Fluorescence, fotosyntéza a stress: jak to spolu souvisí? Mgr. Julie Soukupová, PhD. Ústav systémové biologie a ekologie AVČR, Ústav fyzikální biologie JU
[email protected] T
HTT
T
H
a
RNDr. Karel Roháček, CSc. Ústav molekulární biologie rostlin AVČR, Ústav fyzikální biologie JU
[email protected]
HTT
TTH
Fotosyntéza Rostliny představují otevřené systémy, v nichž dochází k trvalé výměně hmoty (CO 2 , B
B
O 2 , H 2 O, minerálních živin), energie a informací s okolím. V biosféře mají vyjímečné B
B
B
B
postavení, neboť uskutečňují vstup energie do biosféry zvenčí. V procesech fotosyntézy rostliny absorbují energii slunečního záření a přeměňují ji na energii chemickou, kterou využívají ke a stavbě a údržbě svého těla. Vedle důležitých organických látek (cukrů, tuků) vzniká během primární fáze fotosyntézy v důsledku fotofyzikálních dějů kyslík, jehož se za rok uvolní do atmosféry přibližně 10
11
PPP
P
tun. První fototrofní organismy vznikly na naší
planetě přibližně před třemi miliardami let.
Fotosyntézou je označován velký soubor reakcí, při nichž je přijatá sluneční energie využita k syntéze energeticky bohatých chemických sloučenin, za spoluúčasti CO 2 a H 2 O. B
B
B
B
Často je velmi zjednodušeně charakterizována následující sumární rovnicí: hν 6 CO 2 + 12 H 2 O ⎯⎯ → C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 + 6 H 2 O B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
(1)
B
B
B
kde, hυ je kvantum zářivé energie. Oxygenní fotosyntéza probíhá u řas a vyšších rostlin v chloroplastech a lze ji rozdělit na dvě fáze: fázi „světelnou“ (fotofyzikální) a fázi „temnotní“ (chemosyntetickou). „Světelná“ fáze probíhá na tylakoidální membráně, kde dochází k zachycení sluneční energie a její přeměně na energii chemickou, akumulovanou v ATP a NADPH+H + . V „temnotní“ P
P
fázi jsou ATP a NADPH+H + použity k fixaci atmosférického CO 2 a zabudování uhlíku do P
P
B
B
sacharidů v Calvin - Bensonově cyklu, probíhající ve stromatu chloroplastů. Účinnost syntézy sacharidů závisí na intenzitě přísunu ATP a NADPH+H + , tj. na účinnosti světelných P
P
reakcí. My se podrobněji budeme zabývat pouze první částí fotosyntézy. Chloroplast 1 Struktura chloroplastu vyšších rostlin
1 Chloroplast (Obr.1) je nejmenší strukturní a funkční jednotkou, která je schopna i po izolaci absorbovat žáření, fixovat CO 2 a zabudovávat uhlík do sacharidů. B
B
Pod dvěma obalovými membránami je vnitřní amorfní medium, stroma, ve kterém jsou uloženy tylakoidy. Tylakoidy představují rozprostřené systémy vnitřní membrány podobné zploštělým měchýřkům. V chloroplastech se vyskytují stěsnané tylakoidy tvořící grana, která jsou vzájemně propojená tylakoidální membránou a nestěsnané tylakoidy. Tylakoidální membrána 2 Zjednodušené schéma uspořádání a přenosu elektronů v tylakoidální membráně.
2
Membránu tylakoidů tvoří lipidová dvojvrstva, na níž jsou uloženy a do níž jsou vloženy bílkoviny nezbytné pro první „světelnou“ část fotosyntézy (Obr.2). Proto je také nazývána „fotosyntetická membrána“. Vnitřní prostor tylakoidu se nazývá lumen. Oxidoredukční reakce „světelné fáze“ fotosyntézy probíhají na čtyřech hlavních proteinových komplexech tylakoidální membrány: fotosystém II (PSII), cytochrom b 6 f B
B
komplex (cyt b 6 f), fotosystém I (PSI) a ATP syntáza (Obr.2). Tyto integrované proteinové B
B
komplexy jsou v membráně vertikálně orientované. PSII a PSI jsou pigment – proteinové komplexy, zajišťjící absorpci kvant slunečního záření a jejich přenos, společně s rozdělením nábojů. S těmito komplexy jsou spojeny komplexy podílející se na oxidaci vody (s PSII) a redukci NADP + (s PSI). P
P
Plastochinon (PQ) a plastocyanin (PC) jsou malé bílkovinné molekuly sloužící jako přenašeče elektronů (a/nebo protonů) mezi velkými proteinovými komplexy; PQ mezi PSII a Cyt b 6 f, PC mezi Cyt b 6 f a PSI. PQ je hydrofobní molekula, pohybuje se pouze uvnitř B
B
B
B
tylakoidální membrány, PC je hydrofilní a pohybuje se na vnitřní (lumenální) straně membrány. Absorpce světla a tranfer energie Fotosyntéza začíná zachycením kvanta sluneční energie fotoreceptory. Hlavními fotoreceptory zelených rostlin jsou chlorofyly a+b (Obr.3), které obsahují hořečnatý komplex redukovaného porfyrinu s navázaným polyisoprenovým řetězcem alkoholu fytolu. Chlorofyla je nejdůležitější fotosynteticky aktivní pigment, který je nezbytný pro vlastní přeměnu energie. Ostatní pigmenty (zejména karotenoidy) mají pomocnou a ochrannou funkci: zachycují dopadající kvanta záření a energii svého excitovaného stavu předávají na chlorofyl-a, který absorbuje jen modrou a červenou část spektra (Obr.4) a odstraňují radikálové formy kyslíku, které vznikají v průběhu fotosyntézy a působí destruktivně na chlorofyly a lipoproteiny v thylakoidní membráně. 3 Strukturní vzorec molekuly chlorofylu.
4 Absorpční spectrum chlorofylu.
3
4 Většina molekul chlorofylů a ostatních akcesorických pigmentů je asociována v tzv.
anténních či světlosběrných komplexech. Spojením s reakčními centry s přenašečovými molekulami vznikají dva fotosystémy, označované jako PSII a PSI. Fotosystém I má v reakčním centru pigment s maximem absorpce 700 nm (P700), převažují v něm
dlouhovlnné formy chlorofylu-a. Fotosystém II obsahuje analogický pigment s maximem při kratší vlnové délce 680 nm (P680). Úlohou světlosběrných komplexů je zachycení kvant záření a transfer takto získané energie do příslušného reakčního centra PSII a PSI. 5 Zjednodušené tříhladinové schéma využití excitační energie v molekule chlorofylu RC FS II. Energetický diagram ukazuje základní a excitované stavy elektronu vybuzeného excitační energií přijatou anténním systémem FS II. Vertikální šipky prezentují následující kvantové procesy: (1) Absorption – absorpce kvanta radiace s různou vlnovou délkou λ A , způsobující přenesení elektronu ze B
B
základního do excitovaného stavu v čase t≤10 -14 s, (2) P
P
Dissipation to heat – rozptýlení excitační energie na teplo, a (3) fluorescence – zářivá deexcitace s vlnovou délkou λ F >650nm. Parametr τ znamená přibližný čas života B
B
elektronu v jednotlivých stavech. Horizontální šipky ukazují fotochemickou cestu (photochemistry), zahrnující rozdělení náboje, elektronový transport (electron transport) a neutralizaci Chl + elektrony dodávanými (donation of P
P
electrons) komplexem štěpícím vodu (WSC).
Světlo (přesněji řečeno – elektromagnetické záření) můžeme popsat jako proud fotonů o určité vlnové délce a energii. Každý pohlcený foton může způsobit jednoduchý fotochemický děj za předpokladu, že nese dostatečné množství energie. Tato energie pak pohání primární fotochemické reakce, které iniciují fotosyntetickou přeměnu zářivé energie na chemickou. Kvantum červeného světla, které je absorbovánov molekule chlorofylu, vyvolá přechod elektronu ze základního stavu do excitovaného (vzbuzeného - označen jako S 1 na obr. 5). Energie excitovaného elektronu může být využita těmito konkurenčními B
B
cestami (Obr. 5): buď elektron přejde do základního energetického stavu a odpovídající energie se přemění na teplo, nebo je vyzářena v podobě červeného záření (s maximem kolem 700 nm) - fluorescence, či je využita v kaskádě navazujících fotochemických reakcí –
fotosyntéza. Tato tzv. fotochemická cesta zahrnuje rozdělení náboje a přenos elektronu přes řadu přenašečů. Kvantum modrého světla má větší obsah energie než kvantum červeného světla, a proto může vyvolat přechod elektronu až do 2. excitovaného stavu (označen S 2 na B
obr. 5). Ten je ale mnohem méně stabilní než stav S1, proto za dobu přibližně 10
P
elektron přejde ze stavu S2 do stavu S1 a odpovídající část energie se přemění na teplo.
B
-12 P
s
Tyto tři procesy (disipace energie v podobě tepla, fluorescence nebo fotochemie) mezi sebou soutěží. Změna kvantového výtěžku jakéhokoliv z těchto tří de - excitačních procesů se projeví změnou v ostatních dvou. Separace náboje v reakčním centru PSII a následný transport elektronů přes membránu Excitační energie je využívána v reakčních centrech PSII a PSI. Zde je jediný fotochemicky aktivní dimer chlorofylu-a a sem je také směrována energie pohlcená celým světlosběrným komplexem. Na tento dimer připadá 200 – 300 molekul chlorofylu ve světlosběrných systémech. Hlavní funkcí PSII (a přiléhajícího vodu štěpícího komplexu) je rozdělení nábojů a transfer elektronů z vody na plastochinon (PQ) (Obr. 2). Primárním donorem elektronů je pigment P680, speciální pár molekul chlorofylu-a. Po absorpci fotonu se pigment P680 dostává do excitovaného stavu, uvolňuje elektron, který je předán přes feofytin (Pheo) na primární akceptor, chinon Q A . Q A je kovalentně vázanou formou PQ na PSII. Sekundárním B
B
B
B
akceptorem elektronu je difuzní forma PQ, chinon Q B . Jakmile Q B přijme 2 elektrony z Q A , B
B
B
B
B
B
redukuje se na PQH 2 a opouští PSII. B
B
Pigment P680 + vzniklý po uvonění elektronu je zpětně redukován díky kyslík P
P
vyvíjejícímu a vodu stěpícímu komplexu. Pro rozštěpení dvou molekul vody a uvolnění jedné molekuly kyslíku je třeba čtyř elektronů. Čtyři vodíkové protony jsou současně uvolněny do lumenu. Plastochinon PQH 2 na přenáší elektrony a protony ze stromální strany membrány na B
B
lumenální, na cytochrom b 6 f komplex. Zde se H + ionty uvolňují do lumenu a transport B
B
P
P
elektronů dále na PSI zajišťuje PC. V PSI je světelná energie použita k redukci NADP + na P
P
NADPH+H + na stromální straně membrány, který je zároveň posledním akceptorem P
P
elektronů v lineárním elektronovém transportu. Primárním donorem elektronů v reakčním centru PSI je chlorofyl P700. Primárním ekceptorem je feredoxin. Oxidovaný P700 + je redukován elektronem putujícím z PSII. P
P
Je zřejmé, že transport elektronů tylakoidální membránou je spojen s transportem vodíkových protonů přes membránu. Takto generovaný rozdíl v koncentraci H + iontů mezi P
lumenem a stromatem je využíván ATP syntázou k syntéze ATPz ADP.
P
Fluorescence
6.1. Původ fluorescence Jak jsme už zmínili v oddílu č. 4, fluorescence chlorofylu je jedním z deexcitačních procesů po absorpci světelné energie světlosběrným systémem. Fluorescenční emise chlorofylu je světlo o vlnové délce 685nm; zpětnou reabsorpcí listy může být tato emise posunuta až k 740nm. V listech zdravých rostlin a za stabilních optimálních podmínek je zhruba 80% absorbované světelné energie použito pro fotochemii, ca. 15% je vyzářeno v podobě tepla a ca. 3 - 5% je re-emitováno v podobě fluorescence. Ačkoliv tento proces je jen vedlejším de-excitačním procesem, poskytuje nám možnost nahlédnout, jak je absorbovaná světelná energie rostlinou využívána. V případě, že je účinnost fotosyntézy vysoká, výtěžek fluorescence je nízký a naopak (viz dále). Vazba mezi fotochemií a fluorescencí je nejsilnější v PSII. Za pokojové teploty 90% fluorescenční emise pochází právě z PSII, respektive z přilehlých světlosběrných systémů, které obsahují velké množství molekul chlorofylu-a. Kvantový výtěžek fluorescence závisí z velké části na schopnosti PSII realizovat stabilní rozdělení náboje mezi primárním donorem P680 a Q A . Když je Q A oxidován, B
B
B
B
reakční centrum PSII je schopné využít světelnou energii zachycenou anténním systémem na rozdělení náboje (účinnost fotochemie je maximální) a zbylá část excitační energie spotřebovaná na fluorescenci je malá, což odpovídá minimálnímu výtěžku fluorescence (označuje se F 0 nebo F 0 `). Tato situace nastává, když je rostlina adaptovaná na tmu. B
B
B
B
Naproti tomu, když je Q A redukován, reakční centrum není schopno uskutečnit stabilní B
B
rozdělení náboje (účinnost fotochemie se blíží nule) a podíl excitační energie, který je využit na fluorescenci, je vysoký a tím i výtěžek fluorescence je maximální (značí se F M nebo F M `). B
B
B
B
K této situaci dochází, je-li rostlina ve vysokém saturačním světle. K popsání procesu emise fluorescence byl zaveden termín kvantový výtěžek fluorescence (Φ F ), který je definován jako podíl počtu všech vyzářených fotonů (n F ) a počtu B
B
B
B
všech absorbovaných fotonů (n A ): B
ΦF = nF / nA . B
B
B
B
B
B
B
(2)
Jiný způsob, jak vyjádřit kvantový výtěžek fluorescence chlorofylu je popsán následující obecnou rovnicí:
ΦF =
IF k = F . IA Σki
(3)
V tomto vztahu znamená I F intenzitu fluorescence, I A intenzitu absorbovaného záření, B
B
B
B
k F rychlostní konstantu procesu emise fluorescence a Σk i představuje sumu rychlostních B
B
B
B
konstant všech konkurujících si procesů, které vedou k návratu molekuly Chl z excitovaného do základního stavu. Kvantový výtěžek fluorescence může být silně ovlivněn mechanismem, který omezuje tok excitační energie z anténního systému do reakčního centra PSII (např. zvýšení vzniku tepla při nadměrném ozáření). Přestože fluorescence Chl představuje minoritní proces deaktivace excitovaných pigmentů, časové změny výtěžku fluorescence chlorofylu poskytují možnost zkoumat mechanismy, pomocí nichž thylakoidy regulují využití zářivé energie absorbované komplexy PSII. Jak plyne z obr. 5, růst jedné komponenty vede ke snížení alespoň jedné z ostatních dvou komponent, do nichž excitační energie přechází. Lze tedy předpokládat protiběžný (antiparalelní) vztah mezi fotochemickými a nefotochemickými procesy. Záznam časových změn kvantového výtěžku fluorescence (tzv. Kautského jev) se nazývá fluorescenční
indukce. 6.2. Fluorescenční indukce a základní fluorescenční parametry Fluorescence chlorofylu není statická veličina, ale mění se v čase. Dynamiku fluorescenční emise zaznamenali už v 30. letech Kautsky a Hirsch, kteří pozorovali fluorescenci vlastníma očima a položili tak základ jedné vědní disciplíně. Když temnotně adaptovanou rostlinu vystavíme kontinuálnímu světlu, intenzita fluorescence vykazuje charakteristické změny v čase. Tyto změny jsou způsobeny rozdíly v rychlostech fotochemie na tylakoidální membráně a fixace CO 2 ve stromatu chloroplastů. Zatímco fotoB
B
chemické procesy na membráně začnou probíhat okamžitě po vystavení rostliny světlu, metabolické procesy ve stromatu startují daleko později.
6
Fluorescenční indukční křivka chlorofylu - a zaznamenaná
přístrojem PAM-2000 na listu durmanu. +MZ/-MZ měřící záření zapnuto/vypnuto; +AZ/-AZ aktinické záření zapnuto/vypnuto; SP saturační pulz; FR spuštění far-red záření.
Průběh těchto křivek (obr. 6) poskytuje vhled do podstaty zužitkování excitační energie fotosystémem II a nepřímo také dalšími komplexy v thylakoidní membráně. Zvýšení toku excitační energie do fotochemických procesů (fotochemická cesta) vede k poklesu (zhášení) výtěžku fluorescence. Tímto způsobem fluorescence chlofofylu odráží změny účinnosti fotosyntetických procesů. Fotochemické zhášení odpovídá obecně energii spotřebované při rozdělení (separaci) náboje v reakčních centrech fotosystému II. Nefotochemické zhášení je vyvoláno tvorbou pH-gradientu na thylakoidní membráně, jakož i aktivací četných regulačních mechanismů, které zajišťují efektivní zužitkování excitační energie a jsou schopny se vypořádat s nadměrnou ozářeností (fotoihibicí) nebo jiným druhem poškození fotosyntetických komplexů. Rozlišení obou základních typů zhášení fluorescence chlorofylu bylo umožněno zavedením metody saturačních pulzů, jež je nyní využívána téměř ve všech typech přístrojů pro měření fluorescence (fluorimetrů). V temnotně adaptovaném stavu (TAS), který je vzhledem k elektronově transportním procesům fotochemicky neaktivním stavem thylakoidní membrány, jsou obecně všechna reakční centra PSII a přenašeče elektronů na akceptorové straně PSII reoxidovány. V tomto stavu je možné zaznamenat tzv. minimální výtěžek fluorescence (viz F 0 na obr. 6), jestliže je B
B
vzorek v předzatemněném stavu osvětlen slabým modulovaným měřícím zářením (MZ). Je-li vzorek následně ozářen krátkým saturačním pulzem bílého světla (SP), způsobí tento saturační pulz rychlé uzavření všech aktivních reakčních center PSII, neboť dojde k úplné redukci jejich primárního elektronového akceptoru Q A , doprovázené úplným vysycením B
B
fotochemických procesů vPSII. Tehdy je zaznamenán tzv. maximální výtěžek fluorescence (F M ). B
B
Správné stanovení jak F M , tak F 0 je nezbytné pro následné kvantifikování procesů, B
B
B
B
které se uplatňují během fotosyntézy. Všechny časové změny výtěžku fluorescence během světelné periody jsou spojeny s mechanismem fluorescenčního zhášení a jsou porovnávány s těmito základními (referenčními) úrovněmi. Rozdíl mezi F M a F 0 je označován jako B
B
B
B
maximální výtěžek variabilní fluorescence v temnotně adaptovaném stavu (F V ). F V lze B
B
B
B
vypočítat ze vztahu:
FV = FM − F0 .
(4)
Poté, co je zapnuto aktinické světlo (AZ), lze pozorovat výrazné změny výtěžku
fluorescence, jež lze připsat na vrub současnému spolupůsobení fotochemických a nefotochemických procesů. Fotochemické procesy se vztahují k rozdělení náboje v reakčních centrech PSII, které je spojeno se změnami účinnosti dějů v elektronovém transportním řetězci, nefotochemické procesy zahrnují vytváření pH-gradientu, nezářivou disipaci energie na teplo v thylakoidních membránách, fosforylaci mobilních světlosběrných komplexů PSII, fotoinhibici reakčních center PSII atd. Po zapnutí aktinického světla se intenzita fluorescence zvyšuje až na F P (peak), B
B
maxima při dané intenzitě ozářenosti, pak opět klesá, až se po několika minutách ustálí na určité hodnotě F S (steady-state). Změna fluorescence v čase mezi F 0 a F P je tzv. „rychlá B
B
B
B
B
B
fáze“ fluorescenční indukce a souvisí s primárními procesy fotochemie na PSII. „Pomalá fáze“ fluorescenční indukce (F P až F S ) souvisí s postupným přechodem fotosyntetického B
B
B
B
aparátu z temnotně do světelně adaptovaného stavu. Ten je charakterizován nepřetržitou syntézou ATP, NADPH+H + a souběžnou fixací CO2. Jakmile se procesy elektronového P
P
transportu a spřažených biochemických reakcí dostanou do rovnováhy, je dosaženo i tzv. ustálené úrovně (steady-state) výtěžku fluorescence (F S ). B
B
Použití saturačního pulzu v tomto světelně adaptovaném stavu umožňuje určit maximální výtěžek fluorescence chlorofylu (F M ’). Jakmile je AZ vypnuto, je po krátkém B
B
pulzu slabého dlouhovlnného červeného záření (far-red, FR), jež urychluje reoxidaci akceptorové strany PSII, zaznamenán minimální výtěžek fluorescence ve světelně adaptovaném stavu (F 0 ’). Pak je možné určit maximální výtěžek variabilní fluorescence B
B
ve světelně adaptovaném stavu (F V ’) podle vztahu: B
B
F V ’ = F M ’ - F 0 ’. B
B
B
B
B
(8)
B
Obecně tedy úrovně fluorescence F M a F 0 charakterizují temnotně adaptovaný stav, B
B
B
B
F M ’, F S a F 0 ’ charakterizují světelně adaptovaný stav thylakoidní membrány. B
B
B
B
B
B
Vzhledem k velkému množství informací o procesech probíhajících v PSII a jeho okolí se fotosyntetický výzkum výzkum intenzivně zabýval způsobem, jak tyto informace kvalitativně i kvantitativně nejlépe analyzovat. Za tím účelem byly zavedeny tzv. fluorescenční parametry (FP). Bylo definováno množství FP, které jsou používány nejen v základním výzkumu fotosyntéze, ale i k detekci stresu v laboratorních i polních podmínkách.
6.3. Metody měření fluorescence chlorofylu V současné době nejvíce používanými přístroji pro meření fluorescence (fluorimetry) jsou fluorimetry pracující na principu pulzní amplitudové modulace (PAM) fluorescenčního signálu. Lze jimi přesně měřit fluorescenci chlorofylu dokonce i na pozadí denního světla v polních podmínkách. Existují dva typy fluorimetrů: tzv. nezobrazovací a zobrazovací fluorimetry. Nezobrazovací fluorimetry integrují fluorescenční signál z celého měřeného vzorku (list, suspenze řas nebo sinic) a výstupem měření je jediná fluorescenční indukční křivka nebo soubor fluorescenčních parametrů pro daný vzorek. Lze jimi měřit velmi rychlé procesy na fotosyntetické membráně. Zobrazovacími fluorimetry nelze měřit rychlé procesy na fotosyntetické membráně, ale jejich velkou výhodou je možnost měřit změny fluorescenční emise chlorofylu v ploše a tím odhalit prostorovou heterogenitu zkoumaného vzorku a to jak na mikroskopické (µm) tak makroskopické (µm) úrovni (m až desítky m). Testuje se i snímání fluorescence vegetace z letadel a satelitů. Použitím zobrazovací fluorometrie lze např. lokalizovat působení stresového faktoru, dříve než jsou patrná poškození volným okem.
6.4. Příklady detekce stresu pomocí fluorescence Díky vztahu mezi fotosyntézou a fluorescencí se měření fluorescence chlorofylu stalo velmi používanou metodou pro monitorování fotochemické účinnosti rostlin. Tato metoda je neinvazivní, rychlá a zároveň velmi citlivá. Používá se nejen v základním výzkumu fotosyntézy, ale i při detekci mutantních rostlin, a včasné detekci abiotického i biotického stresu. Příklad vlivu vodního stresu na změny fluorescenční indukce je na obr.7, kde je zobrazen odraz přirozeného zasychání listu durmanu stromového v čase (výsledky K. Roháček). 7 Odraz přirozeného zasychání listu durmanu stromového (Datura arborescens) v „3D“-tvaru fluorescenčních indukčních křivek.
8
List africké fialky Sauntpaulia
byl na jednu hodinu ponořen do roztoku herbicidu DCMU. DCMU blokuje fotosyntetický transport elektronů vazbou v Q B kapse PSII. V panelu A je B
B
zřetelná oblast poškozená působením herbicidu (světlá horní část), která vykazuje vysokou intenzitu fluorescence chlorofylu. Tvar fluorescenční indukční křivky je zobrazen v panelu B (horní křivka). U nezasažené oblasti listu (dolní 9
Heterogenita fluorescenčního signálu listu fazole způsobená infekcí bakterie Pseudomonas syringae,
pv. savastanoi. Intenzita fluorescence je zde znázorněna na škále falešných barev, kde červená znamená nejvyšší intenzitu, zatímco modrá nejnižsí. Změny ve fluorescenci jsou patrné již po 3 dnech, zatímco vizuální symptomy (chloróza) se objevují až po 14 dnech. 10
Počáteční stadium infekce citronu houbou Penicillium digitatum, 48 hodin po inokulaci. Zatímco
vizuelně bylo vidět jen místo vpichu, kam byly spory houby inokulovány (panel vlevo), ve dvou fluorescenčních parametrech F 0 (panel uprostřed) a F 0 /F V (panel vpravo) bylo jasně viditelné rozrůstání B
B
B
B
B
B
mycelia. První viditelné stopy infekce (mokvání a „změknutí“ povrchu) se objevily až 4 dny po inokulaci, viditelné mycelium 5-6 dní po inokulaci, sporulace 7 dní po inokulaci.
Dalším příkladem abiotického stresu je působení herbicide DCMU na obr.8. DCMU blokuje fotosyntetický transport elektronů vazbou v Q B kapse PSII. Proto v oblasti zasažené B
B
herbicidem je fluorescence vysoká, zatímco nezasažená oblast nevykazuje žádné změny ve fluorescenční indukci a tím ani poškození fotosyntetického aparátu.
Obr.9, 10 a 11 znázorňují použití zobrazovací fluorimetrie k detekci biotického stresu, v přímé návaznosti na ochranu hospodářských rostlin, zvýšení výnosu plodů a jejich ochrany. Při včasné detekci virové, bakteriální či houbové infekce lze s velkou účinností uplatnit postupy vedoucí k eliminaci patogenů a tak i ochraně rostlinné produkce. Bakterie Pseudomonas syringae, pv. savastanoi (Obr.9) infikuje a působí velké ztráty na olivovnících. Dalším hostitelem je i fazole. Infekci fazole touto bakterií lze pomocí fluorescenční zobrazovací techniky detekovat již po 3 dnech, zatímco vizuální symptomy se objevují až po 14 dnech (výsledky J. Soukupová). Podobně lze detekovat počáteční stadium infekce citrónů houbou Penicillium digitatum (Obr.10), která způsobuje velké ztráty při skladování a transportu citrusů a tak vlastně kontrolovat kvalitu plodů. Navíc, houbou infikovaná místa lze odlišit od mechanického poškození, která na pohled vypadají shodně, ale liší se ve fluorescenčních charakteristikách (výsledky J. Soukupová). Souhrn Záznam indukované fluorescence chlorofylu a je cestou jak nedestruktivně zkoumat fotosyntetické procesy v rostlinách, řasách i sinicích - obecně ve všech fotosyntetizujících organizmech. Změny výtěžku fluorescence chlorofylu jsou citlivým indikátorem fotosyntetických procesů probíhajících v časovém rozmezí od mikrosekund (rychlé primární fotofyzikální děje) až po mnoho minut (pomalé enzymatické procesy ve stromatu chloroplastů). Vyhodnocením fluorescenčních indukčních křivek lze stanovit hodnoty řady fluorescenčních parametrů, které umožňují kvalitativně i kvantitativně charakterizovat funkčnost fotosyntetického aparátu rostlin, jejich fyziologický stav, detailně studovat děje probíhající v thylakoidních membránách uvnitř chloroplastů, ale i včas detekovat abiotický i biotický stres na úrovni buněk, rostlin i porostu.
Doporučená literatura: Govindee: Sixty-three years since Kautsky: Chlorophyll-a fluorescence. Australian Journal of Plant Physiology 22, 131-160, 1995. Krause, G.H. a Weis, E.: Chlorophyll fluorescence and photosynthesis. The basics. Annual Rev of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42, 313-349, 1991.
Maxwell, K. A Johnson, G.N.: Chlorophyll fluorescence – a practical guide, Journal of Experimental Botany Vol.51, No.345, 659-668, 2000. Nedbal, L., Soukupová J., Kaftan D., Whitmarsh, J. a Trtílek, M.: Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light, Photosynthesis Research 66, 3-12, 2000a. Nedbal, L., Soukupová J., Whitmarsh, J. a Trtílek, M.: Postharvest imaging of chlorophyll fluorescence from lemons can be used to predict fruit quality, Photosynthetica 38, 571-579, 2000b. Procházka, S., Macháčková, I., Krekule,J., Šebánek, J.a kol.: Fyziologie rostlin, Academia Praha, 1998. Roháček, K.: Chlorophyll fluorescence parameters: the definitions, photosynthesic meaning, and mutual relationships, Photosynthetica 40, 13-29, 2002.
Pro náročné: Papageorgiou G.C. a Govindjee (eds.): Chlorophyll-a Fluorescence. A signature of photosynthesis, Springer, Dordrecht, Nizozemí, 2004.
