GENETIKAI INSTABILITÁS VIZSGÁLATA A B-SEJTES KRÓNIKUS LYMPHOCYTÁS LEUKÉMIA RICHTER TRANSZFORMÁCIÓJA SORÁN
PhD értekezés tézisei Dr. Fülöp Zsolt
Témavezeto : Dr. Matolcsy András Programvezeto : Dr. Jeney András
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Onkológia Program Budapest 2004
Összefoglalás
A krónikus lymphocytás leukémia (CLL) jellemzoen idosebb életkorban kialakuló alacsony malignitású B sejtes non-Hodgkin lymphoma (NHL). Az esetek 5-10 százalékában az egyébként indolens lefolyású kórkép klinikai progressziót és hisztológiai transzformációt mutathat, kialakulhat a szakirodalomban Richter szindrómának nevezett kép. Tanulmányunkban célul tuztük ki, hogy a CLL transzformációja során vizsgáljuk meg a mikroszatellita instabilitást, (MSI) és az instabilitás kialakulásában a hMLH1 és hMSH2 mismatch repair gének esetleges genetikai alterációját, valamint a hMLH1 gén promoterén a CpG sziget metilációs állapotát. Vizsgálatainkat tizenkilenc CLL-ben szenvedo beteg biopsziás mintáin végeztük. Tíz esetben a második mintavétel az elozohöz hasonló szövettani viszonyokat mutatott, kilenc esetben viszont a szövettani kép a CLL diffúz nagy B sejtes lymphomába (DLBCL) való transzformációját
mutatta.
A
tizenkilenc
szövetminta
nyolc
mikroszatellita markerrel történt analízise során a DLBCL-be transzformálódott minták közül négy esetben nagyfokú MSI volt kimutatható, ugyanakkor a nem transzformálódott CLL mintákban a MSI csak kis mértékben, vagy egyáltalán nem volt detektálható. A hMLH1 és hMSH2 gének egyetlen mintában sem hordoztak szomatikus mutációt. A hMLH1 gén promoterén a CpG sziget hipermetilációja öt betegnél volt kimutatható a CLL transzformációja elotti és utáni DNS mintában egyaránt. A hMLH1 gén promoterének
hipermetilációja négy esetben a vizsgált mikroszatellita markerek nagyfokú, egy esetben pedig kismértéku instabilitásával járt együtt. Ezen eredmények arra utalnak, hogy a CLL transzformációja DLBCL-be bizonyos esetekben genetikai instabilitással jár, amelynek hátterében
a
hMLH1
mismatch
repair
gén
epigenetikai
inaktiválódása állhat, ugyanakkor a hMLH1 és hMSH2 gének a folyamat során strukturálisan nem érintettek.
Bevezetés és célkituzések
A krónikus lymphocytás leukémia (CLL) elsosorban idosebb életkorban kialakuló, indolens klinikai viselkedésu B sejtes nonHodgkin lymphoma (NHL), ami az esetek 5-10 százalékában diffúz nagy B sejtes lymphomába (DLBCL) progrediálhat. A hisztológiai transzformáció,
amit
a
klinikai
terminológiában
Richter
szindrómaként vagy Richter transzformációként említenek, a klinikai lefolyás
progresszióját,
a
túlélési
ido
csökkenését
és
rossz
prognózist jelent. A
CLL
morfológiai
transzformációjának
és
klinikai
progressziójának molekuláris finommechanizmusa még nem teljesen ismert. CLL-ben a bcl-2 onkoprotein szintje igen magas, jóval magasabb mint nem tumoros lymphocytákban. A BCL-2 gén fokozott expressziója képes kivédeni az apoptózist és a CLL daganatos sejtjeinél
hosszabb
túlélési
idot
eredményez.
A
kórosan
megnövekedett élettartamú sejtekben addícionális genetikai zavarok halmozódhatnak fel, melyek a már meglévo genetikai aberrációkhoz csatlakozva
szelektív
növekedési
elonyhöz
és
a
tumor
progressziójához vezethetnek. A Richter szindróma kialakulásához kapcsolódóan több kromoszómális és DNS szintu anomáliát említ a szakirodalom, a leggyakrabban jelzett kromoszómális zavarok a 12. kromoszóma triszómiája, valamint a 13q14, 11q22-23, 17p13, 6q21 kromoszóma-régiókat érinto deléciók. A Rb és a p16/INK4A gének
deléciója, a p53 tumorszuppresszor gén mutációi, a C-MYC gén amplifikációja, az A-MYB gén csökkent expressziója szintén a CLL transzformáció utáni stádiumához kapcsolható. Ezek a zavarok meglehetosen heterogének és egyikük sem tunik olyan domináns genetikai léziónak amely önmagában felelos lehetne a lymphoma transzformációjáért. A kialakuló DLBCL sejtjeinek multiplex genetikai léziót hordozó sajátsága azt sugallja, hogy a CLL daganatos sejtjei közül az általános genetikai instabilitást mutató sejtek predisponáltak a hisztológiai transzformáció elszenvedésére. A tumorok egy részében a genetikai instabilitás nukleotid szekvencia szinten, mint DNS replikációs hiba jelenik meg, mely általában
a
rövid
repetitív
szekvenciák
(mikroszatelliták)
hosszúságának eltérését okozza, így detektálható. A mikroszatellita instabilitás (MSI) gyakran jár együtt a DNS mismatch repair gének szomatikus
mutáció,
vagy
promoter
hipermetiláció
okozta
inaktiválódásával. Annak
tanulmányozására,
transzformációja
összefüggésbe
hogy
a
hozható-e
CLL a
hisztológiai genetikai
instabilitással, longitudinális mikroszatellita analízist végeztünk olyan CLL-ben szenvedo betegek biopsziás mintáin, akiknél a kórkép a második mintavételnél nem mutatott változást, illetve Richter szindrómába progrediált. Vizsgálatunk további szakaszában a hMLH1 és hMSH2 gének nukleotid szekvenciáit valamint a hMLH1 gén
promoterének
metilációs
állapotát
tanulmányoztuk
annak
eldöntésére, hogy a DNS mismatch repair gének defektusai a CLL transzformációjának velejárói lehetnek-e.
Anyag és módszer
Beteganyag Tanulmányunkhoz tizenkilenc beteg szövettani mintapárjait használtuk, akiknél a Stanford University Medical Center illetve a Semmelweis Egyetem I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetében
CLL-t,
illetve
DLBCL-t
diagnosztizáltak.
A
mintaválasztás alapját a molekuláris vizsgálat okra is alkalmas fagyasztott biopsziás minták valamint vérminták megléte képezte. A szövettani
diagnózis
minden
esetben
hisztopatológiai,
immunfenotípus és immungenotípus vizsgálatokon alapult a WHO lymphoma klasszifikációjának megfeleloen. Tíz betegnél a második biopsziás minta szövettana megegyezett az elso minta szövettani vizsgálatának
eredményével.
Kilenc
betegnél
a
második
mintavételbol származó nyirokcsomó minták a DLBCL hisztológiai képének megfelelo elváltozást mutattak. Az egy adott betegtol származó elso és második biopsziás minta klonális kapcsolatának elemzése céljából az immunglobulin nehéz láncán (IgH) a variábilis régió (V H ) 3. komplementaritást meghatározó régióját (CDR3) vizsgáltuk polimeráz láncreakcióval (PCR). Minden esetben az ugyanattól a betegtol nyert két-két biopsziás minta DNS -ében identikus IgH génátrendezodés volt kimutatható, ami a tumorminták azonos klonális eredetére enged következtetni.
DNS izolálás Genomikus
DNS-t
natív
szövetmintákból
telített
NaCl
felhasználásával, kisózásos módszerrel nyertünk. A szövetmintákból izolált DNS koncentrációját 260 nm hullámhosszon határoztuk meg fotométer segítségével. A DNS tartalom meghatározása után a mintákat 4°C-on tároltuk.
Mikroszatellita instabilitás vizsgálatok A mikroszatellita szek venciák analíziséhez nyolc, különbözo kromoszómaszakaszra
specifikus
mikroszatellita
markert
vizsgáltunk: öt dinukleotid szekvenciát (DCC, D6S262, D3S1261, D3S1262,
MYC),
tetranukleotidot génszakaszt
egy
(ACTB2 PCR
trinukleotid és
technikával
FGA).
markert Minden
amplifikáltunk.
(AR)
és
két
mikroszatellita A
primerek
szekvenciáinak kiválasztásához a Genome Data Bank (GDB, Baltimore MD) adatain alapuló, Integrated DNA Technologies (Corallville, IA) szekvenciáit használtuk. A PCR termékeket 6%-os denaturáló poliakrilamid-TBE gélben 1500 volt feszültségen, 70 watton, a hosszúságuktól függoen 2-4 órán át futtattuk. A géleket 10%-os ecetsavban fixáltuk, szárítottuk majd -70°C-on röntgenfilmre exponáltuk.
A hMLH1 és hMSH2 gének vizsgálata „Single Strand Conformation Polymorphism ” (PCR-SSCP) módszerrel
A hMLH1 gén PCR-SSCP vizsgálatát öt exonon végeztük el (9., 11., 14., 15. és 16. exon), amelyek kiválasztását korábban közölt mutációs
vizsgálatok eredményeire alapoztuk. A hMSH2 gén
esetében a PCR-SSCP analízis a cDNS 2020-2225 nukleotid pozíciójában történt, a genomikus DNS intront/exont tartalmazó „fl anking” régiójának megfeleloen. A hMLH1 és hMSH2 gének PCRSSCP
vizsgálata
korábban
közzétett
leírásoknak
megfeleloen
történt. A PCR termékeket nem denaturáló 6%-os poliakrilamid-TBE gélen 300 volt feszültségen, 5-10 watton, 12-16 órán keresztül elektroforetizáltuk. A géleket 10% -os ecetsavban fixáltuk, majd szárítás után -70°C-on röntgenfilmre exponáltuk.
A hMLH1 gén promoter metiláció vizsgálata A hMLH1 gén promoterének metilációs állapotát korábban publikált útmutatások szerint, speciális restrikciós endonukleázok felhasználásával, PCR technikán alapuló vizsgálattal mértük fel a genomiális DNS -ben. A genomiális DNS-t HpaII és MspI enzimekkel a gyártó cég (New England Biolabs, Beverly, MA) útmutatásai szerint emésztettük. A külön-külön emésztett DNS-bol a hMLH1 gén promoter szakaszát amplifikáltuk PCR technikával. Az alkalmazott restrikciós endonukleázok DNS hasítási sajátságaikból kifolyólag diszkrét PCR terméket csak a HpaII enzimmel való emésztés után, és csakis akkor nyerhettünk, ha a kérdéses biopsziás mintából származó DNS-ben a hMLH1 gén promoter szakasza metilált volt.
Eredmények és következtetések
Mikroszatellita analízis A CLL és a megfelelo DLBCL mintapárokat minden esetben párhuzamosan vizsgáltuk, nyolc mikroszatellita markerrel. Pozitív lókuszt véleményeztünk, ha a CLL-bol származó DNS és a transzformált DLBCL-bol származó DNS minták elektroforetikus migrációja különbözo mintázatot mutatott. Egyértelmuen MSI-nak nyilvánítottuk azokat az eseteket, ahol a DLBCL-bol származó DNS minták
migrációja
során
egy
vagy
több
új
migrációs
csík
megjelenését tapasztaltuk a neki megfelelo CLL-bol származó DNS mintához
képest.
Allélvesztést
(loss
of
heterozygosity,
LOH)
azokban az esetekben tekintettük adottnak, ahol az elektroforézis során a CLL-bol származó DNS több migrációs csíkot mutatott, mint a DLBCL-bol származó DNS minta. Kilenc betegnél, akiknél a CLL a második mintavételnél szövettani transzformációt mutatott, összesen 28 eltérést mutattunk ki a vizsgált mikroszatellita lókuszokon a biopsziás mintapárokban. Tizenkilenc esetben MSI-t, kilenc esetben LOH-t detektáltunk. Annál a tíz betegnél, akiknél a CLL nem mutatott progressziót a második biopsziás mintavételnél, összesen öt eltérést
találtunk a vizsgált mikroszatellitákban: négy esetben MSI, egy esetben LOH jelentkezett. Két beteg esetében a CLL és a DLBCL mintákban vizsgált mikroszatellita markerek nem mutattak eltérést. Mivel a tanulmányunkban vizsgált betegektol nem tumoros DNS minta nem volt nyerheto, továbbra is kérdés marad, hogy a mikroszatellita eltérések már a CLL stádiumban elofordulnak-e, vagy csak a tumorprogresszió során jelennek meg.
A hMLH1 és hMSH2 gének PCR-SSCP vizsgálata A
hMLH1
és
hMSH2
gének
PCR-SSCP
vizsgálatát
tizenkilenc beteg esetében végeztük el. Az elso és második biopszia során nyert mintákat minden esetben párhuzamosan vizsgáltuk. A PCR-SSCP vizsgálatok során minden esetben identikus migrációs mintázatot találtunk, ami hangsúlyozza annak a valószínuségét, hogy a hMLH1 és hMSH2 gének nukleotid eltérései nem fordulnak elo sem CLL-ben sem annak transzformált, DLBCL változatában.
A hMLH1 gén promoter metiláció vizsgálata A hMLH1 gén promoterén a CpG dinukleotidok metilációs állapotának felmérésére a biopsziás mintákból izolált DNS-ek HpaII illetve MspI enzimmel való emésztése után PCR reakciókat végeztünk. A PCR termékek kiértékelése minden beteg esetében párhuzamosan történt a két biopsziás mintának megfeleloen. Öt esetben a CLL és a megfelelo DLBCL mintából izolált DNS -ben a hMLH1 promoter régió csak MspI ezimmel volt emésztheto, a HpaII enzim képtelen volt hasítani a vizsgált szekvenciát. Ezek az
eredmények arra utalnak, hogy ezeknél a DNS mintáknál hMLH1 gén promoter szakaszán a vizsgált régióban (-670 és –67 pozícióban levo bázisok között) a CpG dinukleotidok metiláltak voltak a CLL és a megfelelo DLBCL mintákban. A fennmaradó mintákban a hMLH1 gén promotere nem mutatott hipermetilációt. A mikroszatellita analízis és a hMLH1 gén promoter metiláció vizsgálatának összehasonlítása A biopsziákból származó DNS minták nyolc mikroszatellita markerbol álló panellel történt átfogó vizsgálata MSI-t tárt fel három esetben, ahol a CLL nem mutatott progressziót, illetve hét esetben azoknál a betegeknél, akiknél a kezdeti CLL a második biopsziás mintavétel idopontjára DLBCL-be transzformálódott. A MSI mértéke is különbözo volt a két betegcsoportban: míg a transzformációt nem mutató eseteknél maximálisan két markerben jelentkeztek eltérések, addig a Richter-szindrómába progrediált eseteknél az instabilitást mutató markerek száma egytol négyig terjedt. Eredményeink szerint nagyfokú MSI jelentkezett a Richter transzformációt mutató esetek közül négyben, ugyanakkor ilyen mértéku MSI-t nem mutattunk ki egyetlen olyan esetben sem ahol a CLL nem progrediált. A vizsgált Richter szindrómás minták közül öt esetben összesen kilenc mikroszatellita lókusznál volt a LOH kimutatható. Ezzel szemben a szövettani
transzformációt nem mutató CLL esetek közül csak
egyetlen esetben találtunk LOH-t egyetlen mikroszatellita markernél, ami szintén csak azt erosíti meg hogy a genetikai instabilitás hozzájárulhat
a
lymphoma
transzformációjához.
progressziójához
és
szövettani
Herediter és sporadikus szolid tumorokban szoros összefüggést mutattak ki a MSI és a mismatch repair gének strukturális zavarai között.
Annak
érdekében
hogy
felmérjük
a
Richter
transzformációban jelentkezo MSI és a mismatch repair génekben esetlegesen bekövetkezo genetikai vagy epigenetikai zavarok közötti összefüggést,
a
hMLH1
és
hMSH2
mismatch
repair
gének
leggyakrabban mutációt szenvedo exonjait és a hMLH1 gén promoterét vizsgáltuk, ám strukturális elváltozást nem tudtunk kimutatni bennük. Ezzel szemben
a hMLH1 gén promotere
hipermetiláltnak mutatkozott öt progrediáló esetben, a CLL és a belole kialakuló DLBCL mintákban egyaránt. A szövettanilag nem transzformálódó esetekben a hMLH1 gén promoterén hipermetilációt nem tudtunk kimutatni. Továbbra is nyitott kérdés marad, hogy a hMLH1
gén
promoterét
érinto
hipermetiláció
a
lymphoma
transzformációjának speciális velejárója-e, vagy csak egy nem specifikus megnyilvánulása a tumoros szövetekben különbözo gének promoterén megfigyelheto hipermetilációnak. A hMLH1 promoter hipermetilációja a CLL és az abból kialakult DLBCL mintákban arra utal, hogy a DNS metiláció zavarai a CLL bizonyos eseteiben már a korai stádiumban kialkulhatnak, és végigkísérhetik a tumor klonális evolúcióját. Az öt esetbol ahol a hMLH1 promoter hipermetilációját kimutattuk a CLL és a megfelelo DLBCL mintákban, négy esetben a DLBCL mintákban nagyfokú MSI-t tapasztaltunk az eredeti CLL mintákhoz képest. Habár a tanulmányunkban használt hisztológiai transzformációt szenvedett CLL esetek nem tumoros szövettani mintái nem voltak elérhetoek, és így kérdéses maradt, hogy a MSI
bekövetkezhetett-e még a CLL szövettani transzformációja elott, eredményeink azt sugallják hogy a MSI iniciációját a hMLH1 gén promoterének hipermetilációja nagymértékben elosegíti. A vizsgálatunkban detektált MSI, LOH és hMLH1 promoter hipermetiláció fényében úgy tunik, több olyan onkogenetikus útvonal létezik amely hozzájárulhat a CLL Richter transzformációjához. A hMLH1
gén
promoterének
hipermetilációja
CLL-ben
és
a
következményes MSI kialakulása a DLBCL-ben kétségkívül egyike lehet azoknak a molekuláris mechanizmusoknak, melyek bizonyos esetekben szerepet játszanak a Richter szindróma kialakulásában.
A dolgozat alapját képezo közlemények Fülöp Z, Csernus B, Tímár B, Nagy M, Matolcsy A: Microsatellite instability and hMLH1 promoter hypermethylation in Richter’s transformation of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 17: 411415, 2003. Gömöri É, Fülöp Z, Mészáros I, Dóczi T, Matolcsy A: Microsatellite analysis of primary and recurrent glial tumors suggests different modalities of clonal evolution of tumor cells. J Neuropathol Exp Neurol 61: 396-402, 2002. Timár B, Fülöp Z, Csernus B, Angster C, Bognár Á, Szepesi Á, Kopper L, Matolcsy A: Relationship between the mutational status of VH genes and pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma in Richter`s syndrome. Leukemia 18: 326-330, 2004.
Eloadások és poszterek Fülöp Z, Csernus B, Timár B, Matolcsy A: Genetikai instabilitás és hMLH1 promoter hipermetiláció szerepe a CLL Richter transzformációja során. Malignus Lymphoma Konferencia, Szeged, 2002 április 25-27. (Poszter) Timár B, Fülöp Z, Csernus B, Matolcsy A: Lymphomák metilációs státuszának elemzése citozin extenziós teszt segítségével. Malignus Lymphoma Konferencia, Szeged, 2002 április 25-27. (Poszter) Fülöp Z, Csernus B, Timár B, Matolcsy A: Genetikai instabilitás és hMLH1 promoter hipermetiláció szerepe a CLL Richter transzformációja során. PhD Tudományos Napok, Budapest, 2002 június 7-8. (Eloadás) Timár B, Csernus B, Fülöp Z, Matolcsy A: Lymphomák metilációs státuszának elemzése citozin extenziós teszt segítségével. PhD Tudományos Napok, Budapest, 2002 június 7-8. (Eloadás) Fülöp Z, Csernus B, Timár B, Angster C, Matolcsy A: Genetikai instabilitás és hMLH1 promoter hipermetiláció szerepe a CLL Richter transzformációja során. A Magyar Hematológiai és Transzfúziológiai Társaság XIX. Kongresszusa, Debrecen, 2003 május 22-24. (Eloadás) Fülöp Z, Matolcsy A, Casali P: Microsatellite instability and hMLH1 promoter hypermethylation in Richter’s transformation of chronic lymphocytic leukemia. First Immunology Fair, Irvine, 2003 november 5. (Poszter)
