Udang Vaname Viabilitas sel limfoid udang vaname dihitung pada hari terakhir pemeliharaan sel yakni pada hari ke-18. Viabilitas menggambarkan kemampuan daya hidup dari sel yang dikultur. Penentuan viabilitas sel menggunakan pewarnaan dengan trypan blue dan penghitungannya dilakukan dengan bantuan handlycounter. Semua sel yang terlihat dalam satu lapang pandang dihitung baik sel yang berwarna bening maupun sel yang berwarna biru. Sel yang bening menunjukkan bahwa sel masih bertahan hidup sedangkan sel yang berwarna biru menunjukkan bahwa sel tersebut telah mati. Hasil penghitungan sel yang hidup dan mati kemudian dimasukkan dalam rumus viabilitas. Hasil prosentase viabilitas sel pada ketiga media disajikan dalam Tabel. 5.2. Tabel. 5.2 Viabilitas Sel Limfoid pada Media Berbeda Perlakuan Ulangan MEM (%) L-15 (%)

TCM (%)

1

98

97

97

2

97

98

98

3

98

99

97

Rata-rata ± SD

97,667 ± 0,577a

98 ± 1,000a

97,333 ± 0,577a

Keterangan: notasi yang sama pada kolom yang berbeda menunjukkan bahwa setiap perlakuan tidak memberikan pengaruh yang signifikan (p>0,05) Hasil Analisis of Varian (ANOVA) viabilitas sel limfoid udang vaname yang dikultur pada media MEM, L-15 dan TCM menunjukkan bahwa perlakuan media tidak memberikan pengaruh yang nyata (p>0,05) terhadap viabilitas sel limfoid udang vaname. Hasil analisis data dapat dilihat pada Lampiran 5. Grafik

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


31

viabilitas sel limfoid udang vaname pada media MEM, L-15 dan TCM disajikan pada Gambar 5.4.

98,2 98 97,8 97,6 Rata-rata (%)

97,4 97,2 97 96,8

MEM

L-15

TCM

Gambar 5.4. Grafik Viabilitas Sel Limfoid Udang Vaname Pada penelitian ini, berdasarkan hasil penghitungan viabilitas sel limfoid pada media MEM, L-15 dan TCM menunjukkan hasil yang baik karena nilai viabilitas pada ketiga media lebih dari 95 %. Hal ini ditunjukkan dengan warna sel berwarna bening yang lebih dominan setelah diberi trypan blue (Gambar. 5.5).

Keterangan:

Tugas Akhir

Gambar. 5.5. Viabilitas Sel Limfoid : sel yang hidup : sel yang mati


INDRA TRI PRAYUGI


32

5.2 Pembahasan Kultur sel merupakan istilah yang digunakan dalam pemeliharaan atau pengembangan sel secara in vitro mencakup kultur sel tunggal. Pada kultur sel, sel yang tumbuh tidak panjang seperti sel pada jaringan (ATCC, 2012). Sel yang ditumbuhkan di dalam media kultur (in vitro) akan kehilangan sifat interaksi sel yang spesifik serta menjadi mobile ketika sel menyebar dan mulai berproliferasi sehingga populasi sel meningkat (Djuwita, 2002). Media merupakan faktor terpenting bagi pertumbuhan dan perkembangan kultur sel. Pada penelitian ini, media yang digunakan ada tiga macam yakni media MEM, media L-15 dan media TCM. Metode aseptis harus selalu diterapkan dalam proses pembuatan kultur sel, mengingat rawannya terjadi kontaminasi. Pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname menunjukkan hasil yang berbeda pada masing-masing media. Sel limfoid yang dikultur ini bisa tumbuh setelah 24 jam inokulasi (Itami et al., 1999) dan mencapai monolayer pada hari ke-7 hingga hari ke-8 (Lu et al., 1995). Proses pembelahan sel limfoid terbagi dalam 12 tahap. Setelah pembelahan sel, sel turunan mereka berbentuk seperti sel fibroblas atau epiteloid (Lang et al., 2002). Sel limfoid yang dikultur dapat bertahan hingga 54 hari. Sel tidak bisa bertahan lama setelah diberi tripsin atau kolagen yang digunakan saat pemisahan sel (Itami et al., 1999). Sel limfoid udang vaname bisa tumbuh dengan baik kemungkinan karena dipengaruhi oleh beberapa faktor misalnya suhu, CO2 dan nutrisi yang terkandung dalam media. Pada penelitian kultur sel limfoid udang vaname, suhu yang digunakan sebesar 280C. Menurut Hsu et al. (1995) dan Luedeman (1990),

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


33

pada suhu 280C kultur sel limfoid udang dapat tumbuh dengan baik. Pernyataan ini didukung oleh Itami et al. (1999) yang menyatakan bahwa kultur sel limfoid udang tumbuh baik pada suhu 250C - 300C dan akan tumbuh optimum pada suhu 300C. Pada penelitian ini kadar CO2 yang digunakan sebesar 5%. Malole (1990) menyebutkan penggunaan kadar CO2 sebesar 5% dapat digunakan sebagai pengatur keseimbangan pH dalam media. Umur udang juga bisa berpengaruh terhadap pertumbuhan kultur sel limfoid udang. Semakin dewasa udang maka kemampuan regenerasi selnya semakin melambat sehingga saat dikultur pertumbuhan selnya butuh waktu yang agak lama. Kultur sel yang berasal dari jaringan muda akan mengandung lebih banyak sel-sel prekursor dan memiliki kemampuan proliferasi serta daya tahan yang lebih tinggi dibandingkan sel yang berasal dari jaringan dewasa (Djuwita, 2002). Lu et al., (1995) menyatakan ukuran udang optimal yang digunakan untuk preparasi kultur primer sel Oka adalah 20 – 30 gram. Penggunaan udang yang berukuran kurang dari 10 gram akan menyulitkan saat pengambilan organ limfoid. Udang yang telah dewasa dan beratnya lebih dari 30 gram umumnya tidak direkomendasikan karena sel dari organ-organnya terlihat lebih lambat saat berproliferasi dan lebih cepat berdegenerasi walaupun terlihat organnya lebih besar. Pertumbuhan sel pada ketiga media yang diujikan menunjukkan hasil yang baik karena viabilitas sel limfoid lebih dari 95%. Gibco (2011) menyatakan bahwa media yang baik adalah yang dapat mempertahankan kelangsungan hidup sel yang dikultur dengan nilai viabilitas minimal 95%. Penelitian ini dianggap berhasil

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


34

karena jumlah sel limfoid yang tumbuh pada ketiga media melebihi 104 sel/ml. Menurut Phelan (1998) kultur sel yang tumbuh sebesar 104 sel/ml termasuk dalam kategori rendah dan kultur sel dalam kategori tinggi ataupun bisa juga dikatakan berhasil yakni bila sel yang dikultur tumbuh minimal 105 sel/ml. Pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname yang tertinggi adalah pada media L-15 dengan rata-rata jumlah sel sebesar 19,667 x 106 sel/ml pada hari ke-6 dan menjadi 39 x 106 sel/ml pada hari ke-18 dengan viabilitas mencapai 98%. Data statistik menunjukkan bahwa pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname pada media L-15 berbeda signifikan dengan pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname pada kedua media lainnya (p < 0,05). Crane and Williams (1997) menyatakan bahwa dari tiga media komersial yakni MEM, L-15 dan TCM yang digunakan dalam kultur sel udang, L-15 merupakan media terbaik daripada kedua media lainnya. Pendapat ini didukung oleh Toullec (1999) yang menyatakan media L-15 dan TCM bila digunakan dalam kultur sel menunjukkan hasil yang berbeda jauh. TCM dan L-15 secara konsisten berhasil menghasilkan kultur primer dari berbagai jaringan krustasea. Kedua media ini memiliki komposisi dan konsentrasi komponen yang berbeda secara signifikan (Lang et al., 2002). Baik TCM dan L-15 biasanya digunakan sebagai media kultur sel ikan, tetapi L-15 lebih sering digunakan (Lee et al., 1993 dalam Claydon, 2009) dan dilaporkan lebih berhasil daripada TCM dalam memulai kultur sel primer ikan (Schreera et al ., 2005 dalam Claydon, 2009). Keberhasilan L-15 ini mungkin dikarenakan media ini memiliki kapasitas buffer yang lebih besar daripada kedua media lainnya, sehingga memungkinkan

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


35

sel-sel untuk memanfaatkan asam amino bebas dan menggantikan glukosa dengan galaktosa dan piruvat. Piruvat pada media ini memungkinkan sel untuk meningkatkan produksi CO2 endogeneous sehingga tidak bergantung pada CO2 dan HCO3 eksogeneous (Griffiths, 1986). Walaupun TCM mengandung lebih banyak jenis vitamin dan asam amino, namun vitamin dan asam amino yang terdapat pada L-15 mempunyai konsentrasi yang lebih tinggi (Claydon, 2009). Konsentrasi asam amino dan vitamin yang lebih tinggi mengakibatkan kemampuan proliferasi sel limfoid udang vaname pada media L-15 lebih optimal daripada media MEM maupun TCM.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


VI KESIMPULAN DAN SARAN 6.1

Kesimpulan 1. Kultur sel limfoid udang vaname bisa tumbuh pada ketiga media yang diujikan (media MEM, media L-15 dan media TCM) dengan jumlah yang berbeda. 2. Media L-15 merupakan media terbaik bagi kultur sel limfoid udang vaname.

6.2

Saran Media L-15 merupakan media terbaik bagi kultur sel limfoid udang

vaname. Untuk itu dalam pembuatan kultur sel limfoid udang vaname sebaiknya menggunakan media L-15 sehingga akan didapatkan hasil pertumbuhan sel limfoid yang optimal.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


DAFTAR PUSTAKA Alifuddin, M. 2002. Imunostimulasi pada Hewan Akuatik. Jurnal Akuakultur Indonesia, 1(2): 87-92. American Type Culture Collection (ATCC). 2012. Animal Cell Culture Guide. Tips and Techniques for Continuous Cell Line. University Blvd. Manassas, VA 20110. Boediono, A. 2002. Teknik Aseptis dan Upaya Mencegah Kontaminasi pada Kultur Jaringan. Modul VII. Pemanfaatan Teknik Jaringan dan Histokimia dalm Penelitian dan Terapan Bidang Biologi dan Biomedis. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Departemen Pendidikan Nasional. 12 hal. Butler, M. 2004. Animal Cell Culture and Technology. Second Edition. BIOS Scientific Publisher. New York: 1-78. Chen, S.N., S.C. Chi, G .H. Kou, and I.C. Liao. 1986. Cell Culture from Tissues of Grass Prawn, Penaeus monodon. Fish Pathol. 21: 161-166. Chen, S.N., and G.H. Kou. 1989. Infection of Cultured Cells from the Lymphoid Organ of Penaeus monodon Fabricius by Monodon-type Baculovirus (MBV). J. Fish Diseases 12: 73-76. Claydon, K. 2009. Adavances in Crustacean Cell Culture. PhD Thesis. School of Veterinary and Biomedical Sciences. James Cook University. Corteel, M. 2013. White Spot Syndrome Virus Infection in P. vannamei and M. rosenbergii: Experimental Studies on Susceptibility to Infection and Disease. Dissertation, Ghent University, Belgium: 7-34. Crane, M. S. and L. M. Williams. 1997. Development of Continuous Prawn Cell Lines for Virus Isolation and Cultivation. Fisheries Research & Development Corporation. Australia. 39 p. Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya. 2013. Udang Vaname Nusantara 1, Mendukung Program Revitalisasi Tambak. Kementerian Kelautan dan Perikanan. http://www.djpb.kkp.go.id/berita.php?id=899. diakses 6 September 2013. Djuwita, I. 2002. Biologi Kultur Jaringan. Modul II. Pemanfaatan Teknik Jaringan dan Histokimia dalm Penelitian dan Terapan Bidang Biologi dan Biomedis. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Departemen Pendidikan Nasional. 17 hal.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


38

Freshney, R. I. 1992. Introduction to Basic Principles. Animal Cell Culture A Practical Approach Second Edition. Oxford University Press. New York. pp.1-14. Freshney, R. I. 2005. Culture of Animal Cell. A Manual of Basic Technique Fifth Edition. John Wiley & Sons, Inc. pp. 115-128. Giang, N. T. T. 2012. Pathogenesis of Gill Associated Virus Disease on Pacific White Shrimp (P. vannamei). Master’s Dissertation. Faculty of Bioscience Engineering. Universiteit Gent. Belgium. pp. 4-24. Gibco. 2011. Cell Culture Basics. 56 p. www.invitogen.com. Griffiths, J. 1986. Scaling-up of Animal Cell Cultures. In: R. I Freshney (Ed). Animal Cell Culture. IRL Press, Washington DC. pp. 36-69. Harijanto. 2012. Kemampuan Proteksi Protein Membran Imunogenik Zoothamnium penaei terhadap Zoothamniosis pada Udang Vannamei. Thesis. Fakultas Perikanan dan Kelautan. Universitas Airlangga. Surabaya. hal. 1-4 Hariyanto, T. dan Maskur. 2013. Kerjasama Pencegahan Penyakit Udang untuk Mendukung Pencapaian Peningkatan Produksi. Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya. Kementerian Kelautan dan Perikanan. http://www.kkp.go.id/index.php/arsip/c/9116/. diakses 6 September 2013. HiMedia Laboratories. 2011. HiMedia Cell Culture Enabling Breakthroughs. Product Information. HiMedia Laboratories Pvt. Ltd. A-516. Mumbai. India. Hsu, Y., Y. H. Yang, Y. C. Chen, M. C. Tung, J. L. Wu, M. H. Engelking and J. C. Leong. 1995. Development of an In Vitro Subculture System for the Oka Organ (Lymphoid Tissue) of Penaeus monodon. Aquaculture 136: 4355. Itami, T., M. Maeda, M. Kondo and Y. Takahashi. 1999. Primary Culture of Lymphoid Organ Cells and Haemocytes of Kuruma Shrimp (Penaeus japonicus). Methods in Cell Science 21: 237-244. Kondo, M., T. Itami, Y. Takahashi, R. Fujii and S. Tomonaga. 1994. Structure and Function of the Lymphoid Organ in the Kuruma Prawn. Dev Comp Immunol 18(Suppl 1): S109 Kusriningrum. 2012. Buku Ajar Perancangan Percobaan. Cetakan Keempat. Dani Abadi. Surabaya. hal. 31-51. Lang, G. H., N. Nomura, B. Z. Wang and M. Matsumura. 2002. Penaeid (Penaeus japonicus) Lymphoid Cells Replicate by Cell Division In Vitro. In Vitro Cell. Dev. Biol. Animal 38: 142-145.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


39

Lu, Y., L. M. Tapay, P. C. Loh, J. A. Brock and R. Gose. 1995. Development of a Quantal Assay in Primary Shrimp Cell Culture for Yellow Head Baculovirus (YBV) of Penaeid Shrimp. J. Vir. Methods 52: 231-236. Luedeman, R. A. 1990. Development of an In Vitro Primary Cell Culture System from the Penaeid Shrimp Penaeus stylirostris and Penaeus vannamei and Evaluation of Potential Application. Thesis. Faculty of the Department of Nutrition and Food Science. The University of Arizona. p 1-27. Luedeman, R. A. and D. V. Lightner. 1992. Development of an In Vitro Primary Cell Culture System from the Penaeid Shrimp Penaeus stylirostris and Penaeus vannamei. Aquaculture 101: 205-211. Malole, M. B. 1990. Kultur Sel dan Jaringan Hewan. Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Maurer, H. R. 1992. Toward Serum-Free, Chemically Defined Media for Mammalian Cell Culture. In: R. I Freshney (Ed). Animal Cell Culture A Practical Approach Second Edition. Oxford University Press. New York. pp.15-46. Nuryati, S. 2000. Penyediaan Biakan Sel Organ Limfoid (Oka) Udang Windu Penaeus monodon Secara In Vitro Sebagai Media Tumbuh bagi Virus. Tesis. Ilmu Perairan. Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Oka, M. 1969. Studies on the Penaeus orientalis Kishinouye-VIII Structure of the Newly Found Lymphoid Organ. Nagasaki University’s Academic Output SITE. Bull Jpn Soc Sci Fish 35: 245-250. Ott, T. 2004. Tissue Culture of Fish Cell Line. Laboratory Procedure Manual. Second Edition. Chapter 10. Lacrosse Fish Health Center. Phelan, M. C. 1998. Basic Techniques for Mammalian Cell Tissue Culture. Current Protocols in Cell Biology 1.1.1-1.1.10. John Wiley & Sons, Inc. Pusat Penyuluhan Kelautan dan Perikanan. 2011. Budidaya Udang Vaname (Litopenaeus vannamei). Kementerian Kelautan dan Perikanan. Jakarta. hal. 3-13. Smith, S. F., M. Briggs and W. Miao. 2012. Asia Pacific Fishery Commission. Regional Overview of Fisheries and Aquaculture in Asia and the Pacific 2012. Food and Agriculture Organization of the United Nations Regional Office for Asia and the Pacific. Bangkok. pp. 90-93. Toullec, J. Y. 1999. Crustacean Primary Cell Culture. A Technical Approach. Methods in Cell Science, 21: 193-198. Wyban, J.A and J. Sweeney. 1991. Intensif Shrimp Production Technology. Honolulu Hawaii, USA. pp.7-12.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


Lampiran 1. Komposisi Media MEM, TCM dan L-15 Komponen Asam Amino L-alanine L-arginine L-asparagine L-aspartic acid L-cysteine L-cystine L-glutamic acid L-glutamine Glycine L-histidine L-hidroxy-proline L-isoleucine L-leucine L-lysine HCl L-methionine L-phenylalanine L-proline L-serine L-threonine L-tryptophan L-tyrosine L-valine Vitamin p-Aminobenzoic acid L-Ascorbic acid Biotin Calciferol Choline chloride Folic acid myo-Inositol Menadione Nicotinamide Nicotinic acid D-Ca pantothenate Pyridoxal HCl Pyridoxine HCl Riboflavin Thiamin α-Tocopherol Retinol acetate

Tugas Akhir

MEM 6.0E-04

1.0E-04 2.0E-03 2.0E-04 4.0E-04 4.0E-04 4.0E-04 1.0E-04 2.0E-04 4.0E-04 4.9E-05 2.0E-04 4.0E-04

7.1E-06 2.3E-06 1.1E-05 8.2E-06 4.2E-06 4.9E-06 2.7E-07 3.0E-06

Media TCM/M199 2.8E-04 3.3E-04 3.0E-04 2.3E-04 5.6E-07 9.9E-05 4.5E-04 6.8E-04 6.7E-04 1.0E-04 7.6E-05 1.5E-04 4.6E-04 3.8E-04 1.0E-04 1.5E-04 3.5E-04 2.4E-04 2.5E-04 4.9E-05 2.2E-04 2.1E-04 3.6E-07 2.8E-07 4.1E-08 2.5E-07 3.6E-06 2.3E-08 2.8E-07 6.9E-08 2.0E-07 2.0E-07 4.2E-08 1.2E-07 1.2E-07 2.7E-08 3.0E-08 2.3E-08 3.5E-07


L-15 2.5E-03 2.9E-03 7.6E-05 9.9E-04 2.1E-03 2.7E-03 1.6E-03 9.5E-04 9.5E-04 5.1E-04 5.0E-04 7.6E-04 1.9E-03 2.5E-03 9.8E-05 1.7E-03 8.5E-4

7.1E-06 2.3E-06 1.1E-05 8.2E-06 4.2E-06 1.9E-07 2.4E-06

INDRA TRI PRAYUGI


41

Glutathione Garam Anorganik CaCl2 KCl KH2PO4 MgSO4 NaCl NaHCO3 Na2HPO4 Bases, nukleosida, dll. Adenine SO4 AMP ATP 2-Deoxyribose Guanine Hypoxanthine D-Ribose Thymine Uracil Xanthine Energi metabolisme D-galactose D-glucose Sodium acetate Sodium pyruvate Lemak dan prekursor Cholesterol Tween 80 Komponen lain Phenol red Gas CO2

1.5E-07 1.8E-03 5.3E-03 8.1E-04 1.2E-01 2.6E-02

1.3E-03 5.3E-03 4.4E-04 8.1E-04 1.4E-01 4.0E-04

1.3E-03 5.3E-03 4.4E-04 1.6E-03 1.4E-01 2.6E-02 1.6E-03

5.4E-05 5.8E-07 1.8E-05 3.7E-06 1.6E-06 2.2E-06 3.3E-06 2.4E-06 2.7E-06 2.0E-06 5.6E-03

5.6E-03 4.5E-04

5.0E-02 5.0E-03

5.2E-07 1.8E-05 2.7E-05

4.5E-05

2.7E-05

5%

5%

Udara

Semua konsetrasi dalam bentuk molar, dan penulisan angka menggunakan notasi komputer (e.g., 3.0E-2 = 3.0 × 10−2 = 30 mM). Singkatan dan sinonim: AMP, adenosine monophosphate; ATP, adenosine triphosphate; biotin = vitamin H; calciferol = vitamin D2; FAD, flavine adenine dinucleotide; lipoic acid = thioctic acid; menadione = vitamin K3; myo-inositol; = L-inostitol; nicotinamide = niacinamide; nicotinic acid = niacin; pyridoxine HCl = vitamin B6; thiamin = vitamin B1; α-tocopherol = vitamin E; retinol = vitamin A1; TPN, triphosphopyridine nucleotide; UTP, uridine triphosphate; vitamin B12 = cobalamin (Freshney, 2005).

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


42

Lampiran 2. Peralatan dan Bahan Penelitian

Laminar Air Flow

Inkubator CO2

Sentrifugerator

Oven

Freezer

Timbangan digital

Pipet Pasteur dan Mikropipet Haemocytometer dan Hand counter

Peralatan bedah

Tugas Akhir

Media MEM cair

Media L-15 bubuk


INDRA TRI PRAYUGI


43

Media L-15 cair

Media TCM/M199 bubuk

Media TCM/M199 cair

Aquabidest

Larutan Fiksatif

Phenol red

FCS dan NaHCO3

Trypan blue

Udang vaname umur 2 bulan

Tugas Akhir

substrat (96-well plates)

Amphotericin B dan Penicilin-Streptomycin


INDRA TRI PRAYUGI


44

Lampiran 3. Pertumbuhan Kultur Sel Limfoid pada Media Berbeda

Media MEM

1

Jumlah sel yang tumbuh (x 106 sel/ml) 7

Rata-rata (x 106 sel/ml)

2

9

8,333

3.

3

9

4.

1

15

2

13

6.

3

16

7.

1

23

2

21

3

23

Ulangan 1


Rata-Rata (x 106 sel/ml)

2

21

19,667

3.

3

20

4.

1

29

2

31

6.

3

29

7.

1

38

2

40

3

39

No.

Hari ke-

1. 2.

5.

8.

6

12

18

9.

Ulangan ke-

14,667

22,333

Media L-15 No.

Hari ke-

1. 2.

5.

8. 9.

Tugas Akhir

6

12

18


29,667

39

INDRA TRI PRAYUGI


45

Lampiran 3. (lanjutan) Media TCM

1


Rata-rata (x 106 sel/ml)

2

14

15

3.

3

15

4.

1

22

2

20

6.

3

20

7.

1

30

2

29

3

27

No.

Hari ke-

1. 2.

5.

8. 9.

Tugas Akhir

6

12

18

Ulangan


20,667

28,667

INDRA TRI PRAYUGI


46

Lampiran 4. Hasil Analisis Data Pertumbuhan Sel Limfoid dengan SPSS Hari ke-6 One-Sample Statistics N

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Media MEM

3

8.33E6

1.155E6

6.667E5

Media Leibovitz

3

1.97E7

1.528E6

8.819E5

Media TCM

3

1.50E7

1.000E6

5.774E5

One-Sample Test Test Value = 0 95% Confidence Interval of the Difference t

df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Lower

Upper

Media MEM

12.500

2

.006

8.333E6

5.46E6

1.12E7

Media Leibovitz

22.300

2

.002

1.967E7

1.59E7

2.35E7

Media TCM

25.981

2

.001

1.500E7

1.25E7

1.75E7

Tests of Within-Subjects Effects Measure:MEASURE_1 Type III Sum of Source Media

Error(Media)

Squares

df

Mean Square

F

Sphericity Assumed

1.947E14

2

9.733E13

53.091

.001

Greenhouse-Geisser

1.947E14

1.039

1.874E14

53.091

.017

Huynh-Feldt

1.947E14

1.161

1.677E14

53.091

.012

Lower-bound

1.947E14

1.000

1.947E14

53.091

.018

Sphericity Assumed

7.333E12

4

1.833E12

Greenhouse-Geisser

7.333E12

2.077

3.530E12

Huynh-Feldt

7.333E12

2.321

3.159E12

Lower-bound

7.333E12

2.000

3.667E12

Kesimpulan: terdapat perbedaan yang signifikan (p<0,05) antara perlakuan dan pertumbuhan sel limfoid udang vaname.

Tugas Akhir

Sig.


INDRA TRI PRAYUGI


47

ANOVA Hasil Sum of Squares

df

Mean Square

F

Between Groups

1.947E14

2

9.733E13

Within Groups

9.333E12

6

1.556E12

Total

2.040E14

8

62.571

Sig. .000

Hasil Subset for alpha = 0.05 Media a

Duncan

N

1

MEM

3

TCM

3

Leibovitz

3

Sig.

2

3

8.33E6 1.50E7 1.97E7 1.000

1.000

1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


48

Lampiran 4. (lanjutan) Hari ke-12 One-Sample Statistics N

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Media MEM

3

1.47E7

1.528E6

8.819E5

Media Leibovitz

3

2.97E7

1.155E6

6.667E5

Media TCM

3

2.07E7

1.155E6

6.667E5


df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Lower

Upper

Media MEM

16.630

2

.004

1.467E7

1.09E7

1.85E7

Media Leibovitz

44.500

2

.001

2.967E7

2.68E7

3.25E7

Media TCM

31.000

2

.001

2.067E7

1.78E7

2.35E7

Tests of Within-Subjects Effects Measure:MEASURE_1 Type III Sum of Source Media

Error(Media)

Squares

df

Mean Square

F

Sphericity Assumed

3.420E14

2

1.710E14

73.286

.001

Greenhouse-Geisser

3.420E14

1.581

2.164E14

73.286

.002

Huynh-Feldt

3.420E14

2.000

1.710E14

73.286

.001

Lower-bound

3.420E14

1.000

3.420E14

73.286

.013

Sphericity Assumed

9.333E12

4

2.333E12

Greenhouse-Geisser

9.333E12

3.161

2.952E12

Huynh-Feldt

9.333E12

4.000

2.333E12

Lower-bound

9.333E12

2.000

4.667E12


Tugas Akhir

Sig.


INDRA TRI PRAYUGI


49


df

Mean Square

F

Between Groups

3.420E14

2

1.710E14

Within Groups

1.000E13

6

1.667E12

Total

3.520E14

8

102.600

Sig. .000


Duncan

N

1

MEM

3

TCM

3

Leibovitz

3

Sig.

2

3

1.47E7 2.07E7 2.97E7 1.000

1.000

1.000


Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


50

Lampiran 4. (lanjutan) Hari ke-18 One-Sample Statistics N

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Media MEM

3

2.23E7

1.155E6

6.667E5

Media Leibovitz

3

3.90E7

1.000E6

5.774E5

Media TCM

3

2.87E7

1.528E6

8.819E5


df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Lower

Upper

Media MEM

33.500

2

.001

2.233E7

1.95E7

2.52E7

Media Leibovitz

67.550

2

.000

3.900E7

3.65E7

4.15E7

Media TCM

32.505

2

.001

2.867E7

2.49E7

3.25E7

Tests of Within-Subjects Effects Measure:Hasil Type III Sum of Source Media

Error(Media)

Squares

df

Mean Square

F

Sphericity Assumed

4.247E14

2

2.123E14

98.000

.000

Greenhouse-Geisser

4.247E14

2.000

2.123E14

98.000

.000

Huynh-Feldt

4.247E14

2.000

2.123E14

98.000

.000

Lower-bound

4.247E14

1.000

4.247E14

98.000

.010

Sphericity Assumed

8.667E12

4

2.167E12

Greenhouse-Geisser

8.667E12

4.000

2.167E12

Huynh-Feldt

8.667E12

4.000

2.167E12

Lower-bound

8.667E12

2.000

4.333E12


Tugas Akhir

Sig.


INDRA TRI PRAYUGI


51


df

Mean Square

F

Between Groups

4.247E14

2

2.123E14

Within Groups

9.333E12

6

1.556E12

Total

4.340E14

8

136.500

Sig. .000


Duncan

N

1

MEM

3

TCM

3

Leibovitz

3

Sig.

2

3

2.23E7 2.87E7 3.90E7 1.000

1.000

1.000


Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI


52

Lampiran 5. Hasil Analisis Data Viabilitas Sel Limfoid dengan SPSS Data viabilitas sel limfoid Ulangan

Perlakuan MEM (%)

L-15 (%)

TCM (%)

1

98

97

97

2

97

98

98

3

98

99

97

Rata-rata ± SD

97,667 ± 0,577a

98 ± 1,000a

97,333 ± 0,577a

Perlakuan ( setelah ditransformasi arcsin √% )

Ulangan

MEM

L-15

TCM

1

81,87

80,02

80,02

2

80,02

81,87

81,87

3

81,87

Rata-rata ± SD

84,26

81,2533 ± 1,06810

a

80,02 a

82,05 ± 2,12572

80,6367 ± 1,06810a

One-Sample Statistics N

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Media MEM

3 8.12533E1

1.068098

.616667

Media Leibovitz

3 8.20500E1

2.125723

1.227287

Media TCM

3 8.06367E1

1.068098

.616667

One-Sample Test Test Value = 0 95% Confidence Interval of the Difference t Media MEM Media Leibovitz Media TCM

Tugas Akhir

df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Lower

Upper

131.762

2

.000

81.253333

78.60003

83.90664

66.855

2

.000

82.050000

76.76941

87.33059

130.762

2

.000

80.636667

77.98336

83.28997


INDRA TRI PRAYUGI


53

Tests of Within-Subjects Effects Measure:MEASURE_1 Type III Sum of Source

Squares

factor1

Error(factor1)

df

Mean Square

F

Sig.

Sphericity Assumed

3.012

2

1.506

.569

.606

Greenhouse-Geisser

3.012

1.952

1.543

.569

.603

Huynh-Feldt

3.012

2.000

1.506

.569

.606

Lower-bound

3.012

1.000

3.012

.569

.529

Sphericity Assumed

10.588

4

2.647

Greenhouse-Geisser

10.588

3.905

2.711

Huynh-Feldt

10.588

4.000

2.647

Lower-bound

10.588

2.000

5.294

ANOVA Viabilitas Sum of Squares Between Groups

df

Mean Square

3.012

2

1.506

Within Groups

13.601

6

2.267

Total

16.613

8

F

Sig. .664

.549

Viabilitas Duncan

Subset for alpha = 0.05 Media

N

1

TCM

3

80.6367

MEM

3

81.2533

Leibovitz

3

82.0500

Sig.

.308

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Tugas Akhir


INDRA TRI PRAYUGI

RESPON PERTUMBUHAN KULTUR SEL LIMFOID UDANG VANAME

Recommend Documents