FVO Nr. I 3120D I. Auteurs P.H.M. Vrij korte Piet Heinstraat CG Den Haag H.M van Veldhuizen Zandhofsestraat GJ Utrecht

•••f

,ltti

TU Delft

o

o

o

o

o

o

o

o

o

FVO Nr. I 3120D I Fabrieksvoorontwerp Vakgroep Bioprocestechnologie

Onderwerp FABRIEKSVOORONTWERP voor de PRODUKTIE van j1-INTERFERON met behulp van E. COL!; Hergebruik van hulpstoffen

Auteurs P.H.M. Vrij korte

Telefoon 070-3616822

Piet Heinstraat 135 2518 CG Den Haag

H.M van Veldhuizen

030-718453

Zandhofsestraat 78 3572 GJ Utrecht

Keywords l1-interferon, oxidatie, reductie, hulpstoffen, dithiothreitol, sodiumdodecylsulfaat, ureum

Datum opdracht: Datum verslag

september 1994 december 1994

Samenvatting Een medicijn dat sterk in ontwikkeling en opkomst is in de strijd tegen ziekten als kanker en MS is p-interferon. Gezien het gunstige perspectief zal op korte termijn een grote behoefte zijn aan dit medicijn. In dit verslag wordt de produktie van humaan p-interferon uit een E-Coli stam besproken. Het produkt wordt in de vorm van inclusion bodies opgeslagen in de cel. In een fed-batch proces van 3.9 m3 wordt de fermentatie uitgevoerd bij een temperatuur van 37°C. Na de fermentatie volgt de opwerking die bestaat uit verwijdering van het medium, cel-disruptie, oplossen van inclusion bodies, extraktie, precipitatie, refolding en verdere opzuivering met behulp van size exclusion chromatografie. Uiteindelijk wordt per jaar 40 kg p-interferon verkregen met een zuiverheid van 98 %. Op jaarbasis worden 100 batches uitgevoerd.

De nadruk in dit proces ligt op het hergebruik van hulpstoffen ten behoeve van de unfolding en refolding. Daarbij wordt uitgegaan van de base-case zoals die nu bij Chiron wordt uitgevoerd. Er wordt met name gekeken naar de duurste hulpstoffen, SDS en DTT. Vervanging van SDS door ureum in de opwerkingsstappen na de extraktie levert een besparing van ft. 81600, = per jaar. Door de refoldingstap fed-batch uit te voeren wordt de yield van deze stap verhoogd van 91 naar 99.5%. Hergebruik van de waterfase uit vloeistof-vloeistof extractie, die veel DTT en SDS bevat, levert een besparing op het gebruik van hulpstoffen van ft.670.ooo, = per jaar. Tevens wordt de yield van de oplos- en extractiestap verhoogd van 46.4 naar 61.3 %, doordat een gedeelte van het interferon wordt teruggevoerd. Een nadeel van deze optie is dat er hergebruik van niet gesteriliseerd materiaal plaatsvindt. Tenslotte worden de grote afvalstromen van een van de 'size exclusion' chromatografie kolommen en van een ultrafiltratieunit hergebruikt. Op deze manier wordt ft. 328.000, = per jaar bespaard. Over het totale proces bekeken levert de alternatieve procesvoering een besparing van hulpstoffen en een verbetering van de opbrengst op. Het gebruik van hulpstoffen daalt met ft. 850.000,= per jaar ten opzichte van de 'base case'. De totale kosten van hulpstoffen per kg geproduceerd p-interferon dalen van fl 161000,= in de base case naar fl 139.000,= in dit proces. De totale opbrengst van het opwerkingsproces stijgt van 20.1 % naar 27.4% van de in de fermentatie geproduceerde hoeveelheid. Deze twee effecten samen resulteren in een kostprijsverlaging van ft. 1,46/mg in de base case naar ft. 1, 16/mg in dit proces. Hierbij wordt uitgegaan van een ROl van 35 %. De huidige verkoopprijs is ft. 100, =/mg.

INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING 1.1. Algemeen. 1.2. Probleemstelling. 2. KEUZE PROCESROUTE 3. UITGANGSPUNTEN VAN HET ONTWERP 3.1. Exogene gegevens. 3.2. Endogene gegevens. 3.3. Veiligheidsmaatregelen en afvalverwerking. 4. BESCHRIJVING VAN HET PROCES 5.APPARATUURBEREKENINGEN 6. MASSA- EN WARMTEBALANS 7. OVERZICHT EN SPECIFICATIE VAN DE APPARATUUR 8. GEVOELIGHEIDSANALYSE 9. PROCESBEHEERSING 10. ECONOMIE 11. CONCLUSIES EN AANBEVELINGEN LITERATUUR BIJLAGE 2.1: stap- en overall yields base-case en FVO 3120D BIJLAGE 4.1: proces stappen met bijbehorende procestijden BIJLAGE 6.1: STROOM- EN COMPONENTENSTAAT BIJLAGE 6.2: MASSA- EN WARMTEBALANS BIJLAGE 7.1 tlm 7.5: APPARATEN LIJST EN SPECIFICATIEFORMULIEREN

Hoofdstuk I: Inleiding

pagina 1.1

1. Inleiding 1.1. Algemeen. Halverwege de tachtiger jaren was er reeds een produktie-route bekend voor p-Interferon (P-IFN) op basis van genetisch gemanipuleerde E. eoU bacteriën. In die tijd wist men echter nog niet voor welke ziekten dit medicijn geschikt zou zijn. Na verschillende klinische proeven bleek dat bepaalde soorten kanker en sommige moeilijk te genezen virussen te bestrijden waren met p-IFN. Sinds kort is zelfs bekend geworden, dat de ziekteverschijnselen van multiple sclerose (MS) met een factor twee uitgesteld kunnen worden met dit medicijn. Door deze bevindingen is er vraag naar p-IFN "gecreëerd", die zo groot is dat de prijs hoog is. Door strenge keuringen en controles op de produktie van medicijnen in het algemeen is het echter niet mogelijk om het bestaande proces even snel aan te passen of verbeteringen aan te brengen. Pas wanneer blijkt dat de vraag naar p-IFN groot is en blijft, kan er overgegaan worden naar een zogenaamde tweede-generatie. Na verloop van tijd zal namelijk de druk op de markt voor p-IFN, door bijvoorbeeld patientenorganisaties, steeds groter worden om de prijs te verlagen. Bovendien liggen concurrenten op de loer om bij het verstrijken van de patenten direct een graantje mee te pikken. In deze tweede-generatie van een medicijn zal de produktie-capaciteit me~stal verhoogd worden. Dit betekent wel dat de producent reeds in een vroeg stadium op de hoogte moet blijven van mogelijke verbeteringen aan het proces en hoe deze verbeteringen op grotere produktieschaal ingepast kunnen gaan worden. Vooral ook omdat de weg, die nodig is voor goedkeuring van een eventueel vernieuwd produktie-proces, lang en tijdrovend is. In dit _vernieuwde proces zullen dan zaken als minimaliseren van de hulpstoffen, terugwinning en hergebruik van de hulpstoffen, en alternatieve routes bekeken worden. Het belangrijkste optimalisatie aspect van het vernieuwde proces zal het economische voordeel zijn. Afhankelijk van de koers, die het bedrijf wil volgen, kan dit een maximaal marktaandeel, een maximale winst of een maximale omzet zijn.

1.2. Probleemstelling.

In dit fabrieksvoorontwerp (FVO) wordt in eerste instantie uitgegaan van een produktieproces. voor p-IFN op basis van door Chiron verstrekte gegevens, de zogenaamde "base case". Gezien de hoge verkoopprijs van p-IFN is het op dit moment nog niet nodig om hulpstoffen terug te winnen en opnieuw te gebruiken. Wanneer de vraag naar p-IFN groot blijft, is het belangrijk om verschillende mogelijkheden te onderzoeken om p-IFN goedkoper te produceren. Er zal dan oo~ gekeken moeten worden naar het hergebruiken van dure hulpstoffen of schonere process,en. Ook "het lozen van milieubelastende stoffen verdient de nodige aandacht. Dit laatste met alleen omdat het laten verwerken hiervan de nodige kosten met zich meebrengt, maar ook gezien de ontwikkelingen van normen en waarden, dat elke producent zijn atvalstroom moet minimaliseren en zelf verantwoordelijk is en blijft voor een milieu-vriendelijke verwerking. Uitgaande van de "base case" zal de nadruk in dit FVO liggen op het hergebruik van hulpstoffen in het proces. .

SDS (UREUM)

DIT

SDS (UREUM)

•

_I

_oyo----'

~I

.. I DIT + SDS (UREUM)

. SDS (UREUM)

DIT + SDS

.1 .

t----...

~

DIT + SDS SDS (UREUM)

t---tl.~

. SDS (UREUM)

~

I

t---I"~

SDS (UREUM)

t----t.~

SDS (UREUM)

DIT + SDS SDS(UREUM)

Hoofdstuk 2: Keuze proeesroute

pagina 2.1

2. Keuze procesroute Bij het produceren van humaan p-IFN door middel van E. eoli bacteriën, wordt het gewenste eiwit tijdens de fermentatie opgeslagen in de vorm van inclusion bodies in de cel. Het eiwit zit daarin samen met DNA materiaal en endotoxines opgehoopt in een niet natuurlijke vorm. Voor een waardevol produkt zal het eiwit daarom in z'n natuurlijke vorm moeten worden gebracht. Hiervoor moet het p-IFN na uit de cel te zijn gehaald door middel van homogenisatie, eerst opgelost worden en moeten de aanwezige intermoleculaire zwavelbruggen verbroken worden door middel van reductie. Als dit heeft plaatsgehad kan het eiwit in z' n natuurlijke vorm worden gebracht door ervoor te zorgen dat de intramoleculaire zwavelbruggen worden gevormd (bij p-IFN 1 stuks), door middel van oxidatie. Verder is het van belang dat het eiwit gedurende een groot gedeelte van het opwerkingsproces in opgeloste vorm blijft. In de 'base case', FVO 3120 A, wordt ten behoeve van deze eisen gebruikt gemaakt van hulpstoffen, die een groot gedeelte van de kosten van het proces bepalen. Om die reden is voor het ontwerpen van dit proces het volgende doel nagestreefd: Het hooffdoel is om zoveel mogelijk te besparen op hulpstoffen, die gebuikt worden voor de reductie en oxidatiestappen en voor het in oplossing houden van de eiwitten. Als belangrijk nevendoel is hierbij van uitgegaan het feit dat verbetering van de yield in de reductie en oxidatiestappen en dus van de overall yield ook een belangrijke besparing van hulpstoffen oplevert. Om bovenstaande doelen te bereiken is eerst een analyse gemaakt van de belangrijkste hulpstoffen en waar deze gebruikt worden in het proces van de 'base case' . Op basis van de prijs zijn de volgende stoffen belangrijk: * dithiothreitol (DTT), dat wordt gebruikt voor de reductie (verbreking van zwavelbruggen), * natrium-dodecylsulfaat (SDS), een detergent, dat wordt gebruikt voor het in oplossing houden van de eiwitten en overig celmateriaal * iodosobenzoëzuur (lBA), dat wordt gebruikt voor de oxidatie (vorming van intramoleculaire zwavelbruggen) . en ureum, dat dient als vervanging van SDS in een gedeelte van het proces (zie * later). Ureum zorgt voor een hoge milieubelasting . SDS en Ureum kunnen altijd hergebruikt worden, omdat ze niet omgezet worden tijdens het proces. DTT wordt echter geoxideerd tijdens de reductie van de eiwitten en mA wordt gereduceerd tijdens de oxidatie-stap. mA wordt equimolair toegevoegd, en wordt dus geheel gereduceerd. mA komt daarom niet in aanmerking voor hergebruik. DTT echter wordt in grote overmaat toegevoegd tijdens de reductiestappen (R 301 en R 402). Tijdens deze stappen wordt ongeveer 2 % van het toegevoegde DTT geoxideerd. De rest kan dus worden hergebruikt. In de figuur hiernaast staat het opwerkingsproces volgens de 'base case' in blokschema weergegeven, met daarin de van belang zijnde in- en uitgaande hulpstoffen: DTT, SDS en Ureum.

Hoofdstuk 2: Keuze procesroute

pagina 2.2

Om het hierboven geformuleerde doel te kunnen bereiken zijn een aantal opties te bedenken om te besparen op huifstoffen enlof gelijkertijd de yield van de betreffende stappen te verbeteren. In het kort zijn dit de volgende: 1. SDS vervangen door ureum, 2. de oxidatie-stap (R 501) fed batch gewijze uitvoeren in plaats van batch gewijze, 3. DTT + SDS in de waterige afvalstroom uit de extractie-stap (C 301) terugvoeren naar de reductiestap (R301) voor hergebruik, 4. hergebruik van DIT + SDS uit de centrifuge (C 302), 5. hergebruik van het eluent van de eerste 'size exclusion' chromatografie kolom (K401), 6. hergebruik van het filtraat van de eerste ultrafiltratie (F501) 7. en hergebruik van de afvalstromen van de tweede 'size exclusion' chromatografie kolom (K 601), van de laatste ultrafiltratie (F 601) en de ontzoutingskolom (K 602). Ad 1. Voor de vervanging van SDS door Ureum geldt dat het een voordeel is dat Ureum aanzienlijk goedkoper is. SDS speelt echter wel een belangrijke rol in de extractie, waardoor p-IFN oplosbaar wordt in de butanol-fase. Daarom is besloten SDS pas te vervangen door ureum vanaf sectie 4 (R401): Oplossen van het precipitaat (eerste SDS gebruik na de extractie). Hierbij wordt uitgegaan van een 8 molair ureumoplossing vanaf het oplossen van het precipitaat (R401) tot en met de eerste size exclusion chromatografie (K401). Voor de oxidatiestap (R501) en de tweede size eclusion chromatografiestap (K601) wordt uitgegaan van een ureum-oplossing van minimaal 4 molair. In de huidige opzet van het proces is de besparing van deze operatie als weergegeven in onderstaande tabel (per batch):

..

Tabel 2 l' Vergelijking van kosten per batch bij gebruik van ureum of SDS

massa (kg) Ureum-verbruik

398

SDS voor oplossen precipitaat (R401)

4.21

SDS voor eerste S.E. kolom (V405)

3.14

SDS voor oxidatie (V504)

kost-prijs (hfl/kg)

prijs (hf1)

(hfl)

totaal kosten (hfl)

afvalkosten

0.42

167

1695

1862

342.80

2629

49

2678

0

SDS voor tweede S.E. kolom (V601)

0.32

Totaal SDS

7.67

pagina 2.3

Hoofdstuk 2: Keuze procesroute Per batch wordt er dus 816 hfl bespaard aan kosten.

Ad 2. In de oxidatiestap moet de concentratie gedenatureerde eiwitten laag zijn om aggregaatvorming (het vormen van intermoleculaire S-bruggen) te voorkomen. In de 'base case' wordt deze stap batch gewijze uitgevoerd. Bij een volume van ongeveer 1000 liter is de yield ongeveer 91 %. Door de oxidatie stap als een fed batch operatie uit te voeren kan de yield aanmerkelijk verbeterd worden, omdat de concentratie gedenatureerde eiwitten laag gehouden kan worden. In hoofdstuk 5 over apparatuurberekeningen is de berekening te vinden van de oxidatiekinetiek. In het huidige proces wordt de stap zodanig uitgevoerd dat een opbrengst van 99.5% makkelijk haalbaar is. Om dezelfde produktie te behalen betekent dit een besparing van: (1-91/99.5)*100% = 8.5 % op het totaal van hulpstoffen en een ook een besparing van enkele procenten op de grootte van de apparatuur. Ad 3. Uit de extractiestap (6) komt een waterige afvalstroom die een grote hoeveelheid hulpstoffen bevat (DTT en SDS). Aangezien DTT in grote overmaat wordt toegevoerd en dus een erg klein gedeelte hiervan geoxideerd is kan deze stroom gedeeltelijk worden teruggevoerd naar de reductiestap . Een bijkomend voordeel is dat hiermee ook p-IFN, dat in de 'base case' wordt weggegooid, wordt teruggevoerd. Deze stroom bevat het p-IFN echter wel in onzuiverder vorm, dan in de hoofdstroom. Voor deze zuiverheid wordt later in het proces gecompenseerd, namelijk bij de tweede size exclusion chromatografie kolom (K601). Om dezelfde zuiverheid te halen gaat de yield van de size exclusion terug van 92 % naar 86 % Een nadeel van deze optie is dat er 2-butanol en zouten in de reductiestap komen, die er eerder niet waren. Verwacht wordt dat dit geen probleem oplevert voor de reductie. Om ophoping van onopgelost materiaal te voorkomen moet dit eerst verwijderd worden. Dit gebeurt door een tiltratiestap (F301) waar het onopgeloste materiaal kwantitatief verwijderd wordt. Om ophoping van zouten en butanol te voorkomen moet een gedeelte van de recycle gespuid worden. Als criterium voor de grote van de recycle wordt de verhouding van de hoeveelheid gebruikt DTT per hoeveelheid geproduceerd p-IFN. De hoeveelheid gebruikt DTT per batch is de hoeveelheid die met stroom 301 wordt toegevoerd. Voor de hoeveelheid geproduceerd p-IFN wordt de hoeveelheid in stroom 310 genomen (is eerste produktstroom buiten recycle) . In de volgende tabel staat de genoemde verhouding uitgezet als funktie van het recyclepercentage (=stroom 318/stroom 315*100%) Tabel 2.2 recycle percentage DTT(301)/P-IFN(31O)

0

20

40

50

60

70

90

10.2

9.51

9.05

8.98

9.10

9.61

15.7


pagina 2.4

Op grond van het bovenstaande is besloten om een recyclepercentage van 50 % te nemen, omdat daar de hoeveelheid DTT per ~-IFN het kleinst is. Als gevolg van deze recycle van ~-IFN wordt er een stroom gerecycled, die niet gesteriliseerd kan worden voor de volgende batch. Om gevaar van 'besmetting' van volgende batches door vorige batches enigzins te beperken is ervoor gekozen ééns in de zoveel tijd stroom 319 niet te recyclen, maar weg te gooien. Het aantal keren is gekozen op 5 maal per jaar, overeenkomend met ééns per 20 batches. Dit heeft echter wel invloed op de productie van de batches na het weggooien. Met behulp van de spreadsheet is gekeken hoeveel procent ~-IFN er in de batches minder wordt geproduceerd. De uitkomst hiervan staat weergegeven in de volgende tabel: Tabel 2.3

nr. batch na weggooien gemiste percentage

~-IFN

1

2

3

4

5

23.2

5.5

1.3

0.3

0

Betrokken op één batch is dit totaal 30.3 %. Deze gemiste produktie is per 20 batches, dus 1.52 % per batch. Bij 100 batches per jaar wordt er standaard per batch 400 gram geproduceerd. Om echter voor dit verlies te compenseren gaan we uit van 1.52 % extra, dus 400*1.0152 = 406 gram. Alle stromen en apparaten zijn daarom berekend op grond van productie van 406 gram p-IFN. De hoeveelheid DTT, die op deze manier in de huidige procesopzet per batch bespaard wordt is 2.14 kg (6700 hfl). Doordat er ook ~-IFN wordt gerecycled wordt er natuurlijk op het geheel van hulpstoffen extra bespaard. De totale yield van de oplosstap en extractiestap (R301 en C301) is van 0.504 in de 'base case' naar 0.656 in dit proces gegaan. Om toch aan de zuiverheid te voldoen is daardoor wel de yield van de tweede 'size exc1usion' chromatografie verlaagd van 0.92 naar 0.86. De overall yield van deze stappen is dan: Base case: Dit proces:

0.504*0.92 = 0.464 0.656*0.86 = 0.613

Ad 4. De lichte fractie uit centrifuge voor het afscheiden van het precipitaat, C 302 bevat een hoeveelheid DTT, dat hergebruikt zou kunnen worden. Het probleem hierbij is echter dat het een butanoloplossing is, die niet eerder dan bij de extractie kan worden teruggevoerd. DTT is echter al bij de reductie nodig. Ad 5. Uit de eerste 'size exclusion' chromatografie kolom (K401) komt een grote hoeveelheid eluent, die in de 'base case' als afval wordt weggegooid. Deze afvalstroom kan na verwijdering van de eiwitten door middel een ultrafiltratie-unit, worden hergebruikt als eluent van de chromatografie kolom (K401). Omdat de stroom echter DTT bevat is de hoeveelheid die als eluent gebruikt kan worden

#323

#101 #104 #105 #107 #108

#406 #403

....- - - I..~ #11 0

.. I

#106

FI03

#402

.. #116

#415 .&. #4 16

#412

r'"

. I M~1 I

#201

#424 #206

#510

#301 #307 #308 #311 #319

#319

I

P,:\()l--.J

#321 #305 #306

•

#322

• •

#603

.. I

FSOI

/kSO;

K601

~

• #511

.. #601

#324 #614

#612

I--~.~

#606


pagina 2.5

berperkt. We stellen daarom dat de DTT concentratie in de produktstroom van de chromatografie kolom (1(601) maximaal 2 mM mag zijn. Op dit criterium zijn de berekeningen voor de grootte van de recycle (#422) gebaseerd. De rest kan worden hergebruikt voor het oplossen van het precipitaat (R40 1). Dit wordt gerecycled via stroom 406. De hoeveelheid Ureum, die op deze manier per batch wordt bespaard is: Voor oplossen precipitaat via stroom 406: Als eluent voor S.E.C.-kolom via stroom 422:

167 kg 316 kg

Ad 6. Het filtraat uit de eerst ultrafiltratie (F501) bevat een grote hoeveelheid ureum. Deze stroom kan daarom worden hergebruikt als eluent voor de eerste 'size exc1usion' chromatografie kolom. Het aanwezige p-IFN wordt echter gesteriliseerd en is dus niet meer in de natuurlijke vorm. Deze stroom wordt gerecycled via stroom 510. Hiermee wordt 225 kg ureum per batch bespaard. Ad 7. Deze stromen bevatten relatief weinig ureum en worden daarom niet hergebruikt In bijlage 2.1 staan de yields van de 'base case' en van dit proces vergeleken in tabelvo~. Bovendien staan de step yields en de overall yields van dit proces daar grafisch weergegeven. In de figuren hiernaast staat de alternatieve procesopzet, waar in dit proces vanuit wordt gegaan weergegeven. _. ____._. __ _. _

Hoofdstuk 3: Uitgangspunten van het ontwerp

pagina 3.1

3. Uitgangspunten van het ontwerp 3.1. Exogene gegevens. Er moet 40 kg p-IFN per jaar geproduceerd worden met een zuiverheid van 98% ten opzichte van totaal eiwit. In één jaar zijn 50 produktie-weken en 2 weken voor een "total shut down" gereserveerd. Per week wordt er 5 dagen continu gewerkt van maandagochtend 9 uur tot vrijdagmiddag 5 uur. Dit geeft 5200 uren netto beschikbaar voor de produktie van 40 kg p-IFN. Er moeten per week twee batches afgewerkt worden. Het p-IFN wordt gewonnen uit met recombinant-DNA technieken behandelde E. eoli, waarbij het produkt als "inclusion bodies " wordt opgeslagen in de bacterie-cellen. Nadat de inhoud van de cellen is vrijgemaakt, moet het p-IFN afgescheiden worden van de overige proteïnen. Tevens zijn "unfolding-" en "refolding-" stappen nodig niet alleen als opzuiveringsstap, maar ook voor het in de juiste conformatie brengen van het p-IFN, voor het gebruik als medicijn bij mensen.

3.2. Endogene gegevens. De fysische eigenschappen van de hulpstoffen staan vermeld in tabel 3.1.

Tabel 3.1. Stofeigenschappen (onder standaard omstandigheden, 298 Ken 1 bar). MWin g/mol

pin kg/m3

TI in

s,in

Pa·s

J/(kg'K)

80% N2 20% O2

29

1.2

1.8.10-5

1300

water

H20

18

1000

1.10-3

4180

ureum

H2NCONH 2

60.06

1323

DTT

C4H lO0 2S2

154.2

EDTA

C1oHl6N 20 g

292.3

glucose

C~1206

180.2

biomassa

CHI.7700.49 NO.22S0.0045 PO.OO55

29

kaliumfosfaat

K3P04

212.3

mA

C7H50 2I

263.9

ammoniurn-sulfaat

(NH4hS04

132

component

formule

lucht

overige

).=0.607 W/(m·K) Tb = 100 °C

Hoofdstuk 3: Uitgangspunten van het ontwerp

pagina 3.2

sucrose

C12H22011

342.3

1581

l-octanol

C8H 18O

130.2

827

0.01

2121

Tm = -16°C Tb = 194 °C

SDS

NaC 12H 1S 0 4S

288.4

2-butanol

C4H lOO

74.1

808

0.003

2885

Tb

= 99.5

°C

3.3. Veiligheidsmaatregelen en afvalverwerking. Het organisme dat gebruikt wordt voor de productie van ~-interferon is een met recombinant DNA genetisch gemanipuleerde E. coli. De wetgeving is zeer strikt bij het gebruik van dit soort organismen en vereist, dat geen enkel levende bacterie uit de opstelling of de fabriek kan onsnappen naar de omgeving. Om aan deze overheidseis te voldoen dient de opstelling "containment proof" te zijn. Dit betekent dat er bewezen moet worden dat tijdens de produktie in die gedeelten van de apparatuur, waar levende cellen aanwezig zouden kunnen zijn, niets vanuit de opstelling naar buiten kan komen. In de fermentor worden de E-coli met 1 volumeprocent l-octanol, een voor de cellen dodelijke concentratie, afgedood. Ondanks dit afdoden is de eis van containment van toepassing tot en met de extractie, waar mogelijkerwijs de laatste 'levende' micro-organismen gescheiqen worden van de productstroom. Vanaf de extractie zal het accent van containment voornamelijk komen te liggen op het weren van vreemde micro-organismen, welke de productstroom (door eiwitafscheidingen) sterk kunnen verontreinigen. Dit gebeurt onder andere door het toepassen van de deadend filtratie. Deze tweede vorm van containment is echter voornamelijk gericht op het garanderen van productkwaliteit. Om te voldoen aan de primaire containment worden een aantal maatregelen genomen. Ten eerste worden de vloeibare afvalstromen uit het proces en uit het schoonmaken afgevoerd naar een kill tank alwaar 100% afdoding (chemische I thermisch) gegarandeerd wordt vóór afvoer naar de rioolwaterzuivering. De gebruikte hulpstoffen, die nodig zijn bij het proces, leveren over het algemeen en bij de condities waarbij gewerkt wordt nauwelijks gevaar op. Alleen in het geval van brand dient er een goede blus installatie aanwezig te zijn, omdat de ontleding van stoffen als DIT, ureum en EDTA zure gassen geeft, die gevaarlijk zijn bij blootstelling. Verder dient er vanwege het gebruik van een genetisch gemanipuleerd micro-organisme reeds gewerkt te worden volgens de GILSP-GSI (Good Industrial Large Scale Practice-klasse 1). Dit houdt in dat de werknemers bijna niet in aanraking kunnen komen met de stoffen in het proces en bovendien speciale kleding en mondbeschermmg moeten dragen.

11

11

t

.... ~

+ t

(I) ,....

~

(I)

~

o.....

VJ

el)

Q

~ ~ o ~

stoom stikstof (2)

~

~

N ~

~

VJ

Q

~ ~

~Q

~

stikstof (2)

z » » ;0

e ~ .. L.o

...-4 ~

~

~

00;0 fT!

stoom

o C

()

:::!

VJ

fT!

~

.c VJ

.

~

o

stikstof (2) afgas (8)

C

~

...-4

"'Cl ~ .t:J

lucht \"

@D

~

.

...-4

afval (7) afvalstroom

"I:!'

L.o

='

~

~

lucht (5 bar) uit compressiesysteem stikstof (5 bar) R 101 Fermentor + terugvoervat P 101 Doseerpomp stoom (3 bar; 190 C) P 102 Doseerpomp koelwatercircuit (10 C) F 101 Sterilisatiefil ter warmwater (70 C) F 102 Filter leidingwater afval( water+vast) naar afdodingstank P 103 Drukpomp F 103 Crossflow Microfilter s naar een tra al afgassysteem

P 201

P M C V V

202 201 201 201 202

Drukpomp Voedingspomp Homogenizer Tubular Bowl Centrifuge Voorraadvat Homogenizer Voorraadvat Homogenizer

FVO 3120 D: PROCESSCHEMA VOOR DE PRODUKTIE VAN BETA-INTERFERON (BLAD Peter Vrijkorte en Henry van Veldhuizen december 1994

@>stroomnr.(][]temperatuur (C)

druk (bara)

Hoofdstuk 4: Beschrijving van het proces

pagina 4.1

4. Beschrijving van het proces In het nu volgende hoofdstuk wordt een beschrijving van het proces gegeven. Dit zal geschieden aan de hand van het flowsheet in figuur 4.1, blad 1,2 en 3. In paragraaf 4.7 wordt de cycle time analyse beschreven.

4.1. Sectie 1: de fermentatie. In de fermentor, R101, wordt een groeimedium gebracht vanuit VlOl. Vervolgens wordt geïnoculeerd met een reeds ontdooide voorkweek. Deze bestaat uit een met recombinant DNA-techniek behandelde E. coU van de stam K12. Na een lag-fase van 5 uur zal aan de fermentor fed-batch substraat toegevoegd worden uit V102 onder aerobe omstandigheden, waarbij exponentiële groei plaatsvindt. De lucht die hiervoor nodig is wordt eerst door een filter, F101, ontdaan van m.o. van buitenaf. Ook de afgassen worden gefilterd in F102 om te voorkomen dat de genetisch gemanipuleerde m.o. ontsnappen uit de fabriek. Na 18 uur exponentiële groei zal de fermentor zodanig bedreven gaan worden, dat de celculture overgaat naar de produkt-fase, waarbij vooral p-interferon geproduceerd wordt, dat opgeslagen wordt in "inclusion bodies ". Deze fase in de fermentatie zal 6 uur in beslag nemen. De celdichtheid is aan het eind van de fermentatie 13.3 gIl. Tenslotte worden de cellen geïnactiveerd met l-octanol, V103, gedurende 1 uur.

Na het afdoden wordt de celsuspensie in de fermentor geconcéntreerd middels cross-flow microfiltratie, F103, waarbij gecirculeerd wordt over het membraan en fermentor. Deze concentreringsstap tot 100 gIl neemt drie uur in beslag. Hierna wordt met een fosfaat gebufferde saline-oplossing uit VI04 de geconcentreerde celsuspensie gewassen, waarbij het droge stofgehalte op het eind weer 100 gil is. Bij deze diafiltratiestap worden de opgeloste componenten (zouten, exoenzymen, glucose en octanol) merendeels uitgewassen. Er gaat 5% p-IFN verloren door kapotgeslagen E. coU cellen en door het dode volume in het membraan. De afvalstroom van de microflltratie verloopt via het vat V105. Af en toe zal dit vat onder druk worden gezet om de microflltratie te "back flushen" .

4.2. Sectie 2: de eerste opwerkingsfase. De geconcentreerde celsuspensie wordt vervolgens naar de eerste tank, V202, van de homogenizer verpompt. In de homogenizer, M201, wordt de celsuspensie in 2.2 uur drie maal batchgewijs doorgevoerd via de tanks V201 en 202. Hierbij wordt door afschuifspanningen vanwege een grote drukval (450 bar) de celwand kapotgeslagen, waarmee de inclusion bodies met 60% p-IFN vrijkomen. Bij drie passes komen 87% van de "inclusion-bodies" vrij uit de cel en wordt de viscositeit als gevolge van vrijkomend DNA en eiwit niet te hoog. Koeling, H201, van de suspensie is nodig. Met behulp van een doseerpomp wordt de suspensie samen met een sucrose-oplossing uit V203 gevoed aan vier tubular bowl vloeistof-vast-centrifuges, C201. De sucrose-oplossing helpt bij de afscheiding van de solide "inclusion bodies" met relatief hoge dichtheid (1300 kg/m3) van de waterfase met opgeloste en lichtere, onopgeloste, celrestanten. In deze 8.2

• ~

afgas(8)

°l lIl

N

0I- t o o (TI ..... -illl-t

~

Q)

'Q

I c:r

}>

c

o

1.0 o

Ol

Ol

~

~:

o

N

S:

.

~

o

.

Ol

r?

~

eb ..,

r?

oOl

o

I~0

0 1-t

r?-t

Cl>

3 ..,

afgas(~)

IC I(TI

~

~

o

0 '" 0 00 r?(l)(l)-t Cl> r? C }>

r?

.., Cl>

.., 0

Ol

.....,0 Ol .....

o

3

~:

N

'Q

~

.;; Q)

~ 5 (IJ

stoom

Q)

~

(IJ (IJ

~

=

~ ~

) ~4

.. K.W.CÎrcuit

i) ~14

.. W. W.CÎrcuit

~

c. <:) Q)

'Q

E ..

~

fosfaat

~ (IJ

1~

stoom (3)

<:)

c N

z

}> }>

.... -'t 'Q ~

Q)

.c

Q)

..

(IJ

.=

.-c

~

~~

!3

;u

o

~

pHC1r-------

afval(7~

~

6'n~ .c. ~ <:)

[LEGENDA: zi~ lP , R 301 Reductie + Extractietank 'p R 302 Precipitatietank P C 301 L-L Centrifuge P C 302 Tub.B Centrifuge P

ElLAO-l-j

301 302 304 305 306

R Doseerpomp Doseerpomp F Voedingspomp R Voedingspomp V Voedingspomp F

401 Tank voor oplassen P 401 precipitaat P 402 401 Dead end filter P 403 402 Reductietank V 405 K 401 404 Recyclevat 402 Ultrafiltratie P 404

~14

I ~I.

@

~

x 6 }> (TI ::l

afvalstroom (7) Voedingspomp FVO 3120 D: PROCESSCHEMA VOOR DE Doseerpomp PRODUKTIE VAN BETA INTERFERON (BLAD 2) Voedingspomp Peter Vrijkorte en Henry van Veldhuizen Eluentvloeistoftank december 1994 S.E. kolom @straomnrOO temperatuur (C) Voedingspomp druk (bare)


pagina 4.2

uur durende centrifugestap worden de "inclusion bodies" met een droge stofgehalte van 200 gil batchgewijs uit de centrifuges geschrapt met een opbrengst van 90%.

4.3. Sectie 3: de tweede opwerkingsfase. Om de extractie uit te kunnen voeren dienen de inclusion-bodies uit de celdisruptie te worden opgelost. De oplosstap en de extractie worden na elkaar uitgevoerd in hetzelfde vat R 301. Voor het oplossen wordt gebruik gemaakt van SDS, dat als detergent de eiwitten in oplossing houdt. Tevens wordt denaturant (DTT) en een chelating agent (EDTA) gebruikt. Genoemde stoffen worden toegevoegd vanuit vat V301. Hierin is ook een gedeelte aanwezig vanuit de vorige batch, inclusief p-IFN. Na de sterilisatie, die wordt uitgevoerd vóór het bijvoegen van de stroom uit de vorige batch (319), wordt het vat afgekoeld tot 78°C. Samen met de stoom uit de vorige batch(319) en de produktstroom uit de centrifuge (209) levert dit een temperatuur van 50°C. Deze temperatuur is vereist voor het oplossen in R301. Na een reaktietijd van 10minuten, gevolgd door afkoelen en pH-correctie tot pH 7.0 is 95% van de inclusion-bodies en dus van p-IFN opgelost. De extractie wordt uitgevoerd door het toevoeren van 2- butanol aan het oplosvat (R301), zodanig dat een 1 op 1 (v/v) water-butanol systeem ontstaat. Tevens wordt een hoeveelheid keukenzout toegeveogd voor het uitzouten van p-IFN en voor een verlaging van de oplosbaarheid van 2-butanol in water. De water en butanol-fasen worden gescheiden met behulp van een vloeistof-vloeistof centrifuge (C302). Een gedeelte van de waterfase (zie hoofdstuk 2) die uit de centrifuge komt wordt gefiltreerd in een 'dead end' operatie (F301; O.22jLm) voor het verwijderen van onopgelost materiaal. Vervolgens wordt deze stroom (319) teruggevoerd naar het voorraadvat (V301) voor de oplosstap. Met deze stroom wordt een grote hoeveelheid van de benodigde hulpstoffen en van p-IFN teruggevoerd en hergebruikt. De butanol-fase uit de centrifuge gaat door naar de precipitatietank (R302). De zure precipitatie wordt uitgevoerd door het toevoegen van een hoeveelheid fosfaatbuffer uit V303 gelijk aan 1/3 van de hoeveelheid 2-butanol. Hierna wordt de pH op 5 gebracht met behulp van ijsazijn (306). De precipitatie duurt 3 uur. Met behulp van twee tubular bowl centrifuges (C302; zelfde als bij het terugwinnen van de inclusion bodies in sectie 2: C201) worden de geprecipiteerde eiwitten gedurende 3 uur in geconcentreerd tot een concentratie van 200 gIl. Het concentraat gaat door naar de tank voor het oplossen van het precipitaat (R401) in sectie 4.

4.4. Sectie 4: de derde opwerkingsfase. In R401 wordt het concentraat gedurende 10 uur opgelost en verdund tot 3 gIl. Hiervoor wordt ureum (8M), EDTA (5mM) en fosfaatbuffer (50mM) toegevoegd via stroom 403. In deze stroom zit een gedeelte gerecycled materiaal (stroom 406) uit de vorige batch (zie verder in de beschrijving van deze sectie). Vanuit R401 wordt de productstroom door een "dead end" filter van 0.22 jLm geperst, F401, waarmee onopgelost materiaal verwijderd

o.....

o

.0

IQ

o

(1)

o

~ !='

o

o

.0

.0

o

o

(I)

~

cl

Ol -i . . g C3 »

... (1) (1) ...

IQ

o

(1)

en'"

..i> IoC

o.....

o () .... [Tl 0

~J1,. .~

... (I)

o

~

.0

...o (I)

;:!:. N '--'

'-'

~

o(I)

.-... ~

(1)

~ til

stoom (3

= (1)

(1)

~

stoom (3)

til til 0.()

=

~

~"'"

c. o (1)

"C

.S:á:l

'!i

~ til

...: ~ .s::til

z

» »

~

;0

o

-., o

C

.. ('f")

-..c.. "C ~

~

Noor eluent voorraadvat (V405) 1§)

........ ~ (1)

.,~

.,4

®

~~ r

[Tl

::Q

z

~

=

Cl

~!i! "'" ::s

"'" (1)

~

0

afval I (7)

afval (7

~~ .... c.

R 501 F 501 P 501 [LEGENDA: zie BLAD 1

I

P 502 P 503 P 504

Oxidatietank Ultrafiltrotie Doseerpomp Doseerpomp Doseerpomp Voedingspomp

V 602 V 6031 Eluentvloeistoftank K 601 S.E. kolom P 602 Voedingspomp

P 602 P 603 K 602 V 603

Oxidatietank Voedingspomp Voedingspomp Ontzoutingskolom Eluen tvlaeistaftank

Afvalstroom

FVO 3120 D: PROCESSCHEMA VOOR DE PRODUKTIE VAN BElA INTERFERON (BLAD Peter Vrijkorte en Henry van Veldhuizen

3)

december 1994

@stroomnrG[) temperatuur (C)

druk (bora)


pagina 4.3

wordt. In de opvolgende reductiestap, R402, wordt evenals in de oplosstap het p-IFN volledig ontvouwen door toevoeging van extra DTT als denaturant uit V402. De pH wordt verhoogd naar 8.5, en vervolgens wordt verwarmd tot 50°C, op welke temperatuur de oplossing 10 minuten wordt gehouden. Daarna vindt afkoeling naar 25°C plaats. In deze reductiestap gaat 5% van het p-IFN verloren ten gevolge van verandering in primaire structuur. Vervolgens wordt in twee 'size exclusion' Chromatografie (SEC) kolommen, K401, met hoge effectiviteit het denaturant DTT verwijderd, welke stof een storende invloed heeft op de erna komende oxydatie. Met twee parallelle Sephacryl S-l00HR kolommen, die twee maal beladen worden, gaat 5% van het p-IFN verloren en wordt in 5.5 uur alle DTT verwijderd. Bovendien stijgt de zuiverheid van p-IFN van 57% naar 80%. Het eluent wordt aangevoerd vanuit vat V405 en bevat ureum (8M), EDTA (lmM) en acetaat (50mM). Aan dit vat worden twee stromen (422 en 510) uit de vorige batch toegevoegd die worden hergebruikt (zie verder). De recycle uit het afval van de SEC (stroom 422) bevat DTT, als gevolg waarvan er wel DTT in de produktstroom terecht komt. Als gevolg hiervan bevat de produktstroom van de SEC (K401) toch een hoeveelheid DTT. Daarom wordt deze recycle op een zodanige manier beperkt dat de concentratie van DTT in de produktstroom van de SEC (K401) niet hoger wordt dan 2mM. De produktstroom gaat door naar het voorraadvat (V501) voor de oxidatie (zie sectie 5). De afvalstroom van de SEC (K401) wordt met behulp van een ultrafiltratie-unit geconcentreerd tot 0.75 gIl. Deze operatie duurt ongeveer 3 uur. Het concentraat (411) wordt gespuid. Het filtraat (419) wordt gedeeltelijk hergebruikt als eluent voor de volgende batch (stroom 422) en gedeeltelijk hergebruikt voor het oplossen van het precipitaat (stroom 406). De rest wordt gespuid (415).

4.5. Sectie 5: de vierde opwerkingsfase. De produktstroom uit sectie 4 die opgevangen wordt in vat V501 wordt gedurende 3 uur fed-batch toegevoegd aan reaktor R501, waarin vantevoren al oxidatievloeistofuit vat V504 is gebracht. Deze oxidatievloeistof bevat jodosobenzoëzuur (!BA), Ureum (ongeveer 4M) en EDTA (1 mM). Jodosobenzoëzuur wordt equimolair aan de hoeveelheid eiwit plus niet geoxideerd DTT toegevoegd. Hierdoor worden de ontvouwen eiwitmoleculen gecontroleerd weer opgevouwen. De opbrengst van p-IFN bedraagt als gevolg van de fed-batch operatie 99.5%. Om de correct opgevouwen p-IFN verder op te zuiveren wordt de produktstroom over twee SEC-kolommen, K601, geleid ten behoeve van verwijdering van gevormde dimeren en overige nog aanwezige E. coU-eiwitten. De productstroom uit de oxydatie bedraagt echter ruim 1.1 m3 , waardoor concentrering van de eiwitstroom middels ultrafiltratie F501 nodig is. De oplossing wordt geconcentreerd tot 10 gIl eiwit met een yield aan p-IFN van 94%. Hierbij wordt uitgegaan van een hollow fiber membraan met MWCO 3000 en concentrering tot 20 gIl gevolgd door naspoeling met eenzelfde volume uit de penneaatstroom.


pagina 4.4

4.6. Sectie 6: de vijfde opwerkingsfase. Met een eiwitoplossing van 10 gil wordt in twee parallelle Sephacryl S-100HR kolommen, K60l, met een opbrengst van 86% de ~-IFN opgezuiverd tot 98% ten opzichte van het totaal eiwit. De elutievloeistofkomt uit vat V60l en bevat ureum (4M), EDTA (1mM) en acetaat (50mM). Om bij gelijkblijvende eindzuiverheid van 98 % de zouten uit de elutievloeistof te verwijderen is een ontzoutings-gel-chromatografie stap vereist. Wederom is éérst een concentrering naar 10 gil eiwit vereist met behulp van de ultrafiltratieunit V602/F601. Via de procedure concentreren tot 20 gil en naspoelen met eenzelfde volume ureum-oplossing worden de eiwitten geconcentreerd met een opbrengst van 94% aan ~-IFN. Tenslotte wordt dit concentraat gedoseerd toegevoegd aan een laatste opzuiveringsstap, de ontzoutinschromatograaf, K602. Als elutievloeistof wordt uitgegaan van verdunde (1 mM) natronloog uit vat V603. Er wordt gebruik gemaakt van twee parallelle Sephadex G50 kolommen, welke met een rendement van 97% de zouten afscheiden van de productstroom ~-IFN. Na deze stap is er 406 gram ~-IFN verkregen per batch met een zuiverheid van 98%.

4.7 Cycle Time analyse Bij niet-continue processen is het van belang dat apparatuur en utilities zo efficient mogelijk gebruikt worden. Het is dan ook van groot belang de verschillende proces stappen nauwkeurig in kaart te brengen, zodat een compleet overzicht wordt verkregen op welke tijdstippen de verschillende operations plaatsvinden. Voor de produktie van ~-interferon vinden verschillende processtappen plaats, waarbij de volgende units worden gebruikt: procesaktie 1 2 3

4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14

unit RlOl VlOl V102 V 103 Vl04 F103 VlOS V202 V201 M201 C201 V203 R301 V301

fermentor voorraadvat met medium voorraadvat met glucose voorraadvat oktanol voorraadvat fosfaatoplossing module voor rnicro- en diafiltratie vat voor backflushen membraan (F103) voorraadvat homogenizer voorraadvat homogenizer homogenizer centrifuge voor afscheiden inclusion bodies voorraadvat sucroseoplossing vat waarin reduktie en extraktie plaatsvindt voorraadvat met reduktie-stoffen

Q)

:;:: ~ ~ o o '0..

"

40 38 36 34 32 30 28 26 -

',',

"

11

"

" I

f-Hl

I--H

;, 1,,"-

"

,~ ': ",'

I--H

24 -

11

".

22 -

I 111

ft-;

20 -

I

""

t;H

HH -t----tt-:J

IIH

18 - ~ 16 -H,.' 14

!--:-

~

.. .. '1

12 10 8

11

Ol

I

~j.

~

11 I

"

"

I I

:: :,'

.:' "

II

I

:!

11 ~ '~

II'!

"

o

H

" ,,' ,!IIII

:'"

6 4 2

o

I I

20

.i

::

40

"

11

"

60 procestijd [h]

Figuur 4.2: cycle-time diagram

80

100

120

Hoofdstuk 4: Beschrijving van het proces 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

V302 C301 R302 V303 C302 R401 V401 F401 R402 V402 V403 K401 V404 F402 V501 V504 V405 R501 V502 F501 K601 V503 V601 V602 F601 K602 V603

pagina 4 .5

voorraadvat met natronloog liquid-liquid centrifuge (butanol/water) precipitatievat voorraadvat fosfaatoplossing centrifuge voor afscheiden precipitaat oplosvat precipitaat voorraadvat stoffen voor oplossen precipitaat dead-end microflltratie reduktievat voorraadvat met reduktie-stoffen voorraadvat natronloog size exclusion chromatografie 1 buffervat voor ultraflltratie F402 ultraflltratie unit voorraadvat voor fed-batch toevoegen voorraadvat hulpstoffen fed-batch oxidatie voorraadvat elutievloeistof oxidatie vat voorraadvat met natronloog ultraflltratie unit size exclusion chromatografie 2 voorraadvat ijsazijn voorraadvat elutie-vloeistof buffervat voor ultraflltratie F601 ultraflltratie unit ontzoutings chromatografie voorraadvat elutie-vloeistof

Voor de berekening van de cycle-time wordt uitgegaan van een werkweek van 104 uur (maandagochtend 9.00 uur tot vrijdagmiddag 17.00 uur). In de weekenden wordt niet gewerkt. Dit betekent dat er per week op basis van 50 werkweken per jaar en 100 batches per jaar, 2 batches compleet moeten worden afgewerkt. Per batch wordt dan 406 gram 13interferon geproduceerd. In bijlage 4.1 staan de proces stappen gegeven met de procestijden. Belangrijkste aannames zijn: voor het vullen en legen van vaten wordt een standaard tijd van 0.5 uur genomen het schoonmaken van units duurt standaard 2 uur het schoonmaken van de membraan-units bedraagt standaard 20 uur het afkoelen van vaten nadat gesteriliseerd is met stoom is kleiner dan 5 uur de overige procestijden zijn gebaseerd op gegevens die verkregen zijn bij de dimensionering van de units In figuur 4.2 zijn de procesakties die plaatsvinden als funktie van de tijd weergegeven.


pagina 4.6

Het blijkt dat de gebruikstijd van de fermentor (RIOl) limiterend is. Op grond hiervan wordt het meest ideale proces-pad bepaald. Het maximaal aantal fermentaties dat ingezet kan worden bedraagt 2. Een volledige fermentatie duurt 40 uur, zodat het onmogelijk is 3 fermentaties uit te voeren in de beschikbare 104 uur. Gekozen wordt om de tweede fermentatie 2 uur na het einde van de eerste fermentatiein te zetten. De down-stream-processing voor deze tweede batch wordt dan afgebroken nadat het reduktievat (12) gevuld is met de inclusion bodies vanuit de centrifuge (11) . De down-stream-tijd van de eerste batch ligt binnen 104 uur, zodat deze in zijn geheel kan worden afgewerkt. De belangrijkste conclusies zijn - de gebruikstijd van de fermentor is limiterend in het cycle-time diagram; dit betekent dat het aantal batches dat maximaal uitgevoerd kan worden bij continue procesvoering door de fermentatietijd bepaald wordt - alle down-stream-processtappen duren korter dan de fermentatie; dit betekent dat de procestijd voor de proces stappen die relatief duur zijn vergroot kan worden, zodat de investeringskosten verkleind worden. Hierbij kan gedacht worden aan het verkleinen van het membraanoppervlak bij bv. ultrafiltratie. De investeringskosten worden zodoende verkleind en de procestijd vergroot. - uit het cycle diagram kan afgelezen worden dat bepaalde vaten 'dubbel ' gebruikt kunnen worden. Er wordt echter aangenomen dat om containment te minimaliseren voorraadvaten niet gevuld mogen worden met produktstromen. Wel kunnen de centrifuges gebruikt voor het afscheiden van de inclusion bodies (C201, procesaktie 11) ook gebruikt worden voor het afscheiden van het precipitaat (C302, procesaktie 19). - bij vol continu zijn van de fabriek kunnen maximaal 200 batches worden ingezet. (8000 werkuren per jaar en 1 fermentatie duurt 40 uur). De produktie bij vol continue bedrijfsvoering bedraagt dus 80 kg.

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen.

pagina 5.1

5. Apparatuurberekeningen. 5.1. Algemeen. In het nu volgende hoofdstuk zullen de verschillende "unit operations" verder uitgewerkt worden. Hierbij wordt inzicht gegeven in de modellen die zijn gebruikt voor de dimensionering. In bijlage 5.1 wordt ingegaan op de warmtewisselaar, H201, die nodig is voor het koelen na de cel-disruptie en de opwarmtijden voor het oplossen van de inclusion bodies in RJOI. 5.2. De fermentor R101. Het micro-organisme (m.o.) waarmee het p-IFN wordt geproduceerd is een genetisch gemanipuleerde E. coli van de stam K12. Na raadplegen van Atkinson (1991) werd er een gekeuze gemaakt omtrend het groei-traject van de bacterie. Deze trajecten zijn weergegeven in tabel 5.2.1. met de groei-parameters. Er wordt verondersteld dat de groei in de exponentiële en de produkt-fase met Monod-kinetiek kan worden beschreven en dat in de "lag phase" geen groei plaats vindt.

Tabel 5.2.1. De verschillende kweek-stadia van de gebruikte E. coli. tijd in eh]

Ilmax in [1/h]

"lag-phase"

5

0

exponentiële-fase

18

0.4

produkt-fase

6

0.1

De overige groei-parameters worden constant genomen gedurende de fermentatie: ~ ms

Yxs

6.8.10-2 =

0.012 0.5

mg/l, kg substraat/(kg biomassa·h), kg biomassa/kg substraat.

Uit de patenten (zie literatuuroverzicht) volgen de aanbevelingen voor het bedrijven van de fermentatie bij 37 oe onder 2 bar. De substraat-concentratie, glucose, kan het beste liggen tussen de 5 tot 10 gil met een opgeloste zuurstof-concentratie van 40% van het maximaal haalbare. Uit de keuze van de batch-grootte volgt dat er elke run 49.5 kg biomassa gemaakt moet worden. Terugrekenen geeft een benodigde ent van 20.0 g biomassa per batch. Bij het opstarten van de fermentor worden alle nutrienten, die nodig zijn voor het verkrijgen van 49.5 kg biomassa, in een watervolume van 3 m 3 gedaan. Een overzicht van het kweek medium is in tabel 5.2.2. weergegeven. Alleen glucose zal fed-batch toegevoegd worden. Het eindvolumemoet 3.84 m 3 zijn met een biomassa-concentratie van 13.3 gil. De beginconcentratie glucose is 7.5 gil. De totale hoeveelheid glucose die nodig is kan

,

,

.

.~.

" " .

.'

...

~' '

" .,.', .:... .

. . ..

'. '

'

.;

~

'.,

',"

14 - : - - - - -12 - -: ~- 0.95

10 - .

î

~=r_a_at-,I

- 0.9

8 -_..._. - - -.=-7='=-_ _ ·_··· ...::(S=U=b=::S

0')

I

Ü

.-c

---

~

-----U>

"'"-'

> !·-0.85 > ----

Cf)

xI

4 ~I I

!

2

J I o

. . ......... ~

O ~!------========~~~----------

6

12 tijd (uur) ->

18

---,------'-; 0.75

24

Figuur 5.2.1: biomassaconcentratie, substraatconcentratie en relatief volume (VNeind) tijdens fermentatie als funktie van de tijd


pagina 5.2

berekend worden uit de yield van biomassa op substraat, de maintenance en de substraat concentratie in het medium en komt op 132.6 kg glucose. Hiervan zit al 22.6 kg in het beginvolume van 3 m 3 • Dit betekent dat de 0.71 m 3 fed-batch toegevoegde stroom nog 110 kg glucose moet bevatten. De toevoegsnelheid is afhankelijk van de hoeveelheid biomassa en daarmee van de tijd, om tussen de grenzen van de aanbevolen glucose concentratie te blijven. Het debiet als functie van de tijd is verder uitgewerkt in bijlage 5.2. In figuur 5.2.1. staan de biomassaconcentratie, de substraatconcentratie en het volume als functie van de tijd.

Tabel 5.2.2. De samenstelling van het kweekmedium. !F='=--concentratie in M component 1.....- - -

1..----ZnS04· 7H20

30~M

MnS0 4·4H2 0

30~M

1.....- - -

1..----CuS0 ·5H 0 4

2

1..----Na Citraat· 2H 0

l.5mM

1..----KH P04 1..----(NH )2S

21 mM

2

3

2

72mM

04

4

MgS0 4·7H20

3mM

1.....- - -

72~M

1..----FeS0 ·7H 0 4

2

L- Tryptofaan

70 mg/l

Thiamine-HCI

20 mgll

1.....- - -

Tetracycline

5 mg/l

Glucose

7.5 gil

1.....- - -

Bij het ontwerpen van de fermentor is gebruikgemaakt van van 't Riet (1991). Voor de afmetingen van de fermentor wordt gekozen voor een standaard configuratie met een zesbladige turbine-roerder op een afstand D van de bodem en met keerschotten:

met

H D Hs H D Tv Hs

= = = = = = =

2·Tv, 0.33·Tv, 0.2·D, hoogte van de fermentor in m, diameter van de roerder in m, diameter van de fermentor in m, hoogte van het roerderblad in m.

Het vloeistof volume is maximaal VI = 3.9 m 3 • Met een veronderstelde hold-up en foam van 30% van het vloeistofvolume moet het totale fermentor-volume V = 5.1 m 3 zijn. Hieruit volgt voor Tv = 1.48 m.


pagina 5.3

De volgende stap is het bepalen van de zuurstof-overdrachtscapaciteit in de fennentor. In de eerste plaats moet dan bekend zijn hoeveel zuurstof het m.o. opneemt: OUR

met

=

1 «- 1.0525)' IJ.y

+

m)' X

(5.1)

OUR = "oxygen up-take ratelt in kg/(m3·s).

Het getal 1.0525 volgt uit de elementen-balans over het m.o. met als samenstelling: CHI.770o.49No.22So.004sPo.ooss' De OUR is het hoogst op het einde van de exponentiële groei en is dan: OUR = 8.8.10.3 kg/(m3·s). Voor de zuurstof die wordt overgedragen van de gas-fase naar de vloeistof-fase geldt: (5.2) met

OTR klA

= =

Col"

=

Col

=

"oxygen transfer ratelt in kg/(m 3·s), stofoverdrachtscoëfficiënt maal specifiek oppervlak per vloeistofvolume in lis, verzadigingsconcentratie van zuurstof in de vloeistof kg/m3 , zuurstofconcentratie in de vloeistofbulk in kg/m3 •

in

Voor de maximale zuurstofconcentratie in zuiver water volgt uit Binas bij 310 K en 1 bar: Col" = 35 mg/l. Met behulp van de Henry-coëfficiënt volgt dan de maximale zuurstofconcentratie in water als functie van de partiaalspanning van de zuurstof in de lucht: p C'0/-- ~ H

(5.3)

met H = Henry-coëfficiënt, bij 310 K: H = 2.96.103 Pa·lImg. Verder wordt verondersteld, dat in de fermentor als gevolg van de toevoeging van voedingstoffen en de aanwezigheid van m.o. maximaal 0.9·C ol " gehaald kan worden. Er wordt vanuit gegaan dat de uitputting van de luchtbellen verwaarloosd mag worden en dat de weerstand voor stofoverdracht volledig aan de vloeistof zijde ligt. Voor een geroerde tank bij 20 oe en een coalescerende vloeistof is de klA dan met een maximale fout van 30%:

kof'1

met =

Pil

E

04

0.026'(-)· .

v,

c (v,r

het door de roerder ingebracht vermogen per vloeistof-volume in W/m 3, de gecorrigeerde superficiële gassnelheid in mis.

De hold-up voor een CSTR, heterogeen en non-flooding volgt uit:

(5.4)


pagina 5.4

(5.5)

met

€

volume gas/(volume gas + volume vloeistof).

=

Verder kan nu het luchtdebiet berekend worden uit: Q •A . P. ' v c p.

p

(5.6)

waarbij

Q A Ps Pa R T Pgem

luchtdebiet in m 3/s, dwarsdoorsnede van de fermentor in m 2 , druk ter hoogte van de beluchter in Pa, druk bovenin de fermentor in Pa, gasconstante, 8.3144 J/(mol'K), temperatuur in K, gemiddelde druk in de fermentor in Pa.

= = = = = = =

Het vermogen dat door het gas wordt ingebracht in Wis: P

=

g

met

Fg

F'R'T'ln(P,) g P.

(5.7)

molenstroom lucht in mol/s (= Q*pgemIR/T).

=

Het door het gas ingebrachte vermogen mag nooit groter zijn dan het vermogen van de roerder om flooding te voorkomen. De belangrijkste warmte-produkties vinden plaats door het m.o., door de roerder en door het inkomende gas: rHM

~

rHG

460.103

~

•

OUR . VI

Cpg '(Tgt -1)'Q' Pg

waarbij = = = = = =

warmte-produktie, door het m.o. in W, toegevoerde warmte door ingaande gas in W, warmtecapaciteit in J/(kg·K), temperatuur van het ingaande gas in oe, temperatuur in de fermentor in oe, dichtheid van het gas in kg/m3 •

(5.8)

(5.9)


pagina 5.5

De afvoer van warmte geschiedt door verdamping van vloeistof en door warmteoverdracht aan de wand:

°h = H . Q' (L.

r HV

Pa

Y

""

- h ) yj

(5.10)

(5.11) met

rHV Hy po hvü hyi rHW hw Af TI

= = = = = = = = =

afgevoerde warmte door verdamping in W, verdampingswarmte in J/kg [=2.35*106 J/kg] standaard druk in Pa, waterdampconcentratie bovenin de fermentor in kglm 3 , waterdampconcentratie van de ingaande lucht in kglm 3, afgevoerde warmte door de wand in W, warmteoverdrachtscoëfficiënt in Wl(m2•K), wandoppervlak van de fermentor in m 2, temperatuur van de omgevingslucht in K.

Voor het geval dat er te veel warmte geproduceerd wordt tijdens de fermentatie, zal deze afgevoerd moeten worden. Hiervoor moet een koelmantel aangebracht worden. Als koelmedium wordt water gebruikt. Het benodigde oppervlak kan berekend worden uit: (5.12)

1

À 0.6' ( _ N'D C ." h = _. _ )067 . (_'_)0.33

v

T

y

À

l I d.. - = - +hl

h

À..

(5.13)

(5.14)

(5.15)

T-T A = P< ·Q·e < pc '1n( _ _
(5.16)

C

met

rHs h À

N v

= = = = =

warmte-produktie door de roerder in W. warmteoverdrachtscoëfficiënt in de fermentor in W/(m 2·K), warmtegeleidingscoëfficiënt van de fermentorvloeistofin W/(m·K), toerental van de roerder in lis, kinematische viscositeit van de fermentorvloeistof in m 2/s,


Cp ht

=

=

Àw

=

Qe He Teo Tci

=

Ac

=

=

= = =

pagina 5.6

warmtecapaciteit van de fermentorvloeistofin J/(kg'K), totale warmteoverdrachtscoëfficiënt in W/(m2·K), dikte van de fermentorwand in m, warmtegeleidingscoëfficiënt van de fermentorwand in W/(m·K), debiet van het koelmedium in m 3/s, de over te dragen warmte van de fermentor naar het koelmedium in W, uitgaande temperatuur van het koelmedium in K, ingaande temperatuur van het koelmedium in K, oppervlak van de koelspiraal in m 2•

De volgende aannamen zijn gedaan voor de bovenstaande ontwerpvergelijkingen van de reactor: - de weerstand van warmteoverdracht ligt geheel aan de zijde van de fermentorvloeistof, - de uitputting van de gasbellen is verwaarloosbaar, - het ontwerp is gericht op het zogenaamde "worst case" geval; dat wil hier zeggen dat er gekeken wordt naar de situatie waarin de DUR in de reactor maximaal is en waarbij de warmte-produktie maximaal is. De variabelen die zijn gekozen staan weergegeven in tabel 5.2.3.

Tabel 5.2.3. Gekozen variabelen.

grootheid Col PstN I

waarde O.4,C ol ' 4000 W/m3

vgse

0.025 mis

Pa

2 bar

Ps

2.3 bar

Pgem

2.15 bar

Tgi

60°C

hvi T

opmerkingen

maximaal 5000 W/m3 voor commerciële fermentoren

hoge temperatuur door compressor

0.004 kg/m 3

37

oe

hw

10 W/(m2·K)

waarde genomen uit voorbeeld boek

hvo

0.05 kg/m 3

waarde genomen uit voorbeeld boek

Tco

15°C

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. ~

0.05m

Àw

80 W/(m·K)

Col-

12.9 mg/l

pagina 5.7

roestvrijstalen fennentor

De belangrijkste ontwerp grootheden staan in tabel 5.2.4.

Tabel 5.2.4. Ontwerpgrootheden grootheid

waarde

e

0.17

Q

0.0493 m3/s

Pg

1482 W

kolA

0.113 1/s

OTR

0.88.10- 3 kg/(m 3·s)

OUR

0.88.10- 3 kg/(m 3·s)

ht

3320 W/(m 2·K)

Fe

0.00313 m3/s

He

65.4 kW

Ae

0.81 m 2

rHM

49.3 kW

rHs

15.6 kW

rHG

5.31 kW

rHV

2.43 kW

r HW

2.33 kW

Zoals is te zien in tabel 5.2.4 treden er onder de condities zoals gekozen geen problemen op voor wat betreft de zuurstof in de fennentor. Tevens blijkt dat er geen flooding op zal treden. Voor de koeling in de fennentor moet gezorgd worden dat de snelheid van het koelwater in de spiraal groter is dan 0.1 mis om de wannteweerstand geheel aan de kant van de fermentorvloeistofte hebben. Bij een snelheid van 1 mis is dan de lengte van de koelspiraal 4.1 m.


pagina 5.8

Het toerental van de roerder kan berekend worden uit: P• • NP . P . N 3 • D S

=

(5.17)

roerderkental, 5 bij Re> 105 •

Onder de berekende omstandigheden is Re = 1.3.106 • Hieruit volgt

N

=

4.7 lis.

Een analyse van de karakteristieke tijden leert dat: 1:zuurstofconsumptie

~ toverdracht

=

15 s, 53 s, 9 s,

(zuurstofconcentratie in medium/DUR) (mengtijdrelatie voor STR, R. V.d. Lans) (1I(k1A)).

Deze tijden liggen allemaal in dezelfde orde van grootte. Dat geeft aan dat er geen of nauwelijks gradienten in de zuurstofconcentratie in de fermentor verwacht worden. Tenslotte moet nog vermeld worden dat voor het verkrijgen van de juiste temperatuur in de fermentor er een goede regelaar aangebracht moet worden. Er moet rekening mee gehouden worden, dat vooral aan het begin van de fermentatie de mogelijkheid bestaat dat de vloeistof in de fermentor nog niet op de juiste temperatuur gebracht is en er juist verwarmd dient te worden. Verder zal er in het begin van de fermentatie veel minder zuurstof verbruikt worden waardoor of de hold-up of het roervermogen in de fermentor lager kan zijn dan verderop in de fermentatie. Dit kan met behulp van een goede regeling energie besparen.


pagina 5.9

S.3. Microfiltratie en diafiltratie (FI03). Nadat de fermentatie is beëindigd door toevoegen van octanol, wordt de verkregen suspensie door middel van microfiltratie geconcentreerd tot een suspensie met celconcentratie 200 kg droge stoflm 3 • Vervolgens wordt de geconcentreerde oplossing gewassen met een fosfaat gebufferde saline oplossing om de opgeloste zouten voor het grootste gedeelte te verwijderen. Er wordt gebruik gemaakt van cross-flow microfiltratie. T.o.v dead-end filtration biedt dit het voordeel dat de flux door het membraan na verloop van tijd geen funktie meer is van de tijd. De dikte van het filter-cake heeft een maximum, waardoor de weerstand over deze laag niet verder toeneemt, terwijl in dead-end filtratie de dikte blijft toenemen. Voor het beschrijven van de flux door het membraan wordt gebruik gemaakt van de concentratie polarisatie theorie [Hanish, 1986 en Flaschel et al., 1983]. Deeltjes worden naar het membraan getransporteerd door het convectief transport van het oplosmiddel en worden gedeeltelijk ofgeheel tegengehouden aan het oppervlak. Daarbij wordt een concentratiegradient opgebouwd. Onder stationaire omstandigheden is het convectief transport naar het membraan gelijk aan de diffusie van het membraan af. Voor de flux J geldt: J

=

c -c c -c

kl ri-!---l'-) b

(5.18)

P

volumetrische flux stofoverdrachts coëfficient gel concentratie aan membraan oppervlak permeaat concentratie (aanname: Cp = 0) gemiddelde bulk concentratie retentaat

[m3/m2/s]

[mis] [kg/m 3] [kg/m3] [kg/m3]

De stofoverdrachts coëfficient, k, is gebaseerd op de shear-enhanced diffusie waarde, die gegeven is volgens D

D a Y

a

=

2

0.025·(-)·y 2

diffusie coëfficient straal van de cel wand shear snelheid

(5.19)

[m2/s] [m]

[lis]

Voor turbulente stroming geldt: Re y =fu'2x

f u x

Fanning Friction Factor gemiddelde snelheid karakteristieke dimensie = d fiber

(5.20)

[- ] [mis] [m]

---

3.5

200C

-+-

3

300C ---7fE-

400C ,........, en

2.5

co a..

E

.....

·m .....

2 -

en

0 0

en

.S:

1.5

O.5-+0------r10-----.2r--O---3'"O---4""TO-----,50---6'O-----i70 concentratie biomassa droog [kg/m3] Figuur 5.3.1: viscositeit als funktie van celconcentratie en temperatuur


pagina 5.10

De stofoverdrachts coëfficient wordt berekend met de vergelijking k=O.023(Re)o.8(Sc)o33(D)

(5.21)

x

Re Sc

Reynolds getal = p*u*dfibe /1) Schmidt getal = 1)/plD

[-] [- ]

Deze relatie geldt voor circulaire of rectangular geometrie in het turbulente flow regime. De axiale drukval over het membraan kan berekend worden met I1P

L

=

2fL·tl.E..

(5.22)

x

lengte membraan kanaal

[m]

Om de filtratie zo effectief mogelijk uit te voeren, moet de stroming turbulent zijn. Voorwaarde hiervoor is Re>2500. Re

p'u'd =

> 2500

fiber

1)

(5.23)

De viscositeit is een funktie van temperatuur en ce1concentratie. In figuur 5.3.l. is de viscositeitsafhankelijkheid van temperatuur en ce1concentratie gegeven [Advanced Course on Downstream Processing, 1994, deel I, 2.17]. Bij hoge ce1concentraties neemt de viscositeit toe, waardoor Re kleiner wordt. Er moet echter wel aan de voorwaarde Re>2500 worden voldaan. De fermentatie wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 37 °C. Aangenomen wordt dat de micro filtratie en dialyse plaatsvindt bij ongeveer 30 °C. Een eerste orde fit voor de viscositeit geeft: 1)3O"C

= 0.7795

+

0.028006·Cb

Voor de verdere berekeningen wordt genomen 2*10.3 [m] 1050 [kg/m3] 0.5*10-6 [m] u 5 [mis] L = 0.5 [m] f= Fanning Friction Factor = 0.04*(Re)"O.16 [Perry]

dfiber p a

=

3.9 13.3

(5.24)

10~--------------------------------------------------+~--------~

---

J (1 e-4*m3jm2js)

-+-

Cg (0.1 *kgjm3) 8~-------~~---------

. - - -- -- - - - - - - -- - - - - -- - - 7 ' - - - -

delta P (bar)

-Bk (1 e-5*mjs)

7~------

~

Re (1 e-3)

6 . ----------------""'--------/5

""'--=,...-----------,,------_.~----------- -_._----

4-l- -

._---~ -----_._----

3~-------------------~------~q--------------------~~

2~-------~~---------------~~---~

1~-------------------==--

O+---~~--~----~--~----~--~----~----~--~--~

o

0.2

0.4 0.6 dimensieloze tijd [sj

0.8

1

•

Figuur 5.3.2: celconcentratie, stofoverdrachtscoefficient, drukval, Reynolds en flux tijdens microftItratie als funktie van dimensieloze tijd (t/teind)

•


=

pagina 5.11

500

Er geldt nu dV -

dt

~

-A·J

(5.25)

met A=4.2m2 De suspensie moet geconcentreerd worden tot 100 kglm 3 • In figuur 5.3.2 is de celconcentratie (eb), de stofoverdrachts coëfficient (k), de drukval (~P), Reynolds (Re) en de flux (1) uitgezet tegen de tijd. De gewenste ce1concentratie (100 kglm3) wordt bereikt na 8726 s. = 2.4 uur Er geldt dan: = = = = =

J Vconc ~p

Re k

2.53*10-5 0.519 1.47 2919 1.58* 10-5

[m3/m2/s] [m3]

[bar] [-] [mis]

De fraktie verwijderde zouten tijdens de dialyse bedraagt VtJIiVIlIr_~ ) V... w_ ""'-

l-exp(-

=

l-exp(-N)

(5.26)

Indien N=3 wordt 95% van de zouten verwijderd. De tijd benodigd hiervoor is NV

't dkIIyse •

~ =

J·A

4.1 uur

(5.27)

De totale procestijd is 't __

=

't _

+ 't dkIIyse

= 6.5 uur

(5.28)

De procestijd kan eventueel verkleind worden door een groter membraan oppervlak te nemen. De procestijd verandert dan rechtevenredig met het oppervlak. Voor de microfiltratie en diafiltratie kan echter 6 uur worden genomen, zodat berekend wordt: A= 4.2 m2 Voor de berekening van het axiale volume-debiet zijn de volgende gegevens nodig: AjIbIr

K

rc'djlblr'L • 3.l4·10-3 m 2

(5.29)

pagina 5.12

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. aantal fibers = nJU-

A K

-

= 670

(5.30)

AJU-

(5.31)

(5.32)

Er wordt berekend:

4>v

=

Voor de wannteproduktie geldt:

4>..

= 4>v·~p = 1.55 kW

(5.33)

stroom kan de Indien alle wannt e wordt gebruikt voor het opwan nen van de concentraat temperatuur-stijging berekend worden: ~T=

~p·(bv·'t

--P·C·V p

(5.34)

CtIttC

3 dan 15 oe en is dus niet De maximale temperatuur-stijging (betrokken op Vconc = 0.519 m ) is de fermentor. te verwaarlozen. Er moet gekoeld worden. De koeling vindt plaats in Bij het diafiltreren Indien het pomprendement 0.8 is wordt de temperatuurstijging 19 oe. stijging kleiner zal zijn. wordt echter een koude wasstroom toegevoegd, zodat de temperatuur


pagina 5.13

5.4. De homogenizer (M201). Voor de disruptie van de E-Coli cellen zal gebruik worden gemaakt van een APV -Gaulinhomogenizer Om de mate van disruptie in zo'n apparaat te bepalen, wordt gebruik gemaakt van Sauer (1989), waarin de disruptie afhankelijk wordt gesteld van druk, aantal passes en de concentratie: 1

log(--) • k-N~·!J.P· (l-R)

Hierin is

R k !J.P ex

N

P

= = = = = =

(5.35)

fractie gedisrupteerde cellen (-) disruptiesnelheidsconstante (MPa-a) drukval over homogenizer (MPa) drukexponent (-) aantal discrete passes (-) passexponent (-)

Voor de disruptiesnelheidsconstante, k geldt voor een recombinante E-Coli cel, die bij maximale groeisnelheid is geproduceerd, een waarde van 1.8E-3 MPa- t ,407. De bijbehorende drukexponent is dus 1.407. Voor p geldt de onderstaande relatie voor een soortgelijk orgarusme. p = 0.57 + 0.002 * X hierin is

X

= droog gewicht cellen (kg/m3)

Deze ingangsconcentratie wordt bepaald op 100 gil daar dan zowel homogenizer als de hierop volgende centrifuge nog efficiënt werken, i.V.m. respectievelijk viscositeits- en hinderingseffecten. Voor de temperatuurstijging per pass geldt: !J. T

=

!J.p

(p'e)

Er geldt: !J.P N R !J.T ~

=45 MPa =3 =0.87 = 10.7 K = 600 lIuur

Dus de benodigde procestijd bedraagt: 't

= 2.7 uur (drie passes van 540 1)

(5.36)


pagina 5.14

5.5. De centrifuge (C201 en C302). Voor de centrifugatiestappen (terugwinning inclusion bodies en precipitaat) wordt gebruik gemaakt van een tubular bowl centrifuge met de volgende karakteristieken: buitendiameter ro binnendiameter r j hoogte H toerental

0.0635 m = 0.9 * ro = 0.762 m = 15.000 rpm = 1570 rad/sec = 2.25 kW

=

motorvermogen

Hieruit volgt voor de karakteristieke l:-waarde van de centrifuge:

L=

n(ro2

-

2

r , ). (Ci)2'H)

ln( ro)

g

(5.37)

r,

L

=

4375 m 2

Om te bepalen welk deeltje nog wordt afgescheiden moet de valsnelheid van dit deeltje bepaald worden: vg

hierin is

=

(l-e)ndp2(pp-p/).g

(5.38)

18'"

valsnelheid in een zwerm (mis) fractie vaste stof = Richardson-Zaki-exponent = diameter af te scheiden deeltje = dichtheid deeltje = dichtheid vloeistof = val versnelling = viscositeit vloeistof (Higgins, 1978) = =

=0.1 (-) = 3.5 (-) = 0.4 ~m = 1300 kg/m3 = 1050 kg/m3 = 9.81 mls2 = 6.0 mPa.s

Het te gebruiken debiet volgt nu uit

4>

=

L .v

g

Voor de valsnelheid wordt berekend: =

en

=

2.51 *10-9 mis

(5.39)


pagina 5.15

Er is hier 1800 I te bewerken, dus met 4 centrifuges (nodig om voldoende massacapaciteit te hebben: ongeveer 4.2 kg vaste stof per centrifuge [perry]) bedraagt de procestijd 11.4 uur. Door onnauwkeurigheid in dit model (o.a. aggregaatvonning tussen inclusion bodies en cel debris en niet-laminaire stroming) zal in plaats van de verwachte 100 % recovery van de inclusion bodies slechts een recovery van 90 % bereikt worden. Hele cellen (p= 1100 kg/m3 , ~=1.0*1O·6 m) zullen (gelijke valsnelheid) even efficiënt worden afgescheiden als de inclusion bodies, cel debris (p= 1100 kg/m3 , ~=0.4* 10.6 m) zal voor circa 20 % worden afgescheiden in de zware fractie. In de precipitaatterugwinning hoeft geen rekening te worden gehouden met hindering. De nog af te scheiden diameter bedraagt 10-6 m, de dichtheid van het precipitaat bedraagt 1200 kg/m3 • De dichtheid van het medium bedraagt 900 kg/m 3• De viscositeit van het waterbutanol mengsel bedraagt 2.0* 10-3 Pa.s. Hieruit volgt dat de valsnelheid van de precipitaatdeeltjes 8.2* 10-8 mis bedraagt en dat een debiet van 3.6*10-4 m 3/s gebruikt kan worden (=1300 l/h). Er is hier 2982 I te bewerken dus met dezelfde 4 centrifuges is de benodigde procestijd 0.6 uur.


pagina 5.16

5.6.1. Het oplossen (R301) en reduceren (R301).

In de base case wordt de extractie van p-interferon uit een waterige oplossing met 2-butanol in één evenwichtstrap uitgevoerd, waarbij er een yield van 53% en een zuiverheid van 60% ( van totale hoeveelheid eiwit) voor p-interferon wordt bereikt. De evenwichtstrap wordt uitgevoerd door 2-butanol en water in een 1: 1 (v/v) te mengen in een vat. Omdat dit kan worden uitgevoerd in het vat wat ook voor het oplossen van de inclusion bodies wordt gebruikt en het benodigde volume voor de extractie ongeveer twee maal zo groot is als voor het oplossen, wordt het vat gedimensioneerd op basis van de eisen voor de extractie. Als vat wordt een standaard tank gekozen met turbineroerder met baffles. Voor een dergelijke tank gelden de volgende standaard afmetingen: HtlDt= 2 LlHt = 1/3 dlDt = 1/3

w/d = 1/5 (6 blades);

Vd = 1/4; BID = 1/10 (4 baffies);

Het volume benodigd voor de extractie bedraagt 6 m3; hieruit volgt Dt. Om de extractie zo goed en zo snel mogelijk te laten verlopen moet het specifieke oppervlak van de disperse fase zo groot mogelijk zijn. Indien wordt aangenomen dat de deeltjes bolvormig en uniform zijn geldt: 6'E

as - -

(5.40)

dp,&at/IT

waarm

a

=

E

=

~,sauter

=

specifiek opp. disperse fase [m· I ], volumefractie disperse fase [-], verhouding van het oppervlak en het volume van de deeltjes [m].

Met de Kolmogorov-Hinze vergelijking kan de maximale druppel diameter als functie van de energie toevoer en stofeigenschappen berekend worden: d DIIX

a 0.6 • C ·e-0 4 . ( _ ) ~ Pc

waann

(5.41) = = = = =

maximale druppel diameter [m], constante (org. fase dispers: 0.5), vermogen per massa [W/kg], dichtheid continue fase [ kglm3], oppervlaktespanning [N/m].

Voor de Sauterdiameter kan worden aangenomen:


d

0__

::;

pagina 5.17

O.5·d

p-,

(5.42)

-

Indien de organische fase dispers wordt gekozen volgt hieruit voor het te leveren vermogen per massa:

(5.43)

Het totale vermogen P dat door de roerder geleverd moet worden is gelijk aan e massa van de extractie.

*

de totale

Voor een standaardtank met turbineroerder en keerschotten geldt dat het vermogenskental Po in het turbulente gebied gelijk is aan 6 (zie figuur). Het toerental N van de roerder volgt dan uit: p0

p

(5.44)

z

(pN 3'd S)

waarin

P

=

p

N d

= =

vermogen roerder [W], gemiddelde dichtheid water/organische fase [kg/m3], toerental roerder [lis], diameter roerder [m].

Er kan vervolgens gecontroleerd worden of het Reynolds getal inderdaad hoog genoeg is met:

(5.45)

waann

Re

=

"av

Reynoldsgetal [-], gemiddelde viscositeit [pa s].

De gemiddelde viscositeit wordt bepaald volgens [Perry]: "

..,

•

waann

~'(l +1.5'" (l-e)

"C "d

. e ) " (",,+,,)

= =

(5.46)

viscositeit van de continue fase [pa sJ, viscositeit van de disperse fase [pa sJ.

Om een schatting te kunnen maken van de benodigde mengtijd moeten de stofoverdrachtscoëffiënten van p-interferon van de waterfase naar de 2-butanolfase en vice versa bekend zijn. Voor de stofoverdrachtcoëffiënt van de continue fase (van water naar butanol) geldt de


pagina 5.18

volgende empirische correlatie:

(5.47)

=

waann

=

stofoverdrachtscoëffiënt van p-interferon in de continue fase [mis], diffusiecoëffiënt van p-interferon in de continue fase [m2/s].

Voor de stofoverdrachtscoëffiënt van de disperse fase (van butanol naar water) geldt

k./dp~ D~

=

66 ----=-17.9

(starre/circulerende druppels)

=

waann

=

(5.48)

stofoverdrachtscoëffiënt van p-interferon in de disperse fase [mis], diffusiecoëffiënt van p-interferon in de disperse fase [m2/s].

De diffusiecoëffiënten zijn te voorspellen met de gemodificeerde Stokes-Einstein correlatie [Rutten] :

D 11

=

waann

k·T nO·n · r·TI SE I J

D··IJ

k T n SE0 ri rj TIj

r,

(5.49)

rJ

= = = = = = =

diffusiecoëffiënt van stof i in stofj [m2/s], Boltzmann constante [JIK], temperatuur [K], gemodificeerde Stokes-Einstein constante [-], straal van het opgeloste molecuul rml, straal van het oplosmiddelmolecuul rml, viscositeit van het oplosmiddel [pa.s].

Uitgaande van het filmmodel voor stofoverdracht kan de flux J door het grensvlak berekend worden. Er is daarbij sprake van een flux van p-interferon van de waterfase naar de butanolfase (Je) en een teruggaande flux van p-interferon van de butanolfase naar de waterfase (Jd). Er geldt nu:

(5.50)


pc ' C~ -CC __ )

J • k oe

C

p~

C

waann

pagina 5.19

(5.51)

K

koo

=

koe

=

Cd Cc

=

K

=

=

doorgangscoëfficiënt p-interferon betrokken op de butanolfase [mis], doorgangscoëfficiënt p-interferon betrokken op de waterfase [mis], concentratie p-interferon in de butanolfase [kglm3], concentratie p-interferon in de waterfase [kglm3], massaverdelingscoëfficiënt [-].

En verder geldt: k

=

04

[~ k

m]"1

+

(5.52)

kC

~

(5.53)

m

waann

=

volumetrische verdelingscoëfficiënt (K*pJpc) [-].

Voor de massabalansen geldt nu: dC~

J~'6

dt

d,;.-

-z--

(5.54)

dC J'6 -&---

(5.55)

C

dt

C

d,;.-

Hierbij is aangenomen dat de druppels een constant volume en oppervlak hebben. Simultaan oplossen van de differentiaalvergelijkingen levert de tijd op waarna evenwicht is bereikt. Deze tijd is erg afhankelijk van de berekende diffusie-coëfficiënten en de druppel grootte (dus het roervermogen). Alle waarden die berekend zijn met betrekking tot de oplos/extractie-tank staan in bijlage 5.3. Hierbij is er voor een bepaalde druppeldiameter gekozen en is de straal van het opgeloste molecuul, water en 2-butanol voor de berekening van de diffusiecoëfficiënten geschat. De concentratie van p-interferon in de verschillende fasen voor en na extractie (de randvoorwaarden) zijn berekend uit de waarden van de componentenstaat. Voor de extraktietijd wordt berekend: 't extraktie

< 400 s.


pagina 5.20

5.6.2. De chemische oxidatie of refolding (R501). Nadat DTT verwijderd is via de size exclusion chromatografie, wordt het gedenatureerde Binterferon in de aktieve vorm teruggebracht. Hierbij moeten de verbroken zwavelverbindingen intermolekulair worden hersteld. Per B-interferon molekuul moet 1 zwavelverbinding gevormd worden. Voor de beschrijving van de kinetiek wordt uitgegaan dat het aktieve B-interferon (cJ volgens een eerste orde en geaggregeerd B-interferon (ca) volgens een tweede orde proces wordt gevormd uit het gedenatureerde B-interferon (cJ: de dt

_
-(k'c

K

I

+

K.c 2) 2

de _ft. dt

k'C

dc dt

K'c 2

_-

K

I

2

ti

(5.56)

(5.57)

(5.58)

met 1

kl = 0.01 -

s

(5.59)

(Zie Kiefhaber et al.) De refolding wordt voor de base-case uitgevoerd in een reaktorvat met een volume van 1 m 3 • Verdere gegevens zijn: w~

MW

E

K

543 gram 25000 gram

mol

conversie

K

(5.60)

100%

De overige eiwitten hebben hierbij geen storende invloed op de vorming van aktief en geaggregeerd B- interferon. Om een overall yield te bereiken van 91 % wordt K2 berekend op 95 l/M/s. Het blijkt dat vooral bij lage concentraties gedenatureerd B-interferon de selectiviteit voor de vorming van aktief B-interferon groot is. Door de reaktie fed-batch uit te voeren, kan de concentratie gedenatureerd interferon laag gehouden worden en zodoende de selectiviteit voor de vorming van de aktieve vorm worden verhoogd. Er geldt nu:

pagina 5.21


d(V;c)

v'c~, - V'r

-- =

dl

..,,'

d(V;cJ

dt

(5.61)

V·k·c , 1 d

(5.62)

2 V'K'c , 2 d

(5.63)

dt

d(V;c)

c.

d(V)

(5.64)

-' =

dt

v

met (5.65) als het toevoerdebiet constant is: (5.66)

op t=O geldt:

v,

VriJ

=

0.46 m 3

=

(5.67)

c

"

=

c

".0

~

0

c• = c..,0 = 0

en op t=1": cc/,'

V,

Als voor de toevoertijd,

't,

=

V'.'t

=

=

0 1 m3

(5.68)

3 uur wordt genomen is de yield voor aktief p-interferon > 99.5 %.

1

7.-----------------------------------~==-m

---

cd [10 '" 7 mol/I]

0.9

-+-

6~---------------------------~~~~

ca [10'" 8 mol/I] --7IE-

0.8
E

5

en [10 '" 5 mol/I] -E3yield [-] --7+Vr [m3]

0.7

:J

0

> c
...... ('() ...... ~

C

0.6

4

0.5 3

_.-

>-

OA

0 0

-0
" 0.3

2

0.2 0.1 O.r----~------~-----.------~----~-------

o

2

4

6

8

10

0

12

tijd [sJ (Thousands) Figuur 5.6.1: coneentratieverloop van gedenatureerd (cd), geaggregeerd (ca) en aktief (en) interferon en de yield tijdens fed-batch refolding


pagina 5.22

Hierbij is de yield berekend volgens: yield

C'V z

_ .- '

C~'Vw

(5.69)

Door dus de refolding fed-batch uit te voeren, kan de de yield van 91 naar 99.5 % vergroot worden. Daarbij wordt het totaal volume van de refoldings-reaktor constant gehouden. In figuur 5.6.1. is het concentratieverloop van gedenatureerd, geaggregeerd en aktief pinterferon en de yield weergegeven als funktie van de tijd.


pagina 5.23

5.7. De vloeistof-vloeistof centrifuge (CnOI). In deze centrifuge wordt de butanolfase van de waterfase gescheiden. Het type centrifuge dat gebruikt wordt is een tubular bowl. De lengte (L) van de centrifuge is 1 m, de straal (R) is 0.05 m. Het toerental van de centrifuge is 15000 rpm De centrifuge wordt continu bedreven. Voor de straal waarop het faseoppervlak zich bevindt geldt: R-t ..

R\,.-(p.JpwJ.R 2. . l-p.Jp_

(5.70)

waann [m] Rvat [m] ~ut [m] 3 Pbut [kg/m ] 3 Pwat [kg/m ] RUIf

Met

Rvat

~ut Pbut Pwat

= = = =

de straal waarop het faseoppervlak zich bevindt de straal waarop de waterfase-uitlaat zich bevindt de straal waarop de butanolfase-uitlaat zich bevindt de dichtheid van de butanolfase de dichtheid van de waterfase.

= = = =

0.02m 0.01 m 810 kg/m 3 1000 kg/m3

=

0.041 m.

wordt berekend Rurf

De maximale afstand die een waterdruppeltje dus door de butanolfase moet afleggen om over het grensvlak heen te komen is dan 0.031 m. We hebben aangenomen dat het kleinste en tevens langzaamste druppeltje een diameter van 0.1 *10-3 m heeft. Voor de snelheid van een waterdruppeltje door de butanolfase geldt 2·r·!:J.p·m A·p 6 _ ·C·p 11 . .

(5.71)

waarin u [m] t> [rad/sec] r [m] !:J.p [kg/m3] m [kg] Ab [m2]

=

CD

=

= = = = =

de snelheid van de druppel op straal r de hoeksnelheid de afstand van de druppel tot de as het dichtheidsverschil tussen de butanol- en de waterfase de massa van het waterdruppeltje het aangestroomde oppervlak van het waterdruppeltje de weerstandscoëfficiënt.


pagina 5.24

Voor de gemiddelde snelheid van de bel op zijn weg naar het faseoppervlak moet u geïntegreerd worden van Rt,ut tot Rsurf' Het resultaat hiervan is te zien in de volgende fonnule

,.,.

1.5·C

u

Met

R-t - R_

(R-t1.S - R.../· S)

~

=

m Ab

=

CD

=

1570 rad/sec 5.24* 10- 10 kg 7.85*10-9 m 2 2 .77

=

0.829 mlsec.

=

(5.72)

wordt berekend: u gem

Voor de snelheid van een druppel in een zwerm geldt (5.73) waann

=

€

n Met

€

=

de holdup een constante. =

0.5 en n = 3 geeft dit:

=

Uz,gem

0.104 mlsec.

De kleinste druppel heeft dan (Rsurf - Rt,ut)/Uz,gem = 0.385 sec nodig om het fasegrensvlak te berijken. Om een goede scheiding te bewerkstelligen moet moet de stroomsnelheid door de centrifuge (v) dus kleiner dan LlO.385 = 2.6 mlsec. Met een doorstroomd oppervlak (A) van x*(R2 - R 2but) = 7.54*10-3 m 2 levert dit een debiet op van A *v = 1.96* 10-2 m3/sec. Het centrifugeren van een volume van 5 m 3 duurt dan 255 sec wat veel te snel is. De factor die het debiet door de centrifuge bepaald is dan ook niet de scheidingstijd, maar het feit dat de stroming door de centrifuge laminair moet zijn. We nemen hier aan dat voor laminaire stroming geldt: Re~

1000

Nu geldt voor debiet door de centrifuge cl»v

Re'" =

-

p-

(5.74)


pagina 5.25

waann

=

Re 'l)gem Pgem

[pa*sec] = [kg/m3] =

Met Re = 1000,

'l)gem

=

het Reynolds getal de gemiddelde viscositeit de gemiddelde dichtheid van de emulsie.

1.65* 10-3 Pa*sec en =

Pgem

=

905 kg/m3 levert dit een debiet op van

1.82* 10-3 m 3/sec.

De minimale procestijd voor het centrifugeren van 5.5 m 3 wordt dan 3032 sec:: 0.8 uur. Langere tijden zorgen voor een rustigere stroming en dus een betere scheiding. Gekozen wordt om het debiet te halveren, zodat de totale procestijd voor de centrifuge 1.6 uur wordt.


pagina 5.26

5.8. Precipitatie Ondanks ontbrekende gegevens omtrent kinetiek en deeltjesgrootten voor de betreffende zuurprecipitatie kunnen een aantal eisen gesteld worden aan de precipitatie: -1Minimum vlokdiameter in verband met de centrifugale scheiding -2Voldoende sterke vlok tegen uiteenvallen door afschuifspanningen in nageschakelde pomp en centrifuge -3Een goede bulkmixing (Re > 5000 enlof À =: ~anicle) -4Een beperkte batchtijd ( ~ 4 uur). Ná het verlagen van de pH zullen verschillende precipitatie-kernen ontstaan, welke aangroeien met een door diffusie snelheid bepaalde (~anicle < < À) kinetiek. Bij hoge shearrates (G [S-I]) en grotere vlokdiameters zullen door botsingen de kleinere deeltjes ingevangen worden door grotere vlokken (orthokinetische groei). Vanaf een bepaald tijdstip zullen de dynamische processen van orthokinetische groei en shear-break-up aan elkaar gelijk zijn. In deze laatste fase van 'aging' groeien de vlokken naar compactere en steviger deeltjes om te voldoen aan de tweede voorwaarde. Om te voldoen aan de voorwaarde Re Re

P • N· D 2.....

> 5000 [-], >

=

[-]

5000

" met P =: 1000 [kg/m3], 1) =: 2.10-3 [pa.s], Ds = 0.5 [m] dient N ~ 0.04 [S-I] om te voldoen aan bulkmenging. Via de roerenergie € [W/kg] welke volgt uit, €

=

NP . N 3

•

D 5.t.

v_

[W/kg]

met Np = 6.0 [-] voor een zesbladige turbineroerder, zullen bij meer realistische waarden voor € tussen de 2 en 5 [W/kg] de roerdertoerentallen varieren van 3.17 [S-I] tot 4.30 [S-I]. Op basis van de precipitatie van soja-eiwit wordt voor het Campgetal gevonden: Ca

G-.. .

-

't'

Dit getal geeft de mate van 'aging' aan, een waarde voor optimale precipitaat-sterkte gevonden bij Ca = lOS [-Jo Uitgaande van deze waarde en een maximale tijd van 3 [hr] 5 10800 [sJ is een minimale shear-rate G van 9.26 [S-I] vereist, welke wordt gedefmeerd volgens G

-

~

[-]


pagina 5.27

met E in [W/kg] en v de geschatte kinematische viscositeit van de vloeistof van 2.10-6 [m2/s]. Uitgaande van 2 [W/kg] zal met een shear-rate van 1000 [S-I] ruimschoots voldaan worden aan deze minimale waarde. Er zijn geen experimentele deeltjesdiameters van p-IFN gevonden in de literatuur. Voor een goede centrifugale afscheiding dient de deeltjesdiameter te liggen boven 1.10-6 [m]. Afhankelijk van de shear rate en dus van de kleinste eddies, welke bij een E van 2 [W/kg] in de grootte-orde van 5.10.5 [m] liggen, zal zich na 'aging' een bepaalde deeltjesdiameter instellen. Deze gemiddelde deeltjesdiameter wordt geschat op 5 [JLm]. Bij soja-precipitaten wordt na voldoende aging (G.t = lOS) een dichtheidsverschil gevonden tussen deeltjes en vloeistof (water) van 250 en 120 [kg/m3] bij deeltjesdiameters van 1 en 5 [JLm]. Uitgaande van 3000 [kg] vatinhoud en een roervermogen E van 2 [W/kg] wordt door de roerder 6 [kW] aan vermogen aan de vloeistof afgegeven. De vereiste koelcapaciteit bedraagt tenminste 6 [kW].


pagina 5.28

5.9. Size exclusion Chromatografie (K401, K601, K602) In de literatuur worden verschillende namen gebruikt voor het scheiden van stoffen op basis van grootte in een bepaalde oplossing, naast size exc1usion chromatografie (SEC) zijn dit o.a. gelfiltratie, gel penneatiechromatografie, gel exc1usion chromatografie, ontzouten, en gel chromatografie. Naannate een molekuul kleiner is, kan deze een poreus deeltje efficiënter penetreren, en onttrekt zich op deze manier van de bulk vloeistof stroom. Dit resulteert in het feit dat moleculen die klein zijn ten opzichte van de diameter van het drager materiaal veel later in het chromatogram verschijnen dan moleculen die niet in de poriën kunnen diffunderen. Een maat voor de 'verblijftijd' van een stof in een specifieke kolom is het elutievolume CVe). Een parameter die gebruikt wordt om deze parameter uit te rekenen is de volumetrische distributie coëfficiënt Kav, deze parameter geeft een maat voor de fractie van het kolomvolume die beschikbaar is voor een specifieke stof met een bijbehorend molekuul gewicht. Het zal duidelijk zijn dat deze Kav bepaald wordt door enerzijds specifieke parameters van de stationaire fase en anderzijds van de grootte van het molekuul zelf. Kav = ct + 6 In (Mw) Waarin ct en 6 specifieke materiaal parameters zijn (Aspen Libary) en Mw het molekuulgewicht voorstelt. Het elutievolume kan nu uit het vrije volume (Vo) en het gel volume (Vg) worden uitgerekend: = =

ek * Kolom volume Kolom volume - V0 Vo + Kav*Vg*egel

Het is dus van belang voor een specifieke scheiding een specifiek soort pakkingsmateriaal te zoeken. De volgende tabel geeft een aantal mogelijke pakkingsmaterialen met de specifieke fractionatie ranges:

Materiaal

Frac Range (Mw)

Sephadex G 10 G25 G50 G100 Sephacryl S200 Sepharose 6-B

50-700 1000-5000 15000-30000 4000-150000 5000-300000 10000-4e6

De mate van scheiding tussen twee stoffen wordt niet alleen bepaald door het elutie volume maar ook van de spreiding van de opeenvolgende pieken. Deze spreiding is het gevolg van de volgende factoren:


pagina 5.29

a) Moleculaire diffusie over de lengte van de kolom b) Channeling van de flow (axiale dispersie) c) Film diffusie d) Spreiding door porie diffusie De spreiding kan kwantitatief beschreven worden met het bekende HETP-model van van Deemter et al (1956). In dit model wordt de chromatografische kolom ingedeeld in een serie platen met een specifieke lengte zodat de mobiele fase die de plaat verlaat in evenwicht is met de stationaire fase op de plaat. Een vereenvoudigde versie van dit model is weergegeven in de volgende formule:

(5.75)

HETP

De eerste term wordt beschreven als 2* À *~ p waarbij À::: 1 de bedpakkingsfactor (Aspen Library). De tweede term in bovenstaande vergelijking is de axiale dispersie term en is voor grote moleculen gewoonlijk verwaarloosbaar vergeleken met andere termen in de vergelijking. De derde term in de HETP-vergelijking beschrijft de gecombineerde effecten van fllm diffusie en intraparticle diffusie met constante C r. (l-r) .

C •

~P 2

(5 .76)

Met voor de constanten Z en y s (de obstructiefactor voor diffusie in de stationaire fase) waarden van 30 en 10 (Aspen Library), en variabelen r de relatieve snelheidsconstante VoIV e , Dmobiele de diffusiecoefficient in de mobiele fase en ~P de drukval over het bed. Het aantal schotels in een bepaalde kolom N, kan nu worden berekend uit de HETP en de lengte van de kolom volgens N = L/HETP [-]. Tevens is afgeleid dat het aantal schotels N direct gerelateerd is met de spreiding van de pieken (Bioscheidingen 1994), namelijk N

•

t a

(~y

(5.77)

Waarin sigma de standaarddeviatie van een gausiaanse kurve is, en dus een maat voor de spreiding en !ret de retentie tijd van een component (Ve/F).

5.9.2 Resolutie De resolutie Rs van een bepaalde scheiding geeft een maat van de efficiency van de kolom. Rs geeft een maat voor de overlap van twee zones.


RsI!

•

kl . 0.25 . -u-I . u kl +l

pagina 5.30

~ -HETP

(5.78)

met k2 = (tret.2-to)/to [-], met to de retentietijd van de elutievloeistof en tret.2 = Ve2/F de retentietijd van component twee én u = k2/k1. Hieruit kunnen we concluderen dat de resolutie hoger wordt met de wortel van de kolomlengte. De variabelen die aangepast kunnen worden voor een specifieke scheiding zijn: kolom lengte, vloeistof snelheid, deeltjes grootte pakkingsmateriaal en sample volume, deze zullen vervolgens kort worden besproken.

5.9.3 Sample volume Naarmate het sample volume groter wordt zal de resolutie lager worden. In de industriele praktijk (Ganetsos 1992), zal het sample volume maximaal 25 % van het kolom volume zijn, in dit geval wordt alleen het centrale gedeelte van de piek opgevangen terwijl de zogenaamde staarten weer worden gerecycled naar het buffervat. In het geval van interferonproduktie moet onderscheid worden gemaakt tussen SEC gebruikt voor het scheiden van interferon en zouten, en het opzuiveren van interferon met betrekking tot eiwitten (met name scheiden dimeren van interferon).

5.9.4 Vloeistofsnelheid De maximale flowrates varieren in de praktijk tussen 0.06-3 mlhr. Een belangrijk punt om te overwegen is dat een hogere flowrate een hogere drukval over de kolom als gevolg heeft. Verder gaat in het algemeen de resolutie naar beneden naarmate de lineaire snelheid stijgt, er bestaat dus voor elk systeem een optimale vloeistofsnelheid.

5.9.5 Dimensionering chromatografie-kolommen In het algemeen wordt de afweging gemaakt tussen een hogere resolutie door middel van kleinere deeltjes tegenover de grotere drukval die het gebruik van kleinere deeltjes met zich meebrengt. Een hogere drukval over de kolom resulteert weer in een kleinere kolomlengte (compressibiliteit drager materiaal).

Uit het voorgaande is duidelijk geworden dat er een kwa fysische condities een onderscheid gemaakt dient te worden tussen allereerst de plaats van de unitoperation in het proces (initiële zuivering of laatste zuivering) en vervolgens wat er precies gescheiden gaat worden (ontzouting of eiwit/eiwitscheiding )


pagina 5.31

De volgende tabel bevat de proces- en unit parameters die geschat zijn voor de diverse SEC stappen in het interferon proces, (parameter indicatie o.a. Ganetsos et al (1992» .

Te verwijderen component:

DTT I eiwit

eiwit

EDTA

Molecuulgewicht:

154 I 80.000

40.000

292

Materiaal (-) Void fraction (m) Deeltjesgrootte (m) Bed hoogte Aantal bedden per kolom Aantal parallelle kolommen (m) lColomdiameter Totaal kolomvolume (m3)

S-100HR 0.32 47E-6 0.25 2 2 1 0.393

S-l00HR 0.32 47E-6 0.25 2 2 1 0.393

G50 0.32 60E-6 0.2 2 1 0.54 0.092

Lin. eluent snelheid (mis) (bar) Drukval materiaal Sample volume/load (m3) Cycle volume/load (m3) Aantal cycles (m3) Eluent/load

2.2e-4 0.258 0.098 0.589 2x2 0.491

0.83e-4 0.1 0.0336 0.589 2x1 0.555

5.4e-4 0.32 0.0211 0 .138 1x2 0.117

-PERFORMANCE-(hr) TijdsduurI cycle (hr) Totale tijdsduur (-) Yield 6-IFN Yield 'overig eiwit' (-) Yield 'verwijderde comp.'

3 6 0.95 0.31 0.0

8 8 0.86 0.067 0.0

1 2 0 .97 0.97 0 .0

De batchtijd is zoals alle aanwezige unit operations afhankelijk van het aantal apparaten waarin de specifieke stroom geprocessed wordt. Bovenstaande parameters zijn ingevoerd in de unit Gelchrom van Aspen, waaruit de volgende resultaten zijn geboekt:


pagina 5.32

5.9.6. DTT-verwijdering (K401). Stroom en kolom karakteristieken: HETP [m]

N [-]

Kav

totaal kg in

totaal kg uit

yield

protein

4.8e-4

943

0.045

0.440

0.139

0.316

p-IFN

2.6e-4

1697

0.3

0.583

0.554

0.95

DTT

1.1e-4

4184

1

1.681

0.167

0.10

Voor de serie eiwitten en DTT in de stroom zijn model-eiwitten met MW van 80000 en 154 gekozen. Het blijkt uit de run in ASPEN dat de DTT aanwezig in het shot (ingaande stroom) voor 100% gescheiden wordt van de eiwitten. DTT in de elutievloeistof verdeeld zich evenredig over de uitgaande stromen. produkt stroom ingaande stroom

607 kg 411 kg

Uitgaande van 2 parallelle kolommen met twee beladingen per kolom wordt de batch procestijd 6 uur.

5.9.7. Dimeerverwijdering (K601). Stroom en kolom karakteristieken: HETP

N [-]

Kav

totaal kg in

totaal kg uit

yield

[m]

dimeer

2.2e-4

2308

0.174

0.133

0.009

0.07

p-IFN

1.63e-4

3064

0.303

0.518

0.446

0.86

produkt stroom ingaande stroom

88 kg 59 kg

Uitgaande van 2 parallelle kolommen wordt de batch proces tijd 8 uur.

5.9.8. Ontzouting (K602).

Hoofdstuk 5: Ap'Paratuurberekeningen.

pagina 5.33

Stroom en kolom karakteristieken: HETP [m]

N [-]

Kav

totaal kg in

totaal kg uit

yield

protein

2.3e-4

1752

0

0.009

0.009

0.97

p-IFN

2.3e-4

1752

0

0.419

0.406

0.97

De produkt stroom bedraagt 55 kg, en uitgaande van één kolom en twee cycles wordt de batch proces tij·d 1.9 hr.


pagina 5.34

5.10. De Ultrafiltratie units (F402, F501 en F601) Deze unit operation is bedoelt om de overmaat DTT van het gereduceerde BIFN te scheiden om een zo hoog mogelijk rendement bij de chemische oxydatie te halen. Voor deze scheiding kan zowel een gel filtratie als een ultrafiltratie unit gebruikt worden. De laatste heeft de voorkeur omdat het proces sneller bedreven kan worden bij een hogere yield (90%). Gel filtratie heeft als voordeel dat naast DTT ook grote moleculen als cel debris en grootte eiwitten afgescheiden worden, omdat aangenomen is dat deze componenten niet storen bij de volgende unitoperations (refolding en aff. chrom.), is voor ultrafiltratie gekozen.

5.10.1. Inleiding. Om de dimensies van de size-exc1usion-chromatografie kolommen beperkt te houden dient de eiwitstroom met Beta-IFN ingedikt te worden. Dit gebeurt met behulp van ultrafiltratie in unit 14 en 16. Beta-IFN heeft een molecuulgewicht van 20.000 Cg/mol], en is dus met een membraan met MWCO (Molecular Weight Cut Oft) 3000 Cg/mol] goed te concentreren. Er is geen directe literatuur gevonden over ultrafiltratie van Beta-IFN, dit in tegenstelling tot ultrafiltratie van BSA (Bovine Serum Albumine, 69.000 Cg/mol]). Er wordt aangenomen dat eigenschappen van Beta-IFN, zoals thermodynamisch en rheologisch gedrag, globaal overeenkomen met die van BSA. Omdat beide ultrafiltratie-stappen eenzelfde doel hebben, namelijk concentrering van een eiwitstroom, worden beide in één keer besproken. De dimensies en benodigde batchtijden zullen echter verschillen van elkaar. L

5.10.2. De apparatuur en uitvoering. De flowsheet voor de ultrafiltratie staat weergegeven in afbeelding 1. De voorraadtank (VI) wordt of is reeds gevuld met de verdunde eiwitoplossing, waarna met stikstof de tank op een werkdruk van drie atmosfeer wordt gebracht en gehouden middels een drukregeling . Met behulp van een centrifugaalpomp (PI) wordt de eiwitoplossing door een ultrafiltratiemembraan geperst. Het debiet door het membraan wordt constant gehouden door middel van een regelklep in de bypass van het membraan. Het membraan bestaat uit een module met een groot aantal (n) parallel geschakelde fibers van cellulose-acetaat. Het is bekend dat neergeslagen eiwitten vrij eenvoudig zijn uit te spoelen van dit materiaal. Door deze van buiten verstevigde 'poreuze' fibers wordt de te concentreren vloeistof gestuwd. Het permeaat stroomt door de porien, loodrecht op de bulk-stroomrichting (cross-flow-filtration). Het permeaat stroomt onder atmosferische druk naar de kiB-tank. Om fouling van het membraan tegen te gaan en het stoftransport door de filmlaag te vergroten wordt deze bedreven bij hoge Reynolds-getallen. Tevens zal bij lagere pH (pH < 7) het Beta-IFN beter opgelost blijven dan bij waarden dicht bij het isoelectrisch punt (pH 8.9) (Oers 1994). Omdat de temperatuurstijgingen lager dan 2 °C bedragen behoeft de concentraatstroom niet


pagina 5.35

gekoeld te worden. Om redelijke oplosbaarheid van Beta-IFN te garanderen en denaturatie te voorkomen wordt de de ultrafiltratie bedreven bij 25°C. De eiwitoplossing zal ingedikt worden tot 20 [gil]. Na afvoer van deze fractie zal met eenzelfde volume water (+ detergent ?) en een gesloten permeaatklep het membraan doorgespoeld worden om het aangehechte eiwit uit te spoelen. De uiteindelijke eiwitconcentratie voor de volgende unit bedraagt hiermee 10 [gil].

5.10.3. Dimensionering. De membraanconfiguratie wordt uitgedrukt in n doorstroomde fibers met lengte L [m], en inwendige diameter d [m]. Het membraan-oppervlak Am [m2] wordt gedefmieerd volgens Am = n 1t d L [m2]. Er wordt uitgegaan van een constante bulk-vloeistofsnelheid V b [mis] door de fibers. Deze staat in relatie met het debiet F [m 3/s] volgens V b = F/Adwars = 4.F/(n1td2) [mis]. Gebruikelijke waarden voor de fiberdiameter bij eiwit-concentrering liggen tussen de 1 en 4 [mm] en vloeistofsnelheden tussen 2 en 7 [mis]. Voor het dimensioneren van de ultrafiltratie-unit zijn de grootheden membraanflux (J in [m 3/m 2 .s]) en de retentie (R in [-]) van belang.

5.10.4. De permeaatflux. De permeaatflux wordt bepaald door een aantal factoren, zoals osmotische druk, chemische potentiaal, protein-fouling, membraan-weerstand, overige opgeloste componenten, hydrodynamica in de fiber en concentratiegradienten in de stagnante filmlaag aan de fiberwand. Aangenomen wordt dat de flux bij hogere eiwit-concentraties en transmembraandrukken voornamelijk bepaald wordt door de eiwit-concentratiegradient in de stagnante filmlaag (polarisatielaag) aan het binnenoppervlak van de fiber. De situatie in de filmlaag wordt weergegeven in afbeelding 2 (Oers 1994). De flux wordt bepaald door de concentratiegradient en de stofoverdrachtscoefficient ks: J

k• . In

•

c ....0

-c P

C6 - Cp

(5.79)

Hierbij wordt uitgegaan van een concentratie aan het membraanoppervlak (C waU) gelijk aan de gelconcentratie (Cgel)' Er wordt van uitgegaan dat de Cgel van BSA (210 [kg/m3] (perry» vergelijkbaar is met die van Beta-IFN. Voor de stofoverdrachts-coefficient ks in de fiber wordt gebruik gemaakt van de Sherwood-relatie; Sh

:

k. dh D

:

0.023 Re·Ol Sc 0.33

(5.80)

De diffusiecoefficient van het eiwit bedraagt 6*10'11 [mis] voor BSA (Oers, 1994). Uitgaande van experimentele waarden voor de viscositeit van BSA bij 24°C en 47.3 [gil]


pagina 5.36

(pandit ... ) wordt een lineaire afhankelijkheid van de eiwitconcentratie aangenomen. ,,~

c_

..

(5.81)

1.4.-47.3

Waarmee de viscositeit van de oplossing volgt uit "

..

,,_. (1

+

,,~)

10.3

..

•

(1

+

,,~)

(5 .82)

De dichtheid (p in [kg/m3]) van het concentraat wordt geschat op 1000 [kg/m3]. Door een toenemende viscositeit tijdens de concentrering zal de stofoverdrachts-coefficient afnemen met een factor ("/"t=O)(O.8~.33) uit de Sherwoodrelatie. De keuze van stroomsnelheid en membraandimensies zal dus afhangen van een minimaal vereist Reynoldsgetal (turbulente stroming) én een maximaal toelaatbare axiale drukval in het membraan. Bij het ontwerp dient met deze restricties rekening gehouden te worden. Vanwege neerslag van eiwitten op het membraan zal de membraanflux afnemen ('proteinfouling'). De hierboven voorspelde flux op basis van diffusieverschijnselen in de polarisatielaag zal te hoog zijn. Om hiervoor te corrigeren wordt uitgegaan van een (geschatte) gehalveerde flux bij 20 [gil] eiwit volgens een lineair verband, waarmee de uitdrukking voor de gecorrigeerde membraanflux: Jprot'" 1-,

JpoI.U-

=

c_

•

(1--) 40

(5 .83)

5.10.6. De retentie. De retentie (R = l-C/C b [-]) van Beta-IFN dient experimenteel bepaald te worden voor bijvoorbeeld een YM3-cellulose-acetaat membraan. Voor dit membraan met een MWCO van 3000 (90% retentie voor stoffen met MW 3000 [gimol]) wordt aangenomen dat het zeven maal grotere Beta-IFN een retentie heeft van groter dan 99%. (vergelijk FormateDeHydrogenase MW 75.000 met R > 0.999 voor een YMlO-membraan, Papamichael 1987). Tevens wordt aangenomen dat voor alle aanwezige E-Coli-eiwitten dezelfde retentie van 99 % geldt, en dat voor de kleinere opgeloste componenten (MW < 300) een retentie van 0% (Cp = Cb) geldt. Deze retentie van kleinere componenten is niet van groot belang, omdat in de opvolgende size-exclusion-chromatografie stappen deze kleinere componenten eenvoudig gescheiden worden van het Beta-IFN.

5.10.7. Het pompvermogen. De axiale drukval is af te schatten volgens (perry): ~p

=

2fL-u 2J!... x

(5 .84)


pagina 5.37

De transmembraan drukval wordt ingesteld met behulp van de druk in het vat en de opgebrachte druk door de pomp. Hierbij wordt uitgegaan van atmosferische druk van het permeaat. Een te hoge transmembraandruk resulteert in een compacte eiwit-laag op het membraan met als gevolg een verlaagde flux [papamichael, 1987]. Om toch voldoende drijvende kracht voor visceuze stroming in de porien te behouden zal gewerkt worden bij een gemiddelde drukval over het membraan van 200 [kPa]. Door het membraan goed te ontwerpen kan bij de ingestelde vloeistofsnelheid aan het eind van de filtratie, waarbij de viscositeit het hoogst is, voldaan worden aan deze voorwaarde. Het pompvermogen wordt berekend op basis van de vereiste op te brengen druk en debiet bij een pomprendement " volgens: AP. F

"

(5.85)

Hierbij ligt het minimaal vereiste debiet vast volgens F

=

v,.

A....

d.A_ 4L

v, . ----"==

=

(5 .86)

en volgt de ClPpomp uit de te overwinnen drukval van membraan waarbij de weerstand in de recycle-leiding verwaarloosd wordt. Het gemiddelde pompvermogen over de gehele concentreringsstap bij constant debiet en pomprendement bedraagt P

_ ......,.1

=

~-

Met de batchtijd

't

F

--

"

• 't

•

JAP_. dt

(5.87)

o

in [s].

Voor het berekenen van warmte-effecten wordt uitgegaan van de 'worst case': Alle geproduceerde warmte wordt afgegeven aan de concentraatstroom Warmtebronnen in de recyclestroom zijn de pomp (1-,,).Ppomp,gem. [W] én wrijvingsenergie in het membraan" .Ppomp.gem [W], opgeteld Ppomp ,gem[W]. Voor de totale toegevoegde warmte Q [Joule] geldt Q

• P~~ .

--

'tL~

•

V _ ~ . P . c, . AT

(5.88)

Met een cp van 4186 [J.kg-1K 1] en een bekende dichtheid, gemiddeld pompvermogen, batchtijd en concentraatvolume is de temperatuurstijging te berekenen.

5.10.8. Het ontwerp.


pagina 5.38

Bij het ontwerp dient rekening gehouden te worden met de situatie aan het het eind van de concentreringsstap waarbij de viscositeit maximaal is en dus het Reynoldsgetal het laagst en de axiale drukval het hoogst. Voor deze 'worst case' moet gelden dat: -1Re > 3000 [-], waarmee door een turbulent regime een voldoende hoge flux gegaraneerd wordt (Sherwood), ClPaxiaai < 0.25*IOS [pa], om het pompvermogen en dus de afschuifspanningen op -2het eiwit beperkt te houden.

Door middel van simuleren in PSI bij verschillende waarden voor dfiber (d> 1 [mm]), aantal parallelle fibers, vloeistofsnelheid (2 0.95), Re eind (> 3000), dPaxiaai «25 [kPal), pompvermogen en temperatuurstijging « 5 [Kl). Deze procestijd dient vermeerdert te worden met de tijd voor het naspoelen, wat ongeveer één uur in beslag zal nemen.

5.10.9. De resultaten. De resultaten van de verschillende ultrafiltratie-units staan gegeven in onderstaaande tabel. input-gegevens

F402

F501

F601

Vo

[m3]

1.65

1

0.079

Co

[kg/m3]

0.202

0.692

5.759

u

[mis]

3

3

3

df

[mm]

2

2

2

n

[-]

400

400

85

L

[m]

0.5

0.5

0.5

R

[-]

0.99

0.99

0.99

output-gegevens Ceind

[kg/m3]

1.501

19.96

19.99

cp

[kg/m3]

0.015

0.2

0.2

V eind

[m3]

0.218

0.034

0.0225


pagina 5.39

Vp

[m3]

1.432

0.966

0.0565

APax eind

[bar]

0.5

0.53

0.53

Reeind

[-]

6434

4224

4222

Tl eind

[mPa.s]

1.04

1.59

1.59

AT eind

[K]

2.3

14.8

2.8

0.98

0.967

0.988

yield (voor eiwit) [-] Jm.begin

[mis]

1.31 *10-4

1.06*10-4

5.43*10-4

Jm.eind

[mis]

8.85*10-5

1.8*10-5

1.8*10-5

or

[sJ

9850 uur

=2.8

9850 uur

=2.8

5740 uur

= 1.6


pagina 5.40

5.11. Dead-end filtratie

De dead-end filtratiestap is bedoeld om nog aanwezige micro-organismen en niet opgeloste eiwitten te verwijderen, aangezien deze kunnen hinderen bij latere chromatografische stappen. Er is gekozen voor een dead-end filtratie omdat de solid concentratie relatief laag is en omdat de schoonmaak van de unit eenvoudig is. De filterwerking in dit proces is gezien de lage solid concentratie « 1 %) gebaseerd op het filterdoek en niet zozeer op de te vormen cake (~rie 0.22 JLm). In de praktijk worden voor het filteren van soortgelijke stromen apparaten als: filterpers, cartridge 'edge' en horizontal plate technieken toegepast (Coulson en Richardson 1991) Bij Chiron wordt een zogenaamd 'kaarsfilter' gebruikt. Een cylindrisch vormige filter (doek + support) wordt in een buis geschoven waarin vervolgens op diverse plaatsen onder druk de te behandelen vloeistof wordt ingebracht. De gefilterde vloeistof wordt in het centrum van de buis opgevangen en afgevoerd. Nadat de stroom gefilterd is wordt het doek nagespoeld met spoelwater en vervolgens afgevoerd en vervangen door een nieuw doek. Het debiet door zo'n filter is ongeveer 300 11m2 h (Coulson et al. 1991). Toegepast voor het proces levert dit voor een flow van 400 I (incI. wasvloeistot) het volgende filterdoek en apparaat karakteristieken op:

Karakteristiek diameter filter (m) lengte filter (m) (m2) oppervlak aantal filters 4P (bar) batchtijd operatie schoonmaken

0.2 2 1.26 2 0.35

2.5 h 0.5 h

2 h


pagina 5.41

Bijlage S.l. De Warmtewisselaar (11201) Bij de homogeniser moet per pass een hoeveelheid warmte afgevoerd worden, om te voorkomen dat de processtroom te warm wordt wat kan resulteren in deaktivatie van pIFN. De hoeveelheid warmte die afgevoerd moet worden bedraagt 24.3 MI per pass, waarbij de proces stroom van 30.7°C naar 20°C afgekoeld wordt. Met een procestijd van 0.9 uur wordt dit 7.5 kW per pas. Het debiet door de warmtewisselaar is 0.6 m3 per uur. Vanwege de kleine stromen en kleine temperatuurverschillen is er gekozen voor de eenvoudigste, en dus goedkoopste shell en tube warmtewisselaar; de fIXed tube sheet warmtewisselaar met één pass. Van de warmtewisselaar zijn de tubes het makkelijkste schoon te maken, vandaar dat de meest wand-vervuilende stroom, hier de processtroom, door de tubes gevoerd wordt. Het koelwater stroomt dus door de shell. Voor het warmtetransport in een warmtewisselaar geldt ~w

•

U A /j.T/M

waarin ~w

U A /j. T 1m Voor de

/j. T 1m

= = = =

het warmtedebiet [W] de overall warmteoverdrachtscoëfficiënt [W/(m2D C)] het buitenoppervlak van de buizen [m2] het logaritmisch gemiddelde temperatuurverschil

bij tegenstroom en één pass geldt ( TI - t 2

)

-

(

T2

-

ti )

In ( TI - t2 ) ( T2 - ti )

waarin

= = = =

De inlaat temperatuur van de koelstroom De uitlaat temperatuur van de koelstroom De inlaat temperatuur van de processtroom De uitlaat temperatuur van de processtroom .

Met Tl = lODC, T 2 = 12 DC, t l = 30.7°C en ~ = 20°C levert dit een T 1m van - 13.9 DC. Met ~w is - 7.5 kW en U is 800 W/(m2 °C) wordt dus het benodigde warmte wisselend oppervlak A 0.67 m2 De schatting van U ligt al aan de lage kant. Voor een water-water warmtewisselaar ligt de U tussen de 800 en de 1500 W/(m2 °C). Met een tubelengte van 1.3 m, een tube buitendiameter van 0.01 m wordt het oppervlak per tube 0.041 m2 en zijn er 17 tubes nodig.


pagina 5.42

Voor de tubes werd een triangular pitch gekozen omdat dit de kleinste bundel diameter oplevert. De afstand tussen de tubes is 1.25 maal de buiten diameter van de tubes. De bundeldiameter is met de volgende formule uit te rekenen N..!... D • d (_'rl •

• KI

[m] de bundel diameter [m] de buitendiameter van de tubes [-] het aantal tubes twee constanten zijn die afhangen van de pitch, het aantal passes en de afstand tussen de tubes. Hier geldt Kl = 0.319 en n l = 2.142, en wordt de bundel diameter 0.064 m . De shell diameter is dan 0.076

m. Het koelwaterdebiet dat nodig is volgt uit ~k

P C, b. T

~ ~..

P C, b. t

waarin = het debiet van de processtroom = het debiet van de koelstroom

[m3/sec]. [m3/sec].

Met b.t = 10.7 °c, b. T = 5 °C en ~m = l.67*10-4 m 3/sec levert dit een koelwaterdebiet van 3.57*10-4 m 3/sec. Voor het totale disruptie proces (3 passes van 0 .9 uur) is nu 3,73 m 3 koelwater nodig . De drukval over de warmtewisselaar is verwaarloosbaar.

Oplossen inclusion bodies (R301) en reduceren (R401)

Bij het opwarmen en afkoelen wordt uitgegaan van constante debieten warm (90°C) en koelwater (lO°C) door de in de reactorwand bevestigde koel/verwarmingsspiraal met een uitwisselend oppervlak van 5 [m2] . De warmteoverdrachtsweerstand is gelokaliseerd in de oplosvloeistof en in de 5 mm dikke wand van de spiraal. De opwarmen afkoeltijden bepalen de oplostijd en zijn met behulp van simulaties in PSI-C bepaald. Hierbij is uitgegaan van een overall warmteoverdrachtscoefficient hrot volgens Tramper/van It Riet (1991) 1 h...

waarin

hl warmteoverdrachtscoeff. in vloeistof

[m.OC/W]

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen. À-w

pagina 5.43

warmtegeleidbaarheid van de spiraalwand

80 [W/m.oC]

De warmteoverdracht in de vloeistof is bepaald volgens À. ND 1 CT} _, '0.6'(--')067,(-.L!.)033 D. v, À-,

h, •

waarin

warmtegeleidbaarheid in vloeistof de kinematische viscositeit = T}/p Cp de vloeistofwarmtecapaciteit À-I VI

4200 [I/kg.oC]

Met de overall warmteoverdrachtscoefficient wordt de uitgewisselde warmte Hh uitgedrukt volgens

H • ~

met

[W]

de ingangs verwarmingsvloeistof temperatuur de uitgangs verwarmingsvloeistof temperatuur de oplosvloeistof temperatuur

Bij een inwendig mantel-volume van lOOO*A*dgcmiddcld [Liter] en een vastgesteld massadebiet van koel/verwarmingswater [kg/sj ligt de uitgangstemperatuur T h•o als functie van de tijd vast volgens T~,p

z

TI

+

(TlIJ-T)' e C" y.I

met or de batchtijd [sj , en is TI met de defInitie van Th.o en Hh vastgelegd in de tijd volgens T

I

•

20

1 m'C

+ -

I,

•

• IH

~,T,

·dI

0

Voor het afkoelen gelden analoge beschouwingen, waarbij Tc•i = 10°C en verder identieke procesomstandigheden. Er is voor het oplossen voor de inc1usion bodies geen warmte nodig omdat de temperatuur in R301 wordt ingesteld d .m.V. de temperatuur van de benodigde hulpstoffen (stroom 302). De benodigde tijden voor opwarmen en koelen liggen ruim binnen de afgeschatte procestijden.


pagina 5.44

Bijlage 5.2. Voor het verkrijgen van het volume als functie van de tijd zal er een tijdsafhankelijk debiet gevonden moeten worden, waarbij tijdens het proces aan de gestelde voorwaarden wordt voldaan. In de eerste plaats wordt verondersteld dat er tijdens de "lag-phase" geen groei plaatsvindt. Verder zal het m.o. tijdens de exponentiële fase 18 uur lang met een maximale groeisnelheid van 0.4 lIh groeien en tijdens de produkt fase, die 6 uur duurt met 0.1 lIh. Bij een substraatconcentratie van 5 tot 10 gIl mag de Monodconstante Ks verwaarloosd worden. Er wordt geschat dat het totale volume, dat tijdens de exponentiële fase wordt toegevoegd, 0.5167 m3 bedraagt. Het volume dat tijdens de produkt fase wordt toegevoegd is dan 0.484 m3 • Voor het debiet als functie van de tijd worden de volgende vergelijkingen voorgesteld: Voor de exponentiële fase (van t

= Oh tot t = 18h): (5.89)

met Kl = 1.53464.10-5 m 3/h, en voor de produkt fase (van t = 18h tot t = 24h): F. K2'Ce"' "

met K2 = 5.17091.10-3 m 3 /h.

+

(t-18)'~2'el'2 " )

(5.90)

Hoofdstuk 5: Apparatuurberekeningen

pagina 5.45

Bijlage 5.3: gegevens nodig voor de berekeningen bij oplos/extraktie tank (R301)

omschrijving

symbool

volume tank diameter tank hoogte tank diameter roerder hoogte roerder lengte blades hoogte blades breedte baffles

Vt

Sauter diameter volumefractie disp. fase specifiek opp. disp. fase opp. spanning butanol/water (T=30 gr.C) constante (org.fase = disperse fase) dichtheid continue fase (water) dichtheid disperse fase (butanof) vermogenstoevoer per massa totale massa (extractie unit) benodigde vermogenstoevoer vermogenskental turbine roerder Re> > gemiddelde dichtheid toerental roerder viscositeit water viscositeit 2-butanol vi8C08iteit gemiddeld Reynolds getal Boftzmann constante temperatuur tijdens de extractie gemod. Stokes-Einstein const. (In water) gemod. Stokes-Einslein const. (in butanol) straal van het opgeloste molecule straal van de oploesing (water) straal van de oplossing (2-butanof) Diffusiecoefficlent beta-IFN in water Diffusiecoefficient beta-IFN in 2-butanol stofoverdracht disperse fase stofoverdracht continue fase

Ot

Ht d L w B dp eps a sigma Cte rho,c rho,d e mtot

P Po rho,gem N N etha,w etha,b etha,av Re k

T nOSEw nOSEb ri rw rb D,c D,d kd kc

eenheid

6.00 1.56 3.13 0.52

1.04 0.13 0.10 0.16 0.0005 0.5 6000

0.025 0.5 998.00 805.39 0.715 5284.869 3nS 6

901.69 2.63

158 1.002E-03 2. 948 E-03 3.125E-03 205958 1.381E-23 298.15 4.94 3.53 1.50E-09 5.00E-10 1.50E-10 5.883E-11 8.394E-12 3.005E-07 1.291E-05

[m A 3] [ml [m] [ml [m] [m] rml [m] [m] [-] [1/m] [N/m1 [kg/m A 3] [kg/m A 3] [W/kg] [kg1 [W] [-] [kgfm"3] [1/s] [1/min1 [Pa.s1 [Pa.s1 [Pa.s] [-] [J/K1

[K] [m] [m1 [m] [m A 2Is1 [m A 2Is1 [mIs] [mIs]

Hoofdstuk 6: Massa- en warmtebalans

pagina 6.1

6. Massa- en warmtebalans In bijlage 6.1 staat de stroom- en componentenstaat en in bijlage 6.2 de massa- en warmtebalans weergegeven. Deze zijn beide gebaseerd op hoeveelheden (kg en MI) per batch. In hoofdstuk 2 staat beschreven dat in verband met de recycle van p-IFN, er eens per 20 batches niet gerecycled kan worden. In verband hiermee wordt uitgegaan van een produktie van 406 gram p-IFN per batch. Met 100 batches per jaar levert dit uiteindelijk 40 kg p-IFN per jaar. In de stroom- en componentenstaat staan zoveel mogelijk alle stromen tussen verschillende bewerkingen weergegeven. Dit komt niet altijd overeen met de fysische realiteit. Daarom staat in de naamgeving van elke stroom zo duidelijk mogelijk weergegeven op welk stadium in het proces de stroom betrekking heeft. Bijvoorbeeld stroomnummer 115: uit microfiltratie, naar diafiltratie. In werkelijkheid gaan hier achtereenvolgens veel stromen door met verschillende samenstellingen. In de massa- en warmtebalans staat een aantal apparaten meerdere malen weergegeven. Dit is gedaan om de balansen zo duidelijk mogelijk weer te geven, omdat één apparaat of vat vaak voor meerdere bewerkingen wordt gebruikt. Bijvoorbeeld vat V201 wordt 2* per batch gevuld en geleegd.

Hoofdstuk 7: Overzicht en specificatie van de apparatuur

7. Overzicht en specificatie van de apparatuur In de bijlage 7.1 tot en met 7.4 is het volgende te vinden: Bijlage Bijlage Bijlage Bijlage Bijlage

7.1: 7.2: 7.3: 7.4 : 7.5 :

Apparatenlijst voor pompen Apparatenlijst voor centrifuges Apparatenlijst voor filters SpecifIkatiefonnulier wanntewisselaar Apparatenlijst voor kolommen

pagina 7.1

1

~

~

0.98 0.96 0.94 ,........,

Ibase-case

.-

'\

'\ '\

I

0.92

.......... I

"'0 Q)

0.9

.>. 0.88

---_._----

, \

0.86 0.84

\

0.82 0.8 0.1

\

.",

I

I

I

T ,TTT

I

1

10 log (K2/K2')

Figuur 8.1: yield aktief p-interferon tijdens fed-batch refolding als funktie van kinetiekkonstante,K2 voor aggregaatvonning

100

pagina 8.1

Hoofdstuk 8: Gevoeligheidsanalyse

8. Gevoeligheidsanalyse In dit proces, dat een alternatief is van het proces volgens de 'base case' (FV03120A) zijn een aantal aannames gedaan om tot alternatieve proces routes of procesoperaties te komen. Deze aannamen zullen hieronder stuk voor stuk worden besproken en de gevoeligheid van de betreffende parameters zal worden geanalyseerd. Voor het in oplossing houden van de eiwitten wordt gebruik gemaakt van SDS. Na de extractie wordt SDS vervangen door Ureum. In sectie 4 waar oorspronkelijk 1 % SDS werd gebruikt wordt een 8 molair ureumoplossing genomen. In de secties 5 en 6 waar oorspronkelijk 0.1 % SDS werd gebruikt wordt een 4 molair oplossing genomen. De vereiste hoeveelheid voor de laatste secties is enigzins twijfelachtig. In de literatuur wordt ook de waarde van 6 molair genoemd. Daarom wordt met behulp van het spreadsheetprogramma berekend wat de invloed van de grootte van deze concentratie op het totale ureum-gebruik is. Het resultaat van deze analyse staat in tabel 8.1 weergegeven. Tabel 8.1 Gevoeligheid van ureumgebruik op ureumconcentratie

Ureumconcentratie (M) in secties 5 en 6

Totale Ureumgebruik

Procentuele afwijking (%)

4

397

0

5

406

2.3

6

427

7.6

Hieruit volgt dat de hoeveelheid extra toe te voegen ureum beperkt is . Dit is te verwachten in verband met de grote hoeveelheid, die hergebruikt wordt. De refolding vindt fed-batch plaats. De kinetiek-constanten zijn hierbij berekend op basis van geschatte yields voor interferon. In figuur 8.1 staat hoe de yield van aktief interferon verandert als de kinetiek-constante K2 ' voor de aggregaatvorming verandert. K2 ' is de basiswaarde. Het blijkt dat indien K2 ' een faktor 10 groter wordt de yield voor de refolding nog hoger is dan 96 %. Door de fed-batch tijd te verhogen kan het verlies weer gecompenseerd worden. Bij de recycle uit de extractie (hoofdstuk 2, optie 3) is als criterium voor de mate van recycle de hoeveelheid gebruikt DTT per hoeveelheid geproduceerd p-IFN genomen. De gevoeligheid van de gebruikte hoeveelheid DTT als funktie van het recyclepercentage is al bepaald in hoofdstuk 2 en uitgezet in tabel 2.2. Verder valt op te merken dat extra recycle (meer dan de nu gebruikte 50%) extra yield voor p-IFN op zal leveren. Het berekenen van de echte yield is echter complex, omdat de mate van recycle invloed heeft op de zuiverheid van de processtroom, zodat de opbrengst van de tweede SEC (K601) verder omlaag gaat.

0.9

1000

---

OTTin

-+-

900

0.8

,........, 0)

.::s:. '--'

800

,........,

0.7

C

E

700

::J ::J

c

a> a>

0

>. 0 a> I....

E

0.6

600 500

0.5

a>

::J

Ureum recycle

..... ..... 0 c

a> a>

0

>. a> 100

400 004

::J

10-

-B--

c

a>

10-

0)

.::s:.

OTT recycle -7!EUreum in

300

0

0.3

200 100

..... .....

0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 rel. conc. Dn in #426 [-]

1

0.2

Figuur 8.2: ureum en DTT massastromen als funktie van relatieve DTT-concentratie in stroom 426

•


pagina 8.2

De tweede recycle (optie 5, hoofdstuk 2) is te verdelen in A: een eerste recycle (#406 en #422) die komt uit de afvalstroom uit K401 (#420) B: en een tweede recycle (#510) die komt uit de afvalstroom uit F501 (#509)

Figuur 8.2. In deze figuur zijn de ingaande- en recycle- stromen gegeven van DTT en ureum als funktie van de relatieve DTT-concentratie in stroom #426=#501 (uitgaande produkt stroom uit de size exclusion unit K40 1). Voor de relatieve DTT-concentratie geldt: [D TTt e1

=

[DTT] bi; gedeelte/iike recycle -=-------=---=:J:........::. _ _-=:J_ _-'--_ [DTT] bij maximale recycle

met [DTT]

bij maximale recycle

= 2.721 mmol/l

De recycle A is als volgt opgebouwd: De afvalstroom (#420) uit de size exclusion (K401) wordt in de ultrafiltratie-unit F402 geconcentreerd tot 0.75 gram eiwit/I. De retentaat stroom (#411) wordt gespuid en de permeaat stroom (#419) wordt gerecycled. De split tussen stromen #416 en #422 bepaalt de concentratie DTT in stroom #426=#501. Stroom #419 wordt gesplitst in #416 en #422. Stroom #422 wordt teruggevoerd naar het voorraadvat V405, waarin de elutievloeistof zit voor SEC K401. Stroom #416 wordt gedeeltelijk gespuid (#415) en de rest wordt teruggevoerd naar V401 (voorraadvat voor oplossen precipitaat). Uit de figuur blijkt dat bij toenemende concentratie DTT de recycle stromen toenemen en de ingaande stromen dus afnemen. Voor de DTT-concentratie in stroom #501 wordt een maximum gesteld van 2 mMo Hierbij wordt uitgegaan dat een dergelijke concentratie geen invloed heeft op de refolding. Er geldt dan: DTT,in Ureum, in Totaal, in

-

0.750 622 2067

[kg] [kg] [kg]

DTT, recycle Ureum, recycle Totaal, recycle

-

-

0.346 483 1125

[kg] [kg] [kg]

[DTT] ,#426;#501

-

1.997

[mmol/l]

1.2

1000

---

DTTin

1.1

-;-

900

DTT recycle

"""*-

1

~

0) ~

'--'

,........,

800

0.9

c

0) ~

'--'

E :::J

:::J C

C

0.8 I-

700

I-

0.7 0c

600

0
500

0.5

400

0.4 I0

>.

(J)

0.6

(J)

0

>.

0

(J) '-

I-

E :::J

Ureum in -BUreum recycle

.-

:::J

0.3 300

0.2 ~--+ 0.1

200+---~--~-~--~--~--~--

2

2.5

5.5 5 4.5 4 3.5 3 eiwit eone. in oplossen pree. [g/I]

6

ntratie tijdens Figuu r 8.3: ureum en DTT massastromen als funktie van de eiwit conce oplossen van precipitaat

---

750

Ureum in

-+Ureum recycle

700 ,........, 0) ~

650

c

E :::J

600

L..

:::J

c

550

0
500

>. L..

E

":::J

450

'-

:::J

400 350 o

0.1

8 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 O. rel. conc . on-o x in #504 [-]

09 .

1

ntratie stroom Figuu r 8.4: ureum massastroom als funktie van relatieve DTT-ox conce 504


pagina 8.3

Figuur 8.3.

In deze figuur zijn de ingaande- en recycle- stromen gegeven van DTT en ureum als funktie van de eiwit concentratie bij het oplossen "van het precipitaat (R401). Dezelfde recycle wordt toegepast zoals bij de tekst voor figuur 8.2 is uitgelegd. Uit de figuur plijkt dat bij toenemende toegestane eiwit concentratie zowel de ingaande als de recycle stromen van ureum en DIT afnemen. Gekozen wordt om de concentratie eiwitten op 3 gIl te brengen (base-case). Figuur 8.4. Er is nog een mogelijkheid het gebruik van hulpstoffen (in dit geval ureum) terug te brengen, indien een gedeelte van de afvalstroom uit SEC K601 wordt gerecycled (recycle B). Deze stroom bevat veel geoxideerd DTT. In de figuur staat uitgezet hoe de hoeveelheid ureum in en gerecycled verandert als funktie van de relatieve DIT-ox concentratie in stroom #504. Hierbij geldt voor de relatieve DTT-ox concentratie: [DTl']'"'. ""

[DTTJ. gedeeltelijk recycle - [DTl']. uit 1- recycle [DTTJ. bij maximale recycle - [DTTJ. uit 1- recycle

[DTT]-ox 1-ste recycle [DTT]-ox maximale recycle

1.061 1.666

[mmol/l] [mmol/l]

Het blijkt dat de concentratie DTT-ox niet sterk toeneemt. De recycle wordt op 100% gesteld. Uiteindelijk wordt berekend, zie tabel 8.2, waarbij geldt: conc. eiwit oplossen precipitaat (R401) M(ureum) reduktie (R402) [DTT] in stroom naar refolden: #501 M(ureum) refolding (R501) [DTT]-ox uit refolden: #504

= =

<

> <

3 8 2 4 2

[gIl]

[mol/l] [mmol/l] [mol/I] [mmol/l]

Tabel 8.2:

'.

component [kg]

zonder recycle

alleen recycle A

recycle A en B

DIT, in

1.097

0.750

0.750

ureum, in

1106

622

398

DTT ,recycle

0

0.347

0.347

ureum, recycle

0

484

708

~


pagina 8.4

Indien een gevoeligheid van 10% wordt genomen voor de concentratie eiwit in stroom #404 en de DTT-concentratie in stroom #426 geldt: concentratie eiwit #404 [DTT] #426 ureum,in ureum, recycle DTT,in DTT, recycle

= = = =

3.3 2.206 372 633 0.672 0.324

[gIl] [mmol/l] [kg] [kg] [kg] [kg]

Een 10% gevoeligheid heeft dus weinig invloed op de uiteindelijk te gebruiken hoeveelheden ureum en DTT.

Hoofdstuk 9: Procesbeheersing

pagina 9.1

9. Procesbeheersing Omdat hier sprake is van een groot aantal batchprocessen in serie in plaats van een aaneengesloten continu-proces vereist de procesbeheersing een heel andere aanpak. Voor het op tijd aan- en uitschakelen en sluiten en openen van kleppen zal in een zo ingewikkeld proces een centrale regeleenheid nodig zijn. Met deze regeleenheid kunnen acties ten behoeve van het proces automatisch, danwel interactief uitgevoerd worden. Naast deze tijdregeling zullen echter ook een aantal regelingen nodig zijn voor het regelen of in de hand houden van procesparameters. De belangrijkste hiervan zullen hier besproken worden. Op alle voorraadvaten en reaktievaten is een afgasleiding en een stikstoftoevoerleiding aangebracht. Met behulp van de stikstoftoevoer wordt op alle vaten een kleine overdruk gehouden zodat er geen verontreinigde lucht kan binnendringen. Bij een te hoge druk moet het bovenstaande gas via de afgasleiding verdwijnen naar het centrale afgassysteem, waar het gas gefilterd wordt. Deze twee acties worden geregeld via een drukregelaar die de beide regelkleppen aanstuurt op de stikstof en afgasleiding. Op deze manier kunnen ook leeglopende vaten en vaten die gevuld worden op de juiste druk gehouden worden. Bij de crossflow filtratie-eenheden (F 103 / F 402 / F 501 / F 601) mag de volumestroom niet boven een bepaalde waarde komen. Om dit te bewerkstelligen wordt de toevoerstroom van de filtratie-eenheid kortgesloten met de afvoerstroom. De grootte van deze kortsluitstroom wordt geregeld met een flowcontroller, die de volumestroom in de t<:>evoerleiding meet en een regelklep in de kortsluitstroom aanstuurt. Tijdens de diafiltratie (F 103) zijn er twee belangrijke vereisten, namelijk ten eerste moet het filter regelmatig teruggespoeld worden (backflushing). Dit gebeurt met behulp van stikstofdruk via vat V 105. Om dit te kunnen uit voeren is een bepaald niveau in het vat vereist. Dit wordt geregeld met behulp van een niveauregelaar die een klep op de afvoer van het vat aanstuurt. Ten tweede moet tijdens de diafiltratie een fosfaatoplossing toegevoerd worden. De volumestroom hiervan moet gelijk zijn aan de afvalstroom (filtraat) van de diafiltratie. Dit wordt geregeld met een flowcontroller die op z'n beurt aangestuurd wordt door een nieveauregelaar, omdat de klep moeilijk rechtstreeks is aan te sturen met de ni veauregelaar. Om in de chromatografiekolommen (K 401 / K 601 / K 602) een gelijkmatig concentratieprofiel en dus een goede produktkwaliteit en opbrengst te verkrijgen mogen er geen sterke schommelingen op de ingaande volumestroom plaatsvinden, met andere woorden: Hoe stabieler de toevoerstroom, hoe beter de concentratieprofielen. Daarom moet de toevoerstroom worden geregeld met een flowcontroller . Op een aantal plaatsen in het proces moet het proces (R301lR302/R402/R501) op een bepaalde pH worden gebracht met behulp van zuur of loog. Hiervoor is een pH regelaar nodig, die de pH in de oplossing meet en aan de hand daarvan de ZUUf- of de loogpomp aanstuurt.

Kostensoort g:,ondstoffen hulpstoffen stoo:n, \.later energie, koeling bijprodukt,

"produktie { volume zfh." of Kp

~mi-v.riab"~

direkte produktiekosten

~

k.:talys. royalty enderhoud Liboratoriurn loon

{

fabrikage kosten

êfschrijving verzekering

".lnvesterlngs. afh.". of Kr

KF

À

licentie terrein, erfpacht toezicht kêntine b rand\.leer, veiligheid l êbo ratorium opslag, verlading personeelsdienst chem. techno dienst

indirekte produktiekosten of plant overhead

Ka totale kosten van een produkt/ kostenplaats

0

marketing

~

-

[

~arktresearch

techno service verkoop, vervoer kantoorkosten êcmlnlstratie, boekhouding juridische zaken directie

algemene kosten

KA

,

i research en ontwikkeling

Figuur 10.1: specificatie van totale kosten

"I

Hoofdstuk 10: Economie.

pagina 10.1

10. Economie. 10.1. Algemeen. In dit hoofdstuk wordt aan de hand van een ruw model nagegaan of de ontworpen fabriek rendabel zou kunnen draaien. Dit gebeurt aan de hand van Montfoort (1991). Hiervoor worden een aantal economische criteria beschouwd. Alvorens deze criteria te kunnen berekenen zullen de totale kosten geschat moeten worden. Dit kan op de volgende manier: K

met

T

• K +K +K +K +K

AOPLI

(10.1 )

KT = totale kosten, KA = algemene kosten,

Ka = indirecte fabricage kosten oftewel "plant overhead", Kp = produktie-volume afhankelijke kosten, KL = semi-variabele kosten, KI = investeringsafhankelijke kosten.

In figuur 10.1 zijn de verschillende kosten wat uitgebreider gespecificeerd. Niet alle kosten zijn voor dit ontwerp even gemakkelijk te bepalen. Daarom kan het bovenstaande model vereenvoudigd worden tot: (10.2)

=a.Kp , f.I, =d·L,

=

a = 1.13 f = 0.13

d=2.6

De waarden voor a, f, en d zijn een soort van "mats" factoren, die uit de praktijk zijn geschat en gebaseerd zijn op het zogenaamde "best model", zoals beschreven in Montfoort (1991). De waarden zijn exclusief rente en afschrijving. Deze zullen daarom apart worden berekend. De verschillende bijdragen aan de totale kosten zullen nu één voor één besproken worden.

10.2. Produktievolume atbankelijke kosten, Kp. Deze kosten bestaan uit de grond- en hulpstoffen, utilities en de verwerking van de afvalstoffen, die nodig zijn om de jaarproduktie te verwezenlijken. De utilities zijn energie, stoom, koeling en water, waarvan aangenomen wordt dat ze op de plant standaard aanwezig zijn. In bijlage 10.1 staan de kosten voor de grondstoffen en de verwerkingskosten hiervan gegeven. Een maat voor deze verwerkingskosten wordt weergegeven in de Chemical Oxygen Demand (COD) een maat voor de hoeveelheid zuurstof die nodig is om 1 gram component te oxideren. De prijs die voor de afvalstoffen betaald moet worden is gebasserd op inwoner equivalenten (i.e.). Een i.e. is 136 g zuurstof/dag. Er wordt door het zuiveringsschap


pagina 10.2

Amstelland voor de zuivering van 1 i.e. per jaar fl 98.10 gerekend De totale productievolwne afhankelijke kosten (inclusief verwerking) en utilities worden geschat op (zie tabel 10.1): 5.658 Mfl per jaar.

10.3. Semi-variabele kosten, L. In deze kategorie vallen de loon- en onderhoudskosten en royalties. Deze laatste zullen buiten beschouwing gelaten worden. Ook de kosten voor de kolom-vulling van de size exclusion chromatografie units, en de membranen van de ultrafiltratie unit en de microfiltratie kunnen onder de semi-variabele kosten vallen, omdat ze min of meer produktievolwne gevoelig zijn. Voor deze vervangingskosten wordt de eerder genoemde factor dingevoerd. De bepaling van de loonkosten werkt op basis van de Wessel relatie (Montfoort (1991)): manuren ton produkt

met

k aantal stappen

=

k. aantal stappen (capaciteit/dag)076

=

=

(10.3)

voor een discontinu proces = 23, aantal secties = 6.

Aan de dimensies in deze vergelijking is direct te zien dat de relatie is afgeleid voor grote bulkprocessen. Helaas is er niet direct een relatie beschikbaar voor het in dit FVO beschreven proces. Daarom zal een hele ruwe afschatting van het aantal functieplaatsen gemaakt worden. De productie-unit bestaat uit 6 secties, die na elkaar bedreven worden. Daarom wordt er verondersteld, dat één persoon twee secties kan bedienen. Het aantal functieplaatsen is dan gelijk aan drie. Elke functieplaats wordt gelijkgesteld aan 3 arbeidsplaatsen, uitgaande van een vijfdaagse werkweek met 104 uur. Voor de arbeidskosten wordt fl. 400000,= per jaar per arbeidsplaats genomen op basis van vo1continu bedrijf. De totale semi-variabele kosten komen dan op L

=

8

Mfl. per jaar, waarvan voor loonkosten 7.2 Mfl.

10.4. De investeringen. De bepaling van de investeringen is een belangrijk facet van de economische analyse. Hiermee kunnen een aantal economische criteria berekend worden op basis waarvan een beslissing genomen kan worden over de bouw van een fabriek of deel van een fabriek. Bovendien zijn de investeringen een belangrijke component van de totale kosten~. De totale investeringen bestaan uit:

(10.4)

,-+

I

5:>::: r.:ateriële c-

6~~Hr c~ 16J

I L ! 1l;7.

~~ken

ZOGls

~pparatuurt

1

.oon

I

----'r

i;;c i rec t _ _ _--r_ _ _ _ _ _ ~ 197. engineeri n G. toezicht

leidingen

2i:::

----L-sz

start-up/;>re-oper. 67. licenties

Figuur 10.2: investeringsopbouw van een Nederlandse chemische fabriek


pagina 10.3

= investeringen in de proceseenheden inclusief de indirecte bouwkosten, = investeringen in de hulpapparatuur, de off site investeringen en de indirecte kosten daarvan, = investeringen in niet tastbare zaken zoals licenties, pre-operationele kosten, start-up kosten, = werkkapitaal, voorraden, cash, terreinen, etc. Het "fixed capital", Ir, bestaat uit: IJ

=

IB

+

IH

(10.5)

Voor de berekening van de totale investeringen zal uitgegaan worden van de investeringsopbouw van "een Nederlandse chemische fabriek" , zoals is weergegeven in figuur 10.2. Hieruit blijkt dat het "fixed capitai" 80% van de totale investeringen zal zijn. In de volgende paragraaf worden de investeringen bepaald met behulp van de methode van Lang. Deze methode is gebruikt omdat andere methoden (Montfoort (1991)) praktisch allemaal gebaseerd zijn op grootschalige chemische bulkprocessen. In de literatuur die dieper ingaat op de economie van kleinschalige biotechnologische processen (Asenjo (1992) en Datar (1993)) wordt de methode van Lang gebruikt.

10.4.1. De investeringen volgens Lang. Deze methode stelt dat de belangrijkste investeringen worden gevormd door de apparatuur. Het is een zogenaamde factor methode, en wordt vaak gebruikt om de orde van grootte van de investeringen te schatten. De investeringskosten van een plant worden bepaald door de investeringskosten van de te gebuiken apparatuur te vermenigvuldigen met een factor. Deze factor is afhankelijk van het soort proces, en corrigeert de kale apparatuurkosten voor een hele rij bijkomende investeringskosten, waaronder kosten van fundamenten, ondersteuning en montage, leiding stelsel, off sites, constructie, overhead, etc. De vaste investeringskosten van een plant kunnen nu als functie van de apparaatkosten worden beschreven:

(10.6) Waarin Ia de totale apparaatkosten zijn en t; de 'Lang-factor' is. Datar (1993) geeft een waarde van 4.7 voor deze factor in het geval van biotechnologische processen. Om een reële schatting te kunnen maken van de apparaatkosten, is gebruik gemaakt van het WEBeI boekje (1991), Asenjo (1990) en Atkinson (1990). Gezien het feit dat de apparaatkosten afhankelijk zijn van de volumina en de prijs hiervan niet direkt voor handen is, wordt de volgende formule gebruikt:

rest

mem bran en/fi Iters

centrifuges

kolommen

vaten/reaktoren

fermentor

o

2000

4000

6000

investeringskosten apparatuur [kt!.] Figuur 10.3: investeringskosten apparaten

8000


pagina 10.4

De waarde voor n varieert per apparaat en is: 0.56 0.53 1 0.53

Fermentor Geroerd vat Centrifuge Homogenizer

(Atkinson, 1991) (Asenjo, 1990) (Coulson et.al., 1985) (Atkinson, 1991)

Verder kan rekening gehouden worden met inflatie en valuta veranderingen met behulp van de volgende vergelijking: v hosten

v Jaar A = aosten

..

In

Jaar B ( Prijs index jaar A )" Prijs index jaar B

..

In

(10.8)

De prijs index in kwestie, de zogenaamde M&S installed equipment index, wordt jaarlijks gepubliceerd in Chem. Eng. VOL 101 (1994 NOV 174). De volgende waarden zijn voor de diverse jaartallen gegeven, samen met de koopkrachtkoers van de dollar: M&S M&S M&S M&S M&S

(1985) (1987) (1991) (1993) (1994)

= = = = =

$1=fl.99 $1=f2.03

790 814 930.6 964.2 998.1

$1=fl.80

De investeringskosten voor de apparatuur zijn weergegeven in tabel 10.2. Opvallend is de relatief hoge prijs voor de ferrnentor (1.56 Mil). In figuur 10.3 zijn de investeringskosten uitgespecificeerd over de verschillende apparaten. Het blijkt dat de investeringen in de apparatuur, IA = 3.896 Mil bedragen. De Lang-faktor voor een biotechnologisch proces is 4.7. Hieruit volgt: I f = 18.309 Mfl. De totale investeringen loot, volgens Montfort (1991) worden dan, 1.25*If = 22.886 Mil. 10.5. De totale kosten, KT" De totale kosten kunnen nu berekend worden uit: KT

~

a . KP

+

d·L

+

J'I/Qt

(10.9)

Voor de faktoren a, den f geeft Montfoort respectievelijk 1.13, 2.6 en 0.13. Deze laatste faktor, f= "capital charge", bevat alleen verzekeringen en licenties, maar nog niet de rente en de afschrijvingen. Deze zullen als aparte factoren ingevoerd worden. De totale kosten worden nu: = 29.574 Mil.

10.6 Afschrijving en rente. Er wordt een lineair model gebruikt voor het berekenen van de afschrijving. Dit betekent dat


pagina 10.5

de afschrijving van de plant rechtlijnig in 10 jaar tijd plaatsvindt. De afschrijving per jaar Rr kan berekent worden met de volgende formule: Rr

Waarin

= =

•

1t« - I ... n

(10.10)

het werkkapitaal: 6% van Itot, de afschrijfperiode in jaren, hier 10.

De afschrijving wordt dan jaarlijks 2.06 Mfl. In het lineaire afschrijfmodel wordt geen rekening gehouden met de (veranderende !) rentelasten over de periode van afschrijving. Hiervoor worden de zogenaamde rentekosten ingevoerd. Uitgaande van een rentevoet van 8% over een afschrijving van 10 jaar en gebaseerd op 60% van de totale investeringskosten, wordt deze als volgt berekend: Rente kosten = 0.6 . rentevoet· 1t«

(10.11)

De rentekosten worden nu 1.099 Mfl

10.7. Inkomsten en cash flow. De inkomsten uit de bedrijfsvoering bestaan uit de verkoop van p-IFN. De verkoopprijs op dit moment is fl 100,- per mg en dus 100 Mfl per kg. Een jaarproduktie van 40 kg resulteert nu in een inkomstenbron van 4000 Mfl. De verwachting is dat de prijs van p-IFN aanzienlijk zal dalen als de patenten afgelopen zijn. Verderop zal er gekeken worden naar de minimale prijs waarvoor p-IFN nog geproduceerd kan worden. De bruto winst, de netto winst de belastingen en de "cash flow" zijn berekend voor de periode van 2 tot 10 jaar (er is aangenomen dat de bouw 1 jaar duurt):

Inkomsten - total kosten - afschrijving - rente kosten

Bruto winst

4000 29.574 2.06 1.099

- belasting (50%)

3967.27 1983.63

Netto winst + afschrijving

1983.63 2.06

Cash flow

1985.69

Mfl.

Injaar 1 wordt de cash flow -19.68 Mfl (lf+ Iw) en in jaar 11 1987.06 Mfl (= Cash flow jaar 10 + Iw).


pagina 10.6

10.7. De economische criteria. 10.7.1. Return on investment. Dit economisch criterium is geschikt voor het vergelijken van procestechnologische alternatieven met gelijke levensduur en produktiepatroon en wordt veel gebruikt in de ontwerpfase. De formule luidt: ROl

=

~'lOO%

(10.12)

I," Iw

De winst wordt berekend door de opbrengst van de produktverkoop te verminderen met de totale kosten. De netto-winst volgt uit het aftrekken van 50% belastingen. Voor dit FVO betekent dat de ROl = 8177% is.

10.7.2 Internal rate of return. Bij deze methode worden de "cash flows", waaronder de investeringen, over de looptijd van het projekt omgerekend naar de huidige waarde met een zodanig return percentage r, dat de som van deze verdisconteerde "cash flows" over de looptijd gelijk is aan nul. De levensduur is 10 jaar en de restwaarde van de plant, s, wordt gesteld op 10% van 1101 , Er wordt voor rechtlijnige afschrijving gekozen. Voor de bouwtijd is één jaar géÏlomen. Voor het verkrijgen van de IRR moet de volgende vergelijking opgelost worden: met

met

r

IRR

=

D : -1I (Iq)"

(10.13)

100.8%.

10.7.3. Pay out time. De pay out time is het minimale aantal jaar dat nodig is om het initieel geinvesteerde kapitaal min het werk kapitaal terug te verdienen. De berekeningen zijn gebaseerd op de "exploration carry over", Eo, die op de volgende manier berekend kan worden: POT

It« - Iw = ---

Eo

met Eo

=

Inkomsten -

Ca Kp .. d L)

In dit proces is de pay out time 0.005415 jaar, ofwel 2 dagen.

(10.14)

3~-------------------------------------------.120

2.5

- ---\-- - --

- - - - - - - -- - - - - r ' - - - --

-+ 100

----

2 -

~ ~

80

......, ~ :'--. CS --'

.--.

(f2.

60

1.5

'--'

0

a:

) L

1

40

0.5~---~~-----------~~~~-+20

0+-------.------.------.-------.------.-------+0 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 kostprijs interferon [fl/mg] Figuur lQ.4: ROl en POT als funktie van de kostprijs p-interferon


pagina 10.7

10.8 Berekening kostprijs p-interferon. Op basis van een meer realistische waarde voor de ROl en POT kan een kostprijs voor pinterferon worden afgeschat. Voor de ROl wordt 35% genomen. De kostprijs bij een omzet van 46.32 Mfl. wordt dan: kostprijs p-interferon

=

1.158 flImg

en de POT = 1.125 jaar en IRR = 43.93%. In figuur 10.Lf is de ROl en de POT uitgezet tegen de kostprijs.

10.9 Gevoeligheidsanalyse kosten hulpstoffen De kostprijs van p-interferon bij gelijkblijvende ROl verandert als volgt indien recycle #406, #422 en #510 niet wordt toegepast (zie ook tabel 10.3): kostprijs p-interferon

=

1.17 1.22

flImg : indien verwerkingskosten 2 keer zo hoog worden.

De kostprijs blijkt dus niet al te gevoelig te zijn indien geen recycle wordt toegepast en de verwerkingskosten duurder worden. In de base case (FVO 3120A) wordt voor de kostprijs berekend: kostprijs p-interferon (base-case)

=

1.46

flImg

In tabel 10.4 staat een overzicht van de kosten voor de hulpstoffen in de base-case en dit proces.

Tabel 10.1 KOSTEN VAN GEBRUIK EN VERWERKING VAN HULPSTOFFEN PER JAAR IN GULDENS. INDIEN RECYCLE WORDT TOEGEPAST component

COD [g 02/g]

prijs [fl/kg]

massa In [kg/batch]

grondstofkosten [fl/batch]

[fl/Jaar]

verwerkingskosten [fl/Jaar]

0

0.00

9221.8

23.0545

2305.45

0.00

ureum DTT EDTA glucose

2.13 1.76 0.88 1.07

0.42 3130.00 1.70 2.05

397.695 7.251 1.751 132.578

biomassa kal iumfosfaat IBA

1.37 3.048 0.285

ammonium sucrose 1-octanol

0.97 1.12 2.95 3.1 2.16

5.00 700.00 0.08 1.15 3.67 342.00 2.68

8.093 361.471 30.7 42.135 2125.724

167.0319 22695.63 2.9767 271 .7849 0 15.24 199.5 0.64744 415.69165 112.669 14410.17 5696.94032

16703.19 2269563.00 297.67 27178.49 0.00 1524.00 19950.00 64.74 41569.17 11266.90

167404.44 2522.02 304.51 28034.48 0.00 0.00 110.96 1551.38

12332.531

44011.34

------

=======

4401133.64

1231043.93

water

0 1.97

SDS 2-butanol

utilities (stoom, elektriciteit, koelwater)

260.60

1441017.00 569694.03

80007.13 17897.72 25813.20 907398.09

26060.00

-----4427193.64 125.40 kosten stoom: 12.5 m3/batch = fl./batch low density steam * 3 bar; 190 oC; Tcond=134 oC; 2000 kJ/kg ; fl.30/ton

* 20 naar 100 oC; eff.=0.5

= fl./batch kosten elektriciteit: pompen: 20 a 1 kW met t=2 uur roerders: 10 a 1 kW met t= 100 uur 1 kWh = fl. 0.13 [DACE prijzenboekje, mei 1991] kosten koelwater verwaarloosbaar

135.20

============================= TOTAAL kfl.

5658.24

Tabel 10.2 Inveeterlngskosten apparatuur volgens Lang

reaktor/VaVapparaat

R101 V101 V102 V103 V104 F103 V105 V202 V201 M201 Cf201 V203 R301 üacket) V301 V302 Cf301 R302 V303 Cf302 = Cf201 R401 V401 F401 R402 üacket) V402 V403 K401 (2 kolommen) V404 F402 V501 V504 V405 R501 üacket) V502 F501 K601 V503 V601 V602 F601 K602 V603 [pompen kill tank verdeelplaten SEC

eenheid

5.1 3 0.82 0.03 1.49 4.2 0.1 0.55 0.55 600 4 1.3 5.5 3 1.5

prijs Ifkfll m3 m3 m3 m3 m3 m2 m3 m3 m3 I/h stuks m3 m3 m3 m3

3 m3 0.74 m3 0.4 0.4 1.26 0.4 0.01 0.01 0.393 0.393 1.8 1.26 0.6 0.5 2 1 0.01 1.26 0.393 0.393 0.01 0.35 0.1 0.267 0.092 0.22 20 15 20

m3 m3 m2 m3 m3 m3 m3 m3 m3 m2 m3 m3 m3 m3 m3 m2 m3 m3 m3 m3 m3 m2 m3 m3 stuks m3 stuks

1296.43 109.153 66.6773 2.11055 83.6642 27.3 3.33496 57.2884 57.2884 59 80 79.4378 164.91 109.153 83.8771 98 109.153 64 .1264

jacketed

= 1.2*unjacketed

geroerd geroerd geroerd ongeroerd geroerd 6.5 kfl/m2 ongeroerd geroerd geroerd 20 kfl/stuk geroerd geroerd :geroerd geroerd

geroerd geroerd zie Cf201 50.7588 geroerd 50.7588 geroerd 12 60.9106 geroerd 12.4948 geroerd 1.39024 ongeroerd 5.60995 5.60995 89.8944 geroerd 13.23 10.5 kfl/m2 59.2143 geroerd 55 .2507 geroerd 93 .5665 geroerd 86.28 geroerd 1.39024 ongeroerd 13.23 10.5/m2 5.60995 5.60995 1.39024 ongeroerd 48.2475 geroerd 29.9729 Igeroerd 2.8035 10.5 kfl/m2 3.23094 4.49998 ongeroerd 150 7.5 kfl/stuk 22.3875 ongeroerd 200 10 kfl/stuk

===== 1.2* 1*

fermentor 1555.72 [kfl] rest 2339.82 [kfl]

===== 4 .7* fixed capital costs

3895 .54 [kfl] LANG faktor 18309 [kfl]

Tabel 10.3 KOSTEN VAN GEBRUIK EN VERWERKING VAN HULPSTOFFEN PER JAAR IN GULDENS. INDIEN RECYCLE #406, #422 en #510 NIET WORDT TOEGEPAST component

COD [g 02/g]

water

prijs [fl/kg] 0 2.13

ureum DTT

1.76 0.88

EDTA glucose

1.07 1.37 0 1.97 0.97 1.12 2.95 3.1 2.16

biomassa kal iumtostaat IBA ammonium sucrose 1-octanol SDS 2-butanol

massa In [kg/batch]

grondstofkosten [fl/batch]

0.00

9221.8

23.0545

0.42 3130.00

1106 7.598

1.70 2.05

132.578

5.00 700.00 0.08 1.15 3.67 342.00 2.68

3.048 0.285 8.093 361.471 30.7 42.135 2125.724

464.52 23781 .74 2.9767 271.7849 0 15.24 199.5 0.64744 415.69165 112.669 14410.17 5696.94032

13041 .183

45394.93

1.751

utilities (stoom, elektriciteit, koelwater)

260.60

[fl/Jaar] 2305.45 46452.00 2378174.00

verwerkingskosten [fl/Jaar]

297.67 27178.49 0.00 1524.00 19950.00 64.74 41569.17 11266.90 1441017.00 569694.03

0.00 465556.04 2642.71 304.51 28034.48 0.00 0.00 110.96 1551 .38 80007.13 17897.72 25813.20 907398.09

======

=======

4539493.45

1529316.22

26060.00

====== 4565553.45 kosten stoom: 12.5 m3/batch

= tl./batch

125.40

low density steam * 3 bar; 190 oC; Tcond= 134 oC; 2000 kJ/kg; tl.30/ton

* 20 naar 100 oC; eft. =0.5

=

kosten elektriciteit: tl./batch pompen: 20 a 1 kW met t=2 uur roerders: 10 a 1 kW met t= 100 uur 1 kWh = tI. 0.13 [DACE prijzenboekje, mei 1991] kosten koelwater verwaarloosbaar

135.20

============================= TOTAAL kfl.

6094.87

Tabel 10.4 KOSTEN VAN GEBRUIK EN VERWERKING VAN BELANGRIJKSTE HULPSTOFFEN PER JAAR IN GULDENS vergelijking tussen base-case (FVO 3120A) en dit proces component

ureum OTT EOTA IBA sucrose 1-octanol SOS 2-butanol

Totaal fl./jaar dit proces base-case verschil

grondstofkosten [ft/jaar] base-case di~proces

verwerkingskosten [ft/jaar] dit proces base-case

16703 2269563 298 19950 41569 11267 1441017 569694

0 2750925 410 529 56461 15178 2005823 551322

167404 2522 305 111 80007 17898 25813 907398

0 3047 421 0 108249 24031 35734 882356

4370061

5380648

1201458

1053838

5571519 6434486 862967 in het voordeel van dit proces

Hoofdstuk 11: Conclusies en aanbevelingen

pagina 11.1

11. Conclusies en aanbevelingen In het produktie proces voor Ihinterferon zoals het nu plaatsvindt, worden SDS en DTT als twee belangrijke hulpstoffen gebruikt voor de extraktie en het foldenlunfolden. Vanwege de hoge kosten per kg van deze stoffen is gekeken naar alternatieven voor de procesvoering. Op grond van de uiteenzettingen in dit verslag kunnen met betrekking tot het reduceren van het gebruik van hulpstoffen enkele conclusies getrokken worden. Een eerste mogelijkheid voor beperking is het vervangen van SDS door ureum in de opwerkinsstappen na de extraktie. In het proces zoals in dit verslag beschreven levert dit een besparing van ft. 81600, = per jaar. Het gebruik van hulpstoffen wordt verder beperkt doordat de refoldingstap fed-batch wordt uitgevoerd. De yield van deze stap wordt verhoogd van 91 naar 99.5%. In de opwerking zal dus bespaard kunnen worden op de hoeveelheden hulpstoffen. Verder is gekeken naar het hergebruik van de waterfase uit vloeistof-vloeistof extractie, die veel DTT en SDS bevat. Op deze manier wordt een besparing bereikt op het gebruik van DTT en SDS. Tevens wordt de yield van het proces verhoogd, doordat een gedeelte van het interferon wordt teruggevoerd. De besparing aan hulpstoffen is per jaar ft. 670.000, = en de yield van de oplos- en extraktiestap, met inbegrip van de verlaagde yield van een van de latere chromatografie-stappen wordt verhoogd van 46.4 naar 61. 3 %. Een nadeel van deze optie is dat er hergebruik van niet gesteriliseerd materiaal plaatsvindt. Tenslotte worden de grote afvalstromen van de eerste 'size exclusion' chromatografie kolom en van de eerste ultrafiltratieunit als volgt hergebruikt: voor het oplossen van het precipitaat en als eluent voor de genoemde chromatografie. De laatste mogelijkheid wordt beperkt door een maximaal toegestane DTT concentratie in de produktstroom naar de refolding. Op deze manier wordt ft. 328.000, = per jaar bespaard. Over het totale proces bekeken levert de alternatieve procesvoering een besparing van hulpstoffen en een verbetering van de opbrengst op. Het gebruik van hulpstoffen daalt met ft. 850.000,= per jaar ten opzichte van de 'base case'. De totale kosten van hulpstoffen per kg geproduceerd p-interferon dalen van ft. 161000,= in de base case naar ft. 139.000,= in dit proces. De totale opbrengst van het opwerkingsproces stijgt van 20.1 % naar 27.4 % van de in de fermentatie geproduceerde hoeveelheid. Deze twee effecten samen resulteren in een kostprijsverlaging van ft. 1,46/mg in de base case naar ft. 1,16/mg in dit proces. Hierbij wordt uitgegaan van een ROl van 35%. De huidige verkoopprijs is ft. 100, =/mg. Om tot een beter inzicht te komen in hoeverre stromen gerecycled kunnen worden, dient verder onderzoek gedaan te worden naar de invloed van ophopingen van bepaalde stoffen op de werking van bepaalde processtappen, zoals de invloed van zout en 2-butanol op het oplossen van inc1usion bodies en de invloed van DTT op refolding. Een andere optie zou zijn om DTT in de hergebruikte stroom vooraf te oxideren.

LITERATUUR Albertsson, P.A., Johansson, G., Tjemeld, F., Aqueous Two-Phase Seperations, Editor: Asenjo, J.A., Seperation Processes in Biotechnology, Marcel Dekker Inc., New York, pp 287-327 (1990). Atkinson, B., Marvituna, F., Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, second edition, Stockton Press, New York, pp. 949-955, 986 (1991). Bioseparations (Bioscheidingen), BODL Advanced course (1994) Clark, W .M., Thennodynamics of Protein Partitioning in Aqueous Two- Phase Systems, Editor: Shuler, M.L., Chemical Engineering Problems in Biotechnology, American Institute of Chemical Engineers, New York (1989). Coulson, J.M., Richardson, J.F., Chemical Engineering Vol 6, fITst edition Pergamon Press, New York (1991) Datar, R, Rosén, e.G., Separation processes in biotechnology, Asenjo, J.A. (ed.), fITst edition, Marcel Dekker Inc., New York, pp 753-793 (1990). Datar, R, Rosén, e.G., Biotechnology, 11, pp 349-356 (1993). Deemter, J.J. van, Zuiderweg, F.J., Klinkenberg, A.van, Chem. Eng. Sci. 5, 271 (1956) Environmental Biotechnology (Milieu Biotechnologie), BODL Advanced course (1994). Flaschel, E., Wandrey, C., Kula, M., Ultraflltration for the Separation of Biocatalysts, Adv. Biochem. Biotech., 26, 73 (1983) Forciniti, D., Hall, e.K., Kula, M.R, Temperature Dependence of the Partition Coefficient of Proteins in Aqueous Two-Phase Systems, Biosep., ~, blz. 115-128 (1991) Ganetsos, G., Barker, P.E., Preparative and productionscale chromatogaphy, Marcel Dekker Inc., New York (1992) Hanish, W., Cell Harvesting, Membranes Separation in Biotechnology (1986) Higgins, J.J., Lewis, D.J., Daly, W.H., Mosquiera, F.G., Dunnill, P., Lilly, M.D., Biotech. Bioeng. 20, 178 (1978) Huddleston, J.G., Lyddiatt, A., Aqueous Two-Phase Systems in Biochemical Recovery, Editor: Weetall, H., Applied Biochemistry and Biotechnology, The Humana Press Inc., blz. 249-279 (1990). Huddleston, J., Veide, A., The molecular Basis ofPartitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Tibtech., 2, blz. 381-388 (1991).

Literatuur Menge, U., Purification of human fibroblast interferon by extraction in aqueous two-phase systems, Journal of applied biochemistry, 5, 75090 (1983) Montfoort, A.G., (1991) De chemische farbiek, deel 2: Cost engineering en Economische aspekten, Faculteit der Scheikundige Technologie en der Materiaalkunde, vakgroep Chemische Procestechnologie, T.U. Delft. Oers, C. van, Solute rejection in multicomponent systems during ultrafiltration, PhD Thesis, TU Eindhoven, 1994 Pandit, A., Rheological properties of Dextran, Polyethylene Glycol, Bovine Serum Albumine and their mixtures, Biotechnology Techniques Vol 3, 2, 125-130 (1989) Perry's Chemical Engineers' Handbook, 50th ed. (1984) Riet, K. van 't, Tramper, J., Basic Bioreactor Design, Marcel Dekker Inc., New York (1991) Sauer, Th., Robinson, C.W., Glick, B.R., Biotech. Bioeng., 33, 1330-1342 (1989) Sheldon, J. M. , The fme structure of ultrafiltration membranes TI. Protein fouled membranes, Journal of Membrane Science, 62, 87-102 (1991) Weast, R.C., Handbook of Chemistry and Physics, 64th edition (1983-1984), editor R.C. Weast, CRC-press Florida Webci en Wubo, 'Prijzenboekje' , 14th edition, Dutch Association of Co st Engineers, Leidsendam (1991)

PATENTEN:

WO 83/03103 WO 89/02750 WO 89/05158 US Patent no. 4,262,090 US Patent no. 4,450,103 US Patent no. 4,894,330

Bijlage 2.1 -

-

_.- -

.

1 Fermentatie 2 'Crossflow' microfiltratie 3 Cel disruptie 4 'Inclusion body recovery' 5+6 Oplossen + Extractie 7 Precipitatie 8 Precipitaat winning 9 Oplossen precipitaat 10 Filtratie 11 Reductie 12 'Size exclusion' chromatografi 13 Oxidatie 14 Ultrafiltratie (concentrering) 15 'Size exclusion' chromatografi 16 Ultrafiltratie (concentrering) 17 Ontzoutings chromatografie

17 Ontzoutings chromatografie 16 Ultrafiltratie (concentrering) 15 'Size exclusion' chromatografie 14 Ultrafiltratie (concentrering) 13 Oxidatie 12 'Size exclusion' chromatografie

...

11 Reductie

E E :l

10 Filtratie

a.

9 Oplossen precipitaat

C

.!!! en

.

-

-

-

..

'Base case' Stap-Yield Totale Yield

Stap

Cl)

-

8 Precipitaat winning 7 Precipitatie

1.000 0.950 0.870 0.900 0.504 0.980 0.900 0.980 0.980 0.950 0.950 0.910 0.940 0.920 0.940 0.950

1.000 0.950 0.827 0.744 0.375 0.367 0.331 0.324 0.318 0.302 0.287 0.261 0.245 0.226 0.212 0.201

-

.

._ ..

FV03120D Stap-Yield Totale Yield 1.000 0.950 0.870 0.900 0.656 0.980 0.900 0.980 0.980 0.950 0.950 0.995 0.940 0.860 0.940 0.970

1.000 0.950 0.827 0.744 0.488 0.478 0.430 0.422 0.413 0.393 0.373 0.371 0.349 0.300 0.282 0.274

-

-

-

-

-

-

5+6 Oplossen + Extractie 4 'Inclusion body recovery' 3 Cel disruptie 2 'Crossflow' microfiltratie 1 Fermentatie

o

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5 Yield

I0

Step Yields

_

Overall Yields

0.6

0.7

0.8

0.9

Bijlage 4.1: processtappen met bijbehorende procestijden schoonmaken koelen

2 5

proces aktie

procestijd per stap

unit cumulatief

uur

0 0.5 29.5 32.5 34.9 39.5 40 44

0.5 29 3 2.4 4.1 0.5 4

vullen met medium uit V1 01 fermentatie inaktivatie met oktanol uit V1 03 concentratie (F103) diafiltratie (F1 03), was vloeistof uit legen naar voorraadvat homogeni schoonmaken

2 V101 2 voorraadvat medium 2 2 2 2

0 0.5 2.5 3 4 9

0.5 2 0.5

legen naar fermentor (R1 01) schoonmaken vullen steriliseren koelen

3 V102 3 voorraadvat glucose 3 3 3 3

0.5 29.5 31.5 32 33 38

29 2 0.5

4 V103 4 voorraadvat oktanol 4

29.5 32.5 33

3 0.5

legen naar fermentor (R1 01) vullen

5 V104 5 voorraadvat wasoplossing 5 5 5

28.9 29 .9 34.9 39 39.5

5 4.1 0.5

schoonmaken koelen legen naar fermentor (R1 01) vullen

R101 fermentor

5

5

fed batch toevoeren naar fermento schoonmaken vullen steriliseren koelen

F103 micro- en ultrafiltratie

32.5 34.9 39 39.5 59.5

2.4 4.1 0.5 20

concentreren, R101 als toevoervat diafiltratie, R101 als toevoervat back flush schoonmaken

7 V105 7 back-flush vat 7 7 7

32.5 39.5 40 42 42.5

7 0.5 2 0.5

back flush naar F1 03 legen naar afvalstroom schoonmaken vullen

8 V202 8 voorraadvat 8 homogenizer

39.5 40 41

0.5

1ste keer vullen vanuit fermentor ( 1-ste pass homogenizer

6 6 6 6 6

8 V202 8 8 8

41 42 43 45

9 V201 9 voorraadvat 9 homogenizer

40 41 42

1ste keer vullen na 1-ste pass hom 2-de pass homogenizer

9

42

vullen met 3-de pass uit homogeni

V201

2

vullen met 2-de pass uit homogeni 3-de pass homogenizer schoonmaken

43 43.5 47.5 49.5

9 9 9 9

40 41 42 43 45

0.5 4 2

toevoegen sucrose vanuit V203 legen naar centrifuge (Cf201) schoonmaken

1-ste pass 2-de pass 3-depass schoonmaken

10 10 10 10 10

M201 homogenizer

11 11 11 11

Cf201 centrifuge voor afscheiden inclusion bodies

43.5 54.9 55.4 57.4

11.4 0.5

12 12 12 12 12

V203 voorraadvat sucrose-oplossing

43 43.5 45.5 50.5 51

0.5 2 5 0.5

legen naar V201 schoonmaken koelen vullen

13 R301 13 reduktie en 13 - extraktie vat 13 13 13 13

54.9 55.4 58.4 58.9 59.9 60.9 62.9

0.5 3 0.5 1

vullen vanuit centrifuge (Cf201) reduceren vullen met butanol extraktie legen naar centrifuge (Cf301) schoonmaken

14 14 14 14 14 14

V301 voorraadvat met reduktie hulpstoffen

55.4 58.4 60.4 60.9 61.9 66.9

3 2 0.5 1 5

legen naar R301 schoonmaken vullen steriliseren koelen

15 15 15

V302 voorraadvat

55.4 59.9 60.4

4.5 0.5

legen naar R301 vullen

16 16 16

Cf301 liquid-liquid centrifuge butanol/water scheiding

59.9 60.9 62.9

1 2

17 17 17 17 17

R302 precipitaite-vat

59.9 60.9 63.9 64.5 66.5

1 3 0.6 2

vullen vanuit Cf301 precipiteren legen naar Cf302 schoonmaken

18 18 18 18 18 18

V303 voorraadvat fosfaat-oplossing

60.9 63.9 65.9 66.4 67.4 72.4

3 2 0.5 1 5


19 19 19 19

Cf302 centrifuge voor afscheiden precipitaat

63.9 64.5 65 67

0.6 0.5 2

centrifugeren legen naar R401 schoonmaken

20 20 20 20

R401 oplosvat precipitaat

64.5 65 66 70

0.5

vullen vanuit Cf302 oplossen precipitaat legen naar F401 schoonmaken

2

2

2

4 2

centrifugeren inclusion bodies legen naar R301 . schoonmaken

centrifugeren schoonmaken

20 21 21 21

72 V401 voorraadvat voor hulpstoffen oplossen precipitaat

21 21 21 21 21

64.5 65.5 67.5

1 2

legen naar R401 schoonmaken

79 81.8 82.3 83.3 88.3

2.8 0.5 5

vullen vanuit F402 vullen overig steriliseren koelen

22 22 22

F401 dead-end microfiltratie

66 70 72

4 2

dead-end filtratie schoonmaken

23 23 23 23 23

R402 reduktie-vat

66 70 73 80 82

4 3 7 2

vullen vanuit F401 reduceren legen schoonmaken

24 24 24 24 24 24

V402 voorraadvat met reduktie hulpstoffen

69.5 70 72 72.5 73.5 78.5

0.5 2 0.5 5


25 25 25

V403 voorraadvat natronloog

70 73 73.5

3 0.5


26 26 26

K401 size-exclusion

73 79 81

6 2

73 79 81 .8 82.3 84.3

6 2.8 0.5 2

vullen vanuit K501 ultrafiltratie legen naar afvalstroom schoonmaken

79 81.8 101 .8

2.8 20

vanuit V404 ultrafiltratie schoonmaken

73 79 82 64

6 3 2

30 V504 30 voorraadvat hulp30 stoffen oxidatie 30 30

73 79 81 81.5 82.5

6 2 0.5

31 31 31 31 31 31 31

V405 voorraadvat elutievloeistof

73 79 79 81.8 82.3 83.3 88.3

6 2 2.8 0.5 5

legen naar K501 schoonmaken vullen vanuit F402 vullen overig steriliseren koelen

32

R501

73

6

vullen vanuit V504

27 V404 27 buffervat voor ultra27 filtratie unit F402 27 27 28 28 28

F402 ultrafiltratie unit

29 29 29 29

V501 voorraadvat voor fedbatch toevoegen

5

size exclusion chromatografie 1 regenereren

vullen vanuit K401 legen naar R501 schoonmaken


32 32 32 32 32

oxidatievat

79 82 84.8 97.8 99.8

3 2.8 13 2

fed-batch oxideren legen naar ultrafiltratie legen naar K601 schoonmaken

33 33 33

V502 voorraadvat natronloog

79 82 82.5

3 0.5


34 34 34


82 84.8 104.8

2.8 20

ultrafiltratie schoonmaken

35 35 35

K601 size exclusion 2

84.8 92.8 94.8

8 2

36 36 36

V503 voorraadvat ijsazijn

79 82 82.5

3 0.5


37 37 37 37 37 37


84.8 92.8 94.8 95.3 96.3 101.3

8 2 0.5

legen naar K601 schoonmaken vullen steriliseren koelen

38 38 38 38

V602 buffervat voor ultrafiltratie

84 .8 92.8 94.4 94.9

8 1.6 0.5

vullen vanuit K601 ultrafiltratie buffervat legen naar K602

39 39 39


92.8 94.4 114.4

1.6 20

ultrafiltratie schoonmaken

40 40 40

K602 ontzoutings chromatografie

94.4 96.3 98.3

1.9 2

ontzoutings-chromatografie regenereren

41 41 41 41 41 41


94.4 96.3 98.3 98.8 99.8 104.8

1.9 2 0.5

legen naar K602 schoonmaken vullen steriliseren koelen

5

5

size exclusion chromatografie 2 regenereren

Bijlage 6.1: stroom- en componentenstaat

STROOM I COMPONENTENSTAAT KG/BATCH

M-debiet

SECTIE 1 ApPARAAT NR. STROOM NR. NAAM

: : :

COMPONENTEN

R101 101 ent M

water

R101 102 koelwater

Rl01 103 warmwater

R101 104 zuurstof verbruikt

V104jR101 105 octanol

M

M

M

M

204589 0.020

ent octanol

30.700

zuurstof

I

46.154

I 0.020

TOTAAL:

ApPARAAT NR. STROOM NR. NAAM

:

: :

COMPONENTEN water

I 204589

I0

I 46.154

V104jR101 106 fosfaatopI.

V102jR101 107 glucoseopI.

V101jR101 108 medium

R101jF103 109 produktstroom

jR101 110 kooldioxi de-prod.

M

M

M

M

M

1485.501

712.249

3000

3755.804*

1.991 30.700

octanol glucose

I

0.020

ent fosfaat

I 30.700

109.960

ammonium

22.618

28.77

8.093

kooldioxide

65.003

beta-IFN (incl.bod. jcel)

1. 485

DNA (incl.bod. jcel)

0.990

overige eiwitten (cel)

27.223

celwand materiaal (cel)

19.799

TOTAAL: 1487.491 822.309 * l.nclusl.ef produktl.ewater (=43.555)

3030.711

3864.791

65.003

I

ApPARAAT NR. : STROOM NR. : NAAM :

COMPONENTEN water

R101 111 koelwater

R101 112 warmwater

R101/F103 113 naar microfiltratie

R101V202 114 uit diafiltratie naar homogenizer

F103/R101 115 uit microfiltra -tie naar diafilt.

M

M

M

M

M

204589

3755.804

494.503

fosfaat

I

0.663

octanol

30 . 700

glucose

28.77

beta-IFN (incl.bod. /cel)

1.485

1.411

1 . 411

DNA (incl . bod. /cel)

0.990

0.940

0.940


27 . 223

25.862

25.862


19.819

18.828

18.828

I 204589

TOTAAL:

ApPARAAT NR. STROOM NR . NAAM COMPONENTEN

I

494.503

: :

:

F103 116 afval M

water

4746.801

fosfaat

1. 328

octanol

30.700

glucose

28.77

beta - IFN (incl . bod . /cel)

0.074

DNA (incl.bod. /cel)

0.049


1.361


0.991

TOTAAL:

I 3864 . 791 I 542.207 I 541.544 I

I0

I 4810.075 I

M

M

I

M

I

M

I

I

STROOM I COMPONENTENSTAAT M-debiet SECTIE 2 ApPARAAT NR. STROOM NR. NAAM

KG/BATCH

M201/V201 202 uit laatste hom. pass M

V201/C201 203 naar centrifuge M

V202/V201 205(=207) naar homogenizer

COMPONENTEN

V203/V201 201 sucroseop 1. voor centr. M

water

903.678

494.503

1398.181

494.503

1323.285

0.663

0.663

0.663

0.562

: : :

fosfaat sucrose

I

M

361.471

361. 471

C201 206 afval uit centrifuge M

306.723

beta-IFN (incl.bod. /cel)

0.183

0.183

1.411

0.018

DNA (incl. bod. /cel)

0.122

0.122

0.940

0.012


3.362

3.362

25.862

0.336


2.448

2.448

18.828

0.245

beta-IFN (incl. bod. )

1.227

1.227

0.123

DNA (incl. bod. )

0.818

0.818

0.082

overige eiwitten

22.500

22.500

18.082

celwand materiaal

16.380

16.380

13.164

TOTAAL:

I 1265.149 I 542.207 I 1807.356 I 542.207 I 1662.632 I


M201jV201 208(=202) uit laatste hom. pass M

C201jV304 209 uit centrifuge M

H201 210 koelwater

H201 211 koelwater

COMPONENTEN

R101jV202 207(=114) uit microfiltratie M

M

M

water

494.503

494.503

74.897

13555.3

fosfaat

0.663

0.663

0.100

: : :

sucrose

I

54.748

beta-IFN (incl.bod. jcel)

1.411

0.183

0.165

DNA (incl.bod. jcel)

0.940

0.122

0.110


25.862

3.362

3.026


18.828

2.448

2.203

beta-IFN (incl. bod. )

1.227

1.105

DNA (incl. bod. )

0.818

0.736

overige eiwitten

22.500

4.418

celwand materiaal

16.380

3.216

TOTAAL:

13555.3

I 542.207 I 542.207 I 144.724 I 13555.3 I 13555.3 I

STROOM I COMPONENTENSTAAT M-debiet

KG/BATCH


COMPONENTEN water

: : :

V301 301 nieuw oplosmiddel M

1446.142

V301/R301 302 totaal oplosmiddel

R301 303 koelwater

R301 304 warmwater

V303/R302 305 fosfaatopl.

M

M

M

M

2724.680

fosfaat

0.085

sucrose

53.664

overige eiwitten

2.558

celwand materiaal

3.153

beta-IFN

0.318

DNA

0.686

DTT

6.508

8.648

SDS

42.135

55.993

EDTA

1. 215

1.615

26176.19

737.055 0.981

NaOR

I

acetaat

0.002

2-butanol

133.534

NaCl

11.449

TOTAAL:

I 1496.000 I 2996.385 I 26176.19 I 0

I 738.036 I


: : :

COMPONENTEN

R302 306 ijsazijn

R301 307 2-butanol

R301 308 zout-opl.

R302/C302 309 uit precipitatie

C301/R302 310 butanol uit extractie

M

M

M

M

M

water

958.727

221. 672

fosfaat

0.996

0.015

overige eiwitten (opgelost)

0.010

0.483

overige eiwitten (onopgelost)

0.474

beta-IFN (opgelost)

0.014

beta-IFN (onopgelost)

0.710

DTT

4.324

4.324

SDS

27.997

27.997

EDTA

0.807

0.807

1.038

0.005

1989.492

1989.492

acetaat

5.000

1. 033 2125.724

2-butanol

13 .117

NaCl

I

TOTAAL:

I 1. 033

I 2125.724 I 18.117

. 1. 437

0.725

1. 437

I 2986.026 I 2246.957 I


COMPONENTEN

R301/C301 312(=313) naar extractie centrif.

C301 313 (310+315) naar extractie centrif.

R302/C302 314(=309) naar precipitaat winning

C301/F301 315 waterfase uit extractie

M

M

M

M

M

water

2804.576

2804.576

958.727

2582.904

fosfaat

0.185

0.185

0.996

0.170

sucrose

108.411

108.411

108.411

onopgeloste biomassa (in cel)*

5.504

5.504

5.504


5.650

5.650

0.010

5.167


1. 325

1. 325

0.474

1.325

beta-IFN (opgelost)

1. 368

1. 368

0.014

0.643


0.055

0.055

0.710

0.055

DNA (opgelost)

1. 385

1. 385

1.385

DNA (onopgelost)

0.037

0.037

0.037

celwand materiaal (opgelost)

6.369

6.369

6.369

DTT

8.648

8.648

4.324

4.324

SDS

55.994

55.994

27.997

27.997

EDTA

1. 614

1. 614

0.807

0.807

0.010

0.010

1. 038

0.005

2-butanol

2259.257

2259.257

1989.492

269.765

NaCl

24.566

24.566

1.437

23.129

acetaat

*

R301 311 ijsazijn

0.008

5284.954 5284.954 2986.026 0.008 3037.997 TOTAAL: Dl.t l.S al het materl.aal wat nog l.n de cel Zl.t: Ul.t stroom 209: t -IFN (incl.bod.jcel) + DNA (incl.bod.jcel) + overige eiwitten (cel) + celwand materiaal (cel)

ApPARAAT NR. STROOM NR . NAAM

: : :

COMPONENTEN water

R301 316 koelwater

R301 317 warmwater

M

M

26176.19

F301 318 naar filter M

F301jV301 319 recycle naar 1e reductie

F301 321 retentaat

M

M

1291.452

1278.538

fosfaat

0.085

0.085

sucrose

54.206

53.664

onopgeloste biomassa (in cel) (IFNjDNAjO. E jcelwand)

2.752


2.584


0.663

beta-IFN (opgelost)

0.322


0.028

DNA (opgelost)

0.693

DNA (onopgelost)

0.019


3.185

3.153

0.032

DTT

2.162

2.140

0.022

SDS

13.999

13.858

0.141

EDTA

0.404

0.400

0.004

acetaat

0.003

0.002

0.001

2-butanol

134.883

133.534

1. 349

NaCl

11.565

11. 449

0.116

1519.005

1500.385

18.62

TOTAAL:

26176.19

0

12.914

0.542 2.752

2.558

0.356

0.663

0.318

0.004 0.028

0.686

0.007 0.019


: : :

COMPONENTEN

I

F301 322 spui

C302 323 zware fractie M

M

M

C302 324 lichte fractie M

water

1291.452

1.489

957.238

fosfaat

0.085

0.002

0.994

sucrose

54.205

onopgeloste biomassa (in cel) (IFNjDNAjO. E jcelwand)

2.752


2.583

0.426

0.057


0.662

beta-IFN (opgelost)

0.321

0.639

0.086


0.027

DNA (opgelost)

0.692

DNA (onopgelost)

0.018


3.184

DTT

2.162

0.007

4.318

SDS

13.998

0.043

27.953

EDTA

0.403

0.001

0.806

acetaat

0.002

0.002

1. 036

2-butanol

134.882

3.089

1986.403

NaCl

11.564

0.002

1.435

TOTAAL:

I 1518.992 I

I 5.700

I 2980.326 I

M

I

STROOM/cOMPONENTENSTAAT KG/BATCH

M-debiet


: : :

COMPONENTEN

V401 401 nieuw oplosmiddel M

F401 402 retentaat

V401/R401 403 oplosmiddel

R401/F401 404 opgelost precipitaat

R401/F401 405 naar filtratie

M

M

M

M

water

2.761

224.295

225.784

225.784

fosfaat

0.069

0.110

0.111

0.111

0.418

0.418

0.009

0.009

0.626

0.626

0.013

0.013

0.431 (0.077)

0.431 (0.077)

overige eiwitten (opgelost) 0.017

overige eiwitten (onopgelost) beta-IFN (opgelost)

0.025

beta-IFN (onopgelost) DTT*

0.424 (0.077)

SDS

0.006

· 0.049

0.049

170.400

170.400

170.400

EDTA

0.121

0.122

0.122

acetaat

0.001

0.003

0.003

2-butanol

1. 789

4.878

4.878

NaCl

0.001

0.004

0.004

Ureum

3.208

0.042 397.147 402.848 TOTAAL: 6.038 402.848 I* tussen I I I I I I haakJes staat de hoeveelhe1d geox1deerd


COMPONENTEN

F401/R402 407 filtraat

R402 408 koelwater

R402 409 warmwater

M

M

M

M

V404 411 concentraat M

water

221.534

225.784

fosfaat

0.041

0.111

0.048


0.409

0.301

beta-IFN (opgelost)

0.614

0.029

3362.698

2017.619

281.425

DTT

0.424 (0.077)

0.431 (0.077)

0.538 (0.099)

SDS

0.006

0.049

0.007

Ureum

167.192

170.400

212.392

EDTA

0.121

0.122

0.143

acetaat

0.001

0.003

0.713

2-butanol

1. 789

4.878

2.126

NaCl

0.001

0.004

0.002

I

TOTAAL:

ApPARAAT NR. : STROOM NR. : NAAM : COMPONENTEN

I 391.109 I 402.805 I 3362.698 I 2017.619 I 497.723 I V402/R402 412 reductiemiddel M

F402 415 spui M

R402 416 (415+406)

R402 417 koelwater

R402 418 warmwater

M

M

M

water

94.346

315.880

fosfaat

0.022

0.063

0.180 (0.033)

0.604 (0.110)

SDS

0.003

0.009

Ureum

71. 203

238.396

EDTA

0.065

0.186

acetaat

0.922

0.923

2-butanol

0.963

2.752

NaCl

0.001

0.002

DTT*

I

V401 406 recycle oplos middel

TOTAAL:

0.743

I 0.743

(0)

3362.698

2017.619

I 167.705 I 558.815 I 3362.698 I 2017.619 I


COMPONENTEN

M

k401/V404 420 afval recycle M

R402 421 uit reductie M

V405 422 eluent recycle

K401 423 totale kolomtoevoer

M

M

water

734 . 606

1016.031

225.784

418.726

1354.708

fosfaat

0.151

0.199

0.111

0.088

0.199


0.301

0.440

0.440

beta-IFN (opgelost)

0.029

0.583

0.583

DTT

1.405 (0.258)

1.943 (0.358)

1.174 (0.077)

0.800 (0.147)

2.200 (0.450)

SDS

0.022

0.029

0.049

0.013

0.062

Ureum

554.408

766.800

170.400

316.013

1022.400

EDTA

0.447

0.590

0.122

0.261

0.590

acetaat

2.223

2.937

0.003

1.300

4.072

2-butanol

6.627

8.752

4.878

3.875

8.753

NaCl

0.005

0.006

0.004

0.003

0.007

I

I 1299.894 I 1797.617 I 403.548 I 741.079 I 2394.014 I

TOTAAL:


COMPONENTEN

I

F402 419 filtraat

: : :

V405 424 nieuw eluent M

V405/K401 425 eluent

K401/V501 426 uit kolom /naar oxidatie

M

M

water

1128.924

fosfaat

0.088 0.139

beta-IFN (opgelost)

0.554

DTT

1. 026 (0.373)

0.256 (0.093)

SDS

0.013

0.033 255.600

311. 362

852.000

EDTA

0.207

0.468

acetaat

2.769

4.069

2-butanol

3.875

NaCl

0.003

TOTAAL:

M

338.677


Ureum

M

1.135

I 314.338 I 1990.466 I 596.394 I

I

I

STROOM I COMPONENTENSTAAT M-debiet SECTIE 5

KG/BATCH


COMPONENTEN

V501/R501 501 naar oxidatie

R501 502 koelwater

R501 503 koelwater

R501/F501 504 naar ultrafiltratie

V504/R501 506 oxidatievloeistof

M

M

M

M

M

water

338.677

342.06

342.06


0.139

0.141

beta-IFN (opgelost)

0.554

0.551

DTT

0.256 (0.093)

0.256 (0.256)

SDS

0.033

0.033

Ureum

255.600

255.600

IBA TOTAAL:

:

: :

I

0.285

0.285 469.339

596.394

342.06

342.06

1065.732

R501/K601 507 uit ultrafiltratie

F501 509 afval uit ultrafiltratie

510 recycle naar V405

511 spui

M

M

M

51. 917

755.566


0.133

0.008

0.008

beta-IFN (opgelost)

0.518

0.033

0.033

DTT

0.017 (0.017)

0.240 (0.240)

SDS

0.002

0.032

Ureum

16.625

238.975

EDTA

0.013

0.235

0.235

acetaat

0.060 .

1.075

1. 075

0.285

0.285

TOTAAL:

I 69.285

710.198

M

water

IBA

0.248

1.135

1.135

acetaat

COMPONENTEN

468.806

0.248

EDTA


807.483

0.225 (0.225)

M

45.368

0.014 (0.014) 0.032

224.625

14.349

I 996.449 I 935.048 I 61.399

I

I

STROOM I COMPONENTENSTAAT M-debiet SECTIE 6

KG/BATCH


COMPONENTEN

K601 601 afval 2e S.E. kolom M

K601 602 toevoer 2e S.E. kolom M

water

233.626

311. 501


0.124

beta-IFN (opgelost)

K601 603 eluent 2e S.E. kolom

K601/V602 604 naar ultrafiltratie

R501/K601 606 afval ontzoutingskol.

M

M

M

259.584

77.875

204.753

0.133

0.009

0.001

0.073

0.518

0.446

0.013

DTT

0.017 (0.017)

0.017 (0.017)

SDS

0.001

0.002

0.001

0.001

Ureum

78.970

99.752

83.127

20.781

11.126

EDTA

0.070

0.094

0.081

0.023

acetaat

0.655

0.874

0.814

0.218 0.008

natronloog

I

I 313.536 I 412.891 I 343.606 I 99.353

TOTAAL:


COMPONENTEN

: : :

V602 609 uit ultrafil tratie M

K602 610 naar ontzoutingskol. M

water

36.157

258.988


0.009

beta-IFN (opgelost)

V603 612 eluent

M

222.831

F601 614 afval ultrafiltratie M

I 215.902 I K602 615 eindprodukt M

41.718

54.235

0.009

0.001

0.008

0.419

0.419

0.027

0.406

SDS

0.001

0.001

Ureum

11.126

11.126

DTT

9.655

EDTA

0.023

acetaat

0.218

natronloog TOTAAL:

47.712

0.011

0.011

270.554

222.842

0.003 51. 642

54.649

Bijlage 6.2: massa- en warmtebalans

MASSAIN

M

46.06

WARMTE-BALANS

EN

Voorwaarts Q

Retour

M

M

Q

Q

7.15

O~-

603.53

10.10

P;~~l\HJ RlOl

wor",,\..e.

253.69

'1erduM-

voedil\(,; (101'" ,D's-) +ICqt-lcS

2573.46

Q

p:-ocil.,Ldie. (110)

C. 104)

3883.74

M

65.00

CD2-

ve.r-

\xu.i~

UIT

wOJ'LÀ

proc.t.((""'' Ij Fermen-

r \-(vJ

243_25

'>

tatie

554.36

w.toe.Joer "ia 5o.S (\116)

29 uur

roerder-

1628.64

(r-I-{S) ., kodn'\~ l\-\c\

202834

Uc>2) 3864.79

(~D<J)

600.59

iI

13.39

VJ(l(""k

Ç)roctMk.b~

Fl03 MP 2.4 uur

541.54

... \. 10'2..) ,

541.54

3323.25

516.43

637.62

13.39

1486.83

231.05

'"

koe.\i/'lo..

R 101 M f > Diaf .- .,

~~)

:~S")

.v

84.16

I+·I\~~

I{oS-{aot -... ~\.(I()b)

W(J[rI\t~ ..

23.44

(11 6)

4259.52

\

637.62

231.16

It, \bOAl

202834

UIS)

97.55

1487.49

..

Cl' b) ,.

Fl03 Diaf. 4.1 uur

•

~n:x:t

542.21

~I'-{)

.v

84.26 1116.19

,

~

C!0l.)

Rl 0 1 Diaf > Hom.

koe.\\tiC!.

6\Lj) ,~

•

(111)

,.

1116.19

23.44

VERVOLG (1) IN

M

Voorwaarts

UIT

Retour

M

M

Q

Q

Q

542.21 84.26 4608.88 (1\0)

..

M

Q

(\\~) ,.......lL H

kce\if\C\, ,..

201

4608.88

38.71

2982.14

25.05

2982.14

25.05

2..\ I

L...-.--

542.21

~I~)

45.55

.--"--

v 202

--

542.21

,eposs

45.55 25.05

....j,,--

\.JQ.r~~

M

~ro~"'~Q.'

201 -r--

542.21

lt.pqsS

70.60

...-Jt-

.

2982 . 14

G\C)

koe.lw.o.. (21\)

H

201

.#'

.

'--r--

542.21

te.. pasS

,....JL

45.55

v 201 L....-_

542.21

e

2-

45.55 25.05

(>"-s>

~L

l,Jct,-",,4e..

~ M 201

~~~~

L..-:o-

542 . 21

le. p"-SS

70.60

~'-

2982.14 \..'2.10 )

>

"oc\\ 'Y:A

H

201

(2.\1)

L....-.--

542.21 45.55

2. C. fCASS

J"

VERVOLG (2) Retour

Voorwaarts

IN

M M

lCpo..<;C;;

Q

~L

Q

UIT

M Q

M

Q

v 202

'--.542.21

~ep"~

~"-

45.55 25.05

WW""

~

M

.... 201

r~;[

'---:---

542.21

3c ~s

lt pq. ,.-'--

70.60 2982.14

(?\O)

Wil\~,

H

,

201

2982.14

25.05

1662.63

139.66

(21\) '"

'--r--

542.21

c

3 po.sS

---,L

45.55 1265.15

106.27

~ûcrose",

v

Ofl . (2.01)"

201

-1807.36

L:{(3)

151.82

.--"-

c

D.ko.\ " (2.c>b) , r--____ 201

144.72 12.16 1496.00

157.08

-®-r---

I"

OD\OS -

c.a.tkoe1eJ\..

1'11. (301)"

v 301

376.99

s\tri -

,"

h'sQ..tle...

-r--

1496.00

-- --

1500.39

---

r

~L

489.93

U.\J. b* _......

157.54

(3''1) 2996.39 647.47

v 301

'---

-@-- --,

'ct~(

44.14

VERVOLG (3) IN

Voorwaarts

Retour

M M

0.01

Q

(1.~)

Q

~

ii

M

,.........;L

1 So.tli i ,.., , (311) ..

0.00

~ol)

UIT

Q

M

Q

R

301

26176. 19

...

26176.19

329.82

.,

1518.99

159.49

n . v.b* .... ("31:\) '"

1500.39

157.54

re..\:e.t\~ '(3'21) ~

18.62

1. 96

Ct\\JCI-\

2980.33

312.93

kCle..lI'I)!\

(}03) "

'-r--

(3\6)

~

3141.11

~L

329.82 2143.84

..

~~()\t_

225.10

lolAt ( 3Ot

R

301

i-308)'-r--

5284.95

S(2)

554.92

~L c

Ij 1(3)

301

~

\1, 2246 . 96

- - . -@r ~'--

~~.\o ('30~

77.60

(32..<.)

'--r--

235.93 739.07

SpLM

R

'f}~bjv"ll C:s~ ,..... 11 ' \ 302

1519.01

31~

-

159 . 50

.--L-

.;) F

2986.03

301

-@-..

313.53 '-

~,....--

C

302

r'---

5.70

-@t-

0.60

'll

(3~'1)

....

...

VERVOLG (4) IN

M

Voor waarts

Retour

M

M

Q

Q

Q

::l~

5.70 0.60 391.11

41.07

UIT

M

Q

(l;o6) " 6.04

0.63

I

e»\o"

M.I ~

('1°\)

I'

v 401

koe&,

~kr~H~~.

100 . 08

%~cht

"

397.15 41.70

100.08

'--r--

e

--~I.L ~

R 401

'--.--402.85

~°Lt) ,...-L

42.30

F 401

~I.O.\ (~O1.')

0.04

0.00

;-

'--r--

402 . 81

~()T)

42.29 0.74

r-'L

OTT

0.08

-

Ctt l 1.) 2017 . 62

42.37

b~e.'\ ..,

~O9)

R 402

kcclt>'l ... ('1 Ir)

3362 . 70

(lloS) :. '---

403.55 42.37

0-

\11

L.4 IB )

-'-

2017.62

3362.70

42.37

VERVOLG (5) IN

M

Voor waarts Q

Retour

M

M

Q

Q

403.55

UIT

M

Q

-@)-

42.37 r---

314.34

33.01

l'lie.u.,.l.) "

<M"" CLj L4) 741.08

935.05

77.81

I'

\..tN. 6

98 . 18

~U

'

u..v.b

I

Ç"\O

,-

v 405

S~ll.l,-

501.60

1990 . 47

bele.",

501.60

~ Q;.,o..t/

'--r--

-<@}

. -'

209 . 00 ~

~L K 401

r-

1797.62 188.75

~

'--

t--

--r--L.-

V 404

1797.62 188.75

.............-

® .- -

,-:lJn .v.b ,

(t;n)

"

cot'CeJ\tn.t 4 . 81

~~,

F 402

~-

, S(plM

'---

62 . 62

-e@}

77.81

497.72

57.07

167.71

17 . 61

391.11

41.07

(~H)

-

n.v ,\, " (yo6) ... 596.39

741.08

VERVOLG (6) IN

M

Voorwaarts

Retour

M

M

Q

Q

Q

596.39

UIT

M

Q

-<@>-.

62.62

.---

~ V SOl

'-----

596.39

(5-0()

62 . 62 469 . 34

,........., '-6x~dcd-\e.

49.28

R

l . \-0-' 501 \JUel.> L-so6) '-:-

1065.73 )O~

,....:.L

111 . 90

('I .v .b,

\..vO.f ...... ~

4.31

F 501

l5"1O) , Spw.

,

, ~

935.05

98.18

61 . 40

6.45

342.06

4.31

313.54

32.92

("-H)

\><'001.. . '--I'""'-

69.29

CSC>!)

11.58 342.06

~'-

... (5Cl) ...-

R

ble.-. ...

SOl

('03)

'----,--

69.29

tso})

7.27 343.61

It ;---''--

~,

36.08

(pos) .,

K 601

o.tco.\ (bo,)

,

'--t--

99.35 10.43

(?o'j)

,.....!lL v 602

'--,-

99.35 10.43

(j;°lt) \1

•

VERVOLG (7) IN

M

Voorwaarts Q

Retour

M

M

Q

Q

99.35

M

Q

(GOLt )

10.43

~L

'WQ~.Ic.

0.56

UIT

fXocl./

47.71

F 601

--

~ilf.raU". . (6ILtJ'

51.64

5.42

215.90

23 . 12

54.65

5.85

(blo)

5.57

-'"-

v 602 -,....-

47.71

(b \0)

5.57 222.84

~~

elue;~

23.40

IJ> l1) ,

a+lKAi

K 602

'-

(90'5) -

-r--

~\~) f(U)

PKoJ)u kT-

<--

MASSA IN KG/Batch WARMTE IN MJjBatch

- TOTAAL

------------->

266027.6

7824.13

FABRIEKSVOORONTWERP NO. 3120 D

BIJLAGE 7.1: Apparatenlijst voor pompen

APPARAAT NR.:

P 101

·

FVO Nr.3120D P 102

P 103

P 201

P 202

glucose dosering

spoelwater voeding

voeding micro/diafiltratie

voeding homogenizer

voeding C 201

verdringer

verdringer

centrifugal

verdringer

verdringer

13 ww% glucose oplossing

saline oplossing

cel suspensie

cel suspensie

inclusion bodies suspensie

0.008

0.107

11. 0

0 . 15

0.013

1100

1000

1050

1050

1050

Zuigdruk [bar] Persdruk [bar]

1 1.1

1 1.1

2.5 4

1 450

1 1.1

Temperatuur : [ °C]

37

37

37

20

20

1600 2000

6500 8100

< 10

mono-pomp

mono-pomp

P 305

P 306

Pompactie

· Te verpompen medium · Pomp type

·

Capaciteit [kg/sJ Dichtheid [kg/m3 ]

·

Vermogen [W] - theorie : - praktijk

·

Overige

< 10

< 10

:

P 301

APPARAAT NR.:

P 302

P 304

Pompactie

·

dosering zuur R302

dosering zuur R301

voeden C 301

voeden C 302

voeding F301

Pomp type

·

verdringer

verdringer

verdringer

verdringer

verdringer

ijsazijn

ijsazijn

eiwitoplossing (but/water)

precipitaat + butanol

eiwitoplossing (water)

0.1

0.1

0.68

1. 38

0.42

1000

1000

900

900

1000

Zuigdruk [bar] Persdruk [bar]

1 1.1

1 1.1

1 1.1

1 1.1

1 1.1

Temperatuur [ °C]

25

25

25

25

25

< 10

< 10

Te verpompen medium Capaciteit [kg/sJ

· ··

Dichtheid [kg/m3 ]

·

..

Vermogen [W] - theorie - praktijk Overige

..

· ·

< 10 pulsdemping: mono-pomp

< 10

< 10

App arat enlij st voor pomp en APPARAAT NR.:

·

Pomp actie

· Te verpo mpen mediu m ·· Pomp type

Capa citei t [kg/s J

:

Dich theid [kg/m3 ] Zuigd ruk Persd ruk

P 40l.

P 402

P 403

P 404

voedi ng F401

doser ing natron loog

voedin g F402

voedi ng K401

verdr inger

verdr inger

centri fugal

verdr inger

8 molai r ureum opl.

gecon e. natron loog

8 molai r ureum opl .


0.02

0.1

4.2

0.092

1100

1000

1100

1100

1 1.1

1 1.1

2.5 3

1 1.1

25

25

25

25

:

[bar] [bar]

Temp eratu ur [ °C] : Verm ogen [W] - theo rie - prak tijk :

·

< 10

< 10

190 240

< 10

·

Over ige

APPARAAT NR.:

· ·

Pomp actie

Pomp type Te verpo mpen mediu m Capa citei t [kg/s J Dich theid [kg/m3 ]

· ·· ..

Zuigd ruk [bar] Persd ruk [bar] Temp eratu ur [ °C]

.

Verm ogen [W] - theo rie prak tijk

-

Over ige

FVO Nr.3 120D

·

· ··

P SOl

P 502

P 503

P 504

dosere n eiwito pl . R501

doser ing natron loog R501

doseri ng zuur R501

voedin g F501

verdr inger

verdr inger

verdr inger

verdr inger


gecon e. natron loog

ijsazi jn


0.05

0.1

0.1

4.2

1100

1000

1000

1100

1 1.1

1 1.1

1 1.1

3

25

25

25

25

< 10

< 10

< 10

2.5

190 240

FVO Nr.3120D

Apparatenlijst voor pompen

P 602

P 603

voeding K601

voeding F601

voeding K602

verdringer

centrifugal

verdringer

4 molair ureumopl .

4 molair ureumopl .

eiwitopl.

0.01

0.88

0.04

1100

1100

1000

1 1.3

2.5 3

1 1.3

25

25

25

APPARAAT NR.:

P 601

· Pomp type · Te verpompen medium ·· Capaciteit · [kg/sJ Dichtheid [kg/m3 ]

Pompactie

Zuigdruk Persdruk

.

[bar] [bar]

Temperatuur [ °C]

.

Vermogen [W] - theorie - praktijk OVerige

··· .·

< 10

40 50

< 10

BIJLAGE 7.2

FVO Nr.3120D

Apparatenlijst voor centrifuges APPARAAT NO.

·

Type Capaciteit

[l/hr] :

Lengte Binnenstraal

[m] :

[m] :

C20l (C3 02)

C 301

tubular bowl

tubular bowl

39.6

6500

0.76 0.057

1.0 0.05

Temperatuur Werkdruk

[OC] : [bar] :

20 1.0

20 1.0

Toerental

[rpm] :

15,000 1570 4375

15,000 1570 4430

1 4

1 1

2.25

2.25

[rad/sec] : E-waarde Aantal - serie - parallel Motorvermogen Overig

[m2 ]

:

· · [kW] :

·

BIJLAGE 7.3

-FVO Nr. 3120D

Apparatenlijst voor filters APPARAAT NO.

F 103

Benaming

:

Type

:

microfiltr. holle fiber

materiaal

:

O.lJ,LID

scheidingsgrootte

· Temperatuur : Vatdruk [bar] · Permeaatdruk:

1.47 1.5

..

liP axiaal [bar] : liP tranaaambraan

# fibers ~ar

L fiber ~r.aD

. [mm] :

Cm] : [m2 ] :

Aantal - serie parallel

-

Overig

37 2.5 1.0

··· · ··

F 301

F 401

F 402

F 501

F 601

'dead end' kaarsfilter

'dead end' kaarsfilter

ultrafiltratie holle fiber cellulose acetaat



0.22J,LID

0.22J,LID

MWCO

MWCO

MWCO

25 1

25 1

1

1

<

<

=

=

3000

3000

gfmol

gfmol

gfmol

25 2.5 1.0

25 2.5 1.0

25 2.5 1.0

0.76 2.02.67

0.50 2.02.50

0.50 2.0-2.50

400 2.0 0.50 1. 26

85 2.0 0.50 0.27

1 1

1 1

670 2.0 0.5 4.2

1.26

1.26

400 2.0 0.50 1.26

1 1

1 2

1 2

1 1

terugspoelen ter voorkoming aankoeklaag

=

3000

BIJLAGE 7.4 SPECIFICATIEFORMULIER WARMTEWISSELAAR

PVO 3120D Aantal serie : 1 Aantal parallel : 1

APPARAATNUMMER : H201 Algemene eigenschappen

tixed tube sheet warmte-wisselaar

Type

met vaste pijpplaten

Uitvoering

horizontaal

Positie

· .· · : · ·:

Capaciteit warmtewisselend oppervlak Overall warmteoverdrachts-coëmciënt Logaritmisch temperatuursverschil (LMTD) Aantal passages pijpzijde Aantal passages mantelzijde Correctiefactor LMTD (min. 0.75) Gecorrigeerde LMTD

(berekend) (berekend) (globaal)

21.5/7.0*[kW] 1. 64/0.64 [m3 ] [W/m3 • K] 800 [ °C] -16.4/-13.6 20 1 1 -16.4/-13.6

[ °C]

Bedrijfscondities Pijpzijde

Mantelzijde

koelwater

Soort fluïdum Massastroom Soortelijke warmte Temperatuur IN Temperatuur UIT Druk Materiaal

[kg/sJ [kJ/kg.oC] [ °C] [ °C] [bar]

2.56/0.82

gehomogeniseerde celsuspensie 0.151/0.151

4.20

4.20

10 12

37/30.7 20/20

1

1

RVS

RVS

(water)

* Deze warmtewisselaar wordt voor twee verschillende soorten stromen gebruikt: de waarden voor de deelstreep gelden voor de stroom uit de fermentor, de waarden achter de deelstreep gelden voor de stromen uit de homogenizer

BIJLAGE 7.5

FVO Nr.3120D

Apparatenlijst voor kolommen APPARAAT NO.

K401

.

Benaming

/ K601

Eerste en Tweede SEC

K 602

Ontzoutings-SEC

Verwijdering van: (molecuulgewicht)

DTT (154)/Eiwit (80000)/ dimeer (40.000)

EDTA (292)

Inhoud / pakking:

Sephacryl S 100HR

Sehpadex G50

0.32 47

0.32 60

1.3 1.0

1.3 1.0

25

25

0.196 1.0 0.25 2 0.393 2

0.0458 0.54 0.20 2 0.092 2

0.785

0.184

Void fraction deeltje.grootte

[-]

:

[,mL] :

[bar] : Topdruk Bodemdruk [bar] : Temp.

[ Oe]

:

[m3 ] : bedvolume [m] : kolomdiameter [m] : bedhoogte .. bedden/kolom [m3 ] : koloDIVolume .. parallelle kolommen: totaal kolomvolume[m3 ] :

Overig

:

/ ureum (60)

Q~

.', -

z

;I> ;I> ::ti

~ rr1

CJ C

o

=I rr1

stikstof (2) afgas (8)

•

lucht afval (7) afvalstroom lucht (5 bar) uit compressiesysteem R 101 stikstof (5 bar) P 101 stoom (3 bar; 190 C) P 102 koelwoterc ircuit (10 C) F 101 wormwater (70 C) F 102 leidingwater afval( water+vast) noor afdodingstank P 103 F 103 noor centraal afnn""v<:!

Fermentor + terugvoervat Doseerpomp Doseerpomp Sterilisotiefilter Filter Drukpomp Crossflow Microfilter

P 201 P 202 M 201 C 201 V 201 V 202

Drukpomp Voedingspomp Homogenizer Tubular Bowl Centrifuge Voorraadvat Homogenizer Voorraadvat Homogenizer

FVO 3120 D: PROCESSCHEMA VOOR DE PRODUKTIE VAN BETA-INTERFERON (BLAD 1 Peter Vrijkorte en Henry van Veldhuizen dec ember 1994

@§)stroomnr.OOtemperatuur (C)

druk (bare)

'J.

~

\

~G o

IJ)

UlrTJ -i 0 0 Ul-i

~~

~

(])

""""

10 0

~

c;

IJ)

>

0

~

I~~ ~,~ I~ ~ ~I~:I ~~ II~ (I)

__

.-+-..=: Q. ::J

,

::

-, 3 >

lMnl U°lt;rr r" o o

3

0

-i

~......-t

~

_.

~

t

.•

()).

0

(1)

-,

IJ)

:J

0

~

IJ)

-,

0

""""

N.....I.-

o

"X"

-:;

, I

~

0

~

X"

CTlO~

0

""""

10 0

!ll~ -, g o () -,

0

re --t Cb,-C»

, - CD

3

~

~I t~

(])~

Ol

~

stoom

~K . W.circuit ~

water (6)

W. W.circuit

~

fosfaat

stoom (3)

z > > ;0 ~

pHC)

.1.

.14

@

~

ox 6

>

:::!

rTJ

afvalstroom

ILEGENDA: R R C C

301 302 301 302

zie BLAD 1

I

P Reductie + Extractietank P Precipitatietank P L-L Centrifuge P Tub .B Cen trifuge P

301 302 304 305 306

R 401 Tank voor oplossen Doseerpomp precipitaat Doseerpomp F 401 Dead end filter Voedingspomp R 402 Reductietank Voedingspomp V 404 Recyclevot Voedingspomp F 402 Ultrafiltratie

Voed ingspomp FVO 3120 0: PROCESSCHEMA VOOR DE Doseerpomp PRODUKTIE VAN BETA INTERFERON (BLAD 2) Voedingspomp Peter Vrijkorte en Henry van Veldhuizen Eluen tvloeistoftank december 1994 S.E. kolom @stroomnroo temperatuur (C) druk (bora) Voedin 9 sp om P

~

~:~~.

oo~ :I: " (/)

fi

~ ~ ::J

I.,......., 01° '--" 0

• .

.,.......,

--L

'--"

,,'

co

0 0~ ~

til..o~ 0

[

0 .;;.-...,.......,-. I Cl) 00 --L

'-'

'-'

täi, f (/) »'

.,

0

~

..0

~

c

3

0

0 -..,........ ..-.... I CD

N

N

--L

0C ~ ~

00-'0 fTl

:I: m ~ ..,

0 0

3

--~ . _;..-~-- -

~

~ (/)

~

~

l/)

0

~

01

N

'-'

]0~

~ ~

CD '--"

'--"

I

s; -I fTl fTl ;:0

I

stoom (3 ';::'1

Ol

Ul -I rTJ

y> !"'l

'"

0 r0

s:::

Z :l> :l>

;:0

5)~,4

Noor eluent voorroodvat (V405)

-"

M

t:m)

~

~s::: C

r

rTJ

21 z

G)

ofvall (7) 501 501 501 502 P 503 P 504 R F P P

ILEGENDA: zie BLAD 1 I

Oxidotietank Ultrafiltratie Doseerpomp Doseerpomp Doseerpomp Voedingspomp

V 603 K 601 P 602

Elu en tvloeistoftank S.E. kolorTlVoedingspomp

V P P K V

602 602 603 602 603

Oxidotietank Voedingspomp Voedingspomp On tzou tingskolom Eluen tvlbeistoftank

afval I (7)

A fval stroom

FVO 3120 D: PROCESSCHEMA VOOR DE PRODUKTIE VAN BETA INTERFERON (BLAD 3) Peter Vrijkorte en Henry van Veldhuizen december 1994

@stroomnr(]Q] temperatuur (C)

druk (bora)

....".

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

/

FVO Nr. I 3120D I. Auteurs P.H.M. Vrij korte Piet Heinstraat CG Den Haag H.M van Veldhuizen Zandhofsestraat GJ Utrecht

Recommend Documents