Pannon Egyetem Műszaki Informatikai Kar Nanotechnológia Tanszék
FLAGELLINALAPÚ MOLEKULÁRIS OBJEKTUMOK LÉTREHOZÁSA
Doktori (PhD) értekezés tézisei
Sebestyén Anett Környezettudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Vonderviszt Ferenc
Veszprém 2008.
ÖSSZEFOGLALÓ
A hagyományos bioszenzorok illetve fehérje chipek antitesteket, vagy azok alkalmas részegységeit alkalmazzák érzékelő elemként. Ezek előállítása költséges, preparálásuk bonyolult, stabilitásuk sokszor elégtelen, a hordozó felülethez kötve könnyen elveszítik natív térszerkezetüket,
működőképességüket.
Az
antitestek
kiváltása
más
fehérje
alapú
receptorokkal mindenképpen kívánatos. A bakteriális flagellumok helikális filamentumai polimerizálódásra képes flagellin fehérje több tízezer kópiájából épülnek fel. A flagelláris filamentumok önszerveződő rendszerek, azaz a flagellin monomerek spontán módon képesek összeállni a natívval megegyező szerkezetű filamentumokká megfelelő körülmények között. A flagellin polimerizációja könnyen kontrollálható, a kialakuló filamentumok a fizikai-kémiai behatásokkal szemben stabilisak, szerkezetük atomi precizitással ismert. A különböző fajokból származó flagellin fehérjék szekvenciáinak összehasonlításából adódóan ismeretes az is, hogy a molekula centrális szegmensei nagymértékben variábilisak, nem vesznek részt a szerkezetépítésben, éppen ezért különféle kötőhelyek alakíthatók ki ebben a régióban a polimerizáció megzavarása nélkül. Ennek tudatában egyfelől számítógépes molekulatervezés és génsebészeti eszközök segítségével, Ni- és As-kötő flagellinvariánsokat állítottam elő, amelyek az adott nehézfémion felismerésére és erős megkötésére képesek. A flagellin alapú receptorok számos előnyt hordoznak, miszerint baktériumokkal nagy mennyiségben olcsón termeltethetők, a sejtek feltárása nélkül könnyen tisztíthatók, emellett még a flagellin polimerizációs képességénél fogva rendkívül nagy felületi kötőhely sűrűségű filamentáris objektumok építésére is alkalmazhatók. Másfelől megmutattam, hogy a flagellin variábilis D3 doménjét kifejezve, a domén stabil önálló fehérjeként működik, amely lehetővé teszi, hogy mesterséges kötő fehérjék vázelemeként alkalmazható legyen. Későbbiekben, ezek a módosított filamentáris receptorok, vagy a módosított D3 domén önmagában, ivóvizek nehézfémekkel való szennyezettségének mérésére szolgáló optikai szenzorok alapeleméül szolgálhatnak.
2
ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK / TÉZISEK
1. A
flagellinmolekula
ismert
szerkezetéből
kiindulva,
számítógépes
grafika
és
molekulamodellezés alkalmazásával megállapítottam, hogy a flagellin variábilis D3 régiójában mely aminosavak oldalláncai vannak megfelelő orientációban és távolságban ahhoz, hogy hisztidinre cserélve őket, fémkötő centrumot alakíthassak ki. A kiválasztott aminosavakat irányított mutagenezis módszerrel hisztidinre cseréltem. A mutáns flagellin Ni-kötő képességét, kvantitatív izotermális titrációs mikrokalorimetria (ITC) módszerrel vizsgáltam. Megállapítottam, hogy a kötődés disszociációs állandója Kd ~5 μM, és egy flagellin alegységhez egy Ni-ion kötődik. 2. A bakteriális arzénkötő fehérjék (ArsR fehérjék) esetén ismeretes, hogy az arzenit ion specifikus megkötéséért felelős polipeptidszegmens aminosavszekvenciája a következő: SerGlyGluLeuCysValCysAspLeuCysThrAlaLeuAspGln. A rendelkezésre álló adatok szerint ez a szegmens erősen nyújtott konformációjú, végeinek távolsága közel 20Å. Méretéből adódóan megállapítottam, hogy a D3 domén Ala262-Thr273 öblös felületi hurokrégiója megfelelő vázként szolgálhat az arzénkötő motívum befogadására. Ennek megfelelően az Ala262-Thr273 szegmenst a D3 doménből kivágtam, majd ennek helyére ültettem be az arzénkötő motívumot többlépcsős PCR segítségével. Az előállított As-kötő flagellinmutáns esetében a kötődés disszociációs állandója ugyancsak mM-os tartományba esik. 3. A filamentumok képződésének mechanizmusát kutatva azt a feltételezést, hogy a filamentum végén lévő szabad N-terminálishoz kötődik a következő alegység Cterminálisa, fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer módszerrel igazoltam. A csonkított flagellinek polimerizációs vizsgálatából megállapítottam, hogy a megfigyeléseink megfelelnek a hipotézisnek, miszerint az axiális irányban szomszédos flagellin alegységek N- illetve C-terminális régiói egymásba fonódó helikális kötegeket alkotva építik fel a filamentumok belső gyűrűjének szerkezetét.
3
4. A Ni-kötő variánsból épített filamentum struktúrát, egy hordozómátrix nélküli szenzorchip felületre rögzítettem, és felületi plazmon rezonancia spektroszkópia módszerrel vizsgáltam. A mérések alapján megállapítottam, hogy a mutáns filamentum felületi kötőhely sűrűsége elég nagy ahhoz, hogy megfeleljen a nehézfémion kötés optikai úton történő detektálására. 5. A flagellinmolekula D3 domént kódoló génszakaszát klónoztam és differenciális pásztázó kaloriméteres (DSC), valamint tripszines emésztési vizsgálattal megmutattam, hogy D3 domén stabil harmadlagos szerkezettel rendelkező önálló fehérje, amely nagyfokú ellenállást mutat a proteolitikus emésztéssel szemben. Ennek ismeretében a D3 domén kis mérete és stabil szerkezete lehetővé teszi, hogy alkalmazható legyen a későbbi receptor fejlesztések vázelemeként.
4
KÖZLEMÉNYEK, ELŐADÁSOK
SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., VÉGH B.M., & VONDERVISZT, F. The Hypervariable D3 Domain of Salmonella Flagellin Is an Autonomous Folding Unit. Protein and Peptide Letters, 15, 54-57. (2008). SEBESTYÉN, A, VÉGH, B.M., SZEKRÉNYES, Á., KURUNCZI, S., VONDERVISZT, F. Nehézfémkötő flagellin alapú receptorok. Biokémia XXX/4. (2006). GUGOLYA, Z., MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., DIÓSZEGHY, Z. & VONDERVISZT, F. Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation. FEBS Letters, 535, 66-70. (2003). MUSKOTÁL, A., KIRÁLY, R., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z.,VÉGH B.M. VONDERVISZT, F. Interaction of FliS flagellar chaperone with flagellin. FEBS Letters, Vol. 580, 39163920. (2006). FECZKÓ, T., MUSKOTÁL, A., GÁL, L., SZÉPVÖLGYI, J., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F. Synthesis of Ni-Zn ferrite nanoparticles in radiofrequency thermal plasma reactor and their use for purification of histidine-tagged proteins, J. Nanoparticle Research, közlésre elfogadva.
SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., GYIMESI, G., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Ni- and As-binding flagellin-based receptors E-MRS Spring Meeting, Strasbourg (France, 2007). KURUNCZI, S., NAGY, N., TÓTH, A. L., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Immobilization of protein filaments on surfaces for optical sensing E-MRS Spring Meeting, Strasbourg (France, 2007). PAP, A. E., KURUNCZI, S., SEBESTYÉN, A., TÓTH, A. L., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Immobilization of protein segments into porous silicon for biosensor application E-MRS Spring Meeting, Strasbourg (France, 2007). SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., SZEKRÉNYES, Á., GYIMESI, G., KURUNCZI, S., VONDERVISZT, F.: Nehézfém-kötő flagellin alapú receptorok Műszaki Kémiai Napok ’07 Veszprém, (2007).
5
SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., SZEKRÉNYES, Á., GYIMESI, G., KURUNCZI, S. ÉS VONDERVISZT,
F.:
Nehézfém-kötő
flagellin
alapú
receptorok
Nanobiológia
Miniszimpózium Pécs (2006). legjobb poszter díja SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., JAKAB, G., DIÓSZEGHY, Z., ZÁVODSZKY, P. & VONDERVISZT, F.: The FliH component of the flagellar export apparatus is a multizinc enzyme with phospholipase activity. 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference. Budapest, Hungary (2005). SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., JAKAB, G., MUSKOTÁL, A., DIÓSZEGHY, Z., ZÁVODSZKY, P., VONDERVISZT, F.: A flagellumspecifikus exportrendszer FliH komponense foszfolipáz aktivitással rendelkező multi-cink fehérje. A Magyar Biofizikai Társaság XXII. Kongresszusa. Debrecen, (2005). KURUNCZI, S., TÓTH, A. L., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Immobilization of protein filaments on surfaces for optical sensing. Hungarian Nanotechnolgy Symposium. Budapest, Hungary (2005). MUSKOTÁL, A., KIRÁLY, R., SEBESTYÉN A., VÉGH B., VONDERVISZT F.: A flagellinspecifikus FliS dajkafehérje jellemzése. A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 8. Munkaértekezlete. Tihany (2003). MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, ELTE, OTDK Konferencia (2003). Kémiai és Vegyipari Szekcióban, a biokémia-biotechnológia tagozatában III. helyezés. MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., DIÓSZEGHY, Z., VONDERVISZT, F.: A flagellinmolekula kölcsönhatásaiban.
rendezetlen A
Magyar
terminális Biokémiai
régióinak Egyesület
szerepe
az
Molekuláris
alegységek Biológiai
Szakosztályának 7. Munkaértekezlete. Keszthely (2002). VONDERVISZT, F., MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., DIÓSZEGHY Z.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. XIV. International Biophysics Congress, Buenos Aires, Argentina (2002). MUSKOTÁL A., SEBESTYÉN A., VONDERVISZT F.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban. A Magyar Biofizikai Társaság Molekuláris Biofizika Szekciójának szegedi szekcióülése (2002).
6
MUSKOTÁL A., SEBESTYÉN A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, VIII. Országos Felsőoktatási Környezettudományi Diákkonferencia, Veszprém (2002). Környezeti Kémia Szekcióban Környezetvédelmi és Vízügyi Minisztérium különdíja. MUSKOTÁL A., SEBESTYÉN A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, VE, TDK Konferencia (2001). Kémiai és Vegyipari Szekcióban II. helyezés.
7
