GENETIKAI INSTABILITÁS VIZSGÁLATA A B-SEJTES KRÓNIKUS LYMPHOCYTÁS LEUKÉMIA RICHTER TRANSZFORMÁCIÓJA SORÁN

GENETIKAI INSTABILITÁS VIZSGÁLATA A B-SEJTES KRÓNIKUS LYMPHOCYTÁS LEUKÉMIA RICHTER TRANSZFORMÁCIÓJA SORÁN

PhD értekezés

Dr. Fülöp Zsolt Ferenc Témavezeto: Dr. Matolcsy András

Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola Budapest, 2005

TARTALOM I. II. III. IV.

ÖSSZEFOGLALÁS ABSTRACT BEVEZETÉS A B-CLL PATOLÓGIAI JELLEMZOI IV.1. A B-CLL hisztológiai megjelenése IV.2. A B-CLL immunhisztológiai megjelenése IV.3. A B-CLL patogenetikai jellemzoi és sejtes eredete V. A RICHTER-SZINDRÓMA JELLEMZOI V.1. A lymphoma progresszió általános terminológiája V.2. A Richter-szindróma definíciója V.3. A Richter-szindróma hisztológiája és immunfenotípusa V.4. A B-CLL és a Richter-szindróma klonális kapcsolata V.5. A Richter-szindrómában eloforduló genetikai zavarok VI. MIKROSZATELLITA SZEKVENCIÁK VI.1. A mikroszatellita szekvenciák genomiális szervezodése, funkciója VI.2. A mikroszatellita instabilitás és a mismatch repair gének VII. DNS METILÁCIÓ VII.1. A metilált DNS szekvenciák szervezodése a genomban VII.2. DNS metiláció és transzkripció gátlás VII.3. A mismatch repair gének DNS metiláció általi inaktivációja tumoros szövetekben VIII. A MIKROSZATELLITA INSTABILITÁS ÉS A MISMATCH REPAIR GÉNEK SZEREPE HEMATOLÓGIAI MALIGNITÁSOKBAN IX. CÉLKITUZÉSEK X. ANYAG ÉS MÓDSZER X.1. Szövettani minták X.2. DNS izolálás X.3. A biopsziás mintapárok klonalitásának igazolása X.4. Mikroszatellita instabilitás vizsgálatok X.5. A hMLH1 és a hMSH2 gén vizsgálata „Single Strand Conformation Polymorphism” (PCR-SSCP) módszerrel X.6. A hMLH1 gén promoter- metiláció vizsgálata XI. EREDMÉNYEK XI.1. Klonális kapcsolat a biopsziás mintapárok között XI.2. Mikroszatellita analízis XI.3. A hMLH1 és a hMSH2 gén PC R-SSCP vizsgálata IX.4. A hMLH1 gén promoter- metiláció vizsgálata XII. MEGBESZÉLÉS XIIII. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE XIV. IRODALOMJEGYZÉK XV. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE XVI. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

-2 -

I. ÖSSZEFOGLALÁS A B-sejtes krónikus lymphocytás leukémia (B-CLL) egy indolens lefolyású nonHodgkin lymphoma (NHL). Az esetek 5-10%-ában a kórkép klinikai progressziót és hisztológiai transzformációt mutathat diffúz nagy B-sejtes lymphomába (DLBL), melyet az irodalom Richter-szindróma, vagy Richter transzformáció néven ismer. Tanulmányunkban azt a kérdést vizsgáltuk, hogy a B-CLL Richter transzformációja során szerepet tölt-e be a mikroszatellita instabilitás (MSI), és az instabilitás kialakulásának hátterében állhat-e a hMLH1 és hMSH2 mismatch repair gének esetleges genetikai alterációja. Vizsgálatainkat tizenkilenc B-CLL-ben szenvedo beteg biopsziás mintapárjain végeztük. Tíz esetben a második mintavétel az elozohöz hasonló szövettani viszonyokat mutatott, kilenc esetben viszont a második biopsziás készítményen a DLBL szöveti képe látszott. A biopsziás mintákból izolált DNS-ben a MSI mértékét nyolc, különbözo kromoszómákon elhelyezkedo mikroszatellita marker polimeráz láncreakción alapuló amplifikációjával mértük fel. A kilenc DLBL-ba transzformálódott szövettani minta közül négy esetben nagyfokú MSI-t mutattunk ki a megelozo B-CLL-bol származó biopsziás mintához képest. A szövettani transzformációt nem mutató B-CLL-bol származó mintapárok közül három esetben alacsony mértéku MSI-t, hat esetben stabil mikroszatellita szekvenciákat mutattunk ki. A hMLH1 és hMSH2 gének egyetlen mintában sem hordoztak szomatikus mutációt a vizsgált régiókban. A kilenc DLBL-ba transzformálódott szövettani minta közül öt esetben a hMLH1 gén promoter szakaszának hipermetilációja egyaránt kimutatható volt a DLBLbol és a megelozo B-CLL-bol származó mintákban. Ezen esetek közül a hMLH1 gén promoterének hipermetilációja négy esetben a vizsgált mikroszatellita markerek nagyfokú, egy esetben pedig alacsony mértéku instabilitásával járt együtt. Eredményeink arra utalnak, hogy a B-CLL Richter transzformációjának egyes eseteiben a hMLH1 gén epigenetikai inaktiválódása által kiváltott genetikai instabilitás hozzájárulhat a B-CLL progressziójához, ugyanakkor a hMLH1 és hMSH2 gének a folyamat során strukturálisan nem érintettek.

-3 -

II. ABSTRACT B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is an indolent non-Hodgkin lymphoma that may transform into diffuse large B-cell lymphoma (DLBL). DLBL arising from the transformation of B-CLL is referred to as Richter’s syndrome or Richter’s transformation. To analyze whether microsatellite instability (MSI) and DNA mismatch repair defects are associated with Richter’s transformation, we have performed microsatellite analysis, mutational analysis of the hMLH1 and hMSH2 mismatch repair genes and methylation status analysis of the CpG island of the hMLH1 promoter on serial biopsy specimens from 19 patients with B-CLL. Ten cases of B-CLL showed no histologic alteration in the second biopsy, and nine cases of B-CLL underwent morphologic transformation to DLBL in the second biopsy. Investigating eight microsatellite loci, a high level of MSI was associated with Richter’s transformation in four cases of B-CLL, but none of the B-CLL displayed this level of MSI without transformation. Mutations of the hMLH1 and hMSH2 genes were not detected in any of the lymphoma samples. In five cases of Richter’s transformation the hMLH1 promoter was hypermethylated both in the B-CLL and in the DLBL samples. Hypermethylation of the hMLH1 promoter associated with high levels of MSI in four cases, and low levels of MSI in one case. These findings suggest that in some cases of Richter’s transformation the genetic instability initiated by the defect of the DNA mismatch repair system plays a role in tumor progression.

-4 -

III. BEVEZETÉS A B-sejtes krónikus lymphocytás leukémia (B-CLL) az egyik leggyakoribb klonális lymphoproliferatív betegség, a felnottkori leukémiák 40%-át teszi ki. Klinikailag indolens viselkedésu non-Hodgkin lymphoma (NHL), amely leginkább 60-70 éves korban jelentkezik [21, 219]. Incidenc iája 3/100000 lakos/év [206]. A B-CLL átlagos túlélési ideje 8-25 év [51, 106], azonban az esetek 5-10%-ában a kórkép kevesebb mint fél év alatt fatális a B-CLL agresszív lymphomába való transzformációja miatt [231]. A B-CLL talaján kialakuló diffúz nagy B-sejtes lymphoma (DLBL) a kórlefolyás akcelerációjával együtt (progresszív lymphadenopátia, láz és fokozott testsúlyvesztés, extranodális manifesztáció) a szakirodalomban Richter-szindrómaként (RS), vagy a B-CLL Richter transzformációjaként ismert a tünetegyüttes elso leírója után [90, 229]. A B-CLL hisztológiai transzformációjának és klinikai progressziójának pontos mechanizmusa nem teljesen ismert. A RS kialakulása számos kromoszomális, illetve génszintu anomáliával járhat együtt. A genetikai aberrációk részben már a B-CLL stádiumban megjelennek, és változatlanul megfigyelhetok a lymphoma transzformációja után is. Ebbe a csoportba tartoznak egyes kromoszóma-deléciók (del 13q14, del 11q22-q23, del 17p13), a 12. kromoszóma triszómiája, valamint a p53 tumorszuppresszor gént érinto mutációk [73]. A B-CLL transzformáció utáni stádiumához további genetikai és epigenetikai eltérések megjelenése kapcsolható. A 8p és a 9. kromoszómát érinto deléciók [15], a p16/INK4A deléciója [215], a C-MYC amplifikációja [6], az A-MYB csökkent expressziója [92], a p27 expressziójának hiánya és a ciklin D1 fokozott expressziója [45] irodalmi adatok szerint a RS kialakulásához társul, B-CLL-re nem jellemzo. Kérdéses, hogy az említett genetikai zavarok között van-e olyan domináns eltérés, amely önmagában elégséges ahhoz, hogy a B-CLL agresszív lymphomába transzformálódjon. Jelenleg nincs olyan ismert genetikai lézió, amely minden egyes RS-ban detektálható, azaz felelos lehetne a B-CLL transzformációjáért. A sejtciklust szabályozó, proliferációt serkento (ciklin D1 ), és azt gátló (p16/INK4A, p27, p53) fehérjék közti egyensúly felborulása, továbbá a génexpressziót szabályozó transzkripciós faktorok (C -MYC, A-MYB) mennyiségi zavara hozzájárulhat a RS kialakulásához. A heterogén genetikai eltérések jelenléte arra utal, hogy

-5 -

a B-CLL daganatos sejtjei a sejtciklus szabályozásának zavara miatt újabb és újabb genetikai hib ákat halmozhatnak fel, általános genetikai instabilitás alakulhat ki bennük, és a szelektív növekedési elonyhöz jutó sejtek végül kialakítják a RS-ra jellemzo agresszív lymphoma képét [45, 175, 194]. A tumorsejteket érinto genetikai instabilitásnak négyféle megnyilvánulási formája lehet: 1.

Génamplifikációk:

egy

meghatározott

génszakasz

több

kópiában

való

megjelenése, amely 0,5-10 megabázis hosszúságú járulékos örökítoanyagot jelent. A génamplifikációk ismert példája az elorehaladott neuroblastomák 30%ában az N -MYC amplifikációja [248]. 2.

Kromoszóma-transzlokációk: különbözo kromoszóma-szakaszok fúzióját, vagy egy adott kromoszómán belüli, egymástól távol elhelyezkedo DNS-szakaszok összekapcsolódását

jelenti. Példaként említheto a C-ABL és a BCR régiók

fúziójához vezeto t(9;22) transzlokáció krónikus myeloid leukémiában (CML) [203]. 3.

Kromoszómákat érinto számbeli eltérések: egész kromoszómák elvesztése, vagy számfeletti megjelenése tartozik ebbe a csoportba. A genetikai instabilitásnak egyik gyakori megnyilvánulási formája, majdnem az összes humán daganatos betegségben elofordul az ane uploiditás valamilyen formája [186].

4.

DNS-szekvenciát érinto változások: ide sorolhatók a pontmutációk, néhány nukleotidnyi szakaszok deléciója vagy inszerciója és a tandem ismétlodo DNSszakaszok kópiaszámának megváltozása [161]. A DNS bázissorrendjét módosító változások sajátos csoportját képezik a tandem

ismétlodo rövid szekvenciák (mikroszatelliták) hosszbeli változásai. A mikroszatelliták hosszbeli változásához vezeto genetikai instabilitás két élesen elkülönítheto osztályba sorolható. Az I. osztályú genetikai instabilitás „dinamikus expanzió“ (DiE), vagy „dinamikus mutáció“ néven ismert a szakirodalomban [267]. A DiE alapvetoen a CAG és CCG trinukleotidokból álló repetitív elemek expanzióját jelenti a csírasejtekben. Amennyiben az expanzió során az ismétlodések száma egy küszöbérték fölé emelkedik, akkor az adott mikroszatellita - kromoszomális lokalizációjának megfeleloen - fragilis

-6 -

kromoszóma-régiók megjelenéséhez (és az ennek megfelelo tünetegyüttesekhez, például fragilis X szindrómához), vagy neurodegeneratív kórképek (Huntington-kór, I. típusú spinocerebelláris ataxia, myotóniás dystrophia) kialakulásához vezet [8, 267]. A DiE jellegébol fakadóan ezekre a betegségekre jellemzo az anticipáció: a kórkép egyre fiatalabb életkorban és súlyosabb formában jelentkezik az egymást követo generációkban [181]. A II. osztályú genetikai instabilitás - a klasszikus értelemben vett mikroszatellita instabilitás (MSI) - egyenlo arányban bekövetkezo deléciókat és inszerciókat jelent a szomatikus sejtekben. Nemcsak trinukleotid mikroszatellitákat, hanem mono-, di- és tetranukleotid ismétlodéseket is érint. A MSI-t eloször colorectalis tumorokban figyelték meg [1, 129, 272], és azóta a legtöbb szolid tumorban kimutatták [7]. A DiE- vel szemben a MSI nem vezet anticipációhoz. Annak ellenére, hogy a DiE és a MSI egyaránt vezethet repetitív DNS szekvenciák instabilitásához, mechanizmusuk meroben eltér egymástól. A MSI okaként a DNS mismatch repair (MMR) aktivitás elvesztése jelölheto meg [137, 211], a DiE viszont MMR-tol függetlenül következik be, valószínuleg a CAG és CCG mikroszatelliták által facilitált hajtukanyar-szeru DNS struktúrák megjelenése és azok stabilizálódása miatt [75, 91]. Epidemiológiai és kísérletes bizonyítékok szólnak amellett, hogy a B-CLL patogenezisében helyt kaphat a trinukleotid mikroszatellitákat érinto DiE. Epidemiológiai tanulmányok szerint a B-CLL 6%-a familiáris [123] és anticipációt mutat [93, 298], ami feltételezi a trinukleotid ismétlodo elemek dinamikus expanzióját. A 11q22-23 kromoszómarégióban CCG-trinukleotidokból álló repetitív elemek azonosíthatók, melyek a B-CLL elorehaladott stádiumában jelentos expanziót mutatnak, és kromoszómatörésekhez vezethetnek. Ezek az eredmények magyarázatot adnak a B-CLL-ben gyakran kimutatható allélvesztésre ebben a kromoszómarégióban [9]. Nyitott kérdés, hogy a MSI szerepet kaphat-e a B-CLL patogenezisében és progressziójában. Irodalmi adatok szerint a MSI egyéb B-sejtes NHL-ban elenyészo [86, 287], ugyanakkor a B-CLL patogenezise során a vizsgált esetek 7-13%-ában megfigyelheto [87, 243], és egy esetben RS-ban is kimutatták [287]. A MSI és a B-CLL transzformációja közti összefüggést átfogó módon még nem vizsgálták.

-7 -

IV. A B-CLL PATOLÓGIAI JELLEMZOI IV.1. A B-CLL hisztológiai megjelenése A B-CLL világszerte az idoskori lymphoproliferatív kórképek 90%-át teszi ki. Nemzetközi felmérések szerint az összes NHL 6-7%-át alkotja [193]. Szövettanilag a B-CLL a megnagyobbodott nyirokcsomók alapszerkezetét elmosó, diffúz növekedésu tumorként jelenik meg. A tumorsejtek kis, érett, differenciált lymphocyták, kerek maggal, rögös kromatinszerkezettel, vékony citoplazmaszegéllyel. A mitotikus aktivitás alacsony. A diffúz nyirokcsomó-infiltrátumban világos mezok, úgynevezett pseudofolliculusok azonosíthatók (1. ábra) [162], melyek a kis lymphocyták mellett

prolymphocytákból

(a

kis

lymphocytáknál

nagyobb

sejtek,

lazább

kromatinszerkezettel, kis magvacskával) és paraimmunoblastokból (nagy méretu sejtek, nagy kerek vagy ovális maggal, laza kromatinnal, eozinofil magvacskával) állnak [25].

A

B

1. ábra: A B -CLL hisztológiai megjelenése nyirokcsomóban A: A sötétebb háttérbol világosabb területekként kirajzolódó pseudofolliculusok azonosíthatók. HE, 40X. B: Nagy nagyítású felvételen a kis lymphocyták mellett lazább kromatinszerkezetu prolymphocyták és nagy, heterokromatinizált, prominens nucleolusszal rendelkezo paraimmunoblastok is megfigyelhetok (nyíl). HE, 400X.

-8 -

Vérkenetben a daganatos sejtpopuláció mellett gyakran megfigyelhetok elkent sejtek (Gumprecht rögök) a kenetkészítés melléktermékeként. A prolymphocyták aránya általában kevesebb mint 3%; a 10% fe letti prolymphocyta-arány a kórkép agresszívebb klinikai lefolyású variánsát jelzi, amelyet krónikus lymphocytás leukémia / prolymphocytás lymphoma (CLL/PLL) diagnózissal kell illetni [17]. A B-CLL a csontvelot nodulárisan, intersticiálisan, vagy diffúzan infiltrálhatja, ez utóbbi rosszabb prognózist jelez [234].

IV.2. A B-CLL immunhisztológiai megjelenése A B-CLL kis lymphocytái a sejtfelszíni IgM (esetleg IgM és IgD) molekulákat gyengén expresszálják. Ugyancsak gyengén expresszálódik a CD20 és a CD22 marker. A CD5, CD19, CD23 markerek expressziója eroteljes és jellemzo a B-CLL-re [180, 190]. A CD10, FMC7, CD79b, ciklin- D1 nem mutatható ki B-CLL-ben [190]. Esetenként nehézséget jelenthet a B-CLL elkülönítése a köpenysejtes lymphomától, azonban a köpenysejtes malignus lymphomák csaknem mindig CD23 negatívak, illetve ciklin-D1 pozitívak [300]. Újabb vizsgálatok szerint CD38-at expresszálnak a B-CLL azon sejtjei, melyek az expresszált immunglobulin nehézlánc (IgH) és könnyulánc (IgL) gének hipervariábilis régióiban nem hordoznak szomatikus mutációt [51].

IV.3. A B-CLL patogenetikai jellemzoi és sejtes eredete Az utóbbi évek kutatási eredményei jelentos mértékben hozzájárultak a B-CLL citogenetikájának és molekuláris genetikai zavarainak pontosabb megismeréséhez. Jelenleg fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) technikával a B-CLL-ben szenvedo betegek biopsziás mintáinak 80%-ában kimutatható kromoszomális aberráció [59]. Az irodalmi adatok leggyakrabban a 12. kromoszóma triszómiáját [60, 179], valamint a 13q14, 11q2223, 17p13, 6q21 kromoszóma -régiókat érinto deléciókat [57-61, 262] említik. A B-CLLben tapasztalható kromoszóma-törések pontos mechanizmusa nem tisztázott. Kromoszóma festési eljárások alapján úgy tunik, hogy a B-CLL ismert kromoszomális töréspontjai

-9 -

fragilis kromoszómarégiók megjelenésével korrelálnak [84]. A kromoszómadeléciók több részben még azonosításra váró - gén funkciójának megszunését eredményezhetik. Mindeddig a 17p13 és 11q22-23 deléció miatt kieso p53 és a p53-úthoz kapcsolódó ATM gén patogenetikai szerepét igazolták [214]. Ismeretes, hogy DNS-károsodás esetén a p53 gén terméke központi szerepet tölt be a sejtciklus leállításában, vagy az apoptotikus folyamatok elindításában: a sejtmagban szabályozza a p21/ WAF1 ciklin-dependens kináz inhibitor, a proapoptotikus BAX és az antiapoptotikus hatású BCL-2 gének transzkripcióját [157, 164]. A p53 fehérje aktivációjának egyik útja az ATM gén termékén keresztül valósul meg [269]. Az ATM egy szerin-treonin specifikus protein kináz, amely a p53 fehérjét meghatározott pontokon foszforilálva aktiválja [144]. A p53 fehérje nemcsak a génjét érinto mutáció esetén funkcióképtelen, de akkor is, ha elmarad az ATM által biztosított aktivációja. A B-CLL-ben szenvedo betegek 10-15%-ában kimutatható a p53 gén szomatikus mutációja [73], és elfogadott tény, hogy a p53 mutációi rossz kórlefolyást vetítenek elore [47, 201]. A 11q2223 kromoszóma-deléció, amely csak az ATM egyik alléljának a delécióját jelenti, a betegek 20%-ában fordul elo, de a közölt esetek nagy részében a másik allél mutációi is kimutathatók. Az ATM biallélikus eredetu funkcióvesztése minden bizonnyal a p53 aktiváció egyik útjának elmaradását jelenti [61, 201]. A csökkent p53-hatás másik oka a p53 fehérje metabolizmusának a zavara lehet. A p53 fehérje intracelluláris lebontása az ubiquitin-proteaszóma rendszeren keresztül történik [160]. A B-CLL sejtek konstitutívan magas proteaszomális aktivitást mutatnak, ami jelentosen befolyásolhatja a sejten belüli p53-szintet, ezáltal a sejtek apoptózisra való hajlamát [174]. Feltételezheto tehát, hogy a p53 diszfunkciója B-CLL-ben gyakoribb, mint ahogy az a mutációs gyakorisága alapján elvárható lenne [104]. A B-CLL patogenezisének alternatív magyarázata szerint a kórkép kialakulásának oka a lymphoid homeosztázis zavara. Ez az elmélet abból a megfigyelésbol indul ki, hogy a BCL-2 onkoprotein szintje B-CLL-ben meglepoen magas, jóval magasabb, mint nem tumoros lymphocytákban [110]. A BCL-2 gén kórosan fokozott expressziója jellemzoen a follicularis lymphoma (FL) patogenezisében kap helyet. FL-ban az esetek 80%-ában kimutatható a t(14;18) kromoszóma-transzlokáció. Ennek során a 18-as kromoszómán

- 10 -

elhelyezkedo BCL-2 gén expressziója a 14-es kromoszómán levo IgH gén szabá lyozása alá kerül [258]. A B-CLL-re nem jellemzo a t(14;18) kromoszóma-transzlokáció, a daganatos sejtek magas BCL-2 szintje epigenetikai tényezokre, a gén hipometilációjára vezetheto vissza [110]. A BCL-2 egyéb fehérjékkel (BAX, BAD, BAK, MCL1) aktívan részt vesz az apoptózis szabályozásában, és szerepet játszik a perifériás lymphoid szövetek konstans lymphocyta-populációjának fenntartásában [143]. Az apoptózis alapveto fiziológiás folyamat a perifériás nyirokszövetekben, ami kompenzálja a lymphocyta-beáramlás és a lokális lymphocyta-proliferáció sejtszámnövelo hatását. A homeosztatikus szabályozásnak ez a formája nyilvánvalóan zavart szenved B-CLL-ben, ugyanakkor a BCL-2, valamint a BCL-családba tartozó fehérjék expressziója és a terápiás válasz között nem sikerült összefüggést kimutatni [149]. A Rb gén delécióját a B-CLL 30%-ában írták le, azo nban ennek a tumorszuppresszor génnek a patogenetikai szerepe B-CLL-ben vitatható [168, 263]. A BCLL-ben tapasztalható 13q14 kromoszóma -deléció valóban a Rb gén egyik alléljának elvesztését jelenti, de mindkét allél elvesztése B-CLL-ben elenyészoen ritka, ennélfogva a Rb gén teljes hiánya, mint lehetséges patogenetikai tényezo B-CLL-ben elvetheto [169, 264]. A B-CLL sejtjeiben az immunglobulin gének variábilis régióinak (IgV) vizsgálati eredményei átalakították a daganatos B-lymphocyták eredetérol alkotott korábbi elképzeléseket. Hosszú ideig úgy tunt, hogy a lymphocytákban az IgH és IgL gének átrendezodnek, de nem tartalmaznak szomatikus mutációkat [54, 64, 148], ami a daganatos B-sejtek prefollicularis eredetére utal [261]. Újabb tanulmányok a B-CLL esetek 50-60%ában az átrendezett IgH és IgL gének hipervariábilis régióiban szomatikus mutációkat mutattak ki [51, 71, 207]. Ezen adatok alapján a B-CLL két altípusra különítheto. Az esetek 40-50%-ában a daganatos sejtek prefollicularis eredetu CD5+ B-sejtek, melyek természetes autoantitestekre emlékezteto, szomatikus mutációkat nem hordozó, IgM izotípusú, kismértékben

autoreaktív,

keresztreagáló

idiotípusú

(high

idiotype

connectivity)

immunglobulinokat expresszálnak [33, 128]. A szomatikusan mutált immunglobulint hordozó daganatos B-sejtek, melyek a B-CLL másik alcsoportját alkotják, a jelenlegi álláspont szerint postfollicularis memória B-sejteknek felelnek meg [150]. Átfogó

- 11 -

génexpressziós vizsgálatok tovább finomították a B-CLL funkcionális csoportosítását. A daganatos B-sejtek expressziós profiljuk alapján minden más B-sejtes NHL B-sejtjeitol különböznek, és leginkább a memória B-sejtekhez hasonlítanak, jóllehet az IgV-t érinto szomatikus mutációk meglétén vagy hiányán elkülönítheto két csoportjuk további 30 gén expressziójában is eltér egymástól [151, 233]. Mindazonáltal mindkét csoport expresszál CD27-et, amely a memória B-sejtek jellemzo sejtfelszíni markere [150]. A CD27 expressziója és a sejtek „memória-sejt jellege” nehezen egyeztetheto össze az IgV szomatikus mutációinak hiányával a prefollicularis eredetunek vélt sejtcsoportban. Ez az ellentmondás feloldható, ha a naiv B-sejtek a nyiroktüszokön kívül T-independens antigénekkel

(Ag),

vagy

szuperantigénekkel

találkoznak,

amelyek

a

sejtfelszíni

immunglobulinhoz (B-sejt receptor, BcR) nem az Ag- felismero régiónál, hanem a „framework” régiónál kötodnek; így elmarad a IgV szomatikus mutác ióin alapuló affinitásérés [51, 106]. A B-CLL patogenezise az ismertetett adatok alapján feltételez egy elsodleges defektust a betegség mindkét alcsoportjában, ami által a BcR stimulációja a Bsejtek részleges aktivációjához, anergiájához, és az apoptózis elmaradásához vezet [34]. Az IgV régióban szomatikus mutációkat hordozó daganatos B-sejtekben a BcR aktiválása konvencionálisan a nyiroktüszokben történik. A sejtek további sorsa a programozott sejthalál lenne, ehelyett lassan növekvo, indolens tumorként felhalmozódnak. A „germline” konfigurációjú IgH és IgL géneket hordozó B-sejtekben a BcR-t T-independens Ag, vagy szuperantigén stimulálhatja a nyiroktüszokön kívül. Az elozo csoporthoz hasonlóan sikertelen apoptózis révén túlélhetnek, és valószínu, hogy további stimulációjuk lassú sejtosztódásokhoz vezet [105]. A B-CLL patogenezisének eme modellje szerint a szomatikusan nem mutált IgV-t hordozó csoportban gyakoribbak a sejtosztódások. Valóban, ezek a sejtek a szomatikusan mutált IgV-t hordozó B-sejtekhez képest rövidebb telomer-szakaszokkal rendelkeznek [126], és intenzívebb Ki-67 festodést mutatnak [205].

- 12 -

V. A RICHTER-SZINDRÓMA JELLEMZOI V.1. A lymphoma progresszió általános terminológiája A lymphomagenezis többlépcsos modelljének megfeleloen a lymphomák gyakran tesznek szert agresszívebb fenotípusra a természetes lefolyásuk során [175, 194]. Ezt a folyamatot az irodalomban gyakran félreértheto módon transzformáció, progresszió, evolúció, variáció, konverzió, transzmutáció vagy dedifferenciáció szinonimákkal illetik. Az elso kísérletet a tumor progresszió pontosabb meghatározásásra Foulds tette 1954-ben, hangsúlyozva, hogy a daganat progressziója nemcsak egyszeruen a tumor térbeli és idobeli növekedését jelenti, hanem a tumor egy vagy több jellemzojének végleges és irreverzibilis minoségi változását [83]. A „lymphoma progresszió“ egyaránt vonatkozhat a kérdéses lymphoma morfológiájának, klinikai megjelenésének, vagy biológiai viselkedésének megváltozására (2. ábra). A lymphoma progresszió különbözo aspektusai a legtöbb esetben átfedést mutatnak: a különbözo genetikai eltérések klonális megjelenése (biológiai progresszió) legtöbbször agresszívebb morfológiával (morfológiai progresszió), és a lymphoma akcelerált klinikai viselkedésével, disszeminációjával, terápiarezisztenciájával jár (klinikai progresszió). Ez az átfedés nem mindig teljes. Esetenként egy morfológiai és klinikai progressziót mutató lymphoma „eredeti“ és „progrediált“ komponense között nem mutatható ki klo nális kapcsolat, azaz a progresszió egy de novo másodlagosan kialakuló lymphomát is jelenthet. A „kompozit lymphoma“ megjelölést pusztán morfológiai megfontolások alapján vezették be azokra az esetekre, ahol legalább két, szövettanilag különbözo megjelenésu lymphoid malignitás figyelheto meg több, vagy akár egy szerven belül [145, 146]. Az immunhisztokémiai és molekuláris genetikai vizsgálatok eredményeinek megfeleloen jelenleg a kompozit lymphoma elnevezés alatt egy klonális lymphoma különbözo fenotípusos megnyilvánulást, vagy két különbözo lymphoma egyideju fennállását értjük. Ez a megnevezés azonban nem feltétlenül takar klonális kapcsolatot a morfológiailag eltéronek ítélt lymphomák között. Biológiai szempontból célszeru a „lymphoma progresszió“

- 13 -

meghatározást azokra az esetekre alkalmazni, ahol egy adott lymphoma entitás klonális fejlodésérol (biológiai értelemben vett valódi lymphoma progresszióról) van szó [194].

Kezdeti onkogén hatás

Diagnózis

Progresszió

Példa

Térben terjedo B-CLL Klinikai progresszió + Biológiai progresszió Morfológiai progresszió B-CLL p53 inaktivációval Klinikai progresszió + Biológiai progresszió + Morfológiai progresszió B-CLL-bol kialakuló DLBL Klinikai progresszió + Biológiai progresszió + Morfológiai progresszió +

2. ábra: A lymphoma progresszió értelmezése A: A klinikai progresszió csak a tumormassza növekedését (a tumor disszeminációját) jelenti morfológiai és biológiai eltérések nélkül. B: A biológiai progresszió addícionális genetikai zavarok megjelenését jelenti (fekete nyíl), melyek az érintett sejteknek (feketével jelzett sejtek) szelektív növekedési elonyt biztosítanak. C: A morfológiai progresszió (lymphoma tarnszformáció) a tumorsejtek morfológiájának megváltozását vagy a tumor sejtes összetételének megváltozását jelenti, amely legtöbbször klinikai és biológiai progresszióval jár.

V.2. A Richter-szindróma definíciója A RS a B-CLL kórlefolyása során kialakuló agresszív NHL, amely a B-CLL hisztológiai transzformációja mellett a kórkép klinikai viselkedésének megváltozásával is jár. Erre a jelenségre eloször Maurice Richter figyelt fel 1928-ban egy 46 éves férfibetegen, akinél fatális lefolyású generalizált lymphadenopathia, masszív organomegália és gyors testsúlycsökkenés volt megfigyelheto [229]. A tünetek hátterében szövettanilag a B-CLL-re jellemzo kis lymphocyták mellett diffúzan megjeleno, széles citoplazmájú, nagy, kissé

- 14 -

irreguláris magvú, prominens magvacskával rendelkezó polimorf endothelioid sejtek voltak igazolhatók. Ez a szövettani kép a B-sejtes NHL-k jelenlegi WHO osztályozása szerint a DLBL immunoblasztos variánsának (DLBL-IB) felel meg [131]. A RS elnevezést Lortholary vezette be 1964-ben a B-CLL szövettani transzformációjának megjelölésére a kórlefolyás terminális fázisában [171]. A RS jelenlegi értelmezése magába foglalja mindazon lymphoid malignitásokat, melyek a B-CLL-ben szenvedo betegekben megjelenhetnek [283]. A B-CLL szövettani transzformációja leggyakrabban DLBL kialakulásához vezet [199], de ritkábban Hodgkin lymphoma (HL) [28, 90], vagy multiplex myeloma (MM) is kialakulhat [173, 241]. Rendkívül ritkán a B-CLL T-sejtes NHL-ba is transzformálódhat [159, 202]. A B-CLL Richter transzformációjának incidenciája 5-10% [283]. Az általános klinikai tünetek megjelenésével egyidoben lokalizált, vagy disszeminált nyirokcsomó megnagyobbodást, gyakran hepatomegáliát, szplenomgáliát okoz. Ritkán extranodális megjelenést is mutathat a pleurában [90], a borben [38, 222], a gyomor-bélrendszerben [209], a központi idegrendszerben [172], a tüdoben [184] vagy a szemben [114]. A RS kezelésére jelenleg nincs széles körben elfogadott terápiás ajánlás [206]. A prognózis rossz, a kombinált kemoterápiára a betegek legtöbbször rezisztensek, az átlagos túlélési ido 5-8 hónap [50, 282].

V.3. A Richter-szindróma hisztológiája és immunfenotípusa A RS eredeti leírása a B-CLL tala ján kialakuló immmunoblasztos lymphomát jelölt, ami a B-sejtes lymphomák jelenleg elfogadott osztályozása szerint DLBL-IB-nek felel meg, de irodalmi adatok szerint a DLBL centroblasztos variánsának (DLBL-CB) kialakulását is jelentheti [199]. A DLBL a nyirokcsomókat általában teljes egészében beszuri, de megjelenhet a B-CLL mellett is ugyanabban a preparátumban [283]. A csontvelo beszurodése RS -ban ritka jelenség [199]. Az agresszív lymphoma sejtjei a BCLL kis sejtjeitol morfológiailag jól elkülöníthetok: a DLBL jellemzo sejtjei nagy, kerek vagy enyhén szabálytalan alakú sejtek, mérsékelten széles citoplazmával, laza

- 15 -

magszerkezettel, a magban nagy, centrálisan elhelyezkedo erosen bazofil magvacskával (IB), vagy több, a maghártya mentén elhelyezkedo nucleolusszal (CB, 3. ábra).

A

B

3. ábra: A Richter-szindróma hisztológiai megjelenése nyirokcsomóban A: DLBL-IB. Az immunoblasztok nagy, mérsékelten pleiomorf sejtek. Szembetuno vonásuk a centrálisan elhelyezkedo, erosen bazofil nagy nucleolus, valamint a centroblasztokénál kissé szélesebb citoplazmaszegély. HE, 200X. B: DLBL-CB. A centroblasztok kerek magvú, laza megszerkezetu sejtek, melyekben a kis nucleoluszok a maghártya mentén helyezkednek el, citoplazmájuk keskeny, bazofil. HE, 200X.

A RS immunfenotípusára vonatkozó szegényes irodalmi adatok arra utalnak, hogy bizonyos esetekben a RS megorzi a megelozo B-CLL immunfenotípusát (IgM+, IgD+/-, CD5+, CD19+, CD23+ ) [178, 187], egyéb esetekben viszont a RS immunhisztokémiai megjelenése eltér a B-CLL-tol (CD5 -, IgD -, Ki-67+) [14, 48, 177]. B-CLL-bol az esetek kevesebb, mint 0,5%-ában HL is kialakulhat. A RS keretében kialakuló HL-nak két megjelenési formája lehet. Az egyik csoportban a jellegzetes, CD15+, CD30 + Reed-Sternberg sejtek (H-RS sejtek) a B-CLL sejtek alkotta háttérben jelennek meg [189, 251, 281, 295], ritkábban a HL jellegzetes gyulladásos hátterében láthatók a szövettani készítményen [28, 72, 292].

- 16 -

V.4. A B-CLL és a Richter-szindróma klonális kapcsolata A megelozo B-CLL-bol kialakuló DLBL nem mindig az eredeti tumorklónból növekszik ki, de novo is kialakulhat. A molekuláris genetikai vizsgálómódszerek elterjedése elott a klonalitást a B-sejtek sejtfelszíni IgL immunfenotípusa alapján állapították meg. Amennyib en a RS és a B-CLL neoplasztikus B-sejtjei ugyanazon IgL-t hordoztak, akkor a RS feltételezhetoen a megelozo B-CLL klónból alakult ki, különbözo IgL-k detektálása de novo megjeleno RS-ra utalt [117, 183, 286]. Az IgL vizsgálata azonban önmagában nem alkalmas a két lymphoma klonális kapcsolatának megerosítésére vagy kizárására, hiszen egy B-CLL talaján kialakuló DLBL-ben az IgL expresszió eltérhet a B-CLL-ben észlelttol, annak ellenére, hogy az IgH génátrendezodés azonos a két lymphoma entitásban [187, 198]. A klonalitás vizsgálatának hatékonyabb eszköze az IgH génátrendezodés DNS-próbával történo azonosítása (Southern blot) [257]. A Southern blot módszer a genomikus DNS restrikciós endonukleázokkal való emésztésén alapul. Az IgH gén konfigurációjáról a

hasított

DNS

különbözo

hosszúságú

fragmentumainak

gélelektroforézissel történo szétválasztása, majd nitrocellulóz filterre való blottolása után a joining (JH) génszakaszra specifikus próbával történo hibridizációt követoen kaphatunk információt. Az azonos méretu terméket eredményezo IgH génátrendezodés B-CLL-ben és DLBL-ben megerosíti a sejtek közös eredetét, a különbözo hosszúságú átrendezett IgH szakaszok elméletileg kizárják a klonális kapcsolatot [46, 176, 187, 266, 275, 280]. Mivel a restrikciós endonukleázok felismerési szakaszait szomatikus mutációk módosíthatják, különbözo hosszúságú szakaszok jelenhetnek meg abban az esetben is, ha a két lymphoma B-sejtjeiben azonos az IgH génátrendezodés [177]. A lymphomák klonális kapcsolatának modern

módszerekkel

történo

igazolása

szükségessé

teszi

az

IgH

harmadik

komplementaritást determináló régiójának (CDR3) polimeráz láncreakcióval (PCR) történo vizsgálatát. A CDR3 régió tartalmazza a B-sejtekben átrendezodo variábilis (VH), diverzitás (D) és JH génszakaszok egyedi, sejtre jellemzo kombinációját [98, 125], mely végigkíséri az adott B-sejt differenciálódásának folyamatát [156]. A CDR3 régió PCRamplifikációja a VH és JH-génekre specifikus primerpárokkal érheto el [278]. A megegyezo hosszúságú és bázissorrendu amplifikált CDR3 szekvenciák a lymphomák közös klonális

- 17 -

eredetére utalnak, a különbözo hosszúságú szakaszok kizárják a klonális kapcsolatot [39, 177]. Az irodalmi adatok szegényesek arra vonatkozóan, hogy a RS esetek hány százaléka mutat valódi klonális evolúciót a megelozo B-CLL-bol, és hány százalékban alakul ki de novo a B-CLL mellett. Kevés olyan tanulmány létezik, amely a klonalitás kérdését nukleotid szekvencia elemzéssel közelíti meg [273], a közlemények foleg citogenetikai vizsgálatokra és Southern blot eredményekre szorítkoznak [19, 82]. Ezek a tanulmányok arra utalnak, hogy a RS az esetek 50-60%-ban valódi klonális evolúció során fejlodik ki a megelozo B-CLL-bol [19, 82, 90]. A B-CLL esetek 50-60%-ában a B-sejtek az IgV régióban szomatikus mutációkat hordoznak, 40-50%-uk nem tartalmaz mutációkat [105]. Kérdéses, hogy az IgV régióban a mutációk jelenléte va gy hiánya B-CLL-ben hajlamot jelent-e lymphoma transzformációra. Az erre vonatkozó legfrissebb tanulmány szerint valódi klonális evolúció csak szomatikus mutációkat nem hordozó B-CLL eseteknél valósul meg [273].

V.5. A Richter-szindrómában eloforduló genetikai zavarok A legtöbb indolens B-sejtes NHL a lymphomagenezis jelenleg elfogadott elvei szerint leginkább az apoptotikus folyamatok zavarával jellemezheto [35]. A lymphocyták hiperproliferációja az agresszív lymphomák velejárója, ami számos esetben a másodlagosan bekövetkezo genetikai zavaroknak tudható be [152]. Ezek a másodlagos genetikai zavarok különbözo indolens B-sejtes NHL progresszióját egyaránt jellemezhetik, függetlenül azok entitásától [133, 175, 293]. Fontos megjegyezni, hogy ezek a másodlagos genetikai zavarok RS-ban attól függetlenül is megjelenhetnek, hogy történt-e megelozo kemoterápiás kezelés a lymphoma indolens fázisában [122, 199]. A RS-ban észlelt kromoszomális szintu genetikai zavarok gyakran komplex módon nyilvánulnak meg: a 12. kromoszóma triszómiája kombinálódhat 11q23, 13q14, 17p13 delécióval, vagy 14q expanzióval [31, 36, 108, 231]. A 11q23 deléció esetenként de novo DLBL-ben is megfigyelheto, de RS gyakrabban alakul ki azokban a B-CLL-ben szenvedo betegekben, akiknél ez a kromoszóma-deléció kimutatható [153, 299]. A 12. kromoszóma

- 18 -

triszómiája egyedüli eltérésként vagy egyéb kromoszomális zavarokkal együtt jelenhet meg RS-ban [31, 108, 109]. A citogenetikai vizsgálatok eredményei megerosítették azt a feltételezést, hogy a B-CLL-ben detektálható komplex kariotípus-eltérések nagyobb valószínuséggel vezetnek RS-hoz, mint a kromoszomális eltérések hiánya, vagy a 12. triszómia önmagában [108]. A p53 tumorszuppresszor gén inaktivációja a legtöbb indolens lymphoma progressziójának velejárója [47, 57, 194]. A sejtet ért stresszhatások esetén a p53 fehérje egy sor sejtélettani változást indít el, melyek végeredményben leállítják a sejtciklust vagy apoptózist váltanak ki [115]. Hatásának egyik fontos elemeként represszálja a ciklin B1 gént, és aktiválja a p21 tumorszuppresszor gént, melynek terméke gátolja a CDK1 ciklindependens kinázt. A gátló hatás miatt elmarad a CDK1 és a ciklin B1 kapcsolódása, ami megakadályozza a sejtek átlépését a sejtciklus G1/S és G2/M ellenorzo pontjain [270]. Ezek alapján úgy tunt, hogy a p53 inaktivációja a lymphoma progresszió megértésének a kulcsát képezheti. A p53 inaktiválódása azonban már a B-CLL stádiumban is bekövetkezhet, és nem feltétlen velejárója a RS-nak sem [74, 85, 177]. A p53 inaktiváció mellett a p16INK4A gén inaktiválódása is kapcsolatba hozható a RS kialakulásával [215]. A p16 fehérje a CDK4 és CDK6 enzimek regulatorikus alegységeihez kapcsolódva inaktiválja a ciklin D / CDK4/6 komplex hatását a G1/S határvonalon, ami a sejtciklus leállításához vezet [121]. A p27 fehérje expressziójának megszunése szintén a RS kialakulásához kötheto [45]. A p27 hatékonyan képes kapcsolódni a ciklin D / CDK4, valamint a ciklin E / CDK2 komplexhez, és azok funkcióját gátolva fékezo hatást fejt ki a sejtciklusra [216, 276]. A p27 hatását egérmodellekben is sikerült bizo nyítani: a p27 gén kiesése lehetové tette a másodlagos genetikai zavarokat felhalmozó sejtek „szökését” a sejtciklus kontrollja alól, ami a kísérleti állatokban agresszív daganatok kialakulásához vezetett [208]. A p27 gén kiesése RS -ban megfelel a hisztológiailag agresszív lymphomákban tapasztalható funkcióvesztésnek [40, 218, 237, 242]. Ezeknek a kísérleteknek az eredményei arra utalnak, hogy a p27 sejtciklust fékezo hatása alól felszabadult sejtek újra osztódhatnak, és egyéb

genetikai zavarokat

halmozhatnak

fel,

amelyek

hozzájárulhatnak

a

RS

kialakulásához [45]. A C-MYC gén kópiaszámának növekedését [6], valamint az A-MYB gén expressziójának nagyfokú csökkenését [92] egyes RS esetekben szintén kimutatták.

- 19 -

Mindkét gén terméke a sejtdifferenciálódásban vesz részt, hiányuk felveti patogenetikai szerepüket a lympho ma transzformációban [199]. A B-CLL talaján kialakuló HL esetek jelentos részében kimutatható az EBV fertozés, megelozo - még a B-CLL-ben történt fertozés nélkül [213, 235]. Követéses vizsgálatok azt mutatják, hogy a B-CLL talaján kialakuló HL a klasszikus HL- nál rosszabb, de a DLBL típusú RS -nál jobb prognózisú [2].

- 20 -

VI. MIKROSZATELLITA SZEKVENCIÁK VI.1. A mikroszatellita szekvenciák genomiális szervezodése, funkciója A genetikai információ tárolásáért és átörökítéséért felelos kódoló DNS szekvenciák nagyfokú stabilitást és védettséget igényelnek a genomban. Ezzel szemben a genom nagyobb részét alkotó, részben ismétlodo szekvenciákba rendezodött nem kódoló örökítoanyag bizonyos mértéku instabilitást mutat, a genom dinamikus részét képezi. A mikroszatelliták

a

genomban

szétszórtan

elhelyezkedo,

2-6

bázispár

tandem

ismétlodéseibol felépülo DNS szakaszok [220]. Átlagosan 30 kilobázisonként fordulnak elo, egyedspecifikusak és általában stabilan öröklodnek [29, 220, 238]. Habár a szatellita DNS-ek minden organizmusban megtalálhatók, funkciójuk még nem teljesen tisztázott. Prokarióta szervezetekben - úgy tunik - szerepet játszhatnak különbözo gének ki-be kapcsolásában, ily módon lehetové teszik a változó környezethez való célirányos alkalmazkodást [76, 191]. Magasabb rendu szervezetekben a mikroszatellitákat érinto változások befolyásolhatják a génexpressziót és a mRNS érést, ami fenotípusbeli megnyilvánuláshoz vezethet [165]. Protektív szerepük azonban a kromoszómavégek kódoló szekvenciáinak replikáció alatti védelmében kimerül [18]. Ismertebb a mikroszatelliták különbözo betegségekkel való asszociációja. Az egyes nukleotid egységek felhalmozódása megnöveli a kromoszómaszakaszok közti homológ rekombináció esélyét, megteremtve ezzel transzlokációk, deléciók és inverziók lehetoségét [56, 99, 220]. Számfeletti mikroszatellita amplifikációk fordulhatnak elo DNS replikációs hibaként fragilis-X

szindrómában,

myotóniás

dystrophiában,

Huntington-kórban és egyéb

neurodegeneratív kórképekben [8, 52, 267].

VI.2. A mikroszatellita instabilitás és a mismatch repair gének Az utóbbi évtizedben számos genetikai zavart tártak fel humán daganatos kórképekben. A különbözo genetikai zavarok négy nagyobb csoportba oszthatók: apró

- 21 -

DNS szekvencia változások (ide tartoznak a pontmutációk, néhány nukleotidnyi DNS szakaszok deléciója vagy inszerciója, mikroszatelliták hosszbeli változásai), kromoszómák számbeli eltérései, kromoszóma-transzlokációk, és génamplifikációk [161]. Korai megfigyelések szerint bizonyos sporadikus colorectalis tumorokban, illetve herediter nonpolyposis colorectalis carcinomában (HNPCC) a tumoros szövetekben vizsgált mikroszatellita szekvenciák hossza eltér az ép szövetben levo, megfelelo mikroszatelliták hosszától [1, 129, 272]. Ezt a jelenséget azóta a szakirodalomban MSI- nak nevezik [24]. A MSI egy mutációs folyamat eredményét jelenti a DNS-ben, ami inszerciók vagy deléciók képében jelenik meg [68]. In vitro tanulmányok bebizonyították, hogy a MSI molekuláris mechanizmusát a két DNS szál egymás melletti elcsúszása képezi a replikáció alatt, lehetové téve így a mikroszatelliták hosszának megváltozását [245]. A MSI jelenségérol szóló korai beszámolók egyike sem vetette fel a DNS repair rendszerek szerepét a MSI hátterében. Strand és munkatársai voltak az elsok, akik feltételezték, hogy a MSI defektív MMR kapcsán alakulhat ki. Megfigyeléseik szerint a MSI kimutatható volt olyan baktériumokban és gombákban, melyek defektív mutS illetve mutL géneket hordoztak [265]. Az emlos MMR rendszer evolúciós szempontból konzerválódott, a bakteriális MMR rendszerhez hasonló [188], de annál komplexebb mechanizmus. Feladata a DNS replikáció alatt esetlegesen bekövetkezo pontmutációk és az apró (1-4 bp hosszú) inszerciók vagy deléciók felismerése és kijavítása. Míg prokarióta szervezetekben csak három fehérje alkotja a MMR rendszert (mutS, mutH, mutL), jelenleg kilenc olyan humán DNS repair gén ismert, melyek mutáció okozta inaktivációja MSI megjelenéséhez vezet: ezek a hMSH2, hMSH3, hMSH4, hMSH5, hMSH6 (MutS homológok), valamint a hMLH1, hMLH3, hPMS1 és a hPMS2 (MutL homológ) gének [188, 192]. Emlosökben a MMR elso lépéseként a replikációs hibát az MSH2-MSH6 (MutS? ), vagy az MSH2-MSH3 (MutS? ) fehérjék ismerik fel, melyek a hibásan párosodott bázisok számától függoen alkotnak egymással komplexet [66, 88, 103, 285] (4. ábra). Az MSH2-MSH6, illetve az MSH2 MSH3 fehérjekomplexekhez a továbbiakban MutL homológ fehérjék: MLH1-PMS2 (MutL? ), MLH1-PMS1

(MutL? ), vagy

MLH1-MLH3

(MutL?)

fehérjekomplexek

kapcsolódnak. Ezek közül a MutL? komplex egyaránt képes a MutS? és a MutS? komplexekhez kapcsolódni. A két fehérjekomplex interakciója szükséges a MMR további

- 22 -

lépéseinak aktivációjához [81, 289]. A MMR késoi enzimatikus folyamatai a hibás nukleotidot tartalmazó DNS-szál meghatározott szakaszának kihasítását és újraszintézisét jelentik. Ezeknek a folyamatoknak a pontos mechanizmusa még nem teljesen ismert, azonban az EXO1 exonukleáz és a DNS-szintézishez szükséges PCNA (proliferáló sejt mag-antigén) képes kapcsolódni az MLH1, MSH2, MSH3 és az MSH6 fehérjékhez [43, 80, 246, 279] és elképzelheto, hogy a két fehérje szükséges a repair folyamat befejezéséhez.

A Hibás bázispárok felismerése MutS homológokkal

B MutL homológok kapcsolódása a MutS homológokhoz

C DNS hasítás és szintézis 4. ábra: Az emlos mismatch repair korai lépéseinek folyamatábrája A: Az MSH2-MSH6 fehérjekomplex csak 1 bázispárra, az MSH2 -MSH3 komplex 1-4 bázispárra kiterjedo hibás bázispárosodást ismer fel. B: A MutS homológ fehérjékhez MutL homológ fehérjék kapcsolódnak, melyek szükségesek a MMR késoi lépésihez. C: A MMR késoi lépései során a hibás nukleotidokat tartalmazó DNS-szál meghatározott szakasza kihasad és újjátermelodik. Ezeknek a folyamatoknak a részletei még nem teljesen ismertek.

A MSI és a MMR gének funkcionális elégtelensége közötti kapcsolatot több tanulmány is igazolta [65, 274, 291]. Mivel a mikroszatelliták genomszerte megtalálhatók, változásaik, mint mutációs változások bárhol a genomban megjelenhetnek, daganatos megbetegedésekhez társulhatnak vagy azoknak lehetséges okozóivá válhatnak [29]. A MutS és a MutL repair gének humán homológjainak mutációit egyaránt sikerült kimutatni HNPCC-ben szenvedo betegekben [30, 158]. Biokémiai elemzések szerint MSI-t mutató daganatos szövetekben hiányzott a MMR aktivitás [210, 284]. A MMR génekre nullzigóta transzgén

egerekben

kísérletesen

MSI-t

és

daganatképzodést

lehetett

eloidézni

emésztorendszeri, hám-, és lymphoid szövetekben [53, 67, 217, 224, 225]. További

- 23 -

vizsgálatok eredményei szerint a MSI túlnyomóan endodermális eredetu tumorokra: colon[1, 129, 272], oesophagus- [182], gyomor- [42], tüdo- [252], endometrium- [32] és hólyagtumorokra [95] jellemzo, és egyes esetekben kedvezobb prognózissal társul [29]. A mikroszatelliták hosszbeli változásai nemcsak tumoros megbetegedésekhez társulhatnak [8]. A CCG és CAG tripletek ismétlodésébol álló mikroszatelliták hossza az öröklodés során generációról generációra növekedhet, és egy adott küszöbérték elérése után neurodegeneratív kórképeket vagy mentális retardációt válthat ki. Ezt a fajta mutációs mechanizmust az irodalomban DiE- nak nevezik [227]. A DiE csak az elobb említett mikroszatellitákat érinti, és jellemzo vonása, hogy a kérdéses mikroszatellita növekedése az egymást követo generációkban a kórkép korábbi életkorban és súlyosabb formában való megnyilvánulásához vezet (anticipáció) [267]. A MSI a mikroszatellitákat általánosan érinti, és nem jellemzo rá az anticipáció, kérdéses azonban, hogy a MMR enzimek hiánya képes-e MSI mellett DiE-t is eredményezni. Huntington-kórban és MMR-defektusra visszavezetheto colorectalis tumorokban szenvedo betegek különbözo mikroszatellitalókuszainak vizsgálata azzal az eredménnyel zárult, hogy a két kórkép patomechanizmusa valószínuleg eltér egymástól [91]. MMR-defektív és ép MMR rendszerrel rendelkezo sejtekben a CAG és CCG trinukleotid mikroszatelliták mesterséges destabilizálására irányuló kísérletek megerosítették ezt a feltételezést. A CAG és CCG mikroszatelliták hossza exogén kémiai mutagének hatására a muködo MMR-rendszertol függetlenül változott, ami arra utalt, hogy ez a fajta instabilitás nem a MMR rendszer zavarán alapszik [75]. A MSI hátterében a mismatch repair gének hibás muködése ugyan bizonyítottnak tunik, azonban míg egyes tumorokban, mint például a HNPCC-ben az esetek 90%-ában kimutatható a MSI [192], addig az ismert MMR gének mutációi csak körülbelül 50%-ban bizonyíthatók; sporadikus tumorok esetében ez az arányszám még kisebb [89, 155]. Felteheto, hogy egyes esetekben a mismatch repair gének nem mutációk vagy deléciók hatására

inaktiválódnak,

hanem

epigenetikai

hipermetilációján keresztül [130].

- 24 -

módosulással,

a

promoter

szakasz

VII. DNS METILÁCIÓ VII.1. A metilált DNS szekvenciák szervezodése a genomban A DNS metilációja egyike azon epigenetikus módosulásoknak, melynek eredményeképpen a gének expressziós mintázata anélkül változik, hogy eltérések keletkeznének a bázissorrendjükben [253]. Eukariótákban a DNS metilációja egy metilcsoport kapcsolódását jelenti a citozin pirimidingyurujének 5. szénatomjához [13]. A reakciót a DNS-metiltranszferáz enzimek katalizálják (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b) az 5’CG-3’ dinukleotidoknál (CpG dinukleotidok) [23]. Muködésük alapvetoen szükséges az egyedfejlodéshez [204]. Gerincesekben a CpG dinukleotidok 70-80%-a fiziológiásan metilált [3]. Ezek a metilált régiók alapvetoen a késon replikálódó DNS-ben fordulnak elo, nukleoszomális konfigurációjuk és hisztonösszetételük folytán transzkripciós faktorok számára hozzáférhetetlenek [271]. Ezzel szemben a genomban léteznek átlagosan 100 kilobázisonként ismétlodo, 0.5-5 kilobázisnyi szakaszok, ún “CpG szigetek”, melyekben a CpG dinukleotidok halmozottan fordulnak elo (C+G > 50%) és nem metiláltak. A CpG szigeteknél a kromatin erosen acetilált, nem tartalmaz H1 hiszton fehérjéket és nem rendelk ezik nukleoszomális felépítéssel. Valószínu, hogy ez a nyitott kromatin konfiguráció lehetové teszi a transzkripciós faktorokkal való interakciót [49, 271].

VII.2. DNS metiláció és transzkripció gátlás Irodalmi adatok szerint az összes humán gén fele tartalmaz CpG szigeteket a promoter régióban [3]. Ezeknek a géneknek több mint fele szövettípustól függetlenül expresszálódó,

ún.

fenntartó

jellegu

(„housekeeping”)

gén,

40%-uk

azonban

szövetspecifikus gén. Ép szöveti viszonyok között a promoter régiók CpG szigetei nem metiláltak, függetlenül az adott gén transzkripciós aktivitásától. Ez alól kivételt képeznek az inaktív X kromoszóma át nem íródó génjei [12]. A CpG szigetekkel nem rendelkezo

- 25 -

szövetspecifikus gének promoterei változó mértékben metiláltak, a metiláció foka általában fordítottan arányos az adott gén aktivitásával [22, 37]. A promoter DNS metilációja in vitro transzfekciós kísérletekben képes megakadályozni különbözo gének átíródását [223]. Egyes esetekben ezt in vivo végzett tanulmányok is alátámasztották: csirke AEV sejteket demetiláló ágenssel, 5-aza-2’deoxycitidinnel (5-azaC) kezelve a sejtekben jelenlevo virális gének demetilálódtak, és így aktiválódtak [101]. Bár a DNS metiláció transzkripciót gátló hatásának pontos mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, három különbözo mechanizmus feltételezheto. Egyes transzkripciós faktorokról kimutatták, hogy képtelenek promoter szakaszokhoz kapcsolódni, ha azok metilált CpG dinukleotidokat tartalmaznak [268]. Egy másik feltételezett

mechanizmus

szerint

a

promoterek

metilált

CpG

dinukleotidjaihoz

metilcitozin-köto fehérjék kapcsolódnak (MeCP-1, Me CP-2), melyek megakadályozzák a transzkripciós faktorok kötodését a promoter szakaszokhoz [27, 200]. Ugyanakkor az is elképzelheto, hogy az erosen metilált DNS olyan kromatinstruktúrát vesz fel, ami lehetetlenné teszi a transzkripció iniciációját [230]. Ezt a feltételezést transzfekciós kísérletekkel igazolták: gazdasejtekbe bevitt idegen, nem metilált DNS a gazdasejt genomjának nyitott, DNáz-I emésztésre érzékeny kromatinjába integrálódik, míg metilált DNS szakasz bevitele esetén az idegen DNS a gazdasejt kondenzált kromatin-régióiban mutatható ki, ami DNáz-I emésztésre nem érzékeny [138, 142].

VII.3. A mismatch repair gének DNS metiláció általi inaktivációja tumoros szövetekben A DNS metiláció zavarait tumoros szövetekben régóta az onkogenezis egyik lehetséges alternatív útjaként tartják számon. Számos me gfigyelés utalt arra, hogy daganatos sejtekben megemelkedik a DNS-metiltranszferáz enzimek aktivitása, genomiális szinten az össz- metiláció csökken, ugyanakkor a CpG szigetek hipermetilálódnak [13, 253]. Ennek megfeleloen több adat is utal arra, hogy rosszindulatú daganatos szövetekbe n több tumorszuppresszor gén inaktiválódik a promoter szakasz CpG szigeteinek kóros hipermetilációja miatt. A Rb gén mellett a VHL, p16, p15 gének promoter-hipermetiláció

- 26 -

miatti

inaktiválódását

vesecarcinomában

is

[118],

leírták

retinoblastomában

különbözo

szolid

[100,

tumorokban

239], [119]

világos és

sejtes

hematológiai

kórképekben: akut és krónikus myeloid leukémiában (AML, CML), akut lymphoid leukémiában (ALL), B-sejtes NHL-ban, MM-ban [41, 44, 63]. A szakirodalomban “mutátor gének”- nek is nevezett hMLH1 és hMSH2 mismatch repair gének promoter- hipermetiláció okozta inaktiválódását több daganatos betegségben is megfigyelték. Mindkét gén promoter szakaszán található CpG sziget, melynek kóros metilációja transzkripciós inaktivitást eredményez [55, 70]. A hMLH1 gén epigenetikus inaktiválódását leírták colorectalis tumorokban [5, 96, 120, 197, 226], endometriális carcinomában [69, 70], gyomor carcinomában [78, 147, 240], AML-ben [247], emlorákban [195], kis sejtes tüdorákban [290], cholangiocarcinomában [166], valamint a fej-nyaki régió laphámrákjaiban [167]. Megfigyelések szerint azokban a tumoros szövetekben, melyekben a hMLH1 gén promotere hipermetilálódott, nagyfokú MSI-t lehetett detektálni, ugyanakkor a hMLH1 génrol készült mRNS illetve fehérje nem, vagy csak igen csökkent mértékben volt kimutatható [79, 135]. A hMLH1 gén promoter-hipermetiláció okozta inaktiválódása és a MSI közti összefüggést az is bizonyítja, hogy ha

daganatos sejteket 5-azaC-nal

kezeltek, nemcsak normalizálódott a hMLH1 fehérje szintje, de az funkcionálisan is aktív volt, biokémiai próbákon mismatch repair aktivitást mutatott [120].

- 27 -

VIII. A MIKROSZATELLITA INSTABILITÁS ÉS A MISMATCH REPAIR GÉNEK SZEREPE HEMATOLÓGIAI MALIGNITÁSOKBAN Bár a genetikai instabilitás t leginkább endodermális eredetu szövetek tumoraiban sikerült kimutatni

[29], a MSI-t, mint a genetikai instabilitás egyik

jellemzo

megnyilvánulási formáját több tanulmány is elemezte különbözo lymphoproliferatív, illetve myeloproliferatív kórképekben. Annak ellenére, hogy non-Hodgkin lymphomákban a MSI meglehetosen ritka jelenség [86, 232, 287], számos tény egyértelmuen azt sugallja, hogy különbözo hematopoetikus tumorok patogenezise, klonális evolúciója és klinikai progressziója során megjelenhet. Myeloid és lymphoid tumorokon, illetve tumoros sejtvonalakon végzett vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy a MSI sokkal inkább a lymphoid tumorok kialakulásához kötheto, nem pedig a myeloid vonal daganataihoz [127, 154]. Tény, hogy a krónikus lymphoproliferatív megbetegedések – köztük az érett lymphoid sejtek heterogén tumorainak jellemzo molekuláris biológiai eltérései az egyéb hematológiai tumorokra is jellemzo bcl-1, bcl-2 és bcl- 6 gének átrendezettsége, valamint a C-MYC és Ras gének mutációi [4, 113, 175, 296]. Ezek az eltérések nem egy esetben speciális transzlokációkat jelentenek, melyek egymástól távol eso gének juxtapozícióját eredményezve protoonkogének kóros aktivációjához és új fúziós fehérjék megjelenéséhez vezetnek [170]. A kóros transzlokációk hátterében felmerül a genetikai instabilitás jelensége. A genetikai instabilitás valóban megfigyelheto follicularis lymphomában (FL) [221], MALTlymphomában [212], AIDS-hez kapcsolódó lymphomában [16], CLL-ben [87], akut T- és B-sejtes leukémiában [127]. Hematológiai tumorokban - egyéb daganatos kórképekhez hasonlóan - a MSI hátterében a MMR gének csökkent vagy hiányzó aktivitása feltételezheto. A hMLH1 gén esetleges defektusait elsoként Hangaishi és munkatársai vizsgálták PCR-SSCP módszerrel 43 humán leukémia és lymphoma sejtvonalon. Eredményeik szerint csak három lymphoid leukémia sejtvonal tartalmazott genetikailag sérült hMLH1 gént; mindhárom esetben a gén 9. exonjában, vagy annak exon- intron kapcsolódási régiójában megjeleno mutációk miatt fordult elo hMLH1 protein diszfunkció. Ezeket az eseteket részletesebben tanulmányozva a

- 28 -

szerzok 4 mikroszatellita lókuszt vizsgáltak, s a lókuszok mindegyikén hosszúságbeli eltéréseket: expanziót vagy kontrakciót találtak az ismétlodo szekvenciákban [111]. Egyéb források szerint MSI-t mutató hematológiai daganatokban a hMLH1 gén mellett a hMSH2, hPMS2 és hMSH6 repair gének kóros expressziója is elofordulhat [102, 127]. A MMR hiányának jelensége hematológiai tumorokban egérkísérletekkel is bizonyítható. Az MSH2, MSH6, PMS2 és MLH1 knock-out (-/-) egerek markáns MSI-t mutatnak, és viszonylag rövid ido alatt lymphomák alakulnak ki bennük [53, 65, 67, 224, 225]. Érdekes módon a különbözo repair gének expressziójának izolált, teljes hiánya eltéro szövettani típusú tumorok megjelenését okozhatja. PMS2-/- egerekben csak lymphomák alakulnak ki, ugyanakkor az MLH1-/- egerekben a lymphomák mellett bélrendszeri daganatok is megjelennek [217]. Ezen túlmenoen az MLH1-/- egerekben a mikroszatellitákat érinto mutációs ráta 2-3-szor magasabbnak mutatkozott, mint a PMS2 -/- egerekben. A mindkét génre nullzigóta egerek fenotípusa megegyezett az MLH1 -/- egerek fenotípusával, alátámasztva azt a feltételezést, hogy az MLH1 gén expressziójának teljes hiánya önmagában elégséges ahhoz, hogy a MMR aktivitást megszüntesse [297]. Hematológiai tumorokban a MMR gének epigenetikai inaktiválódására vonatkozó szakirodalmi adatok szegényesek és ellentmondóak. AML-ben a hMLH1 gén promoterének hipermetilációja Toyota és munkacsoportja szerint nem detektálható, bár tanulmányukban nem vizsgálták a MSI jelenségét [277]. Frissebb adatok viszont arra utalnak, hogy elsosorban idosebb, AML-ben szenvedo betegeknél a MSI hátterében a hMLH1 és hMSH2 gének promoterének hipermetilációja alacsony százalékban ugyan, de kimutatható [163, 247, 249]. Ezekkel az adatokkal élesen szemben áll Siu és munkatársainak megfigyelése: NK sejtes tumorokban a hMLH1 gén promoterének hipermetilációját a vizsgált esetek 6163%-ában kimutatták [254, 255]. A hMLH1 gén promoter szakaszának hipermetilációja kimatatható mycosis fungoidesben [244] és a MALT-lymphoma egyes eseteiben is [136]. Viszonylag frissebb kutatási eredmények szerint a MSI nemcsak különbözo lymphoid daganatok patogeneziséhez kapcsolható, hanem azok progressziójához is. Ez a lehetoség merült fel idoskori T-sejtes leukémia (ATL) vizsgálata során: a MSI elsosorban azoknál a betegeknél jelentkezett, akik az ATL akut típusától szenvedtek és rosszabb prognózist

mutattak [116]. Egy, a FL szövettani transzformációjának genetikai

- 29 -

vizsgálatával foglalkozó longitudinális tanulmány eredménye szerint MSI mutatható ki a kiindulási FL és a belole kialakult DLBL minták között, ugyanakkor a hMLH1 és hMSH2 génekben nem sikerült mutációkat azonosítani [196]. Bár mindkét tanulmány viszonylag kevés szövettani mintát vizsgált, eredményeik szerint a genetikai instabilitás helyt kaphat a hematológiai tumorok progressziójának mechanizmusában.

- 30 -

IX. CÉLKITUZÉSEK Tanulmányunkban a következo kérdésekre kerestünk választ: 1.

A B-CLL Richter-transzformációja együtt jár-e a mikroszatelliták hosszbeli eltéréseit is eloidézo genetikai instabilitással?

2.

Kimutatható-e a B-CLL Richter-transzformációja alatt strukturális eltérés a hMLH1 és hMSH2 mismatch repair génekben?

3.

Kimutatható-e a hMLH1 gén promoter szakaszán kóros hipermetiláció?

4.

Létezik-e korreláció a B-CLL transzformációja során a MSI, és a MMR gének expressziójának

strukturális

és/vagy

(megszunése) között?

- 31 -

epigenetikai

alapú

csökkenése

X. ANYAG ÉS MÓDSZER X.1. Szövettani minták Tanulmányunkhoz tizenkilenc beteg szövettani mintapárjait használtuk, akiknél a Joan and Sanford I. Weill Medical College illetve a Semmelweis Egyetem I. Sz. Patológiai és

Kísérleti

Rákkutató

Intézetében

B-CLL-t,

illetve

DLBL-t

diagnosztizáltak.

Vizsgálatainkhoz molekuláris biológiai kísérletek végzésére alkalmas fagyasztot biopsziás mintákat, illetve vérmintákat használtunk. A szövettani diagnózis hisztopatológia i, immunfenotípus

és

immungenotípus

vizsgálatokon

alapult

a

WHO

lymphoma

klasszifikációjának megfeleloen [112]. Tíz betegnél (1-10 eset) a második biopsziás minta szövettana megegyezett az elso minta szövettani vizsgálatának eredményével. Kilenc betegnél (11-19 eset) a második mintavételbol származó nyirokcsomó minták a DLBL hisztológiai képének megfelelo elváltozást mutattak (1. táblázat).

X.2. DNS izolálás Genomikus DNS-t natív szövetmintákból telített NaCl felhasználásával, kisózásos módszerrel nyertünk [185]. A fagyasztott metszeteket mag- lízispufferben (10 mM TrisHCl, 400 mM NaCl és 2 mM EDTA) szuszpendáltuk, melyhez proteináz-K oldatot (1 mg proteináz-K, 1% SDS és 2 mM EDTA) adtunk. Ezt követoen az elegyet egy éjszakán át 37°C-on emésztettük, 2 percig telített NaCl oldattal rázattuk, majd 20 percen át 2500 rpm fordulatszámon centrifugáltuk. A felülúszóból a DNS-t 2-szeres térfogatú abszolút alkohollal csaptuk ki, majd a precipitátumot kétszer mostuk 70%-os etanolban. A DNS koncentrációját 260 nm hullámhosszon határoztuk meg fotométer (Gene Quant II, Cambridge, UK) segítségével. A DNS tartalom meghatározása után a mintákat TE pufferben (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA) 4°C-on tároltuk. A genomikus DNS preparálása vérmintákból a fehérvérsejtek Histopaque -ágyon (Sigma, St. Louis, MO) grádiens centrifugálással történt izolálását követoen az elobb leírtaknak megfeleloen történt.

- 32 -

______________________

__________________________________________

Esetszám

Minta

Biopszia Biopszia Szövettani dátuma helye kép _________________________ ______________________________________ 1

A B A B

91-04-03 92-03-25 89-11-09 89-11-13

PV LGL PV LGL

B-CLL DLBL B-CLL DLBL

A B A B A B

86-02-07 86-06-10 89-01-05 89-01-11 91-04-04 92-05-27

PV LGL PV LGL PV LGL

B-CLL DLBL B-CLL DLBL B-CLL DLBL

A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B

91-08-23 91-09-26 88-10-28 88-10-26 95-11-17 95-11-17 97-08-25 97-08-25 98-03-18 02-04-09 99-05-20 02-04-11 02-01-14 02-04-08 02-01-02 02-04-22 99-11-29 02-04-18 02-02-25 02-04-25 02-01-31 02-06-04 00-12-12 02-07-04 99-06-22 02-07-05 99-12-03 02-07-06

PV LGL PV LGL PV LGL PV LGL LGL PV LGL PV PV PV LGL PV LGL PV PV PV LGL PV LGL PV LGL PV LGL PV

B-CLL DLBL B-CLL DLBL B-CLL DLBL B-CLL DLBL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL B-CLL

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

________________________________

_

______________________________

1. táblázat: A vizsgált 19 beteg klinikai adatai Kilenc betegnél (1-9 eset) a B-CLL a második biopsziás mintavételnél DLBL-be progrediált, tíz betegnél (10-19 eset) nem mutatkozott progresszió. Rövidítések: B-CLL, krónikus lymphocytás leukémia; DLBL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma; PV, perifériás vér; LGL, nyirokcsomó.

- 33 -

X.3. A biopsziás mintapárok klonalitásának igazolása A vizsgált betegektol származó biopsziás minták klonalitásának elemzése céljából az IgH variábilis régiójának (VH) 3. komplementaritást meghatározó szakaszát (CDR3) vizsgáltuk polimeráz láncreakcióval (PCR). A vizsgálathoz az IgH 3. „framework” régiójának (FR3) konszenzus szekvenciáira tervezett degenerált sense primert (5’- ACA CGG C[C/T][G/C] TGT ATT ACT GT -3’), és univerzális antisense primert használtunk (5’- ACC TGA GGA GAC GGT GAC C -3’), amit az IgH variábilis régiójának kapcsolási (joining) részére terveztek (JH) [177]. A PCR reakciók 25 ? l végtérfogatban, 100 ng DNS templát, 10 pM sense és antisense primer, 320 ?M dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH=8, 1 mM MgCl2 , 1 U Taq polimeráz jelenlétében zajlottak. A Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR készülékben végzett reakciók optimális körülményei a következok voltak: denaturálás 94°C-on 1 percig, annealing 57°C -on 1 percig, extenzió 72°C-on egy percig, 30 cikluson keresztül. Negatív kontrollként minden reakciósorozathoz reaktív nyirokszövetbol izolált DNS-t használtunk templátként. Az amplifikálást követoen a polimeráz láncreakció termékeinek detektálása etidium-bromidot tartalmazó 2%-os agarózgél-elektroforézissel történt. Abban az esetben, ha a vizsgált DNS monoklonális sejtpopulációból származott, diszkrét DNS csíkok megjelenése volt várható 70-120 bázispár magasságában. Ha egy adott beteg mindkét biopsziás mintájából amplifikált PCR termékek azonos hosszúságot mutattak (azonos magasságban helyezkedtek el a gélben), az az IgH génátrendezodés egyezésére, a két minta klonális kapcsolatára utalt.

X.4. Mikroszatellita instabilitás vizsgálatok A mikroszatellita szekvenciák analíziséhez nyolc, különbözo kromoszómaszakaszra specifikus mikroszatellita markert választottunk ki: 5 dinukleotid szekvenciát (DCC, D6S262, D3S1261, D3S1262, MYC), egy trinukleotid markert (AR) és két tetranukleotidot (ACTB2 és FGA). Minden mikroszatellita génszakaszt PCR technikával amplifikáltunk. A primerek szekvenciáinak kiválasztásához a Genome Data Bank (GDB, Baltimore, MD)

- 34 -

adatain alapuló, Integrated DNA technologies (Corallville, IA) szekvenciáit használtuk (2. táblázat).

Mikroszatellita

Lokalizáció

DCC

18. kromoszóma

D6S262

6. kromoszóma

D3S1261

3. kromoszóma

D3S1262

3. kromoszóma

MYC

8. kromoszóma

AR

X kromoszóma

ACTBP2

6. kromoszóma

FGA

4. kromoszóma

Primer Szekvencia 5’ GATGACATTTTCCCTCTAGA 3’ 5’ TTTAGTGGTTATTGCCTTGAA 3’ 5’ ATTCTTACTGCTGGAAAACCAT 3’ 5’ GGAGCATAGTTACCCTTAAAAATC3’ 5’ GGCAAGTTAGGTGGCAGAAG 3’ 5’ TTGGTGAAATGGGAGC 3’ 5’ CCAGTTTTTATGGACGGGGT 3’ 5’ CGGCCCTAGGATATTTTCAA 3’ 5’ CCTGAGTAGCTGTTAAGGGA 3’ 5’ GCACATGTACCCTAGAACTT 3’ 5’ TCCGCGAAGTGATCCAGAAC 3’ 5’ CTTGGGGAGAACCATTCTCA 3’ 5’ AATCTGGGCGACAAGAGTGA 3’ 5’ ACATCTCCCCTACCGCTATA 3’ 5’ CCATAGGTTTTGAACTCACAG 3’ 5’ CTTCTCAGATCCTCTGACAC 3’

Annealing homérséklet

Ref. szám

55°C

[260]

58°C

[256]

55°C

[259]

58°C

[256]

55°C

[228]

62°C

[287]

58°C

[287]

58°C

[287]

2. táblázat: A vizsgált mikroszatellita markerek adatai A kísérleteinkben használt mikroszatellita markereket az idézett tanulmányok eredményei alapján választottuk ki.

A PCR reakciók kivitelezéséhez 25 ? l végtérfogatban 100 ng DNS templátot használtunk, 1 illetve 2 mM MgCl2 , 10 pM primer, 320 ? M dNTP, 1? Ci [? - 32 P] dCTP, 1 U Taq polimeráz jelenlétében. A reakc iók 30 cikluson keresztül Perkin-Elmer 2400 GeneAmp amplifikátorban zajlottak, a következo paraméterek szerint: denaturálás (1 perc, 94°C), annealing (1 perc; a homérsékletek értékei a különbözo primerpároknak megfeleloen az 2. táblázatban találhatók) és extenzió (1 perc, 72°C). A PCR termékeket 1:10 arányban 1%-os SDS oldatban meghígítottuk, majd 3 ? l mennyiséget 3 ? l puffer jelenlétében (95% formamid, 20 mmol EDTA, 0.05% brómfenolkék, 0.05% xyléncianol) 10 percig 94°C-on denaturáltunk. A denaturált PCR termékeket 6%-os denaturáló poliakrilamid-TBE gélben 1500 volt feszültségen, 70 watt teljesítménnyel, a hosszúságuktól függoen 2-4 órán át futtattuk. A géleket 30 percig 10%-os ecetsavban fixáltuk, megszárítottuk, majd mínusz 70°C-on röntgenfilmre exponáltuk (5. ábra).

- 35 -

sense primer

Tumorsejtek

antisense primer

DNS izolálás

PCR amplifikáció [? 32 P] jelenlétében

Értékelés

Autoradiográfia

Poliakrilamid gélelektroforézis

5. ábra: A mikroszatellita analízis módszerének vázlata A mikroszatellita markerek amplifikálása a tumorsejtekbol izolált DNS mintákból megfelelo primerpárok segítségével PCR technikával, radioaktív izotóp jelenlétében történt. A PCR termékek poliakrilamid gélben történo futtatását az autoradiográfiás felvételek értékelése követte.

X.5. A hMLH1 és a hMSH2 gén vizsgálata „Single Strand Conformation Polymorphism” (PCR-SSCP) módszerrel

A hMLH1 gén PCR-SSCP vizsgálatát öt exonon végeztük el (9., 11., 14., 15. és 16. exon), amelyeket korábban közölt mutációs vizsgálatok eredményei alapján választotunk ki [107, 111]. A hMSH2 gén esetében a PCR-SSCP analízis a cDNS 2020-2225 nukleotid pozíciójában történt, a genomikus DNS intront/exont tartalmazó „flanking” régiójának megfeleloen [77] (3. táblázat). A hMLH1 és hMSH2 gének PCR-SSCP vizsgálata korábban közzétett módszereknek megfeleloen történt [77, 107]. Az egyes PCR termékekbol 3 ? l-t 10 ? l pufferben (95% formamid, 20 mmol EDTA, 0.05% brómfenolkék, 0.05% xyléncianol) vettünk fel. Az így elkészített keverékbol tíz perces hodenaturálás és gyors hutés után 2-3 ? l mennyiséget vittünk fel a natív 6%-os poliakrilamid-TBE gélre. A mintákat 200 volt feszültségen, 5-10 watt teljesítménnyel, 12-16 órán keresztül elektroforetizáltuk. A géleket 10%-os ecetsavban fixáltuk, majd szárítás után mínusz 70°C on röntgenfilmre exponáltuk.

- 36 -

Mismatch repair gén

Lokalizáció 9. Exon 11. Exon

hMLH1

14. Exon 15. Exon 16. Exon

hMSH2

2025-2225 nukleotid

Primerszekvencia 5’ GCTTCAGAATCTCTTTTCTAAT 3’ 5’ GTGGATTTCCCATGTGGTTC 3’ 5’ TCTAAGGTAATTGTTCTCTCTTA 3’ 5’ AAGTAGCTGGATGAGAAGCG 3’ 5’ TTGGTAGGATTCTATTACTTACC 3’ 5’ GTAGTAGCTCTGCTTGTTCAC 3’ 5’ AACTGGTTGTATCTCAAGCATG 3’ 5’ GATATTAGTGGAGAGCATCTAT 3’ 5’ CTTCATGTTCTTGCTTCTTCC 3’ 5’ CAGAAGTATAAGAATGGCTGTC 3’ 5’ CGCGATTAATCATCAGTG 3’ 5’ GGACAGAGACATAGATTTCTATG 3’

Annealing homérséklet 55°C 58°C 55°C 58°C 55°C 62°C

3. táblázat: A hMLH1 és hMSH2 mismatch repair gének PCR-SSCP vizsálatához használt primerek adatai

X.6. A hMLH1 gén promoter-metiláció vizsgálata A hMLH1 gén promoterének metilációs állapotát korábban publikált útmutatások szerint, speciális restrikciós endonukleázok felhasználásával, PCR technikán alapuló vizsgálattal mértük fel a genomiális DNS-ben [135]. A promoter –670. és –67. nukleotid közötti szakaszának bázisösszetétele megfelel a CpG sziget kritériumainak [49]. Az általunk használt HpaII és MspI restrikciós endonukleázok a –567., -527., -347., -341. pozícióban levo nukleotidoknál hasítják a DNS-t. Kísérleteinkben 250 ng genomiális DNSt 20 ? l összmennyiségben a gyártó cég által biztosított pufferben külön reakciókban 16 órán át emésztettünk HpaII és MspI enzimekkel (New England Biolabs, Beverly, MA). A különkülön emésztett DNS-bol 12,5 ng mennyiséget használtunk a PCR reakciókhoz. A PCR reakciókban a hMLH1 gén promoter szakaszát a –670. és –67. pozícióban levo nukleotidok között megfelelo primerpárral amplifikáltuk (sense MLH1-27494: 5’- CGC TGC TAG TAT TCG TGC –3’ és antisense MLH1-25266: 5’- TCA GTG CCT CGT GCT CAC –3’), a következo paraméterek szerint: denaturálás (94°C, 45 másodperc), annealing (56°C, 45 másodperc), extenzió (72°C, 45 másodperc), összesen 30 cikluson át. A PCR termékeket 2%-os, etidium-bromidot tartalmazó agarózgélen futtattuk (6. ábra).

- 37 -

sense p.

antisense p.

Tumorsejtek

DNS izolálás

Emésztés restrikciós endonukleázokkal

PCR amplifikáció

Értékelés

Agaróz elektroforézis

6. ábra: A hMLH1 gén promoter-metiláció vizsgálata A tumorsejtekbol izolált DNS-t izoschizomer restrikciós endonukleázokkal hasítva a kérdéses célszekvencia csak akkor amplifikálható PCR technikával, ha a használt enzimek közül a DNS-metilációra érzékeny enzim (HpaII), nem emésztette a DNS-t. Amennyiben a DNS célszekvencia nem tartalmaz metilált felisemerési motívumokat, a PCR amplifikáció nem kivitelezheto a DNS templát enzimatikus darabolódása miatt.

A genomikus DNS HpaII enzimmel való emésztését követo PCR-amplifikáció után diszkrét csíkok megjelenése 604 bázispár magasságában akkor várható, ha az enzim hasítási helyein a DNS-ben a citozinok eredetileg metiláltak. PCR termék nem jöhet létre, ha a vizsgált promoter szakasz nem hipermetilált; ebben az esetben a HpaII enzim által okozott törések a DNS-ben megakadályozzák a megfelelo hoszúságú termék kialakulását. Az MspI enzim hasítási sajátságaiból fakadóan a vele emésztett genomikus DNS vizsgálata során a kérdéses promoter szakasz nem amplifikálható, az MspI enzim ugyanis metilált palindroma szekvenciákra nem érzékeny és minden esetben hasítja a DNS-t (7. ábra). Ennek megfeleloen használata kísérleteink negatív kontrollját jelentette. Nem metilált DNS HpaII

CCGG GGCC

MspI CCGG GGCC

Metilált DNS HpaII

CCGG GGCC MspI CCGG GGCC

- 38 -

7. ábra: A HpaII és MspI restrikciós endonukleázok hasítási sajátságai A HpaII enzim metilációra érzékeny és csak akkor képes emészteni a DNS-t, ha a felismert szakaszon a citozin nem metilált. Az MspI enzim metilációra nem érzékeny, minden esetben hasítja a felismert szekvenciát. Az ábrán csillag jelképezi a citozin pirimidingyurujén a metilcsoportot.

XI. EREDMÉNYEK XI.1. Klonális kapcsolat a biopsziás mintapárok között A tanulmányunkban vizsgált összes szövettani mintában monoklonális IgH génátrendezodést tapasztaltunk. Az ugyanattól a betegtol nyert két-két biopsziás minta DNS-ében minden esetben azonos IgH génátrendezodés volt kimutatható, ami a tumorminták közös klonális eredetére utal.

XI.2. Mikroszatellita analízis A B-CLL és a megfelelo DLBL mintapárokból minden esetben párhuzamosan amplifikáltuk a nyolc mikroszatellita markert. Instabilnak véleményeztünk egy lókuszt, ha a B-CLL-bol és a transzformált DLBL-bol származó DNS minták PCR termékeinek elektroforetikus migrációja különbözo mintázatot mutatott. Egyértelmuen MSI- nak nyilvánítottuk azokat az eseteket, ahol a DLBL-bol származó PCR termékek migrációja során egy vagy több új migrációs csík megjelenését tapasztaltuk a neki megfelelo B-CLLbol származó PCR termékekhez képest. Allélvesztést (loss of heterozygosity, LOH) azoknál az eseteknél állapítottunk meg, ahol az elektroforézis során a B-CLL-bol származó PCR termékek több migrációs csíkot mutattak, mint a DLBL-bol származó PCR termékek (8. ábra). A mikroszatellita analízis során nyert adatokat a 4. táblázat tartalmazza. A CTBP2

A

B

FGA

A

B

DCC

A

AR

B

A

D6S262

B

A

B

D3S1262

A

B

D3S1261

A

B

MYC

A

B

8. ábra: A mikroszatellita szekvenciák analízisének reprezentatív eredménye Az ábra a mikroszatellita vizsgálat eredményeit mutatja 9. számmal jelzett betegnél a B-CLL (A) és transzformált DLBL (B) biopsziamintákon. MSI figyelheto meg az ACTBP, FGA, DCC, MYC markereknél. Allélvesztés (LOH) történt az AR és D6S262 markereknél. A D3S1262 és D3S1261 markerekben nem történt változás a B-CLL progressziója során.

- 39 -

Esetszám

ACTBP2

FGA

DCC

AR

D6S262

D3S1262

D3S1261

MYC

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 4. táblázat: A mikroszatellita analízis eredményeinek összefoglaló táblázata A táblázat a mikroszatellita markerek vizsgálatának eredményeit mutatja a 19 vizsgált betegnél: az 1-9 betegnél a második szövettani minta a B-CLL DLBL-be történo transzformációját mutatta, a 10-19 betegnél nem történt szövettani transzformáció. A vizsgált mikroszatellita markerek neveit a táblázat elso sora tartalmazza. A táblázat szürke téglalapjai MSI-t, fekete téglalapjai LOH-t jelölnek. Üresen hagytuk a téglalapot, ha az adott beteghez tartozó két biopsziás mintában nem találtunk különbséget a párhuzamosan vizsgált mikroszatellita lókuszokban.

A vizsgált mikroszatellitákban összesen öt eltérést találtunk annál a tíz betegnél, akinél a B-CLL nem mutatott progressziót a második biopsziás mintában: négy esetben MSI, egy esetben LOH jelentkezett. Három esetben (11., 12., és 18. eset) egy, egy esetben (10. eset) két markernél találtunk eltéréseket. Annál a kilenc betegnél, akinél a B-CLL a második mintában szövettani transzformációt mutatott, összesen 28 eltérést mutattunk ki a vizsgált mikroszatellita lókuszokon a biopsziás mintapárok között. Tizenkilenc esetben MSI-t, kilenc esetben LOH-t detektáltunk. Egy esetben (5. eset) egy, két esetben (2. és 4. eset) három, egy esetben (3. eset) négy, egy másik esetben (8. eset) öt, két esetben (1. és 9.

- 40 -

eset) pedig hat mikroszatellita lókuszon jelentkeztek eltérések a lymphoma progressziója során. Két beteg esetében (6. és 7. eset) a B-CLL és a DLBL mintákban vizsgált mikroszatellita markerek nem mutattak eltérést. Mivel a tanulmányunkban vizsgált betegektol nem állt rendelkezésünkre nem tumoros DNS minta, továbbra is kérdéses marad, hogy mikroszatellita markereket érinto genetikai eltérések elofordulnak-e már a B-CLL stádiumban is, vagy csak a tumorprogresszió során jelennek meg.

XI.3. A hMLH1 és a hMSH2 gén PCR-SSCP vizsgálata A hMLH1 és hMSH2 gének PCR-SSCP vizsgálatát tizenkilenc beteg biopsziás mintáin végeztük el. Az elso és második biopszia során nyert mintákat minden esetben párhuzamosan vizsgáltuk. Kontroll mintaként reaktív nyirokszövetbol izolált DNS-t használtunk. A PCR-SSCP vizsgálatok során minden esetben a kontroll mintához hasonló migrációs mintázatot találtunk, ami alátámasztja annak a valószínuségét, hogy a hMLH1 és hMSH2 gének nukleotid szintu eltérései nem detektálhatók sem B-CLL-ben, sem annak transzformált, DLBL változatában (9. ábra). N

7A

7B

8A

8B

9A

9B

18A

18B

19A

19B

9. ábra: A hMLH1 gén 16. exonján végzett PCR-SSCP vizsgálat reprezentatív eredménye Az amplifikált DNS-szekvenciák migrációs mintázata a nem transzformált B-CLL - B-CLL (18-19 eset), és szövettanilag transzformált B-CLL - DLBL (7-9 eset) mintapárokon belül megegyezik, ugyanakkor a negatív kontroll mintához képest egyik mintában sem mutatkozik eltérés. Rövidítések: N, negatív kontroll; A, a vizsgált betegbol eloször nyert biopsziás minta; B, ugyanabból a betegbol nyert második biopsziás minta.

- 41 -

XI.4. A hMLH1 gén promoter-metiláció vizsgálata A hMLH1 gén promoterén a CpG dinukleotidok metilációs állapotának felmérésére PCR reakciókat végeztünk a biopsziás mintákból izolált DNS minták HpaII illetve MspI enzimmel történt emésztése után. A PCR kísérletek kiértékelése minden beteg esetében párhuzamosan történt a két biopsziás mintának megfeleloen. A vizsgálat reprezentatív eredményeit a 10. ábra szemlélteti. 6A (B-CLL) L

N

H

6B (DLBL) M

N

H

2A (B-CLL) M

N

H

2B (DLBL) M

N

H

M

10. ábra: A hMLH1 gén promoter -metiláció analízisének reprezentatív eredménye A 2. és 6. számmal jelzett beteg B-CLL és DLBL mintáinak vizsgálati eredménye. A 2A és a 2B mintából nyert DNS templáttal végzett PCR reakció HpaII-emésztés után a nem emésztett DNS-nek megfelelo terméket eredményezett. Ez a DNS templát metilációját jelentette a HpaII enzim felismerési szekvenciáinál. A 6A és a 6B mintából nyert DNS HpaII enzimmel történo emésztése a DNS feldarabolódásához és sikertelen PCR amplifikációhoz vezetett, ami a DNS templát metilációjának hiányára utalt. Rövidítések: A, a vizsgált betegbol eloször nyert minta; B, a vizsgált betegbol másodszor nyert minta; L, DNS-létra; N, nem emésztett DNS minta; H, HpaII-emésztett DNS minta; M, MspI enzimmel emésztett DNS minta.

A nem emésztett DNS mintákon végzett PCR amplifikáció eredménye minden esetben a várakozásnak megfelelo 604 bázispár hosszúságú termék volt. Öt esetben (1.-3. és 8.-9. eset) a B-CLL és a megfelelo DLBL mintából izolált DNS-ben a hMLH1 promoter régió csak MspI enzimmel volt emésztheto, a HpaII enzim képtelen volt hasítani a vizsgált szekvenciát, amit sikeres PCR reakcióval lehetett kimutatni. A szövettani transzformációt nem mutató eseteknél (10.-19. eset), valamint négy esetben, ahol a B-CLL szövettanilag progrediált (4.-7. eset), a hMLH1 promoter szakasza mindkét restrikciós endonukleázzal (HpaII, MspI) emésztheto volt, ami a DNS templát feldarabolódását és PCR reakció

- 42 -

eredménytelenségét vonta maga után. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hMLH1 gén promoter szakaszán a vizsgált régióban (a -670. és –67. pozícióban levo nukleotidok között) a CpG dinukleotidok metilált állapotban voltak az 1.-3., 8. és 9. beteghez tartozó BCLL és a megfelelo DLBL mintákban, nem voltak viszont metilált állapotban a 4.-7. és 10.19. számmal jelölt betegnél. A vizsgálat összesített eredményét az 5. táblázat tartalmazza.

Esetszám

B-CLL

DLBL

1 2 3 4 5 6 7 8 9

+ + + + +

+ + + + +

Esetszám

B-CLL

B-CLL

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

-

-

5. táblázat: A hMLH1 gén promoter-metiláció vizsgálati eredménye A hMLH1 gén promoter szakasz -67. és -670. nukleotid közötti régiójának vizsgálata minden beteg esetében párhuzamosan történt a két szövettani mintából nyert DNS-en. Rövidítések: B-CLL, krónikus lymphocytás leukémia; DLBL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma; +, hipermetilált; -, nem metilált promoter szakasz.

- 43 -

XII. MEGBESZÉLÉS A genetikai instabilitás valójában nem egy adott, statikus jellemzoje a tumorsejteknek. Sokkal inkább azt jelzi, hogy egy tumoros sejtpopulációban a bekövetkezo mutációk gyakorisága mennyiben tér el a megfelelo ép sejtek spontán mutációs rátájától. A genetikai instabilitás vizsgálatánál figyelembe kell venni, hogy a daganatos sejtekben észlelheto mutációk magasabb prevalenciája gyakran egyéb tényezoknek is tulajdonítható. Egy daganatos sejtpopuláció környezete - melyet részben maguk a daganatos sejtek alakítanak ki - legtöbbször eltér a fiziológiástól, és a módosult környezetben a sejt-sejt, illetve sejt-szubsztrát kölcsönhatások is eltérhetnek a normálistól. Ennek megfeleloen nem zárható ki, hogy egy daganatban és a megfelelo ép szövetben esetleg hasonló a sejtek mutációs rátája, és a spontán mutációs ráta csupán az eltéro környezet miatt szelektív növekedési elonyt jelenthet a daganat számára [161]. Ugyanakkor az is elképzelheto, hogy ugyana z a mutáció egészséges sejtekben apoptózist indukál, a tumoros sejtekben pedig inkább a tumor evolúciójához járul hozzá. A Ras onkogénrol például kimutatták, hogy különbözo körülmények között képes egymással ellentétes, proapoptotikus vagy antiapoptotikus jelátviteli folyamatokat is beindítani [140]. Mindazonáltal a kóros környezet daganat-elosegíto hatását jelenleg nehéz vizsgálni, mert legtöbbször lehetetlen in vitro létrehozni a megváltozott környezet pontos mását. A B-CLL hisztológiai transzformációjához és klinikai progressziójához kapcsolódó molekuláris

biológiai

mechanizmusok

feltárása

kulcslépés

lehet

a

lymphoma

patogenezisének megértésében csakúgy, mint a diagnózis fellállításában, a kezelésben és a prognózis meghatározásában. Tanulmányunkban arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a B-CLL progresszióját milyen mértékben kíséri a mikroszatelliták hosszbeli eltéréseiben megnyilvánuló genetikai instabilitás. Vizsgálatunkhoz olyan, B-CLL-ben szenvedo betegek biopsziás mintáit használtuk, akiknél a követési ido alatt a kórkép szövettani megjelenése nem változott, vagy adott esetben DLBL-be transzformálódott. A biopsziákból származó DNS minták nyolc mikroszatellita markerbol álló panellel történt átfogó vizsgálata MSI-t tárt fel tízbol három olyan esetben, ahol a B-CLL nem mutatott progressziót, illetve kilencbol hét esetben azoknál a betegeknél, akiknél a kezdeti B-CLL a második biopsziás

- 44 -

mintavétel idopontjára DLBL-be transzformálódott. A MSI mértéke is különbözo volt a két betegcsoportban: míg a transzformációt nem mutató eseteknél maximálisan két markerben jelentkeztek eltérések, addig a RS-ba progrediált eseteknél az instabilitást mutató markerek száma egytol négyig terjedt. Colorectális tumorokban megegyezés szerint nagymértékben instabilnak tartják azokat az eseteket, ahol a vizsgált mikroszatellita markerek több, mint 30-40%-ában jelentkezik MSI, és alacsony fokú MSI-t véleményeznek, ha az instabilitást mutató markerek aránya nem éri el a 30-40%-ot [24]. Ha ezt a definíciót vesszük alapul, akkor eredményeink szerint na gyfokú MSI jelentkezett a Richter transzformációt mutató kilenc eset közül négyben, ugyanakkor ilyen mértéku MSI-t nem mutattunk ki egyetlen olyan esetben sem, ahol a B-CLL nem progrediált. Bár a szakirodalom szerint a MSI meglehetosen ritka jelenség különbözo B-sejtes lymphomákban és B-CLL-ben [86, 87, 243, 287], tanulmányunk bizonyosságot szolgáltat a MSI jelenségérol a B-CLL-ben; ugyanakkor

valószínunek

tunik,

hogy

a

MSI

inkább

a

B-CLL

szövettani

transzformációjához járul hozzá, nem pedig a kórkép kialakulásához. Megfigyeléseink összhangban állnak más tanulmányok eredményeivel, melyek szerint a MSI gyakran jelentkezik egyes hematopoetikus tumorok – mint például CML, FL, MALT-lymphoma – progressziója, illetve szö vettani transzformációja során [196, 260, 288]. Érdekes módon ezek a megfigyelések nem érvényesek különbözo ectodermális eredetu malignitásokra: különféle gliasejtes tumorokban (glioblastomában, anaplasztikus oligodendrogliomában és anaplasztikus astrocytomában) úgy tunik, a MSI inkább a tumor kialakulásához, nem pedig a progressziójához vagy kiújulásához kötheto [94]. A genetikai instabilitás egyik elkülönült megjelenési formája a LOH, amely különbözo tumorszuppresszor gének inaktivációját vonhatja maga után. A vizsgált RS-s minták közül öt esetben összesen kilenc mikroszatellita lókusznál volt kimutatható LOH. Ezzel szemben a szövettani transzformációt nem mutató B-CLL esetek közül csak egyetlen esetben találtunk LOH-t egyetlen mikroszatellita markernél, ami szintén azt támasztja alá, hogy a genetikai instabilitás hozzájárulhat a lymphoma progressziójához és szövettani transzformációjához. Az a tény, hogy a LOH különösebb predispozíció nélkül, elszórtan jelentkezett különbözo lókuszoknál, arra utal, hogy a B-CLL transzformációjáért nem egyetlen gén hibája, hanem egyszerre több gén együttes zavara teheto felelossé. Ezt a

- 45 -

feltevést látszanak igazolni azok az újabb komparatív genomikus hibridizációs (CGH) vizsgálatok, melyek B-CLL-bol kialakult DLBL mintákban több kromoszómát (13., 17p, 8p, 11q, 14q) is érinto DNS állomány elvesztésérol számolnak be [15]. Herediter és sporadikus szolid tumorokban szoros összefüggést mutattak ki a MSI és a MMR gének strukturális zavarai között [77, 111]. Annak érdekében, hogy felmérjük a Richter transzformációban jelentkezo MSI és a MMR génekben esetlegesen bekövetkezo genetikai zavarok közötti összefüggést, a hMLH1 és hMSH2 gének leggyakrabban mutációt szenvedo exonjait vizsgáltuk PCR-SSCP módszerrel. Ez a módszer az egyes szálú DNS-ben jelentkezo mutációk kimutatására alkalmas szenzitív és specifikus eljárás [178]. A két MMR gén általunk vizsgált szakaszain strukturális elváltozást nem tudtunk kimutatni. Eredményeink összhangban állnak egy másik, AML-ben és CML-ben szenvedo betegek körében végzett tanulmánnyal, mely szerint a kórképek kialakulása és progressziója során a hMLH1 gén egyetlen exonjában sem mutatható ki mutáció [10]. Jelenleg széles körben elfogadott, hogy a MMR gének nemcsak az exonjaikban bekövetkezo mutációk, vagy allélvesztésük miatt inaktiválódhatnak, hanem epigenetikai módosulással is: a promoter szakasz kóros hipermetilációja miatt [120]. Tanulmányunkban választ kerestünk arra a kérdésre is, hogy a RS kialakulása kapcsán a nagyfokú MSI-t mutató esetek hátterében igazolható-e a hMLH1 gén promoterének hipermetilációja. A hMLH1 gén promoteréne k hipermetilációját tapasztaltuk öt szövettani progressziót mutató esetben, a B-CLL és a belole kialakuló DLBL mintákban egyaránt. A szövettanilag nem transzformálódó esetekben nem tudtunk hipermetilációt kimutatni a hMLH1 gén promoterén. Továbbra is nyitott kérdés marad, hogy a hMLH1 gén promoterét érinto hipermetiláció a lymphoma transzformációjának speciális velejárója-e, vagy csak egy nem specifikus megnyilvánulása a tumoros szövetekben a különbözo gének promoterén megfigyelheto hipermetilációnak. Az ezzel kapcsolatos közlemények az EphA3, p15INK4b, p16INK4a, p73 és a DAP-kináz gének hipermetilációját említik lymphomákban és leukémiákban, ami alapján úgy tunik, hogy inkább nem specifikus metilációs aktivitásnövekedésrol van szó, semmint célirányos hipermetilációról [11, 62, 139, 141, 215]. Az EphA3 gén egy receptor tirozin kinázt kódol, amely fontos szerepet játszik az embryogenezisben, expressziója szövettanilag és idoben egyaránt behatárolt. Eloször egy

- 46 -

pre-B-sejtes leukémia sejtvonalban azonosították (LK63), de érzékeny módszerekkel kimutatható a thymus lymphocytáiban és a csontveloben is [26]. További vizsgálatok alapján úgy tunik, csak bizonyos pre-B és T-sejtes sejtvonalakban expresszálódik in vitro, és azokban a sejtvonalakban, ahol nem expresszálódik, a promoter szekvenciája eroteljesen hipermetilált. A lymphomagenezisben betöltött szerepe továbbra sem tisztázott [62]. A p73 gén a p53- hoz hasonló szerkezetu tumorszuppresszor fehérjét kódol, mely DNS-köto doménnal, transzaktivációs és oligomerizációs doménnal egyaránt rendelkezik. Fokozott expressziója képes apoptózist kiváltani p53 hiányában is a p21 ciklin-depend ens kinázinhibitor aktiválása révén [134]. ALL sejtvonalak 33%-ában a p73 expressziója DNS hipermetiláció miatt megszunik, növelve a daganat kialakulásának vagy progressziójának lehetoségét [141]. A DAP -kináz gén terméke egy szerin-treonin specifikus fehérje-kináz, amely szükséges a ?-interferon (?-IFN) mediált apoptózishoz. Egy átfogó tanulmány szerint a DAP-kináz a Burkitt-lymphomák 100%-ában, az egyéb vizsgált B-sejtes NHL-k 84%ában nem expresszálódik, a gén 5’ végének hipermetilációja miatt. Az egészséges perifériás B-sejtekben a DAP-kináz promotere nem metilált, tehát a gén promoter-hipermetiláció által történo inaktiválódása minden bizonnyal a daganatossá transzformált B-sejtek jellemzoje, amelyek ?-IFN hatására nem apoptotizálnak [139]. A p15 INK4b és p16INK4a gének ciklindependens kináz- inhibitorokat kódolnak, melyek a sejtciklus G1 fázisában a CDK4 enzimet gátolják, ezzel leállítva a sejtciklust. Mindkét gén promoterének hipermetilációját kimutatták a leggyakoribb lymphomákban. Jellemzo módon a promoter szakaszok hipermetilációja jóval gyakoribb volt az agresszív („high-grade”) lymphoma entitásoknál, mint azok békésebb válfajainál: DLBL-ben és a FL centroblasztos fo rmájánál nagyobb mértéku volt a promoter hipermetiláció, mint B-CLL-ben, marginális zóna lymphomában, vagy a FL centrocytás formájában [11]. A DNS hipermetilációja alapvetoen a tumorigenezis kezdeti lépéseihez kötheto. Ezt a feltevést támasztják alá azok a megfigyelések, amelyek a hMLH1 promoter hipermetilációját a gyomor-, endometrialis-, és colorectalis carcinoma korai fázisára teszik, még a tumor propagációja elotti szakaszra [69, 78, 79]. A hMLH1 promoter hipermetilációja a B-CLL és az abból kialakult DLBL mintákban arra utal, hogy a DNS metiláció zavarai a B-CLL bizonyos eseteiben már a korai stádiumban kialkulhatnak, és

- 47 -

végigkísérhetik a tumor klonális evolúcióját. Az öt esetbol, ahol a hMLH1 promoter hipermetilációját kimutattuk a B-CLL és a megfelelo DLBL mintákban, négy esetben a DLBL mintákban nagyfokú MSI-t tapasztaltunk az eredeti B-CLL mintákhoz képest. Habár a tanulmányunkban használt, hisztológiai transzformációt szenvedett B-CLL-es betegek nem tumoros szövettani mintái nem voltak elérhetoek és így kérdéses maradt, hogy a MSI bekövetkezhetett-e még a B-CLL szövettani transzformációja elott, eredmé nyeink azt sugallják, hogy a MSI iniciációját a hMLH1 gén promoterének hipermetilációja nagymértékben elosegíti. A vizsgálatunkban detektált MSI, LOH és hMLH1 promoter hipermetiláció fényében úgy tunik, több olyan onkogenetikus útvonal létezik, amely hozzájárulhat a BCLL Richter transzformációjához. A hMLH1 gén promoterének hipermetilációja B-CLLben és a következményes MSI kialakulása a DLBL-ben kétségkívül egyike lehet azoknak a molekuláris mechanizmusoknak, melyek bizonyos esetekben szerepet játszanak a RS kialakulásában. Tanulmányunkban nem vizsgáltuk a MSI és a daganatok terápiája közti összefüggést, sem a MSI esetleges prognosztikai jelentoségét. Az ezzel kapcsolatos adatok nagymértékben ellentmondóak. Jelenleg úgy tunik, hogy azoknál a colorectális tumoroknál, ahol a MSI kimutatható, a proximális lokalizációjú daganatok jobb prognózisúak (5 éves túlélés 100%), mint a disztálisan jelentkezo daganatok (5 éves túlélés 74%). Ezzel szemben a genetikailag stabil colon tumorok esetében a statisztika fordított eredményt mutat: a proximális szakasz tumorai rosszabb prognózisúak, mint a disztális szakasz tumorai (5 éves túlélés 21%, illetve 57%) [132]. Ezek az eredmények nehezen magyarázhatók. Azoknál a betegeknél, akiknél a daganatos sejtekben a MSI kimutatható, felvetették az apoptózis szerepét mint gátló tényezot a daganat növekedésében [250]. Az is ismert tény, hogy a MSI-t mutató colorectalis tumorok mellett a colonban gyakran Crohn-szeru morfológiai elváltozások jelentkeznek, valószínuleg a tumor által provokált immunválasz miatt. Elképzelheto, hogy egy ilyen immunreakció korlátozhatja a tumor progresszióját, és öszességében jobb prognózist jelent [97], azonban egyik magyarázat sem ad választ arra, hogy miért van jelentos különbség a különbözo colon szakaszokon fellépo daganatok esetében [132]. A pancreas endokrin daganatainál a MSI és a hMLH1 promoter

- 48 -

hipermetilációja szintén jobb prognózist jelent, és hosszabb túlélési idot valószínusít [124]. Ezzel szemben emlorákban szenvedo betegeknél a MSI általában elorevetíti a daganat kemoterápiára való rezisztenciáját, összességében rossz prognózist és rövidebb túlélési idot jelent [294]. Összetett a kapcsolat a MMR és a daganatok kemoterápiája között is. In vitro és in vivo tanulmányok egyaránt kimutatták, hogy az ép MMR rendszer szükséges egyes DNS károsító ágensek citotoxikus hatásának kifejtéséhez (ilyen anyagok például az N- metil-N’nitro-N-nitrozoguanidin, vagy az N-metil-N-nitrozourea). Ezek az anyagok képesek a DNS bázisait módosítani, és hibás bázispárokat létrehozni. A MMR rendszer a hibás bázispárokat felismerve végsosoron DNS-töréseket generál, amelyek az ATM, p53, p73 géneket aktiválva elindítják az apoptózis folyamatát. Ezek alapján a MMR-deficiens tumorok rezisztenciát mutathatnak DNS-károsító anyagokra [20]. MSI-t mutató daganatokban a kemoprofilaxis hatásának felmérésére is történtek próbálkozások. Egy tanulmány azzal a meglepo eredménnyel járt, hogy hMLH1-re, hMSH2-re, illetve hMSH6-ra defektív colorectalis tumoros sejtvonalakban a MSI markánsan csökkent aszpirin hatására [236]. Természetesen ezek még nagyon korai megfigyelések, amelyek tová bbi klinikai vizsgálatokkal történo kiegészítése a jövoben várható. A MSI, a MMR-defektusok és a kóros DNS metiláció tumorképzodésben betöltött szerepe komplex, és különbözo daganattípusokban eltéro lehet. Jelen tanulmányunk arra szolgáltat bizonyítékot, hogy: 1)

A B-CLL Richter transzformációja során nagyobb mértéku MSI figyelheto

meg, mint nem transzformálódott B-CLL esetekben; 2)

A tapasztalt MSI nem a MMR gének strukturális genetikai változásának

következménye, hiszen a hMLH1 és a hMSH2 génekben egy esetben sem mutattunk ki genetikai eltérést; 3)

A

fellépo

MSI

oka

valószínuleg

a

hMLH1

gén

promoterének

hipermetilációja és a MMR rendszer ebbol fakadó elégtelensége. A MMR rendszer károsodásából fakadó genetikai instabilitás patogenetikai tényezo lehet a B-CLL Richter transzformációja során.

- 49 -

XIII. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Ag: antigén ALL: akut lymphoid leukémia AML: akut myeloid leukémia A-MYB: transzkripciós faktort kódoló onkogén ATL: idoskori T sejtes leukémia ATM: „Ataxia teleangiectasia mutated”, szerin-threonin protein kinázt kódoló gén antisense: 3’ primer bcl-1: a 11-es kromoszómán kódolt onkoprotein bcl-2: a 18-as kromoszómán kódolt onkoprotein bcl-6: a 3-as kromoszómán kódolt onkoprotein CD: „cluster designation”, sejtdifferenciálódási immunológiai marker CDK: ciklin-dependens kináz CG: centrum germinativum CGH: komparatív genomikus hibridizáció B-CLL: B-sejtes krónikus lymphocytás leukémia CML: krónikus myeloid leukémia CH : az immunglobulin nehézlánc gén konzervatív szakasza C-MYC: transzkripciós faktort kódoló onkogén DAP kináz: „Death-associated protein kinase”, szerin-threonin protein kináz dCTP: dezoxi-citidinfoszfát DiE: dinamikus expanzió DLBL: diffúz nagy B-sejtes lymphoma Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b: DNS metiltranszferáz enzimek dNTP: dezoxi- nukleotidfoszfát dUTP: dezoxi- uridinfoszfát DNS: dezoxiribonukleinsav EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav EphA3 (HEK): receptor tirozin kináz

- 50 -

FL: follicularis lymphoma ?-IFN: gamma- interferon HCl: hidrogén-klorid hMLH: humán mutL homológ, mismatch repair géncsalád hMSH: humán mutS homológ, mismatch repair géncsalád hPMS: humán posztmeiotikus szegregáció, mismatch repair géncsalád HNPCC: herediter nem polipózus vastagbél tumor Ig: immunglobulin IgD: immunglobulin izotípus IgH:immunglobulin nehézlánc gén IgL: immunglobulin könnyulánc gén IgM: immunglobulin izotípus IgV: immunglobulin variábilis régiója JH : joining régió, az immunglobulin nehézlánc gén kapcsolódási szakasza kb: kilobázis Ki-67: sejtproliferációs marker LOH: „loss of heterozygosity”, allélvesztés MALT: nyálkahártya-asszociált lymphoid szövet MBR: major breakpoint region mcr: minor cluster region MMR: mismatch repair MSI: mikroszatellita instabilitás NaCl: nátrium-klorid SDS: nátrium-dodecil- szulfát NHL: non-Hodgkin lymphoma PCR: polimeráz láncreakció primer: próba, a vizsgált gén egy adott szakaszával komplementer szintetizált oligonukleotid p15INK4B: tumorszuppresszor gén p16INK4A: tumorszuppresszor gén

- 51 -

p53: tumorszuppresszor gén p73: a p53 családba tartozó tumorszuppresszor gén Ras: onkogén REAL: „Revised European-American” lymphoma klasszifikációs rendszer RNS: ribonukleinsav sense: 5’ primer SSCP: „single strand conformation polymorphism” Taq: Thermus aquaticus DNS polimeráz Tris-HCl: tris-(hidroximetil)-aminometán szabad bázisának és sójának keveréke U: nemzetközi egység VH : az immunglobulin nehézlánc gén variábilis szakasza VHL: „von Hippel- Lindau”, tumorszuppresszor gén WHO: World Health Organisation 5-azaC: 5-aza-2’-deoxycitidin, kémiai demetilálószer, Dnmt -blokkoló

- 52 -

XIV. IRODALOMJEGYZÉK 1.

2.

3. 4.

5.

6.

7. 8. 9.

10.

11.

12. 13.

Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin JP, Jarvinen H, Powell SM, Jen J, Hamilton SR et al: Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science, 1993. 260: 812-816. Alliot C, Tabuteau S, Desablens B: Hodgkin's disease variant of Richter's syndrome: complete remission of the both malignancies after 14 years. Hematology, 2003. 8: 229-231. Antequera F, Bird A: Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90: 11995-11999. Armitage JO, Sanger WG, Weisenburger DD, Harrington DS, Linder J, Bierman PJ, Vose JM, Purtilo DT: Correlation of secondary cytogenetic abnormalities with histologic appearance in non-Hodgkin's lymphomas bearing t(14;18)(q32;q21). J Natl Cancer Inst, 1988. 80: 576-580. Arnold CN, Goel A, Compton C, Marcus V, Niedzwiecki D, Dowell JM, Wasserman L, Inoue T, Mayer RJ, Bertagnolli MM, Boland CR: Evaluation of microsatellite instability, hMLH1 expression and hMLH1 promoter hypermethylation in defining the MSI phenotype of colorectal cancer. Cancer Biol Ther, 2004. 3: 73-78. Arranz E, Martinez B, Richart A, Echezarreta G, Roman A, Rivas C, Benitez J: Increased C-MYC oncogene copy number detected with combined modified comparative genomic hybridization and FISH analysis in a Richter syndrome case with complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet, 1998. 106: 80-83. Arzimanoglou II, Gilbert F, Barber HRK: Microsatellite instability in human solid tumors. Cancer, 1998. 82: 1808-1820. Ashely CT Jr, Warren ST: Trinucleotide repeat expansion and human disease. Annu Rev Genetics, 1995. 29: 703-728. Auer RL, Jones C, Mullenbach RA, Syndercombe-Court D, Milligan DW, Fegan CD, Cotter FE: Role for CCG-trinucleotide repeats in the pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 2001. 97: 509-515. Auner HW, Olipitz W, Hoefler G, Bodner C, Konrad D, Crevenna R, Linkesch W, Sill H: Mutational analysis of the DNA mismatch repair gene hMLH1 in myeloid leukaemias. Br J Haematol, 1999. 106: 706-708. Baur AS, Shaw P, Burri N, Delacretaz F, Bosman FT, Chaubert P: Frequent methylation silencing of p15(INK4b) (MTS2) and p16(INK4a) (MTS1) in B-cell and T-cell lymphomas. Blood, 1999. 94: 1773-1781. Baylin, SB: Tying it all together: epigenetics, genetics, cell cycle, and cancer. Science, 1997. 277: 1948-1949. Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM, Issa JP: Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv Cancer Res, 1998. 72: 141196.

- 53 -

14.

15.

16. 17.

18. 19. 20. 21.

22. 23. 24.

25.

26.

27. 28. 29.

Bayliss KM, Kueck BD, Hanson CA, Matthaeus WG, Almagro UA: Richter's syndrome presenting as primary central nervous system lymphoma. Transformation of an identical clone. Am J Clin Pathol, 1990. 93: 117-123. Bea S, Lopez-Guillermo A, Ribas M, Puig X, Pinyol M, Carrio A, Zamora L, Soler F, Bosch F, Stilgenbauer S, Colomer D, Miro R, Montserrat E, Campo E: Genetic imbalances in progressed B-cell chronic lymphocytic leukemia and transformed large-cell lymphoma (Richter’s syndrome). Am J Pathol, 2002. 161: 957-968. Bedi GC, Westra WH, Farzadegan H, Pitha PM, Sidransky D: Microsatellite instability in primary neoplasms from HIV + patients. Nat Med, 1995. 1: 65-68. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, Sultan C: Proposals for the classification of chronic (mature) B and T lymphoid leukaemias. French-American-British (FAB) Cooperative Group. J Clin Pathol, 1989. 42: 567-584. Bennett, P: Demystified ... microsatellites. Mol Pathol, 2000. 53: 177-83. Bessudo A, Kipps TJ: Origin of high-grade lymphomas in Richter syndrome. Leuk Lymphoma, 1995. 18: 367-372. Bignami M, Casorelli I, Karran P: Mismatch repair and response to DNA-damaging antitumour therapies. Eur J Cancer, 2003. 39: 2142-2149. Binet JL, Auquier A, Dighiero G, Chastang C, Piguet H, Goasguen J, Vaugier G, Potron G, Colona P, Oberling F, Thomas M, Tchernia G, Jacquillat C, Boivin P, Lesty C, Duault MT, Monconduit M, Belabbes S, Gremy F: A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer, 1981. 48: 198-206. Bird, A: The essentials of DNA methylation. Cell, 1992. 70: 5-8. Bird, A: DNA methylation de novo. Science, 1999. 286: 2287-2288. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidransky D, Eshleman JR, Burt RW, Meltzer SJ, Rodriguez- Bigas MA, Fodde R, Ranzani GN, Srivastava S: A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res, 1998. 58: 5248-5257. Bonato M, Pittaluga S, Tierens A, Criel A, Verhoef G, Wlodarska I, Vanutysel L, Michaux L, Vandekerckhove P, Van den BH, Wolf-Peeters C: Lymph node histology in typical and atypical chronic lymphocytic leukemia. Am J Surg Pathol, 1998. 22: 49-56. Boyd AW, Ward LD, Wicks IP, Simpson RJ, Salvaris E, Wilks A, Welch K, Loudovaris M, Rockman S, Busmanis I: Isolation and characterization of a novel receptor-type protein tyrosine kinase (hek) from a human pre-B cell line. J Biol Chem, 1992. 267: 3262-3267. Boyes J, Bird A: DNA methylation inhibits transcription indirectly via a methylCpG binding protein. Cell, 1991. 64: 1123-1134. Brecher M, Banks PM: Hodgkin's disease variant of Richter's syndrome. Report of eight cases. Am J Clin Pathol, 1990. 93: 333-339. Brentnall, TA: Microsatellite instability. Shifting concepts in tumorigenesis. Am J Pathol, 1995. 147: 561-563.

- 54 -

30.

31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38.

39.

40.

41. 42.

43.

44. 45.

46.

Bronner CE, Baker SM, Morrison PT, Warren G, Smith LG, Lescoe MK, Kane M, Earabino C, Lipford J, Lindblom A, et al: Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLH1 is associated with hereditary non-polyposis colon cancer. Nature, 1994. 368: 258-261. Brynes RK, McCourty A, Sun NC, Koo CH: Trisomy 12 in Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia. Am J Clin Pathol, 1995. 104: 199-203. Burks RT, Kessis TD, Cho KR, Hedrick L: Microsatellite instability in endometrial carcinoma. Oncogene, 1994. 9: 1163-1166. Caligaris-Cappio, F: B-chronic lymphocytic leukemia: a malignancy of anti-self B cells. Blood, 1996. 87: 2615-2620. Caligaris-Cappio F, Hamblin TJ: B-cell chronic lymphocytic leukemia: a bird of a different feather. J Clin Oncol, 1999. 17: 399-408. Capello D, Gaidano G: Molecular pathophysiology of indolent lymphoma. Haematologica, 2000. 85: 195-201. Catovsky, D: The search for genetic clues in chronic lymphocytic leukemia. Hematol Cell Ther, 1997. 39(Suppl 1): S5-11. Cedar, H: DNA methylation and gene activity. Cell, 1988. 53: 3-4. Cerroni L, Zenahlik P, Hofler G, Kaddu S, Smolle J, Kerl H: Specific cutaneous infiltrates of B-cell chronic lymphocytic leukemia: a clinicopathologic and prognostic study of 42 patients. Am J Surg Pathol, 1996. 20: 1000-1010. Cherepakhin V, Baird SM, Meisenholder GW, Kipps TJ: Common clonal origin of chronic lymphocytic leukemia and high-grade lymphoma of Richter's syndrome. Blood, 1993. 82: 3141-3147. Chiarle R, Budel LM, Skolnik J, Frizzera G, Chilosi M, Corato A, Pizzolo G, Magidson J, Montagnoli A, Pagano M, Maes B, De Wolf-Peeters C, Inghirami G: Increased proteasome degradation of cyclin-dependent kinase inhibitor p27 is associated with a decreased overall survival in mantle cell lymphoma. Blood, 2000. 95: 619-626. Chim CS, Liang R, Kwong YL: Hypermethylation of gene promoters in hematological neoplasia. Hematol Oncol, 2002. 20: 167-176. Chong JM, Fukayama M, Hayashi Y, Takizawa T, Koike M, Konishi M, KikuchiYanoshita R, Miyaki M: Microsatellite instability in the progression of gastric carcinoma. Cancer Res, 1994. 54: 4595-4597. Clark AB, Valle F, Drotschmann K, Gary RK, Kunkel TA: Functional interaction of proliferating cell nuclear antigen with MSH2-MSH6 and MSH2-MSH3 complexes. J Biol C hem, 2000. 275: 36498-36501. Claus R, Lubbert M: Epigenetic targets in hematopoietic malignancies. Oncogene, 2003. 22: 6489-6496. Cobo F, Martinez A, Pinyol M, Hernandez L, Gomez M, Bea S, Esteve J, Rozman M, Bosch F, Lopez-Guillermo A, Montserrat E, Campo E: Multiple cell cycle regulator alterations in Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 2002. 16: 1028-1034. Cofrancesco E, Baldini L, Ciani A, Neri A, Masini T, Chinaglia D, Cortellaro M: Evidence of clonal progression in a case of Richter syndrome. Cancer, 1993. 71: 741-744.

- 55 -

47.

48.

49. 50.

51.

52. 53.

54.

55.

56. 57.

58.

59.

60.

Cordone I, Masi S, Mauro FR, Soddu S, Morsilli O, Valentini T, Vegna ML, Guglielmi C, Mancini F, Giuliacci S, Sacchi A, Mandelli F, Foa R: p53 expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a marker of disease progression and poor prognosis. Blood, 1998. 91: 4342-4349. Cordone I, Matutes E, Catovsky D: Monoclonal antibody Ki-67 identifies B and T cells in cycle in chronic lymphocytic leukemia: correlation with disease activity. Leukemia, 1992. 6: 902-906. Cross SH, Bird AP: CpG islands and genes. Curr Opin Genet Dev, 1995. 5: 309314. Dabaja BS, O'Brien SM, Kantarjian HM, Cortes JE, Thomas DA, Albitar M, Schlette ES, Faderl S, Sarris A, Keating MJ, Giles FJ: Fractionated cyclophosphamide, vincristine, liposomal daunorubicin (daunoXome), and dexamethasone (hyperCVXD) regimen in Richter's syndrome. Leuk Lymphoma, 2001. 42: 329-337. Damle RN, Wasil T, Fais F, Ghiotto F, Valetto A, Allen SL, Buchbinder A, Budman D, Dittmar K, Kolitz J, Lichtman SM, Schulman P, Vinciguerra VP, Rai KR, Ferrarini M, Chiorazzi N: Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood, 1999. 94: 1840-1847. Davies S, Ramsden DB: Huntington's disease. Mol Pathol, 2001. 54: 409-413. de Wind N, Dekker M, Berns A, Radman M, te Riele H: Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell, 1995. 82: 321-330. Deane M, Norton JD: Preferential rearrangement of developmentally regulated immunoglobulin VH1 genes in human B-lineage leukaemias. Leukemia, 1991. 5: 646-650. Deng G, Chen A, Hong J, Chae HS, Kim YS: Methylation of CpG in a small region of the hMLH1 promoter invariably correlates with the absence of gene expression. Cancer Res, 1999. 59: 2029-2033. Dobkin C, Zhong N, Brown WT: The molecular basis of fragile sites. Am J Hum Genet, 1996. 59: 478. Döhner H, Fischer K, Bentz M, Hansen K, Benner A, Cabot G, Diehl D, Schlenk R, Coy J, Stilgenbauer S: p53 gene deletion predicts for poor survival and nonresponse to therapy with purine analogs in chronic B-cell leukemias. Blood, 1995. 85: 1580-1589. Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, Leupolt E, Krober A, Bullinger L, Döhner K, Bentz M, Lichter P: Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med, 2000. 343: 1910-1916. Döhner H, Stilgenbauer S, Döhner K, Bentz M, Lichter P: Chromosome aberrations in B-cell chronic lymphocytic leukemia: reassessment based on molecular cytogenetic analysis. J Mol Med, 1999. 77: 266-281. Döhner H, Stilgenbauer S, Fischer K, Bentz M, Lichter P: Cytogenetic and molecular cytogenetic analysis of B cell chronic lymphocytic leukemia: specific chromosome aberrations identify prognostic subgroups of patients and point to loci of candidate genes. Leukemia, 1997. 11(Suppl 2): S19-S24.

- 56 -

61.

62.

63.

64.

65.

66.

67.

68. 69.

70.

71.

72.

73. 74.

Döhner H, Stilgenbauer S, James MR, Benner A, Weilguni T, Bentz M, Fischer K, Hunstein W, Lichter P: 11q deletions identify a new subset of B-cell chronic lymphocytic leukemia characterized by extensive nodal involvement and inferior prognosis. Blood, 1997. 89: 2516-2522. Dottori M, Down M, Huttmann A, Fitzpatrick DR, Boyd AW: Cloning and characterization of EphA3 (Hek) gene promoter: DNA methylation regulates expression in hematopoietic tumor cells. Blood, 1999. 94: 2477-2486. Drexler, HG: Review of alterations of the cyclin -dependent kinase inhibitor INK4 family genes p15, p16, p18 and p19 in human leukemia-lymphoma cells. Leukemia, 1998. 12: 845-859. Ebeling SB, Schutte ME, Akkermans-Koolhaas KE, Bloem AC, Gmelig-Meyling FH, Logtenberg T: Expression of members of the immunoglobulin VH3 gene families is not restricted at the level of individual genes in human chronic lymphocytic leukemia. Int Immunol, 1992. 4: 313-320. Edelmann L, Edelmann W: Loss of DNA mismatch repair function and cancer predisposition in the mouse: animal models for human hereditary nonpolyposis colorect al cancer. Am J Med Genet C Semin Med Genet, 2004. 129: 91-99. Edelmann W, Umar A, Yang K, Heyer J, Kucherlapati M, Lia M, Kneitz B, Avdievich E, Fan K, Wong E, Crouse G, Kunkel T, Lipkin M, Kolodner RD, Kucherlapati R: The DNA mismatch repair genes Msh3 and Msh6 cooperate in intestinal tumor suppression. Cancer Res, 2000. 60: 803-807. Edelmann W, Yang K, Umar A, Heyer J, Lau K, Fan K, Liedtke W, Cohen PE, Kane MF, Lipford JR, Yu N, Crouse GF, Pollard JW, Kunkel T, Lipkin M, Kolodner R, Kucherlapati R: Mutation in the mismatch repair gene Msh6 causes cancer susceptibility. Cell, 1997. 91: 467-477. Ellegren, H: Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nat Rev Genet, 2004. 5: 435-445. Esteller M, Catasus L, Matias-Guiu X, Mutter GL, Prat J, Baylin SB, Herman JG: hMLH1 promoter hypermethylation is an early event in human endometrial tumorigenesis. Am J Pathol, 1999. 155: 1767-1772. Esteller M, Levine R, Baylin SB, Ellenson LH, Herman JG: MLH1 promoter hypermethylation is associated with the microsatellite instability phenotype in sporadic endometrial carcinomas. Oncogene, 1998. 17: 2413-2417. Fais F, Ghiotto F, Hashimoto S, Sellars B, Valetto A, Allen SL, Schulman P, Vinciguerra VP, Rai K, Rassenti LZ, Kipps TJ, Dighiero G, Schroeder HW Jr, Ferrarini M, Chiorazzi N: Chronic lymphocytic leukemia B cells express restricted sets of mutated and unmutated antigen receptors. J Clin Invest, 1998. 102: 15151525. Fayad L, Robertson LE, O'Brien S, Manning JT, Wright S, Hagemeister F, Cabanillas F, Keating MJ: Hodgkin's disease variant of Richter's syndrome: experience at a single institution. Leuk Lymphoma, 1996. 23: 333-337. Fegan, C: Molecular abnormalities in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Clin Lab Haematol, 2001. 23: 139-148. Fenaux P, Preudhomme C, Lai JL, Quiquandon I, Jonveaux P, Vanrumbeke M, Sartiaux C, Morel P, Loucheux-Lefebvre MH, Bauters F: Mutations of the p53 gene

- 57 -

75.

76.

77.

78.

79.

80.

81.

82.

83. 84.

85.

86.

87.

in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a report on 39 cases with cytogenetic analysis. Leukemia, 1992. 6: 246-250. Fernandez-Lopez L, Pineiro E, Marcos R, Velazquez A, Surralles J: Induction of instability of normal length trinucleotide repeats within human disease genes. J Med Genet, 2004. 41: e3. Field D, Magnasco MO, Moxon ER, Metzgar D, Tanaka MM, Wills C, Thaler DS: Contingency loci, mutator alleles, and their interactions. Synergistic strategies for microbial evolution and adaptation in pathogenesis. Ann N Y Acad Sci, 1999. 870: 378-382. Fishel R, Lescoe MK, Rao MR, Copeland NG, Jenkins NA, Garber J, Kane M, Kolodner R: The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell, 1993. 75: 1027-1038. Fleisher AS, Esteller M, Tamura G, Rashid A, Stine OC, Yin J, Zou TT, Abraham JM, Kong D, Nishizuka S, James SP, Wilson KT, Herman JG, Meltzer SJ: Hypermethylation of the hMLH1 gene promoter is associated with microsatellite instability in early human gastric neoplasia. Oncogene, 2001. 20: 329-335. Fleisher AS, Esteller M, Wang S, Tamura G, Suzuki H, Yin J, Zou TT, Abraham JM, Kong D, Smolinski KN, Shi YQ, Rhyu MG, Powell SM, James SP, Wilson KT, Herman JG, Meltzer SJ: Hypermethylation of the hMLH1 gene promoter in human gastric cancers with microsatellite instability. Cancer Res, 1999. 59: 1090-1095. Flores-Rozas H, Clark D, Kolodner RD: Proliferating cell nuclear antigen and Msh2p-Msh6p interact to form an active mispair recognition complex. Nat Genet, 2000. 26: 375-378. Flores-Rozas H, Kolodner RD: The Saccharomyces cerevisiae MLH3 gene functions in MSH3-dependent suppression of frameshift mutations. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95: 12404-12409. Foon KA, Thiruvengadam R, Saven A, Bernstein ZP, Gale RP: Genetic relatedness of lymphoid malignancies. Transformation of chronic lymphocytic leukemia as a model. Ann Intern Med, 1993. 119: 63-73. Foulds, L: The expreimental study of tumor progression: a review. Cancer Res, 1954. 14: 327-339. Fundia A, Giere I, Larripa I, Slavutsky I: Spontaneous breakage and fragile site expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet, 1998. 103: 144-148. Gaidano G, Ballerini P, Gong JZ, Inghirami G, Neri A, Newcomb EW, Magrath IT, Knowles DM, Dalla-Favera R: p53 mutations in human lymphoid malignancies: association with Burkitt lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88: 5413-5417. Gamberi B, Gaidano G, Parsa N, Carbone A, Roncella S, Knowles DM, Louie DC, Shibata D, Chaganti RS, Dalla-Favera R: Microsatellite instability is rare in B-cell non-Hodgkin's lymphomas. Blood, 1997. 89: 975-979. Gartenhaus R, Johns MM 3rd, Wang P, Rai K, Sidransky D: Mutator phenotype in a subset of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 1996. 87: 38-41.

- 58 -

88.

89.

90. 91.

92.

93. 94.

95.

96.

97. 98. 99. 100.

101.

102.

Genschel J, Littman SJ, Drummond JT, Modrich P: Isolation of MutSbeta from human cells and comparison of the mismatch repair specificities of MutSbeta and MutSalpha. J Biol Chem, 1998. 273: 19895-19901. Ghimenti C, Tannergard P, Wahlberg S, Liu T, Giulianotti PG, Mosca F, Fornaciari G, Bevilacqua G, Lindblom A, Caligo MA: Microsatellite instability and mismatch repair gene inactivation in sporadic pancreatic and colon tumours. Br J Cancer, 1999. 80: 11-16. Giles FJ, O’Brien S, Keating MJ: Chronic lymphocytic leukemia in (Richter’s) transformation. Semin Oncol, 1998. 25: 117-125. Goellner GM, Tester D, Thibodeau S, Almqvist E, Goldberg YP, Hayden MR, McMurray CT: Different mechanisms underlie DNA instability in Huntington disease and colorectal cancer. Am J Hum Genet, 1997. 60: 879-890. Golay J, Luppi M, Songia S, Palvarini C, Lombardi L, Aiello A, Delia D, Lam K, Crawford DH, Biondi A, Barbui T, Rambaldi A, Introna M: Expression of A-myb, but not c-myb and B-myb, is restricted to Burkitt`s lymphoma, sIg+ B-acute lymphoblastic leukemia, and a subset of chronic lymphocytic leukemias. Blood, 1996. 87: 1900-1911. Goldin LR, Sgambati M, Marti GE, Fontaine L, Ishibe N, Caporaso N: Anticipation in familial chronic lymphocytic leukemia. Am J Hum Genet, 1999. 65: 265-269. Gomori E, Fulop Z, Meszaros I, Doczi T, Matolcsy A: Microsatellite analysis of primary and recurrent glial tumors suggests different modalities of clonal evolution of tumor cells. J Neuropathol Exp Neurol, 2002. 61: 396-402. Gonzalez- Zulueta M, Ruppert JM, Tokino K, Tsai YC, Spruck CH 3rd, Miyao N, Nichols PW, Hermann GG, Horn T, Steven K, et al: Microsatellite instability in bladder cancer. Cancer Res, 1993. 53: 5620-5623. Grady WM, Rajput A, Lutterbaugh JD, Markowitz SD: Detection of aberrantly methylated hMLH1 promoter DNA in the serum of patients with microsatellite unstable colon cancer. Cancer Res, 2001. 61: 900-902. Graham DM, Appelman HD: Crohn's -like lymphoid reaction and colorectal carcinoma: a potential histologic prognosticator. Mod Pathol, 1990. 3: 332-335. Grawunder U, West RB, Lieber MR: Antigen receptor gene rearrangement. Curr Opin Immunol, 1998. 10: 172-180. Green, H: Human genetic diseases due to codon reiteration: relationship to an evolutionary mechanism. Cell, 1993. 74: 955-956. Greger V, Debus N, Lohmann D, Hopping W, Passarge E, Horsthemke B: Frequency and parental origin of hypermethylated RB1 alleles in retinoblastoma. Hum Genet, 1994. 94: 491-496. Groudine M, Eisenman R, Weintraub H: Chromatin structure of endogenous retroviral genes and activation by an inhibitor of DNA methylation. Nature, 1981. 292: 311-317. Gu L, Cline-Brown B, Zhang F, Qiu L, Li GM: Mismatch repair deficiency in hematological malignancies with microsatellite instability. Oncogene, 2002. 21: 5758-5764.

- 59 -

103.

104.

105. 106.

107.

108.

109.

110.

111.

112.

113.

114. 115. 116.

117.

Guerrette S, Wilson T, Gradia S, Fishel R: Interactions of human hMSH2 with hMSH3 and hMSH2 with hMSH6: examination of mutations found in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Mol Cell Biol, 1998. 18: 6616-6623. Guipaud O, Deriano L, Salin H, Vallat L, Sabatier L, Merle-Beral H, Delic J: B-cell chronic lymphocytic leukaemia: a polymorphic family unified by genomic features. Lancet Oncol, 2003. 4: 505-514. Hamblin, T: Chronic lymphocytic leukemia: one disease or two? Ann Hematol, 2002. 81: 299-303. Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG, Stevenson FK: Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 1999. 94: 1848-1854. Han HJ, Maruyama M, Baba S, Park JG, Nakamura Y: Genomic structure of human mismatch repair gene, hMLH1, and its mutation analysis in patients with hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC). Hum Mol Genet, 1995. 4: 237-242. Han T, Henderson ES, Emrich LJ, Sandberg AA: Prognostic significance of karyotypic abnormalities in B cell chronic lymphocytic leukemia: an update. Semin Hematol, 1987. 24: 257-263. Han T, Sadamori N, Ozer H, Gajera R, Gomez GA, Henderson ES, Bhargava A, Fitzpatrick J, Minowada J, Bloom ML: Cytogenetic studies in 77 patients with chronic lymphocytic leukemia: correlations with clinical, immunologic, and phenotypic data. J Clin Oncol, 1984. 2: 1121-1132. Hanada M, Delia D, Aiello A, Stadtmauer E, Reed JC: Bcl-2 gene hypomethylation and high-level expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood, 1993. 82: 1820-1828. Hangaishi A, Ogawa S, Mitani K, Hosoya N, Chiba S, Yazaki Y, Hirai H: Mutations and loss of expression of a mismatch repair gene, hMLH1, in leukemia and lymphoma cell lines. Blood, 1997. 89: 1740-1747. Harris, NL, Mature B-cell neoplasms: introduction., in Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues., H.N. Jaffe ES, Stein H, Vardiman JW, Editor. 2001, IARC Press: Lyon. Harris NL, Jaffe ES, Stein H, Banks PM, Chan JK, Cleary ML, Delsol G, De WolfPeeters C, Falini B, Gatter KC: A revised European-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study Group. Blood, 1994. 84: 1361-1392. Hattenhauer MG, Pach JM: Ocular lymphoma in a patient with chronic lymphocytic leukemia. Am J Ophtalmol, 1996. 122: 266-268. Haupt S, Berger M, Goldberg Z, Haupt Y: Apoptosis - the p53 network. J Cell Sci, 2003. 116: 4077-85. Hayami Y, Komatsu H, Iida S, Utsunomiya A, Hanada S, Hua XJ, Huiping N, Harada S, Tsuboi K, Banno S, Wakita A, Kato T, Ueda R: Microsatellite instability as a potential marker for poor prognosis in adult T cell leukemia/lymphoma. Leuk Lymphoma, 1999. 32: 345-349. Hebert J, Jonveaux P, d'Agay MF, Berger R: Cytogenetic studies in patients with Richter's syndrome. Cancer Genet Cytogenet, 1994. 73: 65-68.

- 60 -

118.

119.

120.

121. 122. 123. 124.

125.

126.

127.

128.

129.

130.

Herman JG, Latif F, Weng Y, Lerman MI, Zbar B, Liu S, Samid D, Duan DS, Gnarra JR, Linehan WM, Baylin SB: Silencing of the VHL tumor-suppressor gene by DNA methylation in renal carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91: 97009704. Herman JG, Merlo A, Mao L, Lapidus RG, Issa JP, Davidson NE, Sidransky D, Baylin SB: Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res, 1995. 55: 4525-4530. Herman JG, Umar A, Polyak K, Graff JR, Ahuja N, Issa JP, Markowitz S, Willson JK, Hamilton SR, Kinzler KW, Kane MF, Kolodner RD, Vogelstein B, Kunkel TA, Baylin SB: Incidence and functional consequences of hMLH1 promoter hypermethylation in colorectal carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95: 6870-6875. Hirama T, Koeffler HP: Role of the cyclin-dependent kinase inhibitors in the development of cancer. Blood, 1995. 86: 841-854. Horning SJ, Rosenberg SA: The natural history of initially untreated low-grade non-Hodgkin's lymphomas. N Engl J Med, 1984. 311: 1471-1475. Houlston RS, Catovsky D, Yuille MR: Genetic susceptibility to chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 2002. 16: 1008-1014. House MG, Herman JG, Guo MZ, Hooker CM, Schulick RD, Cameron JL, Hruban RH, Maitra A, Yeo CJ: Prognostic value of hMLH1 methylation and microsatellite instability in pancreatic endocrine neoplasms. Surgery, 2003. 134: 902-908. Hozumi N, Tonegawa S: Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions. Proc Natl Acad Sci USA, 1976. 73: 3628-3632. Hultdin M, Rosenquist R, Thunberg U, Tobin G, Norrback KF, Johnson A, Sundstrom C, Roos G: Association between telomere length and V(H) gene mutation status in chronic lymphocytic leukaemia: clinical and biological implications. Br J Cancer, 2003. 88: 593-598. Indraccolo S, Minuzzo S, Nicoletti L, Cretella E, Simon M, Papakonstantinou G, Hehlmann R, Mion M, Bertorelle R, Roganovic J, Chieco-Bianchi L: Mutator phenotype in human hematopoietic neoplasms and its association with deletions disabling DNA repair genes and bcl-2 rearrangements. Blood, 1999. 94: 24242432. Inghirami G, Foitl DR, Sabichi A, Zhu BY, Knowles DM: Autoantibody-associated cross-reactive idiotype-bearing human B lymphocytes: distribution and characterization, including Ig VH gene and CD5 antigen expression. Blood, 1991. 78: 1503-1515. Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, Perucho M: Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature, 1993. 363: 558-561. Jacob S, Praz F: DNA mismatch repair defects: role in colorectal carcinogenesis. Biochimie, 2002. 84: 27-47.

- 61 -

131.

132.

133. 134. 135.

136.

137. 138. 139.

140.

141.

142. 143. 144.

145. 146. 147.

Jaffe SJ, Harris NL, Stein H, Vardiman JW: Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. World Health Organization Classification of Tumours. 2001, Lyon, IARC Press. Jernvall P, Makinen MJ, Karttunen TJ, Makela J, Vihko P: Microsatellite instability: impact on cancer progression in proximal and distal colorectal cancers. Eur J Cancer, 1999. 35: 197-201. Johansson B, Mertens F, Mitelman F: Cytogenetic evolution patterns in nonHodgkin's lymphoma. Blood, 1995. 86: 3905-3914. Jost CA, Marin MC, Kaelin WG Jr: p73 is a simian [correction of human] p53related protein that can induce apoptosis. Nature, 1997. 389: 191-194. Kane MF, Loda M, Gaida GM, Lipman J, Mishra R, Goldman H, Jessup JM, Kolodner R: Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines. Cancer Res, 1997. 57: 808-811. Kaneko Y, Sakurai S, Hironaka M, Sato S, Oguni S, Sakuma Y, Sato K, Sugano K, Saito K: Distinct methylated profiles in Helicobacter pylori dependent and independent gastric MALT lymphomas. Gut, 2003. 52: 641-646. Karran, P: Microsatellite instability and DNA mismatch repair in human cancer. Semin Cancer Biol, 1996. 7: 15-24. Kass SU, Pruss D, Wolffe AP: How does DNA methylation repress transcription? Trends Genet, 1997. 13: 444-449. Katzenellenbogen RA, Baylin SB, Herman JG: Hypermethylation of the DAPkinase CpG island is a common alteration in B-cell malignancies. Blood, 1999. 93: 4347-4353. Kauffmann-Zeh A, Rodriguez-Viciana P, Ulrich E, Gilbert C, Coffer P, Downward J, Evan G: Suppression of c-Myc-induced apoptosis by Ras signalling through PI(3)K and PKB. Nature, 1997. 385: 544-548. Kawano S, Miller CW, Gombart AF, Bartram CR, Matsuo Y, Asou H, Sakashita A, Said J, Tatsumi E, Koeffler HP: Loss of p73 gene expression in leukemias/lymphomas due to hypermethylation. Blood, 1999. 94: 1113-1120. Keshet I, Lieman-Hurwitz J, Cedar H: DNA methylation affects the formation of active chromatin. Cell, 1986. 44: 535-543. Khaled AR, Durum SK: Lymphocide: cytokines and the control of lymphoid homeostasis. Nat Rev Immunol, 2002. 2: 817-830. Khanna KK, Keating KE, Kozlov S, Scott S, Gatei M, Hobson K, Taya Y, Gabrielli B, Chan D, Lees-Miller SP, Lavin MF: ATM associates with and phosphorylates p53: mapping the region of interaction. Nat Genet, 1998. 20: 398-400. Kim, H: Composite lymphoma and related disorders. Am J Clin Pathol, 1993. 99: 4445-451. Kim H, Hendrickson MR, Dorfman RF: Composite lymphoma. Cancer, 1977. 40: 959-976. Kim H, Kim YH, Kim SE, Kim NG, Noh SH, Kim H: Concerted promoter hypermethylation of hMLH1, p16INK4A, and E-cadherin in gastric carcinomas with microsatellite instability. J Pathol, 2003. 200: 23-31.

- 62 -

148.

149.

150.

151.

152. 153.

154.

155.

156. 157. 158.

159.

160.

161. 162.

Kipps TJ, Tomhave E, Pratt LF, Duffy S, Chen PP, Carson DA: Developmentally restricted immunoglobulin heavy chain variable region gene expressed at high frequency in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA, 1989. 86: 5913-5917. Kitada S, Andersen J, Akar S, Zapata JM, Takayama S, Krajewski S, Wang HG, Zhang X, Bullrich F, Croce CM, Rai K, Hines J, Reed JC: Expression of apoptosisregulating proteins in chronic lymphocytic leukemia: correlations with In vitro and In vivo chemoresponses. Blood, 1998. 91: 3379-3389. Klein U, Rajewsky K, Kuppers R: Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated (memory) B cells. J Exp Med, 1998. 188: 1679-1689. Klein U, Tu Y, Stolovitzky GA, Mattioli M, Cattoretti G, Husson H, Freedman A, Inghirami G, Cro L, Baldini L, Neri A, Califano A, Dalla-Favera R: Gene expression profiling of B cell chronic lymphocytic leukemia reveals a homogeneous phenotype related to memory B cells. J Exp Med, 2001. 194: 1625-1638. Knutsen, T: Cytogenetic changes in the progression of lymphoma. Leuk Lymphoma, 1998. 31: 1-19. Kobayashi H, Espinosa R 3rd, Fernald AA, Begy C, Diaz MO, Le Beau MM, Rowley JD: Analysis of deletions of the long arm of chromosome 11 in hematologic malignancies with fluorescence in situ hybridization. Genes Chromosomes Cancer, 1993. 8: 246-252. Kodera T, Kohno T, Takakura S, Morishita K, Hamaguchi H, Hayashi Y, Sasaki T, Yokota J: Microsatellite instability in lymphoid leukemia and lymphoma cell lines but not in myeloid leukemia cell lines. Genes Chromosomes Cancer, 1999. 26: 267269. Kuismanen SA, Holmberg MT, Salovaara R, de la Chapelle A, Peltomaki P: Genetic and epigenetic modification of MLH1 accounts for a major share of microsatellite-unstable colorectal cancers. Am J Pathol, 2000. 156: 1773-1779. Kuppers R, Klein U, Hansmann ML, Rajewsky K: Cellular origin of human B-cell lymphomas. N Engl J Med, 1999. 341: 1520-1529. Lane, DP: p53, the guardian of the genome. Nature, 1992. 358(15-16). Leach FS, Nicolaides NC, Papadopoulos N, Liu B, Jen J, Parsons R, Peltomaki P, Sistonen P, Aaltonen LA, Nystrom-Lahti M, et al: Mutations of a mutS homolog in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cell, 1993. 75: 1215-1225. Lee A, Skelly ME, Kingma DW, Medeiros LJ: B-cell chronic lymphocytic leukemia followed by high grade T-cell lymphoma. An unusual variant of Richter's syndrome. Am J Clin Pathol, 1995. 103: 348-352. Leng RP, Lin Y, Ma W, Wu H, Lemmers B, Chung S, Parant JM, Lozano G, Hakem R, Benchimol S: Pirh2, a p53-induced ubiquitin-protein ligase, promotes p53 degradation. Cell, 2003. 112: 779-791. Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B: Genetic instabilities in human cancers. Nature, 1998. 396: 643-649. Lennert, K: Malignant Lymphomas other than Hodgkin’s disease. 1978, New York, Springer Verlag.

- 63 -

163.

164. 165. 166.

167.

168.

169.

170. 171.

172.

173.

174.

175. 176.

177.

Lenz G, Hutter G, Hiddemann W, Dreyling M: Promoter methylation and expression of DNA repair genes hMLH1 and MGMT in acute myeloid leukemia. Ann Hematol, 2004. 83: 628-633. Levine, AJ: p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell, 1997. 88(323-331). Li YC, Korol AB, Fahima T, Nevo E: Microsatellites within genes: structure, function, and evolution. Mol Biol Evol, 2004. 21: 991-1007. Limpaiboon T, Khaenam P, Chinnasri P, Soonklang M, Jearanaikoon P, Sripa B, Pairojkul C, Bhudhisawasdi V: Promoter hypermethylation is a major event of hMLH1 gene inactivation in liver fluke related cholangiocarcinoma. Cancer Lett, 2005. 217: 213-219. Liu K, Zuo C, Luo QK, Suen JY, Hanna E, Fan CY: Promoter hypermethylation and inactivation of hMLH1, a DNA mismatch repair gene, in head and neck squamous cell carcinoma. Diagn Mol Pathol, 2003. 12: 50-56. Liu Y, Grander D, Söderhall S, Juliusson G, Gahrton G, Einhorn S: Retinoblastoma gene deletions in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Genes Chromosomes Cancer, 1992. 4: 250-256. Liu Y, Szekely L, Grander D, Soderhall S, Juliusson G, Gahrton G, Linder S, Einhorn S: Chronic lymphocytic leukemia cells with allelic deletions at 13q14 commonly have one intact RB1 gene: evidence for a role of an adjacent locus. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(8697-8701). Look, AT: Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias. Science, 1997. 278: 1059-1064. Lortholary P, Boiron M, Ripault P, Levy JP, Manus A, Bernard J: Leucemie lymphoide chronique secondairement associee a une reticulopathie maligne, syndrome de Richter. Nouv Rev Fr Hematol, 1964. 78: 621-644. Mahe B, Moreau P, Bonnemain B, Letortorec S, Menegali D, Bourdin S, De Lajartre D, Harousseau JL: Isolated Richter's syndrome of the brain: two recent cases. Nouv Rev Fr Hematol, 1994. 36: 383-385. Makower D, Venkatraj U, Dutcher JP, Wiernik PH: Occurrence of myeloma in a chronic lymphocytic leukemia patients after response to differentiation therapy with interleukin-4. Leuk Lymphoma, 1996. 23: 617-619. Masdehors P, Merle-Beral H, Maloum K, Omura S, Magdelenat H, Delic J: Deregulation of the ubiquitin system and p53 proteolysis modify the apoptotic response in B-CLL lymphocytes. Blood, 2000. 96: 269-274. Matolcsy, A: High-grade transformation of low-grade non-Hodgkin’s lymphomas: mechanisms of tumor progression. Leuk Lymphoma, 1999. 34: 251-259. Matolcsy A, Casali P, Knowles DM: Different clonal origin of B-cell populations of chronic lymphocytic leukemia and large-cell lymphoma in Richter's syndrome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 764: 496-503. Matolcsy A, Inghirami G, Knowles DM: Molecular genetic demonstration of the diverse evolution of Richter's syndrome (chronic lymphocytic leukemia and subsequent large cell lymphoma). Blood, 1994. 83: 1363-1372.

- 64 -

178.

179.

180.

181. 182.

183.

184. 185. 186. 187.

188. 189.

190.

191. 192. 193.

Matolcsy A, Schattner EJ, Knowles DM, Casali P: Clonal evolution of B cells in transformation from low- to high-grade lymphoma. Eur J Immunol, 1999. 29: 12531264. Matutes E, Oscier D, Garcia-Marco J, Ellis J, Copplestone A, Gillingham R, Hamblin T, Lens D, Swansbury GJ, Catovsky D: Trisomy 12 defines a group of CLL with atypical morphology: correlation between cytogenetic, clinical and laboratory features in 544 patients. Br J Haematol, 1996. 92: 382-388. Matutes E, Owusu-Ankomah KA, Morilla RM, Garcia MJ, Houlihan A, Que TH, Catovsky D: The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a scoring system for the diagnosis of CLL. Leukemia, 1994. 8: 1640-1645. McMurray, CT: Mechanisms of DNA expansion. Chromosoma, 1995. 104: 2-13. Meltzer SJ, Yin J, Manin B, Rhyu MG, Cottrell J, Hudson E, Redd JL, Krasna MJ, Abraham JM, Reid BJ: Microsatellite instability occurs frequently and in both diploid and aneuploid cell populations of Barrett's-associated esophageal adenocarcinomas. Cancer Res, 1994. 54: 3379-3382. Michiels JJ, van Dongen JJ, Hagemeijer A, Sonneveld P, Ploemacher RE, Adriaansen HJ, van der Kwast TH, Brederoo P, Abels J: Richter's syndrome with identical immunoglobulin gene rearrangements in the chronic lymphocytic leukemia and the supervening non-Hodgkin lymphoma. Leukemia, 1989. 3: 819-824. Milkowski DA, Worley BD, Morris MJ: Richter's transformation presenting as an obstructing endobronchial lesion. Che st, 1999. 116: 832-835. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF: A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 1988. 16: 1215. Mitelman F, Johansson B, Mertens F: Catalog of chromosome aberrations in cancer. Vol. 2. 1994, New York, Wiley-Liss. Miyamura K, Osada H, Yamauchi T, Itoh M, Kodera Y, Suchi T, Takahashi T, Ueda R: Single clonal origin of neoplastic B-cells with different immunoglobulin light chains in a patient with Richter's syndrome. Cancer, 1990. 66: 140-144. Modrich P, Lahue R: Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination, and cancer biology. Annu Rev Biochem, 1996. 65: 101-133. Momose H, Jaffe ES, Shin SS, Chen YY, Weiss LM: Chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma with Reed-Sternberg-like cells and possible transformation to Hodgkin's disease. Mediation by Epstein -Barr virus. Am J Surg Pathol, 1992. 16: 859-867. Moreau EJ, Matutes E, A’Hern RP, Morilla AM, Morilla RM, Owusu-Ankomah KA, Seon BK, Catovsky D: Improvement of the chronic lymphocytic leukemia scoring system with the monoclonal antibody SN8 (CD79b). Am J Clin Pathol, 1997. 108: 378-382. Moxon ER, Wills C: DNA microsatellites: agents of evolution? Sci Am, 1999. 280: 94-99. Muller A, Fishel R: Mismatch repair and the hereditary non-polyposis colorectal cancer syndrome (HNPCC). Cancer Invest, 2002. 20: 102-109. Müller-Hermelink HK, Catovsky D, Montserrat E, Harris NL: Chronic lymphocytic leukemia / small lymphocytic lymphoma. Pathology and Genetics of Tumours of

- 65 -

194. 195.

196.

197.

198.

199. 200. 201. 202.

203. 204.

205. 206.

207.

208.

Haematopoietic and Lymphoid Tissues., ed. H.N. Jaffe ES, Stein H, Vardiman JW. 2001, Lyon, IARC Press. Müller-Hermelink HK, Zettl A, Pfeifer W, Ott G: Pathology of lymphoma progression. Histopathology, 2001. 38: 285-306. Murata H, Khattar NH, Kang Y, Gu L, Li GM: Genetic and epigenetic modification of mismatch repair genes hMSH2 and hMLH1 in sporadic breast cancer with microsatellite instability. Oncogene, 2002. 21: 5696-5703. Nagy M, Balazs M, Adam Z, Petko Z, Timar B, Szereday Z, Laszlo T, Warnke RA, Matolcsy A: Genetic instability is associated with histological transformation of follicle center lymphoma. Leukemia, 2000. 14: 2142-2148. Nakagawa H, Nuovo GJ, Zervos EE, Martin EW Jr, Salovaara R, Aaltonen LA, de la Chapelle A: Age-related hypermethylation of the 5' region of MLH1 in normal colonic mucosa is associated with microsatellite-unstable colorectal cancer development. Cancer Res, 2001. 61: 6991-6995. Nakamine H, Masih AS, Sanger WG, Wickert RS, Mitchell DW, Armitage JO, Weisenburger DD: Richter's syndrome with different immunoglobulin light chain types. Molecular and cytogenetic features indicate a common clonal origin. Am J Clin Pathol, 1992. 97: 656-663. Nakamura N, Abe M: Richter syndrome in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Pathol Int, 2003. 53: 195-203. Nan X, Campoy FJ, Bird A: MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. Cell, 1997. 88: 471-481. Newcombe, EW: p53 gene mutations in lymphoid disease and their possible relevance to drug resistance. Leuk Lymphoma, 1995. 17: 211-221. Novogrudsky A, Amorosi EL, Gottesman SR: High-grade T-cell lymphoma complicating B-cell chronic lymphocytic leukemia: an unusual manifestation of "Richter's syndrome". Am J Hematol, 2001. 66: 203-206. Nowell, PC: Genetic alterations in leukemias and lymphomas: impressive progress and continuing complexity. Cancer Genet Cytogenet, 1997. 94: 13-19. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E: DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell, 1999. 99: 247-257. Orchard JA, Oscier DG: Prognostic value of Ki 67 and cell cycle analysis in chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol, 1996. 93(Suppl 2): 116. Oscier D, Fegan C, Hillmen P, Illidge T, Johnson S, Maguire P, Matutes E, Milligan D; Guidelines Working Group of the UK CLL Forum. British Committee for Standards in Haematology.: Guidelines on the diagnosis and management of chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol, 2004. 125: 294-317. Oscier DG, Thompsett A, Zhu D, Stevenson FK: Differential rates of somatic hypermutation in V(H) genes among subsets of chronic lymphocytic leukemia defined by chromosomal abnormalities. Blood, 1997. 89: 4153-4160. Park MS, Rosai J, Nguyen HT, Capodieci P, Cordon-Cardo C, Koff A: p27 and Rb are on overlapping pathways suppressing tumorigenesis in mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96: 6382-6387.

- 66 -

209.

210.

211. 212.

213.

214.

215.

216.

217.

218.

219. 220. 221.

222.

223.

Parrens M, Sawan B, Dubus P, Lacombe F, Marit G, Vergier B, Reiffers J, de Mascarel A, Merlio JP: Primary digestive Richter's syndrome. Mod Pathol, 2001. 14: 452-457. Parsons R, Li GM, Longley MJ, Fang WH, Papadopoulos N, Jen J, de la Chapelle A, Kinzler KW, Vogelstein B, Modrich P: Hypermutability and mismatch repair deficiency in RER+ tumor cells. Cell, 1993. 75: 1227-1236. Peltomaki, P: Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon cancer. Hum Mol Genet, 2001. 10: 735-740. Peng H, Chen G, Du M, Sin gh N, Isaacson PG, Pan L: Replication error phenotype and p53 gene mutation in lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue. Am J Pathol, 1996. 148: 643-648. Petrella T, Yaziji N, Collin F, Rifle G, Morlevat F, Arnould L, Fargeot P, Depret O: Implication of the Epstein-Barr virus in the progression of chronic lymphocytic leukaemia/small lymphocytic lymphoma to Hodgkin-like lymphomas. Anticancer Res, 1997. 17: 3907-3913. Pettitt AR, Sherrington PD, Stewart G, Cawley JC, Taylor AM, Stankovic T: p53 dysfunction in B-cell chronic lymphocytic leukemia: inactivation of ATM as an alternative to TP53 mutation. Blood, 2001. 98: 814-822. Pinyol M, Cobo F, Bea S, Jares P, Nayach I, Fernandez PL, Montserrat E, Cardesa A, Campo E: p16INK4a gene inactivation by deletions, mutations, and hypermethylation is associated with transformed and aggressive variants of nonHodgkin’s lymphomas. Blood, 1998. 91: 2977-2984. Polyak K, Kato JY, Solomon MJ, Sherr CJ, Massague J, Roberts JM, Koff A: p27Kip1, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-beta and contact inhibition to cell cycle arrest. Genes Dev, 1994. 8: 9-22. Prolla TA, Baker SM, Harris AC, Tsao JL, Yao X, Bronner CE, Zheng B, Gordon M, Reneker J, Arnheim N, Shibata D, Bradley A, Liskay RM: Tumour susceptibility and spontaneous mutation in mice deficient in Mlh1, Pms1 and Pms2 DNA mismatch repair. Nat Genet, 1998. 18: 176-179. Quintanilla-Martinez L, Thieblemont C, Fend F, Kumar S, Pinyol M, Campo E, Jaffe ES, Raffeld M: Mantle cell lymphomas lack expression of p27Kip1, a cyclindependent kinase inhibitor. Am J Pathol, 1998. 153: 175-182. Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Pasternack BS: Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 1975. 46: 219-234. Ramel, C: Mini- and microsatellites. Environ Health Perspect, 1997. 105(Suppl 4): 781-789. Randerson J, Cawkwell L, Jack A, Child JA, Lewis F, Hall N, Johnson P, Evans P, Barrans S, Morgan GJ: Microsatellite instability in follicle centre cell lymphoma. Br J Haematol, 1996. 93: 160-162. Ratnavel RC, Dunn-Walters DK, Boursier L, Frazer-Andrews E, Orchard G, Russell- Jones R, Calonje E: B-cell lymphoma associated with chronic lymphatic leukaemia: two cases with contrasting aggressive and indolent behaviour. Br J Dermatol, 1999. 140: 708-714. Razin A, Cedar H: DNA methylation and gene expression. Microbiol Rev, 1991. 55: 451-458.

- 67 -

224.

225.

226.

227. 228.

229. 230. 231.

232.

233.

234. 235.

236.

237.

Reitmair AH, Redston M, Cai JC, Chuang TC, Bjerknes M, Cheng H, Hay K, Gallinger S, Bapat B, Mak TW: Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res, 1996. 56: 3842-3849. Reitmair AH, Schmits R, Ewel A, Bapat B, Redston M, Mitri A, Waterhouse P, Mittrucker HW, Wakeham A, Liu B, et al: MSH2 deficient mice are viable and susceptible to lymphoid tumours. Nat Genet, 1995. 11: 64-70. Ricciardiello L, Goel A, Mantovani V, Fiorini T, Fossi S, Chang DK, Lunedei V, Pozzato P, Zagari RM, De Luca L, Fuccio L, Martinelli GN, Roda E, Boland CR, Bazzoli F: Frequent loss of hMLH1 by promoter hypermethylation leads to microsatellite instability in adenomatous polyps of patients with a single firstdegree member affected by colon cancer. Cancer Res, 2003. 63: 787-792. Richards RI, Sutherland GR: Dynamic mutations: a new class of mutations causing human disease. Cell, 1992. 70: 709-712. Richter HE, Lohrer HD, Hieber L, Kellerer AM, Lengfelder E, Bauchinger M: Microsatellite instability and loss of heterozygosity in radiation-associated thyroid carcinomas of Belarussian children and adults. Carcinogenesis, 1999. 20: 22472252. Richter, M: Generalized reticular cell sarcoma of lymph nodes associated with lymphocytic leukemia. Am J Pathol, 1928. 4: 285-292. Robertson KD, Jones PA: DNA methylation: past, present and future directions. Carcinogenesis, 2000. 21: 461-467. Robertson LE, Pugh W, O'Brien S, Kantarjian H, Hirsch-Ginsberg C, Cork A, McLaughlin P, Cabanillas F, Keating MJ.: Richter's syndrome: a report on 39 patients. J Clin Oncol, 1993. 11: 1985-1989. Robledo M, Martinez B, Arranz E, Trujillo MJ, Gonzalez Ageitos A, Rivas C, Benitez J: Genetic instability of microsatellites in hematological neoplasms. Leukemia, 1995. 9: 960-964. Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, Simon R, Davis RE, Yu X, Yang L, Pickeral OK, Rassenti LZ, Powell J, Botstein D, Byrd JC, Grever MR, Cheson BD, Chiorazzi N, Wilson WH, Kipps TJ, Brown PO, Staudt LM: Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med, 2001. 194: 1639-1647. Rozman C, Montserrat E: Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med, 1995. 333: 1052-1057. Rubin D, Hudnall SD, Aisenberg A, Jacobson JO, Harris NL: Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia with Hodgkin's-like cells is associated with Epstein-Barr virus infection. Mod Pathol, 1994. 7: 91-98. Ruschoff J, Wallinger S, Dietmaier W, Bocker T, Brockhoff G, Hofstadter F, Fishel R: Aspirin suppresses the mutator phenotype associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer by genetic selection. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95: 11301-11306. Saez A, Sanchez E, Sanchez-Beato M, Cruz MA, Chacon I, Munoz E, Camacho FI, Martinez-Montero JC, Mollejo M, Garcia JF, Piris MA: p27KIP1 is abnormally expressed in Diffuse Large B-cell Lymphomas and is associated with an adverse clinical outcome. Br J Cancer, 1999. 80: 1427-1434.

- 68 -

238. 239.

240.

241.

242.

243.

244.

245. 246.

247.

248.

249.

250.

251.

Sajantila A, Lukka M, Syvanen AC: Experimentally observed germline mutations at human micro- and minisatellite loci. Eur J Hum Genet, 1999. 7: 263-266. Sakai T, Toguchida J, Ohtani N, Yandell DW, Rapaport JM, Dryja TP: Allelespecific hypermethylation of the retinoblastoma tumor-suppressor gene. Am J Hum Genet, 1991. 48: 880-888. Sakata K, Tamura G, Endoh Y, Ohmura K, O gata S, Motoyama T: Hypermethylation of the hMLH1 gene promoter in solitary and multiple gastric cancers with microsatellite instability. Br J Cancer, 2002. 86: 564-567. Saltman DL, Ross JA, Banks RE, Ross FM, Ford AM, Mackie MJ: Molecular evidence for a single clonal origin in biphenotypic concomitant chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. Blood, 1989. 74: 2062-2065. Sanchez-Beato M, Saez AI, Martinez-Montero JC, Sol Mateo M, Sanchez-Verde L, Villuendas R, Troncone G, Piris MA: Cyclin -dependent kinase inhibitor p27KIP1 in lymphoid tissue: p27KIP1 expression is inversely proportional to the proliferative index. Am J Pathol, 1997. 151: 151-160. Sanz-Vaque L, Colomer D, Bosch F, Lopez-Guillermo A, Dreyling MH, Bosch F, Montserrat E, Campo E: Microsatellite instability analysis in typical and progressed mantle cell lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia. Haematologica, 2001. 86: 181-186. Scarisbrick JJ, Mitchell TJ, Calonje E, Orchard G, Russell-Jones R, Whittaker SJ: Microsatellite instability is associated with hypermethylation of the hMLH1 gene and reduced gene expression in mycosis fungoides. J Invest Dermatol, 2003. 121: 894-901. Schlotterer C, Tautz D: Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Res, 1992. 20: 211-215. Schmutte C, Sadoff MM, Shim KS, Acharya S, Fishel R: The interaction of DNA mismatch repair proteins with human exonuclease I. J Biol Chem, 2001. 276: 33011-33018. Seedhouse CH, Das-Gupta EP, Russell NH: Methylation of the hMLH1 promoter and its association with microsatellite instability in acute myeloid leukemia. Leukemia, 2003. 17: 83-88. Seeger RC, Brodeur GM, Sather H, Dalton A, Siegel SE, Wong KY, Hammond D: Association of multiple copies of the N -myc oncogene with rapid progression of neuroblastomas. N Engl J Med, 1985. 313: 1111-1116. Sheikhha MH, Tobal K, Liu Yin JA: High level of microsatellite instability but not hypermethylation of mismatch repair genes in therapy-related and secondary acute myeloid leukaemia and myelodysplastic syndrome. Br J Haematol, 2002. 117: 359365. Shibata D, Peinado MA, Ionov Y, Malkhosyan S, Perucho M: Genomic instability in repeated sequences is an early somatic event in colorectal tumorigenesis that persists after transformation. Nat Genet, 1994. 6: 273-281. Shin SS, Ben-Ezra J, Burke JS, Sheibani K, Rappaport H: Reed-Sternberg-like cells in low-grade lymphomas are transformed neoplastic cells of B-cell lineage. Am J Clin Pathol, 1993. 99: 658-662.

- 69 -

252.

253. 254.

255.

256.

257. 258.

259.

260.

261.

262.

263.

264.

265.

266.

Shridhar V, Sie gfried J, Hunt J, del Mar Alonso M, Smith DI: Genetic instability of microsatellite sequences in many non-small cell lung carcinomas. Cancer Res, 1994. 54: 2084-2087. Singal R, Ginder GD: DNA methylation. Blood, 1999. 93: 4059-4070. Siu LL, Chan JK, Wong KF, Choy C, Kwong YL: Aberrant promoter CpG methylation as a molecular marker for disease monitoring in natural killer cell lymphomas. Br J Haematol, 2003. 122: 70-77. Siu LL, Chan JK, Wong KF, Kwong YL: Specific patterns of gene methylation in natural killer cell lymphomas : p73 is consistently involved. Am J Pathol, 2002. 160: 59-66. Skacel M, Paris PL, Pettay JD, Tsiftsakis EK, Tubbs RR, Casey G, Hsi ED: Diffuse large B-cell lymphoma of the stomach: assessment of microsatellite instability, allelic imbalance, and trisomy of chromosomes 3, 12, and 18. Diagn Mol Pathol, 2002. 11: 75-82. Southern, EM: Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol, 1975. 98: 503-517. Stamatopoulos K, Kosmas C, Belessi C, Stavroyianni N, Kyriazopoulos P, Papadaki T: Molecular insights into the immunopathogenesis of follicular lymphoma. Immunol Today, 2000. 21: 298-305. Starostik P, Greiner A, Schultz A, Zettl A, Peters K, Rosenwald A, Kolve M, Muller-Hermelink HK: Genetic aberrations common in gastric high-grade large Bcell lymphoma. Blood, 2000. 95: 1180-1187. Starostik P, Greiner A, Schwarz S, Patzner J, Schultz A, Muller-Hermelink HK: The role of microsatellite instability in gastric low- and high-grade lymphoma development. Am J Pathol, 2000. 157: 1129-1136. Stevenson F, Sahota S, Zhu D, Ottensmeier C, Chapman C, Oscier D, Hamblin T: Insight into the origin and clonal history of B-cell tumors as revealed by analysis of immunoglobulin variable region genes. Immunol Rev, 1998. 162: 247-259. Stilgenbauer S, Bullinger L, Benner A, Wildenberger K, Bentz M, Döhner K, Ho AD, Lichter P, Döhner H: Incidence and clinical significance of 6q deletions in Bcell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 1999. 13: 1331-1334. Stilgenbauer S, Bullinger L, Lichter P, Döhner H, and the German CLL Study Group (GCLLSG): Genetics of chronic lymphocytic leukemia: genomic aberrations and VH gene mutation status in pathogenesis and clinical course. Leukemia, 2002. 16: 993-1007. Stilgenbauer S, Leupolt E, Ohl S, Weiss G, Schroder M, Fischer K, Bentz M, Lichter P, Dohner H: Heterogeneity of deletions involving RB-1 and the D13S25 locus in B-cell chronic lymphocytic leukemia revealed by fluorescence in situ hybridization. Cancer Res, 1995. 55: 3475-3477. Strand M, Prolla TA, Liskay RM, Petes TD: Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature, 1993. 365: 274-276. Sun T, Susin M, Desner M, Pergolizzi R, Cuomo J, Koduru P: The clonal origin of two cell populations in Richter's syndrome. Hum Pathol, 1990. 21: 722-728.

- 70 -

267. 268. 269. 270. 271. 272. 273.

274.

275.

276. 277. 278.

279.

280.

281. 282.

Sutherland GR, Richards RI: Simple tandem DNA repeats and human genetic disease. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92: 3636-3641. Tate PH, Bird AP: Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression. Curr Opin Genet Dev, 1993. 3: 226-231. Taylor, AMR: What has the cloning of the ATM gene told us about ataxia teleangiectasia? Int J Radiol Biol, 1998. 73: 365-371. Taylor WR, Stark GR: Regulation of the G2/M transition by p53. Oncogene, 2001. 20: 1803-1815. Tazi J, Bird A: Alternative chromatin structure at CpG islands. Cell, 1990. 60: 909920. Thibodeau SN, Bren G, Schaid D: Microsatellite instability in cancer of the proximal colon. Science, 1993. 260: 816-819. Timar B, Fulop Z, Csernus B, Angster C, Bognar A, Szepesi A, Kopper L, Matolcsy A: Relationship between the mutational status of VH genes and pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma in Richter's syndrome. Leukemia, 2004. 18: 326-330. Tindall KR, Glaab WE, Umar A, Risinger JI, Koi M, Barrett JC, Kunkel TA: Complementation of mismatch repair gene defects by chromosome transfer. Mutat Res, 1998. 402: 15-22. Tohda S, Morio T, Suzuki T, Nagata K, Kamiyama T, Imai Y, Nara N, Aoki N: Richter syndrome with two B cell clones possessing different surface immunoglobulins and immunoglobulin gene rearrangements. Am J Hematol, 1990. 35: 32-36. Toyoshima H, Hunter T: p27, a novel inhibitor of G1 cyclin -Cdk protein kinase activity, is related to p21. Cell, 1994. 78: 67-74. Toyota M, Kopecky KJ, Toyota MO, Jair KW, Willman CL, Issa JP: Methylation profiling in acute myeloid leukemia. Blood, 2001. 97: 2823-2829. Trainor KJ, Brisco MJ, Story CJ, Morley AA: Monoclonality in Blymphoproliferative disorders detected at the DNA level. Blood, 1990. 75: 22202222. Tran PT, Simon JA, Liskay RM: Interactions of Exo1p with components of MutLalpha in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98: 97609765. Traweek ST, Liu J, Johnson RM, Winberg CD, Rappaport H: High-grade transformation of chronic lymphocytic leukemia and low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Genotypic confirmation of clonal identity. Am J Clin Pathol, 1993. 100: 519-526. Tsang WY, Chan JK, Sing C: The nature of Reed-Sternberg-like cells in chronic lymphocytic leukemia. Am J Clin Pathol, 1993. 99: 317-323. Tsimberidou AM, Kantarjian HM, Cortes J, Thomas DA, Faderl S, Garcia-Manero G, Verstovsek S, Ferrajoli A, Wierda W, Alvarado Y, O'Brien SM, Albitar M, Keating MJ, Giles FJ: Fractionated cyclophosphamide, vincristine, liposomal daunorubicin, and dexamethasone plus rituximab and granulocyte-macrophagecolony stimulating factor (GM-CSF) alternating with methotrexate and cytarabine plus rituximab and GM-CSF in patients with Richter syndrome or fludarabinerefractory chronic lymphocytic leukemia. Cancer, 2003. 97: 1711-1720.

- 71 -

283. 284.

285.

286.

287.

288.

289.

290.

291.

292.

293.

294.

295.

Tsimberidou AM, Keating MJ: Richter syndrome. Cancer, 2004. Epub ahead of print. Umar A, Boyer JC, Thomas DC, Nguyen DC, Risinger JI, Boyd J, Ionov Y, Perucho M, Kunkel TA: Defective mismatch repair in extracts of colorectal and endometrial cancer cell lines exhibiting microsatellite instability. J Biol Chem, 1994. 269: 14367-14370. Umar A, Risinger JI, Glaab WE, Tindall KR, Barrett JC, Kunkel TA: Functional overlap in mismatch repair by human MSH3 and MSH6. Genetics, 1998. 148: 16371646. van Dongen JJ, Hooijkaas H, Michiels JJ, Grosveld G, de Klein A, van der Kwast TH, Prins ME, Abels J, Hagemeijer A: Richter's syndrome with different immunoglobulin light chains and different heavy chain gene rearrangements. Blood, 1984. 64: 571-575. Volpe G, Gamberi B, Pastore C, Roetto A, Pautasso M, Parvis G, Camaschella C, Mazza U, Saglio G, Gaidano G: Analysis of microsatellite instability in chronic lymphoproliferative disorders. Ann Hematol, 1996. 72: 67-71. Wada C, Shionoya S, Fujino Y, Tokuhiro H, Akahoshi T, Uchida T, Ohtani H: Genomic instability of microsatellite repeats and its association with the evolution of chronic myelogenous leukemia. Blood, 1994. 83: 3449-3456. Wang TF, Kleckner N, Hunter N: Functional specificity of MutL homologs in yeast: evidence for three Mlh1-based heterocomplexes with distinct roles during meiosis in recombination and mismatch correction. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96: 13914-13919. Wang YC, Lu YP, Tseng RC, Lin RK, Chang JW, Chen JT, Shih CM, Chen CY: Inactivation of hMLH1 and hMSH2 by promoter methylation in primary non-small cell lung tumors and matched sputum samples. J Clin Invest, 2003. 111: 887-895. Watanabe Y, Haugen-Strano A, Umar A, Yamada K, Hemmi H, Kikuchi Y, Takano S, Shibata Y, Barrett JC, Kunkel TA, Koi M: Complementation of an hMSH2 defect in human colorectal carcinoma cells by human chromosome 2 transfer. Mol Carcinog, 2000. 29: 37-49. Weisenberg E, Anastasi J, Adeyanju M, Variakojis D, Vardiman JW: Hodgkin's disease associated with chronic lymphocytic leukemia. Eight additional cases, including two of the nodular lymphocyte predominant type. Am J Clin Pathol, 1995. 103: 479-484. Whang-Peng J, Knutsen T, Jaffe ES, Steinberg SM, Raffeld M, Zhao WP, Duffey P, Condron K, Yano T, Longo DL: Sequential analysis of 43 patients with nonHodgkin's lymphoma: clinical correlations with cytogenetic, histologic, immunophenotyping, and molecular studies. Blood, 1995. 85: 203-216. Wild PJ, Reichle A, Andreesen R, Rockelein G, Dietmaier W, Ruschoff J, Blaszyk H, Hofstadter F, Hartmann A: Microsatellite instability predicts poor short-term survival in patients with advanced breast cancer after high-dose chemotherapy and autologous stem-cell transplantation. Clin Cancer Res, 2004. 10: 556-564. Williams J, Schned A, Cotelinga m JD, Jaffe ES: Chronic lymphocytic leukemia with coexistent Hodgkin's disease. Implications for the origin of the Reed -Sternberg cell. Am J Surg Pathol, 1991. 15: 33-42.

- 72 -

296. 297.

298. 299. 300.

Yano T, Jaffe ES, Longo DL, Raffeld M: MYC rearrangements in histologically progressed follicular lymphomas. Blood, 1992. 80: 758-767. Yao X, Buermeyer AB, Narayanan L, Tran D, Baker SM, Prolla TA, Glazer PM, Liskay RM, Arnheim N: Different mutator phenotypes in Mlh1 - versus Pms2deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96: 6850-6855. Yuille MR, Houlston RS, Catovsky D: Anticipation in familial chronic lymphocytic leukaemia. Leukemia, 1998. 12: 1696-1698. Zhu Y, Monni O, Franssila K, Elonen E, Vilpo J, Joensuu H, Knuutila S: Deletions at 11q23 in different lymphoma subtypes. Haematologica, 2000. 85: 908-912. Zukerberg LR, Medeiros LJ, Ferry JA, Harris NL: Diffuse low-grade B-cell lymphomas. Four clinically distinct subtypes defined by a combination of morphologic and immunophenotypic features. Am J Clin Pathol, 1993. 100: 373385.

- 73 -

XV. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE A dolgozat témájával szorosan összefüggo közlemények:

1.

2.

3.

Fulop Z, Csernus B, Timar B, Szepesi A, Matolcsy A: Microsatellite instability and hMLH1 promoter hypermethylation in Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 2003. 17: 411-415. Timar B, Fulop Z, Csernus B, Angster C, Bognar A, Szepesi A, Kopper L, Matolcsy A: Relationship between the mutational status of VH genes and pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma in Richter's syndrome. Leukemia, 2004. 18: 326-330. Gomori E, Fulop Z, Meszaros I, Doczi T, Matolcsy A: Microsatellite analysis of primary and recurrent glial tumors suggests different modalities of clonal evolution of tumor cells. J Neuropathol Exp Neurol, 2002. 61: 396-402. A dolgozat témájához kevésbé kötodo közlemények:

1.

Csernus B, Timar B, Fulop Z, Bognar A, Szepesi A, Laszlo T, Jakso P, Warnke R, Kopper L, Matolcsy A: Mutational analysis of IgVH and BCL-6 genes suggests thymic B-cells origin of mediastinal (thymic) B-cell lymphoma. Leuk Lymphoma, 2004. 45: 2105-2110.

- 74 -

XVI. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném megköszönni Dr. Kopper Lászlónak, a Semmelweis Egyetem I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet igazgatójának, hogy PhD tanulmányaimat intézetében fejezhettem be. Köszönettel tartozom Dr. Matolcsy Andrásnak munkám minden részletére kiterjedo, gondos irányításáért. Dr. Kovalszky Ilonának és munkatársainak, diákjainak szeretném megköszönni a kooperációs lehetoséget és az építo jellegu beszélgetéseket. Külön szeretném megköszönni Dr Sebestyén Annának a dolgozatom elkészítése során kapott sok hasznos tanácsot és értékes bírálatot. Barátaimnak és kollégáimnak az együtt töltött ido alatt összegyult élményeket, és támogatásukat, biztatásukat szeretném megköszönni, név szerint Dr. Csernus Balázsnak, Dr. Timár Botondnak, Dr. Nagy Mónikának, Dr. Bognár Ágnesnek, Dr. Angster Christinenek, Dr. Hajdu Melindának és Bödör Csabának. Szeretném megköszönni Dr. Hirné Perkecz Anikónak a tudományos ténykedéseim kezdetén tole szerzett metodikai ismereteket és a sok segítséget. Szüleimnek köszönöm, hogy életpályámat egyengették, és tudományos téren való törekvéseimet támogatva biztos hátteret nyújtottak számomra.

- 75 -